CN112844314A - 固定相和利用该固定相纯化纽莫康定b0的应用 - Google Patents

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金高娃
郭志谋
丁俊杰
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Abstract

本发明涉及新的硅胶键合含两个及以上氮原子的氨基酸或天冬氨酸的固定相和在液相色谱中利用该类固定相，优化流动相条件，纯化卡泊芬净前体，获得高纯度纽莫康定B0(HPLC纯度>99％，单个杂质<0.1％)的方法。这种色谱方法可以用于分析或纯化制备。

Description

固定相和利用该固定相纯化纽莫康定B0的应用
技术领域
本发明涉及一种新型硅胶基质键合含两个及以上氮原子的氨基酸或天冬氨酸的色谱固定相及基于该固定相的高纯度纽莫康定B0制备方法。其特征在于，除该新型色谱固定相外，优化流动相条件，获得纯度>99％的纽莫康定B0，且各单个杂质的含量<0.1％。该方法可有效改善纽莫康定B0和杂质C0的分离度，通过色谱动力学研究而优化的流动相条件，可提高制备效率，降低溶剂消耗与生产成本。
背景技术
纽莫康定(pneumocandins)是由Zalerionarboricola发酵产生的一类新型环脂肽类天然抗真菌药物，具有环状六肽母核和脂肪酸侧链结构。按照不同脯氨酸在母核上取代的位置差异可以分成4类(式1)：纽莫康定A0是由3-羟基-4-甲基脯氨酸取代、B0则是由3-羟基脯氨酸取代而来、C0母核上取代氨基酸为4-羟基脯氨酸，其中的pneumocandins B0脱侧链后的环状六肽母核是合成pneumocandin类棘白菌素药物醋酸卡泊芬净(caspofunginacetate)的重要原料，卡泊芬净是默克公司开发上市的新广谱抗真菌药物，对包括曲霉和念珠菌属在内的真菌均有良好的抗菌作用；pneumocandins A0和pneumocandins C0是真菌Zalerion arboricola发酵代谢产物之一，为pneumocandins B0类似物之一，二者在发酵液中约为pneumocandins B0的2％～10％(杨渊等，中国抗生素杂志2016年12月第41卷第12期，927页)。
Figure BDA0002292857340000011
式1纽莫康定结构类似物结构式
纽莫康定B0一般通过菌种发酵产生，中国专利201810070947.8公开了制备纽莫康定B0的发酵方法，可得到纽莫康定B0的量约为2.6g/L的发酵液。中国专利201711357884.6公开了纽莫康定B0的提纯与精制方法，含纽莫康定B0的发酵液经大孔树脂富集后，用苯基聚合物纳米微球吸附，结晶得到纯度为98％左右的纽莫康定B0。获得较高纯度的纽莫康定B0后，一般采用亲水模式的高效液相色谱对其进一步纯化，以使杂质含量低于0.1％。中国专利201610628975.8、201611236860.0、201610232761.9均公开了高效分离纯化纽莫康定的方法，采用硅胶、三元溶剂体系或乙醇/水流动相体系，或采用硅胶表面修饰羟基、羧基、氨基、酰胺基、氰基的亲水分离填料，可获得纽莫康定B0的纯度>99％，C0、A0的含量<0.1％。可见，发展制备高纯度纽莫康定B0的方法具有重要的应用价值。
本发明涉及新型硅胶基质键合含两个及以上氮原子的氨基酸或天冬氨酸的色谱固定相及基于该固定相的高纯度纽莫康定B0制备方法。除该新型色谱固定相外，优化流动相条件，获得纯度>99％的纽莫康定B0，且各单个杂质的含量<0.1％。该方法可有效改善纽莫康定B0和杂质C0的分离度，通过色谱动力学研究而优化的流动相条件，可提高制备效率，降低溶剂消耗与生产成本。
发明内容
本发明涉及新型硅胶基质键合含两个及以上氮原子的氨基酸或天冬氨酸的色谱固定相及基于该固定相的高纯度纽莫康定B0制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
1)硅胶键合氨基酸固定相的结构：
Figure BDA0002292857340000021
R为精氨酸(ARG)、赖氨酸(LYS)、天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)、色氨酸(TRP)、组氨酸(HIS)、天冬氨酸(ASP)中一种或二种以上除去一端的氨基和羧基后的侧链。
2)利用上述固定相及优化的流动相的液相色谱体系分析或分离纯化纽莫康定的方法，通过纯化制备获得高纯的纽莫康定B0、降低杂质的含量。
所述步骤1)固定相的粒径5～100μm，孔径
Figure BDA0002292857340000022
所述步骤2)纯化后纽莫康定B0的纯度>99％，各杂质含量均<0.1％。
所述步骤2)流动相是有机溶剂和水混合作为洗脱液。
所述步骤2)有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种。
所述步骤2)有机溶剂和水混合作为洗脱液的体积比例为：99.8/0.2～20/80。
所述步骤2)该液相色谱体系中，采用1/20～1/10倍柱体积/分钟(BV/min)的流速，以提高制备效率并降低成本。
所述步骤2)该液相色谱体系中，采用色谱柱的内径为2.1～1000mm。
所述步骤2)该液相色谱体系中，采用色谱柱的长(高)度为100～1000mm。
所述步骤2)分离纯化体系的合格馏分收集方式为：按时间接取或按色谱峰接取的一种或两种。
所述步骤2)两种极性不同溶剂混合溶解纽莫康定粗品，样品浓度为：10～1000mg/mL。
所述步骤2)分离纯化体系的固体载样量为：0.01％～5％。
本发明具有如下优点：
1.分离选择性好。本发明采用含两个及以上氮原子的氨基酸和/或天冬氨酸键合的硅胶基质亲水色谱模式的固定相分离、纯化纽莫康定B0，与杂质C0的分离选择性好，分离度大。
2.除固定相外，本发明优化的流动相体系适合工业化生产，且重复性好，回收率高，成本低。
3.本发明纯化得到的纽莫康定B0(HPLC纯度)>99％，各单个杂质含量<0.1％。
附图说明
图1为不同固定相(硅胶、ARG、二醇)分析纽莫康定样品的谱图
图2为不同固定相(ARG、ASN、ASP、LYS)分析纽莫康定样品的谱图
图3为采用精氨酸固定相载样量0.067％纯化纽莫康定的制备谱图
图4为采用精氨酸固定相载样量0.33％纯化纽莫康定的制备谱图
图5为载样量0.33％纯化纽莫康定时合格馏分的分析谱图
具体实施方式
实施例1
硅胶基质键合精氨酸固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(氨水调pH至8.5)，然后加入10g精氨酸，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得精氨酸键合固定相。结构如下：
Figure BDA0002292857340000041
实施例2
硅胶基质键合赖氨酸固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积400m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入100mL甲醇，搅拌均匀，然后滴加6mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(氨水调pH至8.5)，然后加入8g赖氨酸，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得赖氨酸键合固定相。结构如下：
Figure BDA0002292857340000042
实施例3
硅胶基质键合天冬酰胺固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积280m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入150mL乙腈，搅拌均匀，然后滴加6mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(氨水调pH至8.5)，然后加入10g天冬酰胺，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得天冬酰胺键合固定相。
结构如下：
Figure BDA0002292857340000051
实施例4
硅胶基质键合谷胺酰胺固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加10mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液(氨水调pH至7.5)，然后加入10g谷胺酰胺，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得谷氨酰胺键合固定相。
结构如下：
Figure BDA0002292857340000052
实施例5
硅胶基质键合组氨酸固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(氨水调pH至9.5)，然后加入10g组氨酸，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得组氨酸键合固定相。结构如下：
Figure BDA0002292857340000061
实施例6
硅胶基质键合色氨酸固定相的制备：
称取10g球形硅胶(粒径为5μm，孔径为10nm，比表面积300m2/g)，置于250mL玻璃烧瓶中，加入150mL体积浓度为5％的盐酸溶液，加热回流12小时，冷却至室温，过滤，水洗至中性，150℃干燥24小时。
将干燥后的硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，在通入干燥的氮气的条件下，向硅胶中加入50mL甲苯，搅拌均匀，然后滴加6mL的3-缩水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，于115℃条件回流搅拌反应16小时。反应体系过滤，依次用甲醇、水、四氢呋喃、甲醇洗涤，产物在80℃条件下干燥12小时即得环氧基硅胶。
将干燥后的环氧基硅胶置于100mL三口玻璃瓶中，加入30mL 0.1mol/L的碳酸氢钠水溶液(氨水调pH至8.5)，然后加入12g色氨酸，65℃条件下搅拌24小时，反应体系冷却至室温，减压过滤并用甲醇、水、甲醇洗涤，固体产品在80℃条件下干燥12小时即得色氨酸键合固定相。结构如下：
Figure BDA0002292857340000062
实施例7
高效液相色谱法，采用不同固定相分析纽莫康定B0的比较：
采用250mm长、4.6mm内径的HPLC分析柱，比较纽莫康定B0及其类似物在不同固定相的保留和选择性。不同的固定相包括：标准二氧化硅(硅胶)、硅胶基质键合二醇基、硅胶基质键合精氨酸(ARG)。固定相均为5μm粒径和
Figure BDA0002292857340000071
的孔径。流动相为丙酮、水，等度洗脱(丙酮/水＝90/10)，采用0.7mL/min的流速，276nm检测谱图如图1所示。不同固定相上纽莫康定B0和C0的选择性如表1所示。
表1
Figure BDA0002292857340000072
实施例8
高效液相色谱法，采用不同固定相分析纽莫康定B0的比较：
采用250mm长、4.6mm内径的HPLC分析柱，比较纽莫康定B0及其类似物在不同固定相的保留和选择性。不同的固定相包括：硅胶基质键合赖氨酸(LYS)、硅胶基质键合精氨酸(ARG)、硅胶基质键合天冬氨酸(ASP)、硅胶基质键合天冬酰胺(ASN)。固定相均为5μm粒径和
Figure BDA0002292857340000074
的孔径。流动相为丙酮、水，等度洗脱(丙酮/水＝85/15)，采用1.0mL/min的流速，220nm检测谱图如图2所示。不同固定相上纽莫康定B0和C0的选择性如表2所示。
表2
Figure BDA0002292857340000073
实施例9
采用上述实例制备的精氨酸固定相纯化纽莫康定B0：
样品：NMK19001样品用80％丙酮水配成100mg/mL
色谱柱：ARG(4.6×250mm，5μm，R2015122801，19071804C)
流动相：D：丙酮，C：水
洗脱条件：D：C＝90：10
流速：0.3mL/min
柱温：30℃
检测：210nm
进样体积：20μL(载样量0.067％)
制备图如图3所示，按色谱峰接取馏分，其中回收纽莫康定B0馏分，可以得到C0小于0.1％的产品，B0占比99.89％，收率92.45％。
实施例10
采用上述实例制备的精氨酸固定相纯化纽莫康定B0：
样品：NMK19001样品用80％丙酮水配成100mg/mL
色谱柱：ARG(4.6×250mm，5μm，R2015122801，19071804C)
流动相：D：丙酮，C：水
洗脱条件：D：C＝90：10
流速：0.3mL/min
柱温：30℃
检测：210nm
进样体积：100μL(载样量0.33％)
制备图如图4所示，按时间接取馏分，回收42.5～46.5min馏分，色谱分析后(图5)，可以看出产品中C0小于0.1％，B0占比99.81％，收率87.99％。
实施例11
其他条件与实施例10相同，不同之处在于，将实施例9中的填料粒径变为60μm。
实施例12
其他条件与实施例10相同，不同之处在于，将实施例9中的流速变为0.4mL/min。
实施例13
其他条件与实施例10相同，不同之处在于，将实施例9中的载样量变为0.8％。
实施例14
其他条件与实施例10相同，不同之处在于，将实施例9中的丙酮变为乙腈。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。饭根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硅胶基质固定相，其特征在于：固定相为硅胶基质，硅胶表面键合含两个以上氮原子氨基酸或天冬氨酸中的一种或二种以上。
2.按照权利要求1所述固定相，其特征在于：所述含两个以上氮原子氨基酸为精氨酸(ARG)、赖氨酸(LYS)、天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)、色氨酸(TRP)、组氨酸(HIS)中的一种或二种以上。
3.按照权利要求1所述固定相，其特征在于：键合相为氨基-环氧开环反应键合氨基酸，其结构式如下中的一种或二种以上：
Figure FDA0002292857330000011
R为精氨酸(ARG)、赖氨酸(LYS)、天冬酰胺(ASN)、谷氨酰胺(GLN)、色氨酸(TRP)、组氨酸(HIS)、天冬氨酸(ASP)中一种或二种以上除去一端氨基和羧基后的侧链。
4.按照权利要求1或2或3所述固定相，其特征在于：硅胶表面氨基酸键合量为0.05-5mmol/g。
5.按照权利要求1或2或3或4所述固定相，其特征在于：硅胶的粒径5～100μm，硅胶孔径
Figure FDA0002292857330000012
硅胶比表面积50-1000m2/g。
6.一种利用权利要求1-5任一所述固定相在液相色谱体系纯化脂肽过程中的应用。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于：流动相是有机溶剂和水混合作为洗脱液；有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种；有机溶剂和水混合作为洗脱液的体积比例为：99.8/0.2～20/80。
8.按照权利要求6或7所述的应用，其中该液相色谱体系用于纯化脂肽；该脂肽是卡泊芬净的前体，纽莫康定B0。
9.按照权利要求8所述的应用，其特征在于：该液相色谱体系中，采用1/25～1/8倍柱体积/分钟(BV/min)的流速，以提高制备效率并降低成本；采用色谱柱的内径为2.1～1000mm；采用色谱柱的长(高)度为100～1000mm；分离纯化体系的合格馏分收集方式为按时间接取或按色谱峰接取的一种或两种。
10.按照权利要求8所述的应用，采用两种极性不同溶剂混合溶解纽莫康定粗品，样品浓度为：10～1000mg/mL，如采用有机溶剂和水混合作为样品溶剂、有机溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、丙酮中的一种或几种、有机溶剂和水混合作为洗脱液的体积比例为：99.8/0.2～20/80；分离纯化体系的固体载样量为0.01％～5％；纯化后纽莫康定B0的纯度>99％，其他单个杂质含量均<0.1％。
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