CN104841375A - 一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种制备和应用具有特殊功能的高效疏水相互作用色谱(HPHIC)填料的方法。将细胞膜上的两性功能分子胆固醇作为固定相配基，与硅胶基质表面化学修饰获得了仿生的HPHIC填料。该填料装填的HPHIC柱采用盐-水为洗脱体系，可应用于天然蛋白质分离，变性溶菌酶、重组人酪氨酸激酶配体(rhFL)包涵体和重组人干细胞因子(rhSCF)的复性与同时纯化。

Description

一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用色谱填料制备与应用
发明领域
本发明涉及一种以胆固醇为配基的高效疏水相互作用的色谱填料的制备方法及其用于蛋白质复性与纯化，属于高效液相色谱技术和生物工程技术交叉领域。
背景技术
胆固醇是生物膜上的主要组成部分。在HPLC中，以胆固醇分子作为色谱配基，采用表面化学修饰合成色谱填料引起了色谱工作者的极大兴趣，并取得一定的进展[Witkiewicz Z.，Mazur J.LC GC，1990，8(3)：224-236；Pesek J.J.，Matyska M.T.Interface Science，1997，5(2)：103-117]。已有的文献报道，以胆固醇为配基的色谱填料主要集中于反相液相色谱(RPLC)研究，其高效分离性能已得到验证和应用[Soukup J.，Jandera P.Journal of Chromatography A，2012，1228：125-134]。对于具有活性功能的蛋白质而言，RPLC仅用于蛋白质分析。
而与反相液相色谱法机理相同的疏水相互作用色谱(HIC)是采用流动相为盐-水洗脱体系，色谱条件温和，被广泛应用于天然活性蛋白质分离和变性蛋白的复性与同时纯化。目前，在HIC中应用最多的配基有两类：一类是线性链烷基(如丁基或辛基)和芳香基团(如苯基)，另一类是疏水性温和的配基有聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)等[Hubert P.，et al.Joumalof Chromatography A，1991，539(2)：297-306]。前者配基所构成的填料容易导致蛋白质，尤其是变性蛋白难以洗脱。后者疏水性弱的配基在变性蛋白复性过程中，会造成吸附载量下降、变性蛋白易于直接穿透的缺点，从而使蛋白质的复性效率很低。
本发明以胆固醇分子作为色谱配基，制备一种硅胶基质的高效疏水相互作用色谱填料，并将该填料应用于天然蛋白质的分离和变性蛋白的复性与纯化。
发明内容
本发明的目的在于将细胞膜上的两性功能分子胆固醇作为色谱填料配基，制备一种具有特殊功能的硅胶基质HPHIC填料，并对还原变性溶菌酶、重组人Flt3ligand(FL)包涵体和重组人干细胞因子(rhSCF)进行复性与同时纯化，以期克服HPHIC配基在变性蛋白复性与纯化中由于其疏水作用较强或较弱会造成吸附载量过强或下降、变性蛋白难于洗脱或易于直接穿透的缺点。
为了实现上述任务，本发明采取解决技术方案如下：
1.以空白基质为原材料，以胆固醇及其衍生物为配基，制备结构式(I)所示胆固醇配基的硅胶基质高效疏水相互作用色谱填料；
其中，R基团为CH(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)2，CH(CH3)CH2CH2COOH，CH(CH3)CH2CH2CH(CH2CH3)CH(CH3)2，CH(CH3)CH2CH2CHC(CH3)2等。
2、所述结构式(I)的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤：
(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；
(2)将环氧基硅胶与胆固醇以及胆固醇类衍生物反应得到高效疏水相互作用色谱填料；
(3)将环氧基硅胶与含有羧基的胆固醇类衍生物反应得到具有高效疏水相互作用/弱阳离子交换作用色谱填料；
3、所述胆固醇配基的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)所用的活化硅胶经1∶10～1∶20(g/mL，m/v)盐酸活化2～6小时，用蒸馏水洗至中性，100～150℃真空干燥12～24小时。其孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。
(2)按照1∶1～1∶2(g/mL，m/v)将干燥的活化硅胶和硅烷偶联剂分别加入装有NaAc缓冲液的三颈圆底烧瓶中，调节温度80～90℃，机械搅拌反应3～5h，然后依次用NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥即可得到环氧基硅胶。
所述NaAc缓冲溶液浓度为45～55mmol/L，pH值为4.5～6.5。
(3)按照1∶0.5～1∶1(g/mL，m/v)将干燥的环氧基硅胶和胆固醇或胆酸分别加入到干燥三颈瓶中，再依次加入1∶1∶0.1(mL/mL/mL，v/v/v)的无水乙醚、干燥的1，4-二氧六环以及三氟化硼乙醚，在4～5℃条件下机械搅拌反应3.5～4.5h。反应结束之后分别用无水乙醚、丙酮、甲醇、水清洗填料，真空干燥得到色谱填料。
4、所述胆固醇配基的高效疏水相互作用色谱填料应用于模型的变性蛋白复性与纯化，其特征在于：
(1)将该色谱填料用于还原变性的溶菌酶的复性与纯化。当在流动相中添加了2.0～3.0mol/L脲时，其质量回收率及活性回收率分别为80～90％和95～98％。
(2)将该色谱填料用于重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3ligand，rhFL)的复性与纯化。将rhFL变性抽提液直接进样流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分质量回收率为45～50％，纯度为95～97％，生物比活为7.2～8.0×108IU/mg。
(3)将该色谱填料用于重组人干细胞因子(Recombined human stem cell factor，rhSCF)的复性与纯化。将rhSCF变性抽提液直接进样流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分纯度为95～98％，质量回收率为55～65％，生物比活为1.1～1.3×106IU/mg。
(4)所述的流动相A为2.5～3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0～50.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0～7.4；或者所述的流动相A分别为2.5～3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0～50.0mmol/L KH2PO4，2.5～3.5mol/L Urea，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH2PO4，2.5～3.0mol/L Urea，pH 7.0～7.4。
(5)所述的流动相A和流动相B或称为平衡缓冲液和洗脱缓冲液，不同是均添加2.5～3.0mol/L Urea。
本发明的优点在于：(1)利用细胞膜的功能分子胆固醇及其衍生物作为色谱填料的配基，将其修饰在填料基质上，具有与蛋白质的良好生物兼容性，能有效抑制变性蛋白分子之间相互聚集，提高变性蛋白在柱上折叠效率；(2)该填料装填的色谱柱对蛋白质分离，变性蛋白复性与纯化具有很好的选择性和负载量，易于规模化；(3)该填料制备工艺简单成熟，易于控制和放大。
附图说明
图1高效疏水相互作用色谱填料合成的红外色谱表征图。
图中：横坐标为红外光谱的波数，纵坐标为红外光谱的百分透过率。
图2高效疏水相互作用色谱对标准蛋白分离的色谱图。
图中：横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；色谱峰顺序为1，溶剂峰；2，细胞色素-C(Cyt-C)；3，肌红蛋白(Myo)；4，溶菌酶(Lys)；5，α-糜蛋白酶原(α-ChyA)；6，胰岛素(Ins)；色谱条件为：流动相A：3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0；流动相B：20.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B 10min；检测波长280nm。
图3高效疏水相互作用色谱填料对变性溶菌酶复性与纯化的色谱图。
图中：横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；标记“1”为天然溶菌酶，标记“2”为复性与纯化的溶菌酶，“*”为复性与纯化的溶菌酶；
图3A：流动相中未添加脲。其中流动相A为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，pH7.0；流动相B为50.0mmol/L KH2PO4，pH7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B10min；检测波长280nm。
图3B：流动相中添加脲。其中流动相A为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/LUrea，pH7.0；流动相B 50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B 10min；检测波长280nm。
图4高效疏水相互作用色谱填料对重组人酪氨酸激酶配体(rhFL)复性与同时纯化的色谱图。图中：横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；“*”为复性与纯化的rhFL色谱峰；色谱条件：流动相A为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0；流动相B为50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B 10min；检测波长280nm。
图5高效疏水相互作用色谱填料对重组人干细胞因子(rhSCF)复性与同时纯化的色谱图。
图中：横坐标为保留时间(time)，纵坐标为波长280nm处紫外吸收值(mAU)；“*”为复性与纯化rhSCF；色谱条件：流动相A为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，pH7.0；流动相B为50.0mmol/L KH2PO4，pH7.0；流速1.0ml/min。0-100％B线性梯度洗脱30min，延长100％B10min；检测波长280nm。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述：
实施例1
(1)高效疏水相互作用色谱填料制备
以高纯球状硅胶作为空白基质，首先进行酸处理，将硅胶用20％盐酸120℃回流3-4小时，冷却，用蒸馏水反复洗涤，直到溶液显中性，真空干燥过夜。然后将酸处理好的硅胶用γ-缩水甘油氧丙基三甲氧基硅烷(TM-560)进行活化，即在50mmol/L的醋酸钠溶液中，90℃条件下缓慢滴加TM-560适量与硅胶反应4h后，依次用50mmol/L的醋酸钠溶液、甲醇、水洗涤干净，真空干燥。胆固醇与环氧化硅胶的反应在无水乙醚、干燥的1，4-二氧六环溶液中进行，加入2.0mL的三氟化硼乙醚作催化剂，在5℃搅拌下反应4h，然后用无水乙醚、丙酮、甲醇、水反复洗涤，真空干燥，过夜即可。利用红外光谱图表征(见图1)，确认填料结构如结构式(I)所述。
(2)高效疏水相互作用色谱填料分离性能和选择性考察
以细胞色素-C(Cyt-C)、肌红蛋白(Myo)、溶菌酶(Lys)、α-糜蛋白酶原(α-ChyA)和胰岛素(Ins)五种蛋白作为模型蛋白，考察该填料的分离性能。将装填的色谱柱(100×4.6mm I.D.)用流动相A(3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0)平衡，将上述5种标准蛋白混合液50μL直接进样，然后线性梯度0-100％B(20.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0)洗脱30min，流速1.0ml/min，并延长100％B 10min，检测波长为280nm，见图2。
(3)高效疏水相互作用色谱填料对变性溶菌酶的复性与同时纯化
将装填的色谱柱(100×4.6mm I.D.)用平衡缓冲液(3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/LKH2PO4，pH7.0)平衡，将溶解于变性缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，8.0mol/L Urea，1.0mmol/LEDTA，0.15mol/L DTT，pH 8.5)还原变性溶菌酶10μL吸附上样，采用0-100％B(50.0mmol/LKH2PO4，pH7.0)线性梯度30min，延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集色谱馏分进行分析。与此同时，将5mg取天然溶菌酶溶解于缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH 8.5)中，按照相同色谱条件吸附-洗脱，作为参照，见图3A。
实施例2
与实施例1类似，不同的是步骤(3)用高效疏水相互作用色谱填料对变性溶菌酶复性与同时纯化，其所用流动相A(平衡缓冲液)为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0，流动相B(复性缓冲液)为50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0进行复性洗脱，洗脱方式为0-100％B线性梯度30min，并延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集色谱峰，见图3B。
实施例3
与实施例1类似，不同的是步骤(3)用高效疏水相互作用色谱填料对重组人酪氨酸激酶配体(rhFL)复性与同时纯化，该包涵体溶解于8.0mol/L Urea，1mmol/L EDTA，50.0mmol/LDDT，pH 8.0缓冲液中，得到rhFL包涵体变性抽提液。用流动相A(平衡缓冲液)为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0平衡，将250μL变性抽提液吸附上样，采用0-100％B(50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0)线性梯度洗脱30min，延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集色谱馏分，见图4。
实施例4
与实施例1类似，不同的是步骤(3)用高效疏水相互作用色谱填料对重组人干细胞因子(rhSCF)复性与同时纯化，该包涵体溶解于8.0mol/L Urea，10mmol/L DTT，1mmol/L EDTA，50.0mmol/L Tris-HCl，pH8.0缓冲液中，得到rhSCF包涵体变性抽提液。用流动相A(平衡缓冲液)为3.0mol/L(NH4)2SO4，50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0平衡，将250μL变性抽提液吸附上样，然后采用0-100％B(50.0mmol/L KH2PO4，3.0mol/L Urea，pH7.0)线性梯度洗脱30min，延长100％B 10min，流速为1ml/min，收集色谱馏分，见图5。

Claims (5)

1.结构式(I)所示高效疏水相互作用色谱填料
其中，R基团可以是：CH(CH3)CH2CH2CH2CH(CH3)2，CH(CH3)CH2CH2COOH，CH(CH3)CH2CH2CH(CH2CH3)CH(CH3)2，CH(CH3)CH2CH2CHC(CH3)2等。
2.权利要求1高效疏水相互作用色谱填料结构式(I)中的色谱配基为胆固醇类衍生物即环戊烷多氢菲的衍生物，如胆固醇；
3.权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料制备方法，包括以下步骤：
(1)将硅烷偶联剂与活化硅胶反应得到环氧基硅胶；
(2)将环氧基硅胶与胆固醇以及胆固醇类衍生物反应得到高效疏水相互作用色谱填料；
(3)将环氧基硅胶与含有羧基的胆固醇类衍生物反应得到具有高效疏水相互作用/弱阳离子交换作用色谱填料；
4.根据权利要求3所述高效疏水相互作用色谱填料制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)所用的活化硅胶经1∶10～1∶20(g/mL，m/v)15～20％盐酸活化2～6小时，用蒸馏水洗至中性，100～150℃真空干燥12～24小时。其孔径在之间，粒径为5～10μm的球状多孔硅胶。
(2)按照1∶1～1∶2(g/mL，m/v)将干燥的活化硅胶和硅烷偶联剂分别加入装有NaAc缓冲液的三颈圆底烧瓶中，调节温度80～90℃，机械搅拌反应3～5h，然后依次用NaAc缓冲液、甲醇、水依次洗涤干净，真空干燥即可得到环氧基硅胶。
所述NaAc缓冲溶液浓度为45～55mmol/L，pH值为4.5～6.5。
(3)按照1∶0.5～1∶1(g/g，m/m)将干燥的环氧基硅胶和胆固醇或胆酸分别加入到干燥三颈瓶中，再依次加入1∶1∶0.1(mL/mL/mL，v/v/v)的无水乙醚、干燥的1，4-二氧六环以及三氟化硼乙醚，在4～5℃条件下机械搅拌反应3.5～4.5h。反应结束之后分别用无水乙醚、丙酮、甲醇、水清洗填料，真空干燥得到色谱填料。
5.权利要求1所述的高效疏水相互作用色谱填料在变性蛋白的复性与纯化应用，其特征在于
(1)将该色谱填料用于还原变性的溶菌酶的复性与纯化。当在流动相中添加了2.0～3.0mol/L脲时，其质量回收率及活性回收率分别为80～90％和95～98％。
(2)将该色谱填料用于重组人酪氨酸激酶配体(Recombined human Flt3 ligand，rhFL)的复性与纯化。将rhFL变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分质量回收率为45～50％，纯度为95～97％，生物比活为7.2～8.0×108IU/mg。
(3)将该色谱填料用于重组人干细胞因子(Recombined human stem cell factor，rhSCF)的复性与纯化。将rhSCF变性抽提液直接进样至流动相A平衡的色谱柱中，在优化色谱条件下，采用0-100％流动相B的30min线性梯度洗脱，得到的目标峰馏分纯度为95～98％，质量回收率为55～65％，生物比活为1.1～1.3×106IU/mg。
(4)所述的流动相A为2.5～3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0～50.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH2PO4，pH 7.0～7.4；或者所述的流动相A分别为2.5～3.0mol/L(NH4)2SO4，20.0～50.0mmol/L KH2PO4，2.5～3.5mol/L Urea，pH 7.0～7.4；流动相B为20.0～50.0mmol/L KH2PO4，2.5～3.0mol/L Urea，pH 7.0～7.4。
(5)所述的流动相A和流动相B或称为平衡缓冲液和洗脱缓冲液，不同是均添加2.5～3.0mol/L Urea。
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