CN104689796B

CN104689796B - 一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料及其制备方法

Info

Publication number: CN104689796B
Application number: CN201310646757.3A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 单圆鸿; 窦阿波; 石先哲; 路鑫
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2013-12-04
Filing date: 2013-12-04
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2033-12-04
Also published as: CN104689796A

Abstract

本发明公开了一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱及其制备方法。首先合成杂化整体柱骨架，在其表面物理吸附一定厚度的氧化亚铜纳米立方体，经硫化钠溶液处理得到更加稳定的硫化亚铜，即得到纳米硫化亚铜修饰的整体柱。该方法得到的整体柱具有常规整体柱的易制作、高渗透性特点，同时纳米硫化亚铜的引入提供了特异性吸附位点，对羧基，氨基以及氮杂环结构有较强的吸附作用，而且显著提高了材料的比表面积。将该材料制备成毛细管固相萃取柱，实现了碱性条件下牛奶中硫酸卡那霉素的高容量富集。

Description

一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料及其制备方法

技术领域

本发明属于液相色谱柱材料领域，具体涉及一种纳米材料修饰的整体柱及其制备方法。

背景技术

固定化金属离子亲和色谱在过去的几十年中广泛应用于生物大分子，代谢及环境小分子的选择性富集，其中比较常见的有Cu²⁺，Fe³⁺，Ni²⁺，Co²⁺，Zr⁴⁺等，不同的金属离子具有不同的吸附特性。但金属离子对溶液pH较敏感，尤其是碱性溶液条件会造成金属氧化物沉淀附着而显著降低吸附容量，同时强洗脱液容易造成金属离子的流失。为了克服这些问题，金属氧化物亲和色谱得到开发，其中纳米氧化锆，氧化铈，三氧化二铁的亲和色谱材料均有报道，这种材料有效解决了碱性溶液敏感以及金属离子流失的问题，并在磷酸化肽和磷酸化蛋白的选择性富集研究中取得了良好的结果。然而，由于铜等金属的氧化物稳定性较差，无法用于目标分子的亲和富集，使得金属氧化物亲和色谱的开发和应用受到了一定的限制。然而，大部分的金属硫化物的稳定性较好，且有文献报道了硫化锌对组氨酸修饰蛋白的吸附性能（Sapsford,K.E.;Pons,T.;Medintz,I.L.;et al.,J.Phys.Chem.C2007,111,11528-11538），说明金属硫化物有作为亲和富集材料的可能。

整体柱因其合成简单，易于微型化，以及灵活的表面修饰而在色谱的各个领域都有所应用。纳米粒子用于修饰整体柱表面，不仅可以增加其比表面积，还是表面改性的一个好方法。本发明首次合成了纳米硫化亚铜修饰的整体柱，并探讨了金属硫化物用做亲和色谱的可能性，实现了牛奶中硫酸卡那霉素的选择性富集，与铜离子亲和色谱材料相比，该材料在碱性条件下依然保持了大吸附容量。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有选择性吸附特点的整体柱及其制备方法。

一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料，由甲基丙烯酰-POSS笼形混合物和乙烯基咪唑聚合而成的有机-无机杂化骨架，硫化亚铜纳米粒子修饰整体材料表面；对材料表面至表面以下一微米厚度范围内的材料进行元素分析，可知铜元素的原子百分比为1%～8%

该种整体柱以含有咪唑基团的整体材料为骨架，表面修饰纳米氧化亚铜，经硫化钠溶液处理，最终得到纳米硫化亚铜修饰的整体柱。与传统的铜离子螯合色谱相比，该材料可以在碱性条件下实现富集并得到了较大的吸附容量。同时，可根据需要合成小直径和长度的整体柱，以适应微量样品的富集需要。

该发明所述的纳米掺杂整体柱的具体合成方法是：

整体材料骨架的合成：将内径为100～530μm的石英毛细管依次用盐酸（0.1～0.5mol/L），水，氢氧化钠（1mol/L），水，甲醇冲洗，经氮气条件下60～160℃干燥2～6小时后，充满甲醇/3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(1:1，v/v),50℃条件保持15-25小时，再用甲醇冲洗1-2小时,氮气条件下40-60℃干燥1-2小时,两端封好待用。

在离心管中加入一定量的甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，四氢呋喃，PluronicF127，乙烯基咪唑，超声使其彻底溶解，再加入偶氮二异丁腈，超声5～10分钟，之后灌入毛细管中。两端用硅胶密封，50-70℃反应4-8h。整体柱使用前用甲醇冲洗2小时以上，以除去致孔剂和未反应的原料。其中甲基丙烯酰-POSS笼形混合物是由硅氧硅键形成笼形，笼形结构的顶点硅原子数为8,10,12三种的混合物，每个顶点硅原子连有一个甲基丙烯酰取代基。该混合物在sigma公司以及Hybrid Plastics公司均有出售。Pluronic F127、四氢呋喃、乙烯基咪唑、甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，偶氮二异丁腈的质量比为100～150:600～900:20～60:100～150:2～8。

纳米氧化亚铜合成方法：在250mL的梨形瓶里加入5～10mL硝酸铜（0.01mol/L），0.5-1.5g果糖，5-20mL抗坏血酸（0.08mol/L），80～150mL水，搅拌均匀并且在水浴中冷却至10-20度，加入1M的氢氧化钠4～8mL，搅拌下反应20-60min。之后用水清洗两次，甲醇清洗一次，最后溶解在5mL甲醇里待用。

整体材料的纳米修饰方法：将2毫升注射器的金属针头去掉，换成2～5厘米长的整体柱，并用胶水黏牢。将1～2mL纳米粒子甲醇溶液加入到12mL甲醇/乙醇（1:1，v/v,含4%-20%的聚乙二醇200）中，超声使纳米粒子分散，之后使用注射泵将纳米粒子溶液注射到之前合成的毛细管整体柱中，直到柱子均匀变成砖红色。之后甲醇冲洗整体柱3-5小时以冲掉未结合的纳米粒子和聚乙二醇。再用硫化钠的乙醇溶液冲洗整体柱2-5分钟，整体柱由砖红色变成黑色，之后立即用50%乙醇冲洗整体柱直至流出液为中性，即得到纳米硫化亚铜修饰的整体柱。

由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下特点：

1.首次将纳米硫化亚铜修饰在整体柱表面，并用于小分子化合物的富集。

2.纳米硫化亚铜的修饰使整体柱比表面积显著提高，同时保留了整体柱渗透性好，易制作，可根据样品量随意调节固相萃取柱体积的特点。

3.纳米硫化亚铜提供了特异性吸附位点，对含羧基，氨基以及氮杂环的小分子化合物有较强的吸附作用，并可通过简单调节溶液酸碱度实现吸附脱附过程。

4.与铜离子螯合色谱相比，纳米硫化亚铜修饰的整体柱可以在碱性条件下实现硫酸卡那霉素的大容量富集。

附图说明

图1是本发明实施例一纳米硫化亚铜修饰整体柱的合成流程图;

图2是本发明实施例一的整体柱的扫描电镜图;

(A)整体柱骨架×10000

(B)整体柱骨架×50000

(C)Monolith-Cu₂O×10000

(D)Monolith-Cu₂O×50000

(E)Monolith-Cu₂S×10000

(F)Monolith-Cu₂S×50000

图3是本发明实施例一中不同PEG用量对纳米硫化亚铜修饰影响的扫描电镜图（A）0%PEG200（B）4%PEG200（C）8%PEG200（D）12%PEG200

图4是本发明实施例二中自制材料和商品化材料在不同pH条件下对硫酸卡那霉素吸附容量的对比：（A）纳米硫化亚铜修饰的整体柱；（B）镍离子螯合柱填料（NiSepharose6Fast Flow，GE Healthcare)以及由该材料再生得到的铜离子螯合柱填料；

图5是本发明实施例三中纳米硫化亚铜修饰整体柱用于富集牛奶中硫酸卡那霉素的色谱图：(1)加标牛奶富集前；（2）加标牛奶富集后。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细的说明。

实施例一：纳米硫化亚铜修饰的整体柱的制备

杂化整体柱骨架合成：将内径为530μm的石英毛细管用HCl（0.1mol/L）冲洗2小时，用水冲洗至中性后，1mol/L的NaOH溶液冲洗10小时，再分别用水、甲醇各冲洗0.5小时，在氮气条件下160℃干燥5小时，之后将毛细管中充满甲醇/3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(1:1，v/v),50℃条件保持20小时，甲醇冲洗1小时,氮气条件下60℃干燥1小时,两端封好待用。

在离心管中加入120mg甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，850μL四氢呋喃，120mgPluronic F127，40μL乙烯基咪唑，超声使其彻底溶解，再加入2.5mg偶氮二异丁腈，超声后灌入毛细管中。两端用硅胶密封，60℃反应8小时。整体柱使用前用甲醇冲洗5小时，以除去未反应的原料。

纳米氧化亚铜合成方法：在250mL的梨形瓶里加入7.5mL硝酸铜(10mmol/L)，0.9g果糖，15mL抗坏血酸(80mmol/L)，110mL水，搅拌均匀并且在水浴中冷却至15℃，加入5mL的氢氧化钠(1mol/L)，搅拌下反应40min，得到粒径约为20nm的氧化亚铜纳米立方体。产物用水清洗两次，甲醇清洗一次，溶解在8mL甲醇里待用。

整体材料的纳米修饰方法：将1mL纳米粒子甲醇溶液加入到12mL甲醇/乙醇（1:1，v/v，含0～8%的聚乙二醇200）中，超声分散后使用注射泵将纳米粒子溶液注射到之前合成的整体柱中，直到柱子均匀变成砖红色。甲醇冲洗整体柱3小时后用硫化钠的乙醇溶液（20mg/mL）冲洗整体柱直到整体柱由砖红色变成黑色，即纳米氧化亚铜转化成纳米硫化铜，之后立即用50%乙醇冲洗整体柱直到流出液为中性。

图1是纳米硫化亚铜修饰整体柱的反应流程图。图中用含有八个硅原子的甲基丙烯酰-POSS笼形物代替三种POSS笼形物的混合物。图2为整体柱修饰前后的扫描电镜图。可以看到，纳米粒子修饰前后整体柱均呈聚集球状，通孔及骨架尺寸变化不大，有利于高效快速传质。在柱材料表面，可以看到呈现立方体形状的纳米氧化亚铜，经硫化钠处理后，得到纳米硫化亚铜，且修饰的更加均匀。

图3给出了聚乙二醇使用量分别为0%，4%，8%和12%时整体柱的扫描电镜图以及元素分析结果。当聚乙二醇200的含量为0%和4%时，纳米粒子大量聚集，堵住了柱材料的通孔，严重影响传质。当PEG200的含量为8%和12%时，柱材料保持了聚集球状，纳米粒子在柱材料表面均匀的吸附。材料的元素分析结果显示（对材料表面至表面以下一微米厚度范围内的材料进行元素分析）随着聚乙二醇用量的增加，铜原子的含量显著减少，在PEG用量为8%时，铜的原子百分比为4.9%，为该实验的最优值。

实施例二：纳米硫化亚铜修饰整体柱与商品化铜离子柱和镍离子柱在吸附硫酸卡那霉素的效果对比

取0.5mL镍离子螯合柱材料（Ni Sepharose6Fast Flow，GE Healthcare)，缓冲液A（20mM PBS,0.5M氯化钠，50mM EDTA,pH=7.4）清洗三次，每次用量1mL。缓冲液B（20mM PBS,0.5M氯化钠，5mM咪唑,pH=7.4）清洗三次，每次用量1mL。超纯水清洗三次，每次用量1mL。之后用0.5mL氯化铜溶液（0.1M）对材料进行铜离子螯合。再分别用超纯水和缓冲液B清洗三次。去掉上清后，加入0.1mL乙醇保存，即得到了铜离子螯合柱材料。

对合成好的纳米硫化亚铜修饰整体柱与商品化的铜离子柱材料和镍离子柱材料，分别考察其在pH为6、7、8、9、10条件下的吸附容量。具体操作如下：

首先配制上述五种pH的5mM甲酸铵（40%乙腈），并分别用其配制硫酸卡那霉素（40μg/mL）。

纳米硫化亚铜修饰的整体柱的合成过程同实施例一。取一根纳米硫化亚铜修饰整体柱2.5cm，用pH6的甲酸铵溶液平衡，之后硫酸卡那霉素（40μg/mL）上样1mL，检测流出液以确定超过其吸附容量，0.1mL90%乙腈弱洗,之后用0.12mL洗脱液（80mM甲酸铵，0.16%乙酸，20%乙腈）洗脱。其他pH条件下的实验过程同上。

分别取铜离子螯合柱材料和镍离子螯合柱材料30μL,40%乙腈溶液1mL用于洗去原有的缓冲液，再用pH6的甲酸铵溶液平衡，之后加入1mL硫酸卡那霉素(40μg/mL)，充分作用0.5小时，检测上清液以保证超过其吸附容量，之后用1mL pH6的甲酸铵溶液清洗掉非特异性吸附，最后用0.12mL洗脱液（80mM甲酸铵，0.16%乙酸，20%乙腈）洗脱。其他pH条件下的实验过程同上。

三种材料处理后得到的洗脱液用质谱MRM模式采集数据，峰面积用于作图，结果见图4。

图4中纳米硫化亚铜修饰整体柱随着pH的增加，吸附容量显著增加。而商品化的铜离子和镍离子柱材料，随着pH的增加，吸附容量显著降低。

由于金属硫化物和金属离子都可定义为路易斯酸，所以都倾向于在碱性条件下吸附路易斯碱，在酸性条件下目标物质通过质子化而得到脱附。所以本实验的两种材料在富集硫酸卡那霉素时，都采用了酸性甲酸铵溶液进行脱附。而在吸附过程中，对于金属离子型亲和色谱材料在碱性条件下易在材料表面形成一层金属氧化物沉淀而显著降低其螯合性能，所以只能在中性条件下富集目标物质。而对于硫化亚铜材料，则有效避免了碱性条件下吸附能力降低的问题，从而实现了在碱性条件下的大容量富集。

实施例三：纳米硫化亚铜修饰整体柱用于牛奶中硫酸卡那霉素的富集

购自超市的鲜牛奶10mL，加入硫酸卡那霉素配置成1μg/mL，并静置10分钟使其充分作用，加入1.25mL三氯乙酸（10%），涡旋30s，超声15min,离心后取150μL上清用于LC-MS检测，再取6mL上清，加350μL氢氧化钠（1M）和4.23mL乙腈，离心后去上清用于固相萃取。

取纳米硫化亚铜修饰的整体柱3cm，pH10的缓冲液平衡，之后上样1.5mL,0.1mL90%乙腈用于弱洗，之后100μL洗脱液（80mM甲酸铵，0.16%乙酸，20%乙腈）洗脱并用于LC-MS分析。图5为富集前后的硫酸卡那霉素检测MRM图。

本发明得到的整体柱具有常规整体柱的易制作、高渗透性特点，同时纳米硫化亚铜的引入提供了特异性吸附位点，对羧基，氨基以及氮杂环结构有较强的吸附作用，而且显著提高了材料的比表面积。将该材料制备成毛细管固相萃取柱，实现了碱性条件下牛奶中硫酸卡那霉素的高容量富集。

Claims

1.一种纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料，其特征在于：由甲基丙烯酰-POSS笼形混合物和乙烯基咪唑聚合而成的有机-无机杂化骨架，硫化亚铜纳米粒子修饰整体材料表面；对材料表面至表面以下一微米厚度范围内的材料进行元素分析，可知铜元素的原子百分比为1％～8％；

通过自由基聚合方法得到整体柱骨架，将合成的氧化亚铜纳米粒子修饰在整体柱表面，再经硫化钠溶液处理，最终得到纳米硫化亚铜修饰的整体柱。

2.一种权利要求1所述整体柱材料的制备方法，其特征在于：通过自由基聚合方法得到整体柱骨架，将合成的氧化亚铜纳米粒子修饰在整体柱表面，再经硫化钠溶液处理，最终得到纳米硫化亚铜修饰的整体柱。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成整体柱骨架，使用的交联剂为甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，单体使用乙烯基咪唑，PluronicF127为致孔剂，四氢呋喃为溶剂，偶氮二异丁腈为引发剂，在石英毛细管中热引发得到整体柱骨架，其中Pluronic F127、四氢呋喃、乙烯基咪唑、甲基丙烯酰-POSS笼形混合物，偶氮二异丁腈的质量比为100～150:600～900:20～60:100～150:2～8。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成氧化亚铜纳米粒子使用硝酸铜为铜源，果糖和抗坏血酸为还原剂，碱性水溶液中常温反应得到氧化亚铜纳米立方体，粒径在15-35纳米之间，其中，摩尔浓度为10mmol/L的硝酸铜、果糖、摩尔浓度为80mmol/L的抗坏血酸、摩尔浓度为1mol/L的氢氧化钠、水的质量比为5～15:0.5～1.5:10～20:3～8：60～200。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：合成的氧化亚铜纳米粒子分散在甲醇/乙醇/聚乙二醇200的混合液中，甲醇：乙醇：聚乙二醇200的质量比为30～60:30～60：1～10，之后通过注射泵将其灌注到整体柱中，直到整体柱均匀的变成砖红色；

之后将整体柱用质量体积浓度为10～40mg/mL的硫化钠的乙醇溶液冲洗，将砖红色的氧化亚铜转化成黑色的硫化亚铜。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：得到的纳米硫化亚铜修饰的整体柱材料内径为100-530微米，长度为2-10厘米。