CN107649103B - 基于原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法。制备基柱多孔聚合物整体柱原料的质量组成：溴化亚铜0.34‑0.68%，乙二醇二甲基丙烯酸酯41‑46%，甲醇26‑36%，正己烷20‑30%，2‑溴丙酸乙酯0.14‑0.28%，五甲基二乙烯三胺0.42‑0.84%；再利用原子转移自由基聚合在基柱多孔聚合物整体柱接枝硼亲和聚合物链，制备硼亲和整体柱，原料的质量组成：4‑乙烯基苯硼酸3.3‑6.4%，五甲基二乙烯三胺0.23‑0.45%，双蒸水12‑20%，异丙醇75‑84%，水合肼（80%）0.45‑0.86%，溴化亚铜0.19‑0.28%。本发明制备方法简单，对顺二羟基类物质具有特异性吸附能力，且亲和力高、容量高，具有广阔的应用前景。

Description

基于原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种基于原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法，具体是首先基于原子转移自由基聚合制备含表面引发剂的多孔整体柱基柱，再利用原子转移自由基聚合在多孔整体柱基柱内表面接枝硼亲和聚合物链，制备硼亲和整体柱。该整体柱对于含顺二羟基基团的化合物，如邻苯二酚、腺苷、迷迭香酸、肾上腺素、糖蛋白等，具有特异性吸附能力。
背景技术
原子转移自由基聚合（ATRP）是最具工业化前景的活性/可控自由基聚合方法之一，其产物分子量分布窄、链结构规整，且反应条件温和、反应过程易控、可聚合的单体种类多。表面引发ATRP（SI-ATRP）特别适合于固体材料表面接枝聚合物，特别是表面含有引发剂的固体材料。固体材料上的引发剂为聚合物链的起点，聚合物链长度随聚合时间延长而增长，固体材料上引发剂的密度决定聚合物链密度（参见Chen S., Dong X., Zha L.,Progress in Chemistry, 2015, 27, 831-840）。
硼亲和整体柱是对顺二羟基类化合物具有选择性识别的固定相材料，可用于分离富集糖、儿茶酚类、糖肽、核苷、糖蛋白等物质。在较高pH条件下，硼酸配基能与顺二羟基（顺二羟基类化合物）共价结合形成五元（或六元）环状酯，该酯在酸性条件下解离，从而释放出顺二羟基类化合物，达到有效的分离富集作用。Li等通过一步反应，制备毛细管硼亲和整体柱，其对邻苯二酚的最大结合量为49.5 μmol g-1（参见Li Q., Lü C., Li H., Liu Y.,Wang H., Wang X., Liu Z., J. Chromatogr. A, 2012, 1256, 114-120）。Yang等通过一步法，以金属有机化合物凝胶为致孔剂，制备大孔硼亲和整体柱，其对邻苯二酚的最大结合量为79.9 μmol g-1（参见Yang F., Lin Z., He X., Chen L., Zhang Y., J.Chromatogr. A, 2011, 1218, 9194-9201）。Li等通过三步，以树枝状PEI为放大骨架，制备毛细管硼亲和整体柱，其对腺苷的最大结合量为102.1 μmol g-1（参见Li D., Li Y., X.Li Y., Bie Z., Pan X., Zhang Q., Liu Z., J. Chromatogr. A, 2015, 1384, 88-96）。但已有硼亲和整体柱普遍结合容量低或制备过程繁琐。所以，值得进一步研究高结合容量的硼亲和整体柱。
发明内容
本发明的目的在于提供一种原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法，可以克服现有硼亲和整体柱吸附容量低的缺点。利用两步ATRP反应方法制备硼亲和整体柱，该整体柱吸附容量高，对顺二羟基类物质具有特异性吸附能力，且亲和力高、容量高，能够直接分离、富集复杂样品中的顺二羟基类物质。本发明是制备方法简单，具有广阔的应用前景。
本发明提供的原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱的原料的质量百分数组成：
表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱原料的质量百分数：
溴化亚铜 0.34- 0.68 %
乙二醇二甲基丙烯酸酯 41-46 %
甲醇 26-36 %
正己烷 20-30 %
2-溴丙酸乙酯 0.14-0.28 %
五甲基二乙烯三胺 0.42-0.84 %
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
接枝硼亲和聚合物链原料的质量百分数：
4-乙烯基苯硼酸 3.3-6.4 %
五甲基二乙烯三胺 0.23-0.45 %
双蒸水 12-20 %
异丙醇 75-84 %
水合肼（80 %） 0.45-0.86 %
溴化亚铜 0.19-0.28 %
上述的各原料的质量组成之和为100 %。
其制备方法为：按计量组成制备出表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱，然后利用原子转移自由基聚合反应在此基柱柱上接枝硼亲和聚合物链，制备出硼亲和整体柱。
本发明提供的原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱的制备方法具体经过下列步骤：
1）按计量分别将溴化亚铜、乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于甲醇、正己烷混合液中，超声至溴化亚铜均匀分散后，加入2-溴丙酸乙酯，通氮气5-15分钟后加入五甲基二乙烯三胺，摇约后，立即灌注至不锈钢色谱柱，密封两端，23-30℃放置，反应24-24.5小时；聚合反应后，整体柱连接至液相高压泵，分别用等体积的四氢呋喃和水冲洗，得到基础多孔聚合物整体柱。
2）按计量分别将4-乙烯基苯基硼酸、五甲基二乙烯三胺溶于异丙醇和水的混合溶液中，超声溶解后用加入水合肼和溴化亚铜，混合均匀，用液相高压泵以0.005 mL /min流速，使混合液注入步骤1）制备的基础多孔聚合物整体柱，持续5至15小时，随后依次用异丙醇-水混合溶液（体积比为3:1）、双蒸水冲洗接枝后的整体柱，得到硼亲和整体柱。
本发明提供了原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱及其制备方法，首次利用两步ATRP反应合成具有特异性识别功能的硼亲和整体柱，利用硼亲和聚合物链增加硼亲和位点数量，提高对顺二羟基类物质的吸附容量，引用试剂较少，容易操作，制备过程简单。
通过硼亲和整体柱对阿魏酸-芦丁、阿魏酸-迷迭香酸、肾上腺素-去氧肾上腺素、溶菌酶-辣根过氧化物酶、溶菌酶-脱氧核糖核酸酶B、溶菌酶-转铁蛋白的分离实验表明，合成的硼亲和整体柱对含有顺二羟基的芦丁、迷迭香酸、肾上腺素、辣根过氧化物酶、脱氧核糖核酸酶B、转铁蛋白等具有特异性识别和明显的吸附效果，而对于不含顺二羟基的物质阿魏酸、去氧肾上腺素、溶菌酶则不具有特异性识别能力。
通过硼亲和整体柱的前沿实验表明，硼亲和整体柱具有对顺二羟基类物质具有高吸附容量。本发明物理和化学性质稳定，可作为一种硼亲和整体柱适用于顺二羟基类物质的富集与分析研究。
总之，本发明提供的一种原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱，制备方法简单，对顺二羟基类物质具有特异性吸附能力，且亲和力高、容量高，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的基于第一步反应的多孔聚合物整体柱基柱扫描电镜图（A）和基于第二部ATRP反应的硼亲和整体柱扫描电镜图（B）。
图2为分别以乙腈、水、甲醇做流动相，基础多孔聚合物整体柱（A）和硼亲和整体柱（B）在不同流速下的柱压变化曲线。
图3 为基础多孔聚合物整体柱（a）和硼亲和整体柱（b）红外表征图。
图4为本发明制备的基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对于小分子阿魏酸-芦丁、阿魏酸-迷迭香酸、肾上腺素-去氧肾上腺素的分离图。
图5为本发明制备的基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对于生物大分子溶菌酶-辣根过氧化物酶、溶菌酶-脱氧核糖核酸酶B、溶菌酶-转铁蛋白的分离图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
首先利用ATRP反应的制备基础多孔聚合物整体柱，然后利用ATRP反应在此基柱柱上接枝硼亲和聚合物链，制备硼亲和整体柱，并对基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱进行扫描电镜分析表征、红外表征和氮吸附分析，具体操作步骤如下：
基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱制备方法：
第一步：将溴化亚铜0.53 %（均为质量分数）和乙二醇二甲基丙烯酸酯41.4%，溶于质量分数为31.2 %的甲醇和26.0 %的正己烷混合液中，室温超声（超声电功率150瓦）至溴化亚铜分布均匀，加入2-溴丙酸乙酯0.23 %，通氮气10分钟后，加入五甲基二乙烯三胺0.64%，摇匀，立即灌注至不锈钢色谱柱，室温23-30℃反应24-24.5小时。聚合反应完成后，用四氢呋喃、水各50 mL冲洗未反应的物质，即得基础多孔聚合物整体柱。
第二步：分别将4-乙烯基苯基硼酸4.13 %和五甲基二乙烯三胺0.39 %，溶于77%异丙醇和17 %双蒸水的混合溶液中，超声溶解后加入水合肼0.72%和溴化亚铜0.26 %，混合均匀后用高压液相泵，以0.005 mL /min流速注入基础多孔聚合物整体柱中，持续10-10.5小时，随后依次用异丙醇-水混合溶液（体积比为3:1）、双蒸水各50 mL冲洗接枝后的整体柱，即得硼亲和整体柱。
扫描电镜表征：将上述合成的基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱晾干研磨成粉末，分散至载玻片，并粘到铝制的扫描电镜金属板上。样品在扫描成图前需要喷金处理。通过扫描电镜图可以看出基础多孔聚合物整体柱（见图1 A）和硼亲和整体柱（见图1 B）均为球形堆积结构，且硼亲和整体柱的球形粒径明显大于基础多孔聚合物整体柱的球形粒径，说明硼亲和聚合物链接枝到基础多孔聚合物整体柱上。
比表面积测试：将合成的基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱晾干研磨成粉末，用ASAP-2020 微粒表面积和孔隙度分析仪测定Brunauer-Emmett-Teller (BET)比表面积。基础多孔聚合物整体柱的BET比表面积为4.11 m2/g；接枝硼亲和聚合物链后，硼亲和整体的BET比表面积增加为4.65 m2/g。
渗透性测试：分别用乙腈、水、甲醇做流动相，测定流速在0.2-4.0 mL/min范围内，基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱的柱压。随流速的增加，基础多孔聚合物整体柱（见图2A）和硼亲和整体柱（见图2B）的柱压均线性增高。基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱的渗透性（K）可以根据Darcy定律计算，即
其中u为线速度，η为流动相粘度，L为整体柱的柱长，ΔP为整体柱的柱压，本实验中的线速度1.0毫米/秒，柱长为10厘米。
表1. 基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱的渗透性
如表所示，乙腈、水、甲醇为流动相时，基础多孔聚合物整体柱和硼亲和整体柱的渗透性变化不明显，且均为×10-11 m2级别，说明改变流动相对整体柱的结构影响很小，两种整体柱的机械稳定性好。另外硼亲和整体柱的渗透性低于基础多孔聚合物整体柱的渗透性，说明硼亲和聚合物链接枝到基础柱上，堵塞了一部分小孔，导致硼亲和整体柱的渗透性低。
红外表征：如图3所示，接枝后的硼亲和整体柱出现新吸收峰，苯环骨架振动吸收峰1540 cm-1和670 cm-1，说明以4-乙烯基苯硼酸为单体的硼亲和聚合物链成功接枝到基础柱上。
实施例2
小分子分离实验以研究基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对顺二羟基类小分子物质的特异性吸附性能。具体操作步骤如下：
同上述方法（实施例1）合成基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱用于分离顺二羟基类小分子物质。
配制流动相：流动相一为醋酸浓度为0.4 %（v/v）的醋酸-氨水溶液（pH=8.5），流动相二为浓度为0.4 %（v/v）的醋酸溶液（pH=3.1）。
用流动相一配制浓度为1 ppm的阿魏酸-芦丁、阿魏酸-迷迭香酸、肾上腺素-去氧肾上腺素混合溶液。以硼亲和整体柱为色谱柱，利用HPLC-UV对上述溶液进行色谱分离。
色谱条件如下：流动相：用流动相一平衡色谱柱，进样15分钟后切换为流动相二；检测波长：芦丁-阿魏酸混合溶液 257 nm，迷迭香酸-阿魏酸混合溶液 310 nm，肾上腺素-去氧肾上腺素混合溶液 280 nm；进样量：20 微升；流速：1.0 毫升/分钟。
如图4表明，在pH=8.5的碱性条件下（流动相一），硼亲和整体柱对于不含顺二羟基的小分子如阿魏酸、去氧肾上腺素无特异性吸附能力，死时间即出峰。而对顺二羟基类小分子物质如芦丁、迷迭香酸、肾上腺素有特异性吸附效果，在该条件下完全吸附、不出峰；当流动相转换为pH=3.1的酸性条件时，芦丁、迷迭香酸、肾上腺素从整体柱表面洗脱出峰。说明基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对顺二羟基类小分子物质具有特异性吸附效果。
实施例3
糖蛋白质分离实验以研究基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对含顺二羟基的蛋白质的特异性吸附性能。具体操作步骤如下：
同上述方法（实施例1）合成基于ATRP反应的硼亲和整体柱用于分离顺二羟基类蛋白。
配制流动相：流动相一为醋酸浓度为0.4 %（v/v）的醋酸-氨水溶液（pH=8.5），流动相二为浓度为0.4 %（v/v）的醋酸溶液（pH=3.1）。
用流动相一配制浓度为10 ppm的溶菌酶-辣根过氧化物酶，溶菌酶-脱氧核糖核酸酶B，溶菌酶-转铁蛋白混合溶液。以硼亲和整体柱为色谱柱，利用HPLC-UV对上述溶液进行色谱分离。
色谱条件如下：流动相：用流动相一平衡色谱柱，进样7分钟后切换为流动相二；检测波长：280 nm；进样量：20 微升；流速：1.0 毫升/分钟。
如图5表明，在pH=8.5的碱性条件下，硼亲和整体柱对于不含顺二羟基的溶菌酶无特异性吸附能力，死时间即出峰；而对于含有顺二羟基的蛋白质如辣根过氧化物酶、脱氧核糖核酸酶B、转铁蛋白有特异性吸附效果，在该条件下完全吸附、不出峰；当流动相转换为pH=3.1的酸性条件时，辣根过氧化物酶、脱氧核糖核酸酶B、转铁蛋白从整体柱表面洗脱出峰。说明基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对于含顺二羟基的蛋白质具有特异性吸附效果。
实施例4
前沿实验以研究基于两步ATRP反应的硼亲和整体柱对顺二羟基类物质的吸附量，从而推测所制备的硼亲和整体柱对顺二羟基类物质的亲和力和饱和吸附容量。
前沿分析所用的突破曲线是在高效液相色谱中测定的。具体操作步骤如下：
同上述方法（实施例1）合成基于ATRP反应的硼亲和整体柱用于顺二羟基类物质的色谱前沿实验。
获取丙酮突破曲线：配制醋酸浓度为0.4 %（v/v）的醋酸-氨水溶液（pH=8.5），超声脱气作为空白流动相备用；以空白流动相配制100 ppm的丙酮溶液作为流动相；先用空白流动相平衡色谱柱直至获得稳定的基线，然后以1.0 mL/min的流速流过硼亲和整体柱直至流出曲线达到一个稳定的平台，即为完成一个突破曲线，得丙酮突破曲线。
获取顺二羟基类物质突破曲线：配制醋酸浓度为0.4 %（v/v）的醋酸-氨水溶液（pH=8.5），超声脱气作为空白流动相；以空白流动相分别配制0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 毫克/毫升的顺二羟基类物质溶液作为流动相备用。将浓度最低的顺二羟基类物质溶液作为流动相以1.0 mL/min的流速流过硼亲和整体柱直至流出曲线达到一个稳定的平台，即为完成一个突破曲线。接着，用下一个浓度稍高的同一样品溶液作为流动相流过色谱柱直到流出曲线达到一个稳定的平台。通过这种方式，一系列浓度不断提高的样品溶液依次流过色谱柱，从而得到一系列样品的突破曲线。
在前沿分析法中某一样品浓度下的平衡吸附量Q i 可用下式计算：
其中t i 为该样品在该浓度下突破曲线达到平台半高的时间，t 0 为丙酮突破曲线达到平台半高的时间，C i 本次样品浓度，C i-1上一样品浓度，v为流速，Q i-1 为上一样品浓度的平衡吸附量。
根据Scatchard方程计算解离常数（K d）和表观最大结合量（Q max）：
式中K d为解离常数，Q max为硼亲和整体柱对顺二羟基类物质的饱和吸附容量，Q i 为硼亲和整体柱在某一浓度对顺二羟基类物质的平衡吸附量，C i 为吸附平衡时顺二羟基类物质的浓度，即某次吸附时的样品浓度。Q i /C i 对Q i 进行线性回归，其斜率为-1/K d，截距为Q max/ K d，可计算得到解离常数（K d）和饱和吸附容量（Q max）。测定结果如表2所示。
表2 硼亲和整体柱对顺二羟基类物质的饱和吸附量和解离常数。
结果表明，由于两位点协同作用，该硼亲和整体柱对迷迭香酸和绿原酸的解离常数比腺苷和邻苯二酚低一个数量级，说明顺二羟基位点越多，结合力越强。此外，该硼亲和整体柱对邻苯二酚的饱和吸附量最大，说明分子体积对饱和吸附量有较大影响，邻苯二酚分子体积小，易接近内部硼亲和位点，饱和吸附量大，而迷迭香酸和绿原酸分子体积较大，接近内部硼亲和位点困难，所以饱和吸附量低。

Claims (3)

1.一种原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱，首先制备表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱，然后在此柱上接枝硼亲和聚合物链，其特征在于它的原料的质量组成：
表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱原料的质量百分数：
溴化亚铜 0.34- 0.68 %
乙二醇二甲基丙烯酸酯 41-46 %
甲醇 26-36 %
正己烷 20-30 %
2-溴丙酸乙酯 0.14-0.28 %
五甲基二乙烯三胺 0.42-0.84 %；
接枝硼亲和聚合物链原料的质量百分数：
4-乙烯基苯硼酸 3.3-6.4 %
五甲基二乙烯三胺 0.23-0.45 %
双蒸水 12-20 %
异丙醇 75-84 %
80 %水合肼 0.45-0.86 %
溴化亚铜 0.19-0.28 %；
上述的各原料的质量组成之和为100 %；
其制备方法为：按计量组成制备出表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱，然后利用原子转移自由基聚合反应在此柱上接枝硼亲和聚合物链，制备出硼亲和整体柱。
2.根据权利要求1所述的原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱，其特征在于它的原料的质量组成：
表面含有引发剂的基础多孔聚合物整体柱原料的质量百分数：
溴化亚铜 0.53 %
乙二醇二甲基丙烯酸酯 41.4%
甲醇 31.2 %
正己烷 26.0 %
2-溴丙酸乙酯 0.23 %
五甲基二乙烯三胺 0.64 %；
接枝硼亲和聚合物链原料的质量百分数：
4-乙烯基苯基硼酸 4.13 %
五甲基二乙烯三胺 0.39 %
异丙醇 77.0 %
双蒸水 17.5 %
水合肼 0.72%
溴化亚铜 0.26 %。
3.权利要求1所述的原子转移自由基聚合的硼亲和整体柱的制备方法，其特征在于具体经过下列步骤：
1）按计量分别将溴化亚铜、乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于甲醇、正己烷混合液中，超声至溴化亚铜均匀分散后，加入2-溴丙酸乙酯，通氮气5-15分钟后加入五甲基二乙烯三胺，摇匀后，立即灌注至不锈钢色谱柱，密封两端，23-30℃放置，反应24-24.5小时；聚合反应后，整体柱连接至液相高压泵，分别用等体积的四氢呋喃和水冲洗，得到基础多孔聚合物整体柱；
2）按计量分别将4-乙烯基苯基硼酸、五甲基二乙烯三胺溶于异丙醇和水的混合溶液中，超声溶解后加入水合肼和溴化亚铜，混合均匀，用液相高压泵以0.005 mL /min流速，使混合液注入步骤1）制备的基础多孔聚合物整体柱，持续5至15小时，随后依次用体积比为3:1的异丙醇-水混合溶液、双蒸水冲洗接枝后的整体柱，得到硼亲和整体柱。
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