CN116116385A - 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 - Google Patents

一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116116385A
CN116116385A CN202211671065.XA CN202211671065A CN116116385A CN 116116385 A CN116116385 A CN 116116385A CN 202211671065 A CN202211671065 A CN 202211671065A CN 116116385 A CN116116385 A CN 116116385A
Authority
CN
China
Prior art keywords
exosomes
reaction
magnetic nanomaterial
blood
bifunctional
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202211671065.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN116116385B (zh
Inventor
孙龙钦
杨佳蕾
李京丽
赵焱
吴松锋
何琳
杜娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd filed Critical Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd
Priority to CN202211671065.XA priority Critical patent/CN116116385B/zh
Publication of CN116116385A publication Critical patent/CN116116385A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116116385B publication Critical patent/CN116116385B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0601—Invertebrate cells or tissues, e.g. insect cells; Culture media therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
    • B01D15/20—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the sorbent material
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/0203—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of metals not provided for in B01J20/04
    • B01J20/0211—Compounds of Ti, Zr, Hf
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/0203—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of metals not provided for in B01J20/04
    • B01J20/0274—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising compounds of metals not provided for in B01J20/04 characterised by the type of anion
    • B01J20/0288—Halides of compounds other than those provided for in B01J20/046
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/06—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising oxides or hydroxides of metals not provided for in group B01J20/04
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/02—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material
    • B01J20/10—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate
    • B01J20/103—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising inorganic material comprising silica or silicate comprising silica
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/22—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof comprising organic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/26—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen
    • C08F220/32—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing epoxy radicals
    • C08F220/325—Esters containing oxygen in addition to the carboxy oxygen containing epoxy radicals containing glycidyl radical, e.g. glycidyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/34—Esters containing nitrogen, e.g. N,N-dimethylaminoethyl (meth)acrylate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/286—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q involving mechanical work, e.g. chopping, disintegrating, compacting, homogenising
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2438/00—Living radical polymerisation
    • C08F2438/01—Atom Transfer Radical Polymerization [ATRP] or reverse ATRP
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法。具体地，本发明提供一种表面修饰兼具有阳离子季铵盐基团与金属离子的新型四氧化三铁磁珠，用于微量血浆外泌体的高效富集。使用该材料进行外泌体分离时，可以与磁性分离自动化装置的结合，实现对微量血液外泌体的高特异性、高通量提取。

Description

一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法。
背景技术
血液是临床检验最常用的样本，人体在细胞外刺激、微生物攻击和其他应激条件可释放携带有特定蛋白质、mRNA、miRNA和DNA的外泌体进入外周血，并且外泌体可以保护内容物不被外周血中的各种酶水解，因此外泌体是无创诊断的潜在生物标志物重要来源。但血液成分复杂，在进行血液中外泌体蛋白质组分析前，首先需要从血液中提取高纯度的外泌体。在分离外泌体时往往高丰度血浆蛋白与外泌体一并分离，因此在后续外泌体蛋白质组分析中对结果造成严重干扰，导致外泌体蛋白鉴定深度有限。因此快速、高效的分离高纯度的外泌体一直是外泌体蛋白质组研究中急需解决的问题。
常见的外泌体分离方法有超速离心法、超滤法、沉淀法、密度梯度离心法、尺寸排阻法等；超滤法是根据外泌体的颗粒大小，选择合适孔径的滤膜将外泌体与血液高丰度蛋白分开；沉淀法利用聚合物（如聚乙二醇、离子液体等）将外泌体选择性沉淀达到分离纯化的目的；超滤法和沉淀法提取外泌体步骤简单，但外泌体回收低，并且沉淀试剂的残留会大大制约外泌体的应用领域。密度梯度离心法与超高速离心能够根据不同物质的沉降系数不同，设置从低到高的梯度离心或离心转速来实现外泌体与血浆蛋白的分离，这种方法耗时长且外泌体回收率低。尺寸排阻法可以高效的分离外泌体与血浆蛋白，但超大的洗脱体积会严重稀释样品中外泌体的浓度，因此需要消耗毫升级的初始血液样品用于外泌体的富集。
发明内容
为了实现微量血液中外泌体的高效富集，我们合成一种表面修饰兼具有阳离子季铵盐基团与金属离子的新型四氧化三铁磁珠，用于微量血浆外泌体的高效富集。该材料在磁珠表面原位嫁接原子转移自由基聚合（Atom Transfer Radical Polymerization，ATRP）反应引发剂，再利用铜离子介导的原子转移自由基聚合反应，引发混合单体试剂（[2-（甲基丙烯酰氧基）乙基] 三甲基氯化铵与甲基丙烯酸缩水甘油酯在磁珠表面发生原位聚合反应，合成聚合物侧链为季铵盐与环氧基基团的聚合物包裹的四氧化三铁磁珠，再使用多步化学修饰策略，在聚甲基丙烯酸缩水甘油酯末端固定金属锆离子，最终合成表面带有金属锆离子与阳离子季铵盐基团的新型四氧化三铁磁珠。
具体地，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种双功能磁性纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）Fe3O4@SiO2与ATRP引发剂混合，加入ARRP反应液封口，60℃震摇反应；
2）加入40%乙二胺（Ethylenediamine，EDA）溶液置于80℃水浴反应；
3）再加入40mM的三氯氧磷（POCl3）与40mM的2，4，6-三甲基吡啶的乙腈溶液室温反应；
4）加入100mM氧氯化锆（ZrOCl2）水溶液反应，使用去离子水洗至中性。
所述ATRP引发剂是2-溴-2甲基-N-（3-（三乙氧基甲硅烷基）丙基）丙酰胺；
所述ARRP反应液中含有以下成分：
0.015 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺、
0.001 mol/L 氯化铜、
0.01 mol/L 氯化亚铜、
1 mol/L [2-（甲基丙烯酰氧基）乙基] 三甲基氯化铵（DMC）、
1 mol/L 甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA）。
优选地，所述步骤1）需要反应至少2小时，更优选地，至少3小时，至少4小时，最优选地，4-6小时。
优选地，所述步骤2）需要反应至少2小时，更优选地，至少3小时，至少4小时，最具体地，反应4小时。
优选地，所述步骤3）需要反应至少8小时，更优选地，至少9、10、11、12小时，最具体地，反应12小时。
优选地，所述步骤4）需要反应至少2小时，更优选地，至少3小时，至少4小时，最具体地，反应4小时。
优选地，所述方法中所使用的Fe3O4@SiO2、乙二胺、三氯氧磷（POCl3）、2，4，6-三甲基吡啶、乙腈溶液、氧氯化锆（ZrOCl2）中任意一种都可以是自行制备的或者是购买的商品化试剂。
优选地，所述Fe3O4@SiO2是甲醇清洗过的。
优选地，所述ATRP引发剂是溶解在80%甲醇中的，终浓度为100mg/mL。
优选地，在进行步骤2）、3）、4）前，还可以包括使用甲醇清洗材料的步骤，所述清洗可以进行一次或更多次，例如2、3、4、5或更多。
优选地，所述制备方法可以是在无菌和/或无尘环境中制备得到的。
另一方面，本发明提供了上述方法制备得到的双功能磁性纳米材料。
另一方面，本发明提供了含有所述双功能磁性纳米材料的产品。
优选地，所述产品中还可以包括提取外泌体所需要的其他仪器、试剂。
优选地，所述产品包括试剂盒。所述试剂盒并非必须是一个盒状产品，其也可以是由几种各自独立的仪器、装置、成分组成。
优选地，所述试剂盒中可以含有收集液体的容器。
优选地，所述试剂盒中可以含有磁铁。
优选地，所述试剂盒可以包含包装材料。如本文所用的，术语“包装材料”可指容纳试剂盒的组件的物理结构。该包装材料可以用于维持试剂盒组件的无菌性，并可由常用于这类目的的材料（例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿等）制成。
另一方面，本发明提供了使用所述双功能磁性纳米材料提取外泌体的方法，所述方法包括将本发明所述双功能磁性纳米材料与待测样本混合，使用磁铁吸取，就得到了表面吸附有外泌体的双功能磁性纳米材料。
如本领域所理解的，人体中的体液成分复杂，任意方法所分离得到的是复杂的混合物，所述提取外泌体的方法使用磁铁提取到的是含有本发明双功能磁性纳米材料和外泌体的混合物，因外泌体是其中的主要成分，故以上方法称为提取外泌体的方法。
或者，以上方法也可称为提取外泌体内成分（包括蛋白、核酸等）的方法，所述提取外泌体内成分是通过将双功能磁性纳米材料上的外泌体裂解，从而得到外泌体内的成分；更优选地，还可以包括使用磁铁去除双功能磁性纳米材料的步骤。
具体如本发明具体实施例一中步骤四的操作，即可得到外泌体内的蛋白成分，从而对外泌体内的蛋白进行检测测定。同理于蛋白，外泌体内的核酸分子也可以由此相同操作得到。
优选地，所述待测样本中含有外泌体。
优选地，所述待测样本包括来自受试者的体液、细胞（或组织）的培养液。
优选地，所述体液包括血液、血清、血浆、尿液、唾液、精液、乳汁、泪液、痰液、腹水、羊水、脑脊液。
优选地，所述细胞包括任意真核细胞，更具体地，例如：心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、肾细胞、角质化细胞、黑色素细胞、成骨细胞、前成脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞中。
优选地，所述细胞可以是癌细胞或非癌细胞。
优选地，所述受试者包括人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫等。
最优选地，所述受试者是人。
具体地，本领域公知细胞在培养过程中分泌外泌体，因此细胞培养液中也存在外泌体。
优选地，所述待测样本是血浆。
更优选地，所述待测样本是预处理过的，所述方法包括离心，取上清。
更优选地，所述待测样本是预处理过的，所述方法包括取100μL待测样品，，离心，取上清，最后用PBS稀释至1ml。
更具体地，所述预处理方法是：取100μL待测样品，300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，取上清，最后用PBS稀释至1ml。
优选地，所述提取外泌体的方法是体外进行的。
优选地，所述提取外泌体的方法是非治疗目的的、非诊断目的的。
另一方面，本发明提供了上述方法制备得到的双功能磁性纳米材料、含有前述双功能磁性纳米材料的产品在提取外泌体中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：
1）本发明利用外泌体膜磷脂双分子层中磷酸基团与金属锆离子的配位螯合作用，和，带有正电的季铵盐基团与带有负电磷脂层的静电吸附的双重协同作用；
2）使用该材料进行外泌体分离时，可以与磁性分离自动化装置的结合，实现对微量血液外泌体的高特异性、高通量提取；
3）获得的高纯度外泌体可以直接用于蛋白质组学样品制备，结合本发明中发展的新的基于质谱检测技术的外泌体蛋白质组检测方法，可实现血液外泌体蛋白质组的深度覆盖研究。
附图说明
图1是本发明所提供的双功能磁性纳米材料的合成及应用流程图。
图2是经新型磁珠富集的血液外泌体蛋白质谱信号强度分布。
图3是合成的Fe3O4、Fe3O4/SiO2、Fe3O4/SiO2/GMA@DMC的透射电镜图和扫描电镜的电镜图。
图4是步骤三提取得到的外泌体在电镜下的图像。
图5是步骤三提取得到的外泌体的粒径及对应浓度的统计结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例一：材料合成及提取效果验证。
一、本发明提供的材料的合成过程
1.磁性Fe3O4合成（或使用市售产品替代）
称取670mg六水合三氯化铁，溶解于30mL乙二醇中（50mL离心管中），超声至均匀溶液状态（5-10min，如有大块的三氯化铁可以中途拿出来使劲摇一摇），称取1.8g无水乙酸钠，与上述三氯化铁乙二醇溶液一起加入50mL圆底烧瓶，室温下剧烈机械搅拌30min，将所得分散均匀的溶液转入50mL teflon高压反应釜，200℃反应8h以上（或过夜），得到的磁珠用乙醇与水各洗3次烘干，即为可得到产物Fe3O4。
2.Fe3O4@SiO2合成（或使用市售产品替代）
将步骤1合成的Fe3O4称取350mg，加入乙醇溶液超声清洗两次，最终分散于160mL的乙醇+40ml水+1.5mL的浓氨水混合液中，超声反应30min，逐滴加入1ml TEOS（使用注射器在1-2min之内逐滴加入），夏天室温（冬天需要加热至25℃）下机械搅拌6小时即可得到所述产物Fe3O4@SiO2。
3.ATRP引发剂（2-溴-2甲基-N-（3-（三乙氧基甲硅烷基）丙基）丙酰胺）合成（或使用市售产品替代）
将8mmol的3-氨丙基三乙氧基硅烷）与10mmoL三乙胺预先混合搅拌，并添加12.5mL四氢呋喃继续搅拌反应，在混合溶液通入氮气除氧的同时冰浴放置30min，将10mmol 2-溴异丁酰溴（1.25mL）用10mL注射器缓慢逐滴加到反应液中并且剧烈搅拌4h，最后将溶液过滤后抽真空干燥至原始体积的1/3，小心去除沉淀后取上清氮气吹干后可得到黄色粘稠状ATRP引发剂2-溴-2甲基-N-（3-（三乙氧基甲硅烷基）丙基）丙酰胺。
4.双功能磁性纳米颗粒合成
取步骤2的二氧化硅包裹的四氧化三铁颗粒（Fe3O4@SiO2）100mg，使用500μL甲醇清洗三次后去除上清备用。将步骤3的ATRP引发剂溶解在80%甲醇中，使其终浓度为100mg/mL。
1）将以上ATRP引发剂和Fe3O4@SiO2颗粒混合，室温反应4-6小时，用甲醇清洗掉剩余引发剂后，加入ATRP反应液（0.015mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺，0.001mol/L氯化铜，0.01mol/L氯化亚铜，1mol/L[2-（甲基丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化铵（DMC）与1mol/L甲基丙烯酸缩水甘油酯（GMA））封口，60℃震摇反应4-6小时。
2）聚合反应结束后，用1mL甲醇清洗三次去除剩余反应溶液。再在ATRP聚合反应后的Fe3O4@SiO2颗粒中加入40%乙二胺（Ethylenediamine，EDA）溶液置于80℃水浴反应4小时。
3）使用500μL甲醇反复冲洗纳米颗粒3次，再加入40mM的三氯氧磷（POCl3）与40mM的2，4，6-三甲基吡啶的乙腈溶液室温反应12小时。
4）最后使用500μL甲醇反复冲洗纳米颗粒3次去除残留溶液后，加入100mM氧氯化锆水溶液反应4小时，使用去离子水洗至中性后即为本发明所提供的双功能磁性纳米材料。
二、血液样本预处理
取100μL血浆，分别经300g离心10分钟，2000g离心10分钟，10000g离心30分钟，收集上清液。然后取50μL用pbs稀释至1ml。
三、血浆样本中外泌体提取
称取2mg步骤一获得的双功能磁珠，分别用纯水和DMEM润洗2次，加入上述经过预处理的血浆，4℃震荡孵育5分钟，通过磁铁分离孵育后的材料，并用PBS缓冲液洗涤3次，可得到表面吸附有外泌体的磁性材料。
四、外泌体裂解及其蛋白质的LC-MS/MS分析
将步骤三得到的表面吸附有外泌体的磁性材料置于冰上，加入4％SDS裂解液20μL中，超声裂解20分钟，用磁铁将材料与上清液分离后，吸取全部上清，加入80μL 8M尿素溶液、二硫苏糖醇（终浓度20mmol/L），37℃反应4小时后，将所得溶液转移至FASP管中，用8M尿素溶液洗涤2次，加入碘乙酰胺（终浓度50mmol/L），室温下避光反应1小时，用50mM碳酸氢铵溶液洗涤3次，加入1μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用0.1％甲酸水溶液定容后，质谱上样分析，上样量1μg。经新型磁珠富集的血液外泌体蛋白质谱信号强度分布如图2所示。
采集的质谱数据使用DIANN搜库检索。目标数据库为uniprot.human。检索参数设置为胰蛋白酶全酶切，设定2个蛋白酶漏切位点，蛋白质固定修饰选取Carbamidomethyl（C），可变修饰为Oxidation（M）。质谱一级质量误差为15ppm，二级质量误差为15ppm，假阳性率设为1％。
通过数据库搜索获得的血浆外泌体蛋白质鉴定数，表明该材料对外泌体具有良好的提取效果，蛋白鉴定数为1665。其中组学数据中外泌体常见marker：CD9、CD63、CD81 均有鉴定到。
五、电镜检测
合成的Fe3O4、Fe3O4/SiO2（Fe3O4@SiO2）、Fe3O4/SiO2/GMA@DMC（本发明所提供的双功能磁性纳米材料）透射电镜图如图3A所示、扫描电镜的电镜图如图3B所示。
经步骤三提取得到的外泌体在电镜下的图像如图4所示。其平均粒径是123.6 nm，浓度是4.3E+10，统计结果如图5所示。

Claims (10)

1.一种双功能磁性纳米材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
1）Fe3O4@SiO2与ATRP引发剂混合，加入ARRP反应液封口，60℃震摇反应；
2）加入40%乙二胺溶液置于80℃水浴反应；
3）再加入40mM的三氯氧磷与40mM的2，4，6-三甲基吡啶的乙腈溶液室温反应；
4）加入100mM氧氯化锆水溶液反应，使用去离子水洗至中性；
所述ATRP引发剂是2-溴-2甲基-N-（3-（三乙氧基甲硅烷基）丙基）丙酰胺；
所述ARRP反应液中含有以下成分：
0.015 mol/L N,N,N',N'',N''-五甲基二乙烯三胺、
0.001 mol/L 氯化铜、
0.01 mol/L 氯化亚铜、
1 mol/L [2-（甲基丙烯酰氧基）乙基] 三甲基氯化铵、
1 mol/L 甲基丙烯酸缩水甘油酯。
2.如权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述ATRP引发剂是溶解在80%甲醇中的，终浓度为100mg/mL。
3.如权利要求1所述制备方法，在进行步骤2）、3）、4）前，还包括使用甲醇清洗材料的步骤。
4.权利要求1所述制备方法制备得到的双功能磁性纳米材料。
5.含有权利要求1所述制备方法制备得到的双功能磁性纳米材料的产品。
6.使用权利要求1所述制备方法制备得到的双功能磁性纳米材料提取外泌体的方法，所述方法包括将权利要求1所述制备方法制备得到的双功能磁性纳米材料与待测样本混合，使用磁铁吸取，就得到了表面吸附有外泌体的双功能磁性纳米材料。
7.如权利要求6所述的方法，所述待测样本包括来自受试者的体液、细胞的培养液。
8.如权利要求6所述的方法，所述待测样本是预处理过的，所述预处理的方式是离心，取上清。
9.如权利要求7所述的方法，所述受试者包括人、猩猩、猴、马、牛、羊、猪、驴、骆驼、狗、兔、猫、大鼠、小鼠、鱼、鸟或昆虫。
10.权利要求1所述制备方法制备得到的双功能磁性纳米材料、或、权利要求5所述的产品在提取外泌体中的应用。
CN202211671065.XA 2022-12-26 2022-12-26 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 Active CN116116385B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211671065.XA CN116116385B (zh) 2022-12-26 2022-12-26 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211671065.XA CN116116385B (zh) 2022-12-26 2022-12-26 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116116385A true CN116116385A (zh) 2023-05-16
CN116116385B CN116116385B (zh) 2023-06-13

Family

ID=86303774

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211671065.XA Active CN116116385B (zh) 2022-12-26 2022-12-26 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116116385B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117187165A (zh) * 2023-09-12 2023-12-08 知行健康产业(广东)有限责任公司 一种分离外泌体的方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434641A (zh) * 2007-11-16 2009-05-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备和应用
CN105001376A (zh) * 2015-06-23 2015-10-28 天津大学 原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法
CN107175086A (zh) * 2017-06-26 2017-09-19 浙江大学宁波理工学院 离子印迹磁性富集材料的制备方法
CN114459877A (zh) * 2021-12-17 2022-05-10 中国计量科学研究院 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434641A (zh) * 2007-11-16 2009-05-20 中国科学院大连化学物理研究所 一种磷酸酯锆纳米磁珠及其制备和应用
CN105001376A (zh) * 2015-06-23 2015-10-28 天津大学 原子转移自由基聚合制备高容量蛋白质层析介质的方法
CN107175086A (zh) * 2017-06-26 2017-09-19 浙江大学宁波理工学院 离子印迹磁性富集材料的制备方法
CN114459877A (zh) * 2021-12-17 2022-05-10 中国计量科学研究院 用于富集外泌体的dna四面体复合磁性纳米材料及制备

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUNG-HYUN PARK等: "Preparation of Zr4+ Affinity Column by Atom Transfer Radical Polymerization for Phosphoprotein Isolation", JOURNAL OF APPLIED POLYMER SCIENCE, vol. 114, pages 1250 - 1255 *
RANRAN WANG等: "Well-Defined Peapod-like Magnetic Nanoparticles and Their Controlled Modification for Effective Imaging Guided Gene Therapy", ACS APPL. MATER. INTERFACES, vol. 8, pages 11298 - 11308 *
SEONG-HO CHOI等: ""Separation of proteins on polymeric stationary phases grafted with various amine groups", JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY A, vol. 987, pages 323 - 330, XP004405834, DOI: 10.1016/S0021-9673(02)01840-X *
SHU LI等: "Fabrication of high-capacity protein ion-exchangers with polymeric ion-exchange groups grafted onto micron-sized beads by atom transfer radical polymerization", BIOCHEMICAL ENGINEERING JOURNAL, vol. 103, pages 122 - 129, XP029266486, DOI: 10.1016/j.bej.2015.07.010 *
李秀涛等: "含氨基和环氧基双功能基的聚合物刷磁性微球的制备及 对青霉素G酰化酶的固定化", 高分子学报, vol. 7 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117187165A (zh) * 2023-09-12 2023-12-08 知行健康产业(广东)有限责任公司 一种分离外泌体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN116116385B (zh) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kang et al. High-purity capture and release of circulating exosomes using an exosome-specific dual-patterned immunofiltration (ExoDIF) device
Brown et al. Polymer-based purification of extracellular vesicles
CN110343664B (zh) 提取外泌体及外泌体蛋白的方法
CN116116385B (zh) 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
CN110231207B (zh) 一种分离外泌体的方法
CN109321577A (zh) 一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法
CN104820100A (zh) 基于分子印迹技术的凝集素模拟物的制备方法与应用
CN111487404A (zh) 体液肿瘤细胞dna提取试剂盒
CN109913417A (zh) 一种采用快速免疫磁珠法分离脑脊液中不同细胞来源外泌体亚型的方法
CN112852725B (zh) 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用
CN106366195B (zh) 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法
CN114276992A (zh) 一种完整外泌体分离、纯化试剂盒及检测分析方法
CN109153882B (zh) 细胞外小泡回收方法及细胞外小泡用容器
CN111724954B (zh) 一种氧化石墨烯磁珠、抗体偶联氧化石墨烯磁珠及其在细胞分选中的应用
CN106498032A (zh) 一种基于磁珠偶联抗体富集并检测样本中miRNA的方法及配套微流控装置
CN114717345B (zh) CRISPR/Cas9介导的金黄色葡萄球菌检测等温核酸扩增方法、试纸条及其应用
CN114736868B (zh) 一种温度响应功能复合物、一种外泌体均相分离纯化方法
CN112430569B (zh) 蛋白sftpc作为肺癌诊断标志物的应用、试剂盒
CN114113287A (zh) 一种血清蛋白制备方法及血清蛋白质组质谱检测方法
CN112986575B (zh) 一种串联式验证dna编码苗头化合物修饰抗体的方法
CN114574437A (zh) 一种血浆外泌体提取试剂、富集方法、提取试剂盒及其应用
CN103389241A (zh) 一种血液纯化的方法
CN112980006A (zh) 蛋白交联纳米亲和微球及制备方法和应用
CN117599763B (zh) 一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用
Lee et al. Mag-spinner: a next-generation Facile, Affordable, Simple, and porTable (FAST) magnetic separation system

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant