CN117187165A - 一种分离外泌体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离外泌体的方法，通过先对β‑环糊精进行改性，而后采用改性后的β‑环糊精对磁性微球进行表面修饰，利用带正电的季铵盐基团与外泌体模组分中带负电的磷脂层静电吸附，以及β‑环糊精对外泌体模组分中的脂肪酸特异性识别包接，在双重协同以及磷钼酸作用下实现了高特异性、高通量提取细胞溶液中的外泌体，从而有效的提高了外泌体的纯度和收率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种分离外泌体的方法。
背景技术
外泌体是指包含了复杂和的小膜泡，人体内多种细胞及体液均可分泌外泌体，包括、、、等。外泌体的功能非常广泛，包括细胞间信息传递、免疫调节、细胞增殖和肿瘤转移等，由于其广泛存在于各种体液中，便于获取和检测，具有疾病诊断和预后检测的应用潜力，因而几乎所有疾病领域都有它的身影；但是如何获得高纯度的外泌体一直是外泌体研究所面临的难题之一。
目前常见的外泌体分离方法有超速离心法、密度梯度离心法、化学沉淀法、尺寸排阻法等。超速离心法是根据样品中外泌体、蛋白质、细胞碎片、细胞以及细胞器等物质沉降速度的差异，通过不同的离心力和离心时间，将外泌体上清液分离；密度梯度离心法是利用外泌体与其他溶质的密度差异而实现分离；化学沉淀法是通过聚乙二醇(PEG)等，改变外泌体溶解度和分散性，使溶解性较低的组分从溶液中析出；尺寸排阻法是根据外泌体大小利用色谱柱进行分离提取的方法，可以获得较为完整的外泌体；上述方法虽然都可以实现外泌体的分离，但是仍存在分离耗时长、回收率低、纯度低、试剂残留量大等问题。
因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的分离外泌体的方法。
为达到本发明之目的，采用如下技术方案：
一种分离外泌体的方法，包括如下步骤：
步骤1：对细胞培养液进行预处理；
步骤2：取经过表面修饰的磁性微珠加入经过预处理的细胞培养液中，在3-5℃的条件下震荡孵育；
步骤3：5-10min后，使用磁铁分离孵育后的材料，用缓冲液清洗3-5次后加入解吸液进行解吸；
步骤4：15-20min后，使用磁铁将磁性微球从上清液中分离出，而后对上清液洗涤、离心、弃去上清液，所得沉淀即为外泌体。
优选的，所述步骤1中，将细胞培养液置于5℃，2000-2500g的条件下离心10-15min，即完成对细胞培养液的预处理。
所述步骤2中，磁性微珠的表面修饰步骤如下：
优选的，步骤S1：称取4.2g磷钼酸和1.25g十八烷基三甲基氯化铵分别溶于10mL和70mL的水中，而后把磷钼酸溶液缓慢滴加到十八烷基三甲基氯化铵溶液中，室温下搅拌；4h后过滤、洗涤、干燥，得到产物1；
步骤S2：称取产物1溶解于10mL 1,2-二氯乙烷中，在搅拌的条件下缓慢滴入β-环糊精溶液中，加热，电磁搅拌回流，放入冰箱静置48h，洗涤，抽滤，自然晾干即得产物2；
步骤S3：称取FeC12、Fe2(SO4)3加入至盛有20mL去离子水的三口烧瓶中并充分混匀，30℃冷凝下边搅拌边滴加氨水，直至pH为10～11，而后升温至50℃反应2h，使形成的Fe304颗粒熟化；反应结束后，冷却至室温，水洗3-5次后加入4mL 95％乙醇，升温至60℃后逐滴加入KH560，反应1.5后冷却至室温，即得改性Fe304磁流体；
步骤S4：称取6g产物2溶于10mL 40％NaOH溶液中，而后加入0.2gNa3P3O9，30℃条件下反应1h后加入改性Fe3O4磁流体0.5g；待其均匀分散后，缓慢滴加7.5g环氧氯丙烷，继续反应90min，加入60mL混有1.2g Span80、Tween20的煤油，高速搅拌10min后降低搅拌速度，60℃条件下反应7h，将所得产物依次用95％乙醇、去离子水、丙酮洗涤，干燥，即得修饰后的磁性微珠。
优选的，所述步骤步骤S2中，产物1与β-环糊精的质量比为1:6。
优选的，所述步骤S3中，FeC12与Fe2(SO4)3的质量比为1:1。
优选的，所述步骤S4中，Span80与Tween20的质量比为3:1。
优选的，所述步骤3中，所述解吸液为β-环糊精酶溶液。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过先对β-环糊精进行改性，而后采用改性后的β-环糊精对磁性微球进行表面修饰，利用带正电的季铵盐基团与外泌体模组分中带负电的磷脂层静电吸附，以及β-环糊精对外泌体模组分中的脂肪酸特异性识别包接，在双重协同以及磷钼酸的作用下实现了高特异性、高通量提取细胞溶液中的外泌体，从而有效的提高了外泌体的纯度和收率。
具体实施方式
为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。
本发明中做采用的原材料、设备及方法均为本领域常规原材料、设备及方法，所用试剂无特殊说明均来源于外购。
一、分离外泌体
步骤1：取待测细胞培养液，例如上皮细胞、干细胞、巨噬细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞等；本实施例以上皮细胞、干细胞、黑色素细胞培养液为例，取待测样本溶液，并对待测样本溶液进行预处理，具体步骤如下：
取100μL待测样本溶液，分别经2000g离心10分钟，2500g离心15分钟，集上清液；然后取50μL用pbs稀释至1ml。
步骤2：使用经过表面修饰的磁性微珠加入经过预处理的细胞培养液中，在3-5℃的条件下震荡孵育；
其中，磁性微珠的表面修饰步骤如下：
步骤S1：称取4.2g磷钼酸和1.25g十八烷基三甲基氯化铵分别溶于10mL和70mL的水中，而后把磷钼酸溶液缓慢滴加到十八烷基三甲基氯化铵溶液中，室温下搅拌；4h后过滤、洗涤、干燥，得到产物1；
步骤S2：称取0.2g产物1溶解于10mL 1,2-二氯乙烷中，在搅拌的条件下缓慢滴入β-环糊精溶液(产物1与β-环糊精的质量比为1:6)中，70℃条件下加热，电磁搅拌回流1.5h，放入冰箱静置48h，洗涤，抽滤，自然晾干即得产物2；
步骤S3：称取FeC12、Fe2(SO4)3各531mg加入至盛有20mL去离子水的三口烧瓶中并充分混匀，30℃冷凝下边搅拌边滴加氨水，直至pH为10～11，而后升温至50℃反应2h，使形成的Fe304颗粒熟化；反应结束后，冷却至室温，水洗3-5次后加入4mL 95％乙醇，升温至60℃后逐滴加入KH560，反应1.5后冷却至室温，即得改性Fe304磁流体；
步骤S4：称取6g产物2溶于10mL 40％NaOH溶液中，而后加入0.2gNa3P3O9，30℃条件下反应1h后加入改性Fe3O4磁流体0.5g；待其均匀分散后，缓慢滴加7.5g环氧氯丙烷，继续反应90min，加入60mL混有1.2g Span80、Tween20(Span80与Tween20的质量比为3:1)的煤油，高速搅拌10min后降低搅拌速度，60℃条件下反应7h，将所得产物依次用95％乙醇、去离子水、丙酮洗涤，干燥，即得修饰后的磁性微珠。
步骤3：孵育5-10min后，使用磁铁分离孵育后的材料，用PBS缓冲液清洗3-5次后加入β-环糊精酶溶液进行解吸。
步骤4：解吸15-20min后，使用磁铁将磁性微球从上清液中分离出，而后对上清液洗涤、离心、弃去上清液，所得沉淀即为外泌体。
对照组
对照组设置2组，分别为对照组1和对照组2；其中，对照组1所使用的磁性微球仅采用β-环糊精进行表面修饰；对照组2采用仅具有季铵盐阳离子，不含磷钼酸的β-环糊精对磁性微球进行表面修饰；其余步骤均与本发明的步骤相同。
分别对采用本发明的方法以及对照组1和对照组2的方法分离的外泌体的形态、收率、纯度进行检测，结果显示，采用本发明的方法分离的外泌体，其形态完整，无粘连，收率为75％，纯度为96.4％；采用对照组1的方法分离的外泌体，其边缘有破损或变形，收率为35％，纯度为67.1％；采用对照组1的方法分离的外泌体，其边缘有破损或变形，收率为58％，纯度为85.1。
综上所述，采用本发明的方法可以有效提高外泌体的纯度，并保证外泌体的完整度。
所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。
Claims (7)
1.一种分离外泌体的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1：对细胞培养液进行预处理；
步骤2：取经过表面修饰的磁性微珠加入经过预处理的细胞培养液中，在3-5℃的条件下震荡孵育；
步骤3：5-10min后，使用磁铁分离孵育后的材料，用缓冲液清洗3-5次后加入解吸液进行解吸；
步骤4：15-20min后，使用磁铁将磁性微球从上清液中分离出，而后对上清液洗涤、离心、弃去上清液，所得沉淀即为外泌体。
2.根据权利要求1所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤1中，将细胞培养液置于5℃，2000-2500g的条件下离心10-15min，即完成对细胞培养液的预处理。
3.根据权利要求2所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤2中，磁性微珠的表面修饰步骤如下：
步骤S1：称取4.2g磷钼酸和1.25g十八烷基三甲基氯化铵分别溶于10mL和70mL的水中，而后把磷钼酸溶液缓慢滴加到十八烷基三甲基氯化铵溶液中，室温下搅拌；4h后过滤、洗涤、干燥，得到产物1；
步骤S2：称取产物1溶解于10mL 1,2-二氯乙烷中，在搅拌的条件下缓慢滴入β-环糊精溶液中，加热，电磁搅拌回流，放入冰箱静置48h，洗涤，抽滤，自然晾干即得产物2；
步骤S3：称取FeC12、Fe2(SO4)3加入至盛有20mL去离子水的三口烧瓶中并充分混匀，30℃冷凝下边搅拌边滴加氨水，直至pH为10～11，而后升温至50℃反应2h，使形成的Fe304颗粒熟化；反应结束后，冷却至室温，水洗3-5次后加入4mL 95％乙醇，升温至60℃后逐滴加入KH560，反应1.5后冷却至室温，即得改性Fe304磁流体；
步骤S4：称取6g产物2溶于10mL 40％NaOH溶液中，而后加入0.2gNa3P3O9，30℃条件下反应1h后加入改性Fe3O4磁流体0.5g；待其均匀分散后，缓慢滴加7.5g环氧氯丙烷，继续反应90min，加入60mL混有1.2g Span80、Tween20的煤油，高速搅拌10min后降低搅拌速度，60℃条件下反应7h，将所得产物依次用95％乙醇、去离子水、丙酮洗涤，干燥，即得修饰后的磁性微珠。
4.根据权利要求3所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤步骤S2中，产物1与β-环糊精的质量比为1:6。
5.根据权利要求3所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S3中，FeC12与Fe2(SO4)3的质量比为1:1。
6.根据权利要求3所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤S4中，Span80与Tween20的质量比为3:1。
7.根据权利要求1所述的一种分离外泌体的方法，其特征在于：所述步骤3中，所述解吸液为β-环糊精酶溶液。
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|---|---|---|---|
| CN202311169529.1A Pending CN117187165A (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种分离外泌体的方法 |
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|---|---|
| CN (1) | CN117187165A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20120070858A1 (en) * | 2009-04-23 | 2012-03-22 | Lionel Fernel Gamarra Contreras | Method for isolating exosomes from biological solutions using iron oxide nanoparticles |
| CN103406081A (zh) * | 2013-07-16 | 2013-11-27 | 商洛学院 | 一种阴离子β-环糊精磁性微球的制备方法及应用 |
| CN111961636A (zh) * | 2020-07-06 | 2020-11-20 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种外泌体的提取试剂及其应用 |
| WO2021086139A1 (ko) * | 2019-10-30 | 2021-05-06 | 연세대학교 원주산학협력단 | 자성 나노입자 클러스터를 이용한 줄기세포 유래 엑소좀 생성 촉진 방법 |
| WO2023274252A1 (zh) * | 2021-06-30 | 2023-01-05 | 同济大学 | 一种聚合物修饰的磁性纳米材料、其制备方法及应用 |
| CN116116385A (zh) * | 2022-12-26 | 2023-05-16 | 北京青莲百奥生物科技有限公司 | 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311169529.1A patent/CN117187165A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
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