CN117599763B

CN117599763B - 一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用

Info

Publication number: CN117599763B
Application number: CN202410087176.9A
Authority: CN
Inventors: 陈思洁; 孙龙钦; 李京丽; 赵焱; 孙薇; 吴松锋; 何琳; 黄帅
Original assignee: Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Qinglian Baiao Biotechnology Co ltd
Priority date: 2024-01-22
Filing date: 2024-01-22
Publication date: 2024-04-09
Anticipated expiration: 2044-01-22
Also published as: CN117599763A

Abstract

本发明公开了一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用，本发明制备的双富集基团富集磁珠兼具有阳离子季铵盐与金属离子基团，通过利用外泌体膜磷脂双分子层中磷酸基团与金属钛离子的配位螯合作用，同时带有正电的季铵盐与带有负电磷酸的静电吸附的作用，实现对血液外泌体的高特异性提取，提取速度快，回收率高。

Description

一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用。

背景技术

人类的血液是诊断分析时常用的临床样本，因样本采集过程中微创且低风险，便于在疾病过程中进行连续检测，因此在临床诊断中普遍使用。外泌体（exosome，EXO）是由细胞内多泡体(multivesicular body，MVB)释放到细胞外基质中的膜性囊泡。几乎所有类型的细胞，都可以产生并释放外泌体，因此血液中包含丰富的外泌体。外泌体，包含细胞的许多成分，包括DNA、RNA、脂质、代谢物以及胞质和细胞表面蛋白，近年来已被认为是肿瘤诊断的新生标志物的来源。分血液外泌体的主要挑战是其中存在大量的红细胞，白细胞和血小板等，使得含量较低的外泌体检测和鉴定变得非常困难。

目前已经基于外泌体的尺寸、疏水性蛋白和特征蛋白开发了多种从复杂样品中分离外泌体的方法，包括超滤法、超速离心法、聚合物沉淀、体积排阻色谱以及免疫亲和捕获等。其中，超速离心法是目前最常用的提取外泌体的方法，被誉为外泌体提取的“金方法”。但这些方法要么面临EXO纯度不高，要么面临方法复杂、EXO产量的损失等问题。因此需发展从复杂样品中富集具有足够产量和纯度的外泌体方法。目前磁珠表面功能化的方法，通常是将二氧化硅层附着于四氧化三铁，再通过带有不同基团的硅烷偶联剂水解的方式，将各种功能性集团修饰在磁珠表面。但这种方法往往只能键合单层功能基团，使磁珠的功能单一，导致富集性能有限。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明合成一种表面修饰兼具有阳离子季铵盐基团与金属离子的新型氧化石墨烯磁珠，用于血液外泌体的高效富集。该材料在磁珠表面以共聚的方式修饰SiO₂层，经过多步化学修饰，并在聚合物上引入伯胺及季铵盐分支，伯胺继续修饰金属离子，最终构建低吸附、双富集基团（季铵盐与金属阳离子）的外泌体富集磁珠，具体包含以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种双富集基团富集磁珠的制作方法，所述方法包括以下步骤：

1）利用硅酸四乙酯在基底材料-Fe₃O₄纳米颗粒表面包裹SiO₂，形成基底材料-Fe₃O₄@SiO₂@MPS颗粒；

2）将MBA，NVF通过共聚的方式，固定在基底材料-Fe₃O₄@SiO₂@MPS表面，并引入氨基，得到基底材料-Fe₃O₄@SiO₂@MBA/NVF；

3）在步骤2）的基础上在侧链上引入金属离子和季铵盐，得到双功能外泌体富集磁性纳米颗粒。

在一些实施方案中，所述基底材料包括聚合物（例如GO等）、陶瓷、金属等任何种类的可以提供多个表面的基质。在一些实施方案中，所述基底材料-Fe₃O₄纳米颗粒可以是自制的或是来自商业购买的商品。

术语“基底材料”是指提供一个或多个表面的基质，其中该表面能够形成纳米颗粒，或者其他物质可以接枝或以其他方式附着其上。

在一些实施方案中，构成金属离子的“金属”可为任何合适的金属，例如，过渡金属、镧系或锕系金属、第I族或第II族金属或准金属。如本文所用的术语“金属离子”可指金属离子体物质，包括多原子金属离子体物质，例如，金属离子络合物。例如，术语“金属离子”可涵盖MO₄ ^-或MO₄ ^2-离子(其中M为如本文所述的金属)，或当在水溶液中时，可涵盖包含一种或多种金属离子和一种或多种氧代、羟代、氯代和/或水代配体的金属离子络合物，这取决于所述溶液的pH和盐浓度。

术语“铵”本身涉及阳离子NH4⁺。类似地在表述“伯、仲、叔胺及其铵盐”中使用的表述“伯、仲或叔胺的铵阳离子”涉及质子化的伯、仲或叔胺。该类铵阳离子的质子化取决于pH并且正电荷相应地变化。术语“季铵(阳离子)”涉及含有具有4个有机结合配对，例如烷基的氮原子的永久带正电的阳离子。因此，术语“季铵盐”涉及含有季铵阳离子的盐。

在一些具体的实施方案中，所述季铵盐包括四甲基铵、四乙基铵、四乙醇铵、胆碱、2-羟基乙基三甲基铵、三羟乙基甲基铵、N,N'-亚甲基丙烯酰胺、N-乙烯基甲酰胺、缩水甘油基三甲基氯化铵等具体的实例。

进一步，所述方法包括步骤：

1）GO-Fe₃O₄、乙醇和水混合，搅拌，加入MPS、氨水、TEOS，孵育，孵育后加热至70℃，反应得到第一产物；

2）第一产物加入到含有乙腈、甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基丙烯酰胺、AIBN、N-乙烯基甲酰胺的混合物中，加热到110℃，回流冷凝，机械搅拌反应，60℃下烘干得到第二产物；

3）将水加热到100℃，调整水的pH>9，将第二产物加入水中，回流冷凝，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，调节pH到9-10，在冰浴条件下，加入二氧六环，加入碳酸酐二叔丁酯，室温搅拌反应，60℃下烘干得到第三产物，全部第三产物加入去离子水，调节pH为10，逐滴加入缩水甘油基三甲基氯化铵，反应，室温下搅拌过夜，干燥得第四产物，所有第四产物溶于DCM与TFA混合溶液中，室温反应，干燥得第五产物，所有第五产物分散于DMSO中，依次加入EDC、NHS、三乙胺、3-膦酰基丙酸、室温反应，得到第六产物，将所有第六产物分散于硫酸钛水溶液中，室温搅拌反应，干燥得最终产物。

进一步，所述步骤1）-3）得到第一产物、第二产物、第三产物、第四产物、第五产物、第六产物之前还包括使用水与乙醇交替洗涤的步骤，得到最终产物之前还包括使用水洗涤的步骤。

进一步，所述步骤1）中GO-Fe₃O₄、乙醇、水、MPS、氨水、TEOS的比例为30 mg：40 mL：10 mL：1 mL：4 mL：240 μL。

进一步，所述步骤1）中水包括去离子水或超纯水。

进一步，所述步骤1）中搅拌方式包括机械搅拌。

进一步，所述步骤1）中孵育时间包括4 h。

进一步，所述步骤1）中孵育后加热至70℃后反应时间5 h。

进一步，所述步骤2）中第一产物、乙腈、甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基丙烯酰胺、AIBN、N-乙烯基甲酰胺的比例为30 mg：40 mL：100 μL：60 mg：10 mg：60 mg。

进一步，所述步骤2）中机械搅拌反应的时间包括30 min。

进一步，所述步骤3）水、第二产物、碳酸酐二叔丁酯、缩水甘油基三甲基氯化铵、去离子水、DMSO、EDC、NHS、三乙胺、3-膦酰基丙酸、硫酸钛水溶液的比例为15 mL：30 mg：240mg：1 mL：30 mL：5 mL：382 mg：230 mg：250 μL：30 mg：50 mL。

进一步，所述步骤3）中调整水的pH值使用的是NaOH溶液。

进一步，所述NaOH溶液的浓度为5%。

进一步，所述NaOH溶液使用水为溶剂。

进一步，所述将第二产物加入100℃水中，回流冷凝，搅拌反应的时间为3 h。

进一步，所述步骤3）中冷却至室温，调节pH值的范围包括9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10。

进一步，所述步骤3）中加入碳酸酐二叔丁酯，室温搅拌反应的时间包括1 h。

进一步，所述步骤3）中逐滴加入缩水甘油基三甲基氯化铵水溶液反应的时间包括3 h。

进一步，所述步骤3）中DCM与TFA混合溶液中DCM与TFA的体积比为5:1。

进一步，所述步骤3）所有第四产物溶于DCM与TFA混合溶液中，室温反应30 min。

进一步，所述步骤3）中得到第六产物之前的室温反应的时间为6 h。

进一步，所述第六产物加入硫酸钛水溶液，室温反应的时间包括12 h。

进一步，所述硫酸钛水溶液的浓度为2 wt%。

在一些实施方案中，所述双富集基团富集磁珠的制作方法具体包括：

1）30 mg GO-Fe₃O₄、40 mL乙醇和10 mL去离子水混合，机械搅拌，加入1 mL MPS、4mL氨水、240 μL TEOS，孵育4 h，孵育后加热至70℃，反应5 h，分别用水和乙醇交替洗涤多次，得到第一产物；

2）30 mg第一产物加入到含有40 mL乙腈、100 μL甲基丙烯酸、60 mg N,N'-亚甲基丙烯酰胺、10 mg AIBN、60 mg N-乙烯基甲酰胺的混合物中，加热到110℃，回流冷凝，机械搅拌反应30 min，用水与乙醇交替洗涤多次，得到第二产物；

3）将15 mL水加热到100℃，调整水的pH>9，将30 mg第二产物加入100℃水中，回流冷凝，搅拌反应3 h，反应结束后冷却至室温，调节pH到9-10，加入二氧六环，加入240 mg碳酸酐二叔丁酯，室温搅拌反应1 h，60℃下烘干得到第三产物，全部第三产物加入30 mL去离子水，调节pH为10，逐滴加入1 mL缩水甘油基三甲基氯化铵，反应3 h，室温下搅拌过夜，干燥得第四产物，所有第四产物溶于DCM与TFA混合溶液中，室温反应30 min，干燥得第五产物，所有第五产物分散于5 mLDMSO中，依次加入382 mg EDC、230 mg NHS、250 μL 三乙胺、30 mg 3-膦酰基丙酸、室温反应6 h，得到第六产物，将所有第六产物分散于50 mL硫酸钛水溶液中，室温搅拌反应，干燥得最终产物。在一个实施方案中，所述第一产物为GO/MoS₂-Fe₃O₄@ SiO₂@MPS。在一个实施方案中，所述第二产物为GO-Fe₃O₄@SiO₂@MBA/NVF。在一个实施方案中，所述最终产物为GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺。

术语“TEOS”又名四乙氧基硅烷、硅酸四乙酯，是一种有机化合物，化学式为C₈H₂₀O₄Si，为无色液体，微溶于水，微溶于苯，溶于乙醚，混溶于乙醇，主要用作电器绝缘材料、涂料、光学玻璃处理剂，还用于有机合成。

术语“甲基丙烯酸”是指MAA，是一种有机化合物，化学式为C₄H₆O₂，为无色结晶性粉末或无色透明液体。

术语“N，N'-亚甲基丙烯酰胺”是指MBA，又称亚甲基双丙烯酰胺，是一种化学物质，分子式为C₇H₁₀N₂O₂，白色粉末状结晶。无气味，吸湿性极小。对光敏感。

术语“2,2′-偶氮二（2-甲基丙腈）”又称“AIBN”，常称为偶氮二异丁腈，是一种有机化合物，化学式为C₈H₁₂N₄，为白色结晶性粉末，不溶于水，溶于乙醇、乙醚、甲苯、甲醇等多种有机溶剂。

术语“N-乙烯基甲酰胺”又称NVF，可用于亲水性聚合物、生物医用高分子材料、环境处理聚合物材料的合成制造。也可用作光固化油墨、涂料、胶粘剂的活性稀释剂。

术语“碳酸酐二叔丁酯” 又称Boc₂O）主要用于引入叔丁氧羰基（Boc）保护基来保护氨基（尤其是氨基酸的氨基），是有机合成常用试剂之一。英文名称为: Di-tert-butyldicarbonate, C.A 命名及登录号:Dicarbonic acid，bis(1,1- dimethylethyl) ester,[24424-99-5]。

术语“N,N-二甲基甲酰胺”又称“DMF”，是一种有机化合物，化学式为C₃H₇NO，为无色透明液体。既是一种用途极广的化工原料，也是一种用途很广的优良的溶剂。能与水及多数有机溶剂任意混合，对多种有机化合物和无机化合物均有良好的溶解能力。

术语“缩水甘油基三甲基氯化铵”又称GTMAC，分子式：C₆H₁₄ClNO，别名2,3-环氧丙基三甲基氯化铵，是一种有机化学物质。

术语“DMSO”又称二甲基亚砜，是一种含硫有机化合物，分子式为C₂H₆OS，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物。

在一些实施方案中，所述GO-Fe₃O₄、乙醇、MPS、氨水、TEOS、乙腈、甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基丙烯酰胺、AIBN、N-乙烯基甲酰胺、NaOH、碳酸酐二叔丁酯、N,N-二甲基甲酰胺、缩水甘油基三甲基氯化铵、EDC、NHS、3-膦酰基丙酸、DMSO、三乙胺、硫酸钛中的一种、多种或全部均可来自于商业化生产的试剂，也可来自于自主制备。

本发明第二方面提供了前面所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠。

本发明第三方面提供了包含有前面任一项所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠的产品。

进一步，所述产品包括试剂、试剂盒、仪器、设备、装置、系统。

进一步，所述试剂盒包含磁性物质。

进一步，所述磁性物质包括磁铁。

进一步，所述试剂盒包括液体反应容器与液体收集容器。

进一步，所述容器包括低吸附容器。

术语“容器”是指任何种类的罐、接受器、反应器、或其组合。“容器”可以发生生化反应。术语“容器”和“隔室”可以互换使用。容器或隔室可以是固体壁的(当容器或隔室的边界是固体，如玻璃、塑料或聚二甲基硅氧烷(PDMS))，或液体壁的(当容器或隔室的边界是液体，如油)。固体壁容器可以含有一个固体支架，它是连接所有容器的连续固体。容器可以包含多种可聚合或可胶凝的聚合物和/或单体。多种可聚合或可胶凝的聚合物和/或单体可以在聚合或胶凝时形成水凝胶或硬化基质，从而形成硬化颗粒。硬化颗粒可以是珠。硬化颗粒可以是多孔颗粒。硬化颗粒可以是水凝胶颗粒。水凝胶颗粒可以由凝胶状聚合物，如交联聚丙烯酰胺、交联PEG、琼脂糖或海藻酸盐制成。硬化颗粒经处理或刺激后可以熔化。

术语“磁珠”指粒径在微纳米范围的超顺磁微球，具有很强的顺磁性，磁珠的磁核为超顺磁四氧化三铁。

本发明第四方面提供了前面任一项所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠在制备外泌体中的应用。

进一步，所述外泌体来自受试者的体液样本或人工培养细胞、组织的培养液。

术语“外泌体”是指由体内几乎所有细胞类型分泌的内吞衍生的纳米囊泡。外泌体或外泌体样囊泡包括蛋白质、核酸(尤其是miRNA)和脂质。

术语“患者”、“生物受试者”、“受试者”、“个体”、“被采集者”在本文中可互换使用来指动物受试者，特别是脊椎动物受试者，更特别是哺乳动物受试者。落在本发明的范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物亚门的任何成员，包括灵长目动物、啮齿动物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠）、兔形目动物（例如，家兔、野兔）、牛科动物（例如，牛）、绵羊类动物（例如，绵羊）、山羊类动物（例如，山羊）、猪类动物（例如，猪）、马科动物（例如，马）、犬科动物（例如，狗）、猫科动物（例如，猫）、鸟类动物（例如，鸡；鸭；鹅；陪伴鸟类，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等）、海洋哺乳动物（例如，海豚、鲸鱼）、爬行动物（例如，蛇、青蛙、蜥蜴等）和鱼。优选的受试者是灵长目动物（例如，人、猿、猴、黑猩猩）。

进一步，所述受试者包括灵长目动物、啮齿动物、兔形目动物、牛科动物、绵羊类动物、山羊类动物、猪类动物、马科动物、犬科动物、猫科动物、鸟类动物、海洋哺乳动物、爬行动物或鱼。

更进一步，所述受试者包括人。

本发明第五方面提供了一种外泌体提取的方法，所述方法包括将前面任一项所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠与样品混合，磁铁吸附得到携带有外泌体的双富集基团富集磁珠的步骤。

进一步，所述外泌体提取的方法是非诊断或非治疗目的的。

进一步，所述样品来自被采集者的体液或人工培养细胞、组织的培养液。

进一步，所述细胞、组织是指任意真核细胞

在某个更具体的实施方案中，所述细胞包括心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、肾细胞、角质化细胞、黑色素细胞、成骨细胞、前成脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、干细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞中。

术语“细胞 (cell)”涵盖植物和动物细胞，并且包括无脊椎动物、非哺乳类脊椎动物和哺乳动物细胞。所有这样的名称包括细胞群体和后代。

本发明中，动物人体内的体液成分复杂，因此制备方法得到的是混合物，所述提取外泌体的方法使用双富集基团富集磁珠提取到的是含有本发明双富集基团富集磁珠和外泌体的混合物，因此外泌体是其主要成分，因此成为外泌体提取的方法。

进一步，所述样品是含有外泌体的样品。

进一步，所述样品包括体液样品。

进一步，所述体液样品可以是尿液样品、血液样品、痰样品、母乳样品、脑脊液(CSF)样品、耵聍(耳垢)样品、胃液样品、粘液样品、内淋巴液样品、外淋巴液样品、腹膜液样品、胸膜液样品、唾液样品、皮脂(皮肤油脂)样品、精液样品、汗液样品、泪液样品、面颊拭子、阴道分泌物样品、液体活检或呕吐物样品，包括它们的成分或组分。“体液样品”还涵盖体液组分，例如血液组分、尿液组分或痰组分。体液样品可以混合或合并。因此，体液样品可以是血液和尿液样品的混合物，或者血液和脑脊液样品的混合物。所述体液样品可以通过从个体或(对照)受试者取出体液来提供，但也可以通过使用先前分离的体液样品材料来提供。体液样品使得能够对个体进行非侵入性分析。进一步优选体液样品的体积为0.01-20mL，更优选为0.1-10mL，甚至更优选为0.5-8mL，并且最优选为1-5mL。如果体液样品是从至少一个(对照)受试者获得的，例如从至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500或1,000个对照受试者获得，则将其指定为“参比体液样品”。

术语“血液样品”涵盖全血样品或血液组分样品，例如血细胞/细胞组分、血清或血浆样品。

进一步，所述样本是预处理过的，所述预处理过的样本包括离心、稀释等。

进一步，所述预处理包括取100 μL血浆，分别经300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000g离心30分钟，收集上清液，取50 μL用PBS稀释至1 mL。

本发明的优点和有益效果：

本发明利用GO作为基体材料，增加了磁珠的比表面积。修饰的双富集基团与外泌体具有双重协同作用，金属钛离子与外泌体膜磷脂双分子层中磷酸基团的配位螯合作用，以及带有正电的季铵盐基团与带有负电磷脂层的静电吸附，实现了对血液外泌体的高特异性、高通量富集。磁珠高特异性技术与质谱技术结合，实现了血液外泌体蛋白质组的深度研究。

附图说明

图1是双富集基团富集磁珠合成流程图；

图2是双富集基团富集磁珠富集血液外泌体实验流程图；

图3是不同粒子的透射电镜图，其中，a为GO，b为GO-Fe₃O₄，c为GO-Fe₃O₄@SiO₂@MBA/NVF，d为GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺；

图4是不同粒子的XPS表征图，其中，a为GO-Fe₃O₄，b为GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺；

图5是经双功能磁珠富集的血液外泌体透射电镜图；

图6是经双功能磁珠富集的血液外泌体粒径分布图。

具体实施方式

除非另有规定，本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。尽管与本文所述的那些方法、组合物、试剂、细胞相似或等效的任意方法、组合物、试剂、细胞可以用于实施或检验本发明中，然而在此描述优选的方法和材料。将本说明书中引用的全部出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，通过引用方式完整并入本文，如同特别地和逐一地指明，将每份单独的出版物或参考文献通过引用方式并入本文，作为完全阐述。本申请要求优先权的任何专利申请也通过引用的方式以针对出版物和参考文献所描述的上述方式完整并入本文。上文所讨论的出版物仅是为了揭示在本申请的申请日之前的出版物而提供的。本文中任何内容均不得解释为承认由于在先发明而使得本发明不早于这种公布。

实施例1双富集基团富集磁珠的合成及外泌体提取效果验证

1、磁性GO-Fe₃O₄的合成（也可使用商业来源的GO-Fe₃O₄）

称取30 mg GO纳米材料，溶解于30 mL乙二醇中，超声至均匀分散状态，加入FeCl₃·6H₂O和柠檬酸三钠，超声至完全溶解，继续加入无水乙酸钠，将所得分散均匀的溶液转入teflon高压反应釜，200℃反应8 h以上，得到的磁珠用乙醇与水各洗3次烘干，即为可得到产物GO-Fe₃O₄。

2、双富集基团富集磁珠（GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺)的合成

1）GO-Fe₃O₄@SiO₂@MPS的制备

将30.0 mg GO-Fe₃O₄加入到40 mL乙醇和10 mL去离子水中，机械搅拌。在溶液中加入1 mL MPS、4 mL氨水和240 μL TEOS孵育4 h。将混合溶液加热至70℃，反应5 h，产物分别用水和乙醇洗涤3次，得到GO/MoS₂-Fe₃O₄@ SiO₂@MPS。

2）GO-Fe₃O₄@SiO₂@MBA/NVF的制备

将30 mg GO-Fe₃O₄@SiO₂@MPS加入到含有40 mL乙腈、100 μL 甲基丙烯酸（MAA）、60mg N,N'-亚甲基丙烯酰胺 (MBA)、10 mg 2,2′-偶氮二（2-甲基丙腈）（AIBN）、60 mg N-乙烯基甲酰胺(NVF)的混合物中。将混合体系电热套定温为110℃，回流冷凝，机械搅拌反应30min。最后用水与乙醇交替洗涤三次，60℃下烘干。

3）双富集基团富集磁珠（即双功能磁珠，GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺)的合成

将15mL的水加热至100℃，将NaOH水溶液，加入到预热的水溶液中，使pH>9，再加入GO-Fe3O4@SiO2@MBA/NVF，回流冷凝，搅拌反应3h，反应结束后，冷却至室温。加入去离子水调节pH 9-10，在冰浴条件下，加入二氧六环，加入240mg碳酸酐二叔丁酯（Boc2O），室温搅拌反应1h。用水与乙醇交替洗涤三次，60℃下烘干。在产物中加入30 mL的去离子水，用NaOH水溶液将 pH 值调节至 10，逐滴加入1 mL 缩水甘油基三甲基氯化铵（GTMAC），反应3小时，在室温下搅拌过夜，产物用乙醇与水交替洗涤三次，干燥。将产物溶于DCM：TFA=5：1（体积比）的水溶液中，室温反应30min，反应结束后，用乙醇与水交替洗涤三次，干燥。产物分散于5 mL DMSO中，依次加入382 mg EDC和230 mg NHS，250 μL三乙胺，30 mg 3-膦酰基丙酸，室温反应6 h，乙醇和水各洗3次，将材料分散于50 mL硫酸钛水溶液中，室温搅拌12 h，水洗三次，干燥保存。

4、血液样本预处理

取100 μL血浆，分别经300 g离心10分钟，2000 g离心10分钟，10000 g离心30分钟，收集上清液。然后取50 μL用PBS稀释至1 mL。

5、血浆样本中外泌体提取及制备

称取1 mg 双富集基团富集磁珠，用纯水清洗1次，加入到血清中，4℃震荡孵育5分钟，通过磁铁分离孵育后的材料，并用PBS缓冲液洗涤3次；将得到的表面吸附有外泌体的磁性材料置于冰上，加入4% SDS裂解液20 μL中，超声裂解20分钟，用磁铁将材料与上清液分离后，吸取全部上清，加入80 μL 8M尿素溶液、二硫苏糖醇(终浓度20 mmol/L)，37℃反应4小时后，将所得溶液转移至FASP管中，用8 M尿素溶液洗涤2次，加入碘乙酰胺(终浓度50mmol/L)，室温下避光反应1小时，用50 mM碳酸氢铵溶液洗涤3次，加入1 μg胰蛋白酶，37℃酶切12小时，将所得溶液45℃热干，用 0.1%甲酸水溶液定容后，质谱上样分析，上样量1 μg。

6、LC-MS/MS分析和数据库检索和数据分析

配制流动相A 液(100%水、0.1%甲酸)和 B 液(80%乙睛、0.1%甲酸)。使用 10 μLA液溶解冻干粉末，4℃下 14000 g 离心 20 min，取上清 400 ng 样品进样，液质检测。液相色谱洗脱条件为：0-17 min（3.5-32% B）,18-20 min(32-95% B)，21-22 min(100%B)。使用timsTOF HT质谱仪，Captive Spray离子源，质谱采用DIA模式采集，质谱扫描范围为 m/z300-1500，一级质谱分辨率设为60000(1222 m/z)在TIMS隧道中，累积时间设定为50 ms。毛细管电压设定为1.5 kV，迁移率为0.70~1.30 cm²/(V)。总循环时间为1.23 s。生成质谱检测原始数据 (.d)。

采集的质谱数据使用DIANN搜库检索。目标数据库为uniprot.human。检索参数设置为胰蛋白酶全酶切，设定2个蛋白酶漏切位点，蛋白质固定修饰选取Carbamidomethyl(C)，可变修饰为Oxidation(M)。质谱一级质量误差为15 ppm，二级质量误差为15 ppm，假阳性率设为1%。

经过GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺双功能磁珠富集得到的血液外泌体蛋白质组鉴定结果如表1所示。

表1经双功能磁珠富集的血液外泌体蛋白质组鉴定量

7、透射电镜检测

GO及合成的GO-Fe₃O₄、GO-Fe₃O₄@SiO₂@MBA/NVF、GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺的透射电镜结果如图3所示。其中GO-Fe₃O₄，GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺的XPS表征结果如图4所示。

本发明得到的GO-Fe₃O₄@SiO₂@R₄NCl/Ti⁴⁺双功能磁珠在富集外泌体后在电镜下的图像如图5所示，具体粒径结果如图6与表2所示，其平均粒径为131.5 nm，浓度为7.2E+5。

表2经双功能磁珠富集的血液外泌体粒径分布

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种双富集基团富集磁珠的制作方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

3）将水加热到100℃，调整水的pH>9，将第二产物加入100℃水中，回流冷凝，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，调节pH到9-10，加入二氧六环，加入碳酸酐二叔丁酯，室温搅拌反应，60℃下烘干得到第三产物，全部第三产物加入去离子水，调节pH为10，逐滴加入缩水甘油基三甲基氯化铵，反应，室温下搅拌过夜，干燥得第四产物，所有第四产物溶于DCM与TFA混合溶液中，室温反应，干燥得第五产物，所有第五产物分散于DMSO中，依次加入EDC、NHS、三乙胺、3-膦酰基丙酸、室温反应，得到第六产物，将所有第六产物分散于硫酸钛水溶液中，室温搅拌反应，干燥得最终产物；

所述步骤1）中GO-Fe₃O₄、乙醇、水、MPS、氨水、TEOS的比例为30 mg：40 mL：10 mL：1 mL：4mL：240 μL；

所述步骤2）中第一产物、乙腈、甲基丙烯酸、N,N'-亚甲基丙烯酰胺、AIBN、N-乙烯基甲酰胺的比例为30 mg：40 mL：100 μL：60 mg：10 mg：60 mg；

所述步骤3）水、第二产物、碳酸酐二叔丁酯、缩水甘油基三甲基氯化铵、去离子水、DMSO、EDC、NHS、三乙胺、3-膦酰基丙酸、硫酸钛水溶液的比例为15 mL：30 mg：240 mg：1 mL：30 mL：5 mL：382 mg：230 mg：250 μL：30 mg：50 mL。

2.根据权利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述步骤1）-3）得到或烘干得到第一产物、第二产物、第三产物、第四产物、第五产物、第六产物之前还包括使用水与乙醇交替洗涤的步骤，得到最终产物之前还包括使用水洗涤的步骤。

3.权利要求1或2所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠。

4.包含有权利要求1或2所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠的产品。

5.权利要求1或2所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠在制备外泌体中的应用。

6.一种外泌体提取的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1或2所述的制作方法得到的双富集基团富集磁珠与样品混合，磁铁吸附得到携带有外泌体的双富集基团富集磁珠的步骤。