CN101402949B

CN101402949B - 一种利用钴离子金属螯合亲和膜纯化木瓜蛋白酶的方法

Info

Publication number: CN101402949B
Application number: CN2008100410388A
Authority: CN
Inventors: 朱利民; 何智妍; 聂华丽; 周毓婷; 胡映清
Original assignee: Donghua University
Current assignee: Donghua University
Priority date: 2008-07-25
Filing date: 2008-07-25
Publication date: 2012-03-21
Anticipated expiration: 2028-07-25
Also published as: CN101402949A

Abstract

本发明涉及一种利用钴离子金属螯合亲和膜纯化木瓜蛋白酶的方法，包括：(1)活化的尼龙膜经壳聚糖键合改性；(2)改性后的尼龙膜与环氧氯丙烷、氢氧化钠和硼氢化钠的混合溶液反应，再将上述膜分别浸入碳酸钠、硼氢化钠和偶联剂的混合溶液和氯化钴溶液，得到螯合钴离子的金属亲和膜；(3)将上述金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入Tris-HCl缓冲液和洗脱液，接着送入木瓜蛋白酶溶液，然后以洗脱剂进行洗脱，得到木瓜蛋白酶；(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。本发明方法快速、高效、简便、分离量大，提取的酶活性好，适用于工业规模化。

Description

一种利用钴离子金属螯合亲和膜纯化木瓜蛋白酶的方法

技术领域

本发明涉及蛋白酶的提纯领域，特别是涉及一种利用钴离子金属螯合亲和膜纯化木瓜蛋白酶的方法。

背景技术

木瓜蛋白酶(Papain)简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，酶学编号EC3.4.22.2，是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品，它是一类含巯基(～SH)蛋白酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，其广泛的特异性对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，能催化各种蛋白质，水解成一系列长短不一的短肽或氨基酸，还能把蛋白水解物合成为类蛋白质，由于它的热稳定性好及天然卫生安全等特点，广泛应用于食品、皮革、纺织、日化和制药行业，提高产品质量与档次，降低成本。

目前，木瓜蛋白酶的提取纯化主要是采用沉淀法，但是这种方法工艺繁琐，产品中仍然混有其它的蛋白酶，纯度不高，不能达到制药工业的需求。随着人们对纯度和安全性提出进一步的要求，色谱技术应用于木瓜蛋白酶的纯化，如离子交换色谱、亲和色谱，该类填料特异性高，纯化倍数高，但分离速度受粒间扩散和低的轴向速率限制，压降大，分离时间长，处理量小，不能使用高的加料速度。而膜分离是一种根据分子的大小进行分离的技术，特点是表面积大、扩散路径短、操作压低、处理量大，但传统膜分离技术只有分离相对分子质量相差10倍以上的物系，不能满足生化分离的需要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，该方法快速、高效、简便、分离量大，适于工业规模化。

本发明的一种利用钴离子金属螯合亲和膜纯化木瓜蛋白酶的方法，包括：

(1)尼龙膜的改性：尼龙膜先在25℃ 1 M HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％磷酸，于60℃反应7h，40～50℃热水洗涤，再浸入10ml 1wt％～2wt％的壳聚糖溶液中，室温反应1h后，转入烘箱60～90℃烘干1h，分别用1.0vol％～5.0vol％醋酸和去离子水洗涤；

(2)尼龙膜螯合金属钴离子：将改性后的尼龙膜浸入4～5ml环氧氯丙烷、40～55ml氢氧化钠和3～6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1～3h后，加入20～30ml环氧氯丙烷溶液和40～50ml氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8～18h，洗涤后再将上述膜浸入110～120ml碳酸钠、6～9mmol硼氢化钠和80～90mmol偶联剂亚氨基二乙酸(IDA)的混合溶液，50～70℃反应10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的氯化钴溶液，反应1～3h，得到螯合钴离子的金属亲和膜；

(3)蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min；接着送入100ml 0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～10.0的木瓜蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0～2.0mol/L，反应10～100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到木瓜蛋白酶；

(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。

所述的步骤(1)中壳聚糖溶液是以0.5vol.％～2.0vol.％醋酸溶解。

所述的步骤(2)中环氧氯丙烷浓度为95wt％～100wt％，氢氧化钠和碳酸钠溶液的浓度为1～3mol/L；环氧氯丙烷、氢氧化钠与硼氢化钠的混合溶液中，三者的体积比为0.9～1.1∶8～11∶0.003～0.005。

所述的步骤(2)中洗涤分别用去离子水和4.0vol％～8.0vol％的醋酸洗涤。

所述的步骤(3)中最佳提纯条件为：反应时间为30min，pH＝9.0，木瓜蛋白酶的吸附浓度为2.0mg/ml，离子强度为0mol/L的氯化钠溶液，即木瓜蛋白酶溶液中不含氯化钠溶液。

所述的步骤(3)中洗脱剂为硫氰酸钠或氯化钠，洗脱剂离子强度为0～2.0mol/L，洗脱缓冲液的pH＝3.0～9.0。

所述的步骤(3)中最佳洗脱条件为：洗脱剂为1.0mol/L的硫氰酸钠，洗脱缓冲液的pH＝5.0。

有益效果

(1)本发明方法操作简单，快速、高效、分离量大，纯化倍数和酶活性较高；

(2)原料来源方便，便于工业大规模提取纯化。

附图说明

图1为不同反应时间的木瓜蛋白酶溶液吸附曲线；

图2为不同pH的木瓜蛋白酶溶液吸附曲线；

图3为不同浓度的木瓜蛋白酶溶液的吸附曲线；

图4为不同离子强度的木瓜蛋白酶溶液吸附曲线；

图5为不同洗脱剂对木瓜蛋白酶的洗脱曲线；

图6为不同浓度的硫氰酸钠的洗脱曲线

图7为不同pH缓冲液的洗脱剂对木瓜蛋白酶的洗脱曲线；

图8为最佳洗脱条件对木瓜蛋白酶的洗脱曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

尼龙膜的活化和键合壳聚糖进行改性，具体步骤如下：

(1)尼龙膜先在25℃1 M HCl中水解24h，然后用甲醛进行活化。10张水解的尼龙膜浸入20ml甲醛溶液(＞36.5wt.％)，加入0.2ml磷酸(85wt.％)，于60℃反应7h，40～50℃热水水洗多次。

(2)将上述甲醛活化的尼龙膜，浸入10ml质量分数为1.5％的壳聚糖溶液(以1vol.％醋酸溶解)，室温反应1h，然后转入80℃烘箱，1h后取出，分别用1vol.％醋酸和去离子水洗去未反应的壳聚糖。尼龙膜上的壳聚糖含量可按茚三酮的方法进行测试。

实施例2

改性后的尼龙膜螯合金属钴离子，具体步骤如下：

(1)上述改性后的100张(大约10克)尼龙膜浸入4.6ml环氧氯丙烷、46ml 2mol/L的氢氧化钠和5mmol硼氢化钠混和液中，室温反应2h后，再直接向混和液加入23ml环氧氯丙烷、46ml 2mol/L的氢氧化钠，60℃反应12h，用去离子水洗多次。

(2)将上述结合环丙烷的10张膜(大约1克)浸入含有86mmol的亚氨基二乙酸(IDA)、8mmol硼氢化钠和114.4ml 2mol/L的碳酸钠的混合溶液，60℃恒温振荡反应12h，用去离子水、5vol.％醋酸和去离子水洗多次。

(3)将上述的膜浸入500ml 100ppm的氯化钴溶液，反应2h，就可得到螯合钴离子的金属膜。

实施例3

用金属螯合膜吸附木瓜蛋白酶，进行条件优化，具体步骤如下：

(1)反应时间的确定。将10张改性尼龙膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入100ml1.0mg/ml木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液(pH＝8)，流速为2.0ml/min，分别反应10min，20min，30min，40min，50min，60min，80min和100min，进行吸附，测定木瓜蛋白酶吸附的量。实验结果如图1，最适的反应时间选择在30min。

(2)反应pH的确定。将10张改性尼龙膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入100ml不同pH值的1.0mg/ml木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液，循环反应2h，流速为2.0ml/min，加入木瓜蛋白酶的Tris-HCl溶液的pH值分别为5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0进行吸附，测定木瓜蛋白酶吸附的量。实验结果如图2，最适的反应pH选择在9.0。

(3)反应起始木瓜蛋白酶溶液浓度的确定。将10张改性尼龙膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入从100ml 0.25mg/ml到2.0mg/ml浓度不等的木瓜蛋白酶反应液，循环反应2h，流速为2.0ml/min，测定木瓜蛋白酶吸附的量。实验结果如图3，最佳吸附浓度为2.0mg/ml的木瓜蛋白酶反应液。

(4)反应离子强度的确定。将10张改性尼龙膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入含有不同量氯化钠的100ml 1.0ppm的木瓜蛋白酶溶液，循环反应2h，流速为2.0ml/min，所加入的氯化钠浓度为0，0.25，1.0，1.5，2.0mol/L(即离子强度)，测定木瓜蛋白酶吸附的量。实验结果如图4，最佳离子强度为0mol/L的氯化钠溶液(即不含氯化钠溶液)。

实施例4

用金属螯合膜吸附木瓜蛋白酶后，对其洗脱条件进行优化，具体步骤如下：

(1)洗脱剂的确定。将10张吸附木瓜蛋白酶的膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入1.0mol/L的硫氰酸钠和氯化钠缓冲液(Tris-HCl，pH＝5.0)溶液，流速为2.0ml/min，进行洗脱，测定木瓜蛋白酶洗脱的量，实验结果如图5，最佳洗脱剂为硫氰酸钠。

(2)洗脱剂离子强度的确定。将10张吸附木瓜蛋白酶的膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入硫氰酸钠缓冲液(Tris-HCl，pH＝5.0)溶液，流速为2.0ml/min，所加入的硫氰酸钠浓度为0，0.25，0.5，1.0，2.0mol/L(即离子强度)，进行洗脱，测定木瓜蛋白酶洗脱的量，实验结果如图6，洗脱剂的最佳离子强度为1.0mol/L。

(3)洗脱剂缓冲液pH的确定。将10张吸附木瓜蛋白酶的膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入硫氰酸钠缓冲液(Tris-HCl)溶液，流速为2.0ml/min，所选择的缓冲液pH值为3.0，5.0，7.0，9.0，进行洗脱，测定木瓜蛋白酶洗脱的量，实验结果如图7，缓冲液的最佳pH为5.0。

实施例5

用1.0mol/L的硫氰酸钠溶液洗脱吸附木瓜蛋白酶的膜，具体步骤如下：

将10张吸附木瓜蛋白酶的膜上叠成膜堆，放入膜桥，以蠕动泵送入1.0mol/L的硫氰酸钠缓冲液(Tris-HCl，pH＝5.0)溶液，流速为2.0ml/min，进行洗脱，测定木瓜蛋白酶洗脱的量，得到木瓜蛋白酶的活性保留率和洗脱率都在95％以上。

实施例6

螯合膜组成膜堆对木瓜蛋白酶进行分离纯化包括如下步骤：

10张上述方法制备的金属螯合膜上叠成膜堆，作为分离介质，放入一种过滤容器膜桥，以分离木瓜蛋白酶。以蠕动泵送入缓冲液和洗脱液等。首先以0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)平衡15min，流速：1.0ml/min；接着送样，30ml的1.0mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，然后以0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)洗去未吸附上的蛋白质。最后以0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH 5.0)配制的1.0mol/LNaSCN进行洗脱，得到目标蛋白质木瓜蛋白酶，其纯化倍数为18.2。

实施例7

精确称取一定量按上述方法制备的金属螯合膜，置于0.05mol/L，不同pH值的缓冲液配制的木瓜蛋白酶溶液中，室温震荡不同时间后，测量吸附前后蛋白质溶液在280nm下的吸光度，按下式计算吸附量：

q＝(c_i-c_t)Vs/m

q是吸附在单位膜量上的木瓜蛋白酶的量(mg/g)；c_i和c_t是吸附前和吸附后木瓜蛋白酶溶液的浓度；V_S是木瓜蛋白酶溶液的体积；m是反应的膜的质量。

Claims

1.一种利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，包括：

(1)尼龙膜的改性：尼龙膜先在25℃ 1M HCl中水解24h，然后浸入20ml甲醛溶液，加入0.2ml 85wt.％磷酸，于60℃反应7h，40～50℃热水洗涤，再浸入10ml 1wt％～2wt％的壳聚糖溶液中，室温反应1h后，转入烘箱60～90℃烘干1h，分别用1.0vol％～5.0vol％醋酸和去离子水洗涤；

(2)尼龙膜螯合金属钴离子：将改性后的尼龙膜浸入4～5ml环氧氯丙烷、40～55ml 1～3mol/L的氢氧化钠溶液和3～6mmol硼氢化钠的混合溶液中，室温反应1～3h后，加入20～30ml环氧氯丙烷溶液和40～50ml 1～3mol/L的氢氧化钠溶液，继续恒温振荡反应8～18h，洗涤后再将上述膜浸入110～120ml 1～3mol/L的碳酸钠溶液、6～9mmol硼氢化钠和80～90mmol偶联剂亚氨基二乙酸IDA的混合溶液，50～70℃反应10～15h，最后浸入500ml 50～150ppm的氯化钴溶液，反应1～3h，得到螯合钴离子的金属亲和膜；

(3)蛋白酶的吸附洗脱：将金属亲和膜上叠成膜堆，放入膜桥，蠕动泵送入缓冲液和洗脱液，以0.05mol/L pH＝8.0的Tris-HCl缓冲液平衡15min，流速2.0ml/min；接着送入100ml0.25～2.0mg/ml pH值＝5.0～10.0的木瓜蛋白酶溶液，其中氯化钠浓度为0～2.0mol/L，反应10～100min进行吸附，然后以Tris-HCl缓冲液洗去未吸附上的蛋白质，最后以洗脱剂进行洗脱，得到木瓜蛋白酶；

(4)测试酶活性和蛋白质含量，计算纯化倍数。

2.根据权利要求1所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(1)中壳聚糖溶液是以0.5vol.％～2.0vol.％醋酸为溶剂对壳聚糖溶液中的壳聚糖进行溶解。

3.根据权利要求1所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中环氧氯丙烷浓度为95wt％～100wt％，环氧氯丙烷、氢氧化钠与硼氢化钠的混合溶液中，三者的体积比为0.9～1.1∶8～11∶0.003～0.005。

4.根据权利要求1所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(2)中洗涤分别用去离子水和4.0vol％～8.0vol％的醋酸洗涤。

5.根据权利要求1所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的木瓜蛋白酶溶液的pH＝9.0，浓度为2.0mg/ml，氯化钠溶液浓度为0mol/L，反应时间为30min。

6.根据权利要求1所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中洗脱剂为硫氰酸钠或氯化钠，洗脱剂离子强度为0～2.0mol/L，洗脱缓冲液的pH＝3.0～9.0。

7.根据权利要求6所述的利用钴离子金属螯合亲和膜提纯木瓜蛋白酶的方法，其特征在于：所述的洗脱剂为1.0mol/L的硫氰酸钠，洗脱缓冲液的pH＝5.0。