CN102382150B

CN102382150B - 高纯度混合脱氧核苷酸钠的制备方法

Info

Publication number: CN102382150B
Application number: CN201010273743.8A
Authority: CN
Inventors: 邱蔚然; 曹静; 邱志云
Original assignee: JIANGSU QIUZHIYOU NUCLEIC ACID DRUG ENGINEERING TECHNOLOGY RESEARCH CENTER Co Ltd; Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Qiuzhiyou Pharmaceutical Co., Ltd.; Nantong Qiuzhiyou Bioscience & Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2010-09-06
Filing date: 2010-09-06
Publication date: 2015-05-20
Anticipated expiration: 2030-09-06
Also published as: CN102382150A

Abstract

本发明提供了一种高纯度混合脱氧核苷酸钠的制备方法，包括如下步骤：(1)将酶解液通过装有经再生处理的两根串联连接的阴离子交换树脂1号柱和2号柱上样；(2)然后用水通入1号柱，洗至2号柱流出液的pH为7.0～9.0，再用酸通入1号柱，洗至2号柱流出液的pH为3.0-3.5；(3)然后用氯化钠和酸的混合溶液通入1号柱，并将2号柱的流出液通入装填有活性炭的3号柱；(4)用水洗涤3号柱，再用氨乙醇溶液洗脱，收集洗脱液中脱氧核苷酸钠浓度高于20g/L，且HPLC大于98％的部分，浓缩，超滤，冷冻干燥，得到成品。本发明通过串联组合，阶段洗脱等手段，可获得几乎只含4种脱氧核苷酸钠的并具有稳定比例高纯度产品。

Description

高纯度混合脱氧核苷酸钠的制备方法

技术领域

本发明涉及脱氧核苷酸钠的制备方法。

背景技术

将DNA酶解，可获得含脱氧腺苷酸钠(dAMP，2Na)、脱氧鸟苷酸钠(dGMP，2Na)、脱氧胞苷酸钠(dCMP，2Na)、脱氧胸苷酸钠(dTMP，2Na)等4种脱氧核苷酸钠产品(以下简称混合脱氧核苷酸钠)。DNA可从小牛胸腺或鱼的精巢中提取。混合脱氧核苷酸钠具有增进骨髓造血功能，对放疗、化疗过程引起的白细胞减少有良好疗效，以及还有提高机体免疫等作用。

在工业生产中，用于酶解DNA的5’-磷酸二酯酶(或核酸酶)，往往含有少量磷酸单酯酶、脱氨酶等杂酶，因此在DNA酶解溶液中会含有少量脱氧核苷以及dAMP、dGMP脱氨后形成的dIMP(脱氧肌苷酸)、dXMP(脱氧黄嘌呤核苷酸)等杂质，以及DNA原料和酶所带入的蛋白质和色素等杂质。

目前，在文献：商业部脏器生化制药情报中心站编著的《动物生化制药学》人民卫生出版社1981年2月中，所述的方法是，将酶解液过滤或离心，然后稀释约1倍，调pH8.5左右上阴离子交换柱，水洗后直接用0.2N盐酸溶液洗脱，从pH2.5时开始收集，到pH0.5为止。此方法缺陷是脱氧核苷和脱氧核苷酸类杂质、蛋白质和色素等未能有效去除，致使其最终成品含量只能达到75％。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度混合脱氧核苷酸钠的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明的方法，包括如下步骤：

(1)将酶解液通过装有经再生处理的两根串联连接的阴离子交换树脂1号柱和2号柱上样，使混合脱氧核苷酸钠被吸附在阴离子交换树脂上；

所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂，优选的为201×8、711、717、HZ201、Dowex-1、Dowex-2或Amberlite-IRA-400，可采用市售产品，如上海树脂厂、上海华震公司和美国Dow chemical等公司的产品；

所述的酶解液可采用上述文献商业部脏器生化制药情报中心站编著的《动物生化制药学》人民卫生出版社1981年2月中，报道的方法进行制备；

其中：脱氧腺苷酸钠(dAMP，2Na)、脱氧鸟苷酸钠(dGMP，2Na)、脱氧胞苷酸钠(dCMP，2Na)、脱氧胸苷酸钠(dTMP，2Na)等4种脱氧核苷酸钠产品(以下简称混合脱氧核苷酸钠)的总的重量含量为50～60％，其余为脱氧核苷、dXMP、dIMP、蛋白质、色素和无机盐等杂质；

术语“再生处理”，指的是用酸或碱浸泡并用纯水(或去离子水)洗涤，再生处理可采用文献商业部脏器生化制药情报中心站编著的《动物生化制药学》人民卫生出版社1981年2月报道的方法，为一种常规的方法，也可根据产品说明书规定的方法进行处理；

(2)然后用蒸馏水通入1号柱，洗至2号柱出口流出液的pH为7.0～9.0左右，再用酸通入1号柱，洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为3.0-3.5，此时，即可将柱上各种脱氧核苷杂质洗尽；

所述的酸为0.0001～0.001mol/L的盐酸、0.001～0.01mol/L的甲酸或0.001～0.02mol/L的醋酸；

(3)然后用氯化钠和酸的混合溶液通入1号柱，并将经过2号柱的流出液全部通入装填有活性炭的3号柱吸附；

所述的活性炭为型号为769或G15，可采用上海活性炭厂等市售的产品；

所述的氯化钠和酸的混合溶液为重量浓度为0.1～0.5％的氯化钠-0.001～0.01mol/L甲酸的混合溶液、重量浓度为0.1～0.5％的氯化钠-0.001～0.02mol/L醋酸的混合溶液或重量浓度为0.1～0.5％-0.0001～0.001mol/L盐酸的混合溶液；

当1号柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L时，所述的氯化钠和酸的混合溶液改用重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.001～0.02mol/L的甲酸的混合溶液、重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.001～0.02醋酸的混合溶液或重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.0001～0.001mol/L盐酸的混合溶液直接通入2号柱进行洗脱，2号柱流出液全部上3号炭柱吸附，直至2号柱流出液中，脱氧核苷酸的浓度浓度低于0.1～0.5g/L；

此时dIMP、dXMP等脱氧核苷酸、蛋白质、色素等杂质大都吸附在1号柱上；

(4)用蒸馏水洗涤3号柱，水的体积用量为3号柱体积的3～5倍，然后再用氨乙醇溶液洗脱，氨乙醇溶液的体积用量为3号柱体积的3～5倍，收集氨乙醇溶液洗脱液中脱氧核苷酸钠浓度高于20g/L，且HPLC大于98％(HPLC归一法)的部分，然后减压浓缩至混合脱氧核苷酸钠的重量浓度为15～20％，超滤，冷冻干燥，得到成品；

氨乙醇溶液的组分和重量浓度如下：

氨水 4～6％

体积浓度为95％的乙醇 45～55％

水余量

由此，便可获得高纯度的几乎只含dAMP，2Na、dGMP，2Na、dCMP，2Na和dTMP，2Na的混合脱氧核苷酸钠产品。

产品含量检测，采用高效液相色谱外标法测定，具体操作为精密称取样品约0.1000g(精确至0.0001g)，用蒸馏水溶解并稀释定容至250mL，摇匀使成为每mL约含400μg的溶液。色谱柱选用Shim-packVP-ODS(4.6×150mm)，流动相为0.05mmol/L乙酸铵溶液(pH 5.5)，流速1ml/min，于254nm波长，用紫外检测器检测。

计算公式为：

S1：产品峰面积

S2：标准品峰面积

W1：产品重量

W2：标准品重量

r1：产品水分

r2：标准品水分。

本发明采用串联组合、阶段洗脱等措施，能够有效的去除脱氧核苷、dIMP、dXMP、蛋白质和色素，提高了层析分离效果，获得了几乎只含4中脱氧核苷酸钠的并具有稳定比例高纯度产品，其各种脱氧核苷酸钠的比例为dAMP，2Na：29.0±1％；dCMP，2Na：21.0±1％；dTMP，2Na：24±1％；dGMP，2Na：26±1％，并接近于文献：J.n.达维生编写的《核酸的生物化学》科学出版社出版所述天然原料所含比例。

具体实施方式

实施例1

将500gDNA溶于50L蒸馏水中，用盐酸调pH5.4左右，升温至90℃加热10分钟，冷至71℃，加入5’-磷酸二酯酶10g(8000单位/g酶活，酶先用蒸馏水调成糊状，72℃保温8分钟。反应3小时，即可升温至90℃保温10分钟(灭活5’-磷酸二酯酶)停止反应，将溶液冷却至40℃以下后调节pH10，过滤去除蛋白等杂质，获得酶解溶液，备用。其中：混合脱氧核苷酸钠的重量含量为50～60％；

准备层析柱3根，分别为1号装有4L HZ-201阴树脂、2号装有4LHZ-201阴树脂、3号装有5L769活性炭，采用文献商业部脏器生化制药情报中心站编著的《动物生化制药学》人民卫生出版社1981年2月报道的方法，对1号和2号进行再生处理；

然后将反应过滤液通过1号和2号串联柱，上样结束后，用2倍柱体积蒸馏水洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为7.0～8.0，再用0.01mol/L醋酸溶液通入1号柱洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为3.5，此时，即可将柱上各种脱氧核苷杂质洗尽；

然后用氯化钠和酸的混合溶液通入1号柱洗脱，并将2号柱流出液全部通入装填有活性炭的3号柱吸附；

所述的氯化钠和酸的混合溶液为重量浓度为0.5％的氯化钠-0.01mol/L醋酸的混合溶液；

当1号柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L时，改用重量浓度为1％的氯化钠-0.01mol/L的醋酸的混合溶液直接通入2号柱进行洗脱，2号柱流出液全部上3号炭柱吸附，直至2号柱流出液中，脱氧核苷酸钠的浓度低于0.5g/L；

断开2号和3号柱，用4倍体积蒸馏水洗涤3号柱，再用氨乙醇溶液洗脱(3％氨水：50％的体积浓度95％乙醇：47％蒸馏水)，收集脱氧核苷酸钠浓度高于20g/L，且HPLC大于98％(重量)的部分，合并后脱氧核苷酸钠用6mol/L氢氧化钠调节pH7.0～8.5，混合后减压浓缩至脱氧核苷酸钠重量浓度为20％，超滤，冷冻干燥，得到成品约250克，经HPLC检测，含量98.8％，其中dAMP，2Na：29.5％；dCMP，2Na：20.7％；dTMP，2Na：23.7％；dGMP，2Na：26.1％。

实施例2

与实施例1同样方法获得酶解液，备用。其中：混合脱氧核苷酸钠的重量含量为50～60％；

准备层析柱3根，分别为1号装有4L 711阴树脂、2号装有4L711阴树脂、3号装有5L G15活性炭；再生处理同实施例1。

将反应过滤液通过1号和2号串联柱上样；上样结束后，用2倍柱体积蒸馏水洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为7.0～8.0，再用0.001mol/L盐酸溶液通入1号柱洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为3.0，此时，即可将柱上各种脱氧核苷杂质洗尽；

所述的氯化钠和酸的混合溶液为重量浓度为0.5％氯化钠-0.001mol/L盐酸溶的混合溶液；

当1号柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L时，改用重量浓度为1％氯化钠-0.001N盐酸的混合溶液直接通入2号柱进行洗脱，2号柱流出液全部上3号炭柱吸附，直至2号柱流出液中，脱氧核苷酸钠浓度低于0.5g/L；

断开2号和3号柱，3号柱用4倍体积蒸馏水洗涤，再用氨乙醇溶液洗脱(3％氨水：50％的95％乙醇：47％蒸馏水)，收集脱氧核苷酸钠的浓度高于20g/L，且HPLC大于98％(重量)的部分，混合后减压浓缩至脱氧核苷酸钠的重量浓度为20％，超滤，冷冻干燥，得到成品约220克，经HPLC检测，含量99.0％，其中dAMP，2Na：29.1％；dCMP，2Na：20.8％；dTMP，2Na：23.8％；dGMP，2Na：26.3％。

Claims

1.高纯度混合脱氧核苷酸钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将酶解液通过装有经再生处理的两根串联连接的阴离子交换树脂1号柱和2号柱上样；

(2)然后用水通入1号柱，洗至2号柱出口流出液的pH为7.0～9.0，再用酸通入1号柱，洗柱，洗至2号柱出口流出液的pH为3.0-3.5；

(3)然后用氯化钠和酸的混合溶液通入1号柱，并将2号柱的流出液通入装填有活性炭的3号柱；

所述的氯化钠和酸的混合溶液为重量浓度为0.1～0.5％的氯化钠-0.001～0.01mol/L甲酸的混合溶液、重量浓度为0.1～0.5％的氯化钠-0.001～0.02mol/L醋酸的混合溶液或重量浓度为0.1～0.5％的氯化钠-0.0001～0.001mol/L盐酸的混合溶液；

当1号柱出口流出液中，dGMP含量低于0.5g/L时，所述的氯化钠和酸的混合溶液改用重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.001～0.02mol/L的甲酸的混合溶液、重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.001～0.02mol/L醋酸的混合溶液或重量浓度为0.6～1％的氯化钠-0.0001～0.001mol/L盐酸的混合溶液直接通入2号柱进行洗脱，2号柱流出液全部上3号炭柱吸附，直至2号柱流出液中，脱氧核苷酸的浓度低于0.1～0.5g/L；

用蒸馏水洗涤3号柱，水的体积用量为3号柱体积的3～5倍，然后再用氨乙醇溶液洗脱，氨乙醇溶液的体积用量为3号柱体积的3～5倍，收集氨乙醇溶液洗脱液中脱氧核苷酸钠浓度高于20g/L，且HPLC大于98％的部分，然后减压浓缩至混合脱氧核苷酸钠的重量浓度为15～20％，超滤，冷冻干燥，得到成品；

氨乙醇溶液的组分和重量浓度如下：

氨水 4～6％

体积浓度为95％的乙醇 45～55％

水余量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的阴离子交换树脂为201×8、711、717、HZ201、Dowex-1、Dowex-2或Amberlite-IRA-400。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的酶解液中，脱氧腺苷酸钠、脱氧鸟苷酸钠、脱氧胞苷酸钠和脱氧胸苷酸钠总的重量含量为50～60％。