CN101851269B

CN101851269B - 富硒灵芝中硒蛋白的制备方法

Info

Publication number: CN101851269B
Application number: CN2010101791172A
Authority: CN
Inventors: 杜明; 胡小松; 赵广华
Original assignee: Harbin Institute of Technology
Current assignee: Harbin Institute of Technology
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2010-05-21
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2030-05-21
Also published as: CN101851269A

Abstract

富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，它涉及一种蛋白质的制备方法。本发明解决了现有方法得到的硒蛋白纯度低的问题。方法：一、超滤、硫酸铵沉淀制备富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和Tris–HCl缓冲液混合，过滤；三、用葡聚糖凝胶柱进行分离纯化；四、用阴离子交换层析柱进行分离纯化；五、用疏水层析柱进行分离纯化即得到富硒灵芝中的硒蛋白。本发明制备得到硒蛋白中硒含量为6mg/g左右，与现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本发明方法制备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤法检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本发明制备得到的硒蛋白纯度好。

Description

富硒灵芝中硒蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的制备方法。

背景技术

硒具有许多生物学功能，人体的低硒状态及硒的营养状况与关节炎、癌症、心血管病、白内障、胆汁郁积、克罗恩氏病、婴儿猝死综合症、囊肿性纤维化、糖尿病、甲状腺肿、免疫缺陷、大骨节病、克山病、淋巴细胞性贫血、肌肉萎缩症、中风和溃疡性结肠炎等40余种疾病的发病率密切相关。而灵芝自古被誉为延年益寿之佳品，具有多种生物学功能(黄伟光等，1993)，然而正常灵芝菌中有机硒含量较低，如果在富含无机硒的培养基中接入灵芝菌种，利用灵芝菌的富硒能力将无机硒转化为有机硒，并使其富集较高含量的有机硒(控制在人体安全吸收范围内)，这种灵芝即为富硒灵芝，富硒灵芝融灵芝和有机硒之长，其药用价值更高。因此开发富硒灵芝将具有广阔的应用前景和极高的社会、经济效益，其中富硒灵芝中硒蛋白作为有效成分，被作为主要的研究对象，现有富硒灵芝中硒蛋白的制备方法多是以富硒灵芝为原料，用碱提的方法得到碱溶性蛋白，然后对碱溶性蛋白进行纯化来制备硒蛋白，但是该方法所得到的硒蛋白中硒含量仅为3mg/g左右，且采用SDS-PAGE检验硒蛋白的纯度，所得到的电泳图不是单一条带，纯度较低，极大的限制了硒蛋白的应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有方法得到的硒蛋白纯度低的问题，而提供了富硒灵芝中硒蛋白的制备方法。

本发明富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行：一、10~15g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在0~10℃的条件下搅拌7~10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.0~4.5，而后加入占混合液质量百分比为20%~30%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70%~90%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min，将离心后的沉淀加入100~200 mL浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4~6次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，然后在11000~13000g的条件下离心20~30min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1 mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水层析柱中，在流速为0.5~1.5mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。

本发明以富硒灵芝子实体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并进一步通过硫酸铵沉淀蛋白、葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析、疏水层析对水溶性粗蛋白进行纯化，即制备得到硒含量为6mg/g左右的硒蛋白，与现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本发明方法制备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤法检验本发明制备得到的硒蛋白的纯度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本发明制备得到的硒蛋白纯度好。

附图说明

图1为具体实施方式十一得到的硒蛋白凝胶过滤层析图，图2中为具体实施方式十一得到的硒蛋白对羟自由基（HO·）和超氧自由基（O2-·）的清除活性的回归方程曲线图，图中

表示羟自由基的回归方程曲线，

表示超氧自由基的回归方程曲。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行：一、10~15g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在0~10℃的条件下搅拌7~10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.0~4.5，而后加入占混合液质量百分比为20%~30%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70%~90%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置10~14小时，而后在4500~5500r/min的条件下离心15~25min，将离心后的沉淀加入100~200 mL浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4~6次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、1~10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，然后在11000~13000g的条件下离心20~30min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1 mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水层析柱中，在流速为0.5~1.5mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。

本实施方式步骤一中富硒灵芝子实体由菌种培育得到，具体步骤如下：在栽培料中，添加亚硒酸钠，通过灵芝菌在生长过程中对无机硒的吸收，富集，然后转化为含有机态硒的生物富硒灵芝子实体。采集的富硒灵芝子实体，测定其含硒量为72.44μg/g，用自来水洗净，双重蒸馏水冲淋，切片，冷冻干燥粉碎制成实验样品，冷冻保藏备用。

本实施方式步骤一中搅拌采用电动搅拌机进行。

本实施方式步骤三中葡聚糖凝胶柱在使用前用浓度为50mmol/L、pH为 8.0的Tris–HCl缓冲液平衡后再使用，其中葡聚糖凝胶柱采用的是Sephadex G-75葡聚糖凝胶。

本实施方式步骤四中阴离子交换层析柱在使用前用浓度为50 mmol/L、pH为 8.0的Tris–HCl缓冲液平衡后再使用，其中阴离子交换层析柱采用的是Mono-Q强阴离子交换树脂。

本实施方式步骤五中疏水层析柱在使用前用浓度为50 mmol/L的硫酸铵-Tris–HCl溶液平衡后使用，其中硫酸铵-Tris–HCl溶液中溶质是浓度为0.5mol/L 硫酸铵，溶剂是浓度为0.05mol/L、pH为 8.0的Tris–HCl缓冲液，疏水层析柱采用的是Phenyl Superose 树脂。

本实施方式步骤三、步骤四、步骤五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液方法均为：用洗脱液洗脱时，每个试管3~6mL的洗脱液（含有蛋白的洗脱液），测定每个蛋白峰在相同浓度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脱液，即得到了具有抗氧化活性的硒蛋白。

本实施方式步骤五中收集抗氧化活性的蛋白洗脱液可经过进一步浓缩或者干燥得到硒蛋白固形物。

对本实施方式制备得到的硒蛋白的结合离子进行测定，具体内容为：用电感偶合等离子体发射光谱法（ICP-AES）（莫定琪等，1999年）测定了该硒蛋白中的硒（Se）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、钴（Co）、镍（Ni）、钡（Ba）、锶（Sr）、钼（Mo）、锗（Ge）、砷（As）等16种元素的含量；检测结果为在所测定的16种金属元素中，该硒蛋白只与硒元素（Se）结合，结合量为 6mg/g左右。

对本实施方式制备得到的硒蛋白进行羟自由基（HO·）和超氧自由基（O₂-·）的清除活性测定，具体内容如下：采用顺磁共振自旋捕集技术（EPR）检测本实施方式制备得到的硒蛋白的羟自由基和超氧自由基的清除活性，研究结果显示，该硒蛋白具有很强的HO· 和O₂-· 清除活性，清除率与硒蛋白之间存在剂量依赖关系。而且对O₂-·和HO·的清除率与其浓度之间存在一定的对数回归关系。对于HO· 而言，该回归方程为Y = -0.0001X² + 0.2187X – 1.0420，R² = 0.9970；对于O₂-·而言，该回归方程为Y = -0.0001X² + 0.2417X + 0.7317，R² = 0.9981。即，清除反应体系产生的50%的HO·和 O₂-· 需要的该硒蛋白的浓度分别为264.15 μg/mL 和 218.03 μg / mL。

本实施方式以富硒灵芝子实体为原料，首先制备水溶性粗蛋白，并进一步通过硫酸铵沉淀蛋白、葡聚糖凝胶层析、阴离子交换层析、疏水层析对水溶性粗进行纯化，即制备得到硒含量为6mg/g左右的硒蛋白，现有方法制备得到的硒蛋白相比较，本实施方式制备得到的硒蛋白中硒含量高，同时采用凝胶过滤层析检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，洗脱曲线呈现单一蛋白峰，本实施方式制备得到的硒蛋白纯度好。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中12~14g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在2~8℃的条件下搅拌8~9小时。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中13g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在5℃的条件下搅拌8.5小时。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤一中占混合液质量百分比为25%的硫酸铵，在4℃的条件下静置12小时。其它步骤及参数与具体实施方式一至三之一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤一中向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为80%的硫酸铵，在4℃的条件下静置12小时。其它步骤及参数与具体实施方式一至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤一中重复超滤过滤5次。其它步骤及参数与具体实施方式一至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤一中冷冻干燥条件为：绝对气压为20 Pa，冷阱温度为-55℃，样品厚度为10~24 mm。其它步骤及参数与具体实施方式一六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤二中在12000g的条件下离心25min。其它步骤及参数与具体实施方式一至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是：步骤四中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液A是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，洗脱液B是浓度为1 mol/L NaCl-Tris–HCl溶液，线性梯度洗脱设定的程序为0%~100% B，其中洗脱液B中NaCl为溶质，浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液为溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同的是：步骤五中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液C是浓度为0.5mol/L的硫酸铵Tris–HCl溶液，洗脱液D是浓度为50 mmol/L、pH为 8.0的Tris–HCl缓冲液，线性梯度设定的程序为100%~0% D，其中洗脱液C中硫酸铵为溶质，Tris–HCl缓冲液为溶液。其它步骤及参数与具体实施方式一至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行：一、10.36g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在5℃的条件下搅拌8小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.3，而后加入占混合液质量百分比为25%的硫酸铵，在3~5℃的条件下静置13小时，而后在5000r/min的条件下离心20min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为80%的硫酸铵，在4℃的条件下静置12小时，而后在5000r/min的条件下离心20min，将离心后的沉淀加入150 mL浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤5次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、8mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH 为8.0的 Tris–HCl缓冲液混合，然后在12000g的条件下离心25min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1 mL/min、检测波长为280 nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅰ加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白Ⅱ加入到疏水层析柱中，在流速为1ml/min、检测波长为280 nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白。

本实施方式步骤一中搅拌采用电动搅拌机进行。

本实施方式步骤三、步骤四、步骤五中收集含有抗氧化活性的蛋白洗脱液方法均为：用洗脱液洗脱时，每个试管5mL的洗脱液（含有蛋白的洗脱液），测定每个蛋白峰在相同浓度下的抗氧化活性，收集具有最高抗氧化活性的洗脱液，即得到了含有抗氧化活性的洗脱液。

本实施方式步骤四中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液A是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液，洗脱液B是浓度为1 mol/L NaCl-Tris–HCl溶液，线性梯度洗脱设定的程序为0%~100% B，其中洗脱液B中NaCl为溶质，浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris–HCl缓冲液为溶液。

本实施方式步骤五中线性梯度洗脱时间为40min，洗脱液C是浓度为0.5mol/L的硫酸铵Tris–HCl溶液，洗脱液D是浓度为50 mmol/L、pH为 8.0的Tris–HCl缓冲液，线性梯度设定的程序为100%~0% D，其中洗脱液C中硫酸铵为溶质，Tris–HCl缓冲液为溶液。

采用凝胶过滤层析检验本实施方式制备得到的硒蛋白的纯度，检测结果如图1所示，图1中为单一蛋白峰，由此可知，本实施方式制备得到的硒蛋白纯度好。

对本实施方式制备得到的硒蛋白进行结合离子测定和抗氧化活性测定，具体内容如下：

1、结合离子测定：用电感偶合等离子体发射光谱法（ICP-AES）（莫定琪等，1999年）测定了该硒蛋白中的硒（Se）、铬（Cr）、锰（Mn）、铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、钴（Co）、镍（Ni）、钡（Ba）、锶（Sr）、钼（Mo）、锗（Ge）、砷（As）等16种元素的含量；检测结果为在所测定的16种金属元素中，该硒蛋白只与硒元素（Se）结合，结合量为5.98 mg/g。

2、羟自由基（HO·）和超氧自由基（O2-·）的清除活性

具体操作为：用Fenton体系产生HO·，分别取5μL 0.5 mol/L DMPO、5 μL试样或PBS (磷酸缓冲液)、5 μL 4 mmol/L DETAPAC (二乙三胺五乙酸)、5 μL 0.1mmol/L FeSO₄混合均匀后，加入5 μL 0.0125% H₂O₂，120 s后即刻采用EPR测量，中心磁场强度336.5mT，响应时间0.1 s，调制幅度0.2 mT，扫场宽度10.0 mT，扫描时间2 min，微波功率10.0 mW，调制频率9.44 GHz，试样对HO·的清除率如公式（2-3）所示：

E= × 100% （2-3）

其中h₀——— 体系中加入试样前EPR图谱中第二个峰的峰高；

h_x——— 体系中加入试样后EPR图谱中第二个峰的峰高。

超氧阴离子(O₂ ^-·)的产生和清除：用次黄嘌呤(HPX)–黄嘌呤氧化酶(XOD)体系产生O₂ ^-·（Finkelstein et al., 1980; Grady et al., 1989），分别取5 μL 1.0 mol/L DMPO、5 μL 6 mmol/L HPX、5 μL 4 mmol/L DETAPAC和5 μL试样或PBS混合均匀后，加入5 μL 50 mU/mL XOD，80s后即刻采用EPR测量，中心磁场强度336.3 mT，响应时间0.1s，调制幅度0.079 mT，扫场宽度5.0 mT，扫描时间2min，微波功率10.0 mW，调制频率9.44 GHz，试样对O₂ ^-· 的清除率计算方法同上对HO·的清除率，不同的是：h₀和h_x分别为体系加入试样前后EPR图谱中第一个峰的峰高。

检测结果显示，该硒蛋白具有很强的HO· 和O₂-· 清除活性，清除率与硒蛋白之间存在剂量依赖关系。而且对O₂-·和HO·的清除率与其浓度之间存在一定的对数回归关系。对于HO· 而言，该回归方程为Y = -0.0001X² + 0.2187X – 1.0420，R² = 0.9970，如图2所示；对于O₂-·而言，该回归方程为Y = -0.0001X² + 0.2417X + 0.7317，R² = 0.9981，如图2所示。即清除反应体系产生的50%的HO·和 O₂-· 需要的该硒蛋白的浓度分别为264.15 μg/mL 和 218.03 μg / mL。

Claims

1.富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于富硒灵芝中硒蛋白的制备方法按照以下步骤进行：一、10～15g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在0～10℃的条件下搅拌7～10小时，然后抽滤得到滤液A，用去离子水清洗抽滤后的残渣得到滤液B，将滤液A和滤液B混合得到混合液，再向混合液中加入醋酸至pH为4.0～4.5，而后加入占混合液质量百分比为20％～30％的硫酸铵，在3～5℃的条件下静置10～14小时，而后在4500～5500r/min的条件下离心15～25min去沉淀，然后向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为70％～90％的硫酸铵，在3～5℃的条件下静置10～14小时，而后在4500～5500r/min的条件下离心15～25min，将离心后的沉淀加入100～200mL浓度为0.05mol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液混合，再经过孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤后，滤液用截留分子量为3000D的膜进行超滤过滤，重复超滤过滤4～6次得到蛋白质溶液，蛋白质溶液再经真空冷冻干燥，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白；二、1～10mg的富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白和1mL的浓度为0.05mol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液混合，然后在11000～13000g的条件下离心20～30min，离心后的上清液经孔径为0.22μm的膜过滤得到滤液；三、将2mL步骤二得到的滤液放入到葡聚糖凝胶柱中，在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行洗脱，洗脱液是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I；四、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白I加入到阴离子交换层析柱中，然后在流速为1mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线形梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II；五、将2mL富硒灵芝子实体水溶性粗蛋白II加入到疏水层析柱中，在流速为0.5～1.5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行线性梯度洗脱，收集抗氧化活性的蛋白洗脱液，即得到富硒灵芝中的硒蛋白；

其中步骤三中葡聚糖凝胶柱采用的是SephadexG-75葡聚糖凝胶；步骤四中阴离子交换层析柱采用的是Mono-Q强阴离子交换树脂，洗脱液A是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液，洗脱液B是NaCl浓度为1mol/L的Tris-HCl溶液；步骤五中疏水层析柱采用的是Phenyl Superose树脂，洗脱液C是硫酸铵浓度为0.5mol/L的Tris-HCl溶液，洗脱液D是浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液。

2.根据权利要求1所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中12～14g的富硒灵芝子实体浸泡于去离子水中，在2～8℃的条件下搅拌8～9小时。

3.根据权利要求1或2所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中占混合液质量百分比为25％的硫酸铵，在4℃的条件下静置12小时。

4.根据权利要求3所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中向离心上清液中加入占离心上清液质量百分比为80％的硫酸铵，在4℃的条件下静置12小时。

5.根据权利要求1或2所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中重复超滤过滤5次。

6.根据权利要求5所述的富硒灵芝中硒蛋白的制备方法，其特征在于步骤一中冷冻干燥条件为：绝对气压为20Pa，冷阱温度为-55℃，样品厚度为10～24mm。