CN109675535A - 固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用 - Google Patents

固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用，一种固定化锌离子亲和层析材料的制备方法，所述固定化锌离子亲和层析材料以琼脂糖为固相载体、亚氨基二乙酸为螯合剂，锌离子为配体，所述方法包括活化琼脂糖并螯合Zn2+，其中，活化琼脂糖的过程包括琼脂糖分子在NaBH4‑NaOH溶液中接枝环氧基丙基，然后依次经蒸馏水、第一NaHCO3‑Na2CO3缓冲液淋洗，并分别在第二NaHCO3‑Na2CO3缓冲液和NaBH4‑Na2CO3溶液中先后两次接枝‑N‑(CH2COOH)2基团。该方法接枝密度高、与Zn2+螯合效率高、Zn2+螯合量大，能够更有效地提取与锌离子有特异性结合的蛋白质。

Description

固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用。
背景技术
锌元素是与动物生长、发育、繁殖、免疫、内分泌等的重要生理活动密切相关的一种金属元素，参与90多种酶的合成，与200多种酶的活性相关，直接参与核酸与蛋白质的合成、DNA的复制、细胞的分化增值、三大营养物质的代谢调节等重要生命过程，是动物体内必不可少的一种微量元素。对与锌离子有特异性结合的蛋白质进行定性、定量、相互作用等研究，对探索锌离子的生理作用及其与疾病的关系等具有重要价值。而对与锌离子有特异性结合的蛋白质进行分离提纯是其中的一个重要环节。近年来，固定化金属亲和层析法已经成为纯化蛋白的主要方法，在蛋白质的分离提纯中得到广泛应用。
固定化金属离子亲和层析又称金属螯合亲和层析，是一种新型快速发展的亲和层析分离技术，主要用于生物大分子的分离。与其他亲和层析技术相比，尤其是免疫亲和层析相比，固定化金属离子亲和层析更为稳定、吸附量大、条件温和、柱再生能力强、成本低。
1975年，Porach首次成功在琼脂糖上偶联了亚氨基二乙酸，再将Ni2+、Cu2+、Co2+等分别与IDA螯合形成螯合物分子，有较多方法试图改进该螯合物分子的结构，但是都往往存在方法复杂且IDA偶联密度较低、金属离子螯合量过少、且螯合效率低的缺陷，限制了其在蛋白质提取分子方面的应用。此外，不同金属离子的原子半径、中心原子外层d轨道、电荷数以及晶体场稳定化能各不相同，这些因素影响着螯合物分子与金属离子间的螯合效果以及进一步与金属蛋白质的螯合效果，影响了金属螯合亲和层析中金属元素的拓展和应用。
发明内容
因此，本发明的目的是提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法和应用。琼脂糖是线性的多聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳糖和1,4连结的3,6-内醚-L-半乳糖交替连接起来的长链。在对琼脂糖进行接枝的过程中，环氧基丙基会与琼脂糖的羟基连接，实现琼脂糖分子链的延伸，在该延伸的琼脂糖分子结构上二乙酸次氨基结构与环氧基结构相遇实现环氧基的开环聚合，进一步实现琼脂糖分子的延展与分子密度的增大。而在该过程中，延展的程度与分子密度增大的程度直接影响着琼脂糖分子的活化效果。而本发明的方法制备得到的亲和层析材料接枝密度高，与Zn2+螯合效率高，1小时螯合时间内的螯合率超过68％，Zn2+螯合量大，能够更有效地提取与锌离子有特异性结合的蛋白质。
本发明的目的在于提供一种固定化锌离子亲和层析材料及其制备方法，以及一种从细胞中提取与锌离子有特异性结合的蛋白质的方法。
具体地，本发明的上述目的是通过以下方案来实现的：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种固定化锌离子亲和层析材料的制备方法，所述固定化锌离子亲和层析材料以琼脂糖为固相载体、亚氨基二乙酸为螯合剂，锌离子为配体，所述方法包括活化琼脂糖并螯合Zn2+，其中，活化琼脂糖的过程包括琼脂糖分子在NaBH4-NaOH溶液中接枝环氧基丙基，然后依次经蒸馏水、第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，并分别在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液和NaBH4-Na2CO3溶液中先后两次接枝-N-(CH2COOH)2基团。
其中，琼脂糖的基本结构如下所示：
n为≥0的自然数。
在本发明的接枝过程中，尤其经过如上所述的两次对-N-(CH2COOH)2基团的接枝后，相较于在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液中第一次接枝-N-(CH2COOH)2基团，在NaBH4-Na2CO3溶液中进行第二次接枝-N-(CH2COOH)2基团时，O-H-N、O-H-O结构的数量激增，锌离子与接枝后的结构中的配位原子螯合形成大量的环状结构，极大地增加了对锌离子的螯合密度。针对O-H-N、O-H-O结构的数量激增的情况，申请人探究了其可能的原因，包括通过调整二次接枝-N-(CH2COOH)2基团的顺序，比如先在NaBH4-Na2CO3溶液中接枝-N-(CH2COOH)2基团，再在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液中接枝-N-(CH2COOH)2基团，结果发现，其相对于仅进行在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液中的一次接枝操作O-H-N、O-H-O结构的数量有小幅度提升外，并未出现O-H-N、O-H-O结构的数量激增状况；以及将两次接枝-N-(CH2COOH)2基团的操作都在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液中进行，其效果稍优于更换两次接枝顺序，但也未出现O-H-N、O-H-O结构的数量的大幅增加。以上效果也可通过最终计算亲和层析材料对Zn2+的螯合量看出，O-H-N、O-H-O结构的数量越多、能与Zn2+配位的位点越多，与锌离子的螯合效率越高，则短时间内螯合的Zn2+量越大。
本发明方法中，所述NaBH4-NaOH溶液中，NaOH溶液的浓度为1.5-2mol/L，NaBH4的浓度为0.5-1mg/mL。
优选地，所述NaOH溶液的浓度为1.5mol/L，NaBH4的浓度为0.5mg/mL。
本发明方法中，所述第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为8.0-8.5，优选为8.5。
本发明方法中，所述第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为9.0-9.5，优选为9.0。
所述第一或第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液比如可以使用0.1mol/L Na2CO3，加HCl调节pH配制得到。
优选地，所述环氧基丙基来自环氧基氯丙烷，所述琼脂糖、环氧基氯丙烷与NaBH4-NaOH溶液的体积比为1：0.2-0.4：0.5-1，优选为1：0.3：0.5。
优选地，所述接枝基团-N-(CH2COOH)2来源于亚氨基二乙酸溶液，所述亚氨基二乙酸溶液的pH值为6.5-6.8，优选为6.8。
本发明方法中，所述NaBH4-Na2CO3溶液中，Na2CO3溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，NaBH4的浓度为0.1-0.25mg/mL。
优选地，所述NaBH4-Na2CO3溶液中，Na2CO3溶液的浓度为0.25mol/L，NaBH4的浓度为0.1mg/mL。
优选地，所述NaBH4-Na2CO3溶液的pH为9.0-9.5，优选为9.0；
本发明方法中，分别在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液和NaBH4-Na2CO3溶液中先后两次接枝-N-(CH2COOH)2基团时，第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1:0.5-0.8；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2-0.5。
优选地，第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.7；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2。
针对两次接枝-N-(CH2COOH)2基团时的溶液中各成分的体积比，申请人也在研究中做了很多尝试和探索，结果发现当第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比低于1：0.5时，比如1：0.3，或高于1：0.8时，比如1:1，在本发明的条件下都无法较好的获得满意的对Zn2+的螯合量；以及，当NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比低于1：0.2时，比如1：0.1，或者高于1：0.5时，比如1：0.8，在本发明的条件下都无法较好的获得满意的对Zn2+的螯合量。而在本发明的范围内，当分别在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液和NaBH4-Na2CO3溶液中先后两次接枝-N-(CH2COOH)2基团时，且第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1:0.5-0.8；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2-0.5时，获得的对Zn2+的螯合量较为满意，而特别是在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.7；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2时，得到的结果很满意，1小时内的螯合率可超过68％。
优选地，所述亚氨基二乙酸的浓度为20-40mg/ml，优选为40mg/ml。
在本发明的接枝条件下，亚氨基二乙酸的浓度为20-40mg/ml时，也可以获得较为满意的接枝效率，尤其在40mg/ml时，能够得到很满意的效果，超过40mg/ml时体现在对Zn2+的螯合量上，数量不再增加，或者低于20mg/ml时，体现在对Zn2+的螯合量上，螯合效果极不理想。
本发明方法中，所述活化琼脂糖的过程包括以下步骤：
(1)将琼脂糖吹打混匀后至于过滤漏斗中，抽去保护液，再用蒸馏水洗4-6次，抽干；优选地，所述琼脂糖选自Sepharose CL-6B、Sepharose 6Fast Flow；
(2)将步骤(1)中处理后的琼脂糖转移至锥形瓶内，依次加入NaBH4-NaOH溶液、环氧氯丙烷，于37℃震荡反应0.5-1小时，优选1小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(3)反应完毕，于过滤漏斗中滤干溶液，用蒸馏水洗涤5-6次，至pH＝6.9-7.1，用第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，抽干；
(4)将步骤(3)处理后的物质转移至锥形瓶内，依次加入第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液、亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇12-24小时，优选20小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(5)将步骤(4)处理后的物质转移至新的锥形瓶中，依次加入NaBH4-Na2CO3溶液、亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇12-24小时，优选12小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(6)反应完毕，于过滤漏斗中滤干溶液，用蒸馏水洗涤5-6次，滤干，转移滤饼至瓶中，加入乙醇/PBS溶液，于4℃保存；
优选地，所述乙醇/PBS溶液为pH为7.4的含有20％乙醇的PBS溶液。
在一个较为优选地实施方式中，所述活化琼脂糖的过程包括以下步骤：
(1)将Sepharose CL-6B或Sepharose 6Fast Flow吹打混匀后取5mL于10mL G-3漏斗中，抽去保护液，再用30mL蒸馏水洗4-6次，抽干；
(2)将步骤(1)处理后的Sepharose CL-6B或Sepharose 6Fast Flow转移至25mL锥形瓶内，依次加入2.5mL NaBH4-NaOH溶液、1.5mL环氧氯丙烷，于37℃震荡反应1小时，振荡速度250r/min；
(3)步骤(2)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，至pH＝7.0，再用pH为8.5的20.0mL的第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，抽干；
(4)将步骤(3)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液，7mL pH为6.8的亚氨基二乙酸溶液(40mg/ml)，37℃振摇20小时，振荡速度为250r/min；
(5)将步骤(4)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的NaBH4-Na2CO3溶液，2mLpH为6.8的亚氨基二乙酸溶液(40mg/ml)，37℃振摇12小时，振荡速度为250r/min；
(6)步骤(5)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，滤干，转移滤饼至瓶中，加入5-10ml pH为7.4的含有20％的乙醇的PBS溶液，于4℃保存。
本发明的方法中，所述螯合Zn2+的步骤包括：
(7)将亲和层析柱清洗干净，烘干，然后把柱子下端封好，再用枪把介质装入柱中；该过程中，可用水测试以确保柱子不漏水；
(8)静置至水层和凝胶层分层明显；
(9)此时打开下端去掉水层，当水面接近凝胶表面时，重新封闭下端；
向柱子中加入超纯水，静置至分层，放掉超纯水，重复此步骤3-5次以洗去保存用的乙醇/PBS溶液。
(10)接着向柱子中加入氯化锌溶液，静置0.5-1h后用超纯水冲洗柱体；超纯水水的用量可以适当调整，以洗掉没有和介质结合的Zn2+；
优选地，所述氯化锌溶液的浓度为100mM。
在一个较为优选地实施方式中，所述步骤(9)为：接着向柱子中加入5ml 100mM氯化锌，静置1h后用15mL的超纯水冲洗柱体3次，以除去未结合的Zn2+；
(11)加入用pH＝7.4的含有20％乙醇的PBS溶液，于4℃下保存。
在本发明的第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的固定化锌离子亲和层析材料或包含该固定化锌离子亲和层析材料的亲和层析柱。
优选地，上述1g固定化锌离子亲和层析材料对锌离子的1小时内的鳌合量大于20mg/g，优选为20.8-22.3mg/g，优选为22.3mg/g。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种从细胞中提取与锌离子有特异性结合的蛋白质的方法，所述方法使用上述的固定化锌离子亲和层析材料或包含该固定化锌离子亲和层析材料的亲和层析柱。
优选地，所述方法包括：向蛋白质提取液中加入锌离子亲和层析材料筛选出与Zn2+结合的蛋白质、去除无关蛋白，然后洗脱、浓缩的过程。
优选地，所述方法中初始蛋白质提取液与锌离子亲和层析材料的体积比为1.5-2：1，优选为2：1。
优选地，在本发明较为优选地实施方式中，所述从细胞中提取与锌离子有特异性结合的蛋白质的方法包括：向蛋白质提取液中加入锌离子亲和层析材料，初始蛋白质提取液与锌离子亲和层析材料的体积比为1.5-2：1，优选为2：1。于4℃缓慢旋转过夜(12h)，垂直放置至材料粒子沉积，吸除上清液；加入1mL含5mmol/L咪唑的结合缓冲液(BindingBuffer)，4℃缓慢旋转10min，旋转速率为10r/min，垂直放置至粒子沉积，弃上清液，重复清洗4-5次；洗脱过程：加入1mL含500mmol/L咪唑的结合缓冲液，4℃缓慢旋转30min，旋转速率为10r/min，垂直放置至粒子沉积，收集上清液，即为洗脱液，重复3次。将洗脱液混合后加入Millipore Ultra-4超滤离心管中，4℃离心40min，所得浓缩液即为可与Zn2+结合的蛋白质浓缩液。在本发明的方法中，可根据实际利用的蛋白质浓度调整浓缩液体积。
优选地，所述初始蛋白质提取液浓度为4ug/ul-8ug/ul。
结合缓冲液可以采用本领域常用的结合缓冲液，或者优选使用具有如下组成的结合缓冲液：7.80mmol/L NaH2PO4、12.20mmol/L Na2HPO4、0.50mol/L NaCl。
优选地，所述蛋白质提取液(或称为细胞蛋白质裂解液)可通过常规方法制备或者优选使用如下所述的方法制备：消化并收集细胞于1.5mL EP管，清洗，离心，加入裂解液(比如RIPA强裂解液)(细胞体积：裂解液体积＝1：10)，细胞裂解液：于冰上超声破碎提取蛋白质；4℃，12000r离心10min，取上清液于另一干净1.5ml EP管，即为初始蛋白质提取液，用裂解液补充体积至800uL即为蛋白质提取液。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的接枝原理及与Zn2+的螯合示意图。
图2为sephorase CL-6B的红外谱图。
图3为sephorase CL-6B-ECH-IDA的红外谱图。
图4为考马斯亮蓝染色图。
图5为锌离子标准曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1固定化锌离子亲和层析材料的制备
Sepharose CL-6B的活化：
(1)将Sepharose CL-6B吹打混匀后取5mL于10mL G-3漏斗中，抽去保护液，再用30mL蒸馏水洗4-6次，抽干；
(2)将步骤(1)处理后的Sepharose CL-6B转移至25mL锥形瓶内，依次加入2.5mLNaBH4-NaOH溶液(0.5mg/mL NaBH4，1.5mol/L NaOH)、1.5mL环氧氯丙烷，于37℃震荡反应1小时，振荡速度250r/min；
(3)步骤(2)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，至pH＝7.0，再用pH为8.5的20.0mL的NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗(0.1mol/L Na2CO3，HCl调至pH＝8.5)，抽干；
(4)将步骤(3)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的NaHCO3-Na2CO3缓冲液(0.1mol/L Na2CO3，HCl调至pH＝9.0，7mL pH为6.8的亚氨基二乙酸溶液(浓度40mg/ml)，37℃振摇20小时，振荡速度为250r/min；
(5)将步骤(4)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的NaBH4-Na2CO3溶液，2mLpH为6.8的亚氨基二乙酸溶液(浓度40mg/ml)，37℃振摇12小时，振荡速度为250r/min；
(6)步骤(5)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，滤干，转移滤饼至瓶中，加入5-10ml pH为7.4的含有20％的乙醇的PBS溶液，于4℃保存，得到的即为Sephorase CL-6B-ECH-IDA。
螯合Zn2+：
(7)将亲和层析柱清洗干净，烘干，然后把柱子下端封好，再用枪把介质装入柱中；该过程中，可用水测试以确保柱子不漏水；
(8)静置至水层和凝胶层分层明显；
(9)此时打开下端去掉水层，当水面接近凝胶表面时，重新封闭下端；
向柱子中加入超纯水，静置至分层，放掉超纯水，重复此步骤3-5次以洗去保存用的乙醇/PBS溶液；
(10)接着向柱子中加入5ml 100mM氯化锌，静置1h后用5.0mL的超纯水冲洗柱体，用5.0mL超纯水冲洗柱子以除去未结合的Zn2+；
(11)加入用pH＝7.4的含有20％乙醇的PBS溶液，于4℃下保存。
其中，琼脂糖分子sephorase CL-6B的色谱图如图2所示；在琼脂糖分子sephoraseCL-6B上分别接枝环氧基丙基、-N-(CH2COOH)2基团后的琼脂糖分子sephorase CL-6B-ECH-IDA的色谱图如图3所示。
由图2可知，3537cm-1为多糖的-OH发生分子间缔合形成的氢键吸收峰，2923cm-1为-CH2吸收峰，1470cm-1附近为-CH2吸收峰，1029cm-1为多糖-C-O-C-吸收峰。由图3可知，当琼脂糖接枝环氧基丙基以及二乙酸次氨基后，3537cm-1吸收峰后出现一个宽峰3272cm-1，此为-COOH形成二聚体产生的吸收峰，1642cm-1、1370cm-1为羧酸盐吸收峰，1191cm-1为叔胺吸收峰，表明为-COOH接枝成功。
在筛选实验中，对以下活化条件进行了筛选，制备了以下不同的亲和层析材料(制备例1-10)，除变量以外，其他条件均与实施例1相同。
(1)改变接枝环氧基丙基的环境，包括将上述制备过程中的NaBH4-NaOH溶液中分别更换为①1.5mg/mL NaBH4溶液(制备例1)、②1mol/L NaOH溶液(制备例2)和③先加入1.5mol/L NaOH溶液，然后加入0.5mg/mL NaBH4(制备例3)。
(2)改变琼脂糖、环氧基氯丙烷与NaBH4-NaOH溶液的体积比①1：0.5：0.7(制备例4)；②1：0.2：0.5(制备例5)；③1：0.3：1(制备例6)。
(3)去除接枝环氧基丙基与第一次接枝-N-(CH2COOH)2之间使用第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗的操作，仅用蒸馏水洗涤(制备例7)。
(4)调换第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液和第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液(制备例8)。
(5)改变亚氨基乙二酸的pH为7(制备例9)。
(6)改变亚氨基二乙酸溶液的浓度为①50mg/ml(制备例10)；②15mg/ml(制备例11)。
(7)关于接枝-N-(CH2COOH)2的操作，①去除第二次接枝-N-(CH2COOH)2的操作，即仅进行一次-N-(CH2COOH)2的接枝(制备例12)；②二次接枝-N-(CH2COOH)2采用相同的条件(制备例13)；③更换二次接枝-N-(CH2COOH)2的顺序，即先进行步骤(5)再进行步骤(4)(制备例14)；④第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：1(制备例15)；⑤第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.3(制备例16)；⑥NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.1(制备例17)；⑦NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.8(制备例18)。
实施例2细胞蛋白质裂解液的制备
消化并收集MHCC97-H细胞(中国科学院细胞库)于1.5mL EP管，清洗，离心，加入RIPA强裂解液(细胞体积：RIPA强裂解液＝1：10)，于冰上超声破碎提取蛋白质。4℃，12000r离心10min，取上清液于另一干净1.5ml EP管，蛋白浓度为4ug/ul，初始蛋白质提取液体积为400ul，用裂解液补充体积至800uL，即为蛋白质提取液。
实施例3提取与锌离子有特异性结合的蛋白质
向实施例2中制备的蛋白质提取液中加入实施例1制备的锌离子亲和层析材料200ul，于4℃缓慢旋转过夜，垂直放置至材料粒子沉积，吸除上清液；加入1mL含5mmol/L咪唑的结合缓冲液，4℃缓慢旋转10min，旋转速率为10r/min，垂直放置至粒子沉积，弃上清液，用含5mmol/L咪唑的结合缓冲液重复清洗4次；洗脱过程：加入1mL含500mmol/L咪唑的结合缓冲液，4℃缓慢旋转30min，旋转速率为10r/min，垂直放置至粒子沉积，收集上清液，即为洗脱液，重复3次。将洗脱液混合后加入Millipore Ultra-4超滤离心管中，4℃离心40min，所得浓缩液即为可与Zn2+结合的蛋白质浓缩液。其中，结合缓冲液的组成为：7.80mmol/L NaH2PO4、12.20mmol/L Na2HPO4、0.50mol/L NaCl。
实施例4考马斯亮蓝染色实验
亲和层析材料：
材料①：实施例1中活化后的sephorase CL-6B-ECH-IDA；
材料②：实施例1中活化后并螯合了Zn2+的sephorase CL-6B-ECH-IDA-Zn2+；
其中，结合缓冲液的组成为：7.80mmol/L NaH2PO4、12.20mmol/L Na2HPO4、0.50mol/L NaCl；
上样缓冲溶液(loading buffer)的组成为：5X SDS上样缓冲液，使用时稀释。
蛋白样品及处理方式：提取方法参照实施例3
1：对照蛋白(未处理过的MHCC97-H细胞蛋白样品，取自实施例2)；
2：与97H细胞蛋白样品(取自实施例2)吸附并经过含5mmol/L咪唑的结合缓冲液清洗后的材料①，清洗后直接加入等体积2X SDS上样缓冲液沸水浴5min；
3：第4次冲洗材料①后的滤液；
4：与97H细胞蛋白样品(取自实施例2)吸附并经过含5mmol/L咪唑的结合缓冲液清洗后的材料②，清洗后直接加入等体积2X SDS上样缓冲液沸水浴5min；
5：第4次冲洗材料②后的滤液。
结果如图4所示，由该图可看出，未结合锌离子的sephorase CL-6B-ECH-IDA材料与蛋白质提取液反应并经过考马斯亮蓝染色后，未呈现出蛋白条带，而与锌离子结合的sephorase CL-6B-ECH-IDA-Zn2+材料经同样处理后，呈现出蛋白条带，表明锌离子成功与材料上的IDA鳌合，且能吸附锌离子亲和蛋白。
实施例5锌离子鳌合量测定
吸取适量实施例1制备的sephorase CL-6B-ECH-IDA材料，抽滤，称取1g抽滤后的干琼脂糖，置于空的层析柱中，加入5ml 100mM ZnCl2溶液，缓慢旋转1h，使Zn2+尽可能与sephorase CL-6B-ECH-IDA上的二乙酸次氨基链鳌合。鳌合完成后静置空柱，使琼脂糖微粒与溶液出现明显分层，打开柱子下方胶塞，收集滤液。将100mM ZnCl2溶液和滤液分别稀释10000倍，通过火焰原子吸收法测定其中的锌离子浓度，根据锌离子标准曲线计算鳌合前后溶液中锌离子量的差值，即为1g材料的锌离子鳌合量。锌离子标准曲线如图5所示。测定结果为1g实施例1制备的sephorase CL-6B-ECH-IDA材料的锌离子鳌合量为22.3mg/g，即343.1umol/g，1小时螯合时间下Zn2+的螯合率可达68.6％。
采用与上述相同的方法测试制备例1-18制备得到的sephorase CL-6B-ECH-IDA材料，结果如下表所示：

Claims (10)

1.一种固定化锌离子亲和层析材料的制备方法，所述固定化锌离子亲和层析材料以琼脂糖为固相载体、亚氨基二乙酸为螯合剂，锌离子为配体，所述方法包括活化琼脂糖并螯合Zn2+，其中，活化琼脂糖的过程包括琼脂糖分子在NaBH4-NaOH溶液中接枝环氧基丙基，然后依次经蒸馏水、第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，并分别在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液和NaBH4-Na2CO3溶液中先后两次接枝-N-(CH2COOH)2基团。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述NaBH4-NaOH溶液中，NaOH溶液的浓度为1.5-2mol/L，NaBH4的浓度为0.5-1mg/mL；
优选地，所述NaOH溶液的浓度为1.5mol/L，NaBH4的浓度为0.5mg/mL；
优选地，所述第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为8.0-8.5，优选为8.5；
优选地，所述第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液的pH为9.0-9.5，优选为9.0。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述环氧基丙基来自环氧基氯丙烷，所述琼脂糖、环氧基氯丙烷与NaBH4-NaOH溶液的体积比为1：0.2-0.4：0.5-1，优选为1：0.3：0.5。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述-N-(CH2COOH)2基团来源于亚氨基二乙酸溶液，所述亚氨基二乙酸溶液的pH值为6.5-6.8，优选为6.8；
优选地，所述NaBH4-Na2CO3溶液中，Na2CO3溶液的浓度为0.1-0.5mol/L，NaBH4的浓度为0.1-0.25mg/mL；
优选地，所述NaBH4-Na2CO3溶液中，Na2CO3溶液的浓度为0.25mol/L，NaBH4的浓度为0.1mg/mL；
优选地，所述NaBH4-Na2CO3溶液的pH为9.0-9.5，优选为9.0；
优选地，分别在第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液和NaBH4-Na2CO3溶液中先后两次接枝-N-(CH2COOH)2基团时，第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1:0.5-0.8；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2-0.5；
优选地，第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.7；NaBH4-Na2CO3溶液与亚氨基二乙酸溶液的体积比为1：0.2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述活化琼脂糖的过程包括以下步骤：
(1)将琼脂糖吹打混匀后至于过滤漏斗中，抽去保护液，再用蒸馏水洗4-6次，抽干；优选地，所述琼脂糖选自Sepharose CL-6B、Sepharose 6Fast Flow；
(2)将步骤(1)中处理后的琼脂糖转移至锥形瓶内，依次加入NaBH4-NaOH溶液、环氧氯丙烷，于37℃震荡反应0.5-1小时，优选1小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(3)反应完毕，于过滤漏斗中滤干溶液，用蒸馏水洗涤5-6次，至pH＝6.9-7.1，用第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，抽干；
(4)将步骤(3)处理后的物质转移至锥形瓶内，依次加入第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液、亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇12-24小时，优选20小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(5)将步骤(4)处理后的物质转移至新的锥形瓶中，依次加入NaBH4-Na2CO3溶液、亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇12-24小时，优选12小时，震荡速率为200-300r/min，优选250r/min；
(6)反应完毕，于过滤漏斗中滤干溶液，用蒸馏水洗涤5-6次，滤干，转移滤饼至瓶中，加入乙醇/PBS溶液，于4℃保存；
优选地，所述乙醇/PBS溶液为pH为7.4的含有20％乙醇的PBS溶液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将Sepharose CL-6B或Sepharose 6Fast Flow吹打混匀后取5mL于10mL G-3漏斗中，抽去保护液，再用30mL蒸馏水洗4-6次，抽干；
(2)将步骤(1)处理后的Sepharose CL-6B或Sepharose 6Fast Flow转移至25mL锥形瓶内，依次加入2.5mL内含NaBH4-NaOH溶液、1.5mL环氧氯丙烷，于37℃震荡反应1小时，振荡速度250r/min；
(3)步骤(2)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，至pH＝7.0，再用pH为8.5的20.0mL的第一NaHCO3-Na2CO3缓冲液淋洗，抽干；
(4)将步骤(3)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的第二NaHCO3-Na2CO3缓冲液，7mL pH为6.8的亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇20小时，振荡速度为250r/min；
(5)将步骤(4)转移至50mL锥形瓶内，加入10mL pH为9.0的NaBH4-Na2CO3溶液，2mL pH为6.8的亚氨基二乙酸溶液，37℃振摇12小时，振荡速度为250r/min；
(6)步骤(4)反应完毕，于G-3漏斗中滤干溶液，用30mL蒸馏水洗涤5-6次，滤干，转移滤饼至瓶中，加入5-10ml pH为7.4的含有20％的乙醇的PBS溶液，于4℃保存。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述螯合Zn2+的步骤包括：
(7)将亲和层析柱清洗干净，烘干，然后把柱子下端封好，再用枪把介质装入柱中；
(8)静置至水层和凝胶层分层明显；
(9)此时打开下端去掉水层，当水面接近凝胶表面时，再重新封闭下端；向柱子中加入超纯水，静置至分层，放掉超纯水，重复此步骤3-5次以洗去保存用的乙醇/PBS溶液；
(10)接着向柱子中加入氯化锌溶液，静置0.5-1h后用超纯水冲洗柱体；
(11)加入用pH＝7.4的含有20％乙醇的PBS溶液，于4℃下保存。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法制备得到的固定化锌离子亲和层析材料或包含该固定化锌离子亲和层析材料的亲和层析柱。
9.一种从细胞中提取与锌离子有特异性结合的蛋白质的方法，所述方法使用权利要求8中所述的固定化锌离子亲和层析材料或包含该固定化锌离子亲和层析材料的亲和层析柱。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：向蛋白质提取液中加入锌离子亲和层析材料筛选出与Zn2+结合的蛋白质、去除无关蛋白，然后洗脱、浓缩的过程；
优选地，所述方法中初始蛋白质提取液与锌离子亲和层析材料的体积比为1.5-2：1，优选为2：1；
优选地，所述方法包括：向蛋白质提取液中加入锌离子亲和层析材料，初始蛋白质提取液与锌离子亲和层析材料的体积比为1.5-2：1，优选为2：1，于4℃缓慢旋转过夜，垂直放置至材料粒子沉积，吸除上清液；加入1mL含5mmol/L咪唑的结合缓冲液，4℃缓慢旋转10min，旋转速率为10r/min，垂直放置至粒子沉积，弃上清液，重复清洗4-5次；加入1mL含500mmol/L咪唑的结合缓冲液，4℃缓慢旋转30min，旋转速率为10r/min，重复3次，垂直放置至粒子沉积，收集上清液，即为洗脱液；将洗脱液混合后加入Millipore Ultra-4超滤离心管中，4℃离心40min，所得浓缩液即为可与Zn2+结合的蛋白质浓缩液；
优选地，所述初始蛋白质提取液浓度为4ug/ul-8ug/ul。
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