CN101485381A - 牛乳中骨桥蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
牛乳中骨桥蛋白的提取方法，它涉及一种骨桥蛋白的提取方法。本发明解决了现有技术提取牛乳中骨桥蛋白纯度低的问题。提取方法如下：离子交换色谱分离；一步疏水色谱分离；二步疏水色谱分离；透析；冻干，即得牛乳中骨桥蛋白。本发明提取的牛乳中骨桥蛋白纯度高。本发明方法不采用使蛋白变性的步骤、操作简便、成本低、提取时间短。
Description
技术领域
本发明涉及一种骨桥蛋白的提取方法。
背景技术
牛乳几乎含有人体所需要的全部营养物质，是唯一的全营养食物。牛乳容易消化吸收、物美价廉、食用方便，还含有许多生物活性物质，是人类食品中优质蛋白质极好的来源。骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)是一种富含唾液酸的高度磷酸化的糖蛋白，主要作为非胶原性的细胞外基质蛋白分布在矿物组织(如骨和牙骨质)中，促进破骨细胞的黏附和促进类骨质的生物矿化。一些研究工作表明骨桥蛋白存在于骨细胞中，粘附到细胞外基质，可以作为骨形成早期阶段的化学诱导物。目前，关于骨桥蛋白与骨健康方面的研究越来越受到人们的关注。
骨桥蛋白可以作为完整的蛋白质或者作为片段的形式从不同来源中获得，如在骨中、人的尿液中提取等。对乳中骨桥蛋白的阐述始于1987年母乳酪蛋白组分。Sorensen等人采用交联葡聚糖凝胶色谱和Q-琼脂糖阴离子交换色谱的方法，从牛乳朊间质蛋白胨中提取了骨桥蛋白，并且指出分子量为60KDa。尽管用这种方法得到了骨桥蛋白，但是在提取的过程中存在蛋白变性步骤致使所制得的骨桥蛋白纯度低，纯度小于0.2mg骨桥蛋白/mg蛋白质。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术提取牛乳中骨桥蛋白纯度低的问题，而提供一种牛乳中骨桥蛋白的提取方法。
牛乳中骨桥蛋白的提取方法按以下步骤实现：一、离子交换色谱分离：1000～2000mL牛乳离心15～30min，去除沉淀物后与200～400mLDEAE-Sephacel树脂混合，在3～6℃条件下搅拌12～24h，然后静止，去除沉淀物后灌入色谱柱中，再在流速为3～5mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L、pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为3～5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱分三个阶段完成，并分别收集每一阶段的梯度洗脱液；二、采用疏水色谱对步骤一获得的梯度洗脱液分别进行分离，分别获得含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液；三、再采用疏水色谱分别分离步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液，然后将收集液混合；四、透析：采用去离子水进行透析，每2～6h更换一次去离子水；五、冻干：真空条件下在3～6℃干燥，即得到牛乳中的骨桥蛋白。
本发明方法可以在每升牛乳中分离纯化得到8.17mg的骨桥蛋白，纯度为0.404mg骨桥蛋白/mg蛋白质。本发明方法不采用使蛋白变性的步骤，操作简便、成本低、提取时间短。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式牛乳中骨桥蛋白的提取方法按以下步骤实现：一、离子交换色谱分离：1000～2000mL牛乳离心15～30min，去除沉淀物后与200～400mL DEAE-Sephacel树脂混合，在3～6℃条件下搅拌12～24h，然后静止，去除沉淀物后灌入色谱柱中，再在流速为3～5mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L、pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为3～5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱分三个阶段完成，并分别收集每一阶段的梯度洗脱液；二、采用疏水色谱对步骤一获得的梯度洗脱液分别进行分离，分别获得含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液；三、再采用疏水色谱分别分离步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液，然后将收集液混合；四、透析：采用去离子水进行透析，每2～6h更换一次去离子水；五、冻干：真空条件下在3～6℃干燥，即得到牛乳中的骨桥蛋白。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中梯度洗脱第一阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液；梯度洗脱第二阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.25mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液；梯度洗脱第三阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.3mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤二中疏水色谱分离按以下步骤进行：分别向步骤一获得的梯度洗脱液中加入NaCl至每一梯度洗脱液中NaCl的浓度均为4mol/L，再在流速为1～3mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L的pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为1～3mL/min、检测波长为280nm的条件下用NaCl的浓度为2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液作为洗脱液分别进行洗脱。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式三不同的是步骤三中疏水色谱分离按以下步骤进行：分别向步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的每一洗脱液中加入NaCl至混合液中NaCl的浓度为5mol/L，再在流速为1～3mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L的pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为1～3mL/min、检测波长为280nm的条件下用NaCl的浓度为2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液作为洗脱液分别进行洗脱。其它与具体实施方式三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一、二或四不同的是步骤一中搅拌时间为16～20h。其它与具体实施方式一、二或四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一、二或四不同的是步骤一中搅拌时间为12h。其它与具体实施方式一、二或四相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一、二或四不同的是步骤一中搅拌时间为24h。其它与具体实施方式一、二或四相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一、二或四不同的是步骤一中搅拌时间为18h。其它与具体实施方式一、二或四相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式五不同的是步骤一中离子交换色谱分离采用的系统为AKTA purified 100系统。其它与具体实施方式五相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一、二、四或九不同的是步骤二中每一梯度洗脱液的上样量均为5mL。其它与具体实施方式一、二、四或九相同。
具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式十不同的是步骤二中疏水色谱分离采用的色谱柱为Phenyl-Sepharose 6FF色谱柱。其它与具体实施方式十相同。
具体实施方式十二：本实施方式与具体实施方式一、二、四、九或十一不同的是步骤三中每一含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液的上样量均为5mL。其它与具体实施方式一、二、四、九或十一相同。
具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二同的是步骤四中每3～5h更换一次去离子水。其它与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十四：本实施方式与具体实施方式十二同的是步骤四中每4h更换一次去离子水。其它与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十五：本实施方式与具体实施方式十二同的是步骤四中每2h更换一次去离子水。其它与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十六：本实施方式与具体实施方式十二同的是步骤四中每6h更换一次去离子水。其它与具体实施方式十二相同。
具体实施方式十七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中干燥温度为4℃。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中干燥温度为3℃。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式十九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤五中干燥温度为6℃。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心时间为18～24min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心时间为15min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心时间为30min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中离心时间为20min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的流速为3mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的流速为4mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的流速为5mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.012mol/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式二十九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.015mol/L。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的流速为1mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的流速为2mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的流速为3mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的流速为1mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的流速为2mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十五：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的流速为3mL/min。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十六：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的体积为600mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十七：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的体积为550mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十八：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中洗脱液的体积为650mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三十九：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的体积为600mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的体积为550mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十一：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤二中洗脱液的体积为650mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的体积为600mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十三：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的体积为550mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十四：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤三中洗脱液的体积为650mL。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式四十五：本实施方式牛乳中骨桥蛋白的提取方法按以下步骤实现：一、离子交换色谱分离：1000mL牛乳离心15min，去除沉淀物后与200mLDEAE-Sephacel树脂混合，在4℃条件下搅拌12h，然后静止，去除沉淀物后灌入色谱柱中，再在流速为3mL/min的条件下用浓度为0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为3mL/min、检测波长为280nm的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱分三个阶段完成，并分别收集每一阶段的梯度洗脱液；二、采用疏水色谱对步骤一获得的梯度洗脱液分别进行分离，分别获得含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液；三、再采用疏水色谱分别分离步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液，然后将收集液混合；四、透析：采用去离子水进行透析，每2～6h更换一次去离子水；五、冻干：真空条件下在3～6℃干燥，即得到牛乳中的骨桥蛋白。
本实施方式可以分离纯化得到8.17mg的骨桥蛋白，纯度为0.404mg骨桥蛋白/mg蛋白质。
在骨桥蛋白的鉴定试验中，通过SDS-PAGE，可以得到纯度较高、单一条带的骨桥蛋白，且纯化蛋白的分子质量约为60KDa。
对各组分进行Western blot检测，将SDS-PAGE电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后与能特异性识别骨桥蛋白的兔抗牛骨桥蛋白抗体进行反应。结果证明，组分骨桥蛋白-3是具有活性、纯度较高的骨桥蛋白，且在每步纯化的过程中骨桥蛋白的蛋白表达也相对加强。
Claims (10)
1、牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于牛乳中骨桥蛋白的提取方法按以下步骤实现：一、离子交换色谱分离：1000～2000mL牛乳离心15～30min，去除沉淀物后与200～400mL DEAE-Sephacel树脂混合，在3～6℃条件下搅拌12～24h，然后静止，去除沉淀物后灌入色谱柱中，再在流速为3～5mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L、pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为3～5mL/min、检测波长为280nm的条件下进行梯度洗脱，梯度洗脱分三个阶段完成，并分别收集每一阶段的梯度洗脱液；二、采用疏水色谱对步骤一获得的梯度洗脱液分别进行分离，分别获得含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液；三、再采用疏水色谱分别分离步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液，然后将收集液混合；四、透析：采用去离子水进行透析，每2～6h更换一次去离子水；五、冻干：真空条件下在3～6℃干燥，即得到牛乳中的骨桥蛋白。
2、根据权利要求1所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤一中梯度洗脱第一阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液；梯度洗脱第二阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.25mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液；梯度洗脱第三阶段洗脱液是NaCl的浓度为0.3mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液。
3、根据权利要求1或2所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤二中疏水色谱分离按以下步骤进行：分别向步骤一获得的梯度洗脱液中加入NaCl至每一梯度洗脱液中NaCl的浓度均为4mol/L，再在流速为1～3mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L的pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为1～3mL/min、检测波长为280nm的条件下用NaCl的浓度为2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液作为洗脱液分别进行洗脱。
4、根据权利要求3所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤三中疏水色谱分离按以下步骤进行：分别向步骤二获得的含有骨桥蛋白的粗纯化组分的每一洗脱液中加入NaCl至混合液中NaCl的浓度为5mol/L，再在流速为1～3mL/min的条件下用浓度为0.01～0.015mol/L的pH值为7.2～7.6的磷酸缓冲溶液平衡色谱柱，然后在流速为1～3mL/min、检测波长为280nm的条件下用NaCl的浓度为2mol/L、pH值为7.0～7.2、浓度为0.01～0.015mol/L的磷酸缓冲溶液作为洗脱液分别进行洗脱。
5、根据权利要求1、2或4所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤一中搅拌时间为16～20h。
6、根据权利要求5所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤一中离子交换色谱分离采用的系统为AKTA purified 100系统。
7、根据权利要求1、2、4或6所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤二中每一梯度洗脱液的上样量均为5mL。
8、根据权利要求7所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤二中疏水色谱分离采用的色谱柱为Phenyl-Sepharose 6FF色谱柱。
9、根据权利要求1、2、4、6或8所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤三中每一含有骨桥蛋白的粗纯化组分的洗脱液的上样量均为5mL。
10、根据权利要求9所述的牛乳中骨桥蛋白的提取方法，其特征在于步骤四中每3～5h更换一次去离子水。
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| CN112557483A (zh) * | 2020-11-20 | 2021-03-26 | 黑龙江飞鹤乳业有限公司 | 乳制品中骨桥蛋白的分析方法 |
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