DE69632057T2

DE69632057T2 - Verfahren zur fällung von nukleinsäuren mit einem sichtbaren träger

Info

Publication number: DE69632057T2
Application number: DE69632057T
Authority: DE
Inventors: R. Mark McCORMICK
Original assignee: EMD Biosciences Inc
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1995-10-02
Filing date: 1996-10-01
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2016-10-02
Also published as: DE69632057D1; WO1997012994A1; ATE263254T1; EP0853680A1; CA2231501A1; EP0853680B1; CA2231501C; EP0853680A4

Description

Die Fällung von Nukleinsäuren ist ein allgemeines Verfahren in der molekularbiologischen Forschung. Die Fällung ist oft nötig, um verdünnte Lösungen einer Nukleinsäure zu konzentrieren oder um das Lösungsmittel, in dem die Nukleinsäure gelöst ist, auszutauschen. In der Praxis wird zu der Nukleinsäurelösung ein Salz zugegeben, gefolgt von einer geeigneten Menge eines Alkohols, beispielsweise Ethanol oder Isopropanol. Die Probe wird bei einer geeigneten Temperatur inkubiert, bis Nukleinsäuremoleküle ausfallen. Die Nukleinsäure wird dann durch Zentrifugation gewonnen.
Beim Arbeiten mit verdünnten Nukleinsäurelösungen (≤ 10 μg/ml) oder kleinen Mengen von DNA oder RNA (≤ 1 μg) ist es oft wünschenswert, die Fällungseffizienz durch Einbeziehen eines Trägermoleküls zu erhöhen. Zusätzlich können die Träger die Fällungsrate erhöhen und können die Gesamtdauer, die nötig ist, um eine Nukleinsäure aus der Lösung rückzugewinnen, verringern. Ein Trägermolekül kann die Menge an Material, das aus verdünnten Lösungen rückgewonnen wird, erhöhen oder die Rückgewinnung von geringen Mengen von Nukleinsäuren erhöhen.
D. M. Wallace (1987) hat in Meth. Enzymol. 152, 41–48 einen Überblick über die Erfordernisse und Strategien, die beim Fällen von Nukleinsäuren verwendet werden, gegeben. Wallace berichtet über die Verwendung von Trägermolekülen, beispielsweise Transfer-RNA (tRNA) und gereinigtem Glykogen, um die Fällungsrate der Nukleinsäure und die Effizienz zu erhöhen.
Glykogen ist ein Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht, das aus sich wiederholenden Einheiten von D-Glucopyranose-Resten, die durch (1→4)-α-D-glycosidische Bindungen mit Verzweigungspunkten an Position C-6 im Durchschnitt an jedem zwölften Rest, zusammengesetzt ist. Die Längen der Zweige sind im Bereich von 4–8 Resten (Bahl, O. P. und Smith, F. J., (1966) Org. Chem., 31, 2915–2920). Bei der Basisstruktur (ohne Verzweigungsstrukturen) handelt es sich um:
Glykogen wird als ein guter Träger für Nukleinsäurefällungsverfahren erachtet, weil es mit Nukleinsäuren Löslichkeit und Fällungseigenschaften gemeinsam hat. Da ein Nukleinsäuregerüst ebenfalls aus Wiederholungseinheiten, nämlich Ribose oder Desoxyribose, die durch Phosphodiester-Bindungen verbunden sind, zusammengesetzt ist, sind sowohl Nukleinsäuren als auch Glykogen in wässrigen Lösungen löslich und fallen aus (aggregieren), wenn die Dielektrizitätskonstante durch zugesetzten Alkohol erniedrigt wird. Glykogen wird auch vorteilhafterweise als Träger verwendet, weil es ladungsneutral ist und keine Hemmung von allgemeinen enzymatischen Reaktionen, die mit Nukleinsäuren durchgeführt werden (z. B. Restriktionsverdau, cDNA-Synthese, Transkription, Ligation, Amplifizierung, Sequenzierung, Zurechtschneiden etc.), verursacht. Bei manchen Anwendungen wird Glykogen gegenüber tRNA, die bei manchen enzymatischen Reaktionen, wie z. B. Markieren der Enden mit Kinase, stören kann, bevorzugt.
Trotz der weitreichenden Verwendung von Nukleinsäurefällung in fast allen allgemeinen molekularbiologischen Verfahren neigt die Technik oft zu unvorhersagbarem Versagen. Selbst wenn ein Trägermolekül eingeschlossen ist, um die Gesamtmenge an gefällter Nukleinsäure zu erhöhen, werden Nukleinsäure-Pellets leicht während der Entfernung von Überstandsphasen verloren, insbesondere wenn man mit kleinen Nukleinsäuremengen (< 10 μg) arbeitet oder wenn Träger verwendet werden, die für das bloße Auge nicht leicht zu erkennen sind. Zusätzlich erfordern die Protokolle oft, dass Nukleinsäure-Pellets mit Alkohollösungen gewaschen werden sollen und vor der Wiederaufnahme in wässrigen Puffern unter Vakuum getrocknet werden sollen. Diese Schritte führen oft zum Ablösen der pelletierten Nukleinsäuren, die leicht beim nachfolgenden Handhaben verloren werden.
Es wäre wünschenswert, das Vorhandensein und den Ort der Nukleinsäure während eines Fällungsverfahren nachzuweisen zu können, um unbeabsichtigten Verlust von pelletiertem Material zu vermeiden.
Dextranblau, ein Komplex von Dextran mit dem Farbstoff „reactive blue 2", ist bekannt (Sigma Katalog 1997). Die DE 43 33 805 A1 erwähnt Verfahren zum Extrahieren von Nukleinsäuren aus wässriger Lösung, wobei die Verfahren das Zusetzen eines Trägers, bei dem es sich um Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose handelt, eines Salzes und eines Alkohols zu einer Probe, die Nukleinsäuren enthält, umfassen.
Die vorliegende Erfindung wird dadurch zusammengefasst, dass die Nachweisprobleme, die im Stand der Technik für Nukleinsäurefällung bekannt sind, durch Modifizieren eines Trägermoleküls überwunden werden, um es besser sichtbar zu machen. Ein modifiziertes Trägermolekül mit erhöhter Sichtbarkeit behält nicht nur die Löslichkeits- und Fällungseigenschaften des unmodifizierten Moleküls, sondern es kann auch leicht sichtbar gemacht werden. Falls es als Träger für eine Nukleinsäure bei einem Fällungsverfahren verwendet wird, wirkt der modifizierte Träger als ein Indikator für das Vorhandensein und den Ort der Nukleinsäure.
In Übereinstimmung mit der Erfindung hat der gemäß der Erfindung modifizierte Träger mit den Nukleinsäuremolekülen eine allgemein polymere Struktur gemeinsam und umfasst eine strukturelle Stelle, die mit einem geeigneten Indikatormolekül modifiziert werden kann, vorzugsweise durch kovalente Modifikation. Die Stelle kann die Größe von einem oder mehreren Atomen aufweisen. Das geeignete Indikatormolekül ist leicht sichtbar zu machen und umfasst eine reaktive Gruppe, die an den polymeren Träger gekoppelt werden kann. Das Indikatormolekül wird an den polymeren Träger unter Verwendung eines aus einer Vielzahl von gut verstandenen chemischen Kopplungsverfahren angebunden.
Die vorliegende Erfindung wird auch dadurch zusammengefasst, dass der modifizierte Träger vorteilhaft bei einem Verfahren zum Fällen von Nukleinsäuremolekülen verwendet wird. Der modifizierte Träger wird zu einer Probe, die eine Nukleinsäure enthält, zugegeben und die Fällung wird dann in einer im Stand der Technik bekannten Weise durchgeführt. Im Gegensatz zu den bekannten Verfahren fällt der modifizierte Träger gemäß der Erfindung jedoch mit der Nukleinsäure aus, wodurch es dem Anwender erlaubt ist, den Ort der Nukleinsäure in der behandelten Probe direkt zu beobachten.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Trägermolekül mit der Löslichkeit und den Fällungseigenschaften von Nukleinsäure bereitzustellen, was es dem Anwender zugleich ermöglicht, das Fortschreiten der Fällung zu sehen.
Die vorliegende Erfindung stellt entsprechend ein Verfahren zum Fällen von ungefällter Nukleinsäure aus einer wässrigen Lösung bereit, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
Versetzen der Lösung mit einem polymeren Trägermolekül, das an ein Indikatormolekül gekoppelt ist, wobei das Indikatormolekül entweder direkt oder durch Anregung mit einfallendem Licht einer geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden kann,
wobei die Lösung eine Menge eines Salzes und eine Menge eines Alkohols, welche ausreichen, um die Fällung der Nukleinsäure aus der Lösung zu bewirken, umfasst, und wobei es sich bei dem polymeren Trägermolekül um Glykogen oder ein Polymer mit primären Amingruppen handelt. Ebenso wird eine Zusammensetzung, die ein Glykogenmolekül, das zur gemeinsamen Fällung mit einem Nukleinsäuremolekül aus einer wässrigen Lösung fähig ist, wobei die wässrige Lösung eine Menge eines Salzes und eine Menge eines Alkohols, welche ausreichen, um die Fällung der Nukleinsäure aus der Lösung zu bewirken und ein an das Glykogenmolekül gekoppeltes Indikatormolekül, wobei das Indikatormolekül entweder direkt oder durch Anregung mit einfallendem Licht einer geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden kann, umfasst, bereitgestellt. Die Zusammensetzung kann ferner ein Nukleinsäuremolekül umfassen, wobei das Nukleinsäuremolekül und das Trägermolekül in einer wässrigen Umgebung bereitgestellt werden.
Es ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung des modifizierten Trägers in einem Fällungsverfahren die nachfolgenden Reaktionen, die mit den gefällten Nukleinsäuren durchgeführt werden, nicht negativ beeinflussen.
Es ist ein Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass der modifizierte Träger eine Ladung, die zu der der Nukleinsäure entgegengesetzt ist, aufweist, wobei es ermöglicht wird, die gefällte Nukleinsäure von dem Trägermolekül durch routinemäßige Elektrophorese abzutrennen.
Andere Aufgaben, Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung werden bei Berücksichtigung der folgenden genauen Beschreibung offensichtlich, wenn sie in Verbindung mit der beigefügten Abbildung gelesen wird.
1 zeigt ein Verfahren zum Herstellen einer Ausführungsform des modifizierten Trägers der vorliegenden Erfindung. 1 zeigt nämlich ein Verfahren zum Bilden eines Tetramethylrhodamin-Glykogen-Konjugats.
Gemäß einem Aspekt ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Fällen von Nukleinsäuren in Gegenwart eines Trägers, der leicht sichtbar gemacht wird. Im ersten Verfahrensschritt wird ein Trägermolekül, das an ein Indikatormolekül gekoppelt ist, zu einer Nukleinsäure-enthaltenden Probe in einem wässrigen Lösungsmittel zugegeben, um gefällt zu werden. Als nächstes wird eine geeignete Menge eines Salzes (wie z. B. Natriumchlorid, Natriumacetat, Ammoniumacetat oder Lithiumchlorid) und ein geeignetes Volumen eines Alkohols zugegeben. Die geeignete Menge des Salzes, die benötigt wird, ist im Stand der Technik bekannt. Es muß nicht nötig sein, ein Salz zuzusetzen, wenn bei der Reaktion die Nukleinsäure in großer Menge vorliegt (z. B. etwa 1 mg/ml oder mehr). Im Allgemeinen ist der Alkohol Ethanol oder Isopropanol. Wenn der Alkohol Ethanol ist, werden 2 Volumina Ethanol pro Probenvolumen zugegeben. Wenn der Alkohol Isopropanol ist, werden typischerweise 0,6 Volumina Isopropanol zugegeben. Dieser Aspekt des Fällungsverfahrens ist im Stand der Technik gut bekannt und ein gewisses Maß an Variabilität für die exakten Verhältnisse von wässriger Probe und Alkohol sind für einen Fachmann annehmbar.
Nachdem der Alkohol zugegeben wurde, wird die Probe typischerweise für einen geeigneten Zeitraum bei einer geeigneten Temperatur inkubiert (z. B. zwischen Raumtemperatur und –70°C.) und dann in einem Zentrifugenröhrchen zentrifugiert, um das Nukleinsäurematerial entlang einer Oberfläche des Röhrchens abzuscheiden. Der flüssige Überstand wird entfernt, die pelletierte Nukleinsäure wird getrocknet und zur nachfolgenden Verwendung in einer von einer Vielzahl molekularbiologischer Reaktionen resuspendiert.
Wallace, siehe oben, beschreibt ausführlich die geeigneten Bedingungen zur Nukleinsäurefällung. Es sind keine besonderen Anpassungen an das Standardfällungsverfahren oder für die Reagenzien nötig, weil die Gegenwart des modifizierten Trägers die Fällungsbedingungen nicht beeinflusst.
Im Gegensatz zu früheren Nukleinsäurefällungsverfahren wird die Lokalisierung der Nukleinsäure in der Probe leicht ersichtlich sein, weil sich der modifizierte Träger selbst im Überstand verteilen oder mit der Nukleinsäure ausfallen wird.
Ein geeignetes Trägermolekül ist ein Polymermolekül, das in seiner unmodifizierten Form eine Stelle umfasst, an die ein geeignetes Indikatormolekül gebunden werden kann. Das Indikatormolekül wird vorzugsweise kovalent an den Träger gebunden. Insbesondere stellen vicinale Hydroxide, reaktive OH-Gruppen, die auf einem Molekül an benachbarten Kohlenstoffen gebunden sind, eine Stelle zur reduktiven Substitution eines Substituenten auf dem Molekül bereit. Vicinale Hydroxidgruppen, die in Polysaccharidmolekülen vorherrschen, sind erwünschte Stellen, weil sie leicht oxidiert und dann an ein geeignetes Indikatormolekül gekoppelt werden. Andere Trägermoleküle können Polymere mit verfügbaren primären Amingruppen umfassen. Ein Beispiel eines solchen Polymers ist ein lineares Polyacrylamid. Bevorzugte Träger gleichen Nukleinsäuren im Allgemeinen in Länge, linearer Struktur, Löslichkeit und Fällungseigenschaften. Ein Vernetzen ist annehmbar, wenn es nicht negativ mit dem Koppeln oder Fällen verbunden ist. Ein Zuckergerüst oder ein modifiziertes Zuckergerüst ist wegen seiner Ähnlichkeit mit dem Nukleinsäuregerüst erwünscht. Ein bevorzugter Träger ist ein Polysaccharid. Ein meist bevorzugter Träger ist Glykogen.
Glykogen ist ein allgemeiner Begriff, der Polysaccharidmoleküle mit verschiedenen Verzweigungsstrukturen umfasst. Ein Standardverfahren zum Erhalten von Glykogen ist in Bell, D. J. und F. G. Young, Biochem J. 28: 882 (1934) beschrieben. Typ III Glykogen aus Kaninchenleber wurde von den gegenwärtigen Erfindern erfolgreich verwendet. Typ III Glykogen ist im Handel von Sigma Chemical Co. erhältlich.
Ein geeignetes Indikatormolekül ist jedes Molekül, das an einen geeigneten Träger gekoppelt werden kann, und entweder direkt sichtbar gemacht oder durch Anregung mit einfallendem Licht einer geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden kann. Bevorzugte Indikatoren sind Farbstoffe oder Fluorophore.
Während die Wahl eines Indikatormoleküls weitgehend von seiner Eignung, unter den erwünschten Bedingungen sichtbar gemacht zu werden und von seiner Reaktionsfähigkeit mit dem Trägermolekül abhängt, ist ein zum Koppeln bevorzugter Indikator ein primäres-Amin-tragender Farbstoff oder Fluorophor. Primäre Amine werden unter Verwenden von wohlbekannten chemischen Kopplungsverfahren leicht an vicinale Hydroxidgruppen auf Polysaccharidträgern gekoppelt. Viele solcher primäres-Amin-tragender Verbindungen sind im Handel erhältlich. Insbesondere ist Molecular Probes, Inc., Eugene, OR eine Bezugsquelle für eine große Anzahl von geeigneten Indikatormolekülderivaten, die wie hier beschrieben gekoppelt werden können (Molecular Probes 1992–1994 Katalog). Geeignete Indikatormolekülvorläufer umfassen die Folgenden, sind aber nicht darauf beschränkt:
5-(Aminoacetamido)-fluorescein (Fluoresceinylglycinamid),
4'-((Aminoacetamido)-methyl)-fluorescein,
5-Aminoeosin,
N-(2-Aminoethyl)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimid-dikaliumsalz,
5-((2-Aminoethyl)-amino-napahthalin-1-sulfonsäure-natriumsalz,
5-((2-Aminoethyl)-thioureidyl)-fluorescein,
4'-(Aminomethyl)-fluorescein-hydrochlorid,
5-(Aminomethyl)-fluorescein-hydrochlorid,
7-Amino-4-methylcumarin,
1-Aminomethylpyren-hydrochlorid,
8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure-dinatriumsalz (ANTS),
5-(und-6)-((N-(5-Aminopentyl)-amino)-carbonyl)-tetramethylrhodamin (Tetramethylrhodamin-cadaverin),
5-((5-Aminopentyl)-thioureidyl)-eosin-hydrochlorid (Eosin-cadaverin),
5-((5-Aminopentyl)-thioureidyl)-fluorescein (Fluorescein-cadaverin),
6-Aminochinolin,
5-(((2-(Carbohydrazino)-methyl)-thio)-acetyl)-aminofluorescein,
Cascade Blue^®-cadaverin-trinatriumsalz,
Cascade Blue^®-ethylendiamin-trinatriumsalz,
Cascade Blue^®-hydrazid-trikaliumsalz und
Cascade Blue^®-hydrazid-trinatriumsalz.
Bestimmte Fluorophore sind dafür bekannt, dass sie nach längerem Aussetzen gegenüber UV-Licht photogebleicht werden und ihre Indikatoreigenschaften verlieren. Entsprechend ist es wünschenswert, Fluorophore ohne zusätzliche UV-Beleuchtung zu verwenden. Obwohl die bevorzugten Indikatormoleküle ohne Hilfe von einfallendem UV-Licht einer geeigneten Wellenlänge beobachtbar sind, haben die Erfinder beobachtet, dass kleinere Mengen von Trägermaterial nachweisbar sind, wenn die Proben unter UV-Licht untersucht werden, weil die Untergrundfluoreszenz tendenziell verringert wird.
Wenn das Indikatormolekül mit Ultraviolett (UV)-Licht beleuchtet wird, ist UV-Licht mit längerer Wellenlänge (größer als 300 nm) besser geeignet, weil diese längeren Wellenlängen weniger dazu neigen, eine Spaltung der Nukleinsäure-Stränge, die ebenfalls bestrahlt werden würden, herbeizuführen. Außerdem kann die Hinzunahme eines anregbaren Indikatormoleküls in eine Nukleinsäureumsetzung tatsächlich eine schützenden Wirkung auf die Nukleinsäure aufweisen, weil das Indikatormolekül UV-Licht absorbieren kann und diese Energie bei einer viel höheren Wellenlänge emittiert. Somit wird einfallendes UV-Licht, das sonst die Nukleinsäuremoleküle angreifen und beschädigen könnte, stattdessen durch das Indikatormolekül eingefangen und umgelenkt. Um Photobleichen zu vermeiden, ist es bevorzugt, dass nur kurze UV-Belichtungen verwendet werden.
Ein bevorzugtes gekoppeltes Indikatormolekül ist Tetramethylrhodamin, das einen molaren Extinktionskoeffizienten von 95.000 bei 542 nm und Anregungs- und Emissionsmaxima bei 542 bzw. 571 nm aufweist. Das primäre-Amin-tragende Derivat, Tetramethylrhodamin-cadaverin [5-(und -6)-((N-(5-Aminopentyl)amino)carbonyl)tetramethylrhodamin] umfasst eine positive Nettoladung bei neutralem pH. Diese drei Eigenschaften dieses Fluorophors stellen drei nützliche Eigenschaften für das Tetramethylrhodamin-glykogenkonjugat als Träger bereit. Erstens ist die Sichtbarkeit jeder Komponente in Lösung oder in gefällter Form für das bloße Auge proportional zur Lichtmenge einer sichtbaren Wellenlänge, die durch die Verbindung absorbiert wird. Da Tetramethylrhodamin stark absorbierend bei 542 nm ist, weist das Glykogenkonjugat dieser Verbindung sowohl in seinen gelösten als auch in seinen gefällten Zuständen ein kräftiges rosa Aussehen auf. Dies ermöglicht es, die Zugabe des Reagenz visuell zu bestätigen, im Gegensatz zur Zugabe von unkonjugiertem farblosen Glykogen. Zusätzlich wird die gefällte Form bei normalem Tageslicht leicht sichtbar gemacht, wenn nur eine so kleine Menge wie 2,5 μg des Konjugats gefällt wird.
Zweitens ist das Anregungs/Emissions-Spektrum von Tetramethylrhodamin zum Fluoreszensnachweis von gefälltem Konjugat durch Anregung mit lang- oder kurzwelligem UV-Licht gut geeignet. Eine Anregung der Verbindung mit lang- oder kurzwelligem UV-Licht führt zu einer leuchtend orangen Fluoreszenzemission mit einem Maximum bei 571 nm. Diese Eigenschaft ermöglicht es, Nukleinsäuren, die in Gegenwart des Glykogen-Tetramethylrhodaminkonjugats gefällt wurden, mit erhöhter Empfindlichkeit nachzuweisen und durch die Verwendung einer UV-Lichtquelle und einer Kameraausrüstung mit einem Filter, die im Allgemeinen in molekularbiologischen Laboratorien verfügbar sind, zu dokumentieren. Zuletzt bewirkt die positive Ladung auf dem Glykogenkonjugat, dass die Moleküle während einer Gelelektrophorese zur negativen Elektrode (Kathode) gezogen werden, sodass sie beim Nachweis von Nukleinsäuren, die zur positiven Elektrode (Anode) wandern, nicht stören. Da Nukleinsäuren und der modifizierte Träger in entgegengesetzte Richtungen wandern, können Ethidiumbromid-gefärbte Nukleinsäurebanden leicht von dem Fluoreszenzsignal, das vom Trägermolekül herrührt, unterschieden werden. Die positive Nettoladung auf dem Molekül beeinflusst weder seine Funktion als Träger für die Nukleinsäurefällung, noch hemmt es die enzymatischen Reaktionen, die allgemein in der Molekularbiologie verwendet werden.
Bei einer besonderen Ausführungsform kann es bevorzugt sein, dass das Indikatormolekül auch für Änderungen des pH-Werts einer Lösung, die den modifizierten Träger und die Nukleinsäure enthält, empfindlich ist. Dies kann besonders wünschenswert sein, wenn z. B. eine alkalische Denaturierung der Nukleinsäure vor der Fällung durchgeführt werden soll, so wie es beim Herstellen von Nukleinsäurematrizen für bestimmte Sequenzierungsverfahren der Fall sein kann. Beispielsweise kann in Gegenwart des pH-empfindlichen Indikators, der an den Träger gekoppelt ist, eine doppel-strängige DNA-Matrize mit 0,1 M NaOH denaturiert werden und danach zur Verwendung bei einer Sequenzierungsreaktion gefällt werden.
Es ist bevorzugt, dass das Indikatormolekül eine nachweisbare Veränderung (z. B. eine Änderung von einer Farbe zu einer anderen) über etwa pH 8,5 zeigt. Es ist vorteilhaft, ein pH-empfindliches Indikatormolekül bereitzustellen, weil es sowohl ein Verfolgen der DNA-Fällung ermöglicht als auch eine Bestätigung für die Denaturierung vor dem Sequenzieren bereitstellt. Es ist am meisten bevorzugt, dass der Indikator sowohl unter alkalischen als auch sauren Bedingungen nachweisbar ist, obwohl es ausreichend sein kann, wenn die Farbe entweder auftritt oder verschwindet, wenn der pH-Übergang durchgeführt wird. Zusätzlich können die pH-empfindlichen, gekoppelten Indikatoren ohne Beleuchtung, die die Nukleinsäure beschädigen kann, sichtbar sein. Es ist bevorzugt, aber nicht notwendig, dass die Farbänderung für das bloße Auge sichtbar ist. Spektrophotometrischer Nachweis kann ebenfalls geeignet sein, wenn die Umsetzungen mit einem automatischen Prozessierungssystem durchgeführt werden.
Es wird angemerkt, dass Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, einen Satz von pH-Indikatormolekülen, die zur Verwendung bei der Bestimmung von intrazellulärem pH (Molecular Probes 1992–1994 Katalog) angeboten werden, käuflich erwerbbar zur Verfügung stellt. Die pH-Indikatormoleküle, die dort aufgeführt sind, können vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, wenn sie als pH-empfindliche Indikatoren bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mindestens zwei der pH-Indikatorverbindungen, die von Molecular Probes erhältlich sind, sind als Succinimidylester (Katalog Titel #3061 und #3062) bereitgestellt, die leicht kovalent an das Glykogen, das durch Periodat-Oxidation gefolgt durch ein Koppeln von Ethylendiamin durch reduktive Aminierung modifiziert wurde, gebunden werden können. Das modifizierte Glykogen wird so eine Umhüllung von reaktiven primären Aminen für die nachfolgenden Umsetzung mit den Succinimidylestern tragen. Parosoanilin, Neu-Fuchsin und Succinimidylester sind zur Verwendung als auf pH-empfindliche Indikatoren bei der vorliegenden Erfindung geeignet.
Das Verfahren, den Indikator an den Träger zu koppeln, kann jedes geeignete Bindungsverfahren sein, das ausgewählt wird, um die speziellen reaktiven Stellen auf dem Träger und den Indikator anzupassen. Aufgrund von ihren speziellen Reaktivitäten ist es bevorzugt, dass das Indikatormolekül eine primäre Amingruppe, die leicht in das Polymergerüst des Trägers an der Stelle der vicinalen Hydroxide substituiert werden kann, umfasst. Es ist auch möglich, ein Indikatormolekül an einen Träger indirekt zu koppeln. Dies könnte beispielsweise durch kovalentes Binden eines biotinylierten primären Amins an den Träger und nachfolgendes Zusetzen eines fluoreszierenden Avidinderivats durchgeführt werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass direktes Koppeln weniger aufwendig ist, dass aber jegliche andere Markierungsverfahren leicht vorstellbar sein können, um das Koppeln eines Trägermoleküls und eines Indikatormoleküls zu erzielen.
Ein geeignetes Verfahren ist in 1 gezeigt. Der modifizierte Träger kann zur Substitution aktiviert werden, wobei zuerst das Polymer, das vicinale Hydroxide enthält, mit einer begrenzenden Behandlung mit Periodat, vorzugsweise in Form von Natriummetaperiodat (NaIO₄), um die C-C-Bindung zwischen den Kohlenstoffen, die die vicinalen Hydroxidgruppen tragen, zu brechen, behandelt wird. Wenn diese Bindung gebrochen ist, werden aminoreaktive Aldehyde gebildet. Die aminoreaktiven Aldehyde des Trägermoleküls werden dann über die Bildung einer Schiffschen Base an funktionelle primäre Amingruppen, die in dem Indikatormolekül vorliegen, gekoppelt. Die so gebildeten Schiffschen Basen werden mit Natriumcyanoborhydrid reduziert. Dieses reduktive Aminierungsverfahren wurden verwendet, um Proteine auf Polysaccharidträgern für andere Zwecke zu immobilisieren. Vergleiche beispielsweise Hermanson, G. T. et al. in Immobilized Affinity Ligand Techniques, 69–77, Academic Press (1992) und Dean, P. D. G. et al., Herausgeber, Affinity Chromotography: A practical approach, 44–48, IRL Press (1985). Die gleiche Chemie wurde auch verwendet, um die C-2 und C-3-Stellen der Glucosereste von Glykogen selektiv zu methylieren. Bahl, O. P. und F. J. Smith, 31 Org. Chem. 2915–2920 (1966).
Ein verwandtes Verfahren kann verwendet werden, um das auf pH-empfindliche Indikatormolekül an das Trägermolekül zu binden. Bei einem geeigneten Verfahren wird Glykogen für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur mit 0,1 M–0,2 M Natriummetaperiodat oxidiert, dann mit dem gleichen Volumen Isopropanol oder zwei Volumina Ethanol gefällt und danach in entionisiertem Wasser bis etwa 10 mg/ml resuspendiert. Die Indikatorlösung wird durch Hochskalieren des Verfahrens von Lillie, R. D. und Fullmer, H. M., Histopathic Technic and Practical Histochemistry, 4. Ausgabe, McGraw-Hill, NY (1976), das in Williams und Wilkens, Staining Procedures, 4. Ausgabe (1981) zitiert ist, hergestellt. Kurz gesagt wird 1 g Parosoanilin (Sigma) in 80 ml entionisiertem Wasser gelöst. Danach werden 2 g NaHSO₄ zugesetzt, gefolgt von 20 ml 1 N HCl. Die Mischung wird für 2 Stunden unter periodischem Mischen gemischt und inkubiert. Danach können 500 mg pulverisierte Kohle zugesetzt, für eine Minute geschüttelt und durch ein Whatman-Filterpapier filtriert werden. Aliquots von oxidiertem Glykogen werden mit verschiedenen Mengen Indikatorlösung kombiniert und dann für 10 bis 60 Minuten umgesetzt. Das entstandene Indikator-markierte Glykogen wird mit einem gleichen Volumen von Isopropanol gefällt, mit 70%-igem Ethanol gewaschen und getrocknet. Nach der Resuspendierung in Wasser wird die Verbindung auf Nachweisbarkeit bei der Fällung, Festigkeit des pelletierten Materials und pH-Empfindlichkeit getestet. Das mit Parosoanilin markierte Glykogen, das in dieser Weise hergestellt wurde, wurde erfolgreich bei den Nukleinsäurefällungsverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet und zeigte eine annehmbare Empfindlichkeit auf pH-Änderungen der Lösung. Man erwartet, dass Neu-Fuchsin (Sigma) auch gut bei diesem Ansatz funktioniert, da es ein Farbstoff ist, der strukturell mit Parosoanilin, das in histologischen Färbungsverfahren austauschbar verwendet wird, verwandt ist.
Andere Verfahren zum Binden der Moleküle an das Trägermolekül sind für den Fachmann verfügbar. Die Auswahl eines speziellen Verfahrens wird von den reaktiven Gruppen, die auf den Indikator- und Trägermolekülen vorhanden sind, abhängen.
Es ist wichtig, dass die Höhe der Trägeraktivierung und Indikatorkopplung sorgfältig ausgewählt wird, um die Löslichkeitseigenschaften des Ausgangsträgermoleküls zu erhalten. Bei der beispielhaften Ausführungsform in 1 ist beispielsweise der Glykogenträger an Tetramethylrhodamin, ein stark fluoreszierendes rosafarbenes Fluorophor, gekoppelt. Das Indikatormolekül ist in Form von Tetramethylrhodamin-Cadaverin, dessen Struktur in 1 gezeigt ist, bereitgestellt. Die erste wichtige Begrenzung dieses Verfahrens ist die verwendete Menge an Natriummetaperiodat, um das Ausgangsträgermolekül zu behandeln. Die Anmelder haben herausgefunden, dass die entstandene gekoppelte Verbindung sind geringe Fällung zeigt und nicht zusammen mit der Nukleinsäure ausfällt, wenn der Träger mit einer überschüssigen Menge Periodat (z. B. größer als 0,5 M für 30 min.) behandelt wird. Die verwendete Menge an Periodat hat eine direkte Wirkung auf die Menge des Indikatormoleküls, die an den Träger gekoppelt werden kann. Da es die Aufgabe des Periodats ist, eine C-C-Bindung im Zuckerring des Gerüsts zu brechen, ist die Menge an Bindungsbruch direkt proportional zur Anzahl von Stellen, die zur Konjugation verfügbar sind. Entsprechend kann eine einfache stöchiometrische Berechnung durchgeführt werden, sobald man den geeigneten Konjugationspegel bestimmt hat. Die Anmelder haben herausgefunden, dass eine geringe Fällung erfolgt, wenn mehr als 10% der Glucosereste durch das Periodat aktiviert werden. Die Anmelder haben ferner herausgefunden, dass eine Aktivierung von 10% oder weniger der Glucosereste geeignet ist. Die Aktivierung von und nachfolgendes Koppeln von 10% der Glucosereste ist ein bevorzugter Konjugationspegel, der ein Trägermolekül mit den erwünschten Fällungseigenschaften hervorbringt.
Die Dauer der Oxidationsreaktion ist für die Periodataktivierung des Trägers ebenso von Wichtigkeit. Bei Vorexperimenten unter Verwendung von Glykogen, in denen die Länge der Oxidationszeit von 30 min bis über Nacht variiert wurde, wurde beobachtet, dass bei langen Behandlungszeiten das Konjugat nicht vollständig ausfiel und weiche Pellets, die schwach an den Röhrchenwänden hafteten, gebildet wurden. Bei einer Reaktionszeit von 30 min erbrachte das markierte Konjugat etwa quantitative Fällung und feste Pellets. Diese Vorexperimente erbrachten ein stöchimetrisches Aktivierungsverhältnis von 1 Periodat pro 10 Glucoseeinheiten bei dem Glykogenträger. Es wird jedoch vermutet, dass die Aktivierungsreaktion nach 30 min nicht beendet ist, aber bei einer Inkubation über Nacht beendet ist. Somit könnten Reaktionszeiten von mehr als 30 min, jedoch weniger als über Nacht, ebenfalls geeignet sein.
Diese Werte wurde unter Verwenden von Glykogen als Träger und konjugiertem Tetramethylrhodamin als Indikator bestimmt. Es ist wahrscheinlich, dass Veränderungen der Fällungseigenschaften beobachtet werden können, wenn andere Moleküle angewendet werden. Deshalb sollte die Konjugationsstrategie, die hier beschrieben wird, als Richtlinie erachtet werden und einfache Experimente werden empfohlen, um das geeignete Ausmaß der Konjugation für einen speziellen Träger mit einem speziellen Indikator zu bestimmen. Es wird vermutet, dass für Polysaccharidträger-Ausgangsmoleküle die Kettenlänge und das Ausmaß der Vernetzung auch die Fällungseigenschaften der entstandenen modifizierten Träger beeinflussen können.
Es ist auch möglich, dass andere Verfahren verwendet werden können, um ein Fluorophor an Glykogen zu koppeln. Es wäre möglich, eine begrenzte Anzahl von verfügbaren Hydroxylen auf dem Glykogen zu einer nicht-endogenen funktionellen Gruppe (beispielsweise ein primäres Amin, Sulfhydryl oder Carbonsäure) umzuwandeln und dann das konvertierte Glykogen mit einem geeigneten aktivierten Fluorophor, das spezifisch mit der zugesetzten funktionellen Gruppe reagiert, umzusetzen. Zahlreiche Fluorophor-markierte Moleküle, die zu solcher spezifischen Reaktivität fähig sind, sind im Handel erhältlich, beispielsweise, bei Molecular Probes, Inc. Diese Reagenzien umfassen markierte Isothiocyanate, Maleimide, Halogenacetyle, Brommethyle, Acryloyle, Succinimidylester und Sulfonylchloride. Verfahren zum Umwandeln von Hydroxylgruppen in Sulfhydrylgruppen und zum Umwandeln von Sulfhydrylgruppen in primäre Amine werden in Wong, S. S. Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, Boca Raton, Florida 21–25 (1993) beschrieben.
Es ist auch möglich, Glykogen unter Verwenden von Cyanogenbromid wie in Wong, siehe oben, beschrieben, durch Bilden eines zyklischen reaktiven Imidocarbonats aus den vicinalen Hydroxylen zu aktivieren. Dieses Produkt lagert sich um, um N-substituiertes Carbamat als Endprodukt zu bilden.
Es ist bekannt, dass Polysaccharide einschließlich Glykogen aufgrund ihrer Beschaffenheit in der Struktur abhängig von ihren Herstellungsverfahren variieren können. Die Anmelder haben bestimmt, dass, wenn die Ausgangsträgermoleküle oder die konjugierten Moleküle übermäßig oder heftig während der Herstellung behandelt werden, ihre Fällungseigenschaften variieren können und nicht annehmbar werden können. Deshalb wird empfohlen, wenn Glykogen als ein Träger verwendet wird, dass es Typ III Glykogen ist, welches bei Sigma Chemical Co. käuflich erhältlich ist. Von Glykogen Typ III wurde hier gezeigt, dass es geeignet ist. Andere Glykogen-Präparate können ebenfalls geeignet sein. Ebenso ist es beim Resuspensieren von gefälltem konjugierten Molekül wichtig, dass es vorsichtig behandelt wird, um die Löslichkeit und die Fällungseigenschaften für die nachfolgenden Behandlungsschritte zu erhalten. Somit sollten keine Vortex- oder Dounce-Homogenisierungsschritte verwendet werden. Die Erfinder haben herausgefunden, dass es vorteilhaft ist, dass der Träger nicht konjugiert wird, um Scherkräfte zu vermeiden. Es werden jedoch so kleine Mengen des konjugierten Trägers bei den Nukleinsäurefällungsverfahren verwendet, dass kurze Vortexing-Schritte tolerierbar sind. Falls gewünscht, kann ein gefälltes Pellet vorsichtig von der Wand des Probenröhrchens abgebrochen werden und dann über Nacht bei 4°C geschwenkt werden, um das Pellet zu resuspendieren. Dieses Verfahren ist besonders empfohlen, wenn die Nukleinsäureprobe mehreren Fällungsschritten unterworfen werden wird.
Die Verwendung eines modifizierten Trägers des hier beschriebenen Typs bei einem Nukleinsäurefällungsverfahren stellt die Fähigkeit bereit, den Ort der gefällten Nukleinsäuren wegen des gut sichtbaren Trägers zu beobachten. Diese Verbesserung gegenüber den vorhandenen Fällungsverfahren kann die möglichen Verluste von gefällten Nukleinsäuren stark verringern oder verhindern und somit die Erfindung als allgemeines spezielles molekularbiologisches Hilfsmittel besonders nützlich und wertvoll machen.
Beispiel 1
Herstellung von fluoreszierend-markiertem Glykogen
1 Gramm Glykogen wurde genau eingewogen und zu 40 ml sterilem Wasser in einem sterilen konischen 50 ml-Röhrchen zugegeben. Das Röhrchen wurde auf einer Schüttelplatte angeordnet und vorsichtig geschüttelt, bis das Glykogen vollständig resuspendiert war. Natriummetaperiodat (114 mg) wurde zu der Glykogen-Suspension zugegeben. Um einen vollständigen Transfer zu erreichen, wurde das Wägeschiffchen, auf dem das Periodat gemessen wurde, mehrere Male mit der Glykogenlösung, die dann zu dem konischen Röhrchen zurückgegeben wurde, gewaschen. Die Periodat-Glykogenmischung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Mischung wurde gleichmäßig in zwei 50 ml-Röhrchen geteilt. Absoluter Ethanol (35 ml) wurde zu jedem Röhrchen zugegeben. Die Röhrchen wurden zum Mischen mehrere Male umgedreht. Beim Mischen bildete sich ein weißes Präzipitat.
Die Röhrchen wurden für 5 Minuten bei 3000 xg zentrifugiert, um das weiße Präzipitat zu pelletieren. Jedes Pellet wurde in 20 ml sterilem Milli-Q-Wasser resuspendiert. Die Resuspendierung wurde ohne Vortexen oder Zerreiben des pelletierten Materials durchgeführt. Das Röhrchen wurde auf einer Schüttelplatte angeordnet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Inhalte der beiden Röhrchen wurden zusammengeschüttet und 5 ml 1 × PBS, pH 7,4 wurden zugesetzt. Eine Tetramethylrhodamin-Stammlösung wurde durch Auflösen von 10 mg Tetramethylrhodamin-cadaverin in 1 ml Ethanol (in einem braunen Fläschchen) unter Vortexen hergestellt. 300 μl der Tetramethylrhodamin-cadaverin-Stammlösung wurde zu der oxidierten Glykogenlösung zugegeben und durch mehrmaliges Umdrehen gemischt. Natriumcyanoborhydrid (5 ml 1 M Lösung in sterilem Milli-Q-Wasser) wurde zu der Mischung von Tetramethylrhodamin und oxidiertem Glykogen zugegeben und zum Mischen mehrfach umgedreht. Das Röhrchen wurde auf einer Schüttelplatte angeordnet und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Reaktion wurde dann auf zwei konische 50 ml-Röhrchen aufgeteilt und 1/10 Volumen 3 M Ammoniumacetat-Lösung, pH 5,2 zu jedem Röhrchen zugegeben. Isopropanol (0,6 Volumina) wurde dann zugegeben und durch Umdrehen gemischt. Ein wolkiges rosafarbenes Präzipitat erschien. Die Röhrchen wurden dann für 5 Minuten bei 3000 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Ein festes, leuchtend rosafarbenes Pellet und ein klarer rosafarbener Überstand wurden beobachtet. Der Überstand wurde abdekantiert und das Pellet mehrere Male mit 70 %-igem Ethanol gewaschen und für 5 Minuten mit 3000 xg bei Raumtemperatur zentrifugiert, um das konjugierte Material wieder zu pelletieren. Das Pellet wurde mit 100 %-igem Ethanol mehrere Male gewaschen, um überschüssiges Wasser zu entfernen und wie nötig zentrifugiert, um das pelletierte Material zurückzuhalten. Der Endüberstand wurde dekantiert und das Röhrchen auf einem sauberen Papiertuch umgedreht und für 5–10 Minuten ein Ablaufen ermöglicht. Das zurückgebliebene Pellet haftete fest an das Röhrchen.
Das Röhrchen wurde locker zugedeckt und in einer Speed-vac mit entferntem Rotor platziert. Ein Vakuum wurde vorsichtig gezogen und über eine Stunde gehalten. Das Pellet löste sich von der Wand des Röhrchens ab, und das Röhrchen wurde mit Vorsicht aus der Speed-vac entfernt. Die Masse des fluoreszierenden Glykogenkonjugats wurde aufgenommen. In mehreren Experimenten wies die Masse typischerweise 50–70% der ursprünglichen Glykogenmasse auf. Das Konjugat wurde wieder auf eine Konzentration von 10 mg/ml in DEPC-behandeltem Milli-Q-Wasser resuspendiert. Diese Resuspendierung wurde ohne Vortexen über mehrere Stunden auf einer Schüttelplatte vorgenommen. Das Konjugat wurde in Folie eingewickelt bei –20°C sicher aufbewahrt.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen beschränkt, sondern umfasst ziemlich alle Modifikationen und Veränderungen die innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche fallen.

Claims

Verfahren zur Fällung von ungefällter Nukleinsäure aus einer wässrigen Lösung, umfassend die folgende Stufe: Versetzen der Lösung mit einem polymeren Trägermolekül, das an ein Indikatormolekül gekuppelt ist, wobei das Indikatormolekül entweder direkt oder durch Anregung mit einfallendem Licht einer geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden kann, wobei die Lösung eine Menge eines Salzes und eine Menge eines Alkohols umfasst, die ausreichen, die Fällung der Nukleinsäure aus der Lösung zu bewirken, und wobei es sich beim polymeren Trägermolekül um Glykogen oder ein Polymeres mit primären Aminogruppen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Trägermolekül kovalent an das Indikatormolekül gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das an ein Indikatormolekül gekuppelte Trägermolekül durch Oxidation eines Paars von vicinalen OH-Gruppen und anschließende Kupplung der oxidierten vicinalen OH-Gruppen an das Indikatormolekül hergestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich beim Trägermolekül um ein Glykogenmolekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich beim Glykogen um Glykogen vom Typ III handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich beim Indikatormolekül um einen Farbstoff oder um ein Fluorophor handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Indikatormolekül eine primäre Aminogruppe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Indikatormolekül ausgewählt ist unter 5-(Aminoacetamido)-fluorescein (Fluoresceinylglycinamid), 4'-((Aminoacetamido)-methyl)-fluorescein, 5-Aminoeosin, N-(2-Aminoethyl)-4-amino-3,6-disulfo-1,8-naphthalimid-dikaliumsalz, 5-((2-Aminoethyl)-amino-napahthalin-1-sulfonsäure-natriumsalz, 5-((2-Aminoethyl)-thioureidyl)-fluorescein, 4'-(Aminomethyl)-fluorescein-hydrochlorid, 5-(Aminomethyl)-fluorescein-hydrochlorid, 7-Amino-4-methylcumarin, 1-Aminomethylpyren-hydrochlorid, 8-Aminonaphthalin-1,3,6-trisulfonsäure-dinatriumsalz (ANTS), 5-(und-6)-((N-(5-Aminopentyl)-amino)-carbonyl)-tetramethylrhodamin (Tetramethylrhodamin-cadaverin), 5-((5-Aminopentyl)-thioureidyl)-eosin-hydrochlorid (Eosin-cadaverin), 5-((5-Aminopentyl)-thioureidyl)-fluorescein (Fluorescein-cadaverin), 6-Aminochinolin, 5-(((2-(Carbohydrazino)-methyl)-thio)-acetyl)-aminofluorescein, Cascadeblau-cadaverin-trinatriumsalz, Cascadeblau-ethylendiamin-trinatriumsalz, Cascadeblau-hydrazid-trikaliumsalz und Cascadeblau-hydrazid-trinatriumsalz.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich beim Indikatormolekül um 5-(und-6)-((N-(5-Aminopentyl)-amino)-carbonyl)-tetramethylrhodamin (Tetramethylrhodamin-cadaverin) handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei es sich beim Indikatormolekül um ein pH-sensitives Indikatormolekül handelt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das pH-sensitive Indikatormolekül unter Pararosanilin, Neufuchsin und Succinimidylestern ausgewählt ist.
Zusammensetzung umfassend: ein Glykogenmolekül, das zur gemeinsamen Fällung mit einem Nukleinsäuremolekül aus einer wässrigen Lösung befähigt ist, wobei die wässrige Lösung eine Menge eines Salzes und eine Menge eines Alkohols umfasst, die ausreichen, die Fällung der Nukleinsäure aus der Lösung zu bewirken; und ein an das Glykogenmolekül gekuppeltes Indikatormolekül, wobei das Indikatormolekül entweder direkt oder durch Anregung mit einfallendem Licht einer geeigneten Wellenlänge sichtbar gemacht werden kann.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei es sich beim Glykogenmolekül um ein Glykogenmolekül vom Typ III handelt.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei es sich beim Indikatormolekül um ein Molekül gemäß der Definition in einem der Ansprüche 6 bis 11 handelt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 12 bis 14, ferner umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wobei das Nukleinsäuremolekül und das Glykogenmolekül in einer wässrigen Umgebung bereitgestellt werden.