DE2239936C2

DE2239936C2 - Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Peptidase-Enzymkonzentrationen in Homogenaten unter Verwendung von 4-Methoxy-2-naphthylamiden

Info

Publication number: DE2239936C2
Application number: DE19722239936
Authority: DE
Inventors: Robert Eugene Greenwood Ind. Smith
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-08-16
Filing date: 1972-08-14
Publication date: 1983-02-10
Also published as: SU515471A3; SE401738B; CH569281A5; CA1007555A; FR2150146A5; GB1404195A; JPS5533475A; JPS4829497A; JPS5621400B2; DE2239936A1

Description

R —N

ii

20

— CHj

in der R ein Rest 1st, der mindestens eine amidarlig gebundene Aminosäuregruppe enthält.

2. Verfahren nach Anspruch i, dadurch geksnnzeichnet, daß man als Substrat Carbobenzoxydiglycyl-l-2rgliiyi-4-methoxy-2-naphthylamid verwendct.

jo

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung J5 von Pepiidase-Enzymkonzentraiionen in Homogenaten unter Verwendung von 4-Methoxy-2-naphthylanildcn, besonders Carbobe.izoxydiglycyl-l-arginyM-mcthoxy^- naphthylamid.

Eines der am häufigsten ungewandten Prinzipien zum Nachweis des Vorhandenseins hydrolytischer Enzyme in Gewebeteilen und Homogenaten umfaßt die beiden folgenden Rcaktionsstulcn:
, .. . Enzym „ , ,

Ϊ T „,' ^K«PP'""^komponenle

+ andere Produkte
2. Kupplungskomponente

+ larbstorrb.ldendcs Mittel . Farbsioll.

Die Kupplungskomponenten sind arnmatischc Hydroxyverbindungen oder Amide üblicherweise der w Naphthalinrcihe. Die farbstoffbildenden Mittel sind typischerweise Diazoniumsalze oder andere Verbindungen. die auf ähnliche Weise unter Bildung eines Farbstoffs mit der Kupplungskomponente reagieren.

Die bei Verwendung von Diazoniumsalzen entstehenden Farbstoffe sind Azofarbstoffe. Eine der Kupplungskomponentcn. die zur hlslochemischen Lokalisierung von Enzymen verwendet wird. Ist 4-Mctho.xy-2-naphthylamln. das zuerst von Rosenblatt. Nachlas und Seligman hergestellt wurde (Synthesis of m-Mcthoxynaphthylamlnes ns Precursors for Chrnmngenlc SuhsiraiQs, Jmir \m Chem.Soc. SO. 246.1. J_u|| |')58l. Es wurde /iivTsi hisuii-homisch /ur Lokalisierung von F.n/ymen \jr«jndjt. an die nur jin Amiiiosiiurerest. i-.iinllch ; (iliii.ini>l ii^hiinden «.ir (Λ RuU'nhiiri: et al.. Histoche- ^h> mk'.i! .huI ι !irastructur.il Demonslratiiin of ;-(iliitann' I r.uisp-jptnia^ \c!i\ ity. Jnu^r Hlstofheniislrv aiul C > In-Ju-mistr·. Γ. 5Π. |%<>>

Carbobenzoxydiglycyl-l-arginylO-naphihylaminhydrochlorid wurde von Plapinger et al hergestellt /ur Untersuchung des Enzyms Trypsin (Synthesis of Chromagenic Arginine Derivatives as Substrates for Trypsin, Jour, of Organic Chem. 30, 1781, Juni l%5). Carbobenzoxydiglycyl-l-arginyl-i-naphthylamid wurde von Nachlas, Plapinger und Seligman als Trypsinsubstrat verwendet. Wahrend diese Verbindung günstig ist, da sie die I niersuchung von irypsinanigen Enzymen erleichtert, bedeulet ihre langsame Kupplungsgeschwindigkeil mit bestimmten Diazoniumsalzen und das Fehlen einer siarken Färbung der gekuppelten Verbindung eine Unannehmlichkeii und einen unerwünschten Nachteil.

Es wurde festgestellt, daß die Kupplungsgesehwindigkeil von 4-Methoxy-2-naphthylamin mit bestimmten Diazoniumsalzen wesentlich schneller ist als diejenige von 2-Naphihylamin. Die bekannten Verfahren zur Bestimmung von Enzymkonzentrationen t-iruhten auf der Anwendung von Aminosüurederivalen von 2-Naphihylamin. (Role of Some Structural Features of Substrates on Trypsin Activity, s. o.). Die Verwendung der 2-Naphihyiaffiin-Kuppiungskornponcntc stellt ein ungünstig langsames und verhältnismäßig unempfindliches Verfahren zur Bestimmung von Enzymkonzentrationen dar.

Es wurden bisher keine Aminosäurederivate von 4-Methoxy-2-naphthylamin zur Bestimmung der Konzentralion von Enzymen In Homogenaten angewandt. Derartige Derivate wurden bisher vielmehr ausschließlich zur histochemischen Lokalisierung von Enzymen angewandt, d. h. sie ermöglichen es dem Beschauer z. B. in einer Gewebeprobc den Bereich der Enzymaktivität zu erkennen (M. Nachlas et al.. Improvement in the Histochemical Localization of Leucine Aminopeptidase with a New Substrate, L-LeucyM-Methoxy^-Naphthylamide, Blophysic. and Blochcm. Cytol. 7, 261, I960).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Peptldase-Enzymkonzentratiorsen in Homogenaten unter Verwendung von 4-Methoxy-2-naphthylamidcn besonders Carbobenzoxydiglycyl-I-arginyM-methoxy^- naphthylamid. Da es möglich Ist. daß ein bestimmtes Enzym nur eine bestimmte Aminosäuresequenz schnell und bei einem vorgegebenen pM-Werl hydrolysiert, kann eine verschiedene Anzahl und Reihenfolge von Aminosauren an das 4-Methoxy-2-naphthylamin gebunden sein, _um _mt _{Bcstimm eincr Vle}|_ah| von Enzymen geelg-

Die Mcthoxygruppe ist für die Analyse von Enzvmen _|n „_{omogenalcn aufgrund lhrer} beschleunigenden Wirkung auf die Kupplung von 4-Methoxy-2-naphthylamin mit bestimmten Dl??oniumsalzen ur.'l der Intensiveren Farbe des gebildeten Farbstoffs wichtig. Es wird auch angenommen, daß die Mcthoxygruppe zu einer Erhöhung der Hydrilysegeschwindlgkelt des Substrats führt. Daher sind die mcthoxyllerisn Verbindungen sowohl empfindlicher als auch schneller wirkend, wenn sie zur Messung der Konzentration von Enzymen in llomogcnaten angewandt werden.

Die Erfindung betrifft besonders die Verwendung eines neuen Amlnosäurcderivais der Formel

n/-—gl_\ --μΙ>

O ■ ■- CIi-,

wobei CBZ-gly-gly-nrg Carbobenzoxydiglyeyl-l-arginyl bedeutet. Die Tatsache, dall dieses Molekül mindestens 3 Aminosäuregruppen besiut ist günstig, da das Substrat dadurch sehr spezifisch for ein spezielles Enzym wird. Die Untersuchung einer grölten Vielzahl von Enzymen kann erreich: werden durch Variation der Anzahl und Sequenz der Aminosäuren, die an das Molekül gebunden sind sowie durch Variation des pH-Wertes und der Menge von Aktivaioren oder Inhibitoren. Allgemein kann gesagt werden, je mehr Aminosäuren an das methoxylierie Naphthyl gebunden sind, um so spezifischer ist das Substrat gegenüber einem speziellen Enzym. Die Methoxygruppe führt zu einer schnellen Kupplung von 4-Methoxy-2-naphthylamln mit bestimmten Diazoniumsalzen sowie zu einer intensiven Farbe und schnelleren Hydrolyse.

Das in dem oben erwähnten Aufsatz von Rosenblatt. Nachlas und Seligman angegebene Verfahren zur Herstellung von 4-Methoxy-2-naphihvlamin zusammen mit dem in dem Aufsatz von Plapinger et al. angegebenen Verfahren zur Herstellung von Amlnosüurederivaten von 2-Naphthylamln Ist das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von CBZ-gly-gly-arg oder verschiedenen anderen Aminosäurederivaten von 4-Methoxy-2-naphthylamin.

Diese spezielle Verbindung Ist geeignet zur Bestimmung von Konzentrationen von Trypsin und trypsinartigen Verbindungen, für die die Arbeitsweise später näher besch.leben wird.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Pepiidase-Enzymkonzentrationen in Homogenaten. Eine derartige Bestir-nung wird durchgeführt durch Verwendung eines 4-Melhoxy-2-naph^>hyhminderivats der Formel

R-N

0-CH₃

In der R mindestens 1 Aminosäure enthält als Substrat. Eine große Anzahl nichtmethoxylierter Verbindungen dieser Art wurde zur Bestimmung von Enzymkonzentrationen bereits verwendet und es hat sich gezeigt. dalJ durch Hinzufügung des Methoxyrestes diese bekannten Verbindungen wesentlich günstigere Eigenschaften zur Bestimmung von Enzymkonzentrationen In Homogenaten wie Serum oder Gewebeextrakten besitzen.

Zu der methoxyllerten Verbindung wird vorzugsweise ein Puffer zugesetzt, um sicherzustellen, daß der pH-Wert bei oder nahe bei dem optimalen Wert für das Interesslerende Enzym liegt. Wenn notwendig kann zur Erleichterung der Lösung der Verbindung Propylenglykol zugegeben werden. Dieses Gemisch wird mit dem das Interesslerende Enzym enthaltenden Homogenat vermischt und stehengelassen, damit das Enzym die Verbindung hydrolysleren kann. Nachdem die Hydrolyse eine Zeitlang stattgefunden hat. wird eine denaturierende Verbindung wlo Salzsäure oder Trlchloresslgsäure zuzugehen, um die Hydrolyse abzubrechen. Nach der Hntlernung eines etwaigen Niederschlages wird ein farbstoflhll- h'> elendes Mittel zugegeben, wobei sich mit dem durch die enzymatschc Hydrolyse des Substrats gebildeten 4-Melhoxy-J-naphlhylamln ein Farbstoff bildet.

Typische farbstoffbilclende Mittel sind letrazotiertes

Ui-o-anisidin (Echtblau BBN), diazotiertes 4-o-Tolyazoo-toluidin (Echtrubin GBO, diazotiertes 4-Amino-2, 5-diäthoxybenzanilid (Echtblau BBN) und hexazotienes Pararosanilin.

Nach Bildung des Farbstoffs wird die Konzentration dieses Farbstoffs photometrisch bestimmt, indem man Licht einer bestimmten Intensität durch das farbstoffhaltige Gemisch leitet und die Intensität des Lichtes nach dem Durchgang durch das Gemisch mißt. Die Enzymkonzentration wird bestimmt durch Vergleich mit einer Standardkurve, die erhallen worden ist durch ähnliche Versuche bei bekannten Enzymkonzentrationen.

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher is erläutert.

A) Das Inkubalionsgemisch wurde hergestellt durch Zugabe von 1,j cm' eines Substrat-Puffers der unten angegebenen Art und 0,3 cm' einer Gewebezubereitung oder von Serum zu 1,2 cm' einer 0,85 π Salzlösung in einem Reagenzglas.

B) Die Reagenzgläser wurden mit einer Kappe verschlossen und 2 h bei 37° C im Wasserbad Inkubiert.

C) Nach der Inkubation wurden die Kappen entfernt und die Enzymreaktion durch Zugabe von 0,5 cm¹ einer 10%igen Trichloresslgsäurelösung abgebrochen und der Niederschlag abzentrifugiert.

D) 1,0 cm¹ einer wäßrigei Lösung von I mg/cm¹ Echtblau B wurde zu jedem Reagenzglas zugegeben.

E) Die Reagenzgläser wurden dann 15 bis 30 see lang vibriert und nach 5 min die Absorption von Licht mit einer Wellenlänge von 520 nm spektrophotometrlsch gemessen und mit einer Blindprobe verglichen. Die Menge an freigesetztem 4-Methoxy-2-naphthylamin wurde anhand einer Stanuardkurve abgelesen, die vorher von 4-Methoxy-2-naphthylainin in Gegenwart von Serum oder Gewebezubcreitungcn erhallen worden war.

Für das ober angegebene Verfahren können die oben angegebenen Substrat-Puffer verwendet werden.

1. LeucyM-methoxy^-naphthylamid wurde verwendet zur Bestimmung der Aminopeptidaseaktlvitäi. Dazu wurden 32,3 mg der angegebenen Verbindung 50 cm' Wasser zugegeben und mit einem gleichen Volumen von 0,2 m Phosphat-Puffer, pH 7,0. zusammengegeben, wobei eine Substrat-Pufferlösung entstand.

2. Lysyl-alanyl-4-methoxy-2-naphthylamid wurde verwendet zur Bestimmung von Dipept: iylamlnopeptidasen II (gefunden in den Lysosomen uer Schilddrüsenzellen). 43,4 mg dieser Verbindung wurden zu 50 cm' Wasser gegeben und mit einem gleichen Volumen einer 0.2 m Natriumcacodylat-Pufferlösung, pH 5,8 zusammengegeben, wobei die Substrat-Pufferlösung entstand.

3. Prolyl-arglnyl^-methoxy^-naphlhylamld wurde zur Bestimmung von Dipeptidylaminopeptidase-I-Aktivität (Cathepsln C) verwendet. 52,0 mg dieser Verbindung wurden zu 50 cm' Wasser gegeben und einer 0,2 m Natrlumcacordylat-Puffcrlösung, pH 5.5. enthaltend 0.5 cm 1,0 m Mereapto-äthylamin-HCI zusammengcgeben. wobei die Substrat-Pufferlösung entstand.

4. Cilycyl-prolyl-4-methoxy-2-naphth>lamid wurde '■erwendet zur Bestimmung von Dipeptidylamlnopeptidasc-IV-.'\ktlviiät. 43.0mg dieser Verbindung wurden zu 50 cm' Wasser gegeben und mit einem glei-

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chen Volmiv.it von Π,Ι πι 2-Amino-2-(nydroxymeihyI)-l,3-propundioI-IICI-Pufrer zusanimengegeben, wobei die Substrat-Pufferlösung entstand.

5. Arginyl-arginyM-methoxy-2-naphthylamid wurde verwendet zur Bestimmung von Dipeptidylaminopeptidase-IIl-Akiivitai. 59,5 mg dieser Verbindung wur'len zu 50 cm¹ zugegeben und mit einem gleichen Volumen 0,2 m 2-Amino-2-<hydroxymethyl)-1,3-propandiol-HCI, pH 9,5, vermischt, wobei die Substrat-Pufferlösung entstand.

6. Carbobenzoxydiglycyl-l-arginyM-methoxy^-naphthylamid wurde verwendet zur Bestimmung von Trypsin und irypsinartigen Enzymen aus dem Acrosom des Spermas. Zur Bestimmung der Cathepsin-B'-Konzentration »vurde eine Menge dieses Amids zu 50 cm¹ Wasser gegeben unter Bildung einer 2,0 m Mol-Lösung und di-jse wurde mit einem gleichen

Volumen einer 2,0 m Mol-Lösung von Nairiumcacodylal-Puffcr. pH 4,8, enthaltend 2-Mercapioflthanol unter Bildung einer Substrat-Pufferlösung zusammengegeben. Durch Änderung des pH-Werts dieser Lösung auf 6,7 kann sie zur Bestimmung der Konzentration eines trypsinartigen f.nzyms in den SekretionsdrOsen der Zellen verwendet werden.
Zur Bestimmung der Trypsin-Konzeniration wurde eine Menge dieses Amids zu 50 cm' Wasser gegeben, wobei ein 2,0 m Mol-Lösung entstand, die mit einem gleichen Volumen einer 0,2 m 2-Amino-2-(hydroxymethy!)-l,3-propandioI-Lösung, pH 7, unter Bildung der Substrat-Pufferlösung zusummengegeben wurde. Propylenglykol kann zusammen mit den 50 cm¹ Wasser verwendet werden, um die Lösung des Amids zu erleichtern.

Claims

Paieniansprüebe:

1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Peptitlase-Enzymkonzentrationen in llomogenaten durch Zugabe eines Substrats, Einwirkenlassen des Enzyms auf das Substrat, anschließende Zugabe eines farbstoffbildenden Mittels, Durchfeilen von Licht einer bestimmten Intensität durch das Gemisch und Vergleichen der Intensität des austretenden Lichts mit in einer Siandardkurve, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat ein 4-Methoxy-2-naphthylamid der Formel