DE3327873A1 - Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von enzymen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung der aktivitaet von enzymen

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    • G01N2333/976—Trypsin; Chymotrypsin

Description

PROF. DR. DR. J. REITSTÖTTER DR. WERNER KINZEBACH DR. ING. WOLFRAM BUNTE
T8TÖTTER. KINZCBACH » PARTNER ITFACH 7βΟ. D-BOOQ MÜNCHEN 43
PATENTANWÄLTE ZUGELASSENE VERTRETER BEIM EUROPÄISCHEN PATENTAMT EUROPEAN PATENT ATTORNEYS
^fRCFF:
telefon: (oea) 2 71 es es TELEX: OS2182OS ISAR O 8AUCnSTRA»8e 22. D-800O MÜNCHEN
München, 2. August 1983
UNKRI AKTI1 M/24 OUR
Torii & Co., Ltd.
3, Nih.onbashi-Honcho-S-chome
Huo-ku
Tokyo / Japan
Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen
POSTANSCHRIFT: OBOOO MÜNCHEN A3. POSTFACH 78Ο
M/24 172 ;K
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, Enzyminhibitoren, Enzymaktivatoren oder Zymogenen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Enzym mit einem Substrat der allgemeinen Formel I
R, - 0 —f || H-R9 (I)
worin R1 eine Aminosäure oder ein Oligopeptid, welche über ihre C-terminale Carboxylgruppe in Form eines Esters gebunden sind, und R2
ein Wasserstoff- oder Bromatom bedeuten, reagieren läßt, wobei das Substrat hydrolysiert wird, anschließen« das Hydrolyseprodukt der allgemeinen Formel
worin Rp die oben angegebenen Be-
deutungen besitzt, mit FR-ITR-SaIz [Fast Red-ITR-Salz (N,N!-Diethyl-4-methoxymetanilamid-diazoniumsalz)] unter Bildung eines Farbstoffs reagieren läßt und das Farbstoff bestimmt.
Bei den oben erwähnten Enzymen handelt es sich um Enzyme, die die Verbindungen der Formel (i) zu hydrolysieren vermögen. Zu derartigen Enzymen zählen Serinproteasen, wie Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Thrombin, Urokinase, Faktor Xa, CI-S und C1r, weitere Proteasen und Esterasen sowie unbekannte Enzyme, die in der Lage sind, die Verbindungen der
M/24 172 *"
. 6·
Formel (I) zu hydrolysieren. Ein Beispiel für die Bestimmung unbekannter Enzyme anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die elektrophoretische Bestimmung der Enzymverteilung im Blut oder Urin und die Zellfärbung.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist brauchbar für die Bestimmung der Serinprotease E.C.
3.4.21 neben weiteren Enzymen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für die Bestimmung von Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Thrombin, Urokinase, Faktor Xa, CIs" und C1r geeignet. Es.ist auch möglich, das erfindungsgemäße Verfahren für die Bestimmung von Inhibitoren, Aktivatoren und Zymogenen der oben erwähnten Enzyme, wie beispielsweise Antithrombin III, Heparin, o^-Plasmin-Inhibitor, a^-
20 Trypsin-Inhibitor, Streptokinase, Echis carinatus venom (ECV), Prekallikrein, Plasminogen und Prothrombin, zu verwenden.
In der Formel (I) bedeutet R1 eine Aminosäure oder 25 ein Oligopeptid, welche über ihre C-terminale
Carboxylgruppe an das Sauerstoffatom, gebunden sind und auf diese Weise einen Ester bilden. Der Ausdruck »Aminosäure oder Oligopeptid" bedeutet eine Aminosäure oder ein Oligopeptid mit 2 bis 4 Aminosäuren, die gleich oder verschieden sein können, wobei der N-Terrainus frei ist oder eine Acyl- oder Sulfonylgruppe aufweist. Beispiele für Aminosäuren sind die L-, D- und DL-Formen von GIy, Ala, VaI, Leu, He, Met, Pro, Phe, Gin, GIu, pyroGlu, Lys, Lys(Me), Arg und Tyr.
M/24-172 ^r
Beispiele geeigneter Substrate der Formel (I) sind diejenigen, in denen R^ für A-R,-R^-FU-Rg-CO- steht, wobei A ein Wasserstoffatom oder eine Acyl- oder Sulfonylgruppe bedeutet, R, bis Rc jeweils GIy, AIa, VaI, Leu, He, Pro, Phe, Gin, GIu, pyroGlu oder eine Einfachbindung bedeuten und Rg für Lys, Lys(Me), Arg, Met oder Tyr steht. Vorzugsweise.steht A für ein Wasserstoffatom, Ac, Bz, Tos, Boc, Cbz, Dansyl oder GIt. Bevorzugte Substrate sind diejenigen, in denen R* für A-Tyr-, A-Arg-, A-Lys-, A-Gly-Lys-, A-Phe-Arg-, A-GIy-GIy-Arg-, A-Leu-GIy-Arg-, A-Gln-Gly-Arg-, A-pyroGlu-Gly-Arg-, A-Leu-Ala-Arg-, A-Pro-Phe-Arg-, A-Val-Leu-Lys-, A-Phe-VaI-Arg- oder A-Ile-Glu-Gly-Arg- steht. Die bevorzugtesten Substrate der Formel (I) sind Tos-Lys-a-NE, Ac-Tyr-a-NE, Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE, Ac-Phe-Arg-a-NE, H-Pro-Phe-
20 Arg-a-NE und Ac-Gly-Lys-a-NE.
In der Formel (I) bedeutet R2 ein Wasserstoff- oder Bromatom. Beispielsweise kann es sich um Bromderivate handeln, in denen das Bromatom in 6-Stellung steht. 25
Bei den Verbindungen der Formel (i) handelt es sich also um Verbindungen, in denen der C-Terminus der oben erwähnten Aminosäuren oder Oligopeptide mit den Verbindungen der Formel
einen Ester bildet.
Μ/24 172 kT
Obwohl für die Reaktion zwischen dem Enzym und dem Substrat die Zeit und die Temperatur dieser Reaktion von der Reaktivität und den Mengen beider Reaktanten abhängen, beträgt die Reaktionszeit im allgemeinen 2 Stunden oder weniger, vorzugsweise 30 Sekunden bis 90 Minuten. Die Reaktionstemperatür liegt im allgemeinen bei 20 bis 400C, vorzugsweise bei 20 bis 370C Das FR-ITR-SaIz [Fast Red-ITR-Salz (N,N'-Diethyl-4-methoxymetanilamid-diazoniumsalz)] hat die Formel
worin X ein Halogenatom bedeutet, und liegt vorzugsweise in Form des Additionsproduktes mit 1/2 ZnCl2 vor.
Das Pigment, das durch die Reaktion des FR-ITR-Salzo3· 25
mit einer Verbindung der Formel H
welche durch die Hydrolyse des Substrats [Formel (I)] mittels eines Enzyms gebildet wird, entsteht, ist ein Azofarbstoff. Die Reaktionszeit für diese Farbreaktion beträgt 2 Stunden oder weniger, vorzugsweise 30 Sekunden bis 90 Minuten. Die Reaktion zwischen einem Substrat und einem Enzym und die Farbreaktion unter Verwendung des FR-ITR-Salzes können nachein-
M/24 172 if
ander oder gleichzeitig durchgeführt werden. Die gebildete Pigmentmenge wird spektroskopisch unter Verwendung eines Colorimeters oder Spektrophotometers oder visuell bestimmt. Die der spektroskopischen Bestimmung zugrundeliegende Wellenlänge beträgt in den meisten Fällen 450 bis 550 mn. Die visuelle Methode erfolgt anhand eines Vergleichs mit einem Standard und wird bei der elektrophoretischen Bestimmung von Enzymverteilungen oder bei der Zellfärbung verwendet.
Die Bestimmung der Enzymaktivität ist für die Qualitätskontrolle von Enzympräparaten, bei klinischen Untersuchungen und bei der Diagnose verschiedener Krankheiten, die auf der Untersuchung des Enzymgehalts von Blut oder Urin beruht, von Bedeutung.
20 Es sind verschiedene Verfahren für die Bestimmung
der Enzymaktivität bekannt. Am häufigsten kommt ein Verfahren unter Verwendung eines synthetischen Substrats zur Anwendung, wobei ein Naphtholester einer Aminosäure oder eines Peptids als ausgezeichnetes
25 Substrat bekannt ist (JA-OSen 63 049/79 und
59 151/80; im folgenden wird das in diesen Patentanmeldungen beschriebene Verfahren als "Verfahren des Stands der Technik" bezeichnet). Gemäß dem Verfahren des Stands der Technik, in dem die Enzymaktivität unter Verwendung eines derartigen Naphtholesters bestimmt wird, läßt man das Naphthol, das durch die Hydrolyse mit einem Enzym freigesetzt wird, mit FVB-SaIz [Fast Violet B-Salz (6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidin-diazoniumsalz] reagieren,
M/24 172
./10·
wobei man ein Azopigment erhält, das anschließend bestimmt wird. Gemäß dem Verfahren des Stands der Technik wird die Reaktion zwischen dem freigesetzten Naphthol und dem FVB-SaIz unter Kühlen in Eis-Wasser durchgeführt, weil ansonsten eine Hydrolyse des Diazoniumsalzes oder eine Reaktion des Diazoniumsalzes mit sich selbst erfolgt, was in schwankenden Absorptions- oder Λ „,„ -Werten resultiert.
Hl CL Λ
Erfindungsgemäß erfolgt dagegen, wie in Beispiel 1 beschrieben, die Reaktion der freigesetzten Verbindung
15 c^-^N
der Formel HO —ff J ^- R9 mit dem FR-ITR-SaIz in
einem Temperaturbereich von 0 bis 400C ohne Schwankung der beobachteten Absorptions- oder λ_ev-Werte. Gemäß dem Verfahren des Stands der Technik muß die Reaktionszeit für·die Reaktion zwischen dem freigesetzten Naphthol und dem FVB-SaIz genauestens kontrollierb werden, weil die Absorption in Abhängigkeit von der Reaktionszeit variiert. Erfindungsgemäß ist dagegen
25 die Reaktion der freigesetzten Verbindung der Formel
mit dem FR-ITR-SaIz rasch beer.!-··4:,
wobei sich die Absorption selbst nach beendeter Re-30 aktion nicht ändert.
Gemäß dem Verfahren des Stands der Technik ist es, wie oben ausgeführt, erforderlich, die Temperatur für die Reaktion zwischen Enzym und Substrat (im allge-35
M/24 172
meinen 20 bis 400C) auf die Temperatur für die Farbreaktion (ungefähr O0C) einzustellen und darüber hinaus die Absorption innerhalb einer vorgeschriebenen Zeitspanne zu bestimmen. Sin wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt deshalb darin, daß es nicht mehr langer erforderlich ist, die beiden Verfahrensschritte bei unterschiedlichen Temperaturen und die Farbreaktion innerhalb eines gewissen Zeitlimits durchzuführen. Dies ist insbesondere deswegen von Bedeutung, weil das erfindungsgemäße Verfahren eine Vereinfachung des Assays und insbesondere die Durchführung des Assays mit Hilfe eines Autoanalyzers, bei dessen Verwendung es schwierig ist, die Verfahrenstemperatur zu wechseln, ermöglicht.
Ein weiterer Nachteil des Verfahrens des Stands der Technik ist das bei der Bestimmung der Enzymaktivität im Urin häufig auftretende Schwanken der beobachteten Werte. Es konnte gezeigt werden, daß dieses Schwanken durch die Anwesenheit von Nitritionen, die bei Kontaminierung des Urins mit einem Mikroorganismus unvermeidlich ist, verursacht wird. Die Anwesenheit von Nitritionen im Urin, die unabhängig von den Enzymen im Urin ist, stand der Anwendung des Verfahrens des Stands der Technik bei der Bestimmung von Enzymen im Urin entgegen [Nippon Rinsho (Japan
30 Clinic), Band 37, Special number for the summer, 2668 (1979)]. Im Gegensatz dazu besitzt das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß es, wie in Beispiel 2 beschrieben, durch die Anwesenheit von Nitritionen nicht nachteilig beeinflußt wird,
M/24
ι ./la·
Bei der praktischen Anwendung ist es häufig erforder-5 lieh, die Reaktion zwischen Enzym und Substrat vor der Farbreaktion durch Ansäuern der Reaktionsmischung zu beenden. Gemäß dem Verfahren des Stands der Technik unter Verwendung des FVB-Salzes läuft die Farbreaktion im sauren Bereich (pH 1 bis 4) jedoch nicht
10 ab, wohingegen beim erfindungsgemäßen Verfahren die Farbbildung auch in diesem pH-Bereich erfolgt. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht deshalb darin, daß nach Beendigung der Reaktion zwischen Enzym und Substrat durch Ansäuern die Reak-
15 tionsmischung direkt für die Farbreaktion eingesetzt werden kann.
Es ist ersichtlich, daß die Verwendung des FR-ITR-Salzes als Färbemittel in einem vorteilhaften Ver-20 fahren zur Bestimmung der'Enzymaktivität resultiert.
Nachfolgend sind die in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendeten Abkürzungen erläutert.
Μ/24 172 / .rs
GIy Glycyl -HN-CH2-CO-
5 CH3'
: Ala Alanyl 1
-HN-CH-CO-
VaI VaIy1 CH (CH3)2
10 -HN-CH-CO-
Leu Leucyl CH(CH-.),
I CH2
-NH-CH-CO-
He Isoleucyl CH
CH(CH-)
'20 ] I 3
I -NH-CH-CO-
Met Methxonyl CH3 25 S
(CH2)2 . -NH-CH-CO-
30 Pro Prolyl | \-C0-
M/24 172
Phe phenylalanyl
VS
Gin Glutaminyl
GIu Glutamyl
CH
-NH-CH-CO-
CONH,
(CH2J2 -NH-CH-CO-
COOH
(CH,)-
- ι 2 2
-NH-CH-CO-
pyroGlu Pyroglutamyl j \-C0-
Tyr Tyrosyl
OH
-NH-CH-CO-
Lys Lysyl
NH2 (CH2)4 -NH-CH-CO-
M/24 Ac 172 .As • Arginyl • NH-
I 2
Ly s (Me) ct-N-Me thy lly sy 1 (CH2J4
-N-CH-CO
I
I
CH3
NH-
I 2
Arg C=NET
Acetyl I
NH
j
-NH-CH-CO
• CH3CO-
Benzoyl
Q)-CO-
p- To luo !sulfonyl CH.
tert-Butoxycarbonyl
(CH3J3COCO-
Benzyloxycarbonyl (QV- CH-OCO-
Dansyl Dansyl
M/24 172
GIt
Me
NE
Glutaryl
Methyl
Naphthyl-ester
. HOOC-(CH2J3-CO-CH3-
6-Br-3-NE 6-Brom>.-ß-naphthyl O
ester
DMSO
Dimethyl—sulf oxid«
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert. Wenn nicht anders angegeben, ■werden die zur Anwendung kommenden Aminosäuren in der L-Form eingesetzt.
Beispiel 1
Einfluß der Reaktionstemperatur und -zeit auf die Bestimmung der Kallikrein-Aktivität im Urin unter Verwendung von H-Pro-Phe-Arg-a-NE als Substrat und FR-ITR-SaIz oder FVB-SaIz als Färbemittel:
Zu 1,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0), der 0,015% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthält, gibt man 0,1 ml Urin und 0,1 ml einer 1,5 mM wäßrigen Lösung von H-Pro-Phe-Arg-a-NE. Die Mischung wird 30 min bei 370C inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml einer 1&Lgen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung oder einer 1?oigen
M/24
wäßrigen FVB-Salz-Lösung läßt man die Mischung unter 5 den folgenden Temperatur-Zeit-Bedingungen reagieren: O0C - 10 min, 250C - 10 min, 250C - 30 min, 370C 10 min und 370C - 30 min. Danach vermischt man jede Reaktionsmischung mit 1,0 ml Eisessig und bestimmt die Absorption. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1
10 zusammengestellt.
Tabelle
Reaktionsbedingungen O Zeit, FVB-SaIz FT-ITR-SaIz Lon
im;
Temp., 25 min ( Absorption Absorptj
OC 10 ; / max'1^1 max (477)
37 10 0,620 (500) 0,620 ( " )
30 0,153 (510) 0,628 ( " )
10 0,207 (510) 0,625 ( " )
30 0,227 (513) 0,625 ( » )
0,334 (513) 0,621
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß bei Verwendung
des FVB-Salzes sowohl die Absorption als auch der
^ max""Wört von der Reaktionstemperatur und der Reak tionszeit beeinflußt werden. Bei Verwendung des FR-
ITR-Salzes dagegen erfolgt im wesentlichen keine
Änderung der Absorption oder des λ -wertes, d.h. die beiden Werte bleiben praktisch konstant.
B e is ρ i e 1 Einfluß von Natriumnitrit auf die Bestimmung der Kallikrein-Aktivität im Urin unter Verwendung von H-Pro-Phe-Arg-a-NE als Substrat und FR-ITR-SaIz oder FVB-SaIz als Färbemittel:
M/24 172
Zu 1,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0), 5 der O,O15?6 SDS enthält, gibt man 0,1 ml Urin, der Natriumnitrit in einer Konzentration von 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 mM enthält, und 0,1 ml einer 1,5 eqM wäßrigen H-Pro-Phe-Arg-a-NE-Lösung. Jede Mischung v/lrd 30 min bei 370C inkubiert. Für den Versuch un-
10 ter Verwendung von PR-ITR-SaIz gibt man dazu 0,1 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung und läßt die erhaltene Mischung 5 min bei 370C reagieren. Nach Zugabe von 1,0 ml Eisessig bestimmt man die Absorp-' tion der Reaktionsmischung bei 475 nm. Für den Ver-
15 such unter Verwendung desEVB-Salzes gibt man zu der oben erwähnten Reaktionsmischung 0,1 ml einer 1%igen wäßrigen FVB-Salz-Lösung und läßt die Mischung 10 min bei O0C reagieren. Nach Zugabe von 1,0 ml Eisessig bestimmt man die Absorption der Reaktionsmischung bei
505 nm.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Konzentration an Natriumnitrit aufgetragen sind; die mit "·" markierten Koordinaten betreffen den Versuch unter Verwendung des FR-ITR-Salzes gemäß der Erfindung, während die mit "o" markierten den Versuch unter Verwendung des FVB-Salzes betreffen. Es ist ersichtlich, daß bei Verwendung des FVB-Salzes als
Färbemittel die Absorption durch die Anwesenheit von Natriumnitrit stark beeinflußt wird, wohingegen bei
Verwendung des FR-ITR-Salzes gemäß der Erfindung die Absorption praktisch konstant ist und damit durch
die Anwesenheit von Natriumnitrit nicht beeinflußt
wird.
M/24 172 ^
- /I9 -
Beispiel 5
Verfahren zur Bestimmung von Thrombin unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Thrombin (1, 2 oder 3 NIH-E/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Tos-Lys-a-NE-Lösung. Jede Mischung wird 10 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-SaIz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man mit 2,0 ml 50#iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Thrombinmenge aufgetragen sind.
Beispiel 4
Verfahren zur Bestimmung von Trypsin unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Trypsin (0,25, 0,5 oder 0,75/ug/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Tos-Lys-a-NE-Lösung. Jede Mischung wird 15 min bei 25°C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-SaIz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 25°C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 50&iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt,
M/24 172 VST
*<20
wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Trypsinmenge aufgetragen sind.
Beispiel 5
Verfahren zur Bestimmung von Urokinase unter Verwendung von Ac-Gly-Lys-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Urokinase (60, 120, 180, 240 oder 300 IE/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Ac-GIy-. Lys-a-NE-Lösung. Jede Mischung wird 15 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%lgen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 5O?6iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Urokinasemenge aufgetragen sind.
Beispiel 6
Verfahren zur Bestimmung von Plasmin unter Verwendung von H-D-Val-Leu-Lys-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Plasmin (0,125, 0,25, 0,375, 0,5 oder 0,625 CU /ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 10bigen wäßrigen DMSO-Lösung, die 1 mM H-D-Val-Leu-Lys-a-NE enthält. Jede Mischung wird 15 min bei 25°C inku-35
Μ/24 172 Vf
biert. %ch Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-Salz-LÖsung läßt man die Mischung 5 min bei 25°C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 50#iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 mn. Die Ergebnisse sind in Fig.5 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an Plasmin aufgetragen sind.
Beispiel 7
Verfahren zur Bestimmung des Faktors Xa unter Ver-15 wendung von Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-oc-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung des Faktors Xa (0,05, 0,1, 0,15 oder 0,2 E/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 10bigen wäßrigen DMSO-Lösung, die 1 mM Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-a-NE enthält. Jede Mischung wird 15 min bei 20°C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-Salz-LÖsung läßt man die Mischung 5 min bei 200C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 50&Lger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an Faktor Xa aufgetragen
30 sind.
Beispiel 8
Verfahren zur Bestimmung von C1r unter Verwendung von Ac-Gly-Lys-a-NE: 35
Zu 1 ,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von C1r (2,5» 5, 7,5 oder 10/ug/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Ac-GIy-Lys-oc-NE-Lösung. Die Mischung wird 15 min bei 250C Inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1?6igen wäßrigen FR-ITR-SaIz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 50%iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 mn. Die Ergebnisse sind in Fig. 7 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an C1r aufgetragen sind.
Beispiel 9
Verfahren zur Bestimmung von C1s" unter Verwendung von Ac-Tyr-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von CIs* (2,5» 5» 7»5 oder 10/ug/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 10bigen wäßrigen DMSO-Lösung, die 1 mM Ac-Tyr-a-NE enthält. Die Mischung wird 15 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 5O?6iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind inFig. 8 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an CIs" aufgetragen sind.
M/24 172 Λ2Γ
Beispiel 10
5 Verfahren zur Bestimmung von Chymotrypsin unter Verwendung von Ac-Tyr-cc-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Chymotrypsin (0,2, 0,4, 0,6 oder 0,8 /Ug/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1Obigen wäßrigen DMSO-Lösung, die 1 mM Ac-Tyr-cc-NE enthält. Die Mischung wird 15 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%lgen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung wird dann mit 2,0 ml 50%iger Essigsäure vermischt und man bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse
20 die Menge an Chymotrypsin aufgetragen sind.
Beispiel 11 ' Verfahren zur Bestimmung von Thrombin unter Verwendung von Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Thrombin (0,25, 0,5, 0,75 oder 1,0 NIH-E/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE-Lösung. Die Mischung wird 15 min bei 25 C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1%igen wäßrigen Fr-ITR-Salz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 5O?4iger Essigsäure und
M/24 172
bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 10 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Thrombinmenge aufgetragen sind,
Beispiel 12
Verfahren zur Bestimmung von Trypsin unter Verwendung von Tos-Lys(Me)-ß-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Tris-HCl-Puffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Trypsin (0,25» 0,5, 0,75 oder 1, 0/ug/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Tos-Lys(Me)-ß-NE-Lösung. Die Mischung wird 15 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1&Lgen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml Eisessig und bestimmt die Absorption bei 495 nm. Die Ergebnisse sind in Fig.' 11 dargestellt, wobei auf der Ordinate, die Absorption und auf der Abszisse die Trypsinmenge aufgetragen sind.
Beispiel 13
Verfahren zur Bestimmung von Urokinase unter Verwendung von Ac-Gly-Lys-6-Br-ß-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriuraphosphatpuffers (pH 7,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Urokinase (300, 600, 900 oder 1200 ΙΕ/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1 mM wäßrigen Ac-GIy-Lys-6-Br-ß-NE-Lösung. Die Mischung wird 15 min bei
f:v.f:;::;.;::;" ·; 332787:
M/24 172
250C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml einer 1&Lgen FR-ITR-SaIz-Lösung läßt man die Mischung 5 min bei 250C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml Eisessig und bestimmt die Absorption bei 500nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Urokinasemenge aufgetragen sind.
Beispiel. 14
Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III unter
Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4) mit einem Gehalt an 1 IS/ml Heparin gibt man 1,5 All eines Plasmas, das Antithrombin III in einer Konzentration von 0, 25, 50, 75, 100 oder 125/6 der Konzen-
20 tration normalen Plasmas enthält, und 0,1 ml
einer Lösung von Thrombin (1,5 NIH-E/ml) in physiologischer Kochsalzlösung. Zu der 10 min bei 370C inkubierten Mischung gibt man dann 0,1 ml einer 2 mM wäßrigen Tos-Lys-oc-NE-Lösung. Die erhaltene Mischung wird erneut 10 min bei 370C inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml einer 1%igen FR-ITR-Salz-Lösung in 50%±ger Essigsäure läßt man die Mischung 5 min bei 37°C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 1,0 ml 50%iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 13 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an Antithrombin III aufgetragen sind.
M/24 172 32-
Beispiel Λ*ρ
5 Verfahren, zur Bestimmung von Antithrombin III mittels eines Autoanalyzers unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 20/Ul eines Plasmas, das Antithrombin III in einer Konzentration von 0, -25, 50, 75, 100 oder ΐ25# der
Konzentration in normalem Plasma enthält, gibt man 1,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4), der Thrombin (4 E/ml), Heparin (5 E/ml) und Rinderserumalbumin (1 mg/ml) enthält. Die 2 min bei 37°C inkubierte Mischung wird dann mit 0,1 ml einer 2 mM
15 wäßrigen, 1% FR-ITR-SaIz enthaltenden Tos-Lys-a-NE- · Lösung vermischt und 30 see bei 37°C inkubiert. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 1,0 ml 50%iger Essigsäure und bestimmt nach 1 min die Absorption bei 540 nm. Als Autoanalyzer wird "Cob'as-Bio"
(Kabi Co.) verwendet. Die Ergebnisse sind in Fig. dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an Antithrombin III aufgetragen sind.
Beispiel 16
Verfahren zur Bestimmung von Plasma-Prekallikrein unter Verwendung von H-Pro-Phe-Arg-a-NE:
Zu 2,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 6,0) gibt man mit Citrat versetztes Plasma (5, 10 oder 15/Ul) und 10/Ul einer wäßrigen Dextransulfatlösung (Molekulargewicht 500 000) (30 /ug/ml). Die 5 min bei 37°C inkubierte Mischung wird mit 0,2 ml einer 2 mM wäßrigen H-Pro-Phe-Arg-a-NE-LÖsung, die 0,1% 35
M/24 172
SDS enthält, vermischt und 10 min bei 37°C inkubiert. Nach Zugabe von 0,2 ml 50%iger Essigsäure, die Λ% FR-ITR-SaIz enthält, läßt man die Mischung 5 min bei 370C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 2,0 ml 50%iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 mn. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Plasmamenge aufgetragen sind. · ·
Beispiel 17
15 Verfahren zur Bestimmung von Thrombin unter Verwendung von Tos-Lys-cc-NE:
Zu 1,7 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 8,0) gibt man 0,1 ml einer Lösung von Thrombin (0,5, 1 oder 1,5 NIH-E/ml) in physiologischer Kochsalzlösung und 0,2 ml einer 1,5 mM wäßrigen Tos-Lys-oc-NE-Lösung. Die Mischung wird 10 min bei 370C inkubiert, dann vermischt man sie mit 0,2 ml einer 1%igen FR-ITR-Salz-Lösung in 50%iger Essigsäure und läßt sie 5 min bei 370C reagieren. Nach Zugabe von 2,0 ml 50%iger Essigsäure bestimmt man die Absorption der Reaktionsmischung bei 475 mn. Die Ergebnisse sind in Fig. 16 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Menge an
30 Thrombin aufgetragen sind.
M/24 172
Beispiel 18
Elektrophoretische Bestimmung der Enzymverteilung im Blut:
Man stellt eine Polyacrylamid-Gelsäule unter Verwendung eines 7 cm langen Glasrohrs mit einem inneren Durch-
messer von 4 mm her. Die Säule wird mit 40 /ul eines Serums beladen und 50 min der Elektrophorese bei 2 mA unterzogen. Das Gel wird aus dem Rohr herausgenommen, in 10 ml einer Lösung von 0,5 mM Tos-Lys-a-NE in einem 100 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) getaucht
15 und 30 min bei 250C inkubiert. Nach Zugabe von 1 ml einer 1#igen wäßrigen FR-ITR-Salz-Lösung läßt man das Gel zur Erzielung einer Färbung 10 min bei 250C stehen. Auf diese Weise ist es möglich, die Enzymverteilung im Blut, in Form von orangeroten Banden sichtbar zu
machen. Die Ergebnisse sind in Fig. 17 am Beispiel von normalem, menschlichem Serum dargestellt,
Beispiel 19
Verfahren zum Färben von Blutzellen:
Man stellt einen Blutausstrich her und fixiert ihn mit Formalindämpfen. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Probe in 10 ml eines 100 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,0), der 0,2 mM eines Substrats (Ac-Tyr-a-NE,
Tos-Lys-a-NE oder Ac-Gly-Lys-a-NE) und 0,1# FR-ITR-SaIz enthält, getaucht und 90 min bei 250C inkubiert. Die Probe wird mit Wasser gewaschen und unter einem Mikroskop betrachtet. Die Ergebnisse der Färbung sind in Tabelle 2 zusammengestellt.
M/24 172
Tabelle 2
Ac-Tyr-α-ΝΕ Tos-Lys-a-NE Ac-GIy-Lys-a-NE
Lymphocy.ten - - -
Monocyten + <\, + ± a» + +
Granulocyten
Neutrophile +++ +++
Eosinophile - - -
Basophilβ + + +
Beurteilung: - keine Färbung; ·
+ bis +++ Intensität der Färbung.
20 Beispiel 20
Die Sensitivitäten gegenüber verschiedenen Enzymen, bestimmt gemäß den in den Beispielen 1 bis 17 beschriebenen Verfahren, sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
25
•Tabelle 3 Sensitivität Einheit
Substrat Enzym« 0.197 AO,D/NIH-U/min
H-pyroGlu-Gly-Arg-α-ΝΕ Throrabin 0.261 A0,D/NIH-U/min
H-Leu-Gly-Arg-cc-NE Thrombin 1.387 Δ0,D/KU/min
H-D-Val-Leu-Arg-a-NE Kallxkrein 0.053 AO,D/NIH-U/min
Bz-Phe-Val-Arg-a-NE Throrabin 1.747 Δ0,D/KU/min
Tos-Gly-Pro-Arg-a-NE Kallikrein 0.173 AO,D/NIH-U/min
H-Phe-Val-Arg-a-NE Thrombin 0.115 AO,D/NIH-U/min
Glt-Gly-Arg-a-NE Thrombin 0.377 AO,D/NIH-U/min
H-Gly-Gly-Ärg-a-NE Thrombin 1.420 ΔΟ,D/KU/min
H-Phe-Arg-a-NE Kallikrein 3.55 χ 10~4 A0,D/IU/min
Tos-Gly-Pro-Lys-a-NE Urokinase 0.0347 ΔΟ,D/KU/min
Ac-Met-a-NE Kallikrein
co co ro
CX) CO
Beispiel 21
5 Verfahren zur Bestimmung von Plasminogen unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,0 ml einer Humanplasraa-Lösung (3, 2,5, 2, 1,5, 1 oder 0,5/ul Plasma/50 mM Natriumphosphat-Puffer) gibt man 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Streptokinase (1000 E/ml). Die Mischung wird 10 min bei 370C inkubiert, dann mit 0,1 ml einer 2 mM Tos-Lysct-NE-Lösung vermischt und erneut 10 min bei 370C inkubiert. Zu der Mischung gibt man 0,1 ml einer 1?£igen FR-ITR-Salz-LÖsung in 50&Lger Essigsäure. Man läßt die Mischung 10 min bei 370C reagieren. Nach Zugabe von 1,0 ml Eisessig wird die Absorption der Reaktionsmischung bei 475 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 18 dargestellt, wobei auf der
20 Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Plasmamenge aufgetragen sind.
Beispiel 22
Verfahren zur Bestimmung von Antiplasmin unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,0 ml einer Humanplasma-Lösung [15, 12,5, 10, 7,5, 5 oder 2,5/ul Plasma/50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4)] gibt man 0,1 ml einer wäßrigen Lösung von Plasmin (0,1 Cl/ml). Die Mischung wird 20 see bei 370C inkubiert, dann mit 0,1 ml einer 2 mM Tos-Lysa-NE-Lösung vermischt und erneut 10 min bei 370C inkubiert. Zu der Mischung gibt man 0,1 ml einer ISOigen FR-ITR-Salz-Lösung in 50%iger Essigsäure. Man
M/24 172 2Ö
läßt die Mischung 10 min bei 370C reagieren. Nach Zugabe von 1,0 ml Eisessig wird die Absorption der Reaktionsmischung bei 475 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 19 gezeigt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Plasmamenge aufgetragen sind.
10
Beispiel 23
Verfahren zur Bestimmung von Heparin unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 0,05 ml einer wäßrigen, 0,01, 0,02, 0,03 oder 0,04 IE/ml Heparin enthaltenden Lösung gibt man 0,05 ml Standardplasma, das mit physiologischer Kochsalzlösung 10fach verdünnt ist, 1,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers und 0,1 ml einer wäßrigen
20 Lösung von Thrombin (1,5 NIH-E/ml). Zu der 10 min bei 37°C inkubierten Mischung gibt man 0,1 ml einer 2 mM Tos-Lys-a-NE-Lösung. Die erhaltene Mischung inkubiert· man erneut 10 min bei 370C. Nach Zugabe von 0,1 ml einer 1#igen FR-ITR-Salz-Lösung in 50&Lger
Essigsäure läßt man. die Mischung 10 min bei 370C reagieren, vermischt mit 1,0 ml Eisessig und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 20 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Heparinmenge
30 aufgetragen sind.
Μ/24 172 2&
• 33 ·
Beispiel 24
Verfahren zur Bestimmung von Antithrombin III unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 0, 5, 10, 15, 20 oder 25 /Ul eines Plasmas gibt
man 3,0 ml eines 50 mM Natriumphosphatpuffers (pH 7,4),
10 der 0,8 NIH-S/ml Thrombin, 4 IE/ml Heparin und
10 KIE/ml Aprotinin enthält. 50/ul dieser Mischung gibt man in ein Teströhrchen und inkubiert 10 min bei 37°C. Zu der Mischung gibt man dann 0,1 ml einer 2 mM Tos-Lys-a-NE-Lösung. Die erhaltene Mischung wird erneut 10 min bei.370C inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml einer I^igen FR-ITR-Salz-Lösung in 10biger Essigsäure läßt man die Mischung 10 min bei ■ 37°C reagieren, vermischt dann mit 2,0 ml 30%iger Essigsäure und bestimmt die Absorption bei 475 ran.
20 Die Ergebnisse sind in Fig. 21 dargestellt, wobei
auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die · Plasmamenge aufgetragen sind.
Beispiel 25
Verfahren zur Bestimmung von Prothrombin unter Verwendung von Tos-Lys-a-NE:
Zu 1,0 ml einer Humanplasmalösung (2,0, 1,6, 1,2, 0,8 oder 0,4/ul Plasma/50 mM Natriumphosphatpuffer) gibt man 0,1 ml einer Lösung eines Schlangengifts (Echis carinatus Gift; 10/Ug/ml) in obigem Puffer. Die erhaltene Mischung wird 5 min bei 37 C inkubiert, anschließend mit 0,1 ml einer 2 mM Tos-Lysa-NE-Lösung vermischt und erneut 30 min bei 250C
Μ/24 172 .50
inkubiert. Nach Zugabe, von 0,1 ml einer 1?&Lgen FR-ITR-Salz-Lösung in 50&Lger Essigsäure läßt man die Mischung 10 min bei 370C reagieren. Die Reaktionsmischung vermischt man dann mit 1,0 ml Eisessig und bestimmt die Absorption bei 475 nm. Die Ergebnisse sind in Fig. 22 dargestellt, wobei auf der Ordinate die Absorption und auf der Abszisse die Plasmamenge aufgetragen sind.
Fig. 1 zeigt die Auswirkung von Nitritionen auf die beobachtete Absorption bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und bei Anwendung eines bekannten Verfahrens.
Fig. 2 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Thrombin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Trypsin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Fig. 4 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Urokinase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig, 5 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung
von Plasmin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung
des Faktors Xa gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 7 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von C1r gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung · von C1s" gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig.9 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Chymotrypsin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren,
Fig.10 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Thrombin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. 35
M/24 172
ι . 35
Fig. 11 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Trypsin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 12 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Urokinase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Fig. 13 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Antithrombin III gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. ' '
Fig. 14 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Antithrombin III gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren;
Fig. 15 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Plasma-Prekallikrein gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 16 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Thrombin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren. Fig. 17 zeigt eine Enzymverteilung im Blut, bestimmt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren; das Zeichen "^ " gibt den Startpunkt an.
Fig. 18 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Plasminogen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 19 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Antiplasmin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 20 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Heparin gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 21 zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Antithrombin III gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Fig. 22 zeigt .die Ergebnisse der Bestimmung von Prothrombin gemäß dem erfindungsgemäiBen Verfahren.

Claims (8)

10 Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, Enzyminhibitoren, Enzymaktivatoren oder Zymogenen, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Enzym mit einem Substrat der allgemeinen Formel I
(D
worin R^ eine Aminosäure oder ein Oligopeptid, welche über ihre C-terminale Carboxylgruppe in Form eines Esters gebunden sind, und I^
ein Wasserstoff- oder Bromatom bedeuten, reagieren läßt, wobei das Substrat hydrolysiert wird, anschließend
25 das Hydrolyseprodukt der allgemeinen Formel
worin R2 die oben angegebenen Bedeutungen besitzt, mit FR-ITR-SaIz [Fast Red-ITR-Salz (N,N'-Diethyl-4-methoxymetanilamid-diazoniumsalz)] unter Bildung eines Pigments reagieren läßt und das Pigment bestimmt.
M/24 172 2
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R1 für
A-R-J-R7-Rr-R^-CO- steht, wobei A ein Wasserstoffatom 3 η ρ ο
oder eine Acyl- oder SuIfony!gruppe bedeutet, R,, R^ und Rc jeweils GIy, Ala, VaI, Leu, He, Pro, Phe, Gin, GIu, pyroGlu oder eine Einfachbindung bedeuten und Rg für Lys, Lys(Me), Arg,.Met oder Tyr steht. 10
3 . Verfahren nach Anspruch 2/ worin A
ein Wasserstoffatorn oder Ac, Bz, Tos, Boc, Cbz, Dansyl
oder GIt bedeutet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, worin R^ für A-Tyr-, A-Arg-, A-Lys-, A-Gly-Lys-, A-Phe-Arg-, A-Gly-Gly-Arg-, Α-Leu-GIy-Arg-, A-Gln-Gly-Arg-, A-pyroGlu-Gly-Arg-, A-Leu-Ala-Arg-, A-Pro-Phe-Arg-, A-D-Val-Leu-Lys-, A-Phe-Val-Arg- oder A-Ile-Glu-
20 GIy-Arg- steht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Substrat der Formel (I) Tos-Lys-a-NE, Ac-Tyr-a-NE, Bz-Leu-Ala-Arg-a-NE, Ac-Phe-Arg-a-NE, H-Pro-Phe-Arg-a-NE oder Ac-Gly-Lysa-NE verwendet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym die Serin-
30 protease E.C. 3.4,21 verwendet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Plasmin, Thrombin, Urokinase, Faktor Xa, C1s" oder C1r und als Inhibitor, Aktivator oder Zymogen Antithrombin III, Heparin, Antiplasmin, Prekallikrein oder Plasminogen verwendet.
M/24 172
8. .Verwendung der Verbindungen der Formel I nach den Ansprüchen 1-5 zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, Enzyminhibitoren/ Enzymaktivatoren oder Zymögenen.
10 15 20
30 35
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002022553A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Musc Foundation For Research Development Non-natural basic amino acids, their preparation and use
US6783946B2 (en) 1996-10-22 2004-08-31 Medical University Of South Carolina Positively charged non-natural amino acids, methods of making thereof, and use thereof in peptides

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8803109D0 (en) * 1988-02-11 1988-03-09 Deltanine Research Ltd Improvements in/relating to clinical testing monitoring & pharmaceutical compositions for treatment of auto-immune diseases
US5663055A (en) * 1989-12-29 1997-09-02 Oklahoma Medical Research Foundation Methods for diagnosing human influenza and 4-position modified chromogenic N-acetylneuraminic acid substrated for use therein
US5252458A (en) * 1990-12-31 1993-10-12 Symex Corp. Method for visually detecting the presence of a virus in a clinical specimen
AU656162B2 (en) * 1990-12-31 1995-01-27 Symex Corp. Method for visually detecting the presence of a virus in a clinical specimen
US5849510A (en) * 1994-04-26 1998-12-15 Selectide Corporation Factor Xa inhibitors
AU697785B2 (en) 1994-07-19 1998-10-15 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Analytical element,composition and method using modified apo-horseradish peroxidase
US5719020A (en) * 1996-09-25 1998-02-17 Oklahoma Medical Research Foundation 4,7-dialkoxy N-acetylneuraminic acid derivatives and methods for detection of influenza type A and B viruses in clinical specimens
US6303764B1 (en) 1998-09-24 2001-10-16 Zymetx, Inc. Synthesis of 4,7-dialkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids
US6528652B1 (en) 1999-01-21 2003-03-04 Chronimed Composition and device for detecting leukocytes in urine
US6348324B1 (en) 1999-01-21 2002-02-19 Hypoguard America Limited Composition and device for detecting leukocytes in urine
US6420552B1 (en) 1999-09-10 2002-07-16 Zymetx, Inc. Syntheses of 4-alkyl chromogenic glycosides and 7-alkyl chromogenic glycosides of N-acetylneuraminic acids

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2239936C2 (de) * 1971-08-16 1983-02-10 Robert Eugene Greenwood Ind. Smith Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Peptidase-Enzymkonzentrationen in Homogenaten unter Verwendung von 4-Methoxy-2-naphthylamiden

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR853177A (fr) * 1938-04-16 1940-03-12 Ig Farbenindustrie Ag Colorants mono-azoïques et procédé de préparation de ces colorants
US3862011A (en) * 1971-08-16 1975-01-21 Robert E Smith Method for quantitatively determining enzyme concentrations in homogenates
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
JPS5559150A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
JPS5559149A (en) * 1978-10-30 1980-05-02 Torii Yakuhin Kk Aminoacid derivative
US4229528A (en) * 1978-11-13 1980-10-21 Smith Robert E Fluorescence method for enzyme analysis which couples aromatic amines with aromatic aldehydes
US4308202A (en) * 1979-10-25 1981-12-29 Torii & Co., Ltd. Prolylphenylalanylarginine derivatives, process for producing same and method for measuring activity of enzymes using same
JPS6035117B2 (ja) * 1980-10-28 1985-08-13 富士写真フイルム株式会社 リパ−ゼ活性測定用試薬

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2239936C2 (de) * 1971-08-16 1983-02-10 Robert Eugene Greenwood Ind. Smith Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Peptidase-Enzymkonzentrationen in Homogenaten unter Verwendung von 4-Methoxy-2-naphthylamiden

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6566330B1 (en) 1996-10-22 2003-05-20 Medical University Of South Carolina Foundation Research Development Positively charged non-natural amino acids, methods of making and using thereof in peptides
US6783946B2 (en) 1996-10-22 2004-08-31 Medical University Of South Carolina Positively charged non-natural amino acids, methods of making thereof, and use thereof in peptides
US6858396B2 (en) 1996-10-22 2005-02-22 Medical University Of South Carolina Positively charged non-natural amino acids, methods of making and using thereof in peptides
WO2002022553A2 (en) * 2000-09-11 2002-03-21 Musc Foundation For Research Development Non-natural basic amino acids, their preparation and use
WO2002022553A3 (en) * 2000-09-11 2003-04-24 Musc Found For Res Dev Non-natural basic amino acids, their preparation and use

Also Published As

Publication number Publication date
JPS5925699A (ja) 1984-02-09
FR2531453A1 (fr) 1984-02-10
FR2531453B1 (fr) 1985-07-12
GB2126720A (en) 1984-03-28
DE3327873C2 (de) 1986-10-23
GB2126720B (en) 1985-08-29
GB8320832D0 (en) 1983-09-01
US4772553A (en) 1988-09-20
JPH0236239B2 (de) 1990-08-16

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