DE4333805A1

DE4333805A1 - Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter Nucleinsäuresequenzen

Info

Publication number: DE4333805A1
Application number: DE19934333805
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Yamagishi
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1993-08-24
Filing date: 1993-10-04
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2013-10-05
Also published as: JPH0759572A; JP3451667B2; DE4333805C2

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und ein Verfahren zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäu resequenz, das sich in Biotechnologie und klinischer Dia gnose verwenden läßt.

Das Extrahieren von Nucleinsäuren aus einer Probe stellt ein wichtiges Verfahren in der Biotechnologie, in der klinischen Diagnose und in anderen Gebieten dar. In Gen-Rekombinations- Verfahren ist z. B. sowohl das Isolieren der zu clonierenden DNA als auch von Vektor-DNA erforderlich, und zur Durchfüh rung eines Gen-Tests auf genetische Krankheiten und Krebs- Gene ist es notwendig, Nucleinsäuren z. B. aus den im Blut vorhandenen Leukozytenzellen zu extrahieren.

Nucleinsäuren kommen im allgemeinen nicht als freie Moleküle vor, sondern in Bakterien, Zellen, Viruspartikeln usw., wo sie mit Zellmembranen und -wänden bedeckt sind, die sich aus Proteinen, Lipiden und Polysacchariden zusammensetzen. Nucleinsäuren selbst bilden Komplexe mit Histonen und ande ren Proteinen. Zur Extraktion von Nucleinsäuren, die in die ser Weise vorliegen, müssen die sie bedeckenden Zellmembra nen und -wände aufgebrochen werden, und die Proteine des er wähnten Komplexes müssen denaturiert oder abgebaut werden, um sie so zu solubilisieren. Dadurch werden die Nucleinsäu ren freigesetzt und können dann extrahiert werden.

Herkömmlicherweise werden Nucleinsäuren nach einem der nach folgenden Verfahren extrahiert:

(i) Das sogenannte Proteinase K-/Phenol-Verfahren, bei dem ein proteolytisches Enzym wie Proteinase K oder ein grenzflächen-aktiver Stoff zugegeben wird, wodurch die Zellmembran oder -wand aufgebrochen und das Protein des betreffenden Komplexes abgebaut wird, und Nuclein säuren freigesetzt werden. Dann wird Phenol/Chloroform zugegeben, und das Gemisch wird zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in die wäßrige Phase überführt wer den. Die wäßrige Phase wird dann abgetrennt und weiter verwendet. Ethanol, iso-Propylalkohol oder etwas ähn liches wird zur wäßrigen Phase gegeben, wodurch die Nucleinsäuren ausgefällt werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Appendices E3-E4, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989);
(ii) Das sogenannte AGPC-Verfahren, bei dem ein flüssiges Gemisch von Guanidiniumisothiocyanat und Phenol zur betreffenden Probe gegeben wird, um Zellmembran und -wand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denaturieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäuren werden dann freigesetzt, und Chloroform wird zugege ben, um die Nucleinsäuren in die wäßrige Phase zu überführen. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und wei ter verwendet. Danach wird Ethanol, iso-Propanol oder etwas ähnliches zur wäßrigen Phase gegeben, wodurch die Nucleinsäuren ausgefällt werden (Acid Guanidinium- Thiocyanate Phenol-Chloroform Method: Analytical Bio chemistry 162 (1987), S. 156-159);
(iii) Das sogenannte Guanidiniumverfahren, bei dem Guanidi niumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat zur be treffenden Probe gegeben wird, um Zellmembran und -Zellwand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denaturieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäu ren werden dann freigesetzt, und z. B. Ethanol wird zur Fällung der freien Nucleinsäuren zugegeben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 7.23-7.25, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; und Analytical Biochemistry 162 (1987) S. 463; und
(iv) Das sogenannte Natriumjodid-Verfahren. Hier wird Gly cogen enthaltendes Natriumjodid (Glycogen besitzt eine Affinität für die zu extrahierende Nucleinsäure) zur betreffenden Probe gegeben, um Zellmembran und -wand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denatu rieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäuren werden dann freigesetzt, und iso-Propanol wird zur Fällung von freien Nucleinsäuren und Glycogen zugegeben (Nucleic Acid Res. 19 (20) (1991), S. 592).

Sämtliche vier vorstehend beschriebenen Verfahren weisen spezifische Nachteile auf. Das Proteinase K-/Phenol-Verfah ren schließt komplizierte Prozeduren ein, da der Abbau durch proteolytische Enzyme lange dauert und da eine Kontrolle der Temperatur für eine wirksame enzymatische Reaktion notwendig ist. Außerdem sind Phenol und Chloroform toxische Chemika lien (beide fallen unter die gesetzlich als giftig und ge fährlich eingestuften Substanzen), und bei ihrer Handhabung ist das Tragen von Schutzkleidung und -handschuhen und die Verwendung chemischer Abzüge usw. notwendig. Ferner muß der aus der Extraktionsprozedur stammende flüssige Abfall spe ziell entsorgt werden, wodurch mehr Zeit und zusätzliche Ge rätschaften benötigt und Extrakosten verursacht werden. Au ßerdem bedarf es einer großen Geschicklichkeit, die wäßrige Phase, in die die betreffenden Nucleinsäuren überführt wur den, abzutrennen. Dies macht es schwierig, eine gleichblei bende Effizienz bei der Extraktion von Nucleinsäuren zu er reichen.

Ähnliche Probleme gibt es im AGPC-Verfahren bezüglich der Handhabung von Phenol und Chloroform und ebenfalls bezüglich der Extraktionseffizienz. Diese ist abhängig vom Abtrennen und von der Rückgewinnung der wäßrigen Phase, in die die entsprechende Nucleinsäure überführt wurde. Außerdem ist das AGPC-Verfahren speziell für die Extraktion von RNA entwickelt und zur Extraktion von DNA ungeeignet.

Im Guanidiniumverfahren wird z. B. Ethanol nach der Zugabe von z. B. Guanidiniumhydrochlorid zur betreffenden Probe ge geben. Um einen nachfolgenden Abfall der Konzentration von Guanidinium in der Lösung zu verhindern, muß hochkonzen triertes (ca. 6 bis 8 M) Guanidinium verwendet werden. Damit ist aber eine erhöhte Möglichkeit des Auskristallisierens von Guanidiniumsalz gegeben (besonders im Winter, oder wenn die Raumtemperatur unter 20°C liegt). Das Auskristallisieren von Guanidiniumsalz kann zum Verstopfen von Pipetten oder anderen Ausrüstungsteilen führen, die zur Zugabe von z. B. Guanidiniumhydrochlorid verwendet werden, und dies stellt ein beträchtliches Hindernis für jeden Versuch dar, die Pro zedur des Guanidiniumverfahrens zu mechanisieren. Ethanol oder etwas ähnliches wird nach dem Guanidiniumhydrochlorid oder ähnlichem zugegeben. Die Endkonzentration von z. B. Ethanol muß 50 bis 70% betragen, um die Nucleinsäuren un löslich zu machen. Das Probenvolumen ist jedoch wegen der Zugabe von Guanidiniumhydrochlorid oder ähnlichem vergrö ßert, und deshalb muß man hochreinen Ethanol (ca. 100%) in einer Menge verwenden, die mindestens ebenso groß ist, wie die des flüssigen Gemisches von Probe und Guanidiniumhydro chlorid.

Das Natriumjodidverfahren ist mit dem Problem behaftet, daß es einer Inkubation bei 60°C bedarf, um Proteine oder ähnli ches zu solubilisieren, was zu einer niedrigen Effizienz bei der RNA-Extraktion führt. Ein weiteres Problem besteht darin, daß labile Jodidionen (J^-) dazu neigen, durch die Wirkung von z. B. Licht oxidiert zu werden und ein Jodmolekül (J₂) zu erzeugen. Um dies zu vermeiden, müssen die Reagen zien in einem kalten dunklen Raum gelagert werden.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Molecular Cloning: A La boratory Manual, Kapitel 14, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ist als ein Verfahren zur DNA-Amplifika tion bekannt mit dem man zum Gen-Test (zur genetischen Dia gnose) mit ultrahoher Empfindlichkeit in der Lage ist. Wenn die DNA-Amplifikation erfolgreich ist, besitzt die PCR das Potential zur mindestens 100 millionenfachen Amplifikation. Im Hinblick auf die Möglichkeit zur Amplifikation von sogar nur einem einzigen DNA-Molekül wird das Testergebnis jedoch beim Vorhandensein einer DNA (exogenen DNA), die in der PCR-Nucleinsäureprobe oder im PCR-Reagenz nicht anwesend sein sollte, nachteilig beeinträchtigt.

Eine Ursache für das Vorhandensein exogener DNA ergibt sich in dem Stadium, in dem Nucleinsäuren aus der vorliegenden Probe zur Präparation der PCR-Nucleinsäurprobe extrahiert werden. Dies betrifft auch das während der Nucleinsäureex traktion erzeugte Aerosol. Beim Proteinase K-/Phenol- oder beim AGPC-Verfahren wird sehr wahrscheinlich ein Aerosol er zeugt. Diese Verfahren beinhalten nämlich abgesehen von der Reagenzienzugabe zur Probe und von der Ausführung anderer Prozeduren wie dem Vermischen von Medien, außerdem zeitauf wendige Prozeduren, wie die Gewinnung der wäßrigen Phase durch Abtrennen. Die Aerosolpartikel haben einen Durchmesser von ungefähr 20 µm und ihr Volumen beträgt nur ungefähr 4×10^-6 µl. Wenn man z. B. einen an Hepatitis B leidenden Pati enten betrachtet, ergibt sich folgende Überlegung: In 1 µl Blut können ungefähr 10⁵ Viruspartikel enthalten sein. Somit kann ein Aerosolpartikel ein Viruspartikel enthalten. Mit anderen Worten, das Aerosol kann in der PCR, die zur Ampli fikation eines einzigen DNA-Moleküls in der Lage ist, ernst haften Schaden stiften. Deshalb gibt es einen Bedarf, die Anzahl der involvierten Verfahrensschritte zu vermindern.

Zur Verminderung der Aerosolbildung in einem PCR-Verfahren wurde in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 487 218 vorge schlagen, die PCR in einem hermetisch abgeschlossenen Zu stand, unter Verwendung eines interkalierenden Fluoreszenz farbstoffes (eines Fluorochroms) zur Quantifizierung einer Ziel-DNA in einer Probe durchzuführen. Das Problem, die Ae rosolbildung bei der Extraktion der Nucleinsäure aus der Probe zu reduzieren, bleibt jedoch bestehen.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, die vorstehend ge nannten Probleme der herkömmlichen Verfahren zur Nuclein säure-Extraktion zu beseitigen oder zu verringern.

Genauer gesagt besteht diese Aufgabe in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Extraktion von DNA und RNA, das leicht durchzuführen ist, eine geringere Anzahl von Schrit ten einschließt, fähig ist, die Möglichkeit einer Aerosol bildung zu verringern, innerhalb kurzer Zeit ausführbar ist, kein Phenol oder Chloroform verwendet und dennoch eine gleichbleibende Wirksamkeit bei der Extraktion von Nuclein säuren erreicht.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung eines Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:

(1) Vermischen der Probe mit einem Träger zur Erzeugung ei nes flüssigen Gemisches, wobei der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxyme thylcellulose ist;
(2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit dem Reagenz C, um Nucleinsäuren und Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocya nat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Na triumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein unter den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propylal kohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylal kohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B ent hält; und
(3) Separieren von ausgefällten Nucleinsäuren und Träger aus der flüssigen Phase.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereit stellung eines Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäuresequenz, das die Gefahr einer Aerosol-Kontamina tion vermeidet oder vermindert.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung eines Nachweisverfahrens gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:

(1) Vermischen der Probe mit einem Träger zur Erzeugung ei nes flüssigen Gemisches, wobei der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxyme thylcellulose ist;
(2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit dem Reagenz C, um Nucleinsäuren und Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocya nat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Na triumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propylalko hol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalko hol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B ent hält;
(3) Separieren von ausgefällten Nucleinsäuren und Träger aus der flüssigen Phase;
(4) Überführen der separierten Nucleinsäuren in DNA mittels einer reversen Transkriptionsreaktion, wenn es sich bei den separierten Nucleinsäuren um RNA handelt;
(5) Unterwerfen der entweder in Schritt (3) separierten oder in Schritt (4) erhaltenen Nucleinsäuren einer Polyme rase-Kettenreaktion in einer PCR-Lösung, die ein Gemisch der Nucleosidtriphosphate, eine Polymerase, ein interka lierendes Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde ent hält, die als Primer zur Amplifikation mindestens einer bestimmten Sequenz geeignet ist;
(6) Messen der Änderung der Fluoreszenzintensität als Folge der PCR bzw. der sich während der PCR ergebenden Ände rung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung; und
(7) Bestimmen (auf der Basis der Änderung der Fluoreszenzin tensität), ob eine Nucleinsäure mit der spezifizierten Sequenz in der Probe vorhanden war.

Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine Packung von Reagenzien zur Extraktion von Nucleinsäuren bereit, die von einander getrennt mindestens die folgenden Bestandteile ent hält:

(1) Einen mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose enthaltenden Träger; und
(2) ein Reagenz C, das mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylal kohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylal kohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalkohol ausge wähltes Reagenz B enthält.

Fig. 1 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach der PCR-Amplifikation von DNA des Hepati tis B-Virus (HBV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: HBV-reiches Serum, Spuren 3 und 4: HBV-armes Serum, Spur 5: HBV-freies Serum; die Bande a zeigt das PCR-Amplifikationsprodukt und die Bande b das Pri mer-Oligomer;

Fig. 2 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis C-Virus (HCV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: HCV-reiches Serum; Spuren 3 und 4: HCV-armes Serum; Spur 5: HCV-freies Serum;

Fig. 3 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der nachstehend aufgeführten unterschiedlichen Zusammensetzungen von Reagenz C extrahiert worden war; Spuren 1 und 2 (1): das Reagenz C enthält 2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natri umcitrat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): das Reagenz C enthält 2,4 M Kaliumthiocyanat, 15 mM Natriumci trat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): das Reagenz C enthält 2,3 M Guanidiniumhydrochlorid, 15 mM Na triumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;

Fig. 4 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Reagenz extrahiert worden war, wo bei die nachfolgend aufgeführten Zusammensetzungen von Rea genz B als Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spu ren 1 und 2 (1): 60% n-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): 60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 50% n-Butylal kohol; Spuren 7 und 8 (4): 60% n-Butylalkohol; Spuren 9 und 10 (5): 50% sek.-Butylalkohol; und Spuren 11 und 12 (6): 60% sek.-Butylalkohol;

Fig. 5 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von RNA des Hepatitis B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Reagenz C extrahiert worden war, wobei die nachfolgend aufgeführten Typen von Reagenz B als Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spuren 1 und 2 (1): 50% tert.-Amylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): 60% tert.-Amylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 60% tert.-Butylalkohol; Spuren 7 und 8 (4): 60% iso-Propylalkohol;

Fig. 6 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war, wobei Dextran in den betreffenden Tests in folgenden Mengen verwendet wurde: Spuren 1 und 2: 0 µg; Spuren 3 und 4: 2 µg; Spuren 5 und 6 : 4 µg; Spuren 7 und 8: 8 µg; Spuren 9 und 10: 16 µg; Spuren 11 und 12: 32 µg, Spuren 13 und 14: 64 µg;

Fig. 7 stellt eine Photographie und ein diese verdeulichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus analog zu Beispiel 3 unter Verwendung von Dextran oder Car boxymethylcellulose als Träger extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: Dextran; Spuren 3 und 4: Carboxymethylcellulose;

Fig. 8 stellt ein Paar von Diagrammen dar, in denen die Er gebnisse der Experimente von Beispiel 12 gezeigt sind. Eine Reaktionslösung einer PCR wurde vor (Fig. 8a) und nach (Fig. 8b) Nucleinsäureextraktion durch Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie untersucht. Die Elutionszeit ist (in Minu ten) auf den horizontalen Achsen und die relative Absorption auf den vertikalen Achsen aufgetragen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extrak tion von Nucleinsäuren (einzel- oder doppelsträngiger DNA und RNA) u Beispiele für DNA, die sich nach dem Verfahren ex trahieren läßt, schließen nicht nur genomische DNA ein, son dern auch Mitochondrien- oder Chloroplasten-DNA, und Bei spiele für RNA, die sich nach dem Verfahren extrahieren läßt, schließen nicht nur mRNA sondern auch tRNA und rRNA ein. Nucleinsäuren enthaltende Proben sind beispielsweise lebende Proben, wie Leukozytenzellen, gezüchtete Wirtszel len, die typischerweise durch Gen-Rekombinationstechnik her gestellte Vektoren usw. enthalten, Zellen, die mit Viren oder Phagen infiziert sind, Viren im Blut und Kulturen von Proben von Mikroorganismen. Die Kultur kann Mikroorganismen enthalten, aber der Kulturüberstand allein ist ausreichend. Nicht nur künstliche Kulturen sondern auch natürlich vorkom mende Kulturen sind verwendbar. Falls die Proben Klumpen von Mikroorganismen enthalten, kann man zum Erzielen einer hohen Extraktionseffizienz nötigenfalls homogenisieren oder mit Ultraschall behandeln.

Erfindungsgemäß können Nucleinsäuren aus den vorstehend be schriebenen Proben extrahiert werden. Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Extraktion amplifi zierter Nucleinsäuren aus einer PCR-Lösung in hoher Aus beute, so daß in den amplifizierten Nucleinsäuren keine En zyme oder niedermolekulare Desoxyribonucleosid-Triphosphate, Primer usw. enthalten sind.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in einem Vermischen der die Nucleinsäure enthaltenden Probe mit einem Träger. Ein Vermischen mit dem Träger unterstützt die Bildung eines größeren unlöslichen Materials durch ein Vernetzen von Nucleinsäuren und Träger im nachfolgenden Aus fällen von Nucleinsäuren und Träger durch Zugabe von Reagenz C. Dadurch läßt sich das nachfolgende Abtrennen des unlösli chen Materials in einer vereinfachten Weise vornehmen. Somit trägt die Verwendung des Trägers zu einer höheren Extrakti onseffizienz bei, als man ohne seine Verwendung erreichen würde.

Der Träger besitzt eine Affinität für die zu extrahierenden Nucleinsäuren und wird unlöslich, wenn er in Kontakt mit dem in Reagenz C enthaltenen Reagenz B gelangt. Da der Träger zusammen mit den Nucleinsäuren extrahiert wird, sollte er nicht die spezifische Verwendung der extrahierten Nuclein säuren wie die Reaktion mit einem Restriktionsenzym, die re verse Transkriptionsreaktion oder die PCR beeinträchtigen. Der erfindungsgemäß zu verwendende Träger ist mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethyl cellulose. Diese Träger erweisen sich als zufriedenstellend wirksam, unabhängig davon, ob sie einzeln oder als Mischun gen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sie weder die reverse Transkriptionsreaktion, die PCR oder irgend eine andere gewünschte Reaktion beeinträchtigen. Glycogen und andere herkömmliche Träger werden durch Amylase oder andere Enzyme, die in der Probe, wenn es sich bei die ser um Serum oder Blut handelt, vorhanden sind, abgebaut, mit dem Ergebnis, daß sich die Effizienz der Nucleinsäureex traktion vermindert. Im Gegensatz dazu wird der erfindungs gemäß verwendete Träger nicht abgebaut, und dementsprechend ergibt sich keine Verminderung der Effizienz der Nucleinsäu reextraktion.

Im allgemeinen wird der Träger in Mengen von ungefähr 0,01 bis 1000 µg, bevorzugt ungefähr 0,1 bis 100 µg pro 10 µl Probenvolumen verwendet. Der Träger kann in einem Gefäß vor gelegt werden, bevor die Probe hineingegeben wird. Alterna tiv kann die Probe vor Zugabe des Trägers in das Gefäß gege ben werden. Der Träger kann durch Gefrier- oder Lufttrocknen in eine feste Substanz überführt werden.

Im nächsten Schritt wird zum flüssigen Gemisch von Probe und Träger das Reagenz C gegeben, und die Bestandteile werden vermischt, um Träger und Nucleinsäuren auszufällen. Das Rea genz C enthält mindestens ein aus den Substanzen Guanidini umthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propanol, n-Butylal kohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amyl alkohol ausgewähltes Reagenz B.

Das Reagenz C kann außerdem andere Reagenzien enthalten. Zum Beispiel: ein zur Unterdrückung des Nucleinsäureabbaus ge eignetes Puffer-Mittel; ein Chelatisierungsmittel, das zur Hemmung der Aktivität von Nucleasen (Desoxyribonucleasen) fähig ist, wie z. B. Natriumcitrat oder EDTA; ein Reduktions mittel zum Erreichen einer wirksameren Denaturierung und So lubilisierung von Proteinen, Lipiden usw., wie z. B. Dithio threit oder β-Mercaptoethanol, die Disulfidbindungen redu zieren und eine grenzflächenaktive Substanz, wie z. B. ein Sarkosylsalz oder Triton, um eine wirksamere Solubilisierung von Proteinen usw. zu erreichen. Ein geeignetes Puffermittel kann zur Einstellung des pH-Wertes von Reagenz C auf den Be reich von 4 bis 9, bevorzugt von 5 bis 8 zugegeben werden, um so den Abbau von Nucleinsäuren zu verhindern, wodurch eine weitere Verbesserung der Effizienz ihrer Extraktion er reicht wird.

Im erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren wird mindestens eine der Verbindungen Guanidiniumthiocyanat, Guanidinium hydrochlorid, Kaliumthiocyanat oder Natriumthiocyanat als Reagenz A verwendet. Diese Verbindungen brechen die Zellmembran oder die Zellwand auf und denaturieren das Protein im Komplex. Sie sind außerdem fähig, das denaturierte Protein, das sich entweder als Ergebnis des Denaturierens des Proteins im Komplex oder wegen des begleitenden Reagenz B bildet, zu solubilisieren. Gleichzeitig sind die Verbindungen fähig, die Aktivität von Nucleasen (Desoxyribonucleasen und Ribonucleasen), die sich in der Probe befinden mögen, zu unterdrücken. Das erfindungsgemäß verwendete Reagenz A besitzt in hohem Maße die Fähigkeit sowohl allein als auch in Kombination zweier oder mehrerer Substanzen Proteine zu solubilisieren, ohne dabei irgendwelche störenden Reaktionen zu verursachen. Es macht daher eine hohe Effizienz der Nucleinsäure-Extraktion möglich. Allgemein bekannte proteindenaturierende Mittel wie Natriumjodid, Kaliumjodid, Kaliumbromid, Natriumbromid und Harnstoff sind nicht derartig wirksam, Proteine usw. zu solubilisieren; andererseits verursachen Guanidiniumsulfat, Guanidiniumcarbonat usw. Proteinaggregation usw. und sind daher nicht fähig, Nucleinsäuren mit hoher Effizienz zu extrahieren.

Erfindungsgemäß wird mindestens eine der Substanzen n-Propa nol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol oder tert.-Amylalkohol als Reagenz B ver wendet. Wenn man ein Gemisch von zwei oder mehr Alkoholen verwendet, kann man ein vorteilhaftes Verhältnis der Alko hole durch Vorexperimente bestimmen. Das erfindungsgemäße Reagenz B besitzt eine hohe Löslichkeit in Wasser und geht nicht ohne weiteres eine Phasentrennung mit Wasser ein. Die Verwendung von Reagenz B bietet daher den Vorteil, daß das Abtrennen von gefällten Nucleinsäuren und Träger aus der wäßrigen Phase in einfacher Weise ausführbar ist. Das bedeu tet letzten Endes, daß sich die Ausbeute der gefällten Nucleinsäuren im letzten Schritt des Verfahrens erhöhen läßt.

Die Konzentration der Reagenzien A und B in Reagenz C kann man in solch einer Weise einstellen, daß bei Zugabe von Rea genz C zu der den Träger enthaltenden Probe Proteine, Lipide usw. gelöst bleiben, Nucleinsäuren und der Träger aber ge fällt werden. Besonders bevorzugte Konzentrationen zur Ver besserung der Extraktionseffizienz sind solche, bei denen die Endkonzentration des Reagenz wie es zur Probe zugegeben wird, für Reagenz A im Bereich von 1,5 bis 4,5 M und für Reagenz B im Bereich von ungefähr 40 bis 80% liegt.

In dem Fall, daß das Reagenz C z. B. Guanidiniumthiocyanat als Reagenz A und iso-Propylalkohol als Reagenz B enthält, liegen die Konzentrationen für eine besonders hohe Effizienz der Nucleinsäure-Extraktion so, daß die Endkonzentration von Reagenz A nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 2 bis 3 M liegt, wohingegen die Endkonzentration von Reagenz B nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 45 bis 55% liegt. Wenn die Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat geringer als 1,5 M ist, können die in der Probe enthaltenen Proteine, Lipide usw. nicht voll solubilisiert werden. Zur Erhöhung der Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat über 4,5 M muß der Anteil von Reagenz A im Reagenz C erhöht wer den. Dann neigt aber das Reagenz A dazu, unlöslich zu wer den, wodurch Schwierigkeiten bezüglich einer geeigneten Zube reitung einer Probe entstehen. Wenn die Endkonzentration von iso-Propylalkohol unter 40% liegt, können Träger und Nucleinsäuren nicht vollständig gefällt werden. Wenn die Endkonzentration von iso-Propylalkohol 80% überschreitet, ist es schwierig, eine Guanidiniumthiocyanat-Konzentration sicherzustellen, die ausreicht, Proteine, Lipide usw. voll ständig zu solubilisieren. Ferner wird die Verdampfung von iso-Propylalkohol problematisch. Deshalb werden die Reagen zien erfindungsgemäß bevorzugt in den vorstehend angegebenen Konzentrationsbereichen verwendet.

Eine geeignete Menge zur Zugabe von Reagenz C liegt beim 2- bis 10fachen des Probenvolumens, wenn es sich bei der Probe um Serum handelt. Wenn die Probe jedoch hohe Konzentrationen von Proteinen, Lipiden usw. aufweist, wird das Reagenz C be vorzugt in einer größeren Menge als dem 10fachen Probenvo lumen zugegeben, um eine vollständige Solubilisierung von Proteinen, Lipiden usw. zu gewährleisten.

Durch die vorstehend beschriebenen Schritte werden Träger und Nucleinsäuren in der Probe gefällt. Anschließend werden die so gefällten Nucleinsäuren und der Träger durch herkömm liche Abtrennungsverfahren wie Zentrifugation oder Filtra tion von der wäßrigen Phase abgetrennt, die die Proteine usw. enthält. Im Falle einer Zentrifugation können die Nucleinsäuren als Sediment am Boden des Gefäßes gewonnen werden. Im Falle einer Filtration können die Nucleinsäuren auf der Filtermembran erhalten werden. Bei der Filtermembran kann es sich um einen Typ handeln, der Poren mit einer Größe von ungefähr 0,1 bis 10 µm besitzt.

Die separierten Nucleinsäuren kann man als solche in einer Reihe von Tests und in gentechnologischen Experimenten ein setzen. Bevorzugt werden sie aber vor der Verwendung gewa schen. Ein Vor-Waschen ist besonders wirksam, wenn man die separierten Nucleinsäuren einer Enzymreaktion (z. B. einer Restriktionsenzym-Reaktion, einer reversen Transkriptionsre aktion oder einer PCR) unterwirft, und in allen anderen Fäl len, in denen das Reagenz A oder etwas ähnliches, das in ge ringem Maße im Präzipitat enthalten ist, die Enzymaktivität, inhibiert. Hier sei ein spezifisches Beispiel gegeben: zu dem durch Zentrifugation oder Filtration erhaltenen Präzipi tat wird eine ein Salz und einen Alkohol enthaltende Lösung gegeben und mit dem Präzipitat vermischt. Das Gemisch wird dann einer weiteren Zentrifugation oder Filtration unterwor fen. Verglichen mit einem bloßen Waschen des Präzipitates mit destilliertem Wasser oder ähnlichem, weist das Waschen mit einer Salz/Alkohol enthaltenden Lösung den Vorteil auf, daß es dazu beiträgt, von der Oberfläche des Sedimentes un erwünschte Substanzen, wie das Reagenz A oder restliche Pro teine wirksam zu entfernen. Als Salz in der Waschlösung kön nen z. B. Kaliumchlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat in Mengen von ungefähr 0,05 bis 0,5 M verwendet werden. Bei spiele für Alkohole schließen Ethanol (der in Mengen von mindestens 50%, bevorzugt von 60 bis 80% enthalten sein kann) ebenso ein, wie n-Propylalkohol und iso-Propylalkohol (die in einer Menge von mindestens 30%, bevorzugt von 40 bis 60% enthalten sein können).

Falls es speziell notwendig sein sollte, jedes restliche Protein aus dem Präzipitat zu entfernen, kann man die nach folgende Prozedur anwenden: Zuerst wird zum Präzipitat wie der eine Lösung gegeben, die das Reagenz A, wie es vorste hend spezifiziert wurde, enthält, um so die Proteine zu so lubilisieren. Dann wird eine Lösung zugegeben, die das Rea genz B, wie es vorstehend spezifiziert wurde, enthält, und das Gemisch wird einer Zentrifugation oder Filtration unter worfen. Selbstverständlich können die Schritte 2 und 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens einfach wiederholt werden. Wenn sehr kleine Nucleinsäuremengen extrahiert werden, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die Probe auf geeignete Weise bei einer niedrigen Temperatur gehalten, z. B. dadurch, daß die Gesamtprozedur in einem Kühlraum vorgenommen wird.

Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die so extrahierten Nucleinsäuren daraufhin untersucht, ob sie eine bestimmte Sequenz, z. B. solch eine, wie sie in He patitis B-Virus oder Hepatitis C-Virus vorkommt, enthalten, die sie von anderen Nucleinsäuren unterscheidbar macht und die Erfindung stellt ein Nachweisverfahren bereit, bei dem die im allgemeinen als PCR-Reaktion bezeichnete Technik der DNA-Amplifikation Anwendung findet; siehe diesbezüglich: Eu ropäischen Patentanmeldung Nr. 487 218.

Wenn es sich bei den in vorstehender Weise separierten und vorzugsweise gewaschenen Nucleinsäuren um RNA handelt, wird diese zunächst erfindungsgemäß durch eine reverse Transkrip tionsreaktion in DNA überführt. Dies ist z. B. beim Hepatitis C-Virus, dessen Genom aus RNA besteht, der Fall. Erfindungs gemäß wird RNA vor dem nachstehend beschriebenen Amplifika tionsschritt in amplifizierbare DNA überführt, um so die PCR zur DNA-Amplifikation verwenden zu können. Dieser Schritt läßt sich durch DNA-Synthese mittels der gewöhnlichen rever sen Transkriptionsreaktion erreichen, wobei die separierte RNA als Matrize verwendet wird.

Im nächsten Schritt werden die separierten Nucleinsäuren oder die Nucleinsäuren, die durch eine reverse Transkripti onsreaktion im früheren Schritt erhalten worden waren, einer PCR in einer PCR-Lösung unterworfen, die ein Gemisch von Nucleosidtriphosphaten, eine Polymerase, ein interkalieren des Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde enthält, die mindestens zur Amplifikation der spezifizierten Sequenz ge eignet ist. Die Oligonucleotid-Sonde in der PCR-Lösung be steht aus zwei oder mehr Oligonucleotiden, die eine ge eignete Zahl von Basen aufweisen. Sie sind zur Herstellung von DNA-Fragmenten, die die spezifizierte Sequenz enthalten, wenn die PCR fortschreitet, notwendig und sie liegen in den schließlich hergestellten DNA-Fragmenten an den 5′-Enden. Eine geeignete oligonucleotid-Sonde läßt sich entsprechend der spezifizierten nachzuweisenden Sequenz auswählen.

Beispiele für das erfindungsgemäß verwendete interkalierende Fluorochrom sind Ethidiumbromid, Acridinorange, Bisbentimid, Diaminophenylindol, Actinomycin, Thiazol, Chromomycin und Derivate dieser Substanzen. In der PCR selbst besteht ein Zyklus aus den nachfolgenden Verfahrensschritten: Die 3′-terminalen Anteile der spezifizierten und der dazu komplementären Sequenz werden mit den betreffenden komple mentären Oligonucleotid-Primern hybridisiert. Dann wird eine Reaktion zur Verlängerung der Primer in 5′ 3′-Richtung mittels einer Polymerase vorgenommen. Anschließend wird der resultierende Doppelstrang dissoziiert. Dieser Zyklus kann so oft wiederholt werden, wie es geeignet erscheint.

Die Änderung der Fluoreszenzintensität in der PCR-Lösung wird entweder nach oder während der PCR gemessen. Da das in terkalierende Fluorochrom infolge seines Einbaus in die dop pelsträngige DNA eine Änderung seiner Fluoreszenzcharakteri stik eingeht, gibt die Änderung der Fluoreszenzintensität zwischen Beginn und Ende der PCR oder die Änderung während der PCR einen Hinweis darauf, ob die separierte DNA oder RNA die spezifizierte Sequenz besitzt.

Wenn das vorstehend beschriebene Nachweisverfahren angewandt wird, besteht keine Notwendigkeit, zusätzliche Mengen des Reagenz hinzuzufügen, nachdem die PCR einmal begonnen hat. Deshalb wird in der Praxis die PCR-Lösung zuerst in ein Ge fäß gegeben, dann werden die extrahierten Nucleinsäuren oder die Nucleinsäuren, die man aus diesen Nucleinsäuren mittels der reversen Transkriptionsreaktion erhält, zugegeben. Da nach wird das Gefäß verschlossen, und die Schritte der PCR und die Messung der Fluoreszenzintensität werden in einem hermetisch abgeschlossenen Zustand durchgeführt. Dadurch läßt sich die Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung eines Ae rosols weiter vermindern.

Dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung gemäß stellt die Erfindung ferner eine Reagenzienpackung zur Durchführung des auf den vorangegangenen Seiten beschriebenen Nuclein säure-Extraktionsverfahrens bereit. Diese Reagenzienpackung enthält Träger und Reagenz C, die ebenfalls vorstehend be schrieben wurden. Träger und Reagenz C werden bis zur Ver wendung getrennt voneinander gehalten. Dies kann man z. B. dadurch erreichen, daß der Träger und das Reagenz C in getrennten Behältern gehalten werden, wobei der Träger im festen Zustand und das Reagenz C im flüssigen Zustand vor liegen.

Die Reagenzienpackung kann wahlweise ein Reaktionsgefäß ent halten, das aus einem geeigneten Plastikmaterial hergestellt ist und das einen Reaktionsraum zur Ausführung des erfin dungsgemäßen Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren (erster Aspekt der Erfindung) oder des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäurese quenz (zweiter Aspekt der Erfindung) bereitstellen kann. Wenn es einen Bedarf gibt, nicht nur Nucleinsäuren zu extra hieren, sondern außerdem eine bestimmte Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, enthält die Reagenzienpackung bevorzugt ein hermetisch verschließbares Reaktionsgefäß.

Der Vorteil der Reagenzienpackung besteht darin, daß man, wenn der Träger in einer geeigneten Form, z. B. als gefrier getrocknetes Pulver, im Reaktionsgefäß vorgelegt wurde, nur noch die zu untersuchende Probe und dann das Reagenz C zum Röhrchen zugeben muß, um das Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und, falls gewünscht, zum Nachweis einer spe zifizierten Nucleinsäuresequenz zu beginnen.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern.

Beispiel 1 Extraktion aus gezüchteten Zellen

Hybridomzellen von Maus-Myelomzellen und Lymphozytenzellen von Mäusen, die mit CEA (cancer embryonic antigen, embryona les Krebsantigen) sensibilisiert worden waren, wurden in ei nem DMEM-Medium gezüchtet. Beim Erreichen einer Dichte von CEL-Zellen von 4×10⁵ pro ml Kulturlösung wurden 100 µl der Lösung in ein 0,5 ml großes Probenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde 1 Minute bei 7000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Präzipitat wurde in 20 µl DMED-Medium aufgenommen. Zur Suspension wurde 1 µl (10 µg) Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und gemischt. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso- Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden gerührt. Nachfolgend wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren sedimentiert wur den. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben. Zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, gegeben. Es wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Über stand wurde verworfen. Das Präzipitat wurde nach dem fluoro metrischen Verfahren von Kissane und Robins (J. Biol. Chem., 233 (1958), 184) zur Bestimmung der DNA-Menge untersucht. Das Präzipitat wurde außerdem einer Veraschungsbehandlung unterzogen, und eine Phosphorbestimmung (Anal. Chem. 28 (1956), 1756) wurde zur Messung der Gesamtnucleinsäuremenge (DNA + RNA) im Präzipitat vorgenommen. Die RNA-Menge wurde durch Subtrahieren der DNA-Menge von der Gesamtmenge von Nucleinsäuren (DNA + RNA) berechnet.

Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren von derselben Probe sowohl nach dem Proteinase K-/Phenol- als auch nach dem AGPC-Verfahren extrahiert.

Das Proteinase K-/Phenol-Verfahren wurde nach der Prozedur von Keller, G.H. et al. (Anal. Biochem., 170 (1988), 441-450) durchgeführt. Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (150 mM Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 2% SDS und 250 µg/ml Proteinase K) in einem Proberöhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 M¹ einer Zellsuspension gegeben. Das Gemisch wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. An schließend wurde 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 60 µl einer Lösung (Phenol/Chloroform/iso- Amylalkohol = 25 : 24 : 1) hinzugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurde 10 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Ein Teil (40 µl) des Überstandes (wäßrige Phase) wurden entnommen und mit 8 µl 4 M Kaliumace tat versetzt. Danach wurden 10 µg (1 µl) Glycogen und 50 µl iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Danach wurde es 30 Minuten bei -20°C gehalten. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 75%iger Ethanol wurden zum Prä zipitat gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Nach 20minütiger Zentrifugation bei 4°C wurde der Überstand ver worfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.

Das AGPC-Verfahren wurde gemäß der Prozedur von Chomczyinski, P. et al. (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) durchgeführt. Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (6 M Guanidiniumthiocya nat, 37,5 mM Natriumcitrat, 0,75% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 0,15 M 2-Mercaptoethanol) in einem Teströhrchen mit ei nem Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 µl einer Zellsuspen sion gegeben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Da nach wurden 6 µl 2 M Natriumacetat (pH 4) zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurden 60 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Im nächsten Schritt wurden 12 µl einer Lösung (Chloroform/iso-Amylalkohol = 49 : 1) zugege ben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann wurde das flüssige Gemisch 15 Minuten in Eiswasser gekühlt und bei 4°C 20 Minuten mit 15 000 UpM zentrifugiert. Ein Teil (60 µl) des Überstandes (wäßrige Phase) wurde entnommen und mit 60 µl iso-Propylalkohol vermischt. Das Gemisch wurde gerührt und 1 Stunde bei -20°C gekühlt. Danach wurde der Überstand verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 75%iger Ethanol gegeben und anschließend wurde gerührt. Im letzten Schritt wurde das Gemisch 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben. Die in den beiden herkömmlichen Verfahren erhaltenen Präzipitate wurden nach der vorstehend bereits beschriebenen Prozedur analysiert. Die Analyseergeb nisse sind nachstehend in Tabelle I gezeigt. Aus Tabelle I geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren den beiden herkömmlichen Verfahren bezüglich der Extraktionseffizienz überlegen ist.

Tabelle I

Beispiel 2 Extraktion aus E. coli

E. coli (JM 109) wurde in L-Nährmedium gezüchtet. Beim Er reichen einer Dichte von E. coli-Zellen von 2×10⁸ pro ml Kulturlösung wurde 1 ml der Lösung in ein 1,5 ml Probenröhr chen gegeben und 1 Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Präzipitat wurde in 50 µl L-Nährmedium suspendiert. Zur Suspension wurden 2 µl (20 µg) Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und damit vermischt. Da nach wurden 250 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Danach wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zen trifugiert, um die Nucleinsäuren zu sedimentieren. Der Über stand wurde verworfen und 250 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge geben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben Die DNA-Menge und die Gesamtmenge von Nucleinsäuren (DNA + RNA) wurden analog zu Beispiel 1 gemessen, und die RNA-Menge wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt.

Tabelle II

Beispiel 3 Extraktion von Hepatitis B-Virus-DNA

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ und 20 µl Serum von Patienten mit Heptatis B wurden zusammen in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden ge rührt. Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren in das Sediment gebracht. Der Überstand wurde verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, gege ben. Danach wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.

Zum Präzipitat wurden 25 µl eines PCR-Reagenz (Takara Shuzo Co., Ltd.) gegeben und eine PCR wurde über 40 Cyclen unter Verwendung eines DNA-Thermal-Cyclers (PCR-Maschine, Perkin- Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen Primer wurden zur spezifischen Amplifikation von Hepatitis B-Virus (HBV) spezifischen Nucleinsäuren verwendet und die PCR-Bedingungen waren wie folgt:

Schritte eines Zyklus

Basensequenzen der Primer
5′-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3′
5′-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3′

Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 ge zeigt.

Beispiel 4 Extraktion von RNA des Heptatis C-Virus

1 µl Dextran (10 µg) mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren sedimentiert. Der überstand wurde gefällt, und 100 µl 40%-iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurden zum Präzipitat gegeben. Danach wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu ren im Präzipitat verblieben.

Das Präzipitat wurde mit 10 µl eines Reagenz für die reverse Transkription (Takara Shuzo Co., Ltd.) versetzt und darin gelöst. Danach wurde eine reverse Transkriptionsreaktion mit einem DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend angegeben.

Anschließend wurden zu 5 µl der Lösung der reversen Tran skriptionsreaktion 20 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde über 40 Zyklen unter Verwendung eines DNA-Thermal- Cyclers (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen Primer wurden zur spezifischen Amplifikation von Nucleinsäuren des Hepatitis C-Virus (HCV) verwendet. Die Bedingungen für die PCR sind nachfolgend angegeben:

Schritte des Zyklus

Basensequenzen der Primer
5′-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3′
5′-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3′

Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 ge zeigt.

Beispiel 5 Extraktion von RNA des Hepatitis C-Virus

2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml gegeben. Danach wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden ge rührt. Durch 3minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren sedimentiert. Die Überstände wurden ver worfen und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Ka liumchlorid enthielt, wurde zum Sediment gegeben. Anschlie ßend wurde ca. 20 Sekunden gerührt und 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.

Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse Transkription vermischt und darin gelöst. Danach wurde eine reverse Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4 durchge führt. Anschließend wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl der Reaktionslösung der reversen Transkription vermischt, und die PCR wurde analog zu den in Beispiel 4 genannten Be dingungen durchgeführt.

Zum Vergleich wurde Nucleinsäure nach dem Natriumjodid-Ver fahren (Ishizawa, M. et al. in Nucleic Acid Res. 19 (20) (1991), 5792) extrahiert. Zuerst wurden 100 µl Serum von Pa tienten mit Hepatitis C in Teströhrchen mit einem Fassungs vermögen von je 1,5 ml gegeben. Dann wurden 300 µl eines Reagenz, das 6 M NaJ, 13 mM EDTA, 0,5% Natrium-N-Lauroyls arcosin, 10 µg Glycogen und Tris-HCl (pH 8) enthielt, zuge geben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. An schließend wurde 15 Minuten bei 60°C inkubiert. Danach wur den 400 µl iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden gerührt und anschließend 15 Minu ten stehengelassen. Dann wurde die Lösung 5 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Im nächsten Schritt wurde 1 ml 40%iger iso-Propylalkohol zu gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und anschließend 5 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Nucleinsäuren befanden sich im Präzipitat. Das Präzipitat wurde einer reversen Tran skriptionsreaktion und einer PCR unter denselben Bedingun gen, wie sie im vorstehenden Absatz beschrieben wurden, un terworfen. Nach Beendigung der PCR wurden 4 µl der Reakti onslösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einem von Tosoh Corp. hergestellten Apparat untersucht. Die Säule enthielt das TSK-Gel G4000SW zur Gel-Permeations- Chromatographie und der Nachweis durch UV-Absorption wurde bei 260 nm mit einem UV 8000 (Tosoh Corp.), durchgeführt. Das Elutionsmittel war Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) und die Flußrate betrug 1 ml/Minute. Die Analyseergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. Das erfindungsgemäße PCR-Amplifi kationsprodukt wurde in einer Menge von durchschnittlich 26 ng pro 10 µl PCR-Lösung nachgewiesen. Wenn nach dem Natri umjodid-Verfahren gearbeitet wurde, konnten demgegenüber nur 3 ng des Amplifikationsproduktes nachgewiesen werden.

Tabelle III

Beispiel 6 Extraktion von DNA des Hepatitis B-Virus

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B parallel in einer Reihe von Probenröhrchen, von denen jedes ein Fassungsvermögen von 0,5 ml aufwies, gegeben. Zu den Proben wurden verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) gegeben und damit vermischt:

(1) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;
(2) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Kaliumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol; und
(3) 100 µl Reagenz C, enthaltend 3,2 M Guanidiniumhydrochlo rid, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol.

Nach Zugabe dieser unterschiedlichen Zusammensetzungen von Reagenz C und dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat gelangten. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40% iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zuge geben. Dann wurde 20 Sekunden gerührt, das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Nucleinsäuren befanden sich weiter im Präzipitat. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3 einer PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektropho rese durchgeführt und die optischen Dichten der betreffenden produzierten Banden miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Die Lösungen, die die Zusammenset zungen (1) bis (3) des Reagenz C enthielten, produzierten offensichtlich Banden mit vergleichbaren Intensitäten.

Beispiel 7 Extraktion von DNA des Hepatitis B-Virus

Je 1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden gemeinsam mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepa titis B in eine Reihe von Probenröhrchen mit einem Fassungs vermögen von je 0,5 ml gegeben. Verschiedene Zusammensetzun gen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und damit vermischt:

(1) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% n-Propylalkohol;
(2) 100 µl Reagenz c, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol;
(3) 80 µl Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocyanat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38% Na trium-N-Lauroylsarcosin und 50% n-Butylalkohol;
(4) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% n-Butylalkohol;
(5) 80 µl Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocyanat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38% Na trium-N-Lauroylsarcosin und 50% sek.-Butylalkohol; und
(6) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% sek.-Butylalkohol.

Nach Zugabe dieser verschiedenen Zusammensetzungen von Rea genz C und nach dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipi tat gebracht wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Es wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. Da nach wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu giert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nuclein säuren weiter im Präzipitat verblieben. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3, einer PCR unter worfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektrophorese durch geführt und die optischen Dichten der betreffenden Banden verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die die Zusammensetzungen (1) bis (6) von Reagenz C enthaltenden Lösungen zu Banden vergleichbarer Intensitäten führten.

Beispiel 8 Extraktion von Virus DNA von Hepatitis B-Virus

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B in eine Reihe von Probenröhrchen mit jeweils 0,5 ml Fassungsvermögen gegeben. Verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und da mit vermischt:

(1) 80 µl von Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocya nat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38 Natrium-N-Lauroylksarcosin und 50% tert.-Amylalkohol;
(2) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Laroylsarcosin und 60% tert.-Amylalkohol;
(3) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% tert.-Butylalkohol; und
(4) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol.

Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Pro pylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, zugegeben. Dann wurde 20 Sekunden gerührt. Danach wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat ver blieben. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3 einer PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektrophorese durchgeführt und die optischen Dichten der betreffenden Banden miteinander verglichen. Die Ergeb nisse sind in Fig. 5 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die die verschiedenen Zusammensetzungen von Reagenz c enthalten den Lösungen zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führ ten.

Beispiel 9 Extraktion von RNA des Hepatitis C-Virus

Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml wurden mit 0, 0,5, 1, 2 und 5 µl (0, 5, 10, 20 und 50 µg) einer Acrylamidlösung (Molekulargewicht ungefähr 0,7×10⁵) bzw. 2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ beladen. Weiterhin wurden je 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in die Röhrchen gegeben und die Gemische ca. 5 Sekunden gerührt. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Gua nidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propyl alkohol) zugegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verwor fen, und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kali umchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat gegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifu giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu ren weiter im Präzipitat verblieben.

Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse Transkription versetzt und darin gelöst. Die Lösung wurde einer reversen Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4 unterworfen. Danach wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl Reaktionslösung (der reversen Transkription) vermischt und analog zu Beispiel 4 wurde eine PCR durchgeführt. Nach Been digung der PCR wurden 10 µl der Reaktionslösung durch Hoch auflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 untersucht. Die Analy seergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV beschrie ben.

Tabelle IV

In Abwesenheit von mit einer Nucleinsäure copräzipitierendem Acrylamid, wurde keine Hepatitis C-Virus-RNA extrahiert, weshalb kein PCR-Amplifikationsprodukt nachweisbar war. Bei einer Zugabe von Acrylamid in Mengen von 20 µg oder mehr wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca. 35 ng nachgewiesen. Bei Zugabe von 20 µg Dextran wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca. 44 ng nach gewiesen.

Beispiel 10 Extraktion von DNA des Hepatitis B-Virus

Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 4 extrahiert und ei ner PCR unterworfen, wobei aber Dextran (mit einem Moleku largewicht von 5×10⁵) in variierenden Mengen von 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 und 6,4 µl (0, 2, 4, 8, 16, 32 und 64 µg) zugegeben wurde. Nach Ende der PCR wurde eine Elektrophorese durchgeführt und die optischen Dichten der Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Es ist offensicht lich, daß beim Fehlen von mit Nucleinsäuren copräzipitieren dem Dextran keine Hepatitis B-Virus-DNA extrahiert und des halb keine Bande nachgewiesen wurde. Wenn Dextran in Mengen von 16 µg oder mehr zugegeben wurde, waren die Intensitäten der Banden nahezu miteinander vergleichbar.

Beispiel 11 Extraktion von DNA des Hepatitis B-Virus

Analog zu Beispiel 3 wurden Nucleinsäuren extrahiert und ei ner PCR unterworfen. Dabei wurde aber Dextran durch Carboxy methylcellulose (Produkt von SIGMA, niedrige Viskosität) er setzt. Diese wurde in einer Menge von 1 µl (10 µg) verwen det. Nach Beendigung der PCR wurde eine Elektrophorese durchgeführt, und die optischen Dichten der Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die Bandenintensitäten miteinander nahezu vergleichbar waren, wenn Dextran bzw. Carboxymethylcellulose als Träger verwendet wurden (als Referenz ist das Ergebnis der Extrak tion bei Verwendung von Dextran in Fig. 7 ebenfalls ge zeigt).

Beispiel 12 Anwendung auf das PCR-Produkt

Teströhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 1,5 ml wurden mit 2 µl (2 µg) einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) beladen. Dazu wurden 20 µl HBV-PCR-Reaktionslösung und 80 µl Wasser gegeben und miteinander vermischt. An schließend wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM β-Mercaptoethanol und 60% iso-Propylalkohol) zugefügt. Nach 20 Sekunden Rüh ren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Propylalko hol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat gegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Auflösen wurden dann 20 µl Wasser zum Präzipitat gegeben.

Die PCR-Lösung (10 µl) wurde sowohl vor als auch nach der Extraktion von Nucleinsäuren durch Hochauflösungs-Flüssig keits-Chromatographie analog zu Beispiel 5 mit einem Apparat von Tosoh Corp. analysiert. Die Säule enthielt das TSK-Gel G3000SW für die Gel-Permeations-Chromatographie.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt, aus der sich ersehen läßt, daß sowohl das PCR-Amplifikationsprodukt als auch das Primer-Oligomer in Ausbeuten von beinahe 100% wiedergewon nen werden. Es wird außerdem deutlich, daß sowohl der Primer als auch die Desoxyribonucleosid-Triphosphate entfernt wor den waren.

Beispiel 13 PCR unter Verwendung extrahierter Nucleinsäuren

2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Sekunden gerührt und dann 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Über stand wurde verworfen und 20 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Danach wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Präzipi tat wurden 50 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt.

Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren nach dem Natri umjodid-Verfahren (Ishizawa, M. et al., in Nucleic Acid Res. 19(20) (1991), 5792) analog zu Beispiel 5 extrahiert, und eine PCR wurde in der gleichen Weise, wie sie gerade vorste hend beschrieben wurde, durchgeführt. Nach Beendigung der PCR wurden 10 µl Reaktionslösung durch Hochauflösungs-Flüs sigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Apparates von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 analysiert.

Die Analyseergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Das erfin dungsgemäß erhaltene PCR-Amplifikationsprodukt wurde in ei ner Menge von durchschnittlich 7,5 ng pro 10 µl PCR-Lösung nachgewiesen, wohingegen nur 4,3 ng des nach dem Natriumjo didverfahren erhaltenen Amplifikationsproduktes nachgewiesen werden konnten. Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse zeigen den Mittelwert von 4 Proben.

PCR-Amplifikationsprodukt (ng)
Erfindung
7,5
Natriumjodid-Verfahren	4,3

Beispiel 14

Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml wurden jeweils mit einem der nachfolgenden Träger bela den:

(1) 2 µl (20 µg) Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵);
(2) 1 µl (10 µg) Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) und 1 µl (10 µg) Acrylamid (Molekulargewicht 7×10⁵);
(3) 1 µl (10 µg) Acrylamid (Molekulargewicht 7×10⁵) und 1 µl (10 µg) Carboxymethylcellulose (Produkt von SIGMA; niedrige Viskosität).

Weiterhin wurden in die Röhrchen 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Pro pylalkohol) gegeben, und die Gemische wurden ca. 20 Sekunden gerührt. Durch 3 Minuten Zentrifugation bei 15 000 UpM wur den die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt. Der Über stand wurde verworfen und 200 µl 40%-iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge geben. Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben.

Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und eine PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Vervoll ständigung der PCR, wurde analog zu Beispiel 5 die PCR-Lö sung durch Hochauflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von Tosoh Corp. analysiert. Die Analyseergeb nisse sind nachstehend in Tabelle VI gezeigt. Es ist offen sichtlich, daß ein einzelner Träger und ein Gemisch von zwei Trägern zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führten. Die Ergebnisse der Tabelle VI geben einen Mittelwert von 4 Proben wieder.

Träger
PCR-Amplifikationsprodukt (ng)
Dextran
37
Dextran und Acrylamid	33
Acrylamid und Carboxymethylcellulose	37

Beispiel 15

Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 0,5 ml wurden mit je 2 µl (20 µg) einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) beladen. In die Röhrchen wurden außerdem 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B gegeben. Verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und damit vermischt:

(1) 500 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;
(2) 500 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 30% iso-Propylalkohol und 30% tert.-Butylalkohol.

Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach dem Vermischen wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, um die Nucleinsäuren in das Präzipitat zu überführen. Der Überstand wurde verworfen, und 200 µl 40%-iger iso-Propylal kohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben.

Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Beendigung der PCR, wurde die PCR-Lösung analog zu Beispiel 5 durch Hoch druck-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von To soh Corp. analysiert. Die Analyseergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII gezeigt. Wenn das Reagenz C nur iso-Propylalkohol enthielt, wurde das PCR-Amplifikationspro dukt in einer Menge von durchschnittlich 42 ng pro 10 µl PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Wenn das Reagenz C iso- Propylalkohol und tert.-Butylalkohol enthielt, wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von durchschnitt lich 33 ng pro 10 µl PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Die in Tabelle VII gezeigten Ergebnisse geben die Mittelwerte von 2 Proben wieder.

In Reagenz C enthaltener Alkohol
PCR-Amplifikationsprodukt (ng)
iso-Propylalkohol
42
iso-Propylalkohol und tert.-Butylalkohol	33

Die vorliegende Erfindung bietet eine Reihe von Vorteilen, die nachfolgend deutlich werden. Mindestens ein aus den Sub stanzen Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Ka liumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A, und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso- Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Bu tylalkohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B, werden vorbereitend vermischt, um das Reagenz C herzustel len. Dies macht es möglich, die Menge zu verringern, in denen diese Reagenzien verwendet werden müssen. Als Beispiel sei ein Fall betrachtet, bei dem eine 10 µl-Probe so be schaffen ist, daß sie ein proteindenaturierendes Agens und iso-Propanol in den Endkonzentrationen 2 M bzw. 50% ent hält. Im Guanidiniumverfahren ist typischerweise die Zugabe einer 6 M Guanidiniumlösung in einer Menge von 20 µl nötig, und dann wird ungefähr 100%-iger iso-Propylalkohol in einer Menge von 30 µl zugegeben. Im Gegensatz dazu verlangt das erfindungsgemäße Verfahren die Zugabe von lediglich 20 µl eines Nucleinsäure extrahierenden Reagenz, das sich aus ca. 75%-igem iso-Propylalkohol zusammensetzt, der 3 M Guanidiniumthiocyanat enthält. Beim Guanidiniumverfahren er geben sich am Ende 60 µl einer Lösung, die die Probe, 2 M Guanidiniumthiocyanat und ca. 50% iso-Propanol enthält, wo hingegen sich erfindungsgemäß nur 30 µl einer Lösung erge ben, die dieselben Konzentrationen aufweisen. Somit läßt sich der flüssige Abfall, der nach dem Extraktionsverfahren entsorgt werden muß, dementsprechend vermindern. Außerdem müssen beim erfindungsgemäßen Verfahren keine giftigen oder gefährlichen Substanzen, wie Chloroform oder Phenol verwen det werden und es kann daher verglichen mit den herkömmli chen Verfahren verhältnismäßig leicht durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß werden die extrahierten Nucleinsäuren im Präzipitat erhalten, und die vorliegende Erfindung kann mit außerordentlich einfachen Verfahrensschritten durchgeführt werden, wenn man einen Vergleich mit Verfahren aus dem Stand der Technik vornimmt, bei denen es auf die Löslichkeit der Nucleinsäure in zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten ankommt, und bei denen die flüssige Phase, in der die interessierende Nucleinsäure gelöst ist von der anderen flüssigen Phase ab getrennt werden muß, um die Nucleinsäure zu extrahieren. Beim Nacharbeiten der vorliegenden Erfindung werden somit keine großen Anforderungen an die Geschicklichkeit gestellt, die gewünschten Nucleinsäuren können jedoch mit gleichblei bend hoher Effizienz extrahiert werden.

Vorteilhaft ist ferner, daß das Reagenz A erfindungsgemäß im Reagenz C, das zur Probe gegeben wird, in einer niedrigeren Konzentration enthalten sein kann, und damit sein Auskri stallisieren wirksam verhindert wird. Außerdem läßt sich die Konzentration von Reagenz B ebenfalls genügend weit vermin dern, um seine Verdampfung zu verhindern. Dadurch eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für eine auto matisierte Verwendung. Wenn die Reagenzien A und B einzeln verwendet werden, ist es im allgemeinen schwierig, die Ge nauigkeit ihrer Zugabe in kleinen Mengen zu optimieren. Man kann jedoch erwarten, daß sich das erfindungsgemäße Reagenz zur Extraktion von Nucleinsäuren mit höherer Genauigkeit zu geben läßt.

Erfindungsgemäß werden Träger und Reagenz C, das die Reagen zien A und B enthält, verwendet. Abgesehen von den vorste hend genannten Vorteilen liefert die Erfindung die Möglich keit, Nucleinsäuren mit einer höheren Effizienz zu extrahie ren als mit den herkömmlichen Verfahren.

Dem zweiten Aspekt der Erfindung gemäß, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer bestimmten Nucleinsäurese quenz bereit, das die Durchführung einer PCR und die Messung der Fluoreszenzintensität in einem geschlossenen Gefäß er laubt. Somit beinhaltet bei einem Vergleich mit herkömmli chen Verfahren, die lediglich Nucleinsäuren durch die PCR amplifizieren, und die amplifizierten Nucleinsäuren nachwei sen, das erfindungsgemäße Nachweisverfahren eine einfache Prozedur und bietet außerdem die Möglichkeit, die Wahr scheinlichkeit einer Aerosolbildung wirksam zu vermindern.

Claims

1. Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfolgenden Schritte umfaßt:

(1) Vermischen der Probe mit einem Träger, der minde stens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose ist, um ein flüssiges Gemisch zu erzeugen;
(2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit Reagenz C, um die Nucleinsäuren und den Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalko hol ausgewähltes Reagenz B enthält; und
(3) Separieren von gefällten Nucleinsäuren und gefälltem Träger aus der flüssigen Phase

2. Verfahren zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäu resequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfol genden Schritte umfaßt:

(1) Vermischen der Probe mit einem Träger, der minde stens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid, Car boxymethylcellulose ist, um ein flüssiges Gemisch zu erzeugen;
(2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit Reagenz C, um die Nucleinsäuren und den Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalko hol ausgewähltes Reagenz B enthält;
(3) Separieren von gefällten Nucleinsäuren und gefälltem Träger aus der flüssigen Phase;
(4) Überführen der separierten Nucleinsäuren in DNA durch eine reverse Transkriptionsreaktion, wenn es sich bei ihnen um RNA handelt;
(5) Unterwerfen der entweder in Schritt (3) separierten oder in Schritt (4) erhaltenen Nucleinsäuren einer Polymerasekettenreaktion in einer PCR-Lösung, die ein Gemisch von Mononucleosid-Triphosphaten, eine Polymerase, ein interkalierendes Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde enthält, die zur Amplifi kation mindestens einer spezifizierten Sequenz ge eignet ist;
(6) Messen der Änderung der Fluoreszenzintensität, die als Ergebnis der PCR auftritt, oder der Änderung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung während die PCR voranschreitet; und
(7) Bestimmen (auf Grundlage der Änderung der Fluores zenzintensität), ob eine Nucleinsäure mit der spezi fizierten Sequenz in der Probe vorhanden war.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die PCR und die Messung der Änderung der Fluoreszenzintensität in einem ge schlossenen Gefäß durchgeführt wird, das die extrahier ten Nucleinsäuren und die PCR-Lösung in einem hermetisch abgeschlossenen Zustand enthält.

4. Reagenzienpackung zur Extraktion von Nucleinsäuren, die voneinander getrennt mindestens einen Träger und ein Reagenz C enthält, wobei

(1) der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose ist; und
(2) das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B enthält.