DE4333805A1 - Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter Nucleinsäuresequenzen - Google Patents
Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und Verfahren zum Nachweis spezifizierter NucleinsäuresequenzenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von
Nucleinsäuren aus einer Probe. Genauer gesagt, betrifft die
Erfindung ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und
ein Verfahren zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäu
resequenz, das sich in Biotechnologie und klinischer Dia
gnose verwenden läßt.
Das Extrahieren von Nucleinsäuren aus einer Probe stellt ein
wichtiges Verfahren in der Biotechnologie, in der klinischen
Diagnose und in anderen Gebieten dar. In Gen-Rekombinations-
Verfahren ist z. B. sowohl das Isolieren der zu clonierenden
DNA als auch von Vektor-DNA erforderlich, und zur Durchfüh
rung eines Gen-Tests auf genetische Krankheiten und Krebs-
Gene ist es notwendig, Nucleinsäuren z. B. aus den im Blut
vorhandenen Leukozytenzellen zu extrahieren.
Nucleinsäuren kommen im allgemeinen nicht als freie Moleküle
vor, sondern in Bakterien, Zellen, Viruspartikeln usw., wo
sie mit Zellmembranen und -wänden bedeckt sind, die sich aus
Proteinen, Lipiden und Polysacchariden zusammensetzen.
Nucleinsäuren selbst bilden Komplexe mit Histonen und ande
ren Proteinen. Zur Extraktion von Nucleinsäuren, die in die
ser Weise vorliegen, müssen die sie bedeckenden Zellmembra
nen und -wände aufgebrochen werden, und die Proteine des er
wähnten Komplexes müssen denaturiert oder abgebaut werden,
um sie so zu solubilisieren. Dadurch werden die Nucleinsäu
ren freigesetzt und können dann extrahiert werden.
Herkömmlicherweise werden Nucleinsäuren nach einem der nach
folgenden Verfahren extrahiert:
- (i) Das sogenannte Proteinase K-/Phenol-Verfahren, bei dem ein proteolytisches Enzym wie Proteinase K oder ein grenzflächen-aktiver Stoff zugegeben wird, wodurch die Zellmembran oder -wand aufgebrochen und das Protein des betreffenden Komplexes abgebaut wird, und Nuclein säuren freigesetzt werden. Dann wird Phenol/Chloroform zugegeben, und das Gemisch wird zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in die wäßrige Phase überführt wer den. Die wäßrige Phase wird dann abgetrennt und weiter verwendet. Ethanol, iso-Propylalkohol oder etwas ähn liches wird zur wäßrigen Phase gegeben, wodurch die Nucleinsäuren ausgefällt werden (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Appendices E3-E4, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989);
- (ii) Das sogenannte AGPC-Verfahren, bei dem ein flüssiges Gemisch von Guanidiniumisothiocyanat und Phenol zur betreffenden Probe gegeben wird, um Zellmembran und -wand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denaturieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäuren werden dann freigesetzt, und Chloroform wird zugege ben, um die Nucleinsäuren in die wäßrige Phase zu überführen. Die wäßrige Phase wird abgetrennt und wei ter verwendet. Danach wird Ethanol, iso-Propanol oder etwas ähnliches zur wäßrigen Phase gegeben, wodurch die Nucleinsäuren ausgefällt werden (Acid Guanidinium- Thiocyanate Phenol-Chloroform Method: Analytical Bio chemistry 162 (1987), S. 156-159);
- (iii) Das sogenannte Guanidiniumverfahren, bei dem Guanidi niumhydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat zur be treffenden Probe gegeben wird, um Zellmembran und -Zellwand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denaturieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäu ren werden dann freigesetzt, und z. B. Ethanol wird zur Fällung der freien Nucleinsäuren zugegeben (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 7.23-7.25, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; und Analytical Biochemistry 162 (1987) S. 463; und
- (iv) Das sogenannte Natriumjodid-Verfahren. Hier wird Gly cogen enthaltendes Natriumjodid (Glycogen besitzt eine Affinität für die zu extrahierende Nucleinsäure) zur betreffenden Probe gegeben, um Zellmembran und -wand aufzubrechen und das Protein des Komplexes zu denatu rieren und zu solubilisieren. Die Nucleinsäuren werden dann freigesetzt, und iso-Propanol wird zur Fällung von freien Nucleinsäuren und Glycogen zugegeben (Nucleic Acid Res. 19 (20) (1991), S. 592).
Sämtliche vier vorstehend beschriebenen Verfahren weisen
spezifische Nachteile auf. Das Proteinase K-/Phenol-Verfah
ren schließt komplizierte Prozeduren ein, da der Abbau durch
proteolytische Enzyme lange dauert und da eine Kontrolle der
Temperatur für eine wirksame enzymatische Reaktion notwendig
ist. Außerdem sind Phenol und Chloroform toxische Chemika
lien (beide fallen unter die gesetzlich als giftig und ge
fährlich eingestuften Substanzen), und bei ihrer Handhabung
ist das Tragen von Schutzkleidung und -handschuhen und die
Verwendung chemischer Abzüge usw. notwendig. Ferner muß der
aus der Extraktionsprozedur stammende flüssige Abfall spe
ziell entsorgt werden, wodurch mehr Zeit und zusätzliche Ge
rätschaften benötigt und Extrakosten verursacht werden. Au
ßerdem bedarf es einer großen Geschicklichkeit, die wäßrige
Phase, in die die betreffenden Nucleinsäuren überführt wur
den, abzutrennen. Dies macht es schwierig, eine gleichblei
bende Effizienz bei der Extraktion von Nucleinsäuren zu er
reichen.
Ähnliche Probleme gibt es im AGPC-Verfahren bezüglich der
Handhabung von Phenol und Chloroform und ebenfalls bezüglich
der Extraktionseffizienz. Diese ist abhängig vom Abtrennen
und von der Rückgewinnung der wäßrigen Phase, in die die
entsprechende Nucleinsäure überführt wurde. Außerdem ist das
AGPC-Verfahren speziell für die Extraktion von RNA
entwickelt und zur Extraktion von DNA ungeeignet.
Im Guanidiniumverfahren wird z. B. Ethanol nach der Zugabe
von z. B. Guanidiniumhydrochlorid zur betreffenden Probe ge
geben. Um einen nachfolgenden Abfall der Konzentration von
Guanidinium in der Lösung zu verhindern, muß hochkonzen
triertes (ca. 6 bis 8 M) Guanidinium verwendet werden. Damit
ist aber eine erhöhte Möglichkeit des Auskristallisierens
von Guanidiniumsalz gegeben (besonders im Winter, oder wenn
die Raumtemperatur unter 20°C liegt). Das Auskristallisieren
von Guanidiniumsalz kann zum Verstopfen von Pipetten oder
anderen Ausrüstungsteilen führen, die zur Zugabe von z. B.
Guanidiniumhydrochlorid verwendet werden, und dies stellt
ein beträchtliches Hindernis für jeden Versuch dar, die Pro
zedur des Guanidiniumverfahrens zu mechanisieren. Ethanol
oder etwas ähnliches wird nach dem Guanidiniumhydrochlorid
oder ähnlichem zugegeben. Die Endkonzentration von z. B.
Ethanol muß 50 bis 70% betragen, um die Nucleinsäuren un
löslich zu machen. Das Probenvolumen ist jedoch wegen der
Zugabe von Guanidiniumhydrochlorid oder ähnlichem vergrö
ßert, und deshalb muß man hochreinen Ethanol (ca. 100%) in
einer Menge verwenden, die mindestens ebenso groß ist, wie
die des flüssigen Gemisches von Probe und Guanidiniumhydro
chlorid.
Das Natriumjodidverfahren ist mit dem Problem behaftet, daß
es einer Inkubation bei 60°C bedarf, um Proteine oder ähnli
ches zu solubilisieren, was zu einer niedrigen Effizienz bei
der RNA-Extraktion führt. Ein weiteres Problem besteht
darin, daß labile Jodidionen (J-) dazu neigen, durch die
Wirkung von z. B. Licht oxidiert zu werden und ein Jodmolekül
(J₂) zu erzeugen. Um dies zu vermeiden, müssen die Reagen
zien in einem kalten dunklen Raum gelagert werden.
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Molecular Cloning: A La
boratory Manual, Kapitel 14, New York, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1989) ist als ein Verfahren zur DNA-Amplifika
tion bekannt mit dem man zum Gen-Test (zur genetischen Dia
gnose) mit ultrahoher Empfindlichkeit in der Lage ist. Wenn
die DNA-Amplifikation erfolgreich ist, besitzt die PCR das
Potential zur mindestens 100 millionenfachen Amplifikation.
Im Hinblick auf die Möglichkeit zur Amplifikation von sogar
nur einem einzigen DNA-Molekül wird das Testergebnis jedoch
beim Vorhandensein einer DNA (exogenen DNA), die in der
PCR-Nucleinsäureprobe oder im PCR-Reagenz nicht anwesend sein
sollte, nachteilig beeinträchtigt.
Eine Ursache für das Vorhandensein exogener DNA ergibt sich
in dem Stadium, in dem Nucleinsäuren aus der vorliegenden
Probe zur Präparation der PCR-Nucleinsäurprobe extrahiert
werden. Dies betrifft auch das während der Nucleinsäureex
traktion erzeugte Aerosol. Beim Proteinase K-/Phenol- oder
beim AGPC-Verfahren wird sehr wahrscheinlich ein Aerosol er
zeugt. Diese Verfahren beinhalten nämlich abgesehen von der
Reagenzienzugabe zur Probe und von der Ausführung anderer
Prozeduren wie dem Vermischen von Medien, außerdem zeitauf
wendige Prozeduren, wie die Gewinnung der wäßrigen Phase
durch Abtrennen. Die Aerosolpartikel haben einen Durchmesser
von ungefähr 20 µm und ihr Volumen beträgt nur ungefähr
4×10-6 µl. Wenn man z. B. einen an Hepatitis B leidenden Pati
enten betrachtet, ergibt sich folgende Überlegung: In 1 µl
Blut können ungefähr 10⁵ Viruspartikel enthalten sein. Somit
kann ein Aerosolpartikel ein Viruspartikel enthalten. Mit
anderen Worten, das Aerosol kann in der PCR, die zur Ampli
fikation eines einzigen DNA-Moleküls in der Lage ist, ernst
haften Schaden stiften. Deshalb gibt es einen Bedarf, die
Anzahl der involvierten Verfahrensschritte zu vermindern.
Zur Verminderung der Aerosolbildung in einem PCR-Verfahren
wurde in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 487 218 vorge
schlagen, die PCR in einem hermetisch abgeschlossenen Zu
stand, unter Verwendung eines interkalierenden Fluoreszenz
farbstoffes (eines Fluorochroms) zur Quantifizierung einer
Ziel-DNA in einer Probe durchzuführen. Das Problem, die Ae
rosolbildung bei der Extraktion der Nucleinsäure aus der
Probe zu reduzieren, bleibt jedoch bestehen.
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, die vorstehend ge
nannten Probleme der herkömmlichen Verfahren zur Nuclein
säure-Extraktion zu beseitigen oder zu verringern.
Genauer gesagt besteht diese Aufgabe in der Bereitstellung
eines neuen Verfahrens zur Extraktion von DNA und RNA, das
leicht durchzuführen ist, eine geringere Anzahl von Schrit
ten einschließt, fähig ist, die Möglichkeit einer Aerosol
bildung zu verringern, innerhalb kurzer Zeit ausführbar ist,
kein Phenol oder Chloroform verwendet und dennoch eine
gleichbleibende Wirksamkeit bei der Extraktion von Nuclein
säuren erreicht.
Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung
eines Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer
Probe gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:
- (1) Vermischen der Probe mit einem Träger zur Erzeugung ei nes flüssigen Gemisches, wobei der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxyme thylcellulose ist;
- (2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit dem Reagenz C, um Nucleinsäuren und Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocya nat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Na triumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein unter den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propylal kohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylal kohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B ent hält; und
- (3) Separieren von ausgefällten Nucleinsäuren und Träger aus der flüssigen Phase.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereit
stellung eines Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten
Nucleinsäuresequenz, das die Gefahr einer Aerosol-Kontamina
tion vermeidet oder vermindert.
Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung
eines Nachweisverfahrens gelöst, das die nachfolgenden
Schritte umfaßt:
- (1) Vermischen der Probe mit einem Träger zur Erzeugung ei nes flüssigen Gemisches, wobei der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxyme thylcellulose ist;
- (2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit dem Reagenz C, um Nucleinsäuren und Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocya nat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Na triumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propylalko hol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalko hol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B ent hält;
- (3) Separieren von ausgefällten Nucleinsäuren und Träger aus der flüssigen Phase;
- (4) Überführen der separierten Nucleinsäuren in DNA mittels einer reversen Transkriptionsreaktion, wenn es sich bei den separierten Nucleinsäuren um RNA handelt;
- (5) Unterwerfen der entweder in Schritt (3) separierten oder in Schritt (4) erhaltenen Nucleinsäuren einer Polyme rase-Kettenreaktion in einer PCR-Lösung, die ein Gemisch der Nucleosidtriphosphate, eine Polymerase, ein interka lierendes Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde ent hält, die als Primer zur Amplifikation mindestens einer bestimmten Sequenz geeignet ist;
- (6) Messen der Änderung der Fluoreszenzintensität als Folge der PCR bzw. der sich während der PCR ergebenden Ände rung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung; und
- (7) Bestimmen (auf der Basis der Änderung der Fluoreszenzin tensität), ob eine Nucleinsäure mit der spezifizierten Sequenz in der Probe vorhanden war.
Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine Packung von
Reagenzien zur Extraktion von Nucleinsäuren bereit, die von
einander getrennt mindestens die folgenden Bestandteile ent
hält:
- (1) Einen mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose enthaltenden Träger; und
- (2) ein Reagenz C, das mindestens ein aus den Substanzen Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylal kohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylal kohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalkohol ausge wähltes Reagenz B enthält.
Fig. 1 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach der PCR-Amplifikation von DNA des Hepati
tis B-Virus (HBV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure
des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert
worden war; Spuren 1 und 2: HBV-reiches Serum, Spuren 3 und
4: HBV-armes Serum, Spur 5: HBV-freies Serum; die Bande a
zeigt das PCR-Amplifikationsprodukt und die Bande b das Pri
mer-Oligomer;
Fig. 2 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis
C-Virus (HCV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des
Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden
war; Spuren 1 und 2: HCV-reiches Serum; Spuren 3 und 4:
HCV-armes Serum; Spur 5: HCV-freies Serum;
Fig. 3 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis
B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der
nachstehend aufgeführten unterschiedlichen Zusammensetzungen
von Reagenz C extrahiert worden war; Spuren 1 und 2 (1): das
Reagenz C enthält 2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natri
umcitrat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): das
Reagenz C enthält 2,4 M Kaliumthiocyanat, 15 mM Natriumci
trat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): das
Reagenz C enthält 2,3 M Guanidiniumhydrochlorid, 15 mM Na
triumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;
Fig. 4 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis
B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in
Beispiel 7 beschriebenen Reagenz extrahiert worden war, wo
bei die nachfolgend aufgeführten Zusammensetzungen von Rea
genz B als Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spu
ren 1 und 2 (1): 60% n-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2):
60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 50% n-Butylal
kohol; Spuren 7 und 8 (4): 60% n-Butylalkohol; Spuren 9 und
10 (5): 50% sek.-Butylalkohol; und Spuren 11 und 12 (6): 60%
sek.-Butylalkohol;
Fig. 5 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von RNA des Hepatitis
B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in
Beispiel 8 beschriebenen Reagenz C extrahiert worden war,
wobei die nachfolgend aufgeführten Typen von Reagenz B als
Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spuren 1 und 2
(1): 50% tert.-Amylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): 60%
tert.-Amylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 60% tert.-Butylalkohol;
Spuren 7 und 8 (4): 60% iso-Propylalkohol;
Fig. 6 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis
B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus
nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war,
wobei Dextran in den betreffenden Tests in folgenden Mengen
verwendet wurde: Spuren 1 und 2: 0 µg; Spuren 3 und 4: 2 µg;
Spuren 5 und 6 : 4 µg; Spuren 7 und 8: 8 µg; Spuren 9 und 10:
16 µg; Spuren 11 und 12: 32 µg, Spuren 13 und 14: 64 µg;
Fig. 7 stellt eine Photographie und ein diese verdeulichen
des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro
phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis
B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus
analog zu Beispiel 3 unter Verwendung von Dextran oder Car
boxymethylcellulose als Träger extrahiert worden war; Spuren
1 und 2: Dextran; Spuren 3 und 4: Carboxymethylcellulose;
Fig. 8 stellt ein Paar von Diagrammen dar, in denen die Er
gebnisse der Experimente von Beispiel 12 gezeigt sind. Eine
Reaktionslösung einer PCR wurde vor (Fig. 8a) und nach (Fig.
8b) Nucleinsäureextraktion durch Hochleistungs-Flüssigkeits-
Chromatographie untersucht. Die Elutionszeit ist (in Minu
ten) auf den horizontalen Achsen und die relative Absorption
auf den vertikalen Achsen aufgetragen.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extrak
tion von Nucleinsäuren (einzel- oder doppelsträngiger DNA
und RNA) u Beispiele für DNA, die sich nach dem Verfahren ex
trahieren läßt, schließen nicht nur genomische DNA ein, son
dern auch Mitochondrien- oder Chloroplasten-DNA, und Bei
spiele für RNA, die sich nach dem Verfahren extrahieren
läßt, schließen nicht nur mRNA sondern auch tRNA und rRNA
ein. Nucleinsäuren enthaltende Proben sind beispielsweise
lebende Proben, wie Leukozytenzellen, gezüchtete Wirtszel
len, die typischerweise durch Gen-Rekombinationstechnik her
gestellte Vektoren usw. enthalten, Zellen, die mit Viren
oder Phagen infiziert sind, Viren im Blut und Kulturen von
Proben von Mikroorganismen. Die Kultur kann Mikroorganismen
enthalten, aber der Kulturüberstand allein ist ausreichend.
Nicht nur künstliche Kulturen sondern auch natürlich vorkom
mende Kulturen sind verwendbar. Falls die Proben Klumpen von
Mikroorganismen enthalten, kann man zum Erzielen einer hohen
Extraktionseffizienz nötigenfalls homogenisieren oder mit
Ultraschall behandeln.
Erfindungsgemäß können Nucleinsäuren aus den vorstehend be
schriebenen Proben extrahiert werden. Eine weitere Anwendung
der vorliegenden Erfindung liegt in der Extraktion amplifi
zierter Nucleinsäuren aus einer PCR-Lösung in hoher Aus
beute, so daß in den amplifizierten Nucleinsäuren keine En
zyme oder niedermolekulare Desoxyribonucleosid-Triphosphate,
Primer usw. enthalten sind.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht
in einem Vermischen der die Nucleinsäure enthaltenden Probe
mit einem Träger. Ein Vermischen mit dem Träger unterstützt
die Bildung eines größeren unlöslichen Materials durch ein
Vernetzen von Nucleinsäuren und Träger im nachfolgenden Aus
fällen von Nucleinsäuren und Träger durch Zugabe von Reagenz
C. Dadurch läßt sich das nachfolgende Abtrennen des unlösli
chen Materials in einer vereinfachten Weise vornehmen. Somit
trägt die Verwendung des Trägers zu einer höheren Extrakti
onseffizienz bei, als man ohne seine Verwendung erreichen
würde.
Der Träger besitzt eine Affinität für die zu extrahierenden
Nucleinsäuren und wird unlöslich, wenn er in Kontakt mit dem
in Reagenz C enthaltenen Reagenz B gelangt. Da der Träger
zusammen mit den Nucleinsäuren extrahiert wird, sollte er
nicht die spezifische Verwendung der extrahierten Nuclein
säuren wie die Reaktion mit einem Restriktionsenzym, die re
verse Transkriptionsreaktion oder die PCR beeinträchtigen.
Der erfindungsgemäß zu verwendende Träger ist mindestens
eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethyl
cellulose. Diese Träger erweisen sich als zufriedenstellend
wirksam, unabhängig davon, ob sie einzeln oder als Mischun
gen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin,
daß sie weder die reverse Transkriptionsreaktion, die PCR
oder irgend eine andere gewünschte Reaktion beeinträchtigen.
Glycogen und andere herkömmliche Träger werden durch Amylase
oder andere Enzyme, die in der Probe, wenn es sich bei die
ser um Serum oder Blut handelt, vorhanden sind, abgebaut,
mit dem Ergebnis, daß sich die Effizienz der Nucleinsäureex
traktion vermindert. Im Gegensatz dazu wird der erfindungs
gemäß verwendete Träger nicht abgebaut, und dementsprechend
ergibt sich keine Verminderung der Effizienz der Nucleinsäu
reextraktion.
Im allgemeinen wird der Träger in Mengen von ungefähr 0,01
bis 1000 µg, bevorzugt ungefähr 0,1 bis 100 µg pro 10 µl
Probenvolumen verwendet. Der Träger kann in einem Gefäß vor
gelegt werden, bevor die Probe hineingegeben wird. Alterna
tiv kann die Probe vor Zugabe des Trägers in das Gefäß gege
ben werden. Der Träger kann durch Gefrier- oder Lufttrocknen
in eine feste Substanz überführt werden.
Im nächsten Schritt wird zum flüssigen Gemisch von Probe und
Träger das Reagenz C gegeben, und die Bestandteile werden
vermischt, um Träger und Nucleinsäuren auszufällen. Das Rea
genz C enthält mindestens ein aus den Substanzen Guanidini
umthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und
Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein
aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propanol, n-Butylal
kohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amyl
alkohol ausgewähltes Reagenz B.
Das Reagenz C kann außerdem andere Reagenzien enthalten. Zum
Beispiel: ein zur Unterdrückung des Nucleinsäureabbaus ge
eignetes Puffer-Mittel; ein Chelatisierungsmittel, das zur
Hemmung der Aktivität von Nucleasen (Desoxyribonucleasen)
fähig ist, wie z. B. Natriumcitrat oder EDTA; ein Reduktions
mittel zum Erreichen einer wirksameren Denaturierung und So
lubilisierung von Proteinen, Lipiden usw., wie z. B. Dithio
threit oder β-Mercaptoethanol, die Disulfidbindungen redu
zieren und eine grenzflächenaktive Substanz, wie z. B. ein
Sarkosylsalz oder Triton, um eine wirksamere Solubilisierung
von Proteinen usw. zu erreichen. Ein geeignetes Puffermittel
kann zur Einstellung des pH-Wertes von Reagenz C auf den Be
reich von 4 bis 9, bevorzugt von 5 bis 8 zugegeben werden,
um so den Abbau von Nucleinsäuren zu verhindern, wodurch
eine weitere Verbesserung der Effizienz ihrer Extraktion er
reicht wird.
Im erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren wird mindestens
eine der Verbindungen Guanidiniumthiocyanat, Guanidinium
hydrochlorid, Kaliumthiocyanat oder Natriumthiocyanat als
Reagenz A verwendet. Diese Verbindungen brechen die
Zellmembran oder die Zellwand auf und denaturieren das
Protein im Komplex. Sie sind außerdem fähig, das
denaturierte Protein, das sich entweder als Ergebnis des
Denaturierens des Proteins im Komplex oder wegen des
begleitenden Reagenz B bildet, zu solubilisieren.
Gleichzeitig sind die Verbindungen fähig, die Aktivität von
Nucleasen (Desoxyribonucleasen und Ribonucleasen), die sich
in der Probe befinden mögen, zu unterdrücken. Das
erfindungsgemäß verwendete Reagenz A besitzt in hohem Maße
die Fähigkeit sowohl allein als auch in Kombination zweier
oder mehrerer Substanzen Proteine zu solubilisieren, ohne
dabei irgendwelche störenden Reaktionen zu verursachen. Es
macht daher eine hohe Effizienz der Nucleinsäure-Extraktion
möglich. Allgemein bekannte proteindenaturierende Mittel wie
Natriumjodid, Kaliumjodid, Kaliumbromid, Natriumbromid und
Harnstoff sind nicht derartig wirksam, Proteine usw. zu
solubilisieren; andererseits verursachen Guanidiniumsulfat,
Guanidiniumcarbonat usw. Proteinaggregation usw. und sind
daher nicht fähig, Nucleinsäuren mit hoher Effizienz zu
extrahieren.
Erfindungsgemäß wird mindestens eine der Substanzen n-Propa
nol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol,
tert.-Butylalkohol oder tert.-Amylalkohol als Reagenz B ver
wendet. Wenn man ein Gemisch von zwei oder mehr Alkoholen
verwendet, kann man ein vorteilhaftes Verhältnis der Alko
hole durch Vorexperimente bestimmen. Das erfindungsgemäße
Reagenz B besitzt eine hohe Löslichkeit in Wasser und geht
nicht ohne weiteres eine Phasentrennung mit Wasser ein. Die
Verwendung von Reagenz B bietet daher den Vorteil, daß das
Abtrennen von gefällten Nucleinsäuren und Träger aus der
wäßrigen Phase in einfacher Weise ausführbar ist. Das bedeu
tet letzten Endes, daß sich die Ausbeute der gefällten
Nucleinsäuren im letzten Schritt des Verfahrens erhöhen
läßt.
Die Konzentration der Reagenzien A und B in Reagenz C kann
man in solch einer Weise einstellen, daß bei Zugabe von Rea
genz C zu der den Träger enthaltenden Probe Proteine, Lipide
usw. gelöst bleiben, Nucleinsäuren und der Träger aber ge
fällt werden. Besonders bevorzugte Konzentrationen zur Ver
besserung der Extraktionseffizienz sind solche, bei denen
die Endkonzentration des Reagenz wie es zur Probe zugegeben
wird, für Reagenz A im Bereich von 1,5 bis 4,5 M und für
Reagenz B im Bereich von ungefähr 40 bis 80% liegt.
In dem Fall, daß das Reagenz C z. B. Guanidiniumthiocyanat
als Reagenz A und iso-Propylalkohol als Reagenz B enthält,
liegen die Konzentrationen für eine besonders hohe Effizienz
der Nucleinsäure-Extraktion so, daß die Endkonzentration von
Reagenz A nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 2
bis 3 M liegt, wohingegen die Endkonzentration von Reagenz B
nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 45 bis 55%
liegt. Wenn die Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat
geringer als 1,5 M ist, können die in der Probe enthaltenen
Proteine, Lipide usw. nicht voll solubilisiert werden. Zur
Erhöhung der Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat über
4,5 M muß der Anteil von Reagenz A im Reagenz C erhöht wer
den. Dann neigt aber das Reagenz A dazu, unlöslich zu wer
den, wodurch Schwierigkeiten bezüglich einer geeigneten Zube
reitung einer Probe entstehen. Wenn die Endkonzentration von
iso-Propylalkohol unter 40% liegt, können Träger und
Nucleinsäuren nicht vollständig gefällt werden. Wenn die
Endkonzentration von iso-Propylalkohol 80% überschreitet,
ist es schwierig, eine Guanidiniumthiocyanat-Konzentration
sicherzustellen, die ausreicht, Proteine, Lipide usw. voll
ständig zu solubilisieren. Ferner wird die Verdampfung von
iso-Propylalkohol problematisch. Deshalb werden die Reagen
zien erfindungsgemäß bevorzugt in den vorstehend angegebenen
Konzentrationsbereichen verwendet.
Eine geeignete Menge zur Zugabe von Reagenz C liegt beim
2- bis 10fachen des Probenvolumens, wenn es sich bei der Probe
um Serum handelt. Wenn die Probe jedoch hohe Konzentrationen
von Proteinen, Lipiden usw. aufweist, wird das Reagenz C be
vorzugt in einer größeren Menge als dem 10fachen Probenvo
lumen zugegeben, um eine vollständige Solubilisierung von
Proteinen, Lipiden usw. zu gewährleisten.
Durch die vorstehend beschriebenen Schritte werden Träger
und Nucleinsäuren in der Probe gefällt. Anschließend werden
die so gefällten Nucleinsäuren und der Träger durch herkömm
liche Abtrennungsverfahren wie Zentrifugation oder Filtra
tion von der wäßrigen Phase abgetrennt, die die Proteine
usw. enthält. Im Falle einer Zentrifugation können die
Nucleinsäuren als Sediment am Boden des Gefäßes gewonnen
werden. Im Falle einer Filtration können die Nucleinsäuren
auf der Filtermembran erhalten werden. Bei der Filtermembran
kann es sich um einen Typ handeln, der Poren mit einer Größe
von ungefähr 0,1 bis 10 µm besitzt.
Die separierten Nucleinsäuren kann man als solche in einer
Reihe von Tests und in gentechnologischen Experimenten ein
setzen. Bevorzugt werden sie aber vor der Verwendung gewa
schen. Ein Vor-Waschen ist besonders wirksam, wenn man die
separierten Nucleinsäuren einer Enzymreaktion (z. B. einer
Restriktionsenzym-Reaktion, einer reversen Transkriptionsre
aktion oder einer PCR) unterwirft, und in allen anderen Fäl
len, in denen das Reagenz A oder etwas ähnliches, das in ge
ringem Maße im Präzipitat enthalten ist, die Enzymaktivität,
inhibiert. Hier sei ein spezifisches Beispiel gegeben: zu
dem durch Zentrifugation oder Filtration erhaltenen Präzipi
tat wird eine ein Salz und einen Alkohol enthaltende Lösung
gegeben und mit dem Präzipitat vermischt. Das Gemisch wird
dann einer weiteren Zentrifugation oder Filtration unterwor
fen. Verglichen mit einem bloßen Waschen des Präzipitates
mit destilliertem Wasser oder ähnlichem, weist das Waschen
mit einer Salz/Alkohol enthaltenden Lösung den Vorteil auf,
daß es dazu beiträgt, von der Oberfläche des Sedimentes un
erwünschte Substanzen, wie das Reagenz A oder restliche Pro
teine wirksam zu entfernen. Als Salz in der Waschlösung kön
nen z. B. Kaliumchlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat in
Mengen von ungefähr 0,05 bis 0,5 M verwendet werden. Bei
spiele für Alkohole schließen Ethanol (der in Mengen von
mindestens 50%, bevorzugt von 60 bis 80% enthalten sein
kann) ebenso ein, wie n-Propylalkohol und iso-Propylalkohol
(die in einer Menge von mindestens 30%, bevorzugt von 40
bis 60% enthalten sein können).
Falls es speziell notwendig sein sollte, jedes restliche
Protein aus dem Präzipitat zu entfernen, kann man die nach
folgende Prozedur anwenden: Zuerst wird zum Präzipitat wie
der eine Lösung gegeben, die das Reagenz A, wie es vorste
hend spezifiziert wurde, enthält, um so die Proteine zu so
lubilisieren. Dann wird eine Lösung zugegeben, die das Rea
genz B, wie es vorstehend spezifiziert wurde, enthält, und
das Gemisch wird einer Zentrifugation oder Filtration unter
worfen. Selbstverständlich können die Schritte 2 und 3 des
erfindungsgemäßen Verfahrens einfach wiederholt werden. Wenn
sehr kleine Nucleinsäuremengen extrahiert werden, wird beim
erfindungsgemäßen Verfahren die Probe auf geeignete Weise
bei einer niedrigen Temperatur gehalten, z. B. dadurch, daß
die Gesamtprozedur in einem Kühlraum vorgenommen wird.
Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden
die so extrahierten Nucleinsäuren daraufhin untersucht, ob
sie eine bestimmte Sequenz, z. B. solch eine, wie sie in He
patitis B-Virus oder Hepatitis C-Virus vorkommt, enthalten,
die sie von anderen Nucleinsäuren unterscheidbar macht und
die Erfindung stellt ein Nachweisverfahren bereit, bei dem
die im allgemeinen als PCR-Reaktion bezeichnete Technik der
DNA-Amplifikation Anwendung findet; siehe diesbezüglich: Eu
ropäischen Patentanmeldung Nr. 487 218.
Wenn es sich bei den in vorstehender Weise separierten und
vorzugsweise gewaschenen Nucleinsäuren um RNA handelt, wird
diese zunächst erfindungsgemäß durch eine reverse Transkrip
tionsreaktion in DNA überführt. Dies ist z. B. beim Hepatitis
C-Virus, dessen Genom aus RNA besteht, der Fall. Erfindungs
gemäß wird RNA vor dem nachstehend beschriebenen Amplifika
tionsschritt in amplifizierbare DNA überführt, um so die PCR
zur DNA-Amplifikation verwenden zu können. Dieser Schritt
läßt sich durch DNA-Synthese mittels der gewöhnlichen rever
sen Transkriptionsreaktion erreichen, wobei die separierte
RNA als Matrize verwendet wird.
Im nächsten Schritt werden die separierten Nucleinsäuren
oder die Nucleinsäuren, die durch eine reverse Transkripti
onsreaktion im früheren Schritt erhalten worden waren, einer
PCR in einer PCR-Lösung unterworfen, die ein Gemisch von
Nucleosidtriphosphaten, eine Polymerase, ein interkalieren
des Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde enthält, die
mindestens zur Amplifikation der spezifizierten Sequenz ge
eignet ist. Die Oligonucleotid-Sonde in der PCR-Lösung be
steht aus zwei oder mehr Oligonucleotiden, die eine ge
eignete Zahl von Basen aufweisen. Sie sind zur Herstellung
von DNA-Fragmenten, die die spezifizierte Sequenz enthalten,
wenn die PCR fortschreitet, notwendig und sie liegen in den
schließlich hergestellten DNA-Fragmenten an den 5′-Enden.
Eine geeignete oligonucleotid-Sonde läßt sich entsprechend
der spezifizierten nachzuweisenden Sequenz auswählen.
Beispiele für das erfindungsgemäß verwendete interkalierende
Fluorochrom sind Ethidiumbromid, Acridinorange, Bisbentimid,
Diaminophenylindol, Actinomycin, Thiazol, Chromomycin und
Derivate dieser Substanzen. In der PCR selbst besteht ein
Zyklus aus den nachfolgenden Verfahrensschritten: Die 3′-terminalen
Anteile der spezifizierten und der dazu
komplementären Sequenz werden mit den betreffenden komple
mentären Oligonucleotid-Primern hybridisiert. Dann wird eine
Reaktion zur Verlängerung der Primer in 5′ 3′-Richtung
mittels einer Polymerase vorgenommen. Anschließend wird der
resultierende Doppelstrang dissoziiert. Dieser Zyklus kann
so oft wiederholt werden, wie es geeignet erscheint.
Die Änderung der Fluoreszenzintensität in der PCR-Lösung
wird entweder nach oder während der PCR gemessen. Da das in
terkalierende Fluorochrom infolge seines Einbaus in die dop
pelsträngige DNA eine Änderung seiner Fluoreszenzcharakteri
stik eingeht, gibt die Änderung der Fluoreszenzintensität
zwischen Beginn und Ende der PCR oder die Änderung während
der PCR einen Hinweis darauf, ob die separierte DNA oder RNA
die spezifizierte Sequenz besitzt.
Wenn das vorstehend beschriebene Nachweisverfahren angewandt
wird, besteht keine Notwendigkeit, zusätzliche Mengen des
Reagenz hinzuzufügen, nachdem die PCR einmal begonnen hat.
Deshalb wird in der Praxis die PCR-Lösung zuerst in ein Ge
fäß gegeben, dann werden die extrahierten Nucleinsäuren oder
die Nucleinsäuren, die man aus diesen Nucleinsäuren mittels
der reversen Transkriptionsreaktion erhält, zugegeben. Da
nach wird das Gefäß verschlossen, und die Schritte der PCR
und die Messung der Fluoreszenzintensität werden in einem
hermetisch abgeschlossenen Zustand durchgeführt. Dadurch
läßt sich die Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung eines Ae
rosols weiter vermindern.
Dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung gemäß stellt
die Erfindung ferner eine Reagenzienpackung zur Durchführung
des auf den vorangegangenen Seiten beschriebenen Nuclein
säure-Extraktionsverfahrens bereit. Diese Reagenzienpackung
enthält Träger und Reagenz C, die ebenfalls vorstehend be
schrieben wurden. Träger und Reagenz C werden bis zur Ver
wendung getrennt voneinander gehalten. Dies kann man z. B.
dadurch erreichen, daß der Träger und das Reagenz C in
getrennten Behältern gehalten werden, wobei der Träger im
festen Zustand und das Reagenz C im flüssigen Zustand vor
liegen.
Die Reagenzienpackung kann wahlweise ein Reaktionsgefäß ent
halten, das aus einem geeigneten Plastikmaterial hergestellt
ist und das einen Reaktionsraum zur Ausführung des erfin
dungsgemäßen Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren
(erster Aspekt der Erfindung) oder des erfindungsgemäßen
Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäurese
quenz (zweiter Aspekt der Erfindung) bereitstellen kann.
Wenn es einen Bedarf gibt, nicht nur Nucleinsäuren zu extra
hieren, sondern außerdem eine bestimmte Nucleinsäuresequenz
nachzuweisen, enthält die Reagenzienpackung bevorzugt ein
hermetisch verschließbares Reaktionsgefäß.
Der Vorteil der Reagenzienpackung besteht darin, daß man,
wenn der Träger in einer geeigneten Form, z. B. als gefrier
getrocknetes Pulver, im Reaktionsgefäß vorgelegt wurde, nur
noch die zu untersuchende Probe und dann das Reagenz C zum
Röhrchen zugeben muß, um das Verfahren zur Extraktion von
Nucleinsäuren und, falls gewünscht, zum Nachweis einer spe
zifizierten Nucleinsäuresequenz zu beginnen.
Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung
weiter erläutern.
Hybridomzellen von Maus-Myelomzellen und Lymphozytenzellen
von Mäusen, die mit CEA (cancer embryonic antigen, embryona
les Krebsantigen) sensibilisiert worden waren, wurden in ei
nem DMEM-Medium gezüchtet. Beim Erreichen einer Dichte von
CEL-Zellen von 4×10⁵ pro ml Kulturlösung wurden 100 µl der
Lösung in ein 0,5 ml großes Probenröhrchen gegeben. Das
Röhrchen wurde 1 Minute bei 7000 UpM zentrifugiert, und der
Überstand wurde entfernt. Das Präzipitat wurde in 20 µl
DMED-Medium aufgenommen. Zur Suspension wurde 1 µl (10 µg)
Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und gemischt. Danach
wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM
Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-
Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20
Sekunden gerührt. Nachfolgend wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM
zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren sedimentiert wur
den. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren
im Präzipitat verblieben. Zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger
iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt,
gegeben. Es wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann wurde das
Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Über
stand wurde verworfen. Das Präzipitat wurde nach dem fluoro
metrischen Verfahren von Kissane und Robins (J. Biol. Chem.,
233 (1958), 184) zur Bestimmung der DNA-Menge untersucht.
Das Präzipitat wurde außerdem einer Veraschungsbehandlung
unterzogen, und eine Phosphorbestimmung (Anal. Chem. 28
(1956), 1756) wurde zur Messung der Gesamtnucleinsäuremenge
(DNA + RNA) im Präzipitat vorgenommen. Die RNA-Menge wurde
durch Subtrahieren der DNA-Menge von der Gesamtmenge von
Nucleinsäuren (DNA + RNA) berechnet.
Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren von derselben
Probe sowohl nach dem Proteinase K-/Phenol- als auch nach
dem AGPC-Verfahren extrahiert.
Das Proteinase K-/Phenol-Verfahren wurde nach der Prozedur
von Keller, G.H. et al. (Anal. Biochem., 170 (1988), 441-450)
durchgeführt. Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (150 mM
Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 2% SDS und
250 µg/ml Proteinase K) in einem Proberöhrchen mit einem
Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 M¹ einer Zellsuspension
gegeben. Das Gemisch wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. An
schließend wurde 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Im nächsten
Schritt wurden 60 µl einer Lösung (Phenol/Chloroform/iso-
Amylalkohol = 25 : 24 : 1) hinzugegeben, und das Gemisch wurde
ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurde 10 Minuten bei
15 000 UpM zentrifugiert. Ein Teil (40 µl) des Überstandes
(wäßrige Phase) wurden entnommen und mit 8 µl 4 M Kaliumace
tat versetzt. Danach wurden 10 µg (1 µl) Glycogen und 50 µl
iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt.
Danach wurde es 30 Minuten bei -20°C gehalten. Der Überstand
wurde verworfen und 100 µl 75%iger Ethanol wurden zum Prä
zipitat gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Nach
20minütiger Zentrifugation bei 4°C wurde der Überstand ver
worfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.
Das AGPC-Verfahren wurde gemäß der Prozedur von Chomczyinski,
P. et al. (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) durchgeführt.
Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (6 M Guanidiniumthiocya
nat, 37,5 mM Natriumcitrat, 0,75% Natrium-N-Lauroylsarcosin
und 0,15 M 2-Mercaptoethanol) in einem Teströhrchen mit ei
nem Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 µl einer Zellsuspen
sion gegeben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Da
nach wurden 6 µl 2 M Natriumacetat (pH 4) zugegeben, und das
Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurden
60 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben, und das Gemisch
wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Im nächsten Schritt wurden 12 µl
einer Lösung (Chloroform/iso-Amylalkohol = 49 : 1) zugege
ben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann
wurde das flüssige Gemisch 15 Minuten in Eiswasser gekühlt
und bei 4°C 20 Minuten mit 15 000 UpM zentrifugiert. Ein
Teil (60 µl) des Überstandes (wäßrige Phase) wurde entnommen
und mit 60 µl iso-Propylalkohol vermischt. Das Gemisch wurde
gerührt und 1 Stunde bei -20°C gekühlt. Danach wurde der
Überstand verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 75%iger
Ethanol gegeben und anschließend wurde gerührt. Im letzten
Schritt wurde das Gemisch 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert,
und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren
im Präzipitat verblieben. Die in den beiden herkömmlichen
Verfahren erhaltenen Präzipitate wurden nach der vorstehend
bereits beschriebenen Prozedur analysiert. Die Analyseergeb
nisse sind nachstehend in Tabelle I gezeigt. Aus Tabelle I
geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren den beiden
herkömmlichen Verfahren bezüglich der Extraktionseffizienz
überlegen ist.
E. coli (JM 109) wurde in L-Nährmedium gezüchtet. Beim Er
reichen einer Dichte von E. coli-Zellen von 2×10⁸ pro ml
Kulturlösung wurde 1 ml der Lösung in ein 1,5 ml Probenröhr
chen gegeben und 1 Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen, und das Präzipitat wurde in 50 µl
L-Nährmedium suspendiert. Zur Suspension wurden 2 µl (20 µg)
Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und damit vermischt. Da
nach wurden 250 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat,
15 mM Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60%
iso-Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20
Sekunden gerührt. Danach wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zen
trifugiert, um die Nucleinsäuren zu sedimentieren. Der Über
stand wurde verworfen und 250 µl 40%iger iso-Propylalkohol,
der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge
geben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1
Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde
verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben
Die DNA-Menge und die Gesamtmenge von Nucleinsäuren (DNA +
RNA) wurden analog zu Beispiel 1 gemessen, und die RNA-Menge
wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle II gezeigt.
1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
und 20 µl Serum von Patienten mit Heptatis B wurden zusammen
in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml
gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini
umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol
zugegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden ge
rührt. Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden
die Nucleinsäuren in das Sediment gebracht. Der Überstand
wurde verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger
iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, gege
ben. Danach wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute
bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,
wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.
Zum Präzipitat wurden 25 µl eines PCR-Reagenz (Takara Shuzo
Co., Ltd.) gegeben und eine PCR wurde über 40 Cyclen unter
Verwendung eines DNA-Thermal-Cyclers (PCR-Maschine, Perkin-
Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen
Primer wurden zur spezifischen Amplifikation von Hepatitis
B-Virus (HBV) spezifischen Nucleinsäuren verwendet und die
PCR-Bedingungen waren wie folgt:
Basensequenzen der Primer
5′-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3′
5′-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3′
5′-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3′
5′-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3′
Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer
Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be
treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid
miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 ge
zeigt.
1 µl Dextran (10 µg) mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C
in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml
gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini
umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko
hol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt.
Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die
Nucleinsäuren sedimentiert. Der überstand wurde gefällt, und
100 µl 40%-iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid
enthielt, wurden zum Präzipitat gegeben. Danach wurde ca. 20
Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu
giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu
ren im Präzipitat verblieben.
Das Präzipitat wurde mit 10 µl eines Reagenz für die reverse
Transkription (Takara Shuzo Co., Ltd.) versetzt und darin
gelöst. Danach wurde eine reverse Transkriptionsreaktion mit
einem DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt.
Die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend angegeben.
Anschließend wurden zu 5 µl der Lösung der reversen Tran
skriptionsreaktion 20 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die
PCR wurde über 40 Zyklen unter Verwendung eines DNA-Thermal-
Cyclers (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend
beschriebenen Primer wurden zur spezifischen Amplifikation
von Nucleinsäuren des Hepatitis C-Virus (HCV) verwendet. Die
Bedingungen für die PCR sind nachfolgend angegeben:
Basensequenzen der Primer
5′-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3′
5′-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3′
5′-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3′
5′-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3′
Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer
Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be
treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid
miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 ge
zeigt.
2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis
C in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml
gegeben. Danach wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini
umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko
hol) zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden ge
rührt. Durch 3minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden
die Nucleinsäuren sedimentiert. Die Überstände wurden ver
worfen und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Ka
liumchlorid enthielt, wurde zum Sediment gegeben. Anschlie
ßend wurde ca. 20 Sekunden gerührt und 1 Minute bei 15 000 UpM
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die
Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.
Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse
Transkription vermischt und darin gelöst. Danach wurde eine
reverse Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4 durchge
führt. Anschließend wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl
der Reaktionslösung der reversen Transkription vermischt,
und die PCR wurde analog zu den in Beispiel 4 genannten Be
dingungen durchgeführt.
Zum Vergleich wurde Nucleinsäure nach dem Natriumjodid-Ver
fahren (Ishizawa, M. et al. in Nucleic Acid Res. 19 (20)
(1991), 5792) extrahiert. Zuerst wurden 100 µl Serum von Pa
tienten mit Hepatitis C in Teströhrchen mit einem Fassungs
vermögen von je 1,5 ml gegeben. Dann wurden 300 µl eines
Reagenz, das 6 M NaJ, 13 mM EDTA, 0,5% Natrium-N-Lauroyls
arcosin, 10 µg Glycogen und Tris-HCl (pH 8) enthielt, zuge
geben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. An
schließend wurde 15 Minuten bei 60°C inkubiert. Danach wur
den 400 µl iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch
wurde ungefähr 20 Sekunden gerührt und anschließend 15 Minu
ten stehengelassen. Dann wurde die Lösung 5 Minuten bei
15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen.
Im nächsten Schritt wurde 1 ml 40%iger iso-Propylalkohol zu
gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und
anschließend 5 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen, die Nucleinsäuren befanden sich
im Präzipitat. Das Präzipitat wurde einer reversen Tran
skriptionsreaktion und einer PCR unter denselben Bedingun
gen, wie sie im vorstehenden Absatz beschrieben wurden, un
terworfen. Nach Beendigung der PCR wurden 4 µl der Reakti
onslösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
mit einem von Tosoh Corp. hergestellten Apparat untersucht.
Die Säule enthielt das TSK-Gel G4000SW zur Gel-Permeations-
Chromatographie und der Nachweis durch UV-Absorption wurde
bei 260 nm mit einem UV 8000 (Tosoh Corp.), durchgeführt. Das
Elutionsmittel war Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) und
die Flußrate betrug 1 ml/Minute. Die Analyseergebnisse sind
in Tabelle III aufgeführt. Das erfindungsgemäße PCR-Amplifi
kationsprodukt wurde in einer Menge von durchschnittlich 26 ng
pro 10 µl PCR-Lösung nachgewiesen. Wenn nach dem Natri
umjodid-Verfahren gearbeitet wurde, konnten demgegenüber nur
3 ng des Amplifikationsproduktes nachgewiesen werden.
1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B
parallel in einer Reihe von Probenröhrchen, von denen jedes
ein Fassungsvermögen von 0,5 ml aufwies, gegeben. Zu den
Proben wurden verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C
(siehe unten) gegeben und damit vermischt:
- (1) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;
- (2) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Kaliumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol; und
- (3) 100 µl Reagenz C, enthaltend 3,2 M Guanidiniumhydrochlo rid, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol.
Nach Zugabe dieser unterschiedlichen Zusammensetzungen von
Reagenz C und dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM
zentrifugiert, so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat
gelangten. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%
iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zuge
geben. Dann wurde 20 Sekunden gerührt, das Gemisch 1 Minute
bei 15 000 UpM zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Die Nucleinsäuren befanden sich weiter im Präzipitat. Die so
extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3 einer
PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektropho
rese durchgeführt und die optischen Dichten der betreffenden
produzierten Banden miteinander verglichen. Die Ergebnisse
sind in Fig. 3 gezeigt. Die Lösungen, die die Zusammenset
zungen (1) bis (3) des Reagenz C enthielten, produzierten
offensichtlich Banden mit vergleichbaren Intensitäten.
Je 1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurden gemeinsam mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepa
titis B in eine Reihe von Probenröhrchen mit einem Fassungs
vermögen von je 0,5 ml gegeben. Verschiedene Zusammensetzun
gen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben
und damit vermischt:
- (1) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% n-Propylalkohol;
- (2) 100 µl Reagenz c, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol;
- (3) 80 µl Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocyanat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38% Na trium-N-Lauroylsarcosin und 50% n-Butylalkohol;
- (4) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% n-Butylalkohol;
- (5) 80 µl Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocyanat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38% Na trium-N-Lauroylsarcosin und 50% sek.-Butylalkohol; und
- (6) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% sek.-Butylalkohol.
Nach Zugabe dieser verschiedenen Zusammensetzungen von Rea
genz C und nach dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM
zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipi
tat gebracht wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl
40%iger iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt,
wurde zugegeben. Es wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. Da
nach wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu
giert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nuclein
säuren weiter im Präzipitat verblieben. Die so extrahierten
Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3, einer PCR unter
worfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektrophorese durch
geführt und die optischen Dichten der betreffenden Banden
verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Es ist
offensichtlich, daß die die Zusammensetzungen (1) bis (6)
von Reagenz C enthaltenden Lösungen zu Banden vergleichbarer
Intensitäten führten.
1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B
in eine Reihe von Probenröhrchen mit jeweils 0,5 ml
Fassungsvermögen gegeben. Verschiedene Zusammensetzungen von
Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und da
mit vermischt:
- (1) 80 µl von Reagenz C, enthaltend 3 M Guanidiniumthiocya nat, 19 mM Natriumcitrat, 75 mM 2-Mercaptoethanol, 0,38 Natrium-N-Lauroylksarcosin und 50% tert.-Amylalkohol;
- (2) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Laroylsarcosin und 60% tert.-Amylalkohol;
- (3) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% tert.-Butylalkohol; und
- (4) 100 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM 2-Mercaptoethanol, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol.
Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach
dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert,
so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden.
Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Pro
pylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, zugegeben.
Dann wurde 20 Sekunden gerührt. Danach wurde das Gemisch 1
Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde
verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat ver
blieben. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu
Beispiel 3 einer PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde
eine Elektrophorese durchgeführt und die optischen Dichten
der betreffenden Banden miteinander verglichen. Die Ergeb
nisse sind in Fig. 5 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die
die verschiedenen Zusammensetzungen von Reagenz c enthalten
den Lösungen zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führ
ten.
Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml
wurden mit 0, 0,5, 1, 2 und 5 µl (0, 5, 10, 20 und 50 µg)
einer Acrylamidlösung (Molekulargewicht ungefähr 0,7×10⁵)
bzw. 2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
beladen. Weiterhin wurden je 100 µl Serum von Patienten
mit Hepatitis C in die Röhrchen gegeben und die Gemische ca.
5 Sekunden gerührt. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Gua
nidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propyl
alkohol) zugegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten
bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in
das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verwor
fen, und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kali
umchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat gegeben. Nach 20
Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifu
giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu
ren weiter im Präzipitat verblieben.
Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse
Transkription versetzt und darin gelöst. Die Lösung wurde
einer reversen Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4
unterworfen. Danach wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl
Reaktionslösung (der reversen Transkription) vermischt und
analog zu Beispiel 4 wurde eine PCR durchgeführt. Nach Been
digung der PCR wurden 10 µl der Reaktionslösung durch Hoch
auflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat
von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 untersucht. Die Analy
seergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV beschrie
ben.
In Abwesenheit von mit einer Nucleinsäure copräzipitierendem
Acrylamid, wurde keine Hepatitis C-Virus-RNA extrahiert,
weshalb kein PCR-Amplifikationsprodukt nachweisbar war. Bei
einer Zugabe von Acrylamid in Mengen von 20 µg oder mehr
wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca.
35 ng nachgewiesen. Bei Zugabe von 20 µg Dextran wurde das
PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca. 44 ng nach
gewiesen.
Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 4 extrahiert und ei
ner PCR unterworfen, wobei aber Dextran (mit einem Moleku
largewicht von 5×10⁵) in variierenden Mengen von 0, 0,2,
0,4, 0,8, 1,6, 3,2 und 6,4 µl (0, 2, 4, 8, 16, 32 und 64 µg)
zugegeben wurde. Nach Ende der PCR wurde eine Elektrophorese
durchgeführt und die optischen Dichten der Banden wurden
durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen.
Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Es ist offensicht
lich, daß beim Fehlen von mit Nucleinsäuren copräzipitieren
dem Dextran keine Hepatitis B-Virus-DNA extrahiert und des
halb keine Bande nachgewiesen wurde. Wenn Dextran in Mengen
von 16 µg oder mehr zugegeben wurde, waren die Intensitäten
der Banden nahezu miteinander vergleichbar.
Analog zu Beispiel 3 wurden Nucleinsäuren extrahiert und ei
ner PCR unterworfen. Dabei wurde aber Dextran durch Carboxy
methylcellulose (Produkt von SIGMA, niedrige Viskosität) er
setzt. Diese wurde in einer Menge von 1 µl (10 µg) verwen
det. Nach Beendigung der PCR wurde eine Elektrophorese
durchgeführt, und die optischen Dichten der Banden wurden
durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen.
Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt. Es ist offensichtlich,
daß die Bandenintensitäten miteinander nahezu vergleichbar
waren, wenn Dextran bzw. Carboxymethylcellulose als Träger
verwendet wurden (als Referenz ist das Ergebnis der Extrak
tion bei Verwendung von Dextran in Fig. 7 ebenfalls ge
zeigt).
Teströhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 1,5 ml wurden
mit 2 µl (2 µg) einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht
5×10⁵) beladen. Dazu wurden 20 µl HBV-PCR-Reaktionslösung
und 80 µl Wasser gegeben und miteinander vermischt. An
schließend wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini
umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM β-Mercaptoethanol
und 60% iso-Propylalkohol) zugefügt. Nach 20 Sekunden Rüh
ren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch
die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der
Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Propylalko
hol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat
gegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die
Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Auflösen
wurden dann 20 µl Wasser zum Präzipitat gegeben.
Die PCR-Lösung (10 µl) wurde sowohl vor als auch nach der
Extraktion von Nucleinsäuren durch Hochauflösungs-Flüssig
keits-Chromatographie analog zu Beispiel 5 mit einem Apparat
von Tosoh Corp. analysiert. Die Säule enthielt das TSK-Gel
G3000SW für die Gel-Permeations-Chromatographie.
Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt, aus der sich ersehen
läßt, daß sowohl das PCR-Amplifikationsprodukt als auch das
Primer-Oligomer in Ausbeuten von beinahe 100% wiedergewon
nen werden. Es wird außerdem deutlich, daß sowohl der Primer
als auch die Desoxyribonucleosid-Triphosphate entfernt wor
den waren.
2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵
wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis
B in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml
gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini
umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko
hol) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Sekunden gerührt und
dann 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die
Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Über
stand wurde verworfen und 20 µl 40%iger iso-Propylalkohol,
der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Danach
wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die
Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Präzipi
tat wurden 50 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die PCR
wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt.
Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren nach dem Natri
umjodid-Verfahren (Ishizawa, M. et al., in Nucleic Acid Res.
19(20) (1991), 5792) analog zu Beispiel 5 extrahiert, und
eine PCR wurde in der gleichen Weise, wie sie gerade vorste
hend beschrieben wurde, durchgeführt. Nach Beendigung der
PCR wurden 10 µl Reaktionslösung durch Hochauflösungs-Flüs
sigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Apparates
von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 analysiert.
Die Analyseergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Das erfin
dungsgemäß erhaltene PCR-Amplifikationsprodukt wurde in ei
ner Menge von durchschnittlich 7,5 ng pro 10 µl PCR-Lösung
nachgewiesen, wohingegen nur 4,3 ng des nach dem Natriumjo
didverfahren erhaltenen Amplifikationsproduktes nachgewiesen
werden konnten. Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse zeigen
den Mittelwert von 4 Proben.
PCR-Amplifikationsprodukt (ng) | |
Erfindung | |
7,5 | |
Natriumjodid-Verfahren | 4,3 |
Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml
wurden jeweils mit einem der nachfolgenden Träger bela
den:
- (1) 2 µl (20 µg) Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵);
- (2) 1 µl (10 µg) Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) und 1 µl (10 µg) Acrylamid (Molekulargewicht 7×10⁵);
- (3) 1 µl (10 µg) Acrylamid (Molekulargewicht 7×10⁵) und 1 µl (10 µg) Carboxymethylcellulose (Produkt von SIGMA; niedrige Viskosität).
Weiterhin wurden in die Röhrchen 100 µl Serum von Patienten
mit Hepatitis B gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M
Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Pro
pylalkohol) gegeben, und die Gemische wurden ca. 20 Sekunden
gerührt. Durch 3 Minuten Zentrifugation bei 15 000 UpM wur
den die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt. Der Über
stand wurde verworfen und 200 µl 40%-iger iso-Propylalkohol,
der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge
geben. Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und 1 Minute
bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,
wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben.
Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und eine
PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Vervoll
ständigung der PCR, wurde analog zu Beispiel 5 die PCR-Lö
sung durch Hochauflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit
einem Apparat von Tosoh Corp. analysiert. Die Analyseergeb
nisse sind nachstehend in Tabelle VI gezeigt. Es ist offen
sichtlich, daß ein einzelner Träger und ein Gemisch von zwei
Trägern zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führten.
Die Ergebnisse der Tabelle VI geben einen Mittelwert von 4
Proben wieder.
Träger | |
PCR-Amplifikationsprodukt (ng) | |
Dextran | |
37 | |
Dextran und Acrylamid | 33 |
Acrylamid und Carboxymethylcellulose | 37 |
Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 0,5 ml
wurden mit je 2 µl (20 µg) einer Lösung von Dextran
(Molekulargewicht 5×10⁵) beladen. In die Röhrchen wurden
außerdem 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B gegeben.
Verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten)
wurden zu den Proben gegeben und damit vermischt:
- (1) 500 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol;
- (2) 500 µl Reagenz C, enthaltend 2,4 M Guanidiniumthiocya nat, 15 mM Natriumcitrat, 30% iso-Propylalkohol und 30% tert.-Butylalkohol.
Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach
dem Vermischen wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert,
um die Nucleinsäuren in das Präzipitat zu überführen. Der
Überstand wurde verworfen, und 200 µl 40%-iger iso-Propylal
kohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben.
Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minuten
bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,
wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben.
Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und die PCR
wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Beendigung der
PCR, wurde die PCR-Lösung analog zu Beispiel 5 durch Hoch
druck-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von To
soh Corp. analysiert. Die Analyseergebnisse sind in der
nachstehenden Tabelle VII gezeigt. Wenn das Reagenz C nur
iso-Propylalkohol enthielt, wurde das PCR-Amplifikationspro
dukt in einer Menge von durchschnittlich 42 ng pro 10 µl
PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Wenn das Reagenz C iso-
Propylalkohol und tert.-Butylalkohol enthielt, wurde das
PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von durchschnitt
lich 33 ng pro 10 µl PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Die
in Tabelle VII gezeigten Ergebnisse geben die Mittelwerte
von 2 Proben wieder.
In Reagenz C enthaltener Alkohol | |
PCR-Amplifikationsprodukt (ng) | |
iso-Propylalkohol | |
42 | |
iso-Propylalkohol und tert.-Butylalkohol | 33 |
Die vorliegende Erfindung bietet eine Reihe von Vorteilen,
die nachfolgend deutlich werden. Mindestens ein aus den Sub
stanzen Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Ka
liumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A,
und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-
Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Bu
tylalkohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B,
werden vorbereitend vermischt, um das Reagenz C herzustel
len. Dies macht es möglich, die Menge zu verringern, in
denen diese Reagenzien verwendet werden müssen. Als Beispiel
sei ein Fall betrachtet, bei dem eine 10 µl-Probe so be
schaffen ist, daß sie ein proteindenaturierendes Agens und
iso-Propanol in den Endkonzentrationen 2 M bzw. 50% ent
hält. Im Guanidiniumverfahren ist typischerweise die Zugabe
einer 6 M Guanidiniumlösung in einer Menge von 20 µl nötig,
und dann wird ungefähr 100%-iger iso-Propylalkohol in einer
Menge von 30 µl zugegeben. Im Gegensatz dazu verlangt das
erfindungsgemäße Verfahren die Zugabe von lediglich 20 µl
eines Nucleinsäure extrahierenden Reagenz, das sich aus ca.
75%-igem iso-Propylalkohol zusammensetzt, der 3 M
Guanidiniumthiocyanat enthält. Beim Guanidiniumverfahren er
geben sich am Ende 60 µl einer Lösung, die die Probe, 2 M
Guanidiniumthiocyanat und ca. 50% iso-Propanol enthält, wo
hingegen sich erfindungsgemäß nur 30 µl einer Lösung erge
ben, die dieselben Konzentrationen aufweisen. Somit läßt
sich der flüssige Abfall, der nach dem Extraktionsverfahren
entsorgt werden muß, dementsprechend vermindern. Außerdem
müssen beim erfindungsgemäßen Verfahren keine giftigen oder
gefährlichen Substanzen, wie Chloroform oder Phenol verwen
det werden und es kann daher verglichen mit den herkömmli
chen Verfahren verhältnismäßig leicht durchgeführt werden.
Erfindungsgemäß werden die extrahierten Nucleinsäuren im
Präzipitat erhalten, und die vorliegende Erfindung kann mit
außerordentlich einfachen Verfahrensschritten durchgeführt
werden, wenn man einen Vergleich mit Verfahren aus dem Stand
der Technik vornimmt, bei denen es auf die Löslichkeit der
Nucleinsäure in zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten ankommt,
und bei denen die flüssige Phase, in der die interessierende
Nucleinsäure gelöst ist von der anderen flüssigen Phase ab
getrennt werden muß, um die Nucleinsäure zu extrahieren.
Beim Nacharbeiten der vorliegenden Erfindung werden somit
keine großen Anforderungen an die Geschicklichkeit gestellt,
die gewünschten Nucleinsäuren können jedoch mit gleichblei
bend hoher Effizienz extrahiert werden.
Vorteilhaft ist ferner, daß das Reagenz A erfindungsgemäß im
Reagenz C, das zur Probe gegeben wird, in einer niedrigeren
Konzentration enthalten sein kann, und damit sein Auskri
stallisieren wirksam verhindert wird. Außerdem läßt sich die
Konzentration von Reagenz B ebenfalls genügend weit vermin
dern, um seine Verdampfung zu verhindern. Dadurch eignet
sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für eine auto
matisierte Verwendung. Wenn die Reagenzien A und B einzeln
verwendet werden, ist es im allgemeinen schwierig, die Ge
nauigkeit ihrer Zugabe in kleinen Mengen zu optimieren. Man
kann jedoch erwarten, daß sich das erfindungsgemäße Reagenz
zur Extraktion von Nucleinsäuren mit höherer Genauigkeit zu
geben läßt.
Erfindungsgemäß werden Träger und Reagenz C, das die Reagen
zien A und B enthält, verwendet. Abgesehen von den vorste
hend genannten Vorteilen liefert die Erfindung die Möglich
keit, Nucleinsäuren mit einer höheren Effizienz zu extrahie
ren als mit den herkömmlichen Verfahren.
Dem zweiten Aspekt der Erfindung gemäß, stellt die Erfindung
ein Verfahren zum Nachweis einer bestimmten Nucleinsäurese
quenz bereit, das die Durchführung einer PCR und die Messung
der Fluoreszenzintensität in einem geschlossenen Gefäß er
laubt. Somit beinhaltet bei einem Vergleich mit herkömmli
chen Verfahren, die lediglich Nucleinsäuren durch die PCR
amplifizieren, und die amplifizierten Nucleinsäuren nachwei
sen, das erfindungsgemäße Nachweisverfahren eine einfache
Prozedur und bietet außerdem die Möglichkeit, die Wahr
scheinlichkeit einer Aerosolbildung wirksam zu vermindern.
Claims (4)
1. Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer
Probe, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfolgenden
Schritte umfaßt:
- (1) Vermischen der Probe mit einem Träger, der minde stens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose ist, um ein flüssiges Gemisch zu erzeugen;
- (2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit Reagenz C, um die Nucleinsäuren und den Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalko hol ausgewähltes Reagenz B enthält; und
- (3) Separieren von gefällten Nucleinsäuren und gefälltem Träger aus der flüssigen Phase
2. Verfahren zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäu
resequenz, dadurch gekennzeichnet, daß es die nachfol
genden Schritte umfaßt:
- (1) Vermischen der Probe mit einem Träger, der minde stens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid, Car boxymethylcellulose ist, um ein flüssiges Gemisch zu erzeugen;
- (2) Vermischen des flüssigen Gemisches mit Reagenz C, um die Nucleinsäuren und den Träger auszufällen, wobei das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalko hol ausgewähltes Reagenz B enthält;
- (3) Separieren von gefällten Nucleinsäuren und gefälltem Träger aus der flüssigen Phase;
- (4) Überführen der separierten Nucleinsäuren in DNA durch eine reverse Transkriptionsreaktion, wenn es sich bei ihnen um RNA handelt;
- (5) Unterwerfen der entweder in Schritt (3) separierten oder in Schritt (4) erhaltenen Nucleinsäuren einer Polymerasekettenreaktion in einer PCR-Lösung, die ein Gemisch von Mononucleosid-Triphosphaten, eine Polymerase, ein interkalierendes Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde enthält, die zur Amplifi kation mindestens einer spezifizierten Sequenz ge eignet ist;
- (6) Messen der Änderung der Fluoreszenzintensität, die als Ergebnis der PCR auftritt, oder der Änderung der Fluoreszenzintensität der Reaktionslösung während die PCR voranschreitet; und
- (7) Bestimmen (auf Grundlage der Änderung der Fluores zenzintensität), ob eine Nucleinsäure mit der spezi fizierten Sequenz in der Probe vorhanden war.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die PCR und die Messung
der Änderung der Fluoreszenzintensität in einem ge
schlossenen Gefäß durchgeführt wird, das die extrahier
ten Nucleinsäuren und die PCR-Lösung in einem hermetisch
abgeschlossenen Zustand enthält.
4. Reagenzienpackung zur Extraktion von Nucleinsäuren, die
voneinander getrennt mindestens einen Träger und ein
Reagenz C enthält, wobei
- (1) der Träger mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethylcellulose ist; und
- (2) das Reagenz C mindestens ein aus den Substanzen Gua nidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kalium thiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Rea genz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Pro pylalkohol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B enthält.
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