DE4333805A1

DE4333805A1 - Process for extraction of nucleic acids and method for detecting specified nucleic acid sequences

Info

Publication number: DE4333805A1
Application number: DE19934333805
Authority: DE
Inventors: Hiroaki Yamagishi
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1993-08-24
Filing date: 1993-10-04
Publication date: 1995-03-02
Anticipated expiration: 2013-10-05
Also published as: JP3451667B2; JPH0759572A; DE4333805C2

Abstract

The invention provides a process for extracting nucleic acids from a sample, which comprises the following steps: - mixing the sample with a carrier which is at least one of the substances dextran, acrylamide or carboxymethylcellulose in order to produce a liquid mixture; - mixing the liquid mixture with a reagent C in order to precipitate the nucleic acids and the carrier, where the reagent C contains at least one reagent A selected from the substances guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and sodium thiocyanate, and at least one reagent B selected from the substances n-propyl alcohol, isopropyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and tert-amyl alcohol; and - separating the precipitated nucleic acids and the precipitated carrier from the liquid phase. The process is easier to use than the procedures hitherto practised, it contains a smaller number of steps, is able to reduce the possibility of aerosol formation, can be carried out within a short time, requires no phenol or chloroform and, nevertheless, achieves a constant efficiency of extraction of nucleic acids. Also disclosed is a method for detecting a particular nucleic acid sequence.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe. Genauer gesagt, betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und ein Verfahren zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäu resequenz, das sich in Biotechnologie und klinischer Dia gnose verwenden läßt.The invention relates to a method for the extraction of Nucleic acids from a sample. More precisely, that concerns Invention a method for the extraction of nucleic acids and a method of detecting a specified nucleic acid resequence in Biotechnology and Clinical Dia to use Gnose.

Das Extrahieren von Nucleinsäuren aus einer Probe stellt ein wichtiges Verfahren in der Biotechnologie, in der klinischen Diagnose und in anderen Gebieten dar. In Gen-Rekombinations- Verfahren ist z. B. sowohl das Isolieren der zu clonierenden DNA als auch von Vektor-DNA erforderlich, und zur Durchfüh rung eines Gen-Tests auf genetische Krankheiten und Krebs- Gene ist es notwendig, Nucleinsäuren z. B. aus den im Blut vorhandenen Leukozytenzellen zu extrahieren. Extraction of nucleic acids from a sample is discontinued important procedure in biotechnology, in clinical Diagnosis and in other areas. In gene recombination Procedure is z. B. both isolating the to be cloned DNA as well as vector DNA required, and to be carried out genetic testing for genetic diseases and cancer Genes it is necessary to use nucleic acids z. B. from those in the blood Extract existing leukocyte cells.

Nucleinsäuren kommen im allgemeinen nicht als freie Moleküle vor, sondern in Bakterien, Zellen, Viruspartikeln usw., wo sie mit Zellmembranen und -wänden bedeckt sind, die sich aus Proteinen, Lipiden und Polysacchariden zusammensetzen. Nucleinsäuren selbst bilden Komplexe mit Histonen und ande ren Proteinen. Zur Extraktion von Nucleinsäuren, die in die ser Weise vorliegen, müssen die sie bedeckenden Zellmembra nen und -wände aufgebrochen werden, und die Proteine des er wähnten Komplexes müssen denaturiert oder abgebaut werden, um sie so zu solubilisieren. Dadurch werden die Nucleinsäu ren freigesetzt und können dann extrahiert werden.Nucleic acids are generally not free molecules but in bacteria, cells, virus particles, etc., where they are covered with cell membranes and walls that are made up of Assemble proteins, lipids and polysaccharides. Nucleic acids themselves form complexes with histones and others ren proteins. For the extraction of nucleic acids in the If this is the case, the cell membranes that cover them must be covered The walls and walls are broken up, and the proteins of the he thought complex must be denatured or degraded, to solubilize her that way. This will make the nucleic acid released and can then be extracted.

Herkömmlicherweise werden Nucleinsäuren nach einem der nach folgenden Verfahren extrahiert:Conventionally, nucleic acids are after any of extracted the following procedure:

(i) The so-called proteinase K / phenol method in which a proteolytic enzyme such as proteinase K or a interface-active substance is added, whereby the Cell membrane or wall broken up and the protein of the complex in question, and Nuclein acids are released. Then phenol / chloroform is added, and the mixture is centrifuged, whereby the nucleic acids are transferred into the aqueous phase who the. The aqueous phase is then separated and further used. Ethanol, iso-propyl alcohol or something similar is added to the aqueous phase, whereby the Nucleic acids are precipitated (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Appendices E3-E4, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989);
(ii) The so-called AGPC method, in which a liquid Mixture of guanidinium isothiocyanate and phenol given sample to cell membrane and wall to break up and the protein of the complex too denature and solubilize. The nucleic acids are then released, and chloroform is added to add the nucleic acids to the aqueous phase convict. The aqueous phase is separated and white ter used. Thereafter, ethanol, isopropanol or something similar to the aqueous phase, whereby the nucleic acids are precipitated (acid guanidinium Thiocyanates Phenol-Chloroform Method: Analytical Bio chemistry 162 (1987), pp. 156-159);
(iii) The so-called guanidinium process, in which Guanidi niumhydrochloride or guanidinium thiocyanate be is given to cell membrane and meeting Cell wall break down and the protein of the complex to denature and solubilize. The nucleic acid ren are then released, and z. For example, ethanol becomes Precipitation of the free nucleic acids added (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 7.23-7.25, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; and Analytical Biochemistry 162 (1987) p. 463; and
(iv) The so-called sodium iodide method. This is Gly cogen-containing sodium iodide (glycogen has a Affinity for the nucleic acid to be extracted) given sample to cell membrane and wall to break up and denatur the protein of the complex freeze and solubilize. The nucleic acids will be then released, and iso-propanol becomes precipitate of free nucleic acids and glycogen added (Nucleic Acid Res. 19 (20): 592 (1991)).

Sämtliche vier vorstehend beschriebenen Verfahren weisen spezifische Nachteile auf. Das Proteinase K-/Phenol-Verfah ren schließt komplizierte Prozeduren ein, da der Abbau durch proteolytische Enzyme lange dauert und da eine Kontrolle der Temperatur für eine wirksame enzymatische Reaktion notwendig ist. Außerdem sind Phenol und Chloroform toxische Chemika lien (beide fallen unter die gesetzlich als giftig und ge fährlich eingestuften Substanzen), und bei ihrer Handhabung ist das Tragen von Schutzkleidung und -handschuhen und die Verwendung chemischer Abzüge usw. notwendig. Ferner muß der aus der Extraktionsprozedur stammende flüssige Abfall spe ziell entsorgt werden, wodurch mehr Zeit und zusätzliche Ge rätschaften benötigt und Extrakosten verursacht werden. Au ßerdem bedarf es einer großen Geschicklichkeit, die wäßrige Phase, in die die betreffenden Nucleinsäuren überführt wur den, abzutrennen. Dies macht es schwierig, eine gleichblei bende Effizienz bei der Extraktion von Nucleinsäuren zu er reichen.All four methods described above have specific disadvantages. The proteinase K / phenol procedure includes complicated procedures, as the degradation by proteolytic enzymes takes a long time and there is a control of Temperature necessary for an effective enzymatic reaction is. In addition, phenol and chloroform are toxic chemicals (both fall under the law as toxic and ge dangerous substances), and in their handling is the wearing of protective clothing and gloves and the Use of chemical deductions, etc. necessary. Furthermore, the from the extraction procedure derived liquid waste spe be disposed of, thus saving more time and additional resources needed and extra costs are incurred. Au In addition, it requires a great deal of skill, the watery Phase into which the relevant nucleic acids were transferred the, to separate. This makes it difficult to achieve the same Efficiency in the extraction of nucleic acids to it rich.

Ähnliche Probleme gibt es im AGPC-Verfahren bezüglich der Handhabung von Phenol und Chloroform und ebenfalls bezüglich der Extraktionseffizienz. Diese ist abhängig vom Abtrennen und von der Rückgewinnung der wäßrigen Phase, in die die entsprechende Nucleinsäure überführt wurde. Außerdem ist das AGPC-Verfahren speziell für die Extraktion von RNA entwickelt und zur Extraktion von DNA ungeeignet.Similar problems exist in the AGPC procedure with regard to the Handling of phenol and chloroform and also with respect the extraction efficiency. This depends on the separation and from the recovery of the aqueous phase into which the corresponding nucleic acid was transferred. Besides, that is AGPC method especially for the extraction of RNA developed and unsuitable for the extraction of DNA.

Im Guanidiniumverfahren wird z. B. Ethanol nach der Zugabe von z. B. Guanidiniumhydrochlorid zur betreffenden Probe ge geben. Um einen nachfolgenden Abfall der Konzentration von Guanidinium in der Lösung zu verhindern, muß hochkonzen triertes (ca. 6 bis 8 M) Guanidinium verwendet werden. Damit ist aber eine erhöhte Möglichkeit des Auskristallisierens von Guanidiniumsalz gegeben (besonders im Winter, oder wenn die Raumtemperatur unter 20°C liegt). Das Auskristallisieren von Guanidiniumsalz kann zum Verstopfen von Pipetten oder anderen Ausrüstungsteilen führen, die zur Zugabe von z. B. Guanidiniumhydrochlorid verwendet werden, und dies stellt ein beträchtliches Hindernis für jeden Versuch dar, die Pro zedur des Guanidiniumverfahrens zu mechanisieren. Ethanol oder etwas ähnliches wird nach dem Guanidiniumhydrochlorid oder ähnlichem zugegeben. Die Endkonzentration von z. B. Ethanol muß 50 bis 70% betragen, um die Nucleinsäuren un löslich zu machen. Das Probenvolumen ist jedoch wegen der Zugabe von Guanidiniumhydrochlorid oder ähnlichem vergrö ßert, und deshalb muß man hochreinen Ethanol (ca. 100%) in einer Menge verwenden, die mindestens ebenso groß ist, wie die des flüssigen Gemisches von Probe und Guanidiniumhydro chlorid.In Guanidiniumverfahren z. For example, ethanol after the addition from Z. B. guanidinium hydrochloride ge the relevant sample give. To a subsequent drop in the concentration of To prevent guanidinium in the solution must be highly concentrated trated (about 6 to 8 M) guanidinium can be used. In order to but is an increased possibility of Auskristallisierens given by guanidinium salt (especially in winter, or when the room temperature is below 20 ° C). The crystallization of guanidinium salt may cause clogging of pipettes or other equipment lead to the addition of z. B. Guanidinium hydrochloride can be used and this provides a significant obstacle to any attempt to pro cedur of the guanidinium process to mechanize. ethanol or something similar becomes after guanidinium hydrochloride or the like is added. The final concentration of z. B. Ethanol must be 50 to 70% to the nucleic acids un to dissolve. The sample volume, however, is due to the Addition of guanidinium hydrochloride or the like magn It is therefore necessary to use high-purity ethanol (about 100%) in use a lot that is at least as big as that of the liquid mixture of sample and guanidiniumhydro chloride.

Das Natriumjodidverfahren ist mit dem Problem behaftet, daß es einer Inkubation bei 60°C bedarf, um Proteine oder ähnli ches zu solubilisieren, was zu einer niedrigen Effizienz bei der RNA-Extraktion führt. Ein weiteres Problem besteht darin, daß labile Jodidionen (J^-) dazu neigen, durch die Wirkung von z. B. Licht oxidiert zu werden und ein Jodmolekül (J₂) zu erzeugen. Um dies zu vermeiden, müssen die Reagen zien in einem kalten dunklen Raum gelagert werden.The sodium iodide process suffers from the problem that it requires incubation at 60 ° C to solubilize proteins or the like, resulting in low efficiency in RNA extraction. Another problem is that labile iodide ions (J ^- ) tend to be damaged by the action of e.g. B. light to be oxidized and to produce an iodine molecule (J₂). To avoid this, the reagents must be stored in a cold, dark room.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Molecular Cloning: A La boratory Manual, Kapitel 14, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) ist als ein Verfahren zur DNA-Amplifika tion bekannt mit dem man zum Gen-Test (zur genetischen Dia gnose) mit ultrahoher Empfindlichkeit in der Lage ist. Wenn die DNA-Amplifikation erfolgreich ist, besitzt die PCR das Potential zur mindestens 100 millionenfachen Amplifikation. Im Hinblick auf die Möglichkeit zur Amplifikation von sogar nur einem einzigen DNA-Molekül wird das Testergebnis jedoch beim Vorhandensein einer DNA (exogenen DNA), die in der PCR-Nucleinsäureprobe oder im PCR-Reagenz nicht anwesend sein sollte, nachteilig beeinträchtigt.The Polymerase Chain Reaction (PCR) (Molecular Cloning: A La boratory manual, chapter 14, New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) is as a method of DNA amplification tion known to the gene test (genetic Dia gnose) with ultra-high sensitivity. If the DNA amplification is successful, the PCR has the Potential for at least 100 million amplifications. With regard to the possibility of amplification of even however, the test result is only given to a single DNA molecule in the presence of a DNA (exogenous DNA) present in the PCR nucleic acid sample or not present in the PCR reagent should, adversely affected.

Eine Ursache für das Vorhandensein exogener DNA ergibt sich in dem Stadium, in dem Nucleinsäuren aus der vorliegenden Probe zur Präparation der PCR-Nucleinsäurprobe extrahiert werden. Dies betrifft auch das während der Nucleinsäureex traktion erzeugte Aerosol. Beim Proteinase K-/Phenol- oder beim AGPC-Verfahren wird sehr wahrscheinlich ein Aerosol er zeugt. Diese Verfahren beinhalten nämlich abgesehen von der Reagenzienzugabe zur Probe und von der Ausführung anderer Prozeduren wie dem Vermischen von Medien, außerdem zeitauf wendige Prozeduren, wie die Gewinnung der wäßrigen Phase durch Abtrennen. Die Aerosolpartikel haben einen Durchmesser von ungefähr 20 µm und ihr Volumen beträgt nur ungefähr 4×10^-6 µl. Wenn man z. B. einen an Hepatitis B leidenden Pati enten betrachtet, ergibt sich folgende Überlegung: In 1 µl Blut können ungefähr 10⁵ Viruspartikel enthalten sein. Somit kann ein Aerosolpartikel ein Viruspartikel enthalten. Mit anderen Worten, das Aerosol kann in der PCR, die zur Ampli fikation eines einzigen DNA-Moleküls in der Lage ist, ernst haften Schaden stiften. Deshalb gibt es einen Bedarf, die Anzahl der involvierten Verfahrensschritte zu vermindern.One cause of the presence of exogenous DNA arises at the stage when nucleic acids are extracted from the subject sample for preparation of the PCR nucleic acid sample. This also applies to the aerosol produced during the Nucleinsäureex traction. The proteinase K / phenol or the AGPC method is very likely an aerosol he testifies. Namely, besides the addition of reagents to the sample and the performance of other procedures such as the mixing of media, these methods also involve time consuming procedures such as separation of the aqueous phase. The aerosol particles have a diameter of about 20 μm and their volume is only about 4 × 10 ^-6 μl. If you z. For example, when examining a patient suffering from hepatitis B, the following consideration results: 1 μl of blood may contain approximately 10% of virus particles. Thus, an aerosol particle may contain a virus particle. In other words, the aerosol can seriously damage the PCR, which is capable of amplifying a single DNA molecule. Therefore, there is a need to reduce the number of involved process steps.

Zur Verminderung der Aerosolbildung in einem PCR-Verfahren wurde in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 487 218 vorge schlagen, die PCR in einem hermetisch abgeschlossenen Zu stand, unter Verwendung eines interkalierenden Fluoreszenz farbstoffes (eines Fluorochroms) zur Quantifizierung einer Ziel-DNA in einer Probe durchzuführen. Das Problem, die Ae rosolbildung bei der Extraktion der Nucleinsäure aus der Probe zu reduzieren, bleibt jedoch bestehen.To reduce aerosol formation in a PCR method was featured in European Patent Application No. 487,218 suggest that the PCR be in a hermetically sealed state using an intercalating fluorescence dye (of a fluorochrome) for quantifying a To perform target DNA in a sample. The problem, the Ae rosolbildung in the extraction of nucleic acid from the However, reducing sample remains.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, die vorstehend ge nannten Probleme der herkömmlichen Verfahren zur Nuclein säure-Extraktion zu beseitigen oder zu verringern.An object of the invention is that the ge above mentioned problems of conventional methods for nuclides acid extraction to eliminate or reduce.

Genauer gesagt besteht diese Aufgabe in der Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Extraktion von DNA und RNA, das leicht durchzuführen ist, eine geringere Anzahl von Schrit ten einschließt, fähig ist, die Möglichkeit einer Aerosol bildung zu verringern, innerhalb kurzer Zeit ausführbar ist, kein Phenol oder Chloroform verwendet und dennoch eine gleichbleibende Wirksamkeit bei der Extraktion von Nuclein säuren erreicht.More specifically, this task is to provide a new method for extraction of DNA and RNA, the easy to perform, a smaller number of steps including the possibility of an aerosol reduce education, is executable within a short time, no phenol or chloroform used and still one consistent efficiency in the extraction of Nuclein achieved acids.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung eines Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren aus einer Probe gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:This object is achieved by the provision according to the invention a method for extracting nucleic acids from a Sample comprising the following steps:

(1) Mix the sample with a carrier to produce egg a liquid mixture, wherein the carrier at least one of the substances dextran, acrylamide or carboxyme thylcellulose is;
(2) mixing the liquid mixture with the reagent C to Precipitate nucleic acids and carriers, the reagent C at least one of the substances guanidinium thiocya nat, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and Na triisocyanate selected reagent A and at least one among the substances n-propyl alcohol, iso-propylal alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butylal alcohol and tert.-amyl alcohol selected reagent B ent holds; and
(3) Separation of precipitated nucleic acids and carriers the liquid phase.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereit stellung eines Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäuresequenz, das die Gefahr einer Aerosol-Kontamina tion vermeidet oder vermindert.Another object of the invention is the ready provision of a procedure for the proof of a specified Nucleic acid sequence that poses the danger of an aerosol contamina tion avoids or reduces.

Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäße Bereitstellung eines Nachweisverfahrens gelöst, das die nachfolgenden Schritte umfaßt:This object is achieved by the provision according to the invention solved a verification procedure, the following Steps includes:

(1) Mix the sample with a carrier to produce egg a liquid mixture, wherein the carrier at least one of the substances dextran, acrylamide or carboxyme thylcellulose is;
(2) mixing the liquid mixture with the reagent C to Precipitate nucleic acids and carriers, the reagent C at least one of the substances guanidinium thiocya nat, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and Na triisocyanate selected reagent A and at least one from the substances n-propyl alcohol, iso-propyl alcohol hol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol hol and tert-amyl alcohol selected reagent B ent holds;
(3) Separation of precipitated nucleic acids and carriers the liquid phase;
(4) transferring the separated nucleic acids into DNA by means of a reverse transcription reaction, if it is the separated nucleic acids are RNA;
(5) Subjecting either in step (3) separated or in step (4) obtained nucleic acids of a polymer rase chain reaction in a PCR solution containing a mixture the nucleoside triphosphates, a polymerase, an interka lierenden fluorochrome and an oligonucleotide probe ent which serves as a primer for amplifying at least one particular sequence is suitable;
(6) Measuring the change of fluorescence intensity as a result the PCR or the change resulting during the PCR tion of the fluorescence intensity of the reaction solution; and
(7) Determine (based on the change in fluorescence intensity), whether a nucleic acid with the specified Sequence was present in the sample.

Ferner stellt die vorliegende Erfindung eine Packung von Reagenzien zur Extraktion von Nucleinsäuren bereit, die von einander getrennt mindestens die folgenden Bestandteile ent hält:Furthermore, the present invention provides a package of Reagents for the extraction of nucleic acids prepared by separated from each other at least the following components ent holds:

(1) At least one of the substances dextran, acrylamide or carboxymethyl cellulose-containing carrier; and
(2) a reagent C containing at least one of the substances Guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, Potassium thiocyanate and sodium thiocyanate selected Rea genz A and at least one of the substances n-propylal alcohol, iso-propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butylal kohol, tert-butyl alcohol and tert-amyl alcohol out contains selected reagent B.

Fig. 1 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach der PCR-Amplifikation von DNA des Hepati tis B-Virus (HBV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: HBV-reiches Serum, Spuren 3 und 4: HBV-armes Serum, Spur 5: HBV-freies Serum; die Bande a zeigt das PCR-Amplifikationsprodukt und die Bande b das Pri mer-Oligomer; Fig. 1 shows a photograph and illustrate this illustrate the diagram. Shown are the results of an electrophoresis, which was carried out after the PCR amplification of DNA of Hepatitis B virus (HBV), wherein the nucleic acid of the virus according to the invention Method was extracted; Lanes 1 and 2 : HBV-rich serum, lanes 3 and 4 : HBV-poor serum, lane 5 : HBV-free serum; band a shows the PCR amplification product and band b the primer oligomer;

Fig. 2 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis C-Virus (HCV) vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: HCV-reiches Serum; Spuren 3 und 4: HCV-armes Serum; Spur 5: HCV-freies Serum; Fig. 2 shows a photograph and this illustrate the diagram. Shown are the results of an electrophoresis, which was carried out after PCR amplification of DNA of hepatitis C virus (HCV), wherein the nucleic acid of the virus extracted by the method according to the invention had been; Lanes 1 and 2 : HCV-rich serum; Lanes 3 and 4 : HCV-poor serum; Lane 5 : HCV-free serum;

Fig. 3 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung der nachstehend aufgeführten unterschiedlichen Zusammensetzungen von Reagenz C extrahiert worden war; Spuren 1 und 2 (1): das Reagenz C enthält 2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natri umcitrat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): das Reagenz C enthält 2,4 M Kaliumthiocyanat, 15 mM Natriumci trat und 60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): das Reagenz C enthält 2,3 M Guanidiniumhydrochlorid, 15 mM Na triumcitrat und 60% iso-Propylalkohol; Fig. 3 shows a photograph and one of these illustrate the diagram. Shown are the results of electrophoresis performed after PCR amplification of DNA of the hepatitis B virus, the nucleic acid of the virus being obtained by the method of the present invention using the following The different compositions of reagent C listed were extracted; Lanes 1 and 2 (1): reagent C contains 2.4 M guanidinium thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% isopropyl alcohol; Lanes 3 and 4 (2): reagent C contains 2.4 M potassium thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol; Lanes 5 and 6 (3): reagent C contains 2.3 M guanidinium hydrochloride, 15 mM sodium citrate and 60% isopropyl alcohol;

Fig. 4 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Reagenz extrahiert worden war, wo bei die nachfolgend aufgeführten Zusammensetzungen von Rea genz B als Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spu ren 1 und 2 (1): 60% n-Propylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): 60% iso-Propylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 50% n-Butylal kohol; Spuren 7 und 8 (4): 60% n-Butylalkohol; Spuren 9 und 10 (5): 50% sek.-Butylalkohol; und Spuren 11 und 12 (6): 60% sek.-Butylalkohol; Fig. 4 shows a photograph and a these illustrate represents the diagram. The results of an electric Shown electrophoresis, which was carried out by PCR amplification of DNA from the hepatitis B virus, wherein the nucleic acid of the virus according to the inventive method using the in Example 7, where the following compositions of Rea Gen B were used as a component of reagent C: Spu Ren 1 and 2 (1): 60% n-propyl alcohol; Lanes 3 and 4 (2): 60% iso-propyl alcohol; Lanes 5 and 6 (3): 50% n-butyl alcohol; Lanes 7 and 8 (4): 60% n-butyl alcohol; Lanes 9 and 10 (5): 50% sec-butyl alcohol; and Lanes 11 and 12 (6): 60% sec-butyl alcohol;

Fig. 5 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von RNA des Hepatitis B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Reagenz C extrahiert worden war, wobei die nachfolgend aufgeführten Typen von Reagenz B als Bestandteil von Reagenz C verwendet wurden: Spuren 1 und 2 (1): 50% tert.-Amylalkohol; Spuren 3 und 4 (2): 60% tert.-Amylalkohol; Spuren 5 und 6 (3): 60% tert.-Butylalkohol; Spuren 7 und 8 (4): 60% iso-Propylalkohol; Fig. 5 shows a photograph and this illustrate the diagram. Shown are the results of an electrophoresis performed after PCR amplification of RNA of the hepatitis B virus, wherein the nucleic acid of the virus according to the method of the invention using the in Example 8 described reagent C, wherein the following types of reagent B were used as a component of reagent C: Lanes 1 and 2 (1): 50% tert-amyl alcohol; Lanes 3 and 4 (2): 60% t-amyl alcohol; Lanes 5 and 6 (3): 60% tert-butyl alcohol; Lanes 7 and 8 (4): 60% iso-propyl alcohol;

Fig. 6 stellt eine Photographie und ein diese verdeutlichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus vorgenommen wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahiert worden war, wobei Dextran in den betreffenden Tests in folgenden Mengen verwendet wurde: Spuren 1 und 2: 0 µg; Spuren 3 und 4: 2 µg; Spuren 5 und 6 : 4 µg; Spuren 7 und 8: 8 µg; Spuren 9 und 10: 16 µg; Spuren 11 und 12: 32 µg, Spuren 13 und 14: 64 µg; Fig. 6 shows a photograph and a these illustrate represents the diagram. The results of an electric Shown electrophoresis, which was carried out by PCR amplification of DNA from the hepatitis B virus, wherein the nucleic acid of the virus was extracted by the inventive method, where dextran was used in the respective tests in the following amounts: lanes 1 and 2 : 0 μg; Lanes 3 and 4 : 2 μg; Lanes 5 and 6 : 4 μg; Lanes 7 and 8 : 8 μg; Lanes 9 and 10 : 16 μg; Lanes 11 and 12 : 32 μg, lanes 13 and 14 : 64 μg;

Fig. 7 stellt eine Photographie und ein diese verdeulichen des Diagramm dar. Gezeigt sind die Ergebnisse einer Elektro phorese, die nach PCR-Amplifikation von DNA des Hepatitis B-Virus durchgeführt wurde, wobei die Nucleinsäure des Virus analog zu Beispiel 3 unter Verwendung von Dextran oder Car boxymethylcellulose als Träger extrahiert worden war; Spuren 1 und 2: Dextran; Spuren 3 und 4: Carboxymethylcellulose; Fig. 7 shows a photograph and this verde bluish represents the diagram. The results of an electric Shown electrophoresis, which was carried out by PCR amplification of DNA from the hepatitis B virus, wherein the nucleic acid of the virus in analogy to Example 3 by using dextran or car boxymethylcellulose was extracted as a carrier; Lanes 1 and 2 : dextran; Lanes 3 and 4 : carboxymethyl cellulose;

Fig. 8 stellt ein Paar von Diagrammen dar, in denen die Er gebnisse der Experimente von Beispiel 12 gezeigt sind. Eine Reaktionslösung einer PCR wurde vor (Fig. 8a) und nach (Fig. 8b) Nucleinsäureextraktion durch Hochleistungs-Flüssigkeits- Chromatographie untersucht. Die Elutionszeit ist (in Minu ten) auf den horizontalen Achsen und die relative Absorption auf den vertikalen Achsen aufgetragen. Fig. 8 illustrates a pair of diagrams showing the results of the experiments of Example 12. A reaction solution of a PCR was examined before ( Fig. 8a) and after ( Fig. 8b) nucleic acid extraction by high performance liquid chromatography. The elution time is plotted (in minutes) on the horizontal axes and the relative absorption on the vertical axes.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extrak tion von Nucleinsäuren (einzel- oder doppelsträngiger DNA und RNA) u Beispiele für DNA, die sich nach dem Verfahren ex trahieren läßt, schließen nicht nur genomische DNA ein, son dern auch Mitochondrien- oder Chloroplasten-DNA, und Bei spiele für RNA, die sich nach dem Verfahren extrahieren läßt, schließen nicht nur mRNA sondern auch tRNA und rRNA ein. Nucleinsäuren enthaltende Proben sind beispielsweise lebende Proben, wie Leukozytenzellen, gezüchtete Wirtszel len, die typischerweise durch Gen-Rekombinationstechnik her gestellte Vektoren usw. enthalten, Zellen, die mit Viren oder Phagen infiziert sind, Viren im Blut und Kulturen von Proben von Mikroorganismen. Die Kultur kann Mikroorganismen enthalten, aber der Kulturüberstand allein ist ausreichend. Nicht nur künstliche Kulturen sondern auch natürlich vorkom mende Kulturen sind verwendbar. Falls die Proben Klumpen von Mikroorganismen enthalten, kann man zum Erzielen einer hohen Extraktionseffizienz nötigenfalls homogenisieren oder mit Ultraschall behandeln. The present invention relates to a process for extracting tion of nucleic acids (single- or double-stranded DNA and RNA) u Examples of DNA obtained by the method ex not only includes genomic DNA, son also mitochondrial or chloroplast DNA, and Bei games for RNA that extract after the process not only exclude mRNA but also tRNA and rRNA on. Examples of nucleic acids containing samples are live samples, such as leukocyte cells, cultured host cells typically produced by gene recombination technology Asked vectors, etc., contain cells that are infected with viruses or phages are infected, viruses in the blood and cultures of Samples of microorganisms. The culture can be microorganisms but the culture supernatant alone is sufficient. Not only artificial cultures but also naturally precom mende cultures are usable. If the samples are lumps of Microorganisms can be used to achieve a high Homogenize extraction efficiency if necessary or with Treat ultrasound.

Erfindungsgemäß können Nucleinsäuren aus den vorstehend be schriebenen Proben extrahiert werden. Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung liegt in der Extraktion amplifi zierter Nucleinsäuren aus einer PCR-Lösung in hoher Aus beute, so daß in den amplifizierten Nucleinsäuren keine En zyme oder niedermolekulare Desoxyribonucleosid-Triphosphate, Primer usw. enthalten sind.According to the invention, nucleic acids can be prepared from those described above written samples are extracted. Another application The present invention is in the extraction amplifi decorated nucleic acids from a PCR solution in high Aus prey, so that in the amplified nucleic acids no En enzymes or low molecular weight deoxyribonucleoside triphosphates, Primers, etc. are included.

Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht in einem Vermischen der die Nucleinsäure enthaltenden Probe mit einem Träger. Ein Vermischen mit dem Träger unterstützt die Bildung eines größeren unlöslichen Materials durch ein Vernetzen von Nucleinsäuren und Träger im nachfolgenden Aus fällen von Nucleinsäuren und Träger durch Zugabe von Reagenz C. Dadurch läßt sich das nachfolgende Abtrennen des unlösli chen Materials in einer vereinfachten Weise vornehmen. Somit trägt die Verwendung des Trägers zu einer höheren Extrakti onseffizienz bei, als man ohne seine Verwendung erreichen würde.The first step of the method according to the invention consists in mixing the sample containing the nucleic acid with a carrier. Supports mixing with the carrier the formation of a larger insoluble material by a Crosslinking of nucleic acids and carriers in the following precipitates of nucleic acids and carriers by addition of reagent C. This allows the subsequent separation of the insoluble chen material in a simplified manner. Thus the use of the carrier contributes to a higher extractivity onefficiency when you reach it without its use would.

Der Träger besitzt eine Affinität für die zu extrahierenden Nucleinsäuren und wird unlöslich, wenn er in Kontakt mit dem in Reagenz C enthaltenen Reagenz B gelangt. Da der Träger zusammen mit den Nucleinsäuren extrahiert wird, sollte er nicht die spezifische Verwendung der extrahierten Nuclein säuren wie die Reaktion mit einem Restriktionsenzym, die re verse Transkriptionsreaktion oder die PCR beeinträchtigen. Der erfindungsgemäß zu verwendende Träger ist mindestens eine der Substanzen Dextran, Acrylamid oder Carboxymethyl cellulose. Diese Träger erweisen sich als zufriedenstellend wirksam, unabhängig davon, ob sie einzeln oder als Mischun gen verwendet werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß sie weder die reverse Transkriptionsreaktion, die PCR oder irgend eine andere gewünschte Reaktion beeinträchtigen. Glycogen und andere herkömmliche Träger werden durch Amylase oder andere Enzyme, die in der Probe, wenn es sich bei die ser um Serum oder Blut handelt, vorhanden sind, abgebaut, mit dem Ergebnis, daß sich die Effizienz der Nucleinsäureex traktion vermindert. Im Gegensatz dazu wird der erfindungs gemäß verwendete Träger nicht abgebaut, und dementsprechend ergibt sich keine Verminderung der Effizienz der Nucleinsäu reextraktion.The carrier has an affinity for the to be extracted Nucleic acids and becomes insoluble when in contact with the reagent B contained in reagent C. As the carrier It should be extracted together with the nucleic acids not the specific use of the extracted nuclei acids such as the reaction with a restriction enzyme, the re transcriptional reaction or PCR. The carrier to be used according to the invention is at least one of the substances dextran, acrylamide or carboxymethyl cellulose. These carriers prove to be satisfactory effective, whether individually or as a mixture be used. Another advantage is that they neither the reverse transcription reaction, the PCR or affect any other desired reaction. Glycogen and other conventional carriers are by amylase or other enzymes in the sample, if it is the case serum or blood, are present, degraded, with the result that the efficiency of the nucleic acid ex reduced traction. In contrast, the invention used according to used carriers, and accordingly there is no decrease in the efficiency of the nucleic acid reextraction.

Im allgemeinen wird der Träger in Mengen von ungefähr 0,01 bis 1000 µg, bevorzugt ungefähr 0,1 bis 100 µg pro 10 µl Probenvolumen verwendet. Der Träger kann in einem Gefäß vor gelegt werden, bevor die Probe hineingegeben wird. Alterna tiv kann die Probe vor Zugabe des Trägers in das Gefäß gege ben werden. Der Träger kann durch Gefrier- oder Lufttrocknen in eine feste Substanz überführt werden.In general, the carrier will be in amounts of about 0.01 to 1000 μg, preferably about 0.1 to 100 μg per 10 μl Sample volume used. The carrier may be in a vessel before be placed before the sample is added. Alterna The sample may be stirred into the vessel before adding the carrier ben. The carrier can be dried by freezing or air drying be converted into a solid substance.

Im nächsten Schritt wird zum flüssigen Gemisch von Probe und Träger das Reagenz C gegeben, und die Bestandteile werden vermischt, um Träger und Nucleinsäuren auszufällen. Das Rea genz C enthält mindestens ein aus den Substanzen Guanidini umthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Kaliumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso-Propanol, n-Butylal kohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol und tert.-Amyl alkohol ausgewähltes Reagenz B.In the next step, the liquid mixture of sample and Carrier given the reagent C, and the ingredients become mixed to precipitate carriers and nucleic acids. The Rea Genz C contains at least one of the substances Guanidini thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and Sodium thiocyanate selected reagent A and at least one from the substances n-propyl alcohol, isopropanol, n-butylal alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and tert-amyl alcohol selected reagent B.

Das Reagenz C kann außerdem andere Reagenzien enthalten. Zum Beispiel: ein zur Unterdrückung des Nucleinsäureabbaus ge eignetes Puffer-Mittel; ein Chelatisierungsmittel, das zur Hemmung der Aktivität von Nucleasen (Desoxyribonucleasen) fähig ist, wie z. B. Natriumcitrat oder EDTA; ein Reduktions mittel zum Erreichen einer wirksameren Denaturierung und So lubilisierung von Proteinen, Lipiden usw., wie z. B. Dithio threit oder β-Mercaptoethanol, die Disulfidbindungen redu zieren und eine grenzflächenaktive Substanz, wie z. B. ein Sarkosylsalz oder Triton, um eine wirksamere Solubilisierung von Proteinen usw. zu erreichen. Ein geeignetes Puffermittel kann zur Einstellung des pH-Wertes von Reagenz C auf den Be reich von 4 bis 9, bevorzugt von 5 bis 8 zugegeben werden, um so den Abbau von Nucleinsäuren zu verhindern, wodurch eine weitere Verbesserung der Effizienz ihrer Extraktion er reicht wird.The reagent C may also contain other reagents. To the Example: a to suppress the nucleic acid degradation ge suitable buffering agent; a chelating agent used to Inhibition of the activity of nucleases (deoxyribonucleases) capable, such as Sodium citrate or EDTA; a reduction means of achieving more effective denaturing and so lubilization of proteins, lipids, etc., such. B. Dithio Threit or β-mercaptoethanol, the disulfide bonds redu and a surfactant such. B. a Sarkosyl salt or Triton for more effective solubilization of proteins, etc. A suitable buffering agent can be used to adjust the pH of reagent C to Be rich from 4 to 9, preferably from 5 to 8, so as to prevent the degradation of nucleic acids, thereby a further improvement in the efficiency of its extraction is enough.

Im erfindungsgemäßen Extraktionsverfahren wird mindestens eine der Verbindungen Guanidiniumthiocyanat, Guanidinium hydrochlorid, Kaliumthiocyanat oder Natriumthiocyanat als Reagenz A verwendet. Diese Verbindungen brechen die Zellmembran oder die Zellwand auf und denaturieren das Protein im Komplex. Sie sind außerdem fähig, das denaturierte Protein, das sich entweder als Ergebnis des Denaturierens des Proteins im Komplex oder wegen des begleitenden Reagenz B bildet, zu solubilisieren. Gleichzeitig sind die Verbindungen fähig, die Aktivität von Nucleasen (Desoxyribonucleasen und Ribonucleasen), die sich in der Probe befinden mögen, zu unterdrücken. Das erfindungsgemäß verwendete Reagenz A besitzt in hohem Maße die Fähigkeit sowohl allein als auch in Kombination zweier oder mehrerer Substanzen Proteine zu solubilisieren, ohne dabei irgendwelche störenden Reaktionen zu verursachen. Es macht daher eine hohe Effizienz der Nucleinsäure-Extraktion möglich. Allgemein bekannte proteindenaturierende Mittel wie Natriumjodid, Kaliumjodid, Kaliumbromid, Natriumbromid und Harnstoff sind nicht derartig wirksam, Proteine usw. zu solubilisieren; andererseits verursachen Guanidiniumsulfat, Guanidiniumcarbonat usw. Proteinaggregation usw. und sind daher nicht fähig, Nucleinsäuren mit hoher Effizienz zu extrahieren.In the extraction process according to the invention is at least one of the compounds guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate or sodium thiocyanate as Reagent A is used. These connections break the Cell membrane or the cell wall and denature the Protein in the complex. You are also capable of that denatured protein resulting either as a result of the Denaturing of the protein in the complex or because of the accompanying reagent B forms to solubilize. At the same time, the compounds are capable of activity Nucleases (deoxyribonucleases and ribonucleases), which are in the sample may be to suppress. The Reagent A used in the invention has a high degree the ability both alone and in combination or more substances to solubilize proteins without doing any disturbing reactions. It therefore, makes high efficiency of nucleic acid extraction possible. Well-known protein denaturing agents such as Sodium iodide, potassium iodide, potassium bromide, sodium bromide and Urea is not that effective, proteins etc. too solubilize; on the other hand, guanidinium sulfate, Guanidinium carbonate, etc., protein aggregation, etc. and are therefore unable to add nucleic acids with high efficiency extract.

Erfindungsgemäß wird mindestens eine der Substanzen n-Propa nol, iso-Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Butylalkohol oder tert.-Amylalkohol als Reagenz B ver wendet. Wenn man ein Gemisch von zwei oder mehr Alkoholen verwendet, kann man ein vorteilhaftes Verhältnis der Alko hole durch Vorexperimente bestimmen. Das erfindungsgemäße Reagenz B besitzt eine hohe Löslichkeit in Wasser und geht nicht ohne weiteres eine Phasentrennung mit Wasser ein. Die Verwendung von Reagenz B bietet daher den Vorteil, daß das Abtrennen von gefällten Nucleinsäuren und Träger aus der wäßrigen Phase in einfacher Weise ausführbar ist. Das bedeu tet letzten Endes, daß sich die Ausbeute der gefällten Nucleinsäuren im letzten Schritt des Verfahrens erhöhen läßt.According to the invention, at least one of the substances is n-propa nol, iso-propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol or tert-amyl alcohol as reagent B ver applies. If you have a mixture of two or more alcohols used, one can have a favorable ratio of Alko determine hole by preliminary experiments. The invention Reagent B has a high solubility in water and goes not readily a phase separation with water. The Use of reagent B therefore offers the advantage that the Separating precipitated nucleic acids and carriers from the aqueous phase can be carried out in a simple manner. That means Finally, that the yield of the precipitated Increase nucleic acids in the last step of the procedure leaves.

Die Konzentration der Reagenzien A und B in Reagenz C kann man in solch einer Weise einstellen, daß bei Zugabe von Rea genz C zu der den Träger enthaltenden Probe Proteine, Lipide usw. gelöst bleiben, Nucleinsäuren und der Träger aber ge fällt werden. Besonders bevorzugte Konzentrationen zur Ver besserung der Extraktionseffizienz sind solche, bei denen die Endkonzentration des Reagenz wie es zur Probe zugegeben wird, für Reagenz A im Bereich von 1,5 bis 4,5 M und für Reagenz B im Bereich von ungefähr 40 bis 80% liegt.The concentration of reagents A and B in reagent C can Adjust in such a way that when Rea to the sample containing the carrier proteins, lipids etc. remain dissolved, but nucleic acids and the carrier ge to be dropped. Particularly preferred concentrations for Ver Improvement of the extraction efficiency are those in which the final concentration of the reagent as added to the sample is, for reagent A in the range of 1.5 to 4.5 M and for Reagent B is in the range of about 40 to 80%.

In dem Fall, daß das Reagenz C z. B. Guanidiniumthiocyanat als Reagenz A und iso-Propylalkohol als Reagenz B enthält, liegen die Konzentrationen für eine besonders hohe Effizienz der Nucleinsäure-Extraktion so, daß die Endkonzentration von Reagenz A nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 2 bis 3 M liegt, wohingegen die Endkonzentration von Reagenz B nach dem Mischen mit der Probe im Bereich von 45 bis 55% liegt. Wenn die Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat geringer als 1,5 M ist, können die in der Probe enthaltenen Proteine, Lipide usw. nicht voll solubilisiert werden. Zur Erhöhung der Endkonzentration von Guanidiniumthiocyanat über 4,5 M muß der Anteil von Reagenz A im Reagenz C erhöht wer den. Dann neigt aber das Reagenz A dazu, unlöslich zu wer den, wodurch Schwierigkeiten bezüglich einer geeigneten Zube reitung einer Probe entstehen. Wenn die Endkonzentration von iso-Propylalkohol unter 40% liegt, können Träger und Nucleinsäuren nicht vollständig gefällt werden. Wenn die Endkonzentration von iso-Propylalkohol 80% überschreitet, ist es schwierig, eine Guanidiniumthiocyanat-Konzentration sicherzustellen, die ausreicht, Proteine, Lipide usw. voll ständig zu solubilisieren. Ferner wird die Verdampfung von iso-Propylalkohol problematisch. Deshalb werden die Reagen zien erfindungsgemäß bevorzugt in den vorstehend angegebenen Konzentrationsbereichen verwendet.In the case that the reagent C z. B. guanidinium thiocyanate contains reagent A and iso-propyl alcohol as reagent B, the concentrations are particularly high efficiency the nucleic acid extraction so that the final concentration of Reagent A after mixing with the sample in the range of 2 to 3 M, whereas the final concentration of reagent B after mixing with the sample in the range of 45 to 55% lies. When the final concentration of guanidinium thiocyanate less than 1.5 M, those contained in the sample can Proteins, lipids, etc. are not fully solubilized. to Increasing the final concentration of guanidinium thiocyanate over 4.5 M, the proportion of reagent A in the reagent C has increased the. Then, however, the reagent A tends to be insoluble which causes difficulties with respect to a suitable preparation of a sample. When the final concentration of iso-propyl alcohol is less than 40%, can carrier and Nucleic acids are not completely precipitated. If the Final concentration of iso-propyl alcohol exceeds 80%, it is difficult to give a guanidinium thiocyanate concentration ensure that sufficient, proteins, lipids, etc. fully to solubilize constantly. Furthermore, the evaporation of iso-propyl alcohol problematic. That's why the reagents zien invention preferably in the above Concentration ranges used.

Eine geeignete Menge zur Zugabe von Reagenz C liegt beim 2- bis 10fachen des Probenvolumens, wenn es sich bei der Probe um Serum handelt. Wenn die Probe jedoch hohe Konzentrationen von Proteinen, Lipiden usw. aufweist, wird das Reagenz C be vorzugt in einer größeren Menge als dem 10fachen Probenvo lumen zugegeben, um eine vollständige Solubilisierung von Proteinen, Lipiden usw. zu gewährleisten.An appropriate amount for addition of reagent C is in 2 to 10 times the sample volume if it is the sample is serum. However, if the sample has high concentrations of proteins, lipids, etc., the reagent C be preferably in a larger amount than the 10 times Probenvo lumens added to complete solubilization of Protect proteins, lipids, etc. to ensure.

Durch die vorstehend beschriebenen Schritte werden Träger und Nucleinsäuren in der Probe gefällt. Anschließend werden die so gefällten Nucleinsäuren und der Träger durch herkömm liche Abtrennungsverfahren wie Zentrifugation oder Filtra tion von der wäßrigen Phase abgetrennt, die die Proteine usw. enthält. Im Falle einer Zentrifugation können die Nucleinsäuren als Sediment am Boden des Gefäßes gewonnen werden. Im Falle einer Filtration können die Nucleinsäuren auf der Filtermembran erhalten werden. Bei der Filtermembran kann es sich um einen Typ handeln, der Poren mit einer Größe von ungefähr 0,1 bis 10 µm besitzt.The steps described above become carriers and nucleic acids in the sample like. Then be the nucleic acids thus precipitated and the carrier by convention Liche separation methods such as centrifugation or Filtra tion separated from the aqueous phase containing the proteins etc. contains. In the case of centrifugation, the Nucleic acids are obtained as sediment at the bottom of the vessel become. In case of filtration, the nucleic acids can be obtained on the filter membrane. At the filter membrane it can be a type of pore with a size of about 0.1 to 10 μm.

Die separierten Nucleinsäuren kann man als solche in einer Reihe von Tests und in gentechnologischen Experimenten ein setzen. Bevorzugt werden sie aber vor der Verwendung gewa schen. Ein Vor-Waschen ist besonders wirksam, wenn man die separierten Nucleinsäuren einer Enzymreaktion (z. B. einer Restriktionsenzym-Reaktion, einer reversen Transkriptionsre aktion oder einer PCR) unterwirft, und in allen anderen Fäl len, in denen das Reagenz A oder etwas ähnliches, das in ge ringem Maße im Präzipitat enthalten ist, die Enzymaktivität, inhibiert. Hier sei ein spezifisches Beispiel gegeben: zu dem durch Zentrifugation oder Filtration erhaltenen Präzipi tat wird eine ein Salz und einen Alkohol enthaltende Lösung gegeben und mit dem Präzipitat vermischt. Das Gemisch wird dann einer weiteren Zentrifugation oder Filtration unterwor fen. Verglichen mit einem bloßen Waschen des Präzipitates mit destilliertem Wasser oder ähnlichem, weist das Waschen mit einer Salz/Alkohol enthaltenden Lösung den Vorteil auf, daß es dazu beiträgt, von der Oberfläche des Sedimentes un erwünschte Substanzen, wie das Reagenz A oder restliche Pro teine wirksam zu entfernen. Als Salz in der Waschlösung kön nen z. B. Kaliumchlorid, Natriumchlorid und Natriumacetat in Mengen von ungefähr 0,05 bis 0,5 M verwendet werden. Bei spiele für Alkohole schließen Ethanol (der in Mengen von mindestens 50%, bevorzugt von 60 bis 80% enthalten sein kann) ebenso ein, wie n-Propylalkohol und iso-Propylalkohol (die in einer Menge von mindestens 30%, bevorzugt von 40 bis 60% enthalten sein können).The separated nucleic acids can be used as such in one Series of tests and in genetic engineering experiments put. Preferably, however, they are gewa rule. Pre-washing is especially effective if you have the separated nucleic acids of an enzyme reaction (eg Restriction enzyme reaction, a reverse transcription re action or a PCR), and in all other cases in which the reagent A or something similar, which in ge contained in the precipitate, the enzyme activity, inhibited. Here's a specific example: too the precipitate obtained by centrifugation or filtration did becomes a solution containing a salt and an alcohol and mixed with the precipitate. The mixture is then subjected to further centrifugation or filtration fen. Compared with a mere washing of the precipitate with distilled water or similar, instructs washing with a solution containing salt / alcohol has the advantage that it contributes to the surface of the sediment un desired substances, such as reagent A or residual Pro to remove effectively. As a salt in the washing solution kön nen z. As potassium chloride, sodium chloride and sodium acetate in Quantities of about 0.05 to 0.5 M are used. at Examples of alcohols include ethanol (which is available in amounts of at least 50%, preferably from 60 to 80% can) as well as n-propyl alcohol and iso-propyl alcohol (in an amount of at least 30%, preferably 40 up to 60% can be included).

Falls es speziell notwendig sein sollte, jedes restliche Protein aus dem Präzipitat zu entfernen, kann man die nach folgende Prozedur anwenden: Zuerst wird zum Präzipitat wie der eine Lösung gegeben, die das Reagenz A, wie es vorste hend spezifiziert wurde, enthält, um so die Proteine zu so lubilisieren. Dann wird eine Lösung zugegeben, die das Rea genz B, wie es vorstehend spezifiziert wurde, enthält, und das Gemisch wird einer Zentrifugation oder Filtration unter worfen. Selbstverständlich können die Schritte 2 und 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens einfach wiederholt werden. Wenn sehr kleine Nucleinsäuremengen extrahiert werden, wird beim erfindungsgemäßen Verfahren die Probe auf geeignete Weise bei einer niedrigen Temperatur gehalten, z. B. dadurch, daß die Gesamtprozedur in einem Kühlraum vorgenommen wird.If necessary, any remaining To remove protein from the precipitate, one can after Use the following procedure: First, the precipitate is like who gave a solution containing the reagent A, as it prevailed has been specified so as to allow the proteins to do so lubilisieren. Then a solution is added, containing the Rea genz B, as specified above, and the mixture is subjected to centrifugation or filtration worfen. Of course, steps 2 and 3 of the inventive method can be easily repeated. If Very small quantities of nucleic acid are extracted in the methods of the invention, the sample in a suitable manner kept at a low temperature, z. B. in that the entire procedure is carried out in a cold room.

Gemäß dem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die so extrahierten Nucleinsäuren daraufhin untersucht, ob sie eine bestimmte Sequenz, z. B. solch eine, wie sie in He patitis B-Virus oder Hepatitis C-Virus vorkommt, enthalten, die sie von anderen Nucleinsäuren unterscheidbar macht und die Erfindung stellt ein Nachweisverfahren bereit, bei dem die im allgemeinen als PCR-Reaktion bezeichnete Technik der DNA-Amplifikation Anwendung findet; siehe diesbezüglich: Eu ropäischen Patentanmeldung Nr. 487 218.According to the second aspect of the present invention The nucleic acids extracted in this way are examined to determine whether they have a certain sequence, eg. For example, such as in He Patitis B virus or hepatitis C virus is present, which makes them distinguishable from other nucleic acids and The invention provides a detection method in which the commonly referred to as PCR reaction technique of DNA amplification finds application; see in this regard: Eu European Patent Application No. 487 218.

Wenn es sich bei den in vorstehender Weise separierten und vorzugsweise gewaschenen Nucleinsäuren um RNA handelt, wird diese zunächst erfindungsgemäß durch eine reverse Transkrip tionsreaktion in DNA überführt. Dies ist z. B. beim Hepatitis C-Virus, dessen Genom aus RNA besteht, der Fall. Erfindungs gemäß wird RNA vor dem nachstehend beschriebenen Amplifika tionsschritt in amplifizierbare DNA überführt, um so die PCR zur DNA-Amplifikation verwenden zu können. Dieser Schritt läßt sich durch DNA-Synthese mittels der gewöhnlichen rever sen Transkriptionsreaktion erreichen, wobei die separierte RNA als Matrize verwendet wird.If it is in the above separated and preferably washed nucleic acids is RNA this initially according to the invention by a reverse transcript tion reaction converted into DNA. This is z. B. in hepatitis C virus whose genome consists of RNA, the case. Fiction according to RNA is before the amplification described below tion step into amplifiable DNA, so the PCR to use for DNA amplification. This step can be synthesized by DNA synthesis using the usual rever reach the transcriptional reaction, the separated RNA is used as template.

Im nächsten Schritt werden die separierten Nucleinsäuren oder die Nucleinsäuren, die durch eine reverse Transkripti onsreaktion im früheren Schritt erhalten worden waren, einer PCR in einer PCR-Lösung unterworfen, die ein Gemisch von Nucleosidtriphosphaten, eine Polymerase, ein interkalieren des Fluorochrom und eine Oligonucleotid-Sonde enthält, die mindestens zur Amplifikation der spezifizierten Sequenz ge eignet ist. Die Oligonucleotid-Sonde in der PCR-Lösung be steht aus zwei oder mehr Oligonucleotiden, die eine ge eignete Zahl von Basen aufweisen. Sie sind zur Herstellung von DNA-Fragmenten, die die spezifizierte Sequenz enthalten, wenn die PCR fortschreitet, notwendig und sie liegen in den schließlich hergestellten DNA-Fragmenten an den 5′-Enden. Eine geeignete oligonucleotid-Sonde läßt sich entsprechend der spezifizierten nachzuweisenden Sequenz auswählen.In the next step, the separated nucleic acids or the nucleic acids produced by a reverse transcripti Onsreaktion in the earlier step had been received, one Subjected PCR in a PCR solution containing a mixture of Nucleoside triphosphates, a polymerase, an intercalate of the fluorochrome and an oligonucleotide probe containing at least for the amplification of the specified sequence ge is suitable. The oligonucleotide probe in the PCR solution be is composed of two or more oligonucleotides having a ge have suitable number of bases. They are for manufacturing DNA fragments containing the specified sequence, if the PCR progresses, necessary and they are in the finally produced DNA fragments at the 5 'ends. A suitable oligonucleotide probe can be appropriately select the specified sequence to be detected.

Beispiele für das erfindungsgemäß verwendete interkalierende Fluorochrom sind Ethidiumbromid, Acridinorange, Bisbentimid, Diaminophenylindol, Actinomycin, Thiazol, Chromomycin und Derivate dieser Substanzen. In der PCR selbst besteht ein Zyklus aus den nachfolgenden Verfahrensschritten: Die 3′-terminalen Anteile der spezifizierten und der dazu komplementären Sequenz werden mit den betreffenden komple mentären Oligonucleotid-Primern hybridisiert. Dann wird eine Reaktion zur Verlängerung der Primer in 5′ 3′-Richtung mittels einer Polymerase vorgenommen. Anschließend wird der resultierende Doppelstrang dissoziiert. Dieser Zyklus kann so oft wiederholt werden, wie es geeignet erscheint.Examples of the intercalating used in the invention Fluorochrome are ethidium bromide, acridine orange, bisbentimide, Diaminophenylindole, actinomycin, thiazole, chromomycin and Derivatives of these substances. There is one in the PCR itself Cycle from the following process steps: The 3'-terminal Proportions of the specified and the Complementary sequence will match the subject hybridized oligonucleotide primers. Then one will Reaction to extend the primers in the 5 '3' direction made by means of a polymerase. Subsequently, the resulting duplex dissociated. This cycle can be repeated as many times as appropriate.

Die Änderung der Fluoreszenzintensität in der PCR-Lösung wird entweder nach oder während der PCR gemessen. Da das in terkalierende Fluorochrom infolge seines Einbaus in die dop pelsträngige DNA eine Änderung seiner Fluoreszenzcharakteri stik eingeht, gibt die Änderung der Fluoreszenzintensität zwischen Beginn und Ende der PCR oder die Änderung während der PCR einen Hinweis darauf, ob die separierte DNA oder RNA die spezifizierte Sequenz besitzt.The change in fluorescence intensity in the PCR solution is measured either after or during the PCR. Since that in terkalierende fluorochrome due to its incorporation in the dop pelsträngige DNA a change in its fluorescence character Stik indicates the change in fluorescence intensity between the beginning and end of the PCR or the change during the PCR gives an indication as to whether the separated DNA or RNA has the specified sequence.

Wenn das vorstehend beschriebene Nachweisverfahren angewandt wird, besteht keine Notwendigkeit, zusätzliche Mengen des Reagenz hinzuzufügen, nachdem die PCR einmal begonnen hat. Deshalb wird in der Praxis die PCR-Lösung zuerst in ein Ge fäß gegeben, dann werden die extrahierten Nucleinsäuren oder die Nucleinsäuren, die man aus diesen Nucleinsäuren mittels der reversen Transkriptionsreaktion erhält, zugegeben. Da nach wird das Gefäß verschlossen, und die Schritte der PCR und die Messung der Fluoreszenzintensität werden in einem hermetisch abgeschlossenen Zustand durchgeführt. Dadurch läßt sich die Wahrscheinlichkeit für die Erzeugung eines Ae rosols weiter vermindern.When the detection method described above is used there is no need to add extra quantities of Add reagent after the PCR has begun. Therefore, in practice, the PCR solution is first transformed into a Ge then the extracted nucleic acids or the nucleic acids obtained from these nucleic acids by means of the reverse transcription reaction is added. because After the vessel is closed, and the steps of the PCR and the measurement of fluorescence intensity are in one hermetically sealed state. Thereby the probability of producing an Ae reduce rosols further.

Dem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung gemäß stellt die Erfindung ferner eine Reagenzienpackung zur Durchführung des auf den vorangegangenen Seiten beschriebenen Nuclein säure-Extraktionsverfahrens bereit. Diese Reagenzienpackung enthält Träger und Reagenz C, die ebenfalls vorstehend be schrieben wurden. Träger und Reagenz C werden bis zur Ver wendung getrennt voneinander gehalten. Dies kann man z. B. dadurch erreichen, daß der Träger und das Reagenz C in getrennten Behältern gehalten werden, wobei der Träger im festen Zustand und das Reagenz C im flüssigen Zustand vor liegen.According to the third aspect of the present invention provides the invention further comprises a reagent pack for carrying out of the Nuclein described on the previous pages acid extraction method. This reagent pack contains carrier and reagent C, which also be above were written. Carrier and reagent C are up to Ver kept separate from each other. This can be z. B. in that the carrier and the reagent C in be kept separate containers, the carrier in the solid state and the reagent C in the liquid state lie.

Die Reagenzienpackung kann wahlweise ein Reaktionsgefäß ent halten, das aus einem geeigneten Plastikmaterial hergestellt ist und das einen Reaktionsraum zur Ausführung des erfin dungsgemäßen Verfahrens zur Extraktion von Nucleinsäuren (erster Aspekt der Erfindung) oder des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis einer spezifizierten Nucleinsäurese quenz (zweiter Aspekt der Erfindung) bereitstellen kann. Wenn es einen Bedarf gibt, nicht nur Nucleinsäuren zu extra hieren, sondern außerdem eine bestimmte Nucleinsäuresequenz nachzuweisen, enthält die Reagenzienpackung bevorzugt ein hermetisch verschließbares Reaktionsgefäß.The reagent pack can optionally ent a reaction vessel Keep that made of a suitable plastic material and that is a reaction space for the execution of the inventions to the invention process for the extraction of nucleic acids (First aspect of the invention) or the invention Method for detecting a specified nucleic acid can provide (second aspect of the invention). If there is a need, not just extra nucleic acids but also a particular nucleic acid sequence to detect, the reagent pack preferably contains a hermetically sealable reaction vessel.

Der Vorteil der Reagenzienpackung besteht darin, daß man, wenn der Träger in einer geeigneten Form, z. B. als gefrier getrocknetes Pulver, im Reaktionsgefäß vorgelegt wurde, nur noch die zu untersuchende Probe und dann das Reagenz C zum Röhrchen zugeben muß, um das Verfahren zur Extraktion von Nucleinsäuren und, falls gewünscht, zum Nachweis einer spe zifizierten Nucleinsäuresequenz zu beginnen.The advantage of the reagent pack is that, if the carrier is in a suitable form, e.g. B. as freeze dried powder, was placed in the reaction vessel, only still the sample to be examined and then the reagent C for Add tubes to the process for extraction of Nucleic acids and, if desired, to detect a spe cited nucleic acid sequence to begin.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung weiter erläutern.The following examples are intended to illustrate the present invention further explain.

example 1 Extraction from cultured cells

Hybridomzellen von Maus-Myelomzellen und Lymphozytenzellen von Mäusen, die mit CEA (cancer embryonic antigen, embryona les Krebsantigen) sensibilisiert worden waren, wurden in ei nem DMEM-Medium gezüchtet. Beim Erreichen einer Dichte von CEL-Zellen von 4×10⁵ pro ml Kulturlösung wurden 100 µl der Lösung in ein 0,5 ml großes Probenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wurde 1 Minute bei 7000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde entfernt. Das Präzipitat wurde in 20 µl DMED-Medium aufgenommen. Zur Suspension wurde 1 µl (10 µg) Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und gemischt. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso- Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden gerührt. Nachfolgend wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren sedimentiert wur den. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben. Zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, gegeben. Es wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Über stand wurde verworfen. Das Präzipitat wurde nach dem fluoro metrischen Verfahren von Kissane und Robins (J. Biol. Chem., 233 (1958), 184) zur Bestimmung der DNA-Menge untersucht. Das Präzipitat wurde außerdem einer Veraschungsbehandlung unterzogen, und eine Phosphorbestimmung (Anal. Chem. 28 (1956), 1756) wurde zur Messung der Gesamtnucleinsäuremenge (DNA + RNA) im Präzipitat vorgenommen. Die RNA-Menge wurde durch Subtrahieren der DNA-Menge von der Gesamtmenge von Nucleinsäuren (DNA + RNA) berechnet.Hybridoma cells from mouse myeloma cells and lymphocyte cells of mice infected with CEA (cancer embryonic antigen, embryona les Krebsantigen) were sensitized in egg grown in DMEM medium. When reaching a density of CEL cells of 4 × 10⁵ per ml of culture solution were added to 100 μl of the Place the solution in a 0.5 ml sample tube. The Tube was centrifuged for 1 minute at 7000 rpm, and the Supernatant was removed. The precipitate was dissolved in 20 μl Recorded DMED medium. To the suspension was added 1 μl (10 μg) Dextran (mol. Wt. 5 × 10⁵) and mixed. After that 100 μl reagent C (2.4 M guanidinium thiocyanate, 15 mM Sodium citrate, 0.3% sodium N-lauroyl sarcosine and 60% iso- Propyl alcohol), and the mixture became about 20 Stirred for a second. This was followed by 2 minutes at 15,000 rpm centrifuged, whereby the nucleic acids were sedimented WUR the. The supernatant was discarded, with the nucleic acids remained in the precipitate. To the precipitate was 100 ul 40% iso-propyl alcohol containing 200 mM potassium chloride, given. It was stirred for about 20 seconds. Then that became Mixture centrifuged for 1 minute at 15,000 rpm and the over stood was rejected. The precipitate was after the fluoro metric methods of Kissane and Robins (J. Biol. Chem. 233 (1958), 184) to determine the amount of DNA. The precipitate also became an ashing treatment and a phosphorus determination (Anal Chem. 28 (1956), 1756) was used to measure the total amount of nucleic acid (DNA + RNA) made in the precipitate. The amount of RNA was by subtracting the amount of DNA from the total amount of Calculated nucleic acids (DNA + RNA).

Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren von derselben Probe sowohl nach dem Proteinase K-/Phenol- als auch nach dem AGPC-Verfahren extrahiert.For comparison, nucleic acids were from the same Sample after both proteinase K / phenol and after extracted using the AGPC method.

Das Proteinase K-/Phenol-Verfahren wurde nach der Prozedur von Keller, G.H. et al. (Anal. Biochem., 170 (1988), 441-450) durchgeführt. Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (150 mM Natriumchlorid, 10 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 8), 2% SDS und 250 µg/ml Proteinase K) in einem Proberöhrchen mit einem Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 M¹ einer Zellsuspension gegeben. Das Gemisch wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. An schließend wurde 1 Stunde bei 50°C inkubiert. Im nächsten Schritt wurden 60 µl einer Lösung (Phenol/Chloroform/iso- Amylalkohol = 25 : 24 : 1) hinzugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurde 10 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Ein Teil (40 µl) des Überstandes (wäßrige Phase) wurden entnommen und mit 8 µl 4 M Kaliumace tat versetzt. Danach wurden 10 µg (1 µl) Glycogen und 50 µl iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Danach wurde es 30 Minuten bei -20°C gehalten. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 75%iger Ethanol wurden zum Prä zipitat gegeben, und das Gemisch wurde gerührt. Nach 20minütiger Zentrifugation bei 4°C wurde der Überstand ver worfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.The proteinase K / phenol procedure was after the procedure von Keller, G.H. et al. (Anal. Biochem., 170 (1988), 441-450) carried out. First, 40 μl of a reagent (150 mM Sodium chloride, 10mM EDTA, 10mM Tris (pH 8), 2% SDS and 250 μg / ml proteinase K) in a test tube with a Capacity of 0.5 ml to 20 M¹ of a cell suspension given. The mixture was then stirred for about 20 seconds. to closing was incubated at 50 ° C for 1 hour. In the next 60 μl of a solution (phenol / chloroform / iso- Amyl alcohol = 25: 24: 1), and the mixture became stirred for about 20 seconds. This was followed by 10 minutes Centrifuged at 15,000 rpm. One part (40 μl) of the supernatant (aqueous phase) were removed and washed with 8 μl of 4 M potassium acetate did. Thereafter, 10 μg (1 μl) of glycogen and 50 μl iso-propyl alcohol, and the mixture was stirred. Thereafter, it was kept at -20 ° C for 30 minutes. The supernatant was discarded and 100 μl of 75% ethanol was added to the pre added, and the mixture was stirred. To Centrifugation at 4 ° C for 20 minutes, the supernatant ver with the nucleic acids remaining in the precipitate.

Das AGPC-Verfahren wurde gemäß der Prozedur von Chomczyinski, P. et al. (Anal. Biochem. 162 (1987), 156-159) durchgeführt. Zuerst wurden 40 µl eines Reagenz (6 M Guanidiniumthiocya nat, 37,5 mM Natriumcitrat, 0,75% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 0,15 M 2-Mercaptoethanol) in einem Teströhrchen mit ei nem Fassungsvermögen von 0,5 ml zu 20 µl einer Zellsuspen sion gegeben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Da nach wurden 6 µl 2 M Natriumacetat (pH 4) zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Anschließend wurden 60 µl wassergesättigtes Phenol zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Im nächsten Schritt wurden 12 µl einer Lösung (Chloroform/iso-Amylalkohol = 49 : 1) zugege ben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Dann wurde das flüssige Gemisch 15 Minuten in Eiswasser gekühlt und bei 4°C 20 Minuten mit 15 000 UpM zentrifugiert. Ein Teil (60 µl) des Überstandes (wäßrige Phase) wurde entnommen und mit 60 µl iso-Propylalkohol vermischt. Das Gemisch wurde gerührt und 1 Stunde bei -20°C gekühlt. Danach wurde der Überstand verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 75%iger Ethanol gegeben und anschließend wurde gerührt. Im letzten Schritt wurde das Gemisch 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben. Die in den beiden herkömmlichen Verfahren erhaltenen Präzipitate wurden nach der vorstehend bereits beschriebenen Prozedur analysiert. Die Analyseergeb nisse sind nachstehend in Tabelle I gezeigt. Aus Tabelle I geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren den beiden herkömmlichen Verfahren bezüglich der Extraktionseffizienz überlegen ist.The AGPC procedure was performed according to the procedure of Chomczyinski, P. et al. (Anal., Biochem., 162 (1987), 156-159). First, 40 μl of a reagent (6 M guanidinium thiocya nat, 37.5 mM sodium citrate, 0.75% sodium N-lauroyl sarcosine and 0.15 M 2-mercaptoethanol) in a test tube with egg Capacity of 0.5 ml to 20 μl of a cell suspension given. The mixture was stirred for about 20 seconds. because After 6 μl of 2 M sodium acetate (pH 4) was added, and the Mixture was stirred for about 20 seconds. Subsequently were Add 60 μl of water-saturated phenol, and mix was stirred for about 20 seconds. In the next step, 12 μl a solution (chloroform / iso-amyl alcohol = 49: 1) zugege and the mixture was stirred for about 20 seconds. Then The liquid mixture was cooled in ice-water for 15 minutes and centrifuged at 4 ° C for 20 minutes at 15,000 rpm. On Part (60 μl) of the supernatant (aqueous phase) was taken and mixed with 60 ul iso-propyl alcohol. The mixture was stirred and cooled at -20 ° C for 1 hour. After that, the Supernatant discarded and the precipitate was 100 ul 75% Ethanol was added and then stirred. In the last Step, the mixture was centrifuged for 20 minutes at 4 ° C, and the supernatant was discarded, with the nucleic acids remained in the precipitate. The in the two conventional Processes obtained precipitates were after the above previously described procedure. The analysis results The following are shown in Table I below. From Table I shows that the inventive method the two conventional methods in terms of extraction efficiency is superior.

Tabelle I Table I

Example 2 Extraction from E. coli

E. coli (JM 109) wurde in L-Nährmedium gezüchtet. Beim Er reichen einer Dichte von E. coli-Zellen von 2×10⁸ pro ml Kulturlösung wurde 1 ml der Lösung in ein 1,5 ml Probenröhr chen gegeben und 1 Minuten bei 7000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und das Präzipitat wurde in 50 µl L-Nährmedium suspendiert. Zur Suspension wurden 2 µl (20 µg) Dextran (Mol. Gew. 5×10⁵) gegeben und damit vermischt. Da nach wurden 250 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 0,3% Natrium-N-Lauroylsarcosin und 60% iso-Propylalkohol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Danach wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zen trifugiert, um die Nucleinsäuren zu sedimentieren. Der Über stand wurde verworfen und 250 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge geben. Das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben Die DNA-Menge und die Gesamtmenge von Nucleinsäuren (DNA + RNA) wurden analog zu Beispiel 1 gemessen, und die RNA-Menge wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle II gezeigt.E. coli (JM 109) was grown in L-broth. He range from a density of E. coli cells of 2 × 10⁸ per ml Culture solution was added to 1 ml of the solution in a 1.5 ml sample tube and centrifuged for 1 minute at 7000 rpm. The Supernatant was discarded and the precipitate was dissolved in 50 μl L-nutrient medium suspended. To the suspension was added 2 μl (20 μg) Dextran (mol. Wt. 5 × 10⁵) and mixed with it. because After 250 μl of reagent C (2.4 M guanidinium thiocyanate, 15 mM sodium citrate, 0.3% sodium N-lauroyl sarcosine and 60% iso-propyl alcohol), and the mixture became about 20 Stirred for a second. Thereafter, zen was at 15,000 rpm for 2 minutes centrifuged to sediment the nucleic acids. The over was discarded and 250 μl of 40% isopropyl alcohol, containing 200 mM potassium chloride was added to the precipitate give. The mixture was stirred for about 20 seconds and then 1 Centrifuged at 15,000 rpm, and the supernatant was discarded, leaving the nucleic acids in the precipitate The amount of DNA and the total amount of nucleic acids (DNA + RNA) were measured analogously to Example 1, and the amount of RNA got calculated. The results are in the following Table II.

Tabelle II Table II

Example 3 Extraction of hepatitis B virus DNA

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ und 20 µl Serum von Patienten mit Heptatis B wurden zusammen in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden ge rührt. Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren in das Sediment gebracht. Der Überstand wurde verworfen und zum Präzipitat wurden 100 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, gege ben. Danach wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.1 μl (10 μg) of dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ and 20 μl of serum from patients with heptatis B were combined in test tubes with a capacity of 0.5 ml each given. Thereafter, 100 μl of reagent C (2.4 M Guanidini thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol was added, and the mixture was ge about 20 seconds ge stir. By centrifugation at 15,000 rpm for 2 minutes the nucleic acids are brought into the sediment. The supernatant was discarded and the precipitate was 100 ul 40% iso-propyl alcohol containing 200 mM potassium chloride, gege ben. Thereafter, it was stirred for about 20 seconds and then for 1 minute centrifuged at 15,000 rpm. The supernatant was discarded, wherein the nucleic acids remained in the precipitate.

Zum Präzipitat wurden 25 µl eines PCR-Reagenz (Takara Shuzo Co., Ltd.) gegeben und eine PCR wurde über 40 Cyclen unter Verwendung eines DNA-Thermal-Cyclers (PCR-Maschine, Perkin- Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen Primer wurden zur spezifischen Amplifikation von Hepatitis B-Virus (HBV) spezifischen Nucleinsäuren verwendet und die PCR-Bedingungen waren wie folgt: To the precipitate, 25 μl of a PCR reagent (Takara Shuzo Co., Ltd.) and a PCR was carried out for 40 cycles Use of a DNA thermal cycler (PCR machine, Perkin Elmer-Cetus). The ones described below Primers were used for the specific amplification of hepatitis B virus (HBV) specific nucleic acids are used and the PCR conditions were as follows:

Schritte eines Zyklus Steps of a cycle

Basensequenzen der Primer
5′-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3′
5′-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3′Base sequences of the primers
5'-GGACTTCTCTCAATTTTCTAGGG-3 '
5'-CAAATGGCACTAGTAAACTGAGC-3 '

Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 ge zeigt.After the PCR, the amplified nucleic acids were subjected to electrophoresis, and the optical densities of the respective bands were compared by staining with ethidium bromide. The results are shown in FIG .

Example 4 Extraction of RNA from Heptatis C virus

1 µl Dextran (10 µg) mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 0,5 ml gegeben. Danach wurden 100 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. Durch 2minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren sedimentiert. Der überstand wurde gefällt, und 100 µl 40%-iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurden zum Präzipitat gegeben. Danach wurde ca. 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu ren im Präzipitat verblieben.1 μl dextran (10 μg) with a molecular weight of 5 × 10⁵ was co-administered with 20 μl serum from hepatitis C patients in test tubes with a capacity of 0.5 ml each given. Thereafter, 100 μl of reagent C (2.4 M Guanidini thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol hol), and the mixture was stirred for about 20 seconds. Centrifugation at 15,000 rpm for 2 min Nucleic acids sedimented. The supernatant was felled, and 100 μl 40% iso-propyl alcohol, 200 mM potassium chloride contained were added to the precipitate. After that was about 20 Stirred for 2 seconds and then centrifuge for 1 minute at 15 000 rpm yaws. The supernatant was discarded, with the nucleic acid remained in the precipitate.

Das Präzipitat wurde mit 10 µl eines Reagenz für die reverse Transkription (Takara Shuzo Co., Ltd.) versetzt und darin gelöst. Danach wurde eine reverse Transkriptionsreaktion mit einem DNA-Thermal-Cycler (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend angegeben.The precipitate was washed with 10 μl of a reagent for reverse Transcription (Takara Shuzo Co., Ltd.) and in it solved. Thereafter, a reverse transcription reaction was carried out with a DNA thermal cycler (Perkin-Elmer-Cetus). The reaction conditions are given below.

Anschließend wurden zu 5 µl der Lösung der reversen Tran skriptionsreaktion 20 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde über 40 Zyklen unter Verwendung eines DNA-Thermal- Cyclers (Perkin-Elmer-Cetus) durchgeführt. Die nachstehend beschriebenen Primer wurden zur spezifischen Amplifikation von Nucleinsäuren des Hepatitis C-Virus (HCV) verwendet. Die Bedingungen für die PCR sind nachfolgend angegeben:Subsequently, 5 μl of the solution of the reverse Tran Script reaction 20 ul of a PCR reagent given, and the PCR was performed over 40 cycles using a DNA thermal Cyclers (Perkin-Elmer-Cetus) performed. The following described primers were for specific amplification used by hepatitis C virus (HCV) nucleic acids. The Conditions for the PCR are given below:

Schritte des Zyklus Steps of the cycle

Basensequenzen der Primer
5′-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3′
5′-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3′Base sequences of the primers
5'-CTCCACCATAGATCACTCCCC-3 '
5'-GCACTCGCAAGCACCCTAT-3 '

Nach der PCR wurden die amplifizierten Nucleinsäuren einer Elektrophorese unterworfen und die optischen Dichten der be treffenden Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 ge zeigt.After the PCR, the amplified nucleic acids were subjected to electrophoresis, and the optical densities of the respective bands were compared by staining with ethidium bromide. The results are shown in FIG .

Example 5 Extraction of RNA of the hepatitis C virus

2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml gegeben. Danach wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) zugegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden ge rührt. Durch 3minütige Zentrifugation bei 15 000 UpM wurden die Nucleinsäuren sedimentiert. Die Überstände wurden ver worfen und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Ka liumchlorid enthielt, wurde zum Sediment gegeben. Anschlie ßend wurde ca. 20 Sekunden gerührt und 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren im Präzipitat verblieben.2 μl (20 μg) dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ were co-administered with 100 μl of serum from patients with hepatitis C in sample tubes with a capacity of 1.5 ml given. Thereafter, 500 μl of reagent C (2.4 M Guanidini thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol hol) was added and the mixture was ge about 20 seconds ge stir. By centrifugation at 15,000 rpm for 3 minutes the nucleic acids sedimented. The supernatants were ver and 200 ul 40% iso-propyl alcohol, the 200 mM Ka lium chloride was added to the sediment. subsequently, The mixture was stirred for about 20 seconds and at 15,000 rpm for 1 minute centrifuged. The supernatant was discarded, with the Nucleic acids remained in the precipitate.

Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse Transkription vermischt und darin gelöst. Danach wurde eine reverse Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4 durchge führt. Anschließend wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl der Reaktionslösung der reversen Transkription vermischt, und die PCR wurde analog zu den in Beispiel 4 genannten Be dingungen durchgeführt.The precipitate was washed with 20 μl of a reagent for reverse Transcription mixed and dissolved in it. After that one became reverse transcription reaction analogous to Example 4 durchge leads. Subsequently, 40 .mu.l of a PCR reagent with 10 .mu.l the reaction solution of the reverse transcription mixed and the PCR was analogous to the Be mentioned in Example 4 conditions.

Zum Vergleich wurde Nucleinsäure nach dem Natriumjodid-Ver fahren (Ishizawa, M. et al. in Nucleic Acid Res. 19 (20) (1991), 5792) extrahiert. Zuerst wurden 100 µl Serum von Pa tienten mit Hepatitis C in Teströhrchen mit einem Fassungs vermögen von je 1,5 ml gegeben. Dann wurden 300 µl eines Reagenz, das 6 M NaJ, 13 mM EDTA, 0,5% Natrium-N-Lauroyls arcosin, 10 µg Glycogen und Tris-HCl (pH 8) enthielt, zuge geben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt. An schließend wurde 15 Minuten bei 60°C inkubiert. Danach wur den 400 µl iso-Propylalkohol zugegeben, und das Gemisch wurde ungefähr 20 Sekunden gerührt und anschließend 15 Minu ten stehengelassen. Dann wurde die Lösung 5 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Im nächsten Schritt wurde 1 ml 40%iger iso-Propylalkohol zu gegeben, und das Gemisch wurde ca. 20 Sekunden gerührt und anschließend 5 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Nucleinsäuren befanden sich im Präzipitat. Das Präzipitat wurde einer reversen Tran skriptionsreaktion und einer PCR unter denselben Bedingun gen, wie sie im vorstehenden Absatz beschrieben wurden, un terworfen. Nach Beendigung der PCR wurden 4 µl der Reakti onslösung durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie mit einem von Tosoh Corp. hergestellten Apparat untersucht. Die Säule enthielt das TSK-Gel G4000SW zur Gel-Permeations- Chromatographie und der Nachweis durch UV-Absorption wurde bei 260 nm mit einem UV 8000 (Tosoh Corp.), durchgeführt. Das Elutionsmittel war Kaliumphosphatpuffer (0,1 M, pH 6,8) und die Flußrate betrug 1 ml/Minute. Die Analyseergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt. Das erfindungsgemäße PCR-Amplifi kationsprodukt wurde in einer Menge von durchschnittlich 26 ng pro 10 µl PCR-Lösung nachgewiesen. Wenn nach dem Natri umjodid-Verfahren gearbeitet wurde, konnten demgegenüber nur 3 ng des Amplifikationsproduktes nachgewiesen werden.For comparison, nucleic acid after sodium iodide Ver (Ishizawa, M. et al., Nucleic Acid Res. 19 (20). (1991), 5792). First, 100 μl of serum from Pa hepatitis C in test tubes of one version assets of 1.5 ml each. Then, 300 μl of a Reagent containing 6 M NaJ, 13 mM EDTA, 0.5% sodium N-lauroyl arcosin, 10 μg glycogen and Tris-HCl (pH 8) and the mixture was stirred for about 20 seconds. to closing was incubated at 60 ° C for 15 minutes. Afterwards wur added to the 400 ul iso-propyl alcohol, and the mixture was stirred for about 20 seconds and then 15 minutes let stand. Then the solution was allowed to stand for 5 minutes Centrifuged at 15,000 rpm and the supernatant was discarded. In the next step, 1 ml of 40% iso-propyl alcohol was added and the mixture was stirred for about 20 seconds and then centrifuged for 5 minutes at 15,000 rpm. The Supernatant was discarded, the nucleic acids were in the precipitate. The precipitate became a reverse tran scripting reaction and a PCR under the same conditions as described in the preceding paragraph, and terworfen. After completion of the PCR, 4 .mu.l of the Reacti onsolution by high performance liquid chromatography with one from Tosoh Corp. examined apparatus examined. The column contained the TSK gel G4000SW for gel permeation Chromatography and detection by UV absorption was at 260 nm with a UV 8000 (Tosoh Corp.). The Eluant was potassium phosphate buffer (0.1 M, pH 6.8) and the flow rate was 1 ml / minute. The analysis results are listed in Table III. The PCR Amplifi invention cation product was used in an average of 26 ng detected per 10 μl of PCR solution. If, according to the Natri On the other hand, only 3 ng of the amplification product can be detected.

Tabelle III Table III

Example 6 Extraction of hepatitis B virus DNA

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B parallel in einer Reihe von Probenröhrchen, von denen jedes ein Fassungsvermögen von 0,5 ml aufwies, gegeben. Zu den Proben wurden verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) gegeben und damit vermischt:1 μl (10 μg) of dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ was co-administered with 20 μl serum from hepatitis B patients parallel in a row of sample tubes, each of which a capacity of 0.5 ml, given. To the Samples were given different compositions of Reagent C. (see below) and mixed with it:

(1) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol;
(2) 100 μl of reagent C containing 2.4 M potassium thiocyanate, 15 mM Sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol; and
(3) 100 μl of reagent C containing 3.2 M guanidinium hydrochlo chloride, 15 mM sodium citrate and 60% isopropyl alcohol.

Nach Zugabe dieser unterschiedlichen Zusammensetzungen von Reagenz C und dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat gelangten. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40% iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zuge geben. Dann wurde 20 Sekunden gerührt, das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Nucleinsäuren befanden sich weiter im Präzipitat. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3 einer PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektropho rese durchgeführt und die optischen Dichten der betreffenden produzierten Banden miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt. Die Lösungen, die die Zusammenset zungen (1) bis (3) des Reagenz C enthielten, produzierten offensichtlich Banden mit vergleichbaren Intensitäten.After addition of these different compositions of reagent C and mixing, centrifugation was carried out at 15,000 rpm for 2 minutes so that the nucleic acids entered the precipitate. The supernatant was discarded and 100 μl of 40% isopropanol containing 200 mM potassium chloride was added. Then, it was stirred for 20 seconds, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 1 minute, and the supernatant was discarded. The nucleic acids were still in the precipitate. The nucleic acids thus extracted were subjected to PCR analogously to Example 3. After the end of the reaction, an electrophoresis was performed and the optical densities of the respective bands produced were compared. The results are shown in FIG . The solutions containing the compositions (1) to (3) of reagent C apparently produced bands of comparable intensities.

Example 7 Extraction of hepatitis B virus DNA

Je 1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden gemeinsam mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepa titis B in eine Reihe von Probenröhrchen mit einem Fassungs vermögen von je 0,5 ml gegeben. Verschiedene Zusammensetzun gen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und damit vermischt:1 μl (10 μg) of dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ were co-administered with 20 μl of serum from patients with Hepa Titis B in a series of sample tubes with a socket assets of 0.5 ml each. Various compositions Reagent C (see below) were added to the samples and mixed with it:

(1) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% n-propyl alcohol;
(2) 100 μl reagent c containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% iso-propyl alcohol;
(3) 80 μl reagent C containing 3 M guanidinium thiocyanate, 19 mM sodium citrate, 75 mM 2-mercaptoethanol, 0.38% Na trium-N-lauroyl sarcosine and 50% n-butyl alcohol;
(4) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% n-butyl alcohol;
(5) 80 μl reagent C containing 3 M guanidinium thiocyanate, 19 mM sodium citrate, 75 mM 2-mercaptoethanol, 0.38% Na trium-N-lauroylsarcosine and 50% sec-butyl alcohol; and
(6) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% sec-butyl alcohol.

Nach Zugabe dieser verschiedenen Zusammensetzungen von Rea genz C und nach dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipi tat gebracht wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Propanol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Es wurde dann ca. 20 Sekunden gerührt. Da nach wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifu giert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nuclein säuren weiter im Präzipitat verblieben. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3, einer PCR unter worfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektrophorese durch geführt und die optischen Dichten der betreffenden Banden verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die die Zusammensetzungen (1) bis (6) von Reagenz C enthaltenden Lösungen zu Banden vergleichbarer Intensitäten führten. After addition of these various compositions of Reagent C and after mixing, centrifugation was carried out at 15,000 rpm for 2 minutes, whereby the nucleic acids were introduced into the precipitate. The supernatant was discarded and 100 μl of 40% isopropanol containing 200 mM potassium chloride was added. It was then stirred for about 20 seconds. After that, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 1 minute, and the supernatant was discarded leaving the nucleic acids in the precipitate. The nucleic acids thus extracted were subjected to a PCR analogously to Example 3. After the end of the reaction, electrophoresis was performed and the optical densities of the respective bands were compared. The results are shown in FIG . It is evident that the solutions containing compositions (1) to (6) of reagent C resulted in bands of comparable intensities.

Example 8 Extraction of virus DNA from hepatitis B virus

1 µl (10 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurde zusammen mit 20 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B in eine Reihe von Probenröhrchen mit jeweils 0,5 ml Fassungsvermögen gegeben. Verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und da mit vermischt:1 μl (10 μg) of dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ was co-administered with 20 μl serum from hepatitis B patients into a series of 0.5 ml test tubes Capacity given. Various compositions of Reagent C (see below) was added to the samples and there mixed with:

(1) 80 μl of reagent C containing 3 M guanidinium thiocya nat, 19 mM sodium citrate, 75 mM 2-mercaptoethanol, 0.38 Sodium N-lauroylsarcosine and 50% tertiary amyl alcohol;
(2) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-laroyl sarcosine and 60% tertiary amyl alcohol;
(3) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% tertiary butyl alcohol; and
(4) 100 μl reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate, 60 mM 2-mercaptoethanol, 0.3% Sodium N-lauroyl sarcosine and 60% iso-propyl alcohol.

Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach dem Vermischen wurde 2 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, so daß die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Pro pylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, zugegeben. Dann wurde 20 Sekunden gerührt. Danach wurde das Gemisch 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat ver blieben. Die so extrahierten Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 3 einer PCR unterworfen. Nach Reaktionsende wurde eine Elektrophorese durchgeführt und die optischen Dichten der betreffenden Banden miteinander verglichen. Die Ergeb nisse sind in Fig. 5 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die die verschiedenen Zusammensetzungen von Reagenz c enthalten den Lösungen zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führ ten.After addition of these compositions of reagent C and after mixing, centrifugation was carried out at 15,000 rpm for 2 minutes so that the nucleic acids were transferred to the precipitate. The supernatant was discarded and 100 μl of 40% iso-propyl alcohol containing 200 mM potassium chloride added. Then it was stirred for 20 seconds. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 1 minute, and the supernatant was discarded leaving the nucleic acids in the precipitate. The nucleic acids thus extracted were subjected to PCR analogously to Example 3. After the end of the reaction, electrophoresis was performed and the optical densities of the bands in question were compared. The results are shown in FIG . It is evident that the solutions containing the various compositions of reagent c lead to bands of comparable intensities.

Example 9 Extraction of RNA of the hepatitis C virus

Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml wurden mit 0, 0,5, 1, 2 und 5 µl (0, 5, 10, 20 und 50 µg) einer Acrylamidlösung (Molekulargewicht ungefähr 0,7×10⁵) bzw. 2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ beladen. Weiterhin wurden je 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis C in die Röhrchen gegeben und die Gemische ca. 5 Sekunden gerührt. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Gua nidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propyl alkohol) zugegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verwor fen, und 200 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kali umchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat gegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifu giert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäu ren weiter im Präzipitat verblieben.Test tubes with a respective capacity of 1.5 ml were 0, 0.5, 1, 2 and 5 μl (0, 5, 10, 20 and 50 μg) an acrylamide solution (molecular weight about 0.7 × 10⁵) or 2 μl (20 μg) dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ loaded. Furthermore, each 100 ul serum from patients with hepatitis C in the tubes and the mixtures are approx. Stirred for 5 seconds. Then, 500 μl of reagent C (2.4 M Gua nidinium thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% isopropyl alcohol) was added. After stirring for 20 seconds, it became 3 minutes centrifuged at 15,000 rpm, whereby the nucleic acids in the precipitate was transferred. The supernatant was verwor 200 μl of 40% iso-propyl alcohol, the 200 mM potash chloride was added to the precipitate. After 20 Stirring was followed by centrifugation at 15,000 rpm for 3 minutes yaws. The supernatant was discarded, with the nucleic acid remained in the precipitate.

Das Präzipitat wurde mit 20 µl eines Reagenz für die reverse Transkription versetzt und darin gelöst. Die Lösung wurde einer reversen Transkriptionsreaktion analog zu Beispiel 4 unterworfen. Danach wurden 40 µl eines PCR-Reagenz mit 10 µl Reaktionslösung (der reversen Transkription) vermischt und analog zu Beispiel 4 wurde eine PCR durchgeführt. Nach Been digung der PCR wurden 10 µl der Reaktionslösung durch Hoch auflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 untersucht. Die Analy seergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV beschrie ben. The precipitate was washed with 20 μl of a reagent for reverse Transcription offset and solved. The solution was a reverse transcription reaction analogous to Example 4 subjected. Thereafter, 40 .mu.l of a PCR reagent with 10 .mu.l Reaction solution (the reverse transcription) mixed and Analogous to Example 4, a PCR was performed. After Been To test the PCR, 10 .mu.l of the reaction solution by high Dissolution-liquid chromatography with an apparatus from Tosoh Corp. investigated analogously to Example 5. The Analy results are described in Table IV below ben.

Tabelle IV Table IV

In Abwesenheit von mit einer Nucleinsäure copräzipitierendem Acrylamid, wurde keine Hepatitis C-Virus-RNA extrahiert, weshalb kein PCR-Amplifikationsprodukt nachweisbar war. Bei einer Zugabe von Acrylamid in Mengen von 20 µg oder mehr wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca. 35 ng nachgewiesen. Bei Zugabe von 20 µg Dextran wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von ca. 44 ng nach gewiesen. In the absence of coprecipitating with a nucleic acid Acrylamide, no hepatitis C virus RNA was extracted, why no PCR amplification product was detectable. at an addition of acrylamide in amounts of 20 μg or more was the PCR amplification product in an amount of about 35 ng detected. Upon addition of 20 μg of dextran, the PCR amplification product in an amount of about 44 ng after rejected.

Example 10 Extraction of hepatitis B virus DNA

Nucleinsäuren wurden analog zu Beispiel 4 extrahiert und ei ner PCR unterworfen, wobei aber Dextran (mit einem Moleku largewicht von 5×10⁵) in variierenden Mengen von 0, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 und 6,4 µl (0, 2, 4, 8, 16, 32 und 64 µg) zugegeben wurde. Nach Ende der PCR wurde eine Elektrophorese durchgeführt und die optischen Dichten der Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Es ist offensicht lich, daß beim Fehlen von mit Nucleinsäuren copräzipitieren dem Dextran keine Hepatitis B-Virus-DNA extrahiert und des halb keine Bande nachgewiesen wurde. Wenn Dextran in Mengen von 16 µg oder mehr zugegeben wurde, waren die Intensitäten der Banden nahezu miteinander vergleichbar.Nucleic acids were extracted analogously to Example 4 and subjected to a PCR, but dextran (with a Moleku large weight of 5 × 10⁵) in varying amounts of 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 3, 2 and 6.4 μl (0, 2, 4, 8, 16, 32 and 64 μg) was added. After the end of the PCR, electrophoresis was performed and the optical densities of the bands were compared by staining with ethidium bromide. The results are shown in FIG . It is obvious that in the absence of coprecipitate with nucleic acids, no hepatitis B virus DNA was extracted from the dextran and half of the band was not detected. When dextran was added in amounts of 16 μg or more, the intensities of the bands were almost comparable.

Example 11 Extraction of hepatitis B virus DNA

Analog zu Beispiel 3 wurden Nucleinsäuren extrahiert und ei ner PCR unterworfen. Dabei wurde aber Dextran durch Carboxy methylcellulose (Produkt von SIGMA, niedrige Viskosität) er setzt. Diese wurde in einer Menge von 1 µl (10 µg) verwen det. Nach Beendigung der PCR wurde eine Elektrophorese durchgeführt, und die optischen Dichten der Banden wurden durch Anfärben mit Ethidiumbromid miteinander verglichen. Das Ergebnis ist in Fig. 7 gezeigt. Es ist offensichtlich, daß die Bandenintensitäten miteinander nahezu vergleichbar waren, wenn Dextran bzw. Carboxymethylcellulose als Träger verwendet wurden (als Referenz ist das Ergebnis der Extrak tion bei Verwendung von Dextran in Fig. 7 ebenfalls ge zeigt). Analogous to Example 3, nucleic acids were extracted and subjected to PCR. However, dextran was by carboxymethylcellulose (product of SIGMA, low viscosity) he sets. This was used in an amount of 1 μl (10 μg). After completion of the PCR, electrophoresis was performed and the optical densities of the bands were compared by staining with ethidium bromide. The result is shown in FIG . It is apparent that the band intensities were almost comparable with each other when dextran or carboxymethyl cellulose were used as the carrier (for reference, the result of extraction when using dextran in Fig. 7 is also ge shows).

Example 12 Application to the PCR product

Teströhrchen mit einem Fassungsvermögen von je 1,5 ml wurden mit 2 µl (2 µg) einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) beladen. Dazu wurden 20 µl HBV-PCR-Reaktionslösung und 80 µl Wasser gegeben und miteinander vermischt. An schließend wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat, 60 mM β-Mercaptoethanol und 60% iso-Propylalkohol) zugefügt. Nach 20 Sekunden Rüh ren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Überstand wurde verworfen und 100 µl 40%iger iso-Propylalko hol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat gegeben. Nach 20 Sekunden Rühren wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Auflösen wurden dann 20 µl Wasser zum Präzipitat gegeben.Test tubes with a capacity of 1.5 ml were with 2 μl (2 μg) of a solution of dextran (molecular weight 5 × 10⁵). To this was added 20 μl of HBV PCR reaction solution and 80 .mu.l of water and mixed together. to Subsequently, 500 μl reagent C (2.4 M Guanidini thiocyanate, 15 mM sodium citrate, 60 mM β-mercaptoethanol and 60% iso-propyl alcohol). After 20 seconds, stir was centrifuged for 3 minutes at 15,000 rpm, whereby the nucleic acids were transferred to the precipitate. The Supernatant was discarded and 100 .mu.l of 40% isopropyl alcohol Hol containing 200 mM potassium chloride became the precipitate given. After 20 seconds stirring was at 15,000 rpm for 3 minutes centrifuged. The supernatant was discarded, with the Nucleic acids remained in the precipitate. To dissolve then 20 μl of water was added to the precipitate.

Die PCR-Lösung (10 µl) wurde sowohl vor als auch nach der Extraktion von Nucleinsäuren durch Hochauflösungs-Flüssig keits-Chromatographie analog zu Beispiel 5 mit einem Apparat von Tosoh Corp. analysiert. Die Säule enthielt das TSK-Gel G3000SW für die Gel-Permeations-Chromatographie.The PCR solution (10 μl) was used both before and after Extraction of nucleic acids by high-resolution liquid keits chromatography analogous to Example 5 with an apparatus from Tosoh Corp. analyzed. The column contained the TSK gel G3000SW for gel permeation chromatography.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 gezeigt, aus der sich ersehen läßt, daß sowohl das PCR-Amplifikationsprodukt als auch das Primer-Oligomer in Ausbeuten von beinahe 100% wiedergewon nen werden. Es wird außerdem deutlich, daß sowohl der Primer als auch die Desoxyribonucleosid-Triphosphate entfernt wor den waren. The results are shown in Fig. 8, from which it can be seen that both the PCR amplification product and the primer oligomer are recovered in yields of nearly 100%. It also becomes clear that both the primer and deoxyribonucleoside triphosphates were removed.

Example 13 PCR using extracted nucleic acids

2 µl (20 µg) Dextran mit einem Molekulargewicht von 5×10⁵ wurden zusammen mit 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B in Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 1,5 ml gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidini umthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Propylalko hol) zugegeben. Das Gemisch wurde 20 Sekunden gerührt und dann 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, wodurch die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt wurden. Der Über stand wurde verworfen und 20 µl 40%iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Danach wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. Zum Präzipi tat wurden 50 µl eines PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt.2 μl (20 μg) dextran with a molecular weight of 5 × 10⁵ were co-administered with 100 μl of serum from patients with hepatitis B in sample tubes with a capacity of 1.5 ml given. Then, 500 μl of reagent C (2.4 M Guanidini thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol hol) added. The mixture was stirred for 20 seconds and then centrifuged for 3 minutes at 15,000 rpm, causing the Nucleic acids were transferred to the precipitate. The over was discarded and 20 ul 40% iso-propyl alcohol, containing 200 mM potassium chloride was added. After that was stirred for 20 seconds and then at 15,000 rpm for 1 minute centrifuged. The supernatant was discarded, with the Nucleic acids remained in the precipitate. To the Präzipi did 50 μl of a PCR reagent were added, and the PCR was carried out analogously to Example 3.

Zu Vergleichszwecken wurden Nucleinsäuren nach dem Natri umjodid-Verfahren (Ishizawa, M. et al., in Nucleic Acid Res. 19(20) (1991), 5792) analog zu Beispiel 5 extrahiert, und eine PCR wurde in der gleichen Weise, wie sie gerade vorste hend beschrieben wurde, durchgeführt. Nach Beendigung der PCR wurden 10 µl Reaktionslösung durch Hochauflösungs-Flüs sigkeits-Chromatographie unter Verwendung eines Apparates von Tosoh Corp. analog zu Beispiel 5 analysiert.For comparison purposes, nucleic acids were added after sodium iodide method (Ishizawa, M. et al., in Nucleic Acid Res. 19 (20) (1991), 5792) is extracted analogously to Example 5, and a PCR was done in the same way as it was before described. After completion of the PCR, 10 μl of reaction solution by high-resolution Flüs sigkeit chromatography using an apparatus from Tosoh Corp. analyzed analogously to Example 5.

Die Analyseergebnisse sind in Tabelle V gezeigt. Das erfin dungsgemäß erhaltene PCR-Amplifikationsprodukt wurde in ei ner Menge von durchschnittlich 7,5 ng pro 10 µl PCR-Lösung nachgewiesen, wohingegen nur 4,3 ng des nach dem Natriumjo didverfahren erhaltenen Amplifikationsproduktes nachgewiesen werden konnten. Die in Tabelle V gezeigten Ergebnisse zeigen den Mittelwert von 4 Proben.The analysis results are shown in Table V. That's invented According to obtained PCR amplification product was in egg An average of 7.5 ng per 10 ul PCR solution whereas only 4.3 ng of that after the sodium jo did amplification product detected could become. The results shown in Table V show the mean of 4 samples.

PCR-Amplifikationsprodukt (ng)PCR amplification product (ng) Erfindunginvention 7,57.5 Natriumjodid-VerfahrenSodium iodide method 4,34.3

Example 14

Teströhrchen mit einem jeweiligen Fassungsvermögen von 1,5 ml wurden jeweils mit einem der nachfolgenden Träger bela den:Test tubes with a respective capacity of 1.5 ml were each bela with one of the following carriers the:

(1) 2 μl (20 μg) dextran (molecular weight 5 × 10⁵);
(2) 1 μl (10 μg) of dextran (molecular weight 5 × 10⁵) and 1 μl (10 μg) acrylamide (molecular weight 7 × 10⁵);
(3) 1 μl (10 μg) of acrylamide (molecular weight 7 × 10⁵) and 1 μl (10 μg) carboxymethylcellulose (product of SIGMA; low viscosity).

Weiterhin wurden in die Röhrchen 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B gegeben. Dann wurden 500 µl Reagenz C (2,4 M Guanidiniumthiocyanat, 15 mM Natriumcitrat und 60% iso-Pro pylalkohol) gegeben, und die Gemische wurden ca. 20 Sekunden gerührt. Durch 3 Minuten Zentrifugation bei 15 000 UpM wur den die Nucleinsäuren in das Präzipitat überführt. Der Über stand wurde verworfen und 200 µl 40%-iger iso-Propylalkohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zum Präzipitat ge geben. Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und 1 Minute bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben.Furthermore, 100 μl of serum from patients were added to the tubes given with hepatitis B. Then, 500 μl of reagent C (2.4 M Guanidinium thiocyanate, 15 mM sodium citrate and 60% iso-Pro ethyl alcohol), and the mixtures were allowed to stand for about 20 seconds touched. Were centrifuged at 15,000 rpm for 3 minutes which converts the nucleic acids into the precipitate. The over was discarded and 200 μl of 40% isopropyl alcohol, containing 200 mM potassium chloride was added to the precipitate give. The mixture was then stirred for 20 seconds and 1 minute centrifuged at 15,000 rpm. The supernatant was discarded, with the nucleic acids remaining in the precipitate.

Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und eine PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Vervoll ständigung der PCR, wurde analog zu Beispiel 5 die PCR-Lö sung durch Hochauflösungs-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von Tosoh Corp. analysiert. Die Analyseergeb nisse sind nachstehend in Tabelle VI gezeigt. Es ist offen sichtlich, daß ein einzelner Träger und ein Gemisch von zwei Trägern zu Banden mit vergleichbaren Intensitäten führten. Die Ergebnisse der Tabelle VI geben einen Mittelwert von 4 Proben wieder.To the precipitate was added 50 μl of PCR reagent, and a PCR was carried out analogously to Example 3. After completing Continuing the PCR was analogous to Example 5, the PCR Lö with high-resolution liquid chromatography an apparatus from Tosoh Corp. analyzed. The analysis results The following are shown in Table VI below. It is open visibly that a single carrier and a mixture of two Carriers led to bands with comparable intensities. The results of Table VI give a mean of 4 Rehearsals again.

Trägercarrier PCR-Amplifikationsprodukt (ng)PCR amplification product (ng) Dextrandextran 3737 Dextran und AcrylamidDextran and acrylamide 3333 Acrylamid und CarboxymethylcelluloseAcrylamide and carboxymethyl cellulose 3737

Example 15

Probenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von jeweils 0,5 ml wurden mit je 2 µl (20 µg) einer Lösung von Dextran (Molekulargewicht 5×10⁵) beladen. In die Röhrchen wurden außerdem 100 µl Serum von Patienten mit Hepatitis B gegeben. Verschiedene Zusammensetzungen von Reagenz C (siehe unten) wurden zu den Proben gegeben und damit vermischt:Sample tubes with a capacity of 0.5 ml each were each with 2 ul (20 ug) of a solution of dextran (Molecular weight 5 × 10⁵) loaded. Into the tubes were also given 100 μl serum from hepatitis B patients. Different compositions of reagent C (see below) were added to the samples and mixed with them:

(1) 500 μl of reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15 mM sodium citrate and 60% iso-propyl alcohol;
(2) 500 μl of reagent C containing 2.4 M guanidinium thiocya nat, 15mM sodium citrate, 30% iso-propyl alcohol and 30% tert-butyl alcohol.

Nach Zugabe dieser Zusammensetzungen von Reagenz C und nach dem Vermischen wurde 3 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert, um die Nucleinsäuren in das Präzipitat zu überführen. Der Überstand wurde verworfen, und 200 µl 40%-iger iso-Propylal kohol, der 200 mM Kaliumchlorid enthielt, wurde zugegeben. Anschließend wurde 20 Sekunden gerührt und dann 1 Minuten bei 15 000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, wobei die Nucleinsäuren weiter im Präzipitat verblieben. After addition of these compositions of reagent C and after the mixing was centrifuged for 3 minutes at 15,000 rpm, to convert the nucleic acids into the precipitate. The Supernatant was discarded, and 200 μl of 40% iso-propylal Cohol containing 200 mM potassium chloride was added. The mixture was then stirred for 20 seconds and then for 1 minute centrifuged at 15,000 rpm. The supernatant was discarded, with the nucleic acids remaining in the precipitate.

Zum Präzipitat wurden 50 µl PCR-Reagenz gegeben, und die PCR wurde analog zu Beispiel 3 durchgeführt. Nach Beendigung der PCR, wurde die PCR-Lösung analog zu Beispiel 5 durch Hoch druck-Flüssigkeits-Chromatographie mit einem Apparat von To soh Corp. analysiert. Die Analyseergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII gezeigt. Wenn das Reagenz C nur iso-Propylalkohol enthielt, wurde das PCR-Amplifikationspro dukt in einer Menge von durchschnittlich 42 ng pro 10 µl PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Wenn das Reagenz C iso- Propylalkohol und tert.-Butylalkohol enthielt, wurde das PCR-Amplifikationsprodukt in einer Menge von durchschnitt lich 33 ng pro 10 µl PCR-Reaktionslösung nachgewiesen. Die in Tabelle VII gezeigten Ergebnisse geben die Mittelwerte von 2 Proben wieder.To the precipitate was added 50 μl PCR reagent and the PCR was carried out analogously to Example 3. After completion of the PCR, the PCR solution was analogous to Example 5 by high pressure-liquid chromatography with an apparatus from To soh Corp. analyzed. The analysis results are in the shown in Table VII below. If the reagent C only iso-propyl alcohol, the PCR amplification pro averaged 42 ng per 10 μl Detected PCR reaction solution. If the reagent C is iso- Propyl alcohol and tert-butyl alcohol, was the PCR amplification product in an amount of average 33 ng per 10 ul PCR reaction solution detected. The Results shown in Table VII give the means of 2 samples again.

In Reagenz C enthaltener AlkoholAlcohol contained in reagent C. PCR-Amplifikationsprodukt (ng)PCR amplification product (ng) iso-Propylalkoholiso-propyl alcohol 4242 iso-Propylalkohol und tert.-Butylalkoholiso-propyl alcohol and tert-butyl alcohol 3333

Die vorliegende Erfindung bietet eine Reihe von Vorteilen, die nachfolgend deutlich werden. Mindestens ein aus den Sub stanzen Guanidiniumthiocyanat, Guanidiniumhydrochlorid, Ka liumthiocyanat und Natriumthiocyanat ausgewähltes Reagenz A, und mindestens ein aus den Substanzen n-Propylalkohol, iso- Propylalkohol, n-Butylalkohol, sek.-Butylalkohol, tert.-Bu tylalkohol und tert.-Amylalkohol ausgewähltes Reagenz B, werden vorbereitend vermischt, um das Reagenz C herzustel len. Dies macht es möglich, die Menge zu verringern, in denen diese Reagenzien verwendet werden müssen. Als Beispiel sei ein Fall betrachtet, bei dem eine 10 µl-Probe so be schaffen ist, daß sie ein proteindenaturierendes Agens und iso-Propanol in den Endkonzentrationen 2 M bzw. 50% ent hält. Im Guanidiniumverfahren ist typischerweise die Zugabe einer 6 M Guanidiniumlösung in einer Menge von 20 µl nötig, und dann wird ungefähr 100%-iger iso-Propylalkohol in einer Menge von 30 µl zugegeben. Im Gegensatz dazu verlangt das erfindungsgemäße Verfahren die Zugabe von lediglich 20 µl eines Nucleinsäure extrahierenden Reagenz, das sich aus ca. 75%-igem iso-Propylalkohol zusammensetzt, der 3 M Guanidiniumthiocyanat enthält. Beim Guanidiniumverfahren er geben sich am Ende 60 µl einer Lösung, die die Probe, 2 M Guanidiniumthiocyanat und ca. 50% iso-Propanol enthält, wo hingegen sich erfindungsgemäß nur 30 µl einer Lösung erge ben, die dieselben Konzentrationen aufweisen. Somit läßt sich der flüssige Abfall, der nach dem Extraktionsverfahren entsorgt werden muß, dementsprechend vermindern. Außerdem müssen beim erfindungsgemäßen Verfahren keine giftigen oder gefährlichen Substanzen, wie Chloroform oder Phenol verwen det werden und es kann daher verglichen mit den herkömmli chen Verfahren verhältnismäßig leicht durchgeführt werden.The present invention offers a number of advantages, which will become clear below. At least one from the sub punch guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, Ka lium thiocyanate and sodium thiocyanate selected reagent A, and at least one of the substances n-propyl alcohol, iso- Propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-Bu tyl alcohol and tert-amyl alcohol selected reagent B, are preliminarily mixed to prepare the reagent C. len. This makes it possible to reduce the amount in which these reagents must be used. As an an example Let us consider a case in which a 10 μl sample is so be is that they are a protein-denational agent and Isopropanol in the final concentrations of 2 M and 50% ent holds. In the guanidinium process is typically the addition a 6 M guanidinium solution in an amount of 20 μl needed, and then about 100% iso-propyl alcohol in one Amount of 30 μl was added. In contrast, that requires inventive method the addition of only 20 ul a nucleic acid-extracting reagent consisting of ca. 75% iso-propyl alcohol, the 3 M Guanidinium thiocyanate contains. In the guanidinium method he in the end add 60 μl of a solution containing the sample, 2 M Guanidinium thiocyanate and about 50% iso-propanol, where whereas, according to the invention, only 30 μl of a solution result ben, which have the same concentrations. Thus leaves the liquid waste after the extraction process must be disposed of accordingly. also need in the process according to the invention no toxic or hazardous substances such as chloroform or phenol and it can therefore be compared with the herkömmli chen procedures are relatively easily performed.

Erfindungsgemäß werden die extrahierten Nucleinsäuren im Präzipitat erhalten, und die vorliegende Erfindung kann mit außerordentlich einfachen Verfahrensschritten durchgeführt werden, wenn man einen Vergleich mit Verfahren aus dem Stand der Technik vornimmt, bei denen es auf die Löslichkeit der Nucleinsäure in zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten ankommt, und bei denen die flüssige Phase, in der die interessierende Nucleinsäure gelöst ist von der anderen flüssigen Phase ab getrennt werden muß, um die Nucleinsäure zu extrahieren. Beim Nacharbeiten der vorliegenden Erfindung werden somit keine großen Anforderungen an die Geschicklichkeit gestellt, die gewünschten Nucleinsäuren können jedoch mit gleichblei bend hoher Effizienz extrahiert werden.According to the invention, the extracted nucleic acids are in the Precipitate obtained, and the present invention can with extremely simple process steps carried out if one compares with procedures from the state the technique, which is based on the solubility of the Nucleic acid arrives in two immiscible liquids, and in which the liquid phase in which the one of interest Nucleic acid is dissolved off from the other liquid phase must be separated to extract the nucleic acid. When reworking the present invention thus become no great demands on skill, However, the desired nucleic acids can be gleichblei with be extracted with high efficiency.

Vorteilhaft ist ferner, daß das Reagenz A erfindungsgemäß im Reagenz C, das zur Probe gegeben wird, in einer niedrigeren Konzentration enthalten sein kann, und damit sein Auskri stallisieren wirksam verhindert wird. Außerdem läßt sich die Konzentration von Reagenz B ebenfalls genügend weit vermin dern, um seine Verdampfung zu verhindern. Dadurch eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für eine auto matisierte Verwendung. Wenn die Reagenzien A und B einzeln verwendet werden, ist es im allgemeinen schwierig, die Ge nauigkeit ihrer Zugabe in kleinen Mengen zu optimieren. Man kann jedoch erwarten, daß sich das erfindungsgemäße Reagenz zur Extraktion von Nucleinsäuren mit höherer Genauigkeit zu geben läßt.A further advantage is that the reagent A according to the invention in Reagent C, which is added to the sample, in a lower Concentration can be included, and thus its Auskri stalling is effectively prevented. In addition, can the Concentration of reagent B also vermin far enough to prevent its evaporation. This makes it suitable the inventive method especially for a car matized use. When reagents A and B are single In general, it is difficult to use the Ge accuracy of their addition in small quantities. you However, it can be expected that the reagent according to the invention for extraction of nucleic acids with higher accuracy give.

Erfindungsgemäß werden Träger und Reagenz C, das die Reagen zien A und B enthält, verwendet. Abgesehen von den vorste hend genannten Vorteilen liefert die Erfindung die Möglich keit, Nucleinsäuren mit einer höheren Effizienz zu extrahie ren als mit den herkömmlichen Verfahren.According to the invention, the carrier and reagent C are the reagents Zien A and B contains used. Apart from the first As mentioned advantages, the invention provides the possible ability to extract nucleic acids at a higher efficiency than with conventional methods.

Dem zweiten Aspekt der Erfindung gemäß, stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer bestimmten Nucleinsäurese quenz bereit, das die Durchführung einer PCR und die Messung der Fluoreszenzintensität in einem geschlossenen Gefäß er laubt. Somit beinhaltet bei einem Vergleich mit herkömmli chen Verfahren, die lediglich Nucleinsäuren durch die PCR amplifizieren, und die amplifizierten Nucleinsäuren nachwei sen, das erfindungsgemäße Nachweisverfahren eine einfache Prozedur und bietet außerdem die Möglichkeit, die Wahr scheinlichkeit einer Aerosolbildung wirksam zu vermindern.According to the second aspect of the invention, the invention provides a method of detecting a particular nucleic acid ready to carry out a PCR and the measurement the fluorescence intensity in a closed vessel he laubt. Thus, when compared with herkömmli chen procedures that only nucleic acids by PCR amplify, and the amplified nucleic acids nachwei sen, the detection method according to the invention a simple Procedure and also offers the possibility of the true to reduce the probability of aerosol formation.

Claims

1. A method for extracting nucleic acids from a sample, characterized in that it comprises the following steps:

(1) mixing the sample with a carrier which is at least one of dextran, acrylamide or carboxymethylcellulose to produce a liquid mixture;
(2) mixing the liquid mixture with reagent C to precipitate the nucleic acids and the carrier, wherein the reagent C is at least one Reagent A selected from guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and sodium thiocyanate and at least one of n-Pro pyl alcohol, iso-propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and tert-amyl alcohol containing selected reagent B; and
(3) Separation of precipitated nucleic acids and precipitated carrier from the liquid phase

2. A method for detecting a specified Nucleinsäu resequenz, characterized in that it comprises the fol lowing steps:

(1) mixing the sample with a carrier which is at least one of the substances dextran, acrylamide, car boxymethylcellulose to produce a liquid mixture;
(2) mixing the liquid mixture with reagent C to precipitate the nucleic acids and the carrier, wherein the reagent C is at least one Reagent A selected from guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and sodium thiocyanate and at least one of n-Pro pyl alcohol, iso-propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert-butyl alcohol and tert-amyl alcohol containing selected reagent B;
(3) separating precipitated nucleic acids and precipitated carrier from the liquid phase;
(4) transferring the separated nucleic acids into DNA by a reverse transcription reaction, if they are RNA;
(5) Subjecting the nucleic acids separated in either step (3) or obtained in step (4) to polymerase chain reaction in a PCR solution containing a mixture of mononucleoside triphosphates, a polymerase, an intercalating fluorochrome and an oligonucleotide probe is suitable for Amplifi cation of at least one specified sequence ge;
(6) measuring the change in the fluorescence intensity that occurs as a result of the PCR or the change in the fluorescence intensity of the reaction solution as the PCR proceeds; and
(7) Determine (based on the change in fluorescence intensity) whether a nucleic acid having the specified sequence was present in the sample.

3. The method of claim 2, wherein the PCR and the measurement the change in fluorescence intensity in a ge Closed vessel is performed, which extract the nucleic acids and the PCR solution in a hermetic contains completed state.

4. reagent pack for the extraction of nucleic acids, which separately contains at least one carrier and a reagent C, wherein

(1) the carrier is at least one of dextran, acrylamide or carboxymethylcellulose; and
(2) Reagent C is at least one reagent selected from guanidinium thiocyanate, guanidinium hydrochloride, potassium thiocyanate and sodium thiocyanate and at least one of n-propyl alcohol, iso-propyl alcohol, n-butyl alcohol, sec-butyl alcohol, tert. Butyl alcohol and tert-amyl alcohol reagent B contains.