JPH0599926A - 細菌、細胞、ウイルス測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 好ましくは磁性細菌から抽出した磁性細菌粒
子に、蛍光標識を行った抗体を固定化し、細菌、細胞、
ウィルスと反応を行い凝集を生じさせる。その後、凝集
物を好ましくは磁気的に分離し、その蛍光強度を測定す
る。 【効果】 きわめて微量まで高感度、高精度にて定量で
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、細菌、細胞、ウィルス
測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、磁気微粒子を用いた液体試料中の
細菌、細胞等の免疫学的測定法は磁気微粒子含有ラテッ
クス粒子(Dynabeads) を用いたものが報告されている(J
ournalof Immunological Methods, 137(1991)1-8)。こ
の方法は抗体固定化磁気微粒子含有ラテックス粒子を含
む溶液と細菌を含む溶液とを混合し、抗原抗体反応をさ
せた後、磁気微粒子含有ラテックス粒子を分離洗浄し、
その後、酵素標識抗体を二次抗体として反応させ、余剰
の二次抗体を分離洗浄した後、磁気微粒子含有ラテック
ス粒子に残っている酵素を反応させることで細菌量を定
量するエンザイムイムノアッセイである。

【０００３】しかし、この方法は分離洗浄操作を含むた
め操作が煩雑であり、測定時間が長く２〜３時間必要で
ある上、測定感度も低く検出感度は１０³ 〜１０⁴cells
/mlである。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、短時
間で高感度に細菌、細胞、ウィルスの定量をすることが
できる測定方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】このような目的は、下記
の（１）〜（４）の本発明によって達成される。

【０００６】（１）強磁性粒子に、抗体を固定化し、蛍
光標識を行い、これと細菌、細胞またはウィルスとを液
中で反応させ、抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせた
のち、蛍光濃度を測定して、細菌、細胞またはウィルス
の濃度測定をすることを特徴とする細菌、細胞、ウィル
ス測定方法。

【０００７】（２）前記強磁性粒子は、表面に有機薄膜
を有する上記（１）に記載の細菌、細胞、ウィルス測定
方法。

【０００８】（３）前記強磁性粒子は、磁性細菌粒子で
ある上記（１）または（２）に記載の細菌、細胞、ウィ
ルス測定方法。

【０００９】（４）前記凝集を生じさせたのち、これを
磁気的に分離し、蛍光濃度を測定する上記（１）ないし
（３）のいずれかに記載の細菌、細胞、ウィルス測定方
法。

【００１０】なお、本発明者らは、磁性細菌から抽出し
た磁気微粒子に蛍光色素標識抗体を固定化し、微量抗原
の検出を行う旨を報告している（ANALYTICAL CHEMISTR
Y,VOL. ６３，No. ３，FEBRUARY １，１９９１ Ｐ２
６８−Ｐ２７２）。この方法は、蛍光色素標識抗体固定
化磁性細菌粒子と抗原とを液中で反応させ、抗原抗体反
応に基づく凝集を生じさせたのち、凝集分離後の液の分
散液の蛍光強度を測定し、蛍光強度の減少から、抗体減
少量を検出し、抗原量を定量するものである。

【００１１】しかし、この提案時点では、この方法が、
通常の抗原よりサイズの大きな病原菌やガン細胞等の検
出や検査に使用できる旨の確認はできなかった。

【００１２】

【発明の具体的構成】以下、本発明の具体的構成につい
て詳細に説明する。

【００１３】磁性細菌は、１９７０年代、アメリカで発
見され、菌体内に５０〜１００nmの程度の粒径のマグネ
タイト（Ｆｅ₃ Ｏ₄ ）単結晶の微粒子が１０〜２０個ほ
ど連なったマグネトソームと呼ばれるチェイン状の粒子
を保持している。磁性細菌はこのマグネトソームを保持
することで地磁気を感知し、磁力線の方向を認識するこ
とができる。磁性細菌は微好気性の細菌であり、地磁気
を感知することで好気的な水面から微好気的な沈殿物表
層へ磁力線に沿って泳ぐことができる。前記報文に示さ
れるように、このものは単菌分離され、大量培養が可能
となっている。磁性細菌は大きさがおよそ２μｍのグラ
ム陰性の螺旋菌で、菌体内に１０〜２０個のマグネタイ
ト単結晶を合成する。

【００１４】この磁性細菌中の磁性粒子は、六角柱で粒
径、形状が非常に均一であり、純度も高く、粒子を含む
菌体の磁化を微粒子当りに換算すると約５０emu/g であ
る。また、保磁力は２３０ Oe で、単磁区構造をとって
いることが確かめられている。

【００１５】また、粒子表面が有機薄膜で覆われている
ことから金属の溶出がほとんど起こらず安定に存在し、
水溶液中での分散性にも優れているといった特性を有し
ている。そして、この有機薄膜はホスファチジルエタノ
ールアミンを主成分とする厚さが約４nmの脂質二分子膜
である。この有機薄膜は除去しないで使用することが好
ましい。なお、磁性細菌粒子は、通常１次粒子単独であ
るが、その２〜１０個の２次粒子であってもよい。

【００１６】磁性細菌からの磁性細菌粒子の抽出方法に
はフレンチプレスを用いた物理的圧力破砕、アルカリ煮
沸、酵素処理、超音波破砕処理などがあり、いずれの方
法で抽出された磁性細菌粒子もその表面が有機薄膜で覆
われている。リゾチーム、プロテアーゼなどの酵素を用
いると、菌体内で保持されていたマグネトソームの状態
で抽出することができ、また、超音波処理を用いると一
つ一つが分散した状態のものが得られる。よって、その
利用目的により適した抽出方法を用いることが望まれ
る。磁性細菌粒子を大量に得る場合には、超音波による
破砕が適している。抽出後、磁石等により磁性細菌粒子
を分離する。なお、この有機薄膜は化学処理により除去
可能であるが、後述の抗原、抗体の固定化のために残し
ておくことが好ましい。すなわち、本発明で用いる強磁
性粒子は、結合性官能基を有するリン脂質層の有機薄膜
で被覆された磁気微粒子であることが好ましい。

【００１７】ここで結合性官能基としては、例えば、ア
ミノ基、カルボキシル基、水酸基等が挙げられ、アミノ
基およびカルボキシル基、特にアミノ基が好適である。
このような結合性官能基を有するリン脂質としては、例
えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルセリン、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピ
ン、ホスファチジル−Ｎ−メチルエタノールアミン、ホ
スファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ス
フィンゴミエリン、ホスファチジルトレオニン等があ
る。

【００１８】また、強磁性微粒子としては、例えば、Ｆ
ｅ₃ ０₄ 、γ−Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、Ｃｏ−γ−Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、
（ＮｉＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、（ＣｕＺｎ）Ｏ・Ｆ
ｅ₂ Ｏ₃ 、（Ｍｎ・Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、（ＮｉＺ
ｎ）Ｏ・Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、ＳｒＯ・６Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、ＢａＯ・
６Ｆｅ₂ Ｏ₃ 、ＳｉＯ₂ で被覆したＦｅ₃ ０₄ （粒径約
２００A ）［Enzyme Microb. Technol.,vol.2, p.2〜10
(1980)参照] 、各種の高分子材料（ナイロン、ポリアク
リルアミドタンパク質等）とフェライトとの複合微粒子
等を挙げることができる。

【００１９】このようなフェライト系の粒子は、公知の
方法の他に、例えば、水性媒体中において結合性官能基
を有するリン脂質の脂質二重層からなるリボソームを形
成し、このリボソーム内に共沈法によりフェライトを合
成する方法等でも製造される。

【００２０】フェライト系以外の粒子では、磁性金属粒
子やその複合体でもよい。さらにＳｉＯ₂ で被覆した粒
径約２００A のＦｅ₃ Ｏ₄ 粒子、粒径２００〜３００A
のγ−Ｆｅ₂ Ｏ₃ 粒子を挙げることができる。さらに好
ましい粒子としては、炭素が共存する液層中で熱プラズ
マ法により製造される鉄を主成分とし、Ｎｉ、Ｃｏを含
有する微粒子も挙げられ、このような粒子は、例えば特
願平２−１７０８８７号に開示された方法により容易に
製造することができる。

【００２１】このような磁性細菌粒子等の強磁性粒子に
は、蛍光標識を行った抗体が固定化される。使用可能な
抗体としては、測定すべき細菌、細胞、ウィルスと相補
性をもち、エンザイムイムノアッセイに用いられる全て
のものが可能である。また、蛍光物質についても制限は
なく、その抗体の固定化についても制限はない。蛍光物
質の抗体等に対する固定量は、一般的に、抗体等１分子
あたり、１〜１０分子程度である。

【００２２】また、蛍光標識抗体等を磁性細菌粒子に固
定するには、磁性細菌粒子等の好ましくは有機薄膜を利
用して、グルタルアルデヒド等の各種多官能性化合物
や、各種カップリング剤等を用いて行えばよい。そし
て、蛍光標識抗体等の磁性細菌粒子等に対する固定量
は、一般に、粒子１個あたり、１〜１０分子程度とする
固定化と標識とはどちらを先に行なってもよい。

【００２３】また、磁性細菌粒子以外の磁気微粒子への
固定化は、抗体の固定化技術として公知の方法により行
うことができる。例えば、シランカップリング剤、ブド
ウ状球菌より得られるプロテインＡを磁気微粒子に被覆
し、その後抗体を結合させる方法などを用いていればよ
い。

【００２４】このような場合、蛍光標識抗体等を磁性細
菌粒子に固定するには、磁性細菌粒子等の有機薄膜のア
ミノ基を利用して、ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−
スクシンイミジルエステルを用いて行うことが好まし
い。ピリジルジチオアルキル脂肪酸Ｎ−スクシンイミジ
ルエステルとしては、下記化１で表される２−ピリジル
ジチオ直鎖アルキル脂肪酸のＮ−スクシンイミジルエス
テル、特にｎ＝２の３−（２−ピリジルジチオ）プロピ
オン酸Ｎ−Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＳＰＤＰ）
が好ましい。

【００２５】

【化１】

【００２６】そして、図１に示されるように強磁性粒子
表面の有機薄膜のアミノ基と脱スクシンイミド反応を生
じさせ、アミド結合により３−（２−ピリジルジチオ）
エチレン基等の２−ピリジルジチオアルキレン基を結合
する。

【００２７】このときには、分子内部にジチオ基（ジス
フィド結合）−ＳＳ−を有するＩｇＧ、ＩｇＥ、Ｉｇ
Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の抗体が使用可能である。そし
て、一般的なＩｇＧを例にとるとジチオスレイトール
（ＤＴＴ）等の還元剤やペプシン等の還元酵素を用い、
末端に−ＳＨ基をもつ還元体を作成する。図１には、Ｉ
ｇＧをＤＴＴによりＦａｂセグメントをもつＩｇＧ抗体
フラグメント（還元体）とした例が示される。

【００２８】この後、被検細菌、細胞、ウィルスと相補
性をもつフラグメントを、図１に示されるように、強磁
性粒子に固定化する。すなわち、抗体フラグメントは、
脱ＨＳ反応により、アルキレンカルボニルアミノ基を介
し、強磁性粒子表面の有機薄膜に固定化される。

【００２９】本発明では、このような蛍光標識抗体を固
定した磁性細菌粒子等を、緩衝液中に好ましくは超音波
分散する。そして、例えば蛍光標識抗体固定磁性細菌微
粒子と、細菌、細胞、ウィルスとの抗原抗体反応を行
う。用いる細菌、細胞、ウィルスとしては、大腸菌・ク
ラミジア等のグラム陰性菌，グラム陽性菌等の細菌類、
HeLa細胞等の各種癌細胞等の細胞類、ヘルペスウィル
ス，サイトメガロウィルス，水痘ウィルス、インフルエ
ンザウィルス，エンテロウィルス等のウィルス類等、公
知のいずれのものも適用可能である。反応時には、外部
から磁場を印加し、磁性細菌粒子等の凝集を促進するこ
とが好ましい。反応時間は１〜６０分程度とする。これ
らは測定対象のサイズが大きいため、細菌・細胞・ウィ
ルスのまわりをいくつもの磁性体がとりかこむことにな
る。

【００３０】反応終了後、抗原抗体反応に基づき凝集し
た磁性細菌粒子等と、未反応の微粒子とを磁気的に分離
濃縮する。凝集粒子を分離するには、凝集粒子の磁界感
応性の高さを利用して、反応終了後の液中の凝集粒子を
磁石により捕集した状態でデカンテーションしたり、あ
るいは液を流入流出させながら、磁石により凝集粒子の
みを捕捉したりすればよい。なお、一般に、凝集粒子
は、１次ないし２次粒子である磁性細菌粒子等１０個程
度の凝集体である。磁気的な分離濃縮を行うことによ
り、感度が向上する。

【００３１】分離された凝集強磁性粒子は、必要に応じ
ゼラチンを含む緩衝液中に分散させ、蛍光強度の測定を
行う。あるいは、上澄み液の蛍光測定をしてもよい。こ
のとき、５０pg/ml 以上、例えば５０〜１０００pg/ml
の微量抗原量が定量できる。なお、本発明では、磁気分
離せずに、測定セル中で１５分程度以上自然沈降させ、
そのままの溶液で測定してもよい。

【００３２】

【実施例】以下、本発明を、実施例によってさらに詳細
に説明する。

【００３３】実施例１ 前記報文（ANALYTICAL CHEMISTRY）に準じ、下記の操作
を行った。

【００３４】まず、磁性細菌Aquaspirillum magnetotac
ticum Strain AMB−１を定常期初期まで、ＭＳＧＭ培地
で培養した。菌体からの磁性細菌粒子の抽出は、超音波
破砕処理後、フレンチプレス処理した。菌体破砕物中か
らの磁性細菌粒子の抽出は、Ｓｍ−Ｃｏ磁石を用いて行
った。

【００３５】蛍光標識抗体としては、フルオロセインイ
ソシアネート（ＦＩＴＣ）を固定化した抗体（ａｎｔｉ
−Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いた。磁性細菌粒子は周囲を脂質
膜で覆われていることから、Ｎ−スクシンイミジル３−
（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）
で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元した抗体フラ
グメントの固定化を行った。

【００３６】より詳細には、ＳＰＤＰを用いて固定化す
るためにはまず抗体のＩｇＧ分画の鎖間ジスルフィド結
合（ジチオ基）を還元することで切断しなければならな
い。すなわち、抗体１０mgを０．１５Ｍ Tris-HCl Buff
er (pH8.0)に溶解し、１０mMのジチオスレイトール（Ｄ
ＴＴ）を添加し、２時間反応させて抗体の還元を行な
い、図１に示されるように、抗体分画から還元体を得
た。この反応液をセファデックスＧ−１００カラムを用
いてゲル濾過精製して抗体フラグメントを有する分画を
精製した。

【００３７】次に、ＳＰＤＰ６６３μg をエタノール１
００ulに溶解後、蒸留水を４００μl 添加し、磁性細菌
粒子０．５mgをこの溶液に分散し、２時間反応させた。
反応させた磁性細菌粒子をよく洗浄した後、還元した抗
体と４℃、１２時間反応させ抗体の固定化を行った。そ
の後、未反応の抗体を洗浄除去した。

【００３８】さらに、０．２５M 炭酸ナトリウム緩衝液
（pH９．０）１mlに抗体固定化磁性粉を懸濁し、ＦＩＴ
Ｃ０．１mgを加え４℃１２時間反応させ、未反応のＦＩ
ＴＣを洗浄除去しリン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）中
に保存した。

【００３９】これとは別に、菌数測定後、大腸菌を、リ
ン酸生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）で０〜１０⁵ セル/ml
の菌体濃度になるように調製し、試料溶液とした。

【００４０】５０μｇの抗体固定化磁性細菌粒子と、１
００μｌの試料溶液を混合し、３７℃、１５分間インキ
ュベートした。抗原抗体反応に基づく凝集反応では、Ｓ
ｍ−Ｃｏ磁石で磁場を与え、反応時間の短縮を行った。

【００４１】抗原抗体反応をさせた後に、凝集反応を起
こした磁性細菌粒子と未反応の粒子を磁気的に分離し、
凝集反応を起こした粒子を取り除いた残りの上澄み液の
蛍光強度を指標に測定した。すなわち、磁石により凝集
粒子を捕捉した状態で、デカンテーションを行い、その
上澄み液をフロー型マイクロセル（１２μｌ）を改良し
たものを用いて、粒子の沈降を抑えるためにセル外部に
磁場を与え、蛍光強度を測定した。また、凝集粒子は、
ゼラチン１％を含むＧＶＢにThermomixer （サーモニク
ス社Model ＴＭ−１０５）を用いて分散させ、蛍光分光
光度計（日立Ｆ−１２００）で蛍光強度を測定した。励
起光は４９０nm、蛍光は５２０nmで検出し、１０×１０
mmの石英セルを用いて測定を行った。蛍光強度は値の安
定する１５分後の値で評価した。

【００４２】菌体濃度１０² 〜１０⁵ セル/ml における
蛍光強度を図２に示す。この場合、大腸菌を加えずイン
キュベートし、測定した時のバックグラウンドの値を１
００として相対強度計算した。菌体濃度１０² セル/ml
から相対蛍光強度の減少がみられ、より高感度での検出
が可能であった。

【００４３】実施例２ 実施例１により抽出した磁性細菌粒子を、超音波洗浄機
（Tocho UC 0310100W）で分散させ、２．５％グルタル
アルデヒド溶液と１時間、室温でインキュベートした。
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳpH７．４）で洗浄後、Ｆ
ＩＴＣ標識マウスＩｇＥ抗体と１２時間、４℃でインキ
ュベートし固定化を行った。未反応の抗体を洗浄除去
後、ＰＢＳ中に分散させ４℃で保存した。

【００４４】実施例１と同様に、大腸菌を用いて抗原抗
体反応をさせ、磁気的に分離濃縮し、凝集反応を起こし
た粒子量をその蛍光強度を指標に測定した。最適波長で
検出したところ、実施例１と同様な結果が得られた。

【００４５】

【発明の効果】本発明によれば、細菌、細胞、ウィルス
を、きわめて微量まで高感度に精度よく定量することが
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明における固定化方法を説明するための図
である。

【図２】本発明の測定方法による大腸菌体濃度と相対蛍
光強度との関係を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渋江 明 東京都中央区日本橋一丁目13番１号 テイ ーデイーケイ株式会社内 (72)発明者 神谷 晋司 東京都中央区日本橋一丁目13番１号 テイ ーデイーケイ株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 強磁性粒子に、抗体を固定化し、蛍光標
   識を行い、 これと細菌、細胞またはウィルスとを液中で反応させ、
   抗原抗体反応に基づく凝集を生じさせたのち、 蛍光濃度を測定して、細菌、細胞またはウィルスの濃度
   測定をすることを特徴とする細菌、細胞、ウィルス測定
   方法。
2. 【請求項２】 前記強磁性粒子は、表面に有機薄膜を有
   する請求項１に記載の細菌、細胞、ウィルス測定方法。
3. 【請求項３】 前記強磁性粒子は、磁性細菌粒子である
   請求項１または２に記載の細菌、細胞、ウィルス測定方
   法。
4. 【請求項４】 前記凝集を生じさせたのち、これを磁気
   的に分離し、蛍光濃度を測定する請求項１ないし３のい
   ずれかに記載の細菌、細胞、ウィルス測定方法。