JP3149116B2 - ヒトパルボウイルスのエピトープ関連ペプチド - Google Patents
ヒトパルボウイルスのエピトープ関連ペプチドInfo
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- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14211—Erythrovirus, e.g. B19 virus
- C12N2750/14222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトパルボウイルス
（ＨＰＶ）Ｂ１９に対する抗体の特異的検出に有用なエ
ピトープペプチド、そのエピトープペプチドを含有する
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬、お
よびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法
に関するものである。
（ＨＰＶ）Ｂ１９に対する抗体の特異的検出に有用なエ
ピトープペプチド、そのエピトープペプチドを含有する
ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定試薬、お
よびヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ヒトパルボウイルスＢ１９は、Ｃｏｓｓ
ａｒｔらによりヒト血液中から発見され（Lancet 1:72-
73(1975)) 、１９８１年以降ヒトの病気との関連が明ら
かにされてきた。ヒトパルボウイルスＢ１９は伝染性紅
斑、関節炎等を引き起こすウイルスであり、特に妊婦に
感染すると流産、胎児水腫等の重大な疾患を招くとされ
ている。そのため、的確かつ正確な診断が肝要である。
診断法としてはウイルスを検出する方法と、抗体を検出
する方法が挙げられる。いずれの場合も抗原となる物質
が不可欠であり、診断法の重点となるものである。従
来、抗原物質としては、ヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒ
トパルボウイルスＢ１９、遺伝子工学的手法によるウイ
ルス抗原タンパク等が用いられていた。
ａｒｔらによりヒト血液中から発見され（Lancet 1:72-
73(1975)) 、１９８１年以降ヒトの病気との関連が明ら
かにされてきた。ヒトパルボウイルスＢ１９は伝染性紅
斑、関節炎等を引き起こすウイルスであり、特に妊婦に
感染すると流産、胎児水腫等の重大な疾患を招くとされ
ている。そのため、的確かつ正確な診断が肝要である。
診断法としてはウイルスを検出する方法と、抗体を検出
する方法が挙げられる。いずれの場合も抗原となる物質
が不可欠であり、診断法の重点となるものである。従
来、抗原物質としては、ヒト骨髄赤芽球系細胞由来のヒ
トパルボウイルスＢ１９、遺伝子工学的手法によるウイ
ルス抗原タンパク等が用いられていた。
【０００３】一般に抗体は抗原のアミノ酸数残基を認識
するといわれており、その部位はエピトープと呼ばれて
いる。抗原タンパクは数種のエピトープを有しており、
その部位を含むペプチドを用いればウイルス粒子を用い
なくとも容易にかつ特異的に測定が可能である。
するといわれており、その部位はエピトープと呼ばれて
いる。抗原タンパクは数種のエピトープを有しており、
その部位を含むペプチドを用いればウイルス粒子を用い
なくとも容易にかつ特異的に測定が可能である。
【０００４】近年、固相合成法の発達によりペプチドは
比較的簡単に得ることができるようになった。図１に示
すヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムＤＮＡシーケンス
（遺伝子配列）は、Ｓｈａｄｅらにより解明されている
(J.Virol.58:921-936(1986))。これを基にＦｒｉｄｅｌ
ｌらは読取枠（オープンリーディングフレーム：ＯＲ
Ｆ）１とＯＲＦ２の一部の領域について対応するペプチ
ドを合成し、ＯＲＦ１領域のアミノ酸ナンバー２３６−
２５３、２８４−３０７、７３２−７４１およびＯＲＦ
２領域のアミノ酸ナンバー１６１−１７０に相当するペ
プチドの坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体に対する反応
性を見出している(Scand.J.Infect.Dis.21:591-603(198
9)) 。またＳａｔｏらはウイルスタンパク(Viral Prote
in : VP)２領域のアミノ酸ナンバー３２８−３４４に相
当するペプチドが坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反
応することを示唆した(J.Virol.65:1667-1672(1991))。
比較的簡単に得ることができるようになった。図１に示
すヒトパルボウイルスＢ１９ゲノムＤＮＡシーケンス
（遺伝子配列）は、Ｓｈａｄｅらにより解明されている
(J.Virol.58:921-936(1986))。これを基にＦｒｉｄｅｌ
ｌらは読取枠（オープンリーディングフレーム：ＯＲ
Ｆ）１とＯＲＦ２の一部の領域について対応するペプチ
ドを合成し、ＯＲＦ１領域のアミノ酸ナンバー２３６−
２５３、２８４−３０７、７３２−７４１およびＯＲＦ
２領域のアミノ酸ナンバー１６１−１７０に相当するペ
プチドの坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体に対する反応
性を見出している(Scand.J.Infect.Dis.21:591-603(198
9)) 。またＳａｔｏらはウイルスタンパク(Viral Prote
in : VP)２領域のアミノ酸ナンバー３２８−３４４に相
当するペプチドが坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反
応することを示唆した(J.Virol.65:1667-1672(1991))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ヒト由
来の抗原は入手が困難であること、遺伝子工学的手法で
は操作が煩雑であることから、安定的な供給のできる抗
原が望まれていた。そこで本発明は、ヒトパルボウイル
スＢ１９に対する抗体と特異的に反応するペプチドを提
供するとともに、その用途、すなわちヒトパルボウイル
スＢ１９に対する抗体の測定試薬、およびヒトパルボウ
イルスＢ１９に対する抗体の測定方法を提供するもので
ある。
来の抗原は入手が困難であること、遺伝子工学的手法で
は操作が煩雑であることから、安定的な供給のできる抗
原が望まれていた。そこで本発明は、ヒトパルボウイル
スＢ１９に対する抗体と特異的に反応するペプチドを提
供するとともに、その用途、すなわちヒトパルボウイル
スＢ１９に対する抗体の測定試薬、およびヒトパルボウ
イルスＢ１９に対する抗体の測定方法を提供するもので
ある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者は、ヒト
パルボウイルスＢ１９抗体につき鋭意研究・探索した結
果、上記部位のペプチドよりもさらに強く坑ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体と反応する部位のペプチドを見出し
た。
パルボウイルスＢ１９抗体につき鋭意研究・探索した結
果、上記部位のペプチドよりもさらに強く坑ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体と反応する部位のペプチドを見出し
た。
【０００７】坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反応し
て、該ウイルスに感染後の回復期に強い反応性を示すペ
プチドは、下記(1) 式 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH (1) なるアミノ酸配列を有している。
て、該ウイルスに感染後の回復期に強い反応性を示すペ
プチドは、下記(1) 式 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH (1) なるアミノ酸配列を有している。
【０００８】上記 (1)式に示したアミノ酸配列は、ＯＲ
Ｆ１領域のアミノ酸ナンバー１５２−１７６に相当する
部位のペプチドである（図１参照）。
Ｆ１領域のアミノ酸ナンバー１５２−１７６に相当する
部位のペプチドである（図１参照）。
【０００９】また坑ヒトパルボウイルスＢ１９抗体と反
応して、該ウイルスに感染後の急性期に強い反応性を示
すペプチドは、下記(2) 式 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH (2) なるアミノ酸配列を有している。
応して、該ウイルスに感染後の急性期に強い反応性を示
すペプチドは、下記(2) 式 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH (2) なるアミノ酸配列を有している。
【００１０】上記 (2)式に示したアミノ酸配列はＯＲＦ
１領域のアミノ酸ナンバー５２５−５４６に相当する部
位のペプチドである（図１参照）。
１領域のアミノ酸ナンバー５２５−５４６に相当する部
位のペプチドである（図１参照）。
【００１１】これらのエピトープペプチドの抗ヒトパル
ボウイルスＢ１９抗体との反応性の特徴は高反応性のみ
ならず、(1) 式のペプチドは回復期に強い反応性を示
し、(2) 式のペプチドは急性期に強い反応性を示す。し
たがって、(1) 式と(2) 式のペプチドを使い分けること
により、感染・発症後の時期に適した診断法が可能とな
る。
ボウイルスＢ１９抗体との反応性の特徴は高反応性のみ
ならず、(1) 式のペプチドは回復期に強い反応性を示
し、(2) 式のペプチドは急性期に強い反応性を示す。し
たがって、(1) 式と(2) 式のペプチドを使い分けること
により、感染・発症後の時期に適した診断法が可能とな
る。
【００１２】ペプチドの製造法としてはタンパクの酵素
分解法、化学的合成法が挙げられるが、化学的合成法の
方が簡便かつ大量に得ることが可能である。化学的合成
法のうちの液相合成法あるいは固相合成法のどちらでも
よく、また固相合成法のうちのｔ−ブトキシカルボニル
（Ｂｏｃ）法または９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル（Ｆｍｏｃ）法のどちらでも得ることは可能である。
固相合成法を採用すれば自動合成器の使用も可能であ
る。これら化学的方法によるペプチドは官能基を保護し
てあるため、これを除去しなければならない。すなわち
フッ化水素法、接触還元法、トリフルオロ酢酸法、臭化
トリメチルシリル（ＴＭＳＢｒ）法、トリメチルシリル
トリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）法等
の一般的に用いられる方法により保護基を除去して目的
のペプチドを得る。さらに最終的には、逆相液体クロマ
トグラフィーにより精製することが望ましい。
分解法、化学的合成法が挙げられるが、化学的合成法の
方が簡便かつ大量に得ることが可能である。化学的合成
法のうちの液相合成法あるいは固相合成法のどちらでも
よく、また固相合成法のうちのｔ−ブトキシカルボニル
（Ｂｏｃ）法または９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル（Ｆｍｏｃ）法のどちらでも得ることは可能である。
固相合成法を採用すれば自動合成器の使用も可能であ
る。これら化学的方法によるペプチドは官能基を保護し
てあるため、これを除去しなければならない。すなわち
フッ化水素法、接触還元法、トリフルオロ酢酸法、臭化
トリメチルシリル（ＴＭＳＢｒ）法、トリメチルシリル
トリフルオロメタンスルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）法等
の一般的に用いられる方法により保護基を除去して目的
のペプチドを得る。さらに最終的には、逆相液体クロマ
トグラフィーにより精製することが望ましい。
【００１３】(1) 式と(2) 式のペプチドは、抗ヒトパル
ボウイルスＢ１９抗体に特異的かつ高親和性を有するの
で、抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の高感度な測定試
薬として用いることが可能である。
ボウイルスＢ１９抗体に特異的かつ高親和性を有するの
で、抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の高感度な測定試
薬として用いることが可能である。
【００１４】また(1) 式と(2) 式のペプチドを利用した
抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の測定法としては既知
の免疫学的方法のいずれも利用可能である。すなわち、
放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫凝集
法などである。
抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体の測定法としては既知
の免疫学的方法のいずれも利用可能である。すなわち、
放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳ
Ａ）、蛍光免疫測定法、化学発光免疫測定法、免疫凝集
法などである。
【００１５】これら測定系の構成要素としては固定化担
体、被検試料および標識抗体あるいは標識抗原からな
る。ここでの固定化担体とはガラス、プラスチック、高
分子物質等の固相担体に被検試料との結合能を有する物
質を結合したものである。担体の形状としては試験管、
マイクロプレート、キュベット、ビーズ、微粒子、膜な
どが挙げられる。被検試料との結合能を有する物質と
は、被検試料に対する抗体あるいは抗原、プロテインＡ
等の抗体との結合能を有する物質である。担体と上記物
質の結合方法としては物理吸着、共有結合法が挙げられ
る。また、担体と被検試料との結合能を有する物質の間
には、抗体−抗抗体の親和性、ビチオン−アビジンの親
和性、プロテインＡおよびプロテインＧと抗体の親和
性、レクチン−炭水化物の親和性等の使用可能なあらゆ
る親和性を有した物質を介してもかまわない。固定化担
体は担体表面上の未結合部位による非特異的吸着反応を
抑制するために、ブロッキング剤により未結合部位を被
覆することが望ましい。ブロッキング剤とは測定系中の
特異反応にはあずからない物質で構成されたものであ
り、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、乳成
分、タンパク分解物等のタンパク成分、ゼラチン、ポリ
ビニルアルコールなどの天然および合成高分子物質等が
挙げられる。被検試料は、血清、血漿など抗体を含むも
のなら全て採用できる。構成要素のうちの標識抗体ある
いは標識抗原に用いられる標識物としては放射性物質、
酵素、蛍光物質、化学発光物質等が挙げられる。標識抗
体あるいは標識抗原は、標識物と抗体あるいは抗原を前
述の親和性を有した物質を介してもかまわない。同様に
被検試料と標識抗体あるいは標識抗原の間に親和性を有
した物質を介しても可能である。本発明によるペプチド
は上記測定系の構成要素のうちの固定化担体あるいは標
識抗原としての利用が可能である。
体、被検試料および標識抗体あるいは標識抗原からな
る。ここでの固定化担体とはガラス、プラスチック、高
分子物質等の固相担体に被検試料との結合能を有する物
質を結合したものである。担体の形状としては試験管、
マイクロプレート、キュベット、ビーズ、微粒子、膜な
どが挙げられる。被検試料との結合能を有する物質と
は、被検試料に対する抗体あるいは抗原、プロテインＡ
等の抗体との結合能を有する物質である。担体と上記物
質の結合方法としては物理吸着、共有結合法が挙げられ
る。また、担体と被検試料との結合能を有する物質の間
には、抗体−抗抗体の親和性、ビチオン−アビジンの親
和性、プロテインＡおよびプロテインＧと抗体の親和
性、レクチン−炭水化物の親和性等の使用可能なあらゆ
る親和性を有した物質を介してもかまわない。固定化担
体は担体表面上の未結合部位による非特異的吸着反応を
抑制するために、ブロッキング剤により未結合部位を被
覆することが望ましい。ブロッキング剤とは測定系中の
特異反応にはあずからない物質で構成されたものであ
り、例えば牛血清アルブミン、卵白アルブミン、乳成
分、タンパク分解物等のタンパク成分、ゼラチン、ポリ
ビニルアルコールなどの天然および合成高分子物質等が
挙げられる。被検試料は、血清、血漿など抗体を含むも
のなら全て採用できる。構成要素のうちの標識抗体ある
いは標識抗原に用いられる標識物としては放射性物質、
酵素、蛍光物質、化学発光物質等が挙げられる。標識抗
体あるいは標識抗原は、標識物と抗体あるいは抗原を前
述の親和性を有した物質を介してもかまわない。同様に
被検試料と標識抗体あるいは標識抗原の間に親和性を有
した物質を介しても可能である。本発明によるペプチド
は上記測定系の構成要素のうちの固定化担体あるいは標
識抗原としての利用が可能である。
【００１６】
【実施例】以下、本発明のペプチドを合成し、そのペプ
チドと抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体との反応性を測
定した例を詳細に説明する。
チドと抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体との反応性を測
定した例を詳細に説明する。
【００１７】（ペプチドの調製例）ペプチドの調製は固
相合成法によった。保護ペプチドはアプライドバイオシ
ステムズ社製４３０Ａ合成機を用い、Ｆｍｏｃ固相合成
法により作製した。保護ペプチドをＴＭＳＯＴｆ法によ
り脱保護し、粗精製ペプチドを得た。これをゲル濾過、
逆相液体クロマトグラフィーの順で精製を行ない、(1)
式 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH (1) および(2) 式 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH (2) に示す最終的な精製ペプチドを得た。
相合成法によった。保護ペプチドはアプライドバイオシ
ステムズ社製４３０Ａ合成機を用い、Ｆｍｏｃ固相合成
法により作製した。保護ペプチドをＴＭＳＯＴｆ法によ
り脱保護し、粗精製ペプチドを得た。これをゲル濾過、
逆相液体クロマトグラフィーの順で精製を行ない、(1)
式 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH (1) および(2) 式 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH (2) に示す最終的な精製ペプチドを得た。
【００１８】比較のため(3) 式に示すペプチド（Ｆｒｉ
ｄｅｌｌらが報告したペプチド）、 H-Phe-Ser-Pro-Ala-Ala-Ser-Ser-Cys-His-Asn-Ala-Ser-Gly- Lys-Glu-Ala-Lys-Val-Cys-Thr-Ile-Ser-Pro-Ile-OH (3) および(4) 式（Ｓａｔｏらが報告したペプチド）に示す
ペプチド H-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Val-Ser-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp- Asp-Thr-Asp-Lys-OH (4) を調製し使用した。
ｄｅｌｌらが報告したペプチド）、 H-Phe-Ser-Pro-Ala-Ala-Ser-Ser-Cys-His-Asn-Ala-Ser-Gly- Lys-Glu-Ala-Lys-Val-Cys-Thr-Ile-Ser-Pro-Ile-OH (3) および(4) 式（Ｓａｔｏらが報告したペプチド）に示す
ペプチド H-Leu-Arg-Pro-Gly-Pro-Val-Ser-Gln-Pro-Tyr-His-His-Trp- Asp-Thr-Asp-Lys-OH (4) を調製し使用した。
【００１９】測定例１．イムノグロブリンＧ（Immunogl
obulin G：ＩｇＧ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＧ抗体を測定する方法の例を示す。
担体としてポリスチレン製のマイクロプレートを用い
た。これにりん酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０μｇ／ｍｌの
濃度に調整したペプチド溶液を１００μｌずつ分注し、
室温で一晩固相化することにより固定化担体を得た。未
結合部位による非特異的吸着反応を抑制するために、ブ
ロッキング剤で被覆した。次に患者血清を市販の希釈液
で２００倍に希釈して１００μｌずつ分注し、３７℃で
２時間反応した。この血清は、ヒトパルボウイルスＢ１
９感染により造血障害発作を起こした１２歳女児から得
たものである。りん酸緩衝液で６回洗浄後、りん酸緩衝
液で１０００倍に希釈した市販の西洋ワサビベルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌず
つ分注し、３７℃で１時間反応させた。さらにりん酸緩
衝液で６回洗浄後、発色剤としてオルトフェニレンジア
ミン（ＯＰＤ：ＯＰＤ4mg/10ml H2O,H2O2 15μｌ）を１
００μｌずつ分注し、室温で３０分反応した後、１Ｎ−
H2SO4 を１００μｌずつ加えて反応を停止させた。着色
生成物をマイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍ
の吸光度（ＯＤ）を測定することによりＨＲＰの検出を
行なった。
obulin G：ＩｇＧ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＧ抗体を測定する方法の例を示す。
担体としてポリスチレン製のマイクロプレートを用い
た。これにりん酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０μｇ／ｍｌの
濃度に調整したペプチド溶液を１００μｌずつ分注し、
室温で一晩固相化することにより固定化担体を得た。未
結合部位による非特異的吸着反応を抑制するために、ブ
ロッキング剤で被覆した。次に患者血清を市販の希釈液
で２００倍に希釈して１００μｌずつ分注し、３７℃で
２時間反応した。この血清は、ヒトパルボウイルスＢ１
９感染により造血障害発作を起こした１２歳女児から得
たものである。りん酸緩衝液で６回洗浄後、りん酸緩衝
液で１０００倍に希釈した市販の西洋ワサビベルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を１００μｌず
つ分注し、３７℃で１時間反応させた。さらにりん酸緩
衝液で６回洗浄後、発色剤としてオルトフェニレンジア
ミン（ＯＰＤ：ＯＰＤ4mg/10ml H2O,H2O2 15μｌ）を１
００μｌずつ分注し、室温で３０分反応した後、１Ｎ−
H2SO4 を１００μｌずつ加えて反応を停止させた。着色
生成物をマイクロプレートリーダーを用いて４９２ｎｍ
の吸光度（ＯＤ）を測定することによりＨＲＰの検出を
行なった。
【００２０】使用したペプチドは、(1) 式および(2) 式
に示したものである。比較のために(3) 式および(4) 式
に示した比較ペプチドについても使用した。測定結果の
グラフを図２に示してある。グラフの横軸は造血障害の
発症経過日、縦軸は吸光度である。この結果より(1) 式
および(2) 式のペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９
抗体との高反応性を有していることが明らかである。ま
た(2) 式のペプチドは、特に急性期に強い反応性を示す
ことも判明した。
に示したものである。比較のために(3) 式および(4) 式
に示した比較ペプチドについても使用した。測定結果の
グラフを図２に示してある。グラフの横軸は造血障害の
発症経過日、縦軸は吸光度である。この結果より(1) 式
および(2) 式のペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９
抗体との高反応性を有していることが明らかである。ま
た(2) 式のペプチドは、特に急性期に強い反応性を示す
ことも判明した。
【００２１】測定例２．イムノグロブリンＭ（Immunogl
obulin M：ＩｇＭ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＭ抗体を測定する方法の例を示す。
測定例１と同様にして固定化担体を得てアッセイを行な
ったものであるが、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体の代わ
りにＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体を使用した。
obulin M：ＩｇＭ）の測定 ＥＬＩＳＡ法によりヒトパルボウイルスＢ１９に感染し
た患者血清中のＩｇＭ抗体を測定する方法の例を示す。
測定例１と同様にして固定化担体を得てアッセイを行な
ったものであるが、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ抗体の代わ
りにＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＭ抗体を使用した。
【００２２】使用したペプチドは、(1) 式に示したもの
である。比較のために(3) 式および(4) 式に示した比較
ペプチドについても使用した。測定結果を図３に示して
ある。この結果より(1) 式のペプチドは、抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体のうちのＩｇＭとも強い反応性も有
していることを示している。
である。比較のために(3) 式および(4) 式に示した比較
ペプチドについても使用した。測定結果を図３に示して
ある。この結果より(1) 式のペプチドは、抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体のうちのＩｇＭとも強い反応性も有
していることを示している。
【００２３】測定例３．ビチオン−アビジンを利用した
ＩｇＧの測定 この例はビチオン−アビジンの親和性を利用して担体に
ペプチドを固定することにより固定化担体を得てＩｇＧ
を測定する方法である。まず表面にアミノ基を有するポ
リスチレン製マイクロプレートに、２５０μｇ／ｍｌの
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｎ
ＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を１００μｇ／ｍｌずつ分注し、
３７℃、２時間反応させた。次にりん酸緩衝液で６回洗
浄し、５０μｇ／ｍｌのアビジンを１００μｌずつ分
注、３７℃、１時間反応した。さらにりん酸緩衝液で６
回洗浄後、５０μｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドを１０
０μｇ／ｍｌずつ分注し、３７℃、１時間反応させた。
ここでのビオチン化ペプチドは、前記ペプチドの調製例
に記載の方法で合成した保護ペプチドのＮ−末端にＮＨ
Ｓ−Ｂｉｏｔｉｎを結合し、以下、ペプチドの調製例に
記載した方法と同様に脱保護、精製して得たものであ
る。りん酸緩衝液で６回洗浄後、測定例２に記した方法
と同様にブロッキング、アッセイを行なった。
ＩｇＧの測定 この例はビチオン−アビジンの親和性を利用して担体に
ペプチドを固定することにより固定化担体を得てＩｇＧ
を測定する方法である。まず表面にアミノ基を有するポ
リスチレン製マイクロプレートに、２５０μｇ／ｍｌの
ビオチン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル（Ｎ
ＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ）を１００μｇ／ｍｌずつ分注し、
３７℃、２時間反応させた。次にりん酸緩衝液で６回洗
浄し、５０μｇ／ｍｌのアビジンを１００μｌずつ分
注、３７℃、１時間反応した。さらにりん酸緩衝液で６
回洗浄後、５０μｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドを１０
０μｇ／ｍｌずつ分注し、３７℃、１時間反応させた。
ここでのビオチン化ペプチドは、前記ペプチドの調製例
に記載の方法で合成した保護ペプチドのＮ−末端にＮＨ
Ｓ−Ｂｉｏｔｉｎを結合し、以下、ペプチドの調製例に
記載した方法と同様に脱保護、精製して得たものであ
る。りん酸緩衝液で６回洗浄後、測定例２に記した方法
と同様にブロッキング、アッセイを行なった。
【００２４】使用したペプチドは、(1) 式および(2) 式
に示したものである。比較のために(3) 式に示した比較
ペプチドについても使用した。測定結果を図４に示して
ある。この結果より(1) 式および(2) 式のペプチドは、
いずれも抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体との高反応性
を有していることが明らかである。さらに(1) 式のペプ
チドは特に回復期に強い反応性を有し、(2) 式のペプチ
ドは特に急性期に強い反応を有すという特徴が示されて
いる。
に示したものである。比較のために(3) 式に示した比較
ペプチドについても使用した。測定結果を図４に示して
ある。この結果より(1) 式および(2) 式のペプチドは、
いずれも抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体との高反応性
を有していることが明らかである。さらに(1) 式のペプ
チドは特に回復期に強い反応性を有し、(2) 式のペプチ
ドは特に急性期に強い反応を有すという特徴が示されて
いる。
【００２５】なお、本明細書においてアミノ酸はＩＵＰ
ＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会の勧告に準拠した略号
で記述した。また、特に指定しない場合、アミノ酸はＬ
型を示すものとする。
ＡＣとＩＵＢの生化学命名委員会の勧告に準拠した略号
で記述した。また、特に指定しない場合、アミノ酸はＬ
型を示すものとする。
【００２６】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明によ
るペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体に特異的
に反応する。そのため本発明のペプチドは抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体の測定試薬にすることができる。ま
たこの測定試薬を用いれば、血清または血漿中の抗ヒト
パルボウイルスＢ１９抗体を高感度かつ特異的に検出可
能である。さらにまた本発明によるペプチドはヒトパル
ボウイルスＢ１９に起因する伝染性紅斑、関節炎等のウ
イルスに対するワクチンとしての応用が可能であり、こ
れらペプチドを利用した抗体は治療薬としての可能性も
考えられる。
るペプチドは抗ヒトパルボウイルスＢ１９抗体に特異的
に反応する。そのため本発明のペプチドは抗ヒトパルボ
ウイルスＢ１９抗体の測定試薬にすることができる。ま
たこの測定試薬を用いれば、血清または血漿中の抗ヒト
パルボウイルスＢ１９抗体を高感度かつ特異的に検出可
能である。さらにまた本発明によるペプチドはヒトパル
ボウイルスＢ１９に起因する伝染性紅斑、関節炎等のウ
イルスに対するワクチンとしての応用が可能であり、こ
れらペプチドを利用した抗体は治療薬としての可能性も
考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトパルボウイルスＢ１９の遺伝子配列とオー
プンリーディングフレームの対応、およびヒトパルボウ
イルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図である。
プンリーディングフレームの対応、およびヒトパルボウ
イルスＲＮＡとタンパクの対応を示す図である。
【図２】ＩｇＧの測定結果を示す図である。
【図３】ＩｇＭの測定結果を示す図である。
【図４】ビチオン−アビジンを利用したＩｇＧの測定結
果を示す図である。
果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 河本 泰良 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 信越化学工業株式会社コーポレート リサーチセンター内 (72)発明者 千葉 徹 神奈川県川崎市高津区坂戸３丁目２番１ 号 信越化学工業株式会社コーポレート リサーチセンター内 (72)発明者 布上 董 福岡県福岡市中央区大手門３丁目10−10 −1103 (56)参考文献 国際公開91／12269（ＷＯ，Ａ１) ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯ ＧＹ（1986）Ｖｏｌ．58，Ｎｏ．３, ｐ．921−936 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/015 A61K 39/00 A61K 39/12 G01N 33/53 G01N 33/569 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体
と反応して、該ウイルスに感染後の回復期に強い反応性
を示す、下記式、 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH なるアミノ酸配列を有するペプチド。 - 【請求項２】 ヒトパルボウイルスＢ１９に対する抗体
と反応して、該ウイルスに感染後の急性期に強い反応性
を示す、下記式、 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH なるアミノ酸配列を有するペプチド。 - 【請求項３】 下記式、 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH なるアミノ酸配列を有し、ヒトパルボウイルスＢ１９ウ
イルスに感染後の回復期に強い反応性を示すペプチドを
含有することを特徴とするヒトパルボウイルスＢ１９に
対する抗体の測定試薬。 - 【請求項４】 下記式、 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH なるアミノ酸配列を有し、ヒトパルボウイルスＢ１９ウ
イルスに感染後の急性期に強い反応性を示すペプチドを
含有することを特徴とするヒトパルボウイルスＢ１９に
対する抗体の測定試薬。 - 【請求項５】 下記式、 H-Ile-His-Asp-Phe-Arg-Tyr-Ser-Gln-Leu-Ala-Lys-Leu-Gly- Ile-Asn-Pro-Tyr-Thr-His-Trp-Thr-Val-Ala-Asp-Glu-OH なるアミノ酸配列を有するペプチドを、ヒトパルボウイ
ルスＢ１９に対する抗体と反応させて、該ウイルスに感
染後の回復期に強い反応性を示すことを特徴とするヒト
パルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法。 - 【請求項６】 下記式、 H-Ser-Thr-Lys-Glu-Gly-Asp-Ser-Ser-Asn-Thr-Gly-Ala-Gly- Lys-Ala-Leu-Thr-Gly-Leu-Ser-Thr-Gly-OH なるアミノ酸配列を有するペプチドを、ヒトパルボウイ
ルスＢ１９に対する抗体と反応させて、該ウイルスに感
染後の急性期に強い反応性を示すことを特徴とするヒト
パルボウイルスＢ１９に対する抗体の測定方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29010292A JP3149116B2 (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | ヒトパルボウイルスのエピトープ関連ペプチド |
| US08/139,711 US5436127A (en) | 1992-10-28 | 1993-10-21 | Epitope-related peptides of human parvovirus |
| EP93308632A EP0595638B1 (en) | 1992-10-28 | 1993-10-28 | Epitope-related peptides of human parvovirus |
| DE69323688T DE69323688T2 (de) | 1992-10-28 | 1993-10-28 | Epitop-Peptide von menschlichem Parvovirus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29010292A JP3149116B2 (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | ヒトパルボウイルスのエピトープ関連ペプチド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06135994A JPH06135994A (ja) | 1994-05-17 |
| JP3149116B2 true JP3149116B2 (ja) | 2001-03-26 |
Family
ID=17751825
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29010292A Expired - Fee Related JP3149116B2 (ja) | 1992-10-28 | 1992-10-28 | ヒトパルボウイルスのエピトープ関連ペプチド |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5436127A (ja) |
| EP (1) | EP0595638B1 (ja) |
| JP (1) | JP3149116B2 (ja) |
| DE (1) | DE69323688T2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988002699A1 (en) * | 1986-10-07 | 1988-04-21 | Dai Nippon Insatsu Kabushiki Kaisha | Thermal transfer sheet |
| FR2772047B1 (fr) * | 1997-12-05 | 2004-04-09 | Ct Nat D Etudes Veterinaires E | Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection |
| US6238860B1 (en) | 1998-11-05 | 2001-05-29 | Dyax Corp. | Binding moieties for human parvovirus B19 |
| GB0001481D0 (en) * | 2000-01-21 | 2000-03-15 | Theryte Ltd | System for delivering a medicament |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3939470A1 (de) * | 1989-11-29 | 1991-06-06 | Biochrom Beteiligungs Gmbh & C | Peptide und antikoerper gegen peptide, welche zur diagnose und zur verhuetung der b19-infektion verwendbar sind |
| DE4003826C2 (de) * | 1990-02-08 | 1995-11-23 | Mikrogen Molekularbiol Entw | Peptide der Kapsidproteine VP1 oder VP2 des Parvovirus B19 |
-
1992
- 1992-10-28 JP JP29010292A patent/JP3149116B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-10-21 US US08/139,711 patent/US5436127A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-10-28 EP EP93308632A patent/EP0595638B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-10-28 DE DE69323688T patent/DE69323688T2/de not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８６）Ｖｏｌ．５８，Ｎｏ．３，ｐ．９２１−９３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69323688D1 (de) | 1999-04-08 |
| JPH06135994A (ja) | 1994-05-17 |
| EP0595638A3 (ja) | 1994-08-03 |
| EP0595638A2 (en) | 1994-05-04 |
| DE69323688T2 (de) | 1999-07-22 |
| US5436127A (en) | 1995-07-25 |
| EP0595638B1 (en) | 1999-03-03 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |