JPH085637A - Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＨＡＶに対する抗体を検出するための試験方
法において、その検出感度において優れ、早い時期でＨ
ＡＶ関連抗体を検出したり、Ａ型肝疾患における検出率
を高めたり、さらに確実にＨＡＶ感染などを診断・検出
することのできる試薬及び測定法を提供する。 【構成】 イン・ビトロの細胞培養法で得られた細胞ラ
イゼートから得られたＨＡＶ抽出物を、少なくとも界面
活性剤、特にアニオン性界面活性剤で処理したものであ
るＨＡＶ抗原試薬を用いることにより、予想外にも抗原
活性に悪影響を与えること無く、測定感度を大幅に上昇
させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ａ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＡＶ）抗原の改良された調製方法に関し、より具体的に
は、界面活性剤、特にアニオン性界面活性剤を用いての
Ａ型肝炎ウイルス抗原の調製方法に関する。こうして試
料中の該抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法におい
て用いられる、Ａ型肝炎ウイルス抗原を用いたところの
測定感度の改良された測定用試薬が提供される。本発明
は、更に改良されたＡ型肝炎ウイルス抗原を用いたＡ型
肝炎感染の免疫学的測定法にも関する。

【０００２】

【従来技術及び解決すべき課題】Ａ型肝炎ウイルス（ｈ
ｅｐａｔｉｔｉｓ Ａ ｖｉｒｕｓ： ＨＡＶ）は、１
９７３年フェインストン（Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ）等によ
りＡ型肝炎急性期患者の便材料のうちに発見され、１９
７７年には実験感染チンパンジー肝組織における増殖の
報告がされてのち、１９７９年には初代マーモセット肝
細胞及びアカゲザル胎児腎細胞での増殖が報告された。
以来、ＨＡＶの増殖は、培養細胞系では初代及び株化ア
フリカミドリザル腎細胞、ヒト二倍体細胞などにおいて
報告されている。

【０００３】ところで、現在日本では、Ａ型肝炎ウイル
ス感染の発生は減少してはいるものの、若年層を中心に
抗ＨＡＶ抗体陰性者が増加するのに対して、一方では高
年齢者にはその陽性者が多く分布するという状況から、
成人ではＨＡＶに汚染された飲食物に接する機会が多く
なることに加えて、大人では一旦感染した場合、肝炎の
発症につながる恐れが高いことから、そのＨＡＶ感染を
防ぐ意味でも、正確かつ迅速なＨＡＶ感染の有無を検出
することが求められている。また、ＨＡＶは糞便などに
よる経口感染をその主な伝播経路とするため、環境衛生
の不備な地域での感染の危険は大きく、最近では海外渡
航の機会も増加し、こうしてＨＡＶ感染の検査が、近親
者間、従業員者間などでの感染を防ぐ意味でも重要視さ
れている。

【０００４】このＨＡＶ感染の検出のためには、ＨＡＶ
感染に伴って生体内の強い免疫反応により生じる抗ＨＡ
Ｖ抗体を検出して行われており、この抗ＨＡＶ抗体と免
疫学的に反応性を有するＨＡＶ抗原が試薬として用いら
れている。このＨＡＶ抗原は、上記したようなＨＡＶを
感染させた培養細胞から得られているＨＡＶをそのまま
あるいは固定化又は標識して、免疫学的測定法において
試薬として用いている。

【０００５】しかしながら、こうしたこれまでのこのＨ
ＡＶに対する抗体を検出するための試験方法は、依然と
して急性期の診断においてとか、その検出感度、さらに
はその特異性が必ずしも充分なものでなく、そのうえ非
特異的な反応が観察されるなどの問題を有しており、よ
り感度、特異性に優れた測定法の開発が求められてい
る。より早い時期でのＨＡＶ関連抗体の検出は、有効な
治療を進める上でも、医療の現場での安全性を確保する
上でも重要であり、またＡ型肝疾患における検出率を高
めることも求められている。これまで、ＨＡＶを感染さ
せた培養細胞は、約２〜１０日間、好ましくは７日間培
養され、生育培地を培養物から除いた後、その細胞を溶
菌化し、こうして得られた細胞ライゼートからその核由
来物質、細胞オルガネラ、破砕物などを遠心分離処理し
て除き、こうしてＡ型肝炎ウイルスが得られている。

【０００６】ところでその感染培養細胞の溶菌化処理に
あたり、キレート化剤及び非イオン界面活性剤を緩衝化
された溶液に含む生理的ではない溶液を用いることによ
り、該ウイルスの収量が顕著に増加するとの報告もなさ
れているが、上記のようにしてＨＡＶを感染させた培養
細胞を溶菌化して得られた細胞ライゼートから取得され
たウイルスは、単にそれをそのまま公知のホルマリン処
理、例えば感染細胞から抽出されたウイルスを３７℃で
３７％ホルマリン溶液の１：４０００希釈下にインキュ
ベーション処理し、その感染性を不活性化してＨＡＶ抗
原とし、それをそのままＨＡＶに対する抗体などを検出
する免疫学的測定法を行なう場合のＨＡＶ抗原として用
いている。ところが、こうしたＨＡＶ抗原を用いた場合
には感度の点で問題があり、偽陰性の要因にもなってい
た。上記したようにこれまでは感染細胞を溶菌化する場
合に界面活性剤を用いることは知られているが、溶菌化
して得られた細胞ライゼートから一旦分離されたＨＡＶ
は、それをそのまま単に不活性化してＨＡＶ抗原として
用いられているだけであった。上記したようにより早い
時期でＨＡＶ関連抗体を検出したり、Ａ型肝疾患におけ
る検出率を高めたり、さらに確実にＨＡＶ感染などを診
断・検出を行うために従来のＨＡＶ抗原を用いた時に生
じる低濃度域での偽陰性を少なくすることが、緊急的か
つ強く求められている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＨＡＶ抗
原と免疫学的に反応性の抗体（ＨＡＶ抗体）をイン・ビ
トロの細胞培養法で得られたウイルス抗原を用いてより
特異性に優れ、正確に測定する方法を見いだすべく鋭意
研究を行った結果、簡単な方法により、再現性のあるか
つより感度を高くすることのできる方法及び試薬の開発
に成功した。

【０００８】本発明者らは、イン・ビトロの細胞培養法
で得られたウイルス抗原を用いて、試料中の該抗原と免
疫学的に反応性の抗体を測定する場合、感染細胞を溶菌
化して得られた細胞ライゼートから一旦分離されたＨＡ
Ｖ抽出物を、さらに界面活性剤で処理したものを、ＨＡ
Ｖ抗原試薬として用いると、予想外にも抗原活性に悪影
響を与えることが少なく、また抗原の非特異吸着を抑え
ることができた。さらに測定系で用いるＨＡＶ抗原試薬
の添加量を増加することも可能となった。こうして測定
感度を大幅に上昇させることができることを見出し、本
発明を完成した。

【０００９】本発明は、イン・ビトロの細胞培養法で得
られた細胞ライゼートから得られたＨＡＶ抽出物を、少
なくとも界面活性剤、特にアニオン性界活性剤で処理し
たものであるＨＡＶ抗原試薬を提供する。さらに本発明
は、ＨＡＶと免疫学的に反応性の抗体の測定用試薬にお
いて、イン・ビトロの細胞培養法で得られた細胞ライゼ
ートから得られたＨＡＶ抽出物を少なくとも界面活性
剤、特にアニオン性界面活性剤で処理したものをＨＡＶ
抗原試薬として用いることを特徴とするＨＡＶ抗体測定
試薬及びその試薬を用いた測定方法を提供する。

【００１０】本発明で用いられるＨＡＶ抽出物は、例え
ばアフリカミドリザル腎培養細胞、ヒト肝臓腫瘍セルラ
インＰＬＣ／ＰＲＦ／５、Ｈｅｐ．Ｇ２などのＨＡＶ感
染細胞であって培養しうるもので、さらに好ましくは大
量にＨＡＶを産生しうるセルライン細胞を、公知の生育
培地、例えばイーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ
ＭＥＭ）、ダルベッコ最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃ
ｏ’ｓ ＭＥＭ）、ＰＲＭ１−１６４０（Ｇｉｂｃｏ
社）、Ｅａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ）、Ｎ−（２−ヒドロキ
シエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン
酸）（ＨＥＰＥＳ）緩衝液添加イーグルＭＥＭ、リン酸
緩衝化Ｌ−１５−ａ培地、ハンクス液（Ｈａｎｋｓ’
ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）など
の生育培地で、必要に応じウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ペ
ンシリン、トレプトマイシンなどの抗生物質、酵母抽出
液、バクトペプトン、ラクトアルブミン加水分解物、そ
の他細胞成長因子などを添加したものの中で培養し、次
にこうして得られた細胞培養物から次のようにして得ら
れる。

【００１１】つまり、上記のようにして得られた細胞培
養物から栄養培地を除去し、ついで細胞を生理的食塩
水、燐酸塩などで緩衝化された溶液などで、必要に応じ
ＥＤＴＡなどのキレート化剤を添加したもので洗浄す
る。こうして単離・収穫された細胞を、代表的にはＥＤ
ＴＡなどのキレート化剤及びポリオキシエチレンエーテ
ル（代表的なものは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００などの商品名で入手しうる）などの非イオン界面活
性剤を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液、例えば１ｍ
ＭのＥＤＴＡ及び０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００
を含む燐酸塩緩衝化溶液、あるいはデオキシコール酸塩
を含む燐酸塩などで緩衝化された溶液でもって溶菌処理
し、こうして得られた細胞ライゼートを、必要に応じ、
例えば約１０〜１５分間インキュベーション処理し、つ
ぎに遠心処理、例えば約１，０００〜２０，０００×
ｇ、好ましくは約２，０００〜１０，０００×ｇで、約
５〜６０分間、好ましくは約１０〜３０分間遠心処理
し、ＨＡＶ抽出物を得ることができる。ＨＡＶ抽出物
は、例えば米国特許明細書第４，７２１，６７５号に記
載のようにしても得られる。ＨＡＶ抽出物は、必要に応
じ、例えばクロロホルム抽出法、酵素処理法、蔗糖濃度
勾配遠心分離法などでさらに精製することもできる。

【００１２】こうして得られたＨＡＶ抽出物は、つぎに
公知の方法又はそれを修飾した方法によりその感染性を
不活性化するための処理がなされる。不活性化処理は、
例えばホルマリン液で処理する、例えば約３７℃で約２
５〜４５％ホルマリン溶液の約１：３０００〜１：７０
００希釈下、例えば、１：４０００希釈下にインキュベ
ーション処理することにより行うことができるが、その
他適切な方法を公知のものの中から選んで適用すること
が出来る。この処理は、例えば、２週間行うこともで
き、さらにそれより短い時間あるいは長い時間でもよ
い。この処理の際の処理液においては、必要に応じ、緩
衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保存剤などを
添加して用いることもできる。

【００１３】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、水、
リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナ
トリウム液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン
−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）液、
ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸）
（ＰＩＢＥＳ）液、３−（シアノヘキシルアミノ）−１
−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）液、３−（モルホリ
ノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）液、アミノ酸液な
どが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて
配合しても用いることができる。キレート化剤として
は、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレ
ングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）などが挙
げられる。

【００１４】本発明によれば、こうして得られた感染性
が不活性化されたＨＡＶ抽出物は、つぎに界面活性剤で
処理される。界面活性剤としては、特にアニオン性界面
活性剤が適している。アニオン性界面活性剤としては、
ステアリン酸カリウムなどの炭素数１２〜１８の高級脂
肪酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩、胆汁酸
のアルカリ金属塩、炭素数１２〜１８の高級脂肪酸のト
リエタノールアミンなどの有機塩基塩、ラウリル硫酸ナ
トリウム（ＬＤＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）などの炭素数１２〜１８の高級脂肪酸又は高級アル
コールの硫酸エステル、アルキルスルホン酸塩、アルキ
ルベンゼンスルホン酸ナトリウムなどのアルキルアリー
ルスルホン酸塩などが挙げられ、特にＬＤＳ、ＳＤＳは
著効を示す。アルカリ金属としては、ナトリウム、カリ
ウム、リチウムなど、アルカリ土類金属としては、カル
シウム、マグネシウムなどが挙げられる。

【００１５】これら界面活性剤は、共存する蛋白質の量
に応じて、その使用量を選ぶことが好ましく、例えば約
０．００１％ｖ／ｖ〜約１０％ｖ／ｖの範囲で用いるこ
とができる。特に好ましくはＳＤＳを用い、約０．０５
％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖ、より好ましくは共存する他の
蛋白質が存在しない場合には約０．５％ｖ／ｖ〜約１．
０％ｖ／ｖの範囲で用いることができる。

【００１６】界面活性剤でＨＡＶ抽出物を処理するにあ
たっては、必要に応じＨＡＶ抽出物を緩衝剤、希釈液又
は希釈剤などで希釈し、所要濃度を与える界面活性剤溶
液と混合するか、懸濁する。こうして得られた混合物
は、必要に応じ攪拌処理されることができる。また場合
によっては、混合物中にガラスビーズなどを加えて攪拌
処理してもよい。攪拌処理は、測定感度を改善しうるも
のであれば、例えば穏やかな混合のみで済ますこともで
きるし、激しい攪拌混合であることもできる。処理温度
は、室温で行うこともできるし、冷却下行うこともでき
るし、３７℃あるいはそれ以上の温度とすることも測定
感度を改善しうるものであれば、採用できる。界面活性
剤で処理されたＨＡＶ抽出物は、そのまま次の処理に使
用できるし、あるいは一旦保存したのち次の処理に使用
できるし、また必要に応じ遠心分離などの分離処理を
し、さらに必要に応じ洗浄などの処理をして後次の処理
に使用できる。これらの処理は、測定時の非特異吸着を
抑制し、感度を改善しうるように選ぶことができる。

【００１７】本発明の界面活性剤処理の際の処理液にお
いては、緩衝剤、希釈液又は希釈剤、キレート化剤、保
存剤などを添加して用いることができる。緩衝剤、希釈
液又は希釈剤としては、水、リン酸又はリン酸塩緩衝
液、Ｔｒｉｓ緩衝液、例えば生理食塩水などの塩化ナト
リウム液、ＨＥＰＥＳ液、ＰＩＢＥＳ液、ＣＡＰＳ液、
ＭＯＰＳ液、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）液、Ｎ−トリ
ス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンスル
ホン酸（ＴＥＳ）液、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−
アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）液、アミノ酸液な
どが挙げられる。これらは単独でも、任意に組合わせて
配合して用いることができる。キレート化剤としては、
ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げられる。

【００１８】本発明によれば、ＨＡＶ抽出物は、必要に
応じて、その感染性を不活性化する前に上記界面活性剤
で処理し、つぎに得られた界面活性剤で処理されたＨＡ
Ｖを、公知の方法又はそれを修飾した方法により不活性
化処理してもよい。不活性化処理は、上記と同様にして
よく、例えば約３７℃で約３７％ホルマリン溶液の１：
４０００希釈下にインキュベーション処理することによ
り行うことができる。

【００１９】より具体的な態様においては、本発明は、
イン・ビトロの細胞培養法で得られた細胞ライゼートか
ら得られたＨＡＶ抽出物を約０．５％ｖ／ｖ〜約１．０
％ｖ／ｖの範囲の濃度のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）液と混合し、つぎに必要に応じ、例えば室温で３時
間インキュベーション処理し、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物
を得るものである。本発明では、その得られたＳＤＳ処
理ＨＡＶ抽出物を用いたことを特徴とする試料中のＨＡ
Ｖ抗体の免疫測定試薬及びそれを用いた試料中の抗体の
測定法が提供される。

【００２０】本発明において試料中の抗原と免疫学的に
反応性の抗体を測定するにあたっては、ラジオイムノア
ッセイ、酵素免疫測定法、螢光免疫測定法、化学発光免
疫測定法、あるいは微粒子を標識剤とする免疫測定法及
び凝集反応免疫測定法などの方法によることができる。
特に、ＨＡＶ感染の急性期には、ＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗
体が患者の血液中に出現することが知られ、このＩｇＭ
型の抗ＨＡＶ抗体を測定することにより急性Ａ型肝炎の
感染を診断できる。このＩｇＭ型の抗ＨＡＶ抗体を特異
的に測定する系では、抗ヒトＩｇＭ抗体で被覆した固相
担体を、測定試料と反応させ、次に（１）標識剤で標識
した標識ＨＡＶ抗原と反応させるか、又は（２）ＨＡＶ
抗原試薬と反応させ、最後に標識抗ＨＡＶ抗体と反応さ
せるというように順次反応させることにより行われてい
る。

【００２１】したがって、より具体的な態様において
は、本発明は、試料中のＨＡＶ抗体を抗ヒトＩｇＭ抗体
結合固体担体あるいは粒子状担体などと反応させ、試料
中のＨＡＶ抗体を固相抗ヒトＩｇＭ抗体と免疫学的に反
応させ、つぎに上記のようにして得られた界面活性剤処
理ＨＡＶ抽出物、例えばＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出物を免疫
学的に反応させ、得られた反応生成物に化学発光標識抗
ＨＡＶ抗体を免疫学的に反応させることからなることを
特徴とするＨＡＶ抗体の測定法及びその測定法に用いる
試薬が提供される。

【００２２】本発明において試料中の抗原と免疫学的に
反応性の抗体を測定するにあたっては、抗原抗体反応に
あずかる抗原や抗体は、必要に応じて、例えば、寒天、
アガロース、セルロース、紙、ニトロセルロース、デキ
ストラン、ゼラチン、キチン、コラーゲン、綿などの生
体由来高分子あるいは天然物由来高分子、ポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリアクリ
ルアミドなどのアクリル樹脂、イオン交換樹脂、光架橋
樹脂、テフロン、ポリアセタールなどの合成高分子、ガ
ラスビーズ、シリカゲル、アルミナ、セラミック、カー
ボン、硫酸マグネシウムなどの無機質材料などからな
る、微粒子、ビーズ、マイクロプレート、マイクロタイ
ターウェル、マイクロチューブ、トリップ、メンブレ
ン、トレイ、ゲルなど、さらには赤血球、ラテックス粒
子、乳剤などの固体担体に固定しておき、この固体担体
を、分析対象としての抗体等を含有する試料と接触さ
せ、こうして固体担体に固定された抗原と、分析試料中
の抗体等とを特異的に結合反応せしめ、この特異的に結
合した分析対象物を検知することによりおこなうことが
できる。もちろん、これらの固体担体はＨＡＶ抗原の処
理に用いた界面活性剤との間で好ましくない反応が起き
ないようにして使用することが好ましい。

【００２３】好ましい態様において、本発明では試料と
反応せしめられる抗ヒトＩｇＭ抗体結合固体担体あるい
は粒子状担体などとしては、ポリスチレン製のビーズ、
ポリスチレン製の微小粒子などを用いることができる。
また、抗体としては、ヒトＩｇＭに対する抗体及びＨＡ
Ｖに対する抗体など対象抗原に対する抗体であれば特に
限定されることなく用いることができる。抗体は常法に
より得ることができ、例えば村松繁、他編、実験生物学
講座１４、免疫生物学、丸善株式会社、昭和６０年、日
本生化学会編、続生化学実験講座５、免疫生化学研究
法、東京化学同人、１９８６年、日本生化学会編、新生
化学実験講座１２、分子免疫学ＩＩＩ、抗原・抗体・補
体、東京化学同人、１９９２年などに記載の方法に準じ
て、例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、ラッ
ト、マウスなどを免疫するなどして得たり、モノクロー
ナル抗体であることもでき、これらは単独でもあるいは
これらを組合せて用いることは任意にできる。これら抗
体は、必要なら、ペプシン、パパインなどの酵素で消化
して、Ｆ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ’として使用してもよ
い。抗ヒトＩｇＭ抗体としては、好ましくはμ鎖に対し
て特異的に反応する抗体、抗μ鎖−ヒトＩｇＭ抗体が挙
げられ、これらはマウスミエローマ細胞を用いて細胞融
合技術を利用して得られたモノクローナル抗体であって
もよいことはいうまでもない。また、抗ＨＡＶ抗体は、
高力価を有するヒトＨＡＶ陽性血清又は血漿から得られ
たものが利用できるが、上記したようにモノクローナル
抗体であってもよいことはいうまでもない。

【００２４】ラジオイムノアッセイ、酵素免疫測定法、
螢光免疫測定法、化学発光免疫測定法などでは、
¹²⁵Ｉ、 ³Ｈなどの放射性物質、西洋わさびペルオキシ
ダーゼ、β−D −ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼなどの酵素、フルオレッセインなどの螢光色
素、アクリジニウムエステル類などの化学発光色素、金
コロイド、セレンコロイドあるいは有色ラテックス粒子
などの有色物質などで標識された抗原あるいは二次抗体
が試薬として用いられ、分析試料中の抗体、複合体等と
特異的に結合反応せしめられ、その放射活性、酵素活
性、化学発光あるいは色の有無などを測定して、試料中
の抗体等が存在していたか否かを判別することができ
る。本発明においては、特に化学発光標識法、例えばア
クリジニウムエステル類などで標識された二次抗体試薬
を用いる化学発光免疫測定法あるいは発光ランタニドな
どで標識された二次抗体試薬を用いる螢光免疫測定法は
自動化された測定ができ好ましい方法である。特にアク
リジニウムエステル類で標識された二次抗体試薬を用い
る化学発光免疫測定法は自動化された測定ができ好まし
い。

【００２５】アクリジニウムエステル類としては、例え
ば特開昭６２−３９５９８号公報、特開昭６２−６１９
６９号公報、特開昭６３−５７５７２号公報、特開昭６
３−１０１３６８号公報、特開昭６３−１１２５６４号
公報、特開平１−１９９９４９号公報、特開平１−２６
１４６１号公報、特開平２−９６５６７号公報、特開平
２−１３３４６９号公報、特開平２−５０３２６８号公
報、特開平２−５０１７７２号公報、欧州特許公開出願
第００８２６３６号、英国特許明細書第１，４６１，８
７７号、米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに
記載のＮ−アルキル又はアリールアクリジニウム−９−
カルボン酸エステルなどが挙げられる。

【００２６】特に、特開昭６３−１１２５６４号公報、
米国特許明細書第３，５３９，５７４号などに記載の１
０−アルキル・Ｎ−アルキル又はアリール−スルホニル
−Ｎ−アルキル又はアリールスルホニルアクリジニウム
−９−カルボキサミド、Ｎ−メチルアクリジニウム−９
−カルボン酸エステルなどは代表的な化学発光標識とし
て挙げられる。アクリジニウム標識の場合、測定前にト
リガー試薬処理、例えば過酸化水素、例えば約０．０１
％〜約０．１％の過酸化水素水溶液、及び水酸化ナトリ
ウム、例えば約０．０５Ｎ〜約０．５Ｎの水酸化ナトリ
ウム水溶液で処理してから、ルミノメーターなどを用い
て測定を行うことができる。

【００２７】発光ランタニドとしては、例えば欧州特許
公開出願第００６８８７５号、米国特許明細書第４，３
７４，１２０号、米国特許明細書第４，２８３，３８２
号、米国特許明細書第４，２５９，３１３号、米国特許
明細書第４，３５２，７５１号、米国特許明細書第４，
４３２，９０７号、欧州特許公開出願第０１０３５５８
号などに記載のアミノカルボン酸基を持つ発光ランタニ
ドをキレート化できるものなどが挙げられる。また測定
前にレーザー光などによる励起処理をして測定を容易に
することもできる。勿論、標識剤は上記のものに限定さ
れること無く、測定に使用される機器、場所などを考慮
し、適宜当該分野で使用することが知られているものの
中から目的に応じ選択して用いることができる。

【００２８】凝集反応を利用した測定法では、一般には
可溶性抗原を粒子状担体、例えば、赤血球、ポリスチレ
ン粒子、ラテックス粒子などに結合させたいわゆる感作
粒子抗原などの粒子状抗原と、それに対する抗体とが特
異的に結合反応して、観察できるような凝集塊をつくる
反応を利用することができる。

【００２９】固体担体、粒子状担体あるいは標識などと
抗原あるいは抗体などとを結合あるいは吸着させるに
は、当該分野で汎用されている方法を用いることがで
き、例えばイオン相互作用、疎水相互作用、共有結合な
どの物理的吸着や化学的結合により行うことができる。
例えば、架橋剤としては、グルタルアルデヒド、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミド、Ｎ−ス
クシンイミジル ３−（２−ピリジルジチオ）プロピオ
ネート、Ｎ−スクシンイミジル Ｓ−アセチルメルカプ
トアセテート、Ｎ−スクシンイミジル ４−（Ｎ−マレ
イミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレー
ト、Ｎ−スクシンイミジル ６−マレイミドヘキサノエ
ート、Ｎ−スクシンイミジル ４−ヨードアセチルアミ
ノベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジル３−（ｐ−ヒド
ロキシフェニル）プロピオンネート、Ｎ−スクシンイミ
ジルｍ−マレイミドベンゾエート、Ｎ−スクシンイミジ
ル ４−マレイミドブチレート、Ｎ−スクシンイミジル
（ｐ−マレイミドフェニル）アセテート、Ｎ−スクシ
ンイミジル ４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレー
トなどが挙げられる。

【００３０】固体担体、粒子状担体などの例としては、
上記したようなものが挙げられ、例えば寒天、アガロー
ス、架橋アガロース、架橋アルギン酸、架橋グアガム、
ニトロセルロースやカルボキシルセルロースなどのセル
ロースエステルあるいは混合セルロースエステル、ゼラ
チン、架橋ゼラチン、ラテックス、ゴム、ポリエチレ
ン、ポリプロピレン、ポリスチレン、スチレン−ブタジ
エン共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
アクリルアミド、ポリメタクリレート、スチレン−メタ
クリレート共重合体、ポリグリシジルメタクリレート、
アクロレイン−エチレングリコールジメタクリレート共
重合体などのポリエステル、ポリアミド、ポリウレタ
ン、ポリエポキシ樹脂などの天然あるいは合成の修飾あ
るいは非修飾の重合炭水化物、重合炭化水素など、それ
らの架橋誘導体など、ガラス、例えば活性化ガラス、シ
リカゲル、カオリン、タルク、シリカ−アルミナ、アル
ミナ、硫酸バリウムなどの無機材料などからなる群から
選ばれたものを、多孔性のゲル、微粒子などにしたもの
が挙げられる。

【００３１】本発明においては、測定は競合アッセイ、
サンドイッチアッセイ、中和アッセイ、固相アッセイ、
クロマトグラムアッセイなどに適したようにしておこな
うこともできる。本発明で用いられる測定対象試料とし
ては、全血、血清、血漿、唾液、生体粘液などの生体由
来材料をあげることができる。これら測定対象試料は、
必要に応じ濃縮したり、希釈して用いられるが、普通上
記したような希釈剤などで希釈して用いることが好まし
い。また、上記したような緩衝剤、希釈液、キレート化
剤、保存剤などを添加して用いることができる。試料
は、場合によって５０〜５００倍に希釈してもよい。

【００３２】また、試料は、必要に応じ肝炎陰性のヒト
血清、血漿、イムノグロブリン含有フラクションなどの
水溶液で希釈処理することもできる。

【００３３】さらにまた、試料は、必要に応じ上記の希
釈に代え、ヒトＩｇＭ含有フラクション、精製ヒトＩｇ
Ｍなどのの水溶液を添加して、試料中のＩｇＭ量に影響
されること無く目的抗ＨＡＶ−ＩｇＭ抗体を測定できる
ようにすることもできる。約０．１％のヒトＩｇＭを含
有する水溶液の場合、その水溶液で試料を約５０〜２０
０倍に希釈してもよい。測定試料調製の手間、例えば試
料濃度の調整などの測定範囲設定が簡易に行うことがで
きるようになり、自動化免疫測定系における適用が容易
になる。

【００３４】本発明においては、標識用試薬として、４
−ヒドロキシフェニル酢酸、１，２−フェニレンジアミ
ン、テトラメチルベンジジンなどと西洋ワサビ・ペルオ
キシダーゼ、ウンベリフェリルガラクトシド、ニトロフ
ェニルガラクトシドなどとβ−D −ガラクトシダーゼ、
ウンベリフェリルホスフェート、ニトロフェニルホスフ
ェート、ＮＡＤＰなどとアルカリフォスファターゼ、グ
ルコース−６−リン酸・デヒドロゲナーゼなどの酵素試
薬、放射性物質試薬、フルオレッセインイソチオシアネ
ート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ア
クリジニウムエステル類、発光ランタニドなどを用いて
いる螢光試薬、発光試薬、化学発光試薬、金コロイド、
銀コロイド、セレンコロイドなどのコロイド標識試薬、
磁性体試薬、ビオチン標識抗ビオチン抗体などのハプテ
ン標識抗ハプテン抗体検出系試薬などを用いることがで
きる。上記したように本発明においては、特に化学発光
標識試薬、例えばアクリジニウムエステル類あるいは螢
光標識試薬、例えば発光ランタニドなどで標識された二
次抗体試薬を用いると、測定は自動化され好ましい。こ
のように自動化に適した当該分野で知られた適当な標識
剤から選択して標識して用いることは、その目的に合致
するならばすべて本発明においてなすことができる。

【００３５】本発明の測定系においては、さらにＨＡＶ
抗原の処理に用いた界面活性剤以外の別の界面活性剤、
緩衝剤、希釈液又は希釈剤、ブロッキング剤、キレート
化剤、保存剤などを含有して用いることができる。好ま
しい該別の界面活性剤としては、ポリオキシエチレンソ
ルビタン（代表的なものは、Ｔｗｅｅｎ ２０などの商
品名で入手しうる）、ポリオキシエチレンエーテル（代
表的なものは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの商品名
で入手しうる）、オクチルフェノール・エチレンオキサ
イド縮合物（代表的なものは、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４
０などの商品名で入手しうる）などが挙げられる。

【００３６】緩衝剤、希釈液又は希釈剤としては、上記
したような水、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、例えば
生理食塩水など、ＨＥＰＥＳ液、ＰＢＥＳ液、ＣＡＰＳ
液、ＭＯＰＳ液、アミノ酸液などが挙げられる。これら
は単独でも、任意に配合しても用いることができる。キ
レート化剤としては、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡなどが挙げら
れる。保存剤としては、例えばナトリウムアジド、エチ
ルパラベンなどが挙げられる。その他、本発明の測定系
には、各種動物の血清、例えばウシ血清、ウシ血清アル
ブンミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ヤギ血
清、卵白アルブンミン、ゼラチン、各種乳蛋白質、例え
ばスキムミルク、カゼイン、カゼイン分解物、ホエー蛋
白質など、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリド
ンなどからなる群から選ばれたものを添加することがで
きる。

【００３７】

【実施例】次に実施例を示して、本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこの具体例により限定されるもの
でなく、その思想に従うかぎり各種の形態で実施できる
ことは理解されるべきである。

【００３８】実施例１ 抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微粒子の調製 ヤギから得られたヒトＩｇＭのμ鎖に対して特異性をも
ポリクローナル抗体(米国ジャクソン・イムノ・リサー
チ・ラボ社製〔Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｌａｂｏ．，ＵＳＡ．〕）をカルボキシル化
ポリスチレンラテックス微粒子( 米国セラダイン社製
〔Ｓｅｒａｄｙｎ，ＵＳＡ．〕；０．２μｍ）に以下に
記載の方法で結合した。まず、０．０１５ＭのＭＥＳ
（２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸）緩衝液
（ｐＨ４．７）中の１−エチル−３−（３−ジメチルア
ミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ；１６ｍｇ／
ｍｌ）を用いてポリクローナル抗体抗ヒトＩｇＭ抗体
（１６０ｍｇ／ｍｌ）を室温で１．５時間かけて結合し
た。次に１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０及び０．９％
ＮａＣｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を用いて洗浄した。最終的には、０．０５％ゼ
ラチン、０．１％ツイーン２０、０．９％ＮａＣｌ及び
０．１％アジ化ナトリウムを含有する０．０１Ｍのトリ
ス（Ｔｒｉｓ）緩衝液（ｐＨ７．４）中に貯蔵した。被
覆微粒子の固形分の％が、０．０６２５％になるように
貯蔵バッファーで希釈し、抗ヒトμ−ＩｇＭ抗体被覆微
粒子試薬とした。

【００３９】アクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体の調製 β−アラニンアクリジニウム（１ｍｇ）を無水ジメチル
ホルムアミド（ＤＭＦ）（１００μｌ）中に溶解し、Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（５．７５ｍｇ
／ｍｌ、５０μｌ）及びＥＤＡＣ（９．６ｍｇ／ｍｌ、
５０μｌ）を連続して添加し、暗所、２５℃で４８時間
攪拌することにより活性化した。プロテインＡ精製モノ
クローナル抗ＨＡＶ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）を含有してい
る、０．９％ＮａＣｌ及び０．５％ＣＨＡＰＳを含む
０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に活性化アクリ
ジニウムを加え（抗体の４倍のモル数）、反応混合物を
室温中で１０分間攪拌した。緩衝液を０．１％ＣＨＡＰ
Ｓ、０．１％アジ化ナトリウム及び０．９％ＮａＣｌを
含有する０．０１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）に置
き換えた後、調整物を遠心分離にかけ、上清を置換後の
ものと同じ緩衝液で平衡化したバイオシル ＳＥＣ ２
５０（米国バイオラド社製〔Ｂｉｏｌａｄ，ＵＳＡ．〕
のＨＰＬＣカラム上のクロマトグラフィーにかけた。そ
れぞれのフラクション（１ｍｌ）を３６９ｎｍ及び２８
０ｎｍでの紫外分光分析により分析し、アクリジニウム
の結合量を決定した。結合体を濃縮フラクション（約１
００μｇ／ｍｌ）中、約４℃で貯蔵し、使用前に１％カ
ゼインナトリウム、０．１％ツイーン２０、０．１％ア
ジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．９％ＮａＣ
ｌを含有する０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）
で希釈し、アクリジニウム標識抗ＨＡＶ抗体試薬とし
た。

【００４０】ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原の調製 ＨＡＶは栄養培地中のバース−アレキサンダー細胞（Ｂ
ａｒｔｈ−Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｃｅｌｌｓ）を用いて
培養した。培養細胞に、０．５％トライトン（Ｔｒｉｔ
ｏｎ）Ｘ−１００を含有しかつ５ｍＭ ＥＤＴＡ及び
０．９％ＮａＣｌを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）を混合し、３６℃で１６〜６８時間攪拌した
後、遠心分離にかけ、上清を捨てることにより、ＨＡＶ
抽出物をホルムアルデヒド希釈倍率で１：４０００とな
るように添加した後、３６℃で３日間攪拌して、ＨＡＶ
の感染性を不活性化した。不活性化したＨＡＶ抽出物に
ＳＤＳを添加し、室温で２４時間攪拌して、ＳＤＳ処理
ＨＡＶ抽出物を得た。ＳＤＳは１．２ｗｔ％までの各種
濃度となるようにして添加した。ＳＤＳ処理ＨＡＶ抽出
物は、０．１％のアジ化ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ
及び０．９％ＮａＣｌを含む０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）で希釈して、ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬
とした。ＳＤＳ処理ＨＡＶ抗原試薬は使用時まで４℃で
貯蔵した。

【００４１】アッセイ ＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料、及びＨＡＶＡＢ−Ｍ陰
性パネル試料を生理食塩水で２０１倍に希釈した。希釈
した試料（２５μｌ）を容器に入れ、これに抗ヒトμ−
ＩｇＭ抗体被覆微粒子試薬（３０μｌ）を添加し、３７
℃で２０分間反応させた。反応した微粒子をガラス繊維
フィルターで捕捉し、０．１Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ
８．５）（３００μｌ）で２回洗浄した。次にＳＤＳ処
理ＨＡＶ抗原試薬（３０μｌ）をフィルター表面に添加
し、３７℃で２０分間フィルター表面に捕捉されている
微粒子と反応させた。フィルターを０．１Ｍのホウ酸緩
衝液（ｐＨ８．５）（１００μｌ）で１回、そして同緩
衝液（３００μｌ）で１回洗浄した。次にアクリジニウ
ム標識抗ＨＡＶ抗体試薬（３０μｌ）をフィルター表面
に添加し、３７℃で１０分間フィルター表面に捕捉され
ている微粒子と反応させた。フィルターを０．１Ｍのホ
ウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）（１００μｌ）で１回、そし
て同緩衝液（３００μｌ）で１回洗浄した。このフィル
ターを化学発光読取り機に移し、この中で０．２５Ｎの
ＮａＯＨ中の０．４％過酸化水素を含むトリガー溶液
（５０μｌ）をフィルターに送り込んだ。微粒子に結合
したアクリジニウムが発光し、生じた光の量を測定し
た。得られた結果を図１及び図２に示す。図１中横軸は
ＳＤＳ処理抗原試薬中のＳＤＳ濃度を示す。図２中には
ＨＡＶＡＢ−Ｍ陽性パネル試料の発光量をＨＡＶＡＢ−
Ｍ陰性パネル試料の発光量で割った比率とＳＤＳ濃度の
関係が示されている。図２より適量のＳＤＳでＨＡＶを
処理することにより、ノイズ（陰性パネル試料の発光
量）に対するシグナル（陽性パネル試料の発光量）の比
が大幅に増加し、感度が大幅に向上したことが分かる。

【００４２】

【発明の効果】抗原として、界面活性剤、特にアニオン
性界面活性剤で処理されたＨＡＶ抗原を用いることで、
試料中の該抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定におい
て、感度の高い測定系を組み立てることが可能となる。
より優れたＨＡＶ抗原と免疫学的に反応性の抗体測定系
が提供でき、臨床検査においての有用性が高いし、検出
率を高める。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＳＤＳ処理抗原試薬中のＳＤＳ濃度と、試料
の発光量との関係を示す。

【図２】 陽性パネル試料の発光量／陰性パネル試料の
発光量と、ＳＤＳ処理抗原試薬中のＳＤＳ濃度との関係
を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＨＡＶ感染培養細胞で産生されたＨＡＶ
   抗原を用いたＨＡＶ抗体の測定法において、界面活性剤
   で処理したＨＡＶ抗原を用いることを特徴とするＨＡＶ
   抗体の測定法。
2. 【請求項２】 ＨＡＶ感染培養細胞で産生されたＨＡＶ
   抗原を用いたＨＡＶ抗体の測定法において、ＨＡＶ感染
   培養細胞から収穫されたＨＡＶ抽出物を少なくとも界面
   活性剤で処理した後ＨＡＶ抗原として用いることを特徴
   とする請求項１記載のＨＡＶ抗体の測定法。
3. 【請求項３】 ＨＡＶ抗体が、ヒトＩｇＭであることを
   特徴とする請求項１又は２記載のＨＡＶ抗体の測定法。
4. 【請求項４】 界面活性剤が、アニオン性の界面活性剤
   である請求項１〜３のいずれか一記載のＨＡＶ抗体の測
   定法。
5. 【請求項５】 アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫酸
   ナトリウム（ＳＤＳ）又はラウリル硫酸ナトリウム（Ｌ
   ＤＳ）である請求項４記載のＨＡＶ抗体の測定法。
6. 【請求項６】 ＨＡＶ抽出物が、ＨＡＶ感染培養細胞を
   溶菌化し、得られた細胞ライゼートから得られたＨＡＶ
   を、ＨＡＶ感染性について不活性化し得られたものであ
   る請求項１〜５のいずれか一記載のＨＡＶ抗体の測定
   法。
7. 【請求項７】 試料中のＨＡＶ抗体を抗ヒトＩｇＭ抗体
   結合固体担体と反応させて試料中のＨＡＶ抗体を固相抗
   ヒトＩｇＭ抗体と免疫学的に反応させ、つぎにＨＡＶ感
   染培養細胞から収穫されたＨＡＶ抽出物を少なくとも
   （ａ）アニオン性界面活性剤で処理して得られたＨＡＶ
   抗原と免疫学的に反応させ、得られた反応生成物に標識
   抗ＨＡＶ抗体を免疫学的に反応させるか、又は（ｂ）ア
   ニオン性界面活性剤で処理して得られたＨＡＶ抗原を標
   識剤で標識して得られた標識抗原を免疫学的に反応させ
   ることからなることを特徴とする請求項１〜６のいずれ
   か一記載のＨＡＶ抗体の測定法。
8. 【請求項８】 化学発光標識が、アクリジニウム標識で
   ある請求項１〜７のいずれか一記載のＨＡＶ抗体の測定
   法。
9. 【請求項９】 ＨＡＶ感染培養細胞から収穫されたＨＡ
   Ｖ抽出物を少なくともアニオン性界面活性剤で処理して
   得られたＨＡＶ抗原。
10. 【請求項１０】 アニオン性界面活性剤が、ドデシル硫
    酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はラウリル硫酸ナトリウム
    （ＬＤＳ）である請求項９記載のＨＡＶ抗原。