JP2012112879A - 免疫検査試薬、それを用いる検査装置及び検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を容易に鑑別できる免疫検査試薬を提供する。強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を、一般的な季節性インフルエンザおよび新型インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍから鑑別可能とする。
【解決手段】本Ａ型インフルエンザ抗原免疫学的検査試薬は、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含む。
【選択図】図４
【解決手段】本Ａ型インフルエンザ抗原免疫学的検査試薬は、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含む。
【選択図】図４
Description
本発明は、免疫検査試薬及びその関連技術に係り、特に、ヒトから採取した試料から強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を検出し、さらに、一般的な季節性インフルエンザおよび新型インフルエンザＡ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍとの鑑別診断を容易に可能とする試薬に関するものである。
インフルエンザウイルスは、ヒトを含む多くの動物に感染し、インフルエンザを引き起こす病原体である。ヒトがインフルエンザウイルスに感染すると、数日の潜伏期を経て、発熱、頭痛、関節を含む全身各部の痛み、脱力感、咳、のどの痛み等の症状を引き起こす。また、気管支炎、肺炎、中耳炎などを併発することも多く、さらに脳症、筋肉炎、心筋炎などを引き起し重篤な状態に陥る場合もある。特に、体力に乏しい、高齢者、乳幼児等では、命にかかわることもある。
インフルエンザウイルスとしては、主にＡ型とＢ型の２つのタイプが知られており、このうち、Ａ型インフルエンザウイルスは、赤血球凝集素（ヘマグルチニン（ＨＡ）；Ｈ１〜Ｈ１６）、ノイラミターゼＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）由来の亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が多数存在し、多くの変異株が発生し、全世界的な大流行を引き起こすことがある。
Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒトだけでなく、鳥、ブタ、馬、ミンク、クジラ等の動物にも感染する。通常、ヒトは、他の動物が感染するインフルエンザウイルスに感染することはほとんどなく、一般に、ヒトは、Ａ香港型（Ｈ３Ｎ２）、Ａソ連型（Ｈ１Ｎ１）などに感染するとされる。
しかしながら、ウイルスの変異により、これまでヒトに感染しなかったウイルスが動物からヒトへ感染したり、さらには、ヒトからヒトへ感染したりするようになる場合がある。このようにして新たにヒト間での感染性を示すものを新型インフルエンザと呼んでおり、時として世界的な流行を引き起こし、その感染により甚大な健康被害を与えることがある。
２００９年４月メキシコにおいて豚から人に感染したと考えられるＨ１Ｎ１新型インフルエンザ２００９（新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）が報告され、その後世界的な感染拡大を引き起こしている。６月には世界保健機構（ＷＨＯ）は世界的流行病（パンデミック）であることを宣言し、警戒水準を最も高いフェーズ６まで引き上げた。日本でも５月には国内最初の感染者が見つかり、その後感染は拡大の一途をたどり重大な社会問題になった。２０１０年２月７日現在、世界で２１２以上の国、自治領、地域から、１５，２９２症例以上の死亡例を含む、実験室診断により確定された症例が報告されている。国内でも２０００万人以上の感染者が報告され、死者も２００人に達している。なお、死亡率としては０．１％以下と推定され特に高いとは考えられていない。
更に、１９９７年香港において、鳥由来の強毒型のＡ型インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）が最初にヒトに感染した例が報告され、その後、東南アジアやエジプトなどにおいて散発的に感染者が出ており、約５００人の患者に対し３００人もの死者が出るという致死率の高さでたいへん大きな問題になっている。この強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１は増殖部位が呼吸器系に限らず全身の臓器に広がるため症状も重篤化しやすく、対処が難しく死亡率が極めて高くなる。
これらの新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍや強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１の検査法としては、従来より遺伝子増幅法（ＰＣＲ法）が用いられてきたが、これによると、複雑な作業が必要で、検査だけでも６時間乃至二日程度の時間が必要になる。新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍや強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１の蔓延を防ぐためにも迅速な検査が強く要望されている。
さて、イムノクロマト法による試薬を含む検査試薬は、例えば、妊娠検査、あるいは感染症（肝炎ウイルス、アデノウイルス等）の検査に広く用いられている。さらに、Ａ型インフルエンザウイルスやＢ型インフルエンザウイルスを検査できるイムノクロマト法による試薬を含む検査試薬は、既に実用化されている。これらの試薬は、僅か５分〜１５分の短時間で、簡便な操作法による診断を可能とし、医療現場での診療に大いに役立っている。
また、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１の検出キットについても簡易検査試薬が提案されている（特許文献１：特開２０１０−１９７３９号公報）が、２つのテストの比較を要するものであり判定が難しいという問題がある。結局、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を容易に鑑別できる免疫検査試薬は、未だ十分に確立していない。
特開２０１０−１９７３９号公報
そこで本発明は、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を容易に鑑別できる免疫検査試薬を提供することを目的とする。そして、これにより、一般的に流行が見られる季節性インフルエンザおよび２００９年から急速に感染が拡大した新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザから、致死率の高い強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１のみを鑑別診断できるようにし、その結果、患者の隔離、蔓延の防止、早期の治療などに役立てようとするものである。
第１の発明に係る免疫検査試薬は、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含む。
第２の発明に係る検査装置は、ストリップと、ストリップの上流側に配置される滴下部と、ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、滴下部より吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、塗布部と吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、第１の抗体は、第１の発明の第１モノクローナル抗体及び第２モノクローナル抗体の一方であり、第２の抗体は、第１の発明の第１モノクローナル抗体及び第２モノクローナル抗体の他方である。
第３の発明に係る検査方法では、第１の発明の第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体とが、イムノクロマト法により使用される。
第４の発明に係る検査方法では、第１の発明の第１モノクローナル抗体と第２モノクローナル抗体とが、ＥＬＩＳＡ法により使用される。
本発明によれば、既に市販されているイムノクロマト法の試薬を含む検査試薬と全く同等の操作と検査時間で、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスを他のウイルスと区別して明確に判定できる。
短時間で、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスによる陽性を特定できるため、万が一このウイルスが発生した場合、患者を隔離して蔓延を防止でき、また患者を早期に集中的に治療できるため、予後を改善することができる。
具体的な実施の形態の説明に先立ち、概要を以下説明する。好ましい形態の検査装置では、ストリップと、ストリップの上流部に配置される滴下部と、ストリップの下流部に配置される吸水ろ紙と、滴下部より吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、塗布部と吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部を有する検査領域とを備える検査試薬であって、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含む。これにより、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスについて陽性／陰性であることが示される。
本試薬は、第１、第２モノクローナル抗体により、免疫学的なサンドイッチ反応物を生成するため、上述の組み合わせにおいて、第１、第２モノクローナル抗体を互いに入れ変えて検査試薬を作ることも可能である。
好ましくは、本発明の検査試薬は、ストリップは、ケースに保持され、ケースは、滴下部に対応して開口する漏斗部と、検査領域に対応する観察窓とを備えることが望ましい。また、従来の季節性インフルエンザや２００９新型インフルエンザ（新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）の検出キットと組み合わせて作製もしくは測定することも可能となる。
なお、本発明の検査試薬は、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含むものであり、上述のイムノクロマト法に従ったストリップタイプの試薬に限らず、例えばＥＬＩＳＡ法なども含まれる。
（開発の経緯）
次に、本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。
次に、本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。
一般的にＡ型インフルエンザウイルスの感染の有無を検査するにあたっては、種々のタイプのウイルスを検出できるようにするため変異が少ない抗原タンパクを標的とすべきと考えられる。具体的には、赤血球凝集素ＨＡやノイラミニターゼＮＡそのものには、多数の亜型が存在するので、これらは標的としては適しない。一方、核タンパク（ＮＰ）は変異が少ないので、標的に適していると考えられる。
Ａ型インフルエンザウイルスは、表面抗原である赤血球凝集素（ヘマグルチニン（ＨＡ）；Ｈ１〜Ｈ１６）、ノイラミターゼ（ＮＡ；Ｎ１〜Ｎ９）由来の亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）が多数存在し、多くの変異株が発生しており、これらの亜型を鑑別することも疫学的に重要である。しかしながら、亜型の鑑別のために赤血球凝集素（ＨＡ）やノイラミターゼ（ＮＡ）に対する抗体を使用することも試みられてきたが感度が十分ではないという問題があった。
核タンパク（ＮＰ）は表面抗原である赤血球凝集素（ＨＡ）やノイラミターゼ（ＮＡ）に比べると明らかに変異部位は少ないが、詳しく分析すると幾つかの領域で表面抗原に由来する亜型の分類に対応して系統的な変異が起こっている可能性が示唆された。そこで本発明者らは、新型インフルエンザの鑑別を目的として核タンパク（ＮＰ）の特定の配列を認識するモノクローナル抗体の評価選定およびモノクローナル抗体の作製、評価を行うこととした。
モノクローナル抗体の作製は、免疫原に、強毒型Ｈ５Ｎ１株であるインフルエンザＡ型核蛋白質抗原組換え核蛋白質（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／ＶＬ０２０／０５由来（ｒ‐ＮＰ／Ａ））を免疫し、ラットモノクローナル抗体として独立行政法人国立国際医療研究センターにて作製した。
こうして得られた抗体について、以下の各配列を持つｒ‐ＮＰ／Ａ、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ由来組換え核蛋白質（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ｒ‐ＮＰ（Ｓｗ））、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物を抗原とし、反応性を確認した。上記各核蛋白のアミノ酸配列は、以下の通りである。
強毒型H5N1（A/VietNam/VL020/05のNP） 全アミノ酸の配列(1-498)
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新型A/H１N１pdm（A/California/04/2009）の全アミノ酸の配列(1-498)
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H3N2（A／New York／55／2004）の全アミノ酸の配列(1-498)
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H1N1 A(New Caledonia/20/99) の全アミノ酸の配列(1-498)
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新型A/H１N１pdm（A/California/04/2009）の全アミノ酸の配列(1-498)
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H3N2（A／New York／55／2004）の全アミノ酸の配列(1-498)
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H1N1 A(New Caledonia/20/99) の全アミノ酸の配列(1-498)
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その結果、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物には反応性を示さず、ｒ‐ＮＰ／Ａ、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ由来組換え核蛋白質（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ｒ‐ＮＰ（Ｓｗ））に強い反応性を示す特殊なクローン６Ｇ６，７Ｆ６を得た。これらを、本明細書において、「第１モノクローナル抗体」という。なお以下、クローン７Ｆ６を主として取り扱うが、クローン６Ｇ６もクローン７Ｆ６と同様であり、本願発明の第１モノクローナル抗体に包含される。
これらの第１モノクローナル抗体のエピトープについて調べたところ、これら第１モノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側４−１８番目がＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥであるペプチドに特異的な反応性を有し、ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ及びＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤであるペプチドには反応性を有しない新規のモノクローナル抗体であることが分かった。従って、第１モノクローナル抗体は、Ｎ末端側１６−１８番目がＧＧＥ（グリシン−グリシン−グルタミン酸）の配列を認識していると考えられる。
(第１モノクローナル抗体の詳細)
これらの第１モノクローナル抗体について認識する反応部位を分析するため、ｒ‐ＮＰ/Ａについて全長(ｆｕｌｌ)、フラグメントｆｒ１、ｆｒ２、ｆｒ３、ｆｒ１‐１、ｆｒ１‐２の各配列を有する合成ペプチドを固相とするＥＬＩＳＡを行った。各ｒ‐ＮＰ/Ａ断片は１μｇ/ｍｌで固相化を行い、モノクローナル抗体は４ｎ段階希釈として１〜１６３８４倍で希釈した各測定試料を用いて、上述と同様のＥＬＩＳＡ法にて測定を実施した。６Ｇ６の反応性は、次表の通りである。なお、全長(ｆｕｌｌ)、フラグメントｆｒ１、ｆｒ２、ｆｒ３、ｆｒ１‐１、ｆｒ１‐２については、図５、図６を参照されたい。
これらの第１モノクローナル抗体について認識する反応部位を分析するため、ｒ‐ＮＰ/Ａについて全長(ｆｕｌｌ)、フラグメントｆｒ１、ｆｒ２、ｆｒ３、ｆｒ１‐１、ｆｒ１‐２の各配列を有する合成ペプチドを固相とするＥＬＩＳＡを行った。各ｒ‐ＮＰ/Ａ断片は１μｇ/ｍｌで固相化を行い、モノクローナル抗体は４ｎ段階希釈として１〜１６３８４倍で希釈した各測定試料を用いて、上述と同様のＥＬＩＳＡ法にて測定を実施した。６Ｇ６の反応性は、次表の通りである。なお、全長(ｆｕｌｌ)、フラグメントｆｒ１、ｆｒ２、ｆｒ３、ｆｒ１‐１、ｆｒ１‐２については、図５、図６を参照されたい。
７Ｆ６の反応性は、次表の通りである。
この結果、第１モノクローナル抗体はｆｒ２,ｆｒ３には反応せず、ｆｒ１、更にはｆｒ１-１に反応することが分かった。認識する反応部位を絞り込むため、更にｆｒ１‐１‐１(配列１-５６番),ｆｒ１‐１‐２(配列３７-９２番)の各配列を有する合成ペプチドを作製して、これを固相とするＥＬＩＳＡを行った。ここでｒ‐ＮＰ/Ａ断片は１μｇ/ｍｌで固相化を行い抗体添加濃度は１０μｇ/ｍｌとして上述と同様のＥＬＩＳＡ法で測定を行った。なお、対照として抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体も同時に測定を行い、本発明のモノクローナル抗体の各ペプチドの活性を抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体活性に対する相対比率で表した(表３、表４参照)。
６Ｇ６の反応性は、次表の通りである。
７Ｆ６の反応性は、次表の通りである。
以上の結果より、第１モノクローナル抗体はｒ‐ＮＰ/Ａの配列のうち、ｆｒ１‐１‐１に反応性を有し、従ってモノクローナル抗体の認識する反応部位はアミノ酸配列１-５６の中に存在することが分かった。Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ/Ａ)、新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)の配列を比較してｒ‐ＮＰ/Ａ、ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ)に共通に含まれて、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ/５５/２００４)、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)のいずれにも含まれていない配列として１６-１８のアミノ酸を見出した。
以上の知見より、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目に相当する部分について、新型インフルエンザに存在するペプチド１(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥ)、季節性インフルエンザＨ１Ｎ１に存在するペプチド２(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ)および季節性インフルエンザＨ３Ｎ２に存在するペプチド３(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤ)の３種のペプチドを合成し、第１モノクローナル抗体６Ｇ６、７Ｆ６の反応部位を調べた。これらのペプチドを固相化する場合には予め終濃度１ｍＭとなるようにスベリン酸ジスクシンイミジル(ＰＩＥＲＣＥ社製)を添加した９６穴に、ペプチドをそれぞれ１０μｇ/ｍｌとなるように添加して固相化を行い、ＥＬＩＳＡ法による測定を行った。陰性コントロールとして正常ラット血清を同時に測定し、この値に対するカットオフインデックスとして求めた。その結果は、次表の通りである。
この結果、第１モノクローナル抗体(ハイブリドーマ６Ｇ６および７Ｆ６)は、いずれも１６番目のアミノ酸がグリシン型であるペプチド１(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥ)と反応し、アスパラギン酸型のペプチド２(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ)およびペプチド３(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤ)とは反応しないことが確認された。
過去のインフルエンザ流行株について第１モノクローナル抗体の認識部位である１６-１８番目のアミノ酸を詳細に調べたところ、ペプチド１にある配列ＧＧＥを有する株は新型Ｈ１Ｎ１および新型Ｈ５Ｎ１が殆どであり、ペプチド２にある配列ＤＧＥを有する株の多くは季節性Ｈ１Ｎ１であった。更にペプチド３にある配列ＤＧＤを有する株のほとんどが季節性Ｈ３Ｎ２であった。したがってこの認識部位を利用することによってＡ型インフルエンザの鑑別が可能であることが強く示唆され、第１モノクローナル抗体は特に新型インフルエンザを季節性のインフルエンザと区別して認識できる有用性があると考えられる。
(第２モノクローナル抗体の詳細)
Ａ型インフルエンザウイルスＮＰに反応するとされるモノクローナル抗体の特異性を上述の各抗原を用いて詳細に検討した。その中に季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物、季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物およびｒ‐ＮＰ／Ａには反応性を示すが、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ由来組換え核蛋白質（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ｒ‐ＮＰ（Ｓｗ））にのみ反応性を示さない特殊なモノクローナル抗体（以下、本明細書において、「第２モノクローナル抗体」という。）を見出すに至った。
Ａ型インフルエンザウイルスＮＰに反応するとされるモノクローナル抗体の特異性を上述の各抗原を用いて詳細に検討した。その中に季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物、季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物およびｒ‐ＮＰ／Ａには反応性を示すが、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ由来組換え核蛋白質（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（ｒ‐ＮＰ（Ｓｗ））にのみ反応性を示さない特殊なモノクローナル抗体（以下、本明細書において、「第２モノクローナル抗体」という。）を見出すに至った。
そこで、このモノクローナル抗体の反応部位を検証するために、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰの４９８アミノ酸の中で、新型Ｈ１Ｎ１インフルエンザ（Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ）に特徴的に認められるＤ２１、Ｄ５３、Ａ１９０、Ｖ３１３、Ｍ３１６、Ｋ３５０、Ｖ３７１、Ｎ４３３、Ｌ４５６の９個の変異のうち、ＮＰの立体構造データを元に、分子の外部表面に出ていて抗原決定基となりそうな、Ｄ５３、Ｖ３１３、Ｍ３１６、Ｖ３７１、およびＮ４３３の５箇所を選んで、それぞれ強毒型Ｈ５Ｎ１型、すなわち、Ｄ５３をＥ、Ｖ３１３をＦ、Ｍ３１６をＩ、ＶＥＴ３７１をＭＥＡ、およびＮ４３３をＴに、それぞれ変更したＮＰ遺伝子を作製し、２９３細胞で発現させ人工ＮＰ抗原蛋白を得た。
第２モノクローナル抗体をマイクロプレートに２μｇ／ｍＬの濃度で結合させ、Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋ（ＰＩＥＲＣＥ社製）にてブロッキングを行った。その後、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ抗原に上記の変異を取り込んだ各抗原５００ｎｇ／ｍＬを５０μＬ添加して１時間反応させて洗浄し、ＨＲＰ（西洋わさびペルオキシダーゼ）の酵素標識を行った抗Ａ型インフルエンザモノクローナル抗体（（米国Ｂｉｏｓ Ｐａｃｉｆｉｃ社製、クローンナンバー：Ａ６００１００４４Ｐ）５０μＬを添加して３０分間反応させた。洗浄したのちに、ＴＭＢ酵素基質溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）５０μＬを加えて１０分間酵素反応を行い、１Ｎ硫酸を５０μＬ添加して反応を停止させた。４５０ｎｍで反応生成物の発色を測定した。
表６及び図１は、この結果を示す。なお、酵素標識に用いた抗Ａ型インフルエンザモノクローナル抗体は、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１型などのいずれのＮＰともに反応することが既に確認されている。
この結果、第２モノクローナル抗体は新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザのＮＰとは反応せず、Ｄ５３をＥ、Ｖ３１３をＦ、ＶＥＴ３７１をＭＥＡ、およびＮ４３３をＴに、それぞれ変えてもその反応性は回復しなかった。ところが、Ｍ３１６をＩに変えることで反応性が改善されることが確認された。この結果は、第２モノクローナル抗体が、Ｎ末端側から３１６番目のアミノ酸がイソロイシン（Ｉ）を含むペプチドを強く認識することを示唆している。
更に、イムノクロマト法を用いて反応性の確認を行った。ニトロセルロースに７Ｆ６抗体を固相化し、金コロイド標識に第２モノクローナル抗体を用いてテストストリップとした。７Ｆ６抗体については前述したように新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザ、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１のいずれのＮＰともに反応することが既に確認されている。この試作品にＤ５３をＥ、Ｖ３１３をＦ、Ｍ３１６をＩ、ＶＥＴ３７１をＭＥＡ、およびＮ４３３をＴに、それぞれ変更した各抗原を１００μＬ添加して１５分反応させた。
図２は、この結果を示す。ここでも、Ｍ３１６をＩに変えることで反応性が大きく改善されることが確認され、第２モノクローナル抗体が、Ｎ末端側から３１６番目のアミノ酸がイソロイシン（Ｉ）を含むペプチドを強く認識することが明らかになった。
以上より、第１モノクローナル抗体についてはＡ型インフルエンザのＮＰにおいて、Ｎ末端から１６−１８番目の配列ＧＧＥを認識し、第２モノクローナル抗体についてはＮ末端から３１６番目のＩを認識していることが確認された。そして第１モノクローナル抗体については、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザおよび強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１に反応性を示し、他の季節性Ｈ１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２には反応しない結果が得られ、第２モノクローナル抗体については季節性Ｈ１Ｎ１，Ｈ３Ｎ２および強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１には反応するが、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍインフルエンザには反応しない結果が得られた。
第１モノクローナル抗体、第２モノクローナル抗体が認識するこれらの各変異部位は、Ａ型インフルエンザの各亜型においてどのようになっているかを、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＩｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅにデータベースとして２０１０年１０月２７日迄に報告されたＡ型インフルエンザ６６３７例について核蛋白のアミノ酸配列を調べてみた。そのうち、該当箇所のいずれかのアミノ酸の分析が出来ていないものが３３０例あったため、これらは除外し６３０７例を対象にした。
配列１６−１８については、主にＤＧＤ、ＤＧＥ、ＧＧＥの３つに分類された。このうち、ＤＧＤの配列は１９４６例中１９１７例（９８．５％）がＨ３Ｎ２であった。また、ＤＧＥの配列は１５７０例中１０３５例（６５．９％）が新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ以外のいわゆる季節性Ｈ１Ｎ１であり、４３１例（２７．５％）がＨ３Ｎ２であった。なお、これらのＨ３Ｎ２はいずれも１９９７年以前の比較的古い株であった。ＧＧＥの配列は２７８７例あり、このうち新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍが２５５７例（９１．７％）、強毒型Ｈ５Ｎ１が１９４例（７．０％）含まれていた。
インフルエンザの型別に分析すると、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍは２５７０例中２５５７例（９９．５％）がＧＧＥの配列をもっており、更にこのうちの２５４６例が３１６番目のアミノ酸がＭ（メチオニン）であった。季節性と考えられるその他のＨ１Ｎ１については１０５５例中１０３５例（９８．１％）がＤＧＥの配列であり、Ｈ３Ｎ２は２３５１例中１９１７例（８２％）がＤＧＤの配列であった。
強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１では１９５例中１９４例（９９．１％）がＧＧＥであり、鳥由来とされるＨ７Ｎ２（１例）、Ｈ７Ｎ３（１例）、Ｈ７Ｎ７（４例）、Ｈ９Ｎ２（９例）についても、全てＧＧＥであった。更に、これらは３１６番目のアミノ酸の全てがＩ（イソロイシン）であった。
同じデータを３１６番目のアミノ酸について分析して表８にまとめた。新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍは２５７０例中２５５９例（９９．６％）がＭ（メチオニン）であり、他の亜型については４例のＶ（バリン）を除いて全てＩ（イソロイシン）であった。
Ａ型インフルエンザのＮＰにおいて、Ｎ末端から１６−１８番目の配列ＧＧＥを認識する第１モノクローナル抗体、およびＮ末端から３１６番目のＩを認識する第２モノクローナル抗体を用いてサンドイッチ免疫測定を行った場合、これら両方の配列を持つ株だけが検出されることになる。従って、上記のＮＰ配列の分析結果より、この検出系によって強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１を１９５例中１９４例（９９．１％）と非常に高い確率で検出できることが分かった。またトリ由来とされるＨ７Ｎ２，Ｈ７Ｎ３，Ｈ７Ｎ７，Ｈ９Ｎ２も検出可能であることが示唆された。
なお、本検出系において、強毒型インフルエンザＨ５Ｎ１およびＨ７Ｎ２，Ｈ７Ｎ３，Ｈ７Ｎ７，Ｈ９Ｎ２以外で反応する株が３２例存在したが、これらは新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍの一部（１１例）およびＨ１Ｎ１（１８例）、Ｈ３Ｎ２（３例）であった。この中にはＡ／Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ／８／１９７６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／３０１／１９７６（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｏｈｉｏ／３５２３／１９８８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｏｈｉｏ／３５５９／１９８８（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｍａｒｙｌａｎｄ／１２／１９９１（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｉｏｗａ／ＣＥＩＤ２３／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｔｈａｉｌａｎｄ／２７１／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓａｓｋａｔｃｈｅｗａｎ／５１３１／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／１７７４／９９（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｏｎｔａｒｉｏ／ＲＶ１２７３／２００５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｏｎｔａｒｉｏ／１２５２／２００７（Ｈ３Ｎ２）などがあり、養豚労働者が直接ブタからヒトに感染した特殊な例などが多く、中には重篤化した症例や死亡例も含まれていた。
以上の結果を踏まえて、Ａ型インフルエンザのＮＰのＮ末端から１６−１８番目の配列ＧＧＥを認識する第１モノクローナル抗体としてラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）、およびＮ末端から３１６番目のＩを認識する第２モノクローナル抗体としてマウスモノクローナル抗体（ＶｉｒｏＳｔａｔ社＃１３７１）を用いてサンドイッチ免疫測定ＥＬＩＳＡ法にて反応性を確認した（ＥＬＩＳＡ（１））。また対照としてＡ型全般に反応するモノクローナル抗体を用いて同様に反応性を確認した（ＥＬＩＳＡ（２））。
ラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２μｇ／ｍＬの濃度になるように調製し、９６穴マイクロプレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウエルに１００μＬずつ加え、４℃で一晩静置し固相化を行った。固相抗体溶液を除去後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を各ウエルに４００μＬ加え、２５℃で３時間静置しブロッキングを行った。１％ＢＳＡ／ＰＢＳを除去後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）にて各ウエルを洗浄後に反応に用いた。対照ＥＬＩＳＡにはマウスモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体Ｍ２１１０１６９（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）を用いて同様に作製した。酵素標識抗体は、モノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体＃１３７１（ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）をマレイミド法を用いてアルカリフォスファターゼで標識して作製した。対照として、同様にモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体Ａ６００１００４４Ｐ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製）を標識した。
反応性の確認には、強毒型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／ＶＬ０２０／０５）由来組換え核蛋白質抗原、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）由来組換え核蛋白質抗原、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物をそれぞれ希釈して用いた。すなわち、抽出液で適当な濃度に希釈した各種インフルエンザＡ型ウイルス抗原を各ウエルに１００μＬ加え、３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した後、アルカリフォスファターゼ標識モノクローナル抗体を０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．５μｇ／ｍＬになるように希釈し、各ウエルに１００μＬ加え、３７℃で１時間反応させた。反応後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、基質液（フェニルリン酸２ナトリウム，４−アミノアンチピリン含有溶液）を各ウエルに１００μＬ加え、３７℃で３０分間反応後、呈色液（メタ過ヨウ素酸ナトリウム含有溶液）を各ウエルに１００μＬ加え、室温で１０分間静置後、マイクロプレートリーダーで４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。表９及び図３は、測定結果を示す。
ＥＬＩＳＡ（１）においては、Ｈ５Ｎ１の抗原に対して明確な反応性が示されたが、他の抗原では殆ど反応性が示されなかった。一方、対照のＥＬＩＳＡ（２）では全ての抗原に反応性が示された。ＥＬＩＳＡ（１）の対照ＥＬＩＳＡ（２）に対する比率をみると、Ｈ５Ｎ１においては２３１．６％であるが、他の抗原ではいずれも２．５％以下となった。
次に本発明者らは、第１、第２モノクローナル抗体を用いてイムノクロマト法の作製法に準じて各種検査試薬の試作品を作製し、その反応性を評価した。本発明の検査試薬は通常のイムノクロマト試薬の構造、形態で達成可能であり、その典型的な形態について、図４を用いて説明する。
図４に示すように、本発明の検査試薬はハウジング１内にセットされ、試料を滴下する検体滴下部２及び判定窓部３を持っている。
ハウジング１内にセットされているテストストリップは、テストストリップの上流部に配置される滴下部４と、ストリップの下流部に配置される吸水ろ紙５と、滴下部４より吸水ろ紙５に至る流れ方向下流側に配置され、第１の抗体を着色粒子で標識した酵素標識粒子を流動可能に保持する標識粒子塗布部６と、標識粒子塗布部６と吸水ろ紙５との間に配置されニトロセルロースメンブレン７上に、第２の抗体が固相される検査部８および検査対照部９を有する。ここで、第１の抗体は、第１、第２モノクローナル抗体の一方であり、第２の抗体は、第１、第２モノクローナル抗体の他方であり、これらは互いに交換可能である。
検査対照部９は目的の検出物質の有無に関わらず発色サインが出現するように作製される。滴下部４はハウジング１の検体滴下部２に合致する位置に設置される。
検査部８及び検査対照部９は、共にハウジングの判定窓部３を通して外部から観察できるようになっている。
テストストリップは一般的に知られるイムノクロマト法の作製方法に準じた。すなわち抗体固相化メンブレンはニトロセルロースメンブレン７上に、ＰＢＳ緩衝液に溶解した第２の抗体をライン状に塗布して乾燥させて作製し検査部８とした。
抗体標識粒子については金コロイド溶液と第一の抗体を混合して結合させ、適当な緩衝液に分散溶解させてガラス繊維ろ紙に塗布して乾燥させて標識粒子塗布部６とした。これらを支持体１０の上にそれぞれが重なり合うように、滴下部４と、給水ろ紙５と共に貼りあわせ、約６ｍｍの短冊状に切断した。
切断されたテストストリップは試料滴下部２、および判定窓部３を有するプラスチック製のハウジング１内に封入した。
（実施の形態１）
好ましい実施の形態１として、第１モノクローナル抗体である、ラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）をメンブレンに固相し、第２モノクローナル抗体である、モノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体＃１３７１（ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）を金コロイド粒子に結合させた。これをイムノクロマト法の作製法に従って組み立てて、プラスチック製のハウジングに入れてキットとした。
好ましい実施の形態１として、第１モノクローナル抗体である、ラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）をメンブレンに固相し、第２モノクローナル抗体である、モノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体＃１３７１（ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）を金コロイド粒子に結合させた。これをイムノクロマト法の作製法に従って組み立てて、プラスチック製のハウジングに入れてキットとした。
（実施の形態２）
また、実施の形態２として実施の形態１の第１、第２モノクローナル抗体を逆にしたものを作製した。すなわち、第２モノクローナル抗体である、モノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体＃１３７１（ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）をメンブレンに固相し、第１モノクローナル抗体である、ラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）を金コロイド着色粒子に結合させた。これをイムノクロマト法の作製法に従って組み立てて、プラスチック製のハウジングに入れてキットとした。
また、実施の形態２として実施の形態１の第１、第２モノクローナル抗体を逆にしたものを作製した。すなわち、第２モノクローナル抗体である、モノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体＃１３７１（ＶｉｒｏＳｔａｔ社製）をメンブレンに固相し、第１モノクローナル抗体である、ラットモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体７Ｆ６（独立行政法人国立国際医療研究センター製）を金コロイド着色粒子に結合させた。これをイムノクロマト法の作製法に従って組み立てて、プラスチック製のハウジングに入れてキットとした。
対照として、一般的に知られる全ての亜型に反応性を有する抗インフルエンザＮＰ抗体を用いた。すなわちマウスモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体Ｍ２１１０１６９（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）をメンブレンに固相し、マウスモノクローナル抗インフルエンザＡウイルス抗体Ａ６００１００４４Ｐ（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ社製）を金コロイド粒子に結合させた。これをイムノクロマト法の作製法に従って組み立てて、プラスチック製のハウジングに入れてキットとした。
これらの試作品を用いて各抗原に対する反応性を調べた。反応性の確認には、強毒型Ｈ５Ｎ１（Ａ／ＶｉｅｔＮａｍ／ＶＬ０２０／０５）由来組換え核蛋白質抗原、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９）由来組換え核蛋白質抗原、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ／５５／２００４）培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス（Ａ／Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９）培養物をそれぞれ抽出液で適当な濃度に希釈して用いた。こうして準備した試料を１００μＬずつ試作品の検体滴下部へ滴下し、１０分後に判定窓部に出現するラインの有無を判定した。表１０は、その結果を示す。
以上の結果より、本発明である実施形態１、および実施形態２は季節性のＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２、新型Ａ／Ｈ１Ｎ１ｐｄｍ株には反応せず、Ｈ５Ｎ１にのみ反応することが示された。また、希釈系列を作って感度を比較したところ対照品と同等以上の実用的な感度を持つことが分かった。
１ ハウジング
２ 検体滴下部
３ 判定窓部
４ 滴下部
５ 吸水ろ紙
６ 標識粒子塗布部
７ ニトロセルロースメンブレン
８ 検査部
９ 検査対照部
１０ 支持体
２ 検体滴下部
３ 判定窓部
４ 滴下部
５ 吸水ろ紙
６ 標識粒子塗布部
７ ニトロセルロースメンブレン
８ 検査部
９ 検査対照部
１０ 支持体
Claims (4)
- Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側１６−１８番目がグリシン−グリシン−グルタミン酸（ＧＧＥ）であるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第１モノクローナル抗体と、
前記Ａ型インフルエンザの核蛋白（ＮＰ）のアミノ酸配列においてＮ末端側３１６番目がイソロイシン（Ｉ）であるインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有する第２モノクローナル抗体とを含む免疫検査試薬。 - ストリップと、
前記ストリップの上流側に配置される滴下部と、
前記ストリップの下流側に配置される吸水ろ紙と、
前記滴下部より前記吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、
前記塗布部と前記吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部とを備える検査装置であって、
前記第１の抗体は、請求項１記載の前記第１モノクローナル抗体及び前記第２モノクローナル抗体の一方であり、前記第２の抗体は、請求項１記載の前記第１モノクローナル抗体及び前記第２モノクローナル抗体の他方である検査装置。 - 請求項１記載の前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体とが、イムノクロマト法により使用されることを特徴とする検査方法。
- 請求項１記載の前記第１モノクローナル抗体と前記第２モノクローナル抗体とが、ＥＬＩＳＡ法により使用されることを特徴とする検査方法。
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