TWI507688B - 流感病毒之凝血素之測定方法 - Google Patents

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Description

流感病毒之凝血素之測定方法
本發明係關於屬於流感病毒抗原的凝血素之測定方法。
流感病毒係屬於正黏液病毒科，因為病毒內部存在的核蛋白質及基質蛋白質的抗原性不同，而被分類為A、B及C型的病毒。每年均出現流行者係A型及B型，特別係A型病毒因為屬於粒子表面抗原的糖蛋白質不同，就凝血素被分類為16種，神經胺糖酸苷酶被分類為9種亞型，屬於容易引發抗原性突變的病毒。所以，必需預測每季節流行並選定疫苗株，且屬於疫苗主要抗原的凝血素測定用試劑亦必需隨株的變更而準備。
[先前技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Mahmood N, Hay AJ., An ELISA utilizing immobilised snowdrop lectin GNA for the detection of envelope glycoproteins of HIV and SIV. J Immunol Methods., 151(1992)9-13
[非專利文獻2]Legastelois I., et al., Avian glycan-specific IgM monoclonal antibodies for the detection and quantitation of type A and B haemagglutinins in egg-derived influenza vaccines. J Virol Methods., 178(2011)129-136
凝血素之高感度且高檢體處理能力的測定法係可例如：使用單株抗體(monoclonal antibody)及多株抗體(polyclonal antibody)的三明治ELISA法，但必需株特異的2種抗體，而對新疫苗製造株或全球大流行病毒的凝血素測定提供單株抗體時，就抗體製作期間而言係屬困難。又，非專利文獻2所記載對鳥類的糖鏈使用特異單株抗體的測定法，因特殊抗體庫會有供應量等問題，因而成為普及性偏低的測定法，且無法使用於利用動物細胞放大的流感病毒之凝血素測定。
緣是，本發明目的在於提供：能構建較使用2種抗凝血素抗體的三明治免疫測定法，可依更短期間進行的測定系統之流感病毒之凝血素的新穎測定方法。
本案發明者等經深入鑽研的結果，發現凝集素會結合於流感病毒的凝血素，而不會與抗體結合，構思到若利用凝集素與抗凝血素抗體將凝血素予以夾三明治，必要的抗凝血素抗體便僅有1種，可構建較使用2種抗凝血素抗體的三明治免疫測定法，依更短期間進行的測定系統，遂完成本發明。
即，本發明所提供的流感病毒之凝血素之測定方法，係包括有：藉由會與流感病毒的凝血素結合但不會與抗體結合的凝集素、以及會與該凝血素產生抗原抗體反應的抗凝血素抗體，將該凝血素予以夾三明治的三明治免疫測定法。
根據本發明，使用1種抗凝血素抗體，便可利用三明治免疫測定，精度佳地測定流感病毒的凝血素。
圖1-1係去活化全粒子病毒經利用以下各界面活性劑施行處理後，再將依蔗糖密度梯度離心分離法進行的分段分析，施行西方墨點法(western blotting；WB)的圖。A：非處理；B：1.0%TritonX-100處理；C：1.0% NP-40處理；D：1.0% Tween80處理；E：1.0%Brij35處理；F.1.0% CHAPS處理；G：1.0% Zwittergent 3-14處理；H：1.0% CTAB處理；I：0.3% SDS處理；J：4.0M尿素處理；K：3.0M鹽酸胍處理。
圖1-2係同上。
圖2係下述實施例所施行利用三明治免疫測定所測定的凝血素濃度與吸光度之關係圖。
如上述，本發明的方法係關於利用：會與流感病毒的凝血素(以下簡稱「凝血素」)結合但不會與抗體結合的凝集素、以及會與該凝血素進行抗原抗體反應的抗凝血素抗體，將該凝血素予以夾三明治之由三明治免疫測定法進行的凝血素之測定方法。
本發明方法所使用的凝集素係會與凝血素結合。有無與凝血素結合係可利用下述參考例2所具體記載的凝集素墨點法(lectin blot)(使經轉印於PVDF膜上的凝血素與標幟凝集素進行反應，再看是否有檢測出標幟)便可確認。又，所謂「不會與抗體結合」係指與構成免疫測定所使用抗體的免疫球蛋白為同種，不會與同類型免疫球蛋白(通常係鼠、兔或羊等的IgG)結合；而不會與從鼠、兔及羊等各動物衍 生的IgG結合係如下述參考例3具體所記載，藉由進行與各動物HRP標幟IgG的ELISA，從所測得吸光度是否未滿陰性對照(空白)平均值的2倍(較佳係未滿1.5倍)便可確認。會與凝血素結合但不會與抗體結合的凝集素較佳例，係可例如：曼陀羅凝集素(DSL)、刺桐凝集素(ECL)及蓖麻凝集素(RCA120)。會與凝血素結合但不會與抗體結合的凝集素係可單獨使用、亦可組合使用2種以上。
本發明的方法中，最好將上述凝集素固定化於固相中之後才施行三明治法。固相係可使用在三明治ELISA等周知三明治免疫測定中所使用的任一者，可例如：盤、管、珠、透膜、凝膠等。材質係可例如：聚苯乙烯、聚丙烯、尼龍、乳膠、玻璃、交聯糊精(cross-linked dextrin)、瓊脂糖、交聯瓊脂糖、聚丙烯醯胺等。
使凝集素吸附於該等固相上的方法，係可採用例如：共價鍵法、物理吸附法、離子結合法及生化特異結合法(例如使生物素鍵結凝集素結合於卵白素(streptavidin)鍵結固相等)等。特別係就從操作簡便的觀點，較佳係物理吸附法及生化特異結合法。
此處，物理吸附法係可例如：將凝集素溶解於含有0.05% Tween20(商品名)的pH7~9緩衝液(例如：三鹽酸緩衝液生理食鹽水、磷酸緩衝液生理食鹽水、碳酸緩衝液等)中，再添加於固相(例如微量盤的孔)中，於室溫下靜置1~2小時左右、或依4℃左右靜置一晚而使其吸附的方法。又，生化特異結合法因為卵白素結合固相(盤或珠)已有市售，因而可例如：將凝集素溶解於含有0.05% Tween20(商品名)的pH7~9緩衝液(例如：三鹽酸緩衝液生理食鹽水、磷酸緩衝液生理食鹽水、碳酸緩衝液等)中，再添加於市售的卵白素結合固相中，於室溫下靜置1~2小時左右、或依4℃左右靜置一晚而使吸附的方法(參照下述實施例)。 物理吸附法、生化特異結合法等與固相進行反應的凝集素濃度，並無特別的限定，通常係最終濃度成為10μg/mL~60μg/mL左右。
在已吸附凝集素的固相表面上會有殘存未吸附之表面部分之情況，若該處吸附檢體中的凝血素、或其他分子種，便會有無法獲得正確測定結果的可能性。所以，在使檢體接觸到固相之前，最好添加阻斷物質以被覆未吸附凝集素的部分。此種阻斷物質係可例如從哺乳動物(諸如牛等)能採取到的血清白蛋白、酪蛋白、乳蛋白(milk protein)、乳酸發酵物、膠原蛋白及該等的分解物質等，又免疫測定時的阻斷物質亦可使用市售物。
本發明方法所使用的抗凝血素抗體係會與流感病毒的凝血素進行抗原抗體反應者，可為單株抗體、亦可為多株抗體。當施行流感病毒的型特異測定時，通常係使用會與各型凝血素產生特異性抗原抗體反應的抗凝血素單株抗體。
抗凝血素抗體通常會經標幟。標幟時所使用的標幟物質係可例如：酵素(過氧化酶、鹼性磷酸酯酶(alkaline phosphatase)、β-半乳糖酶、螢光素酶(luciferase)、乙醯膽鹼脂酶(acetylcholinesterase)等)、同位素(125 I、131 I、3 H等)、螢光色素(發光胺(luminol)、螢光異硫氰酸鹽(fluorescein isothiocyanate；FITC)、繖形酮(umbelliferone)、7-胺基-4-甲基香豆素-3-醋酸等)、化學發光物質、半抗原(hapten)、生物素、抗生物素蛋白(avidin)(例如卵白素等)，但在通常能使用於蛋白質標幟的前提下，並無特別的限定。另外，此處所謂「標幟物質」係亦涵蓋組合使用如生物素之類本身不會直接被檢測出，而是在與該物質具有特異結合能的物質(例如抗生物素蛋白)上，結合可檢測標幟之物質的方法中，所使用之物質。
前述抗體的標幟方法係可從適於標幟物質的公知方法(例如：當對酵素進行標幟時便為戊二醛法、過碘酸交聯法、順丁烯二醯亞胺交聯法、碳二醯亞胺法、活化酯法(activated ester)等，而當利用放射性同位物質進行標幟時，便為氯胺T法(chloramine T)、乳過氧化酶法(lactoperoxidase)等)之中適當選擇。另外，因為標幟抗凝血素抗體針對各種型均已有市售，因而亦可使用市售物。
本發明的方法通常係使上述固相化凝集素、與標幟抗凝血素抗體、及含有流感病毒之凝血素的檢體進行反應，經洗淨後，測定在固相上所結合的標幟。
使用本發明方法的檢體，係在含有流感病毒之凝血素的前提下，可為含有流感病毒粒子、亦可為從其之中所萃取的凝血素。當萃取凝血素時，不管凝血素的存在樣式均可測定，不管係存在於病毒粒子中、或依游離凝血素形式存在均可測定，且測定精度亦高，故屬較佳。在凝血素萃取時，可使用陽離子性或陰離子性界面活性劑(以下將二者統稱「離子性界面活性劑」)。離子性界面活性劑的較佳例係可例如：十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鋰(LiDS)、溴化十六烷基三甲銨(CTAB)、氯化十六烷基三甲銨(CTAC)及氯化十六烷基吡啶鎓(HPC)，更佳係溴化十六烷基三甲銨(CTAB)。離子性界面活性劑係可單獨使用、亦可組合使用2種以上。
離子性界面活性劑的處理條件較佳係在檢體中依成為最終濃度0.1~2.0%的方式添加離子性界面活性劑，於37℃下靜置或攪拌1~2小時左右，便可從病毒粒子萃取出凝血素，惟並不僅侷限於此。
固相化凝集素、檢體及標幟抗凝血素抗體係可同時進行反應；亦可先使固相化凝集素與檢體進行反應，經洗淨後，在使標幟 抗凝血素抗體進行反應；亦可先使檢體與標幟抗凝血素抗體進行反應而形成免疫複合體(immune complex)後，再與固相化凝集素進行反應。各反應係可在室溫下進行30分鐘~120分鐘左右。反應系統中，凝血素的最終濃度範圍通常係1ng/mL~1μg/Ml左右，標幟抗凝血素抗體的最終濃度範圍通常係0.2~50μg/mL左右。
待反應後，洗淨固相，測定固相上所結合的標幟。洗淨液係可例如經添加Tween(商品名)系界面活性劑等界面活性劑的緩衝液(例如：磷酸緩衝液、磷酸緩衝液生理食鹽水、三鹽酸緩衝液、三鹽酸緩衝液生理食鹽水)等。標幟物質的檢測方法係依照所使用標幟物質而有所不同，例如當標幟物質係使用生物素的情況，便經由卵白素等，使過氧化酶等酵素結合於含有標幟物質之生物素的複合體，再添加該酵素之基質的四甲基聯苯胺等發色物質及過氧化氫水，利用吸光度變化測定由酵素反應所生成的生成物發色程度之方法等。又，當標幟物質係使用螢光物質、化學發光物質的情況，可例如測定經反應後的溶液螢光或發光之方法等。
另外，亦可取代標幟抗凝血素抗體，改為使尚未標幟的抗凝血素抗體進行反應，更進一步使標幟抗免疫球蛋白抗體(Immunoglobulin)進行反應，經洗淨後，再測定固相上所結合的標幟(間接抗體法)。原本間接抗體法因為抗原抗體反應的次數會多1次，因而當要求迅速檢查的情況，如前述，最好為使用標幟抗凝血素抗體的直接法。
本發明的測定方法中，檢體中的凝血素濃度係使用預先已知濃度的凝血素標準液，針對凝血素與標幟物質檢測結果之關係製作檢量線，再利用使用相關未知濃度檢體的檢測結果與前述檢量線的 方法便可定量。
本發明測定方法的較佳一形態係如下所說明。首先使凝集素吸附(被覆)於固相上。較佳的吸附方法係如上述。
經上述吸附後，最好添加含有脫脂乳(skimmed milk)等阻斷物質的緩衝液，於室溫下靜置30~2小時左右，俾被覆未吸附凝集素的部分。
當檢體中的凝血素存在於病毒粒子中的情況，在檢體中依成為最終濃度0.1~2.0%的方式添加CTAB，於37℃下靜置或攪拌1~2小時左右，便從病毒粒子萃取出凝血素。
其次，在已吸附凝集素的固相中，添加檢體或經凝血素萃取處理過的檢體，例如於室溫下靜置或攪拌30~120分鐘的適當時間，便使上述凝集素結合著凝血素。
然後，將該已結合複合體的固相，利用含有Tween系界面活性劑等的緩衝液(例如三鹽酸緩衝液生理食鹽水、磷酸緩衝液生理食鹽水等)等洗淨液施行洗淨。又，在前述固相中，添加經利用標幟物質進行標幟過的抗凝血素抗體、或經利用抗凝血素抗體與標幟物質進行標幟過的抗抗凝血素抗體，例如於室溫中靜置或攪拌30~120分鐘，便使凝血素結合著抗凝血素抗體(或抗凝血素抗體-抗抗凝血素抗體)。藉由此項操作，便使形成由固相-凝集素-凝血素-抗凝血素抗體(或固相-凝集素-凝血素-抗凝血素抗體-抗抗凝血素抗體)構成的複合體。接著，檢測前述複合體的標幟物質而測定凝血素。
另外，針對凝血素標準品濃度與標幟物質檢測結果(例如吸光度)的關係製成檢量線，再使用相關未知試料的檢測結果與上述檢量線，定量未知試料中的凝血素。
[實施例]
以下，針對本發明利用實施例進行具體說明，惟本發明並不受該等任何限定。
參考例1 凝血素萃取用界面活性劑之研究
在經受精蛋放大，且利用超過濾、蔗糖密度梯度離心分離法及β-丙內酯施行精製及去活化的A/Brisbane/59/2007株去活化全粒子病毒中，依最終濃度成為1.0%的方式，添加TritonX-100(商品名、Sigma-Aldrich Japan公司製)、NP-40(商品名、Nacalai Tesque公司製)、Tween80(商品名、和光純藥工業公司製)、Brij35(商品名、和光純藥工業公司製)、CHAPS(商品名、同仁化學研究所公司製)、及Zwittergent 3-14(商品名、Calbiochem公司製)及CTAB(和光純藥工業公司製)，再依最終濃度成為0.3%的方式添加SDS，且依最終濃度成為4.0M及3.0M的方式添加尿素(MP Bio Japan公司製)及鹽酸胍(MP Bio Japan公司製)，於37℃下靜置60分鐘而使進行反應。在反應溶液中依成為最終濃度20%的方式添加蔗糖，將其利用分餾密度20~50w/w%的蔗糖密度梯度離心分離法分餾為17分段。將各分段溶液、與SDS-PAGE用樣品緩衝液(8%SDS、40%甘油/250mM Tris-HCl Buffer pH6.8)施行等量混合，於100℃下靜置5分鐘而使進行反應。反應溶液利用12.5%聚丙烯醯胺凝膠(ATTO公司製ePAGEL)施行電泳，利用半乾式轉印裝置(ATTO公司製)施行對PVDF膜的轉印反應。經轉印後的PVDF膜浸漬於75mL阻斷緩衝液(含10%脫脂乳的TBS)中，於室溫下進行4小時的遮蔽反應(masking reaction)。經反應後，利用適當量的TBS對PVDF膜施行3次洗淨，然後將PVDF膜浸漬於抗HA抗體溶液(SRD(Single radial immunodiffusion)用抗血清)中，於4℃下進行約16小時反應(一次抗體反應)。待一次抗體反應後，利用含Tween20(商品名)的TBS將PVDF膜洗淨計5次，添加HRP標幟抗羊抗體(Bethyl公司製)溶液，於室溫下進行60分鐘的反應(二次抗體反應)。經二次抗體反應後，利用含Tween20(商品名)的TBS洗淨PVDF膜計5次，利用Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(商品名、Thermo Fisher Scientific公司製)施行凝血素的檢測。檢測係使用LAS-3000(商品名、GE Healthcare公司製)。
藉此，如圖1所示，若非處理的去活化全粒子病毒、屬於蛋白質變性劑的尿素、及鹽酸胍處理，僅在高密度區域才有檢測出凝血素；而若屬於非離子性界面活性劑的TritonX-100(商品名)、NP-40(商品名)、Tween80(商品名)及Brij35(商品名)、以及屬於兩性界面活性劑的CHAPS(商品名)及Zwittergent 3-14(商品名)，則從高密度起至低密度均有的各種密度均有檢測到凝血素。另一方面，因為利用屬於離子性界面活性劑的CTAB、SDS處理，在低密度側的凝血素帶會收束，因而得知離子性界面活性劑處理最適用於凝血素的可溶化‧萃取處理。
參考例2 各種凝集素與凝血素的結合
利用MDCK細胞及受精蛋，製備A/California/7/2009(H1N1)、A/Brisbane/59/2007(H1N1)、A/Victoria/210/2009(H3N2)、A/Uruguay/716/2007(H3N2)、B/Brisbane/60/2008(B型維多利亞株)及B/Florida/4/2006(B型山形株)等6株病毒溶液。將所製備的病毒、與SDS-PAGE用樣品緩衝液(8%SDS、40%甘油/250mM Tris-HCl Buffer pH6.8)等量混合，於100℃下靜置5分鐘而進行反應。反應溶液利用12.5%聚丙烯醯胺凝膠(ATTO公司製ePAGEL)施行電泳，再利用半乾式轉印裝置(ATTO公司製)施行朝PVDF膜的轉印反應。經轉印後的PVDF膜浸漬於75mL阻斷緩衝液(含10%脫脂乳的TBS)中，於室溫下進行4小時的遮蔽反應。待反應後，利用適當量的TBS洗淨PVDF膜計3次，在室溫下進行與各種生物素化凝集素：VECTOR LABORATORIES公司製)的反應4小時。經與凝集素進行反應後，利用Tween20(商品名)含有TBS洗淨PVDF膜計5次，添加HRP標幟卵白素(Thermo Fisher Scientific公司製)溶液，並於室溫下進行60分鐘反應。經反應後，利用含有Tween20(商品名)的TBS洗淨PVDF膜計5次，再利用Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(商品名、Thermo Fisher Scientific公司製)檢測凝血素與凝集素的複合體。檢測係使用LAS-3000(商品名、GE Healthcare公司製)。
結果，RCA120、DSL及ECL均對源自使用當作顯現基材用的MDCK細胞及受精蛋任一者而製備病毒的凝血素，可確認到有結合。
參考例3 各種凝集素與IgG的結合
在經卵白素塗覆的微量盤(Nunc公司製)中，依100μL/孔添加將利用0.05% Tween20(商品名)/三鹽酸緩衝液生理食鹽水(TBST)，依最終濃度成為30μg/mL的方式進行稀釋的各生物素化凝集素，於25℃下進行2小時反應。經凝集素反應後，各孔利用Wash buffer(TBST)300μL洗淨5次。接著，在各孔中添加300μL的2.5%脫脂乳/TBST，於25℃下施行1小時的阻斷，然後，將各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次， 在各孔中添加100μL的經0.5%脫脂乳/TBST或0.5% BSA/TBST稀釋之HRP標幟化IgG抗體(鼠抗體：BioSS公司製Mouse Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody(H+L)，HRP Conjugated、兔抗體：Bethyl Laboratories公司製Sheep IgG-heavy and light chain antibody、羊抗體：Bethyl Laboratories公司製Rabbit IgG-heavy and light chain antibody)，於25℃下進行1小時反應。經抗體反應後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，在各孔中添加TMB溶液(和光純藥工業公司製)200μL，於25℃下進行20分鐘反應後，於各孔中添加1mol/L硫酸(和光純藥工業公司製)50μL而停止反應。待反應停止後，測定450nm的吸光度。
結果如表1所示。如表1所示，RCA120、DSL及ECL係當使與鼠、兔及羊IgG進行反應時的吸光度，均未滿陰性對照(空白)值的2倍，得知並未與鼠、兔及羊IgG產生反應。
另外，RCA120、DSL及ECL在上述參考例2中均確認到與凝血素結合，因而可認為即便使用該等任一凝集素，均可利用三明治免疫測定進行凝血素測定。
實施例1 三明治免疫測定
在購自NIBSC(The National Institute for Biological Standards and Control，英國國家生物標準和控制研究院)的SRD試驗用標準抗原小玻璃瓶(vial)中，添加1mL水，靜置5分鐘後充分攪拌(50μg HA/mL)。 將50μL的NIBSC標準品(50μg HA/mL)與50μL的1.0%CTAB進行混合，經充分攪拌後(25μg HA/mL)，於37℃下靜置2小時。接著，稀釋10倍而製備得2.5μg HA/mL的凝血素溶液。稀釋該標準液，調製3.13、6.25、12.5、25、50、100及250ng HA/mL的凝血素溶液。
在經卵白素塗覆的微量盤(Nunc公司製)中，依100μL/孔添加經利用0.05% Tween20(商品名)/三鹽酸緩衝液生理食鹽水(TBST)，依最終濃度成為30μg/mL方式進行稀釋的各生物素化凝集素，於25℃下進行2小時反應。待凝集素反應後，各孔利用Wash buffer(TBST)300μL洗淨5次。接著，在各孔中添加300μL的2.5%脫脂乳/TBST，於25℃下進行1小時的阻斷，然後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，所製備的各濃度凝血素溶液在各孔中添加100μL，於25℃下進行2小時反應。待反應後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，再於各孔中添加經利用0.5%脫脂乳/TBST依成為最終濃度2μg/mL的方式進行稀釋過的HRP標幟抗凝血素抗體(Sino Biological公司製2009H1N1 Influenza(Swine Flu)附加Hemagglutinin ELISA kit)溶液100μL，於25℃下進行1小時反應。經與抗凝血素抗體進行反應後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，在各孔中添加TMB溶液(和光純藥工業公司製)200μL，於25℃下進行20分鐘反應後，在各孔中添加1mol/L硫酸(和光純藥工業公司製)50μL，而停止反應。待反應停止後，測定450nm的吸光度。
表2及圖2所示係依照使用RCA120、DSL及ECL的ELISA所進行的凝血素測定結果，任一凝集素均可確認到凝血素(HA)濃度與吸光度具有良好相關性。所以，利用凝血素結合凝集素及1種抗凝血素抗體便可成為高感度的凝血素測定法。
實施例2 與SRD試驗測定值間之相關性確認
在A/California/07/2009(X-179A)A/Victoria/361/2011(IVR-165)及B/Wisconsin/01/2010(BX-41A)的標準流感HA抗原(單向幅射免疫擴散試驗用國立感染症研究所)各小玻璃瓶中，添加1mL水，靜置5分鐘後充分攪拌。將50μL的標準流感HA抗原溶液、與50μL的1.0%CTAB進行混合，經充分攪拌後，於37℃下靜置2小時。接著，稀釋10倍便製備得凝血素溶液。稀釋該標準液，製備1.95、3.91、7.81、31.3、62.5及125ng HA/mL的凝血素溶液，將其當作檢量線用標準溶液。又，利用單向幅射免疫擴散試驗(SRD試驗)而賦予HA濃度的製造工程液(A/California/07/2009(X-179A)株、A/Victoria/361/2011(IVR-165)株及B/Wisconsin/01/2010(BX-41A)株)，亦與上述檢量線用標準溶液同樣地施行CTAB處理及稀釋操作，做為測定檢體。
在經卵白素塗覆的微量盤(Nunc公司製)中，依100μL/孔添加經利用0.05% Tween20(商品名)/三鹽酸緩衝液生理食鹽水(TBST)，依最終濃度成為30μg/mL方式進行稀釋的生物素化ECL，於25℃下進行2小時反應。待凝集素反應後，各孔利用Wash buffer(TBST)300μL洗淨5次。接著，在各孔中添加300μL的2.5%脫脂乳/TBST，於25℃下施行1小時的阻斷，然後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，在各孔中添加所製備的檢量線用標準溶液及測定檢體100μL，於25℃下進行2小時反應。待反應後，各孔利用Wash buffer 300μL洗淨5次，將經0.5%脫脂乳/TBST稀釋2500倍的各株參考抗血清(單向幅射免疫擴散試驗用、國立感染症研究所)溶液，當作抗凝血素抗體並添加100μL於各孔中，於25℃下進行1小時反應。待與抗凝血素抗體進行反應後，各孔利用Wash buffer300μL洗淨5次，在各孔中添加經0.5%脫脂乳/TBST稀釋2500倍的HRP標幟抗羊IgG抗體(Bethyl Laboratories公司)100μL，於25℃下進行1小時反應。待抗羊IgG抗體反應後，在各孔中添加TMB溶液(和光純藥工業公司製)200μL，於25℃下進行20分鐘反應後，在各孔中添加1mol/L硫酸(和光純藥工業公司製)50μL，而停止反應。待反應停止後，測定450nm的吸光度。
表3、表4及表5所示係A/H1N1亞型(A/California/07/2009 X-179A)、A/H3N2亞型(A/Victoria/361/2011 IVR-165)、及B型(B/Wisconsin/01/2010 BX-41A)的SRD試驗測定結果、使用凝血素結合凝集素的ELISA測定結果、及ELISA測定值對SRD試驗測定值的比例。如表所示，本案ELISA測定值對SRD試驗測定值的比例係A/H1N1亞型為92.2~111%、A/H3N2亞型為96.9%~132%、B型為80.4~91.6%，可確認到良好的相關性。所以，藉由使用凝血素結合凝集素的本案ELISA，可獲得與屬於疫苗效力試驗的SRD試驗結果間具有相關性之測定值。
[表3]

Claims (7)

  1. 一種流感病毒之凝血素之測定方法，係包括有：藉由會與流感病毒的凝血素結合但不會與抗體結合的凝集素、以及會與該凝血素產生抗原抗體反應的抗凝血素抗體，將該凝血素予以夾三明治的三明治免疫測定法。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中，上述凝集素係固定化於固相上；上述抗凝血素抗體係經標幟，藉由上述凝集素與上述凝血素，測定在固相上所結合的該標幟抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中，上述凝集素係從蓖麻凝集素、曼陀羅凝集素及刺桐凝集素所構成群組中選擇至少1種。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，上述凝血素係將流感病毒利用陽離子性或陰離子性界面活性劑施行處理而萃取。
  5. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之方法，其中，上述陽離子性或陰離子性界面活性劑係從十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨及氯化十六烷基吡啶鎓所構成群組中選擇至少1種。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，上述陽離子性或陰離子性界面活性劑係從十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鋰、溴化十六烷基三甲銨、氯化十六烷基三甲銨及氯化十六烷基吡啶鎓所構成群組中選擇至少1種。
  7. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，上述界面活性劑係溴化十六烷基三甲銨。
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