TWI411685B - 腸病毒檢測及純化方法、大量增加腸病毒之方法、及腸病毒疫苗之製造方法 - Google Patents

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Description

腸病毒檢測及純化方法、大量增加腸病毒之方法、及腸病毒疫苗之製造方法
本發明係關於一種腸病毒檢測及純化方法、大量增加腸病毒之方法、及腸病毒疫苗之製造方法，尤指一種利用單醣則可輕易檢測及純化腸病毒、大量增加腸病毒、及製作腸病毒疫苗之方法。
腸病毒係屬小RNA病毒科(Picornaviridae)之腸病毒屬(Enterovirus)，其中尤以腸病毒71型所引發之症狀最為嚴重。腸病毒71型係為一正單股核醣核酸病毒，其易感染三歲以下孩童並造成手口足症(Hand-foot and mouth disease)或皰疹性咽峽炎(Herpangina)。但在不明的原因下，腸病毒71型感染有時會造成嚴重的中樞神經系統疾病，包括腦炎(encephalitis)、腦脊髓炎(meningoencephalitis)、無菌性腦膜炎(aseptic meningitis)或急性無力肢體麻痺症(acute flaccid paralysus,AFP)。其中，腦幹腦炎(brainstem encephalitis)常會併發肺水腫及心臟衰竭，並進而造成病人的死亡。
自從腸病毒71型於1969年被分離出來後，已陸續在世界各大洲造成廣泛的流行，並引起嚴重的腦炎及類小兒麻痺症候群。台灣於1998年爆發腸病毒71型大流行時，共有78名孩童腸病毒71感染後併發嚴重的神經性休克和神經性肺水腫而死亡。因此，腸病毒71型被認為是繼小兒麻痺病毒後重要的嗜神經性腸病毒。
由於腸病毒71型所併發之中樞神經系統疾病相當嚴重，因此能早期檢測出孩童是否感染到腸病毒71型以及早進行治療，則可大幅提升治癒率且大幅降低致死率。因此，目前極需發展出一種檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法，以期能快速且簡便的檢測病患是否感染腸病毒，而提早進行治療。
此外，除了早期檢測出是否感染腸病毒以及早治癒外，亦可使用腸病毒疫苗以降低受到腸病毒感染之風險。目前，已有許多國家及公司致力於腸病毒71型疫苗之開發，疫苗形式主要包括有DNA疫苗、次單位疫苗、類病毒顆粒疫苗、及完整顆粒病毒疫苗。其中，尤以完整顆粒病毒疫苗之功效最為顯著。然而，製作完整顆粒病毒疫苗時，需大量培養及純化腸病毒，以大量生產腸病毒疫苗，進而供多數孩童進行接種預防。因此，目前亦極需發展出一種可大量培養腸病毒且快速純化腸病毒之方法，以期能用於腸病毒疫苗的製作上。藉此，以供應大量之腸病毒疫苗於醫療市場上。
本發明之主要目的係在提供一種檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法，俾能快速且簡單的篩選出樣品中是否含有腸病毒。
本發明之另一目的係在提供一種純化腸病毒之方法，俾能以簡單的方法達到快速且大量純化腸病毒之目的。
本發明之再一目的係在提供一種大量增加腸病毒之方法，俾能大量培養腸病毒以用於腸病毒相關研究或腸病毒疫苗之製作或開發上。
本發明之更一目的係在提供一種腸病毒疫苗之製造方法，俾能大量製作出完整顆粒病毒形式之腸病毒疫苗。
為達成上述目的，本發明係提供一種檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法，其包括下列步驟：(A)提供一檢體樣品、及一固定載體，其中固定載體之表面係連接有一單醣，且單醣具有與腸病毒連接之結合特性；(B)將檢體樣品與固定載體接觸；(C)移除未與固定載體連接之檢體樣品；(D)提供一檢測單元，將檢測單元與固定載體接觸，則檢測單元係與連接於固定載體之檢體樣品連接；以及(E)量測檢測單元之訊號，其中當檢測單元之訊號存在時，代表檢體樣品中含有腸病毒。
於本發明之檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法中，係藉由腸病毒可與單醣特異性結合的特性，而達到簡單且快速檢測樣品中是否含有腸病毒之目的。同時，由於本發明之檢測方法中所使用之單醣取得方便且價格便宜，故視為一種符合經濟效益且成本較低之腸病毒檢測方法。
此外，於本發明之檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法中，於步驟(A)中，單醣可直接連接於固定載體之表面；或單醣可透過一外源凝集素與固定載體之表面連接。再者，本發明之檢測方法中所使用之檢測單元可為一抗腸病毒抗體、或一連接有螢光或磷光之單醣。較佳為，檢測單元係包括一抗腸病毒抗體。更佳為，檢測單元更包括一HRP結合抗體，其中HRP結合抗體係與抗腸病毒抗體連接。當使用抗腸病毒抗體做為檢測單元時，因抗體與腸病毒之專一性結合，可使檢測結果更加準確。
另一方面，本發明亦提供一種純化腸病毒之方法，包括下列步驟：(A)提供一固定載體，其中固定載體之表面係連接有一單醣；(B)將一含有腸病毒之病毒溶液與固定載體混合，使腸病毒與連接於固定載體上之單醣結合；(C)清洗固定載體，以移除病毒溶液中未與固定載體上之組成物；以及(D)提供一單醣溶液，以將與固定載體上之單醣結合之腸病毒從固定載體上分離。
於本發明之純化腸病毒之方法中，由於腸病毒與單醣間具有特異性結合的特性，故當含有腸病毒之病毒溶液與固定載體混合時，可使腸病毒連接於固定載體上。而後，再透過一高濃度之單醣溶液進行競爭反應，則可將腸病毒從固定載體上分離。因此，本發明係提供一種純化方法，其係使用取得容易且便宜之單醣，而達到快速純化腸病毒之目的。
此外，於本發明之純化腸病毒之方法中，於步驟(A)中，單醣可直接連接於固定載體之表面；或單醣可透過一外源凝集素與固定載體之表面連接。
另一方面，本發明更提供一種大量增加腸病毒之方法，包括下列步驟：(A)提供一宿主細胞、以及一腸病毒；(B)於一含有單醣之培養基下，混合宿主細胞及腸病毒以感染宿主細胞；(C)培養該腸病毒感染之宿主細胞；以及(D)取出宿主細胞中之腸病毒。
於本發明之大量增加腸病毒之方法中，當在病毒吸附(absorption)在宿主細胞的階段下(即，步驟(B))加入單醣時，可增加腸病毒和宿主細胞受體的結合(或吸附)，並增強病毒的複製，進而達到增加腸病毒之產量。因此，以本發明之方法，可大量增加腸病毒之複製，進而大量培養腸病毒以用於腸病毒相關研究或腸病毒疫苗之製作或開發上。
此外，於本發明之大量增加腸病毒之方法中，於步驟(C)中，經腸病毒感染之宿主細胞可於一含有單醣之培養基下培養。因此，本發明之方法所使用之單醣，除了可幫助腸病毒之吸附(即，步驟(B))外，更可在腸病毒進入宿主細胞後，增加病毒的複製(即，步驟(C))。於本發明中，單醣之含量可介於0.03 M至1.0 M之間。
再者，於本發明之大量增加腸病毒之方法中，步驟(D)中，可透過將宿主細胞破壞以取出宿主細胞中之腸病毒，並得到一含有腸病毒之溶液；並搭配本發明上述之純化腸病毒之方法，以純化宿主細胞中之腸病毒。換言之，本發明之大量增加腸病毒之方法中，步驟(D)可包括下列步驟：(D1)提供一固定載體，其中固定載體之表面係連接有一單醣；(D2)破壞宿主細胞，以得到一含有腸病毒之病毒溶液；(D3)將病毒溶液與固定載體混合，使腸病毒與連接於固定載體上之單醣結合；(D4)清洗固定載體，以移除該病毒溶液中未與固定載體上之組成物；以及(D5)提供一單醣溶液，以將與固定載體上之單醣結合之腸病毒從固定載體上分離。此外，於步驟(D1)中，單醣可直接連接於固定載體之表面；或單醣可透過一外源凝集素與固定載體之表面連接。
另一方面，本發明另提供一種腸病毒疫苗之製造方法，包括下列步驟：(A)提供一宿主細胞、以及一腸病毒；(B)於一含有單醣之培養基下，混合宿主細胞及腸病毒以感染宿主細胞；(C)培養經腸病毒感染之該宿主細胞；(D)取出宿主細胞中之腸病毒；以及(E)去活化由宿主細胞中取出之腸病毒。
於本發明之腸病毒疫苗之製造方法中，係結合上述大量增加腸病毒之方法、以及純化腸病毒之方法(即，步驟(A)-(D))，並搭配去活化腸病毒之製程，以快速且大量的製作出腸病毒疫苗。
此外，於本發明之腸病毒疫苗之製造方法中，步驟(E)之去活化步驟，可採用本技術領域常用之病毒去活化製程。例如：可使用甲醛溶液去活化宿主細胞中取出之腸病毒。
於本發明之上述方法中，腸病毒係為A型腸病毒。較佳為，腸病毒係為腸病毒71型(EV71)、或克沙奇病毒A16(Cox A16)。更佳為，腸病毒係為腸病毒71型。此外，於本發明之上述方法中，各方法所使用之單醣可為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺(N-acetyl-galactosamine)。較佳為，單醣係為葡萄糖。再者，於本發明之上述方法中，各方法所使用之外源凝集素可半乳糖凝集素(galectin-1)、刀豆素(Con A)、扁豆凝集素(LCA)、麥胚凝集素(WGA)、雙花扁豆凝集素(DBA)、或蓖麻凝集素(RCA)。較佳為，外源凝集素係為半乳糖凝集素。
 細胞及病毒培養
本發明共使用兩種細胞株，分別為SK-N-SH及RD細胞。其中，SK-N-SH細胞係為人類神經母細胞癌(Human neuroblastoma cell line)，而RD細胞係為人類橫紋肌肉瘤細胞(Human mesenchymal rhabdomyosarcoma cell line)，兩細胞均以100 IU/ml青黴素(penicillin)、100 mg/ml鏈黴素(streptomycin)、含10%胎牛血清的DMEM培養基培養。
此外，腸病毒71型(EV71)係感染RD細胞，並於含有醣類或不含有醣類之DMEM培養基培養。以下實驗，如無特別說明，均是以含有醣類之DMEM培養基培養之腸病毒進行試驗。
實驗例1-腸病毒71型病毒結合各種醣類結合試驗
在此，係以酵素免疫分析法(ELISA)分析腸病毒71型與單醣結合的特性。首先，將腸病毒71型加入已固定抗腸病毒71型抗體(anti-EV71 antibody)的96孔盤(Genesis,台灣)，以抗體先抓住腸病毒71型病毒。而後，加入經生物素(biotin)標記之單醣聚合物，即葡萄糖-聚丙烯醯胺(glucose-PAA(polyacrylamide))、甘露糖-PAA(mannose-PAA)、半乳糖-PAA(galactose-PAA)、N-乙醯半乳糖胺-PAA(N-acetyl-galactosamine-PAA,GalNAc-PAA)、N-乙醯葡萄糖胺-PAA(N-acetyl-glucosamine-PAA,GlcNAc-PAA)於室溫下反應2小時，並以鏈黴親和素-HRP(streptoavidin-HRP)呈色(R&D System,Minneapolis,MN)，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值。結果係如圖1A-1C所示。
如圖1A所示，相較於控制組(未加入任何病毒)或加入106 PFU的量之登革熱病毒，發現加入以106 PFU的量之腸病毒71型病毒可與葡萄糖、半乳糖及N-乙醯半乳糖胺結合。
此外，如圖1B所示，當以加入不同量(從106 PFU至102 PFU以10倍依序稀釋)之腸病毒71型病毒進行測試時，發現隨著腸病毒71型病毒量增加，與葡萄糖、半乳糖及N-乙醯半乳糖胺的結合也隨之增加。尤其是，葡萄糖與腸病毒71型之結合，即使在低腸病毒病毒量下(102 PFU)，即可觀察到明顯的結合情形。於圖1B中，控制組係指未加入任何病毒之吸光值。
再者，如圖1C所示，於腸病毒71型與醣類結合時，若所使用之醣類係溶於一PBS溶液、或一含有1:1000稀釋之抗EV71單株抗體mAb979之PBS溶液時，可發現腸病毒與葡萄糖、半乳糖及N-乙醯半乳糖胺的結合可被抗EV71單株抗體mAb979所抑制。此結果顯示，單醣和腸病毒71型病毒之結合係具有特異性。於圖1C中，控制組係指未加入任何醣類之吸光值。
實驗例2-腸病毒71型病毒結合各種醣類結合試驗
本實驗例係與實驗例1相同，以酵素免疫分析法分析腸病毒71型與單醣結合的特性。首先，將葡萄糖-PAA、甘露糖-PAA、半乳糖-PAA、N-乙醯半乳糖胺-PAA、N-乙醯葡萄糖胺-PAA先固定在96孔盤，加入106 PFU量的腸病毒71型病毒後，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體(HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody)呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值。結果係如圖1D所示。
如圖1D所示，相較於未加入腸病毒71型病毒之控制組，葡萄糖、甘露糖、半乳糖、N-乙醯半乳糖胺、及N-乙醯葡萄糖胺均可與腸病毒71型特異的結合。
此外，為檢測不同腸病毒是否可對醣類進行特異性結合，係先將葡萄糖-PAA及半乳糖-PAA固定在96孔盤，再加入106 PFU量的不同腸病毒(EV71、CA16(克沙奇病毒A16,Cox A16)、CB3(克沙奇病毒B3,Cox B3)、CB2(克沙奇病毒B2,Cox B2))後，加入抗EV71抗體、抗CA16抗體、抗CB3抗體、抗CB2抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值。結果係如圖1E及圖1F所示。在此，控制組係指未加入任何病毒之吸光值。
其中，圖1E係顯示葡萄糖可特異的結合A型腸病毒，如EV71、或CA16；且圖1F亦顯示半乳糖可特異的結合A型腸病毒。此外，如圖1E及圖1F所示，特別是EV71對葡萄糖或半乳糖之結合能力最佳。然而，無論是葡萄糖或是半乳糖，對其他的腸病毒(如CB2及CB3)均沒有結合能力。
因此，綜合實驗例1及2之實驗結果，如圖1A至1F所示，葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺對於A型腸病毒，特別是對於EV71型病毒之結合能力最強。據此，使用上述單醣，可達到辨識A型腸病毒之效果。
實驗例3-腸病毒71型病毒結合各種凝集素結合試驗
在此，係以酵素免疫分析法(ELISA)分析腸病毒71型與凝集素結合的特性。首先，將腸病毒71型病毒以106 PFU的量加入已固定不同凝集素如Con A、LCA、WGA、DBA、RCA的96孔盤，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值，如圖2A所示。結果顯示，腸病毒71型病毒與凝集素有結合的特性。於圖2A中，控制組係指未加入腸病毒之吸光值。
此外，亦將以含有葡萄糖以及未含有葡萄糖的培養基所培養出來的腸病毒71型病毒，以106 PFU的量加入已固定不同凝集素如Con A、LCA、WGA、DBA、RCA的96孔盤，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值，如圖2B所示。於圖2B中，控制組係指未加入腸病毒之吸光值。結果顯示，未含有葡萄糖的培養基培養出來的腸病毒71型病毒失去結合凝集素的能力，顯示培養基中的葡萄糖或其他單醣類在腸病毒71型顆粒產生過程中會先結合，而結合在腸病毒上之醣類會進一步參與和凝集素的結合。因此，可以確認腸病毒71型病毒與凝集素確實透過醣類進行結合。
除了上述凝集素外，本實驗例更發現哺乳類的凝集素如半乳糖凝集素(galectin-1)亦可腸病毒特異性結合。首先，半乳糖凝集素固定在96孔盤，加入不同量(從106 PFU至104 PFU以10倍依序稀釋)腸病毒71型病毒培養後，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值，如圖2C所示。結果顯示，腸病毒71型病毒可以結合半乳糖凝集素，且隨著病毒量的增加，結合於半乳糖凝集素之病毒量也增加。於圖2C中，控制組係指未加入腸病毒之吸光值。
另外，於固定有半乳糖凝集素之96孔盤內加入106 PFU量之不同的病毒，包括腸病毒71型(EV71)、克沙奇病毒A16(CA16)、流行性感冒病毒(Flu)、登革熱病毒(DV)培養後，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值，如圖2D所示。結果顯示，半乳糖凝集素僅可特異的結合A型腸病毒(EV71及CA16)，而無法與流行性感冒病毒及登革熱病毒。於圖2D中，控制組係指未加入腸病毒之吸光值。
再者，將以含有葡萄糖以及未含有葡萄糖的培養基所培養出來的腸病毒71型病毒，以106 PFU的量加入已固定半乳糖凝集素之96孔盤，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值，如圖2E所示。結果顯示，未含有葡萄糖的培養基培養出來的腸病毒71型病毒失去結合半乳糖凝集素的能力，顯示培養基中的葡萄糖或其他單醣類在腸病毒71型顆粒產生過程中會先結合，而結合在腸病毒上之醣類會進一步參與和半乳糖凝集素的結合。此結果係與圖2B所示之結果相符合。
綜合實驗例3之實驗結果，如圖2A至2E所示，可以確認腸病毒與凝集素(包括哺乳類的凝集素)，確實透過醣類進行結合。因此，當偵測檢體中是否存在有腸病毒時，可將凝集素與單醣搭配，進而提升偵測腸病毒之效果。
實驗例4-以醣類競爭腸病毒71型病毒與凝集素之結合
在此，係以酵素免疫分析法(ELISA)分析。首先，將腸病毒71型病毒以不同濃度之半乳糖、葡萄糖、N-乙醯葡萄糖胺、蔗糖、及甘露糖，於4℃下預培養2小時。而後，將預培養之腸病毒，加入固定有半乳糖凝集素之96孔盤，再加入抗腸病毒71型病毒的抗體，並以HRP-山羊抗老鼠IgG抗體呈色，由酵素免疫分析儀檢測OD450 的吸光值。結果如圖3所示。如圖3結果所示，當使用大量的葡萄糖、半乳糖、甘露糖、或N-乙醯葡萄糖胺，均可競爭性地部份抑制腸病毒71型病毒和半乳糖凝集素的結合。其原因在於，醣類會先和凝集素結合，故導致凝集素與腸病毒間之結合被抑制。
因此，當使用醣類純化腸病毒時，可先將單糖或凝集素固定於一固定載體上，如96孔盤，而後加入含有腸病毒之溶液，最後透過高濃度之醣類溶液，則醣類溶液中之單醣可與固定載體上之單醣或凝集素競爭，進而將病毒從固定載體上分離。
實驗例5-單醣增加腸病毒71型病毒之複製
於本實驗例中，係使用病毒斑分析(plaque assay)，以了解單醣對於腸病毒複製之關係。
首先，將SK-N-SH細胞(2 x 105 細胞/孔)(宿主細胞)接種於24孔盤中，培養16-18小時形成單層細胞，將腸病毒71型病毒分別加入不同量(0.0625 M,0.125 M,及0.25 M)葡萄糖、半乳糖或N-乙醯半乳糖胺後感染宿主細胞，於37℃下培養1小時後，再添加1.6%甲基纖維素(methylcellulose)、2% FBS，繼續於37℃下培養72小時。最後，以結晶紫染劑(crystal violate)染色，觀察病毒斑的形成，而量化結果係如圖4A所示，其中縱軸係顯示病毒效價(virus titer)。如圖4A結果顯示，無論是葡萄糖、半乳糖或N-乙醯半乳糖胺，均可達到增加腸病毒71型病毒的產量之效果。
為了更進一步瞭解單醣是在病毒吸附(absorption)在宿主細胞的階段，還是進入細胞之後幫助病毒複製，係進行下述試驗。
首先，將腸病毒71型病毒分別加入不同量(0.0625 M,0.125 M,及0.25 M)葡萄糖、半乳糖或N-乙醯半乳糖胺後感染宿主細胞，於37℃下培養1小時後，以PBS清洗未附著於24孔盤中之病毒，並去除培養基中之醣類。而後，在未含有葡萄糖的培養基(添加有1.6%甲基纖維素、2% FBS)，繼續於37℃下培養72小時。最後，以結晶紫染劑染色，觀察病毒斑的形成，而量化結果係如圖4B所示。如圖4B結果所示，無論是葡萄糖、半乳糖或N-乙醯半乳糖胺，均可以增加腸病毒71型病毒的產量。此結果表示，單醣可以增加腸病毒71型病毒的吸附，進而增強病毒的複製。
此外，先讓腸病毒71型病毒在有葡萄糖的培養基下吸附在宿主細胞，於37℃下培養1小時後，以PBS清洗未附著於24孔盤中之病毒。而後，在含有0.25 M的葡萄糖或半乳糖的培養基(添加有1.6%甲基纖維素、2% FBS)，繼續於37℃下培養72小時。最後，以結晶紫染劑染色，觀察病毒斑的形成，而量化結果係如圖4C所示。如圖4C結果所示，單糖可以增加腸病毒71型病毒的產量，不只在吸附的階段(absorption)增加和宿主細胞受體的結合，增加病毒感染的量，也可以在病毒進入細胞之後，增加病毒的複製。
因此，當欲大量增加腸病毒時，可於病毒吸附宿主細胞階段、或病毒進入細胞之後，以單醣進行培養。藉此，除了可幫助病毒的吸附，亦可幫助病毒的複製。
實驗例6-葡萄糖增加腸病毒71型病毒的穩定性
將腸病毒71型病毒於DMEM培養基、未含有葡萄糖的DMEM培養基、或未含有葡萄糖的DMEM培養基培養後再外加葡萄糖，於37℃下進行培養，並使用病毒斑分析檢驗腸病毒71型病毒穩定性。結果如圖5A及圖5B所示，顯示含有葡萄糖的培養基所培養出來的腸病毒71型病毒穩定性最佳，其次為未含有葡萄糖的培養基培養後再外加葡萄糖的腸病毒71型病毒，最差為未含有葡萄糖的培養基培養出來的腸病毒71型病毒。由上述結果可知，葡萄糖可以增加腸病毒71型病毒的穩定性。
實驗例6-腸病毒71型病毒疫苗製作
首先，EV71於含有葡萄糖之培養基中大量培養，並收取病毒液。經離心去除細胞碎片後，與含有42% PEG8000及6% NaCl混合，置於4℃冰箱中隔夜。離心後，移除上清液，並以TES緩衝溶液回溶菌體，再次離心移除上清液，並以TES緩衝溶液進行多次萃取，則可製得一病毒溶液。而後，將病毒溶液與連接有葡萄糖之固定載體混合，並以葡萄糖梯度，藉由葡萄糖競爭，可將病毒從固定載體上分離，以純化此病毒溶液。最後，將溶液置換成PBS，則完成病毒純化。
純化後之病毒加入0.1%(v/v)甲醛溶液(formaldehyde,37%)，於37℃下作用2小時，以去活化腸病毒。最後，將去活化之腸病毒與鋁鹽佐劑(alum hydroxide,最終濃度：660 μg/ml)混合，並作用半小時，則可製得一腸病毒疫苗。
上述實施例僅係為了方便說明而舉例而已，本發明所主張之權利範圍自應以申請專利範圍所述為準，而非僅限於上述實施例。
圖1A-1C係本發明實驗例1之腸病毒71型病毒結合各種醣類結合試驗結果，其中「*」表示T-TEST統計之p<0.05。
圖1D-1F係本發明實驗例2之腸病毒71型病毒結合各種醣類結合試驗結果，其中「*」表示T-TEST統計之p<0.05。
圖2A-2E係本發明實驗例3之腸病毒71型病毒結合各種凝集素結合試驗結果，其中「*」表示T-TEST統計之p<0.05。
圖3係本發明實驗例4之以醣類競爭腸病毒71型病毒與凝集素之結合試驗結果，其中「*」表示T-TEST統計之p<0.05。
圖4A-4C係本發明實驗例5之單醣對腸病毒71型病毒之複製影響之試驗結果，其中「*」表示T-TEST統計之p<0.05。
圖5A-5B係本發明實驗例6之腸病毒71型病毒穩定性之試驗結果。

Claims (16)

  1. 一種檢測檢體樣品中腸病毒存在之方法，其中該腸病毒係A型腸病毒，包括下列步驟：(A)提供一檢體樣品、及一固定載體，其中該固定載體之表面係連接有一單醣，且該單醣具有與腸病毒連接之結合特性，其中該單醣係直接連接於該固定載體之表面；或該單醣係透過一外源凝集素與該固定載體之表面連接；且該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺(N-acetyl-galactosamine)；(B)將該檢體樣品與該固定載體接觸；(C)移除未與該固定載體連接之檢體樣品；(D)提供一檢測單元，將該檢測單元與該固定載體接觸，則該檢測單元係與連接於該固定載體之該檢體樣品連接；以及(E)量測該檢測單元之訊號，其中當該檢測單元之訊號存在時，代表該檢體樣品中含有腸病毒。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該A型腸病毒係為腸病毒71型(EV71)、或克沙奇病毒A16(Cox A16)。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該外源凝集素係為半乳糖凝集素(galectin-1)、刀豆素(Con A)、扁豆凝集素(LCA)、麥胚凝集素(WGA)、雙花扁豆凝集素(DBA)、或蓖麻凝集素(RCA)。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該檢測單元係包括：一抗腸病毒抗體。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之方法，其中該檢測單元更包括：一HRP結合抗體，其中該HRP結合抗體係與該抗腸病毒抗體連接。
  6. 一種純化腸病毒之方法，其中該腸病毒係A型腸病毒，包括下列步驟：(A)提供一固定載體，其中該固定載體之表面係連接有一單醣，其中該單醣係直接連接於該固定載體之表面；或該單醣係透過一外源凝集素與該固定載體之表面連接；且該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺；(B)將一含有腸病毒之病毒溶液與該固定載體混合，使腸病毒與連接於該固定載體上之單醣結合；(C)清洗該固定載體，以移除該病毒溶液中未與該固定載體上之組成物；以及(D)提供一單醣溶液，以將與該固定載體上之單醣結合之腸病毒從該固定載體上分離。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該A型腸病毒係為腸病毒71型(EV71)、或克沙奇病毒A16(Cox A16)。
  8. 如申請專利範圍第6項所述之方法，其該外源凝集素係為半乳糖凝集素(galectin-1)、刀豆素(Con A)、扁豆凝集素(LCA)、麥胚凝集素(WGA)、雙花扁豆凝集素(DBA)、或蓖麻凝集素(RCA)。
  9. 一種大量增加腸病毒之方法，包括下列步驟：(A)提供一宿主細胞、以及一腸病毒，其中該腸病毒係為A型腸病毒； (B)於一含有單醣之培養基下，混合該宿主細胞及該腸病毒以感染該宿主細胞，其中該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺；(C)於一含有單醣之培養基下，培養經該腸病毒感染之該宿主細胞，其中該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺；以及(D)取出該宿主細胞中之腸病毒。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該A型腸病毒係為腸病毒71型(EV71)、或克沙奇病毒A16(Cox A16)。
  11. 一種腸病毒疫苗之製造方法，包括下列步驟：(A)提供一宿主細胞、以及一腸病毒，其中該腸病毒係為A型腸病毒；(B)於一含有單醣之培養基下，混合該宿主細胞及該腸病毒以感染該宿主細胞，其中該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺；(C)培養經該腸病毒感染之該宿主細胞；(D)取出該宿主細胞中之腸病毒，其包括(D1)至(D5)之步驟：(D1)提供一固定載體，其中該固定載體之表面係連接有一單醣，其中該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺；(D2)破壞該宿主細胞，以得到一含有腸病毒之病毒溶液； (D3)將該病毒溶液與該固定載體混合，使腸病毒與連接於該固定載體上之該單醣結合；(D4)清洗該固定載體，以移除該病毒溶液中未與該固定載體上之組成物；(D5)提供一單醣溶液，以將與該固定載體上之單醣結合之腸病毒從該固定載體上分離；以及(E)去活化由該宿主細胞中取出之腸病毒。
  12. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中該A型腸病毒係為腸病毒71型(EV71)、或克沙奇病毒A16(Cox A16)。
  13. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中於步驟(C)中，經該腸病毒感染之該宿主細胞係於一含有單醣之培養基下培養。
  14. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中於步驟(E)中，係使用甲醛溶液去活化該宿主細胞中取出之腸病毒。
  15. 如申請專利範圍第13項所述之製造方法，其中該單醣係為葡萄糖、半乳糖、或N-乙醯半乳糖胺。
  16. 如申請專利範圍第11項所述之製造方法，其中於步驟(D1)中，該單醣係直接連接於該固定載體之表面；或該單醣係透過一外源凝集素與該固定載體之表面連接。
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