CN113209275A - Stch在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,公开应激伴侣分子(Stress and Chaperon,STCH)在制备抗黄病毒属病毒的功能产品中的应用。本发明通过对黄病毒的抑制实验证实了STCH过表达载体对黄病毒属病毒具有显著的抑制作用,表明将STCH过表达载体应用于制备抗黄病毒属病毒感染的药物,有望预防和治疗黄病毒属病毒感染引起的疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,更具体地,涉及STCH在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用。
背景技术
黄病毒(Flavivirus)属于黄病毒科黄病毒属,是一大群直径40~70nm呈20面体立体对称的有包膜的单正链RNA病毒。该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染,过去曾归类为虫媒病毒。目前对人类影响较大的包括登革病毒(Dengue Virus,DENV)、寨卡病毒(Zika Virus,ZIKV)、日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)和黄热病毒(Yellow Fever Virus,YFV)等。
登革病毒(DENV)感染所引起的疾病包括:一般性发热、温和的登革热(dengueFever,DF),以及严重的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)和登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS),主要在非洲、美洲、东南亚等热带、亚热带地区流行。寨卡病毒(ZIKV)感染后,仅20%的人出现症状,症状较轻,主要表现为发热、皮疹、肌肉和关节痛、全身乏力以及头痛,但孕妇感染ZIKV可导致新生儿小头畸形(Microcephaly),成人感染ZIKV可导致吉兰-巴雷综合症(Guillain–Barrésyndrome,GBS)。日本脑炎病毒(JEV)主要在东亚、东南亚、南亚、西印度以及西太平洋地区流行,有较强的季节性。大多数人感染日本脑炎病毒后不发病为隐形感染,并可以获得对其的免疫力。西尼罗河病毒(WNV)在血清分类学上同属于日本脑炎病毒血清型,病毒表面抗原位点和部分相同,感染也可以造成脑炎。黄热病病毒(YFV)盛行在许多非洲和南美国家,虽然有有效的疫苗,但每年还会导致20万例感染和3万例死亡病例。
目前尚无有效的预防和治疗黄病毒属病毒感染的药物,为解决黄病毒属病毒感染及传播带来的危害,亟需开发一种新的有效抗黄病毒属病毒感染的试剂或药物。因此,针对黄病毒的抗病毒活性分子的发现具有重要的生物学研究意义和实践意义,为开发治疗黄病毒的有效药物提供支持。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述问题,首先提供STCH在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现:
STCH在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用。
应激伴侣分子(Stress and Chaperon,STCH/HSPA13/HSP70-13)属于热休克蛋白70家族中的一员,在HSP70家族中十分保守,主要对细胞质中钙离子应激起反应。HSP70和STCH(HSPA13)是热休克蛋白家族的两个不同成员,二者是不同的两个蛋白;由大量研究文献总结得出,体内的HSP 70蛋白存在一定的动态平衡,在特定情况以及细胞的免疫情况发挥帮助病毒复制或抑制病毒复制的不同作用。本发明通过对黄病毒属病毒的研究发现,过表达STCH可有效抑制黄病毒属病毒的复制,提示STCH具有抑制黄病毒复制的效果,有望应用于黄病毒属病毒感染的综合治疗中。
优选的,所述黄病毒属病毒包括DENV,JEV,YFV,ZIKV。
更优选的,所述黄病毒属病毒为DENV和ZIKV。
本发明研究发现,在黄病毒属病毒易感的细胞中过表达STCH,然后再与黄病毒属病毒接触,病毒发生了以下变化:(1)病毒的基因转录水平下降;(2)病毒的翻译水平下降;(3)病毒的滴度下降。
因此,在实际应用中,可以通过在细胞中过表达STCH,以增强细胞对病毒的抑制能力,达到抗病毒的目的。
更优选的,所述功能产品用于抑制黄病毒属病毒蛋白的转录和翻译。
或者,更优选的,所述功能产品用于抑制黄病毒属病毒复制。
或者,更优选的,所述功能产品用于抑制黄病毒属子代病毒的产生。
优选的,所述功能产品包括以下任意一种:
(i)以STCH转录本为靶序列,且能够激活STCH基因表达产物的表达或基因转录的核苷酸、慢病毒或腺病毒等基因治疗产品;
(ii)含有STCH互补序列,且能够在转入体内后形成促进STCH基因表达产物的表达或基因转录的激活分子的构建体;
(iii)激活STCH基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体等基因改造后的细胞治疗药物如CAR-T。
作为一种优选的实施方式,上述应用具体可以是:构建过表达STCH的重组子,并转染细胞,成功制备过表达STCH的细胞,该细胞具有抗黄病毒属病毒的作用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明通过抑制实验发现在细胞中过表达激活STCH后对黄病毒属病毒感染具有良好的抑制作用,从本质上证明了STCH在治疗黄病毒属病毒感染疾病中具有广范的应用背景。该发明能够为临床治疗由DENV、ZIKV、JEV、YFV等黄病毒感染引起的疾病提供良好的候选药物靶点,具有十分良好的应用前景。
附图说明
图1显示在DENV、JEV、YFV、ZIKV四种黄病毒感染A549细胞后STCH基因转录水平升高;图中*代表P<0.05、**代表P<0.01、***代P<0.001;
图2显示在黄病毒属病毒易感的A549细胞中过表达STCH后感染黄病毒(ZIKV、DENV、JEV、YFV),黄病毒的基因转录水平降低图;其中,Vector代表对照组,STCH为过表达STCH的A549细胞感染黄病毒组;
图3显示在A549细胞中过表达STCH后分别感染ZIKV、DENV致病毒转录和翻译水平降低;右下图中,ctl代表对照组,即正常A549细胞感染DENV;
图4显示在A549细胞中过表达STCH后分别感染DENV、ZIKV致病毒滴度降低;其中,Vector代表对照组,STCH为过表达STCH的A549细胞感染黄病毒组。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是,对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明,但并不构成对本发明的限定。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 黄病毒感染A549细胞后STCH基因转录水平测定实验
1、检测样品的收集:
收集ZIKV、DENV、JEV和YFV感染后的A549细胞的总RNA样本。
2、检测方法,具体包括如下步骤:
(1)A549细胞按照2×105个/ml的密度接种12孔板,培养过夜。
(2)第二天弃掉培养液,用1×PBS洗两遍。以DENV感染为例:以MOI=1感染细胞,吸附1h,每隔15min摇匀一次。1h后弃掉吸附液,用无FBS DMEM洗两遍,加入1ml维持液,培养48h。
(3)收集0h、24h和48h的细胞总RNA,Quantitative Real-time PCR(Q-RT-PCR)检测STCH基因的转录水平。
3、实验结果:
结果如图1示,STCH在ZIKV、DENV、JEV、YFV四种黄病毒感染后基因转录水平呈时间依赖性升高。提示STCH可能在黄病毒感染中具有重要作用。
实施例2 A549细胞过表达STCH后黄病毒基因转录水平测定实验
1、检测样品的收集:
收集过表达STCH后感染DENV、JEV、YFV和ZIKV的A549细胞总RNA样本。
2、检测方法,具体包括如下步骤:
(1)A549细胞按照2×105个/ml的密度接种12孔板,培养过夜。
(2)第二天弃掉培养液,用1×PBS洗两遍。以DENV感染为例:构建了带HA标签的STCH过表达质粒(HA-STCH,1ug/ul),转染A549细胞,然后病毒以MOI=1感染细胞,培养24h。
(3)收集细胞总RNA,Q-RT-PCR检测病毒的转录水平。
3、实验结果:
结果如图2示,在过表达STCH后感染黄病毒DENV、JEV、YFV和ZIKV,黄病毒的基因转录水平均显著降低。提示STCH可能对黄病毒感染具有抵抗作用。
实施例3 A549细胞过表达STCH后黄病毒病毒蛋白转录和基因翻译水平测定实验
1、检测样品的收集:
收集过表达STCH后感染ZIKV、DENV的A549细胞总RNA样本和总蛋白样本。
2、检测方法,具体包括如下步骤:
(1)A549细胞按照2×105个/ml的密度接种12孔板,培养过夜。
(2)第二天弃掉培养液,用1×PBS洗两遍。以DENV感染为例:构建了带HA标签的STCH过表达质粒(HA-STCH,1ug/ul),转染A549细胞,然后病毒以MOI=1感染细胞,培养24h。
(3)收集细胞总RNA和总蛋白,Q-RT-PCR、Western Blot检测病毒蛋白的转录和翻译水平。
3、实验结果:
结果如图3所示,在过表达STCH后感染黄病毒ZIKV、DENV,ZIKV-E蛋白、DENV-NS1蛋白的基因转录水平和蛋白翻译水平均显著降低。提示STCH通过抑制病毒结构蛋白和非结构蛋白的转录和翻译来发挥抗病毒作用。
实施例4 A549细胞过表达STCH后黄病毒滴度测定实验
1、检测样品的收集:
收集过表达STCH后感染DENV、ZIKV的A549细胞培养上清。
2、检测方法,具体包括如下步骤:
(1)A549细胞按照2×105个/ml的密度接种12孔板,培养过夜。
(2)第二天弃掉培养液,用1×PBS洗两遍。以DENV感染为例:构建了带HA标签的STCH过表达质粒(HA-STCH,1ug/ul),转染A549细胞,然后病毒以MOI=1感染细胞,培养24h。
(3)收集A549细胞培养上清,PFU法检测病毒滴度:将Vero细胞按照密度9×104个/ml接种于12孔板培养过夜。第二天待细胞长至90%密度后,用无FBS的DMEM培养基将病毒液进行连续10倍稀释,培养吸附1h,每15min摇一次。吸附完后,弃去病毒液,每孔补加2ml甲基纤维素与含4%胎牛血清的DMEM 1:1混合,培养3~4d,显微镜观察空斑的形成。4d左右,把甲基纤维素弃去,每孔加1ml 4%甲醛固定1h吸走甲醛,用自来水缓慢冲洗,滴加结晶紫至没过孔底,5分钟后冲干净结晶紫,计算空斑形成个数,计算PFU。
3、实验结果:
结果如图4所示,A549细胞中过表达STCH后分别感染DENV、ZIKV,病毒滴度水平明显降低。提示STCH通过抑制病毒复制来发挥抗病毒作用。
本领域技术人员应该理解的是,本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言,本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是,本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案,且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
Claims (5)
1.STCH在制备抗黄病毒属病毒感染的功能产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述黄病毒属病毒包括登革病毒、寨卡病毒、日本脑炎病毒、黄热病毒。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述功能产品用于抑制病毒结构蛋白的转录和翻译,和/或抑制病毒在细胞中产生子代病毒。
4.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述功能产品用于抑制病毒非结构蛋白的转录和翻译,和/或抑制病毒在细胞中产生子代病毒。
5.根据权利要求1至4任一项所述的应用,其特征在于,所述功能产品包括以下任意一种:
(i)以STCH转录本为靶序列,且能够激活STCH基因表达产物的表达或基因转录的核苷酸、慢病毒或腺病毒;
(ii)含有STCH互补序列,且能够在转入体内后形成促进STCH基因表达产物的表达或基因转录的激活分子的构建体;
(iii)激活STCH基因序列后的免疫相关细胞、其分化细胞或构建体。
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