CN105503979B - 一种化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用，本发明提供了一种具有式(I)所示结构的化合物，本发明所述的化合物能够用于治疗手足口病。

Description

一种化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种化合物及其制备方法和应用。

背景技术

热毒宁注射液，国药准字Z20050217，为江苏康缘药业股份有限公司研发的原中药二类新药，其处方为青蒿、金银花、栀子，辅料为聚山梨酯80，热毒宁注射液在外感风热所致感冒、流感、咳嗽、上呼吸道感染等疾病的临床治疗中应用广泛，其作用迅速、效果显著。

发明内容

本发明提供了一种化合物及其制备方法和应用，通过对热毒宁注射液进行研究，得到了一种化合物，能够用于治疗手足口病。

本发明提供了一种式(I)结构的化合物，

本发明还提供了一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)将热毒宁注射液经大孔吸附树脂柱进行色谱分离，用水、第一质量浓度的醇的水溶液，第二质量浓度的醇的水溶液进行洗脱，收集第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的洗脱液，

所述醇为C1～C6的醇，

所述第一质量浓度的醇的水溶液为10％～40％的醇的水溶液，

所述第二质量浓度的醇的水溶液为85％～98％的醇的水溶液；

2)将步骤1)得到的洗脱液浓缩，得到第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的浓缩物；

3)将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，即得式(I)结构的化合物；

优选的，所述大孔吸附树脂柱用大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂、DA-201大孔吸附树脂、HPD-750大孔吸附树脂或ADS-17大孔吸附树脂。

优选的，所述第一质量浓度的醇的水溶液为25％～30％的醇的水溶液；所述第二质量浓度的醇的水溶液为90％～95％的醇的水溶液。

优选的，所述步骤3)具体为：

3-1)将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集洗脱液中含有分子量为802的化合物的洗脱液；

3-2)浓缩步骤3-1)得到的含有分子量为802的化合物的洗脱液，将浓缩物再次进行分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，浓缩，即得式(I)结构的化合物。

优选的，所述步骤3-1)的色谱分离用分离柱为凝胶色谱柱。

优选的，所述凝胶色谱柱用凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G-25、Sephadex G-30。

优选的，所述步骤3-2)中的再次分离用分离方法为硅胶柱色谱法分离、制备型高效液相色谱法分离或凝胶柱色谱法分离。

本发明还提供了一种式(I)所示化合物在制备治疗手足口病药物中的应用，

本发明还提供了一种用于治疗手足口病的药物，包括式(I)所示化合物，

与现有技术相比，本发明提供了一种具有式(I)所示的化合物，且本发明所述的化合物能够用于治疗手足口病。

附图说明

图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；

图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；

图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-NMR谱；

图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³C-NMR谱；

图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的DEPT-135谱；

图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱；

图7为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱；

图8为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-¹H COSY谱；

图9为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的NOESY谱。

具体实施方式

本发明提供了一种式(I)结构的化合物，

本发明还提供了一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)将热毒宁注射液经大孔吸附树脂柱进行色谱分离，用水、第一质量浓度的醇的水溶液，第二质量浓度的醇的水溶液进行洗脱，收集第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的洗脱液，

所述第一质量浓度的醇的水溶液为10％～40％的醇的水溶液，

所述第二质量浓度的醇的水溶液为85％～98％的醇的水溶液；

2)将步骤1)得到的洗脱液浓缩，得到第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的浓缩物；

3)将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，即得式(I)结构的化合物；

按照本发明，将热毒宁注射液经大孔吸附树脂柱进行色谱分离，用用水、第一质量浓度的醇的水溶液，第二质量浓度的醇的水溶液进行洗脱，收集第二质量浓度的醇的水溶液洗脱的洗脱液；所述热毒宁注射液为本领域技术人员公知的热毒宁注射液，所述大孔吸附树脂柱用大孔吸附树脂优选为HP-20大孔吸附树脂、DA-201大孔吸附树脂、HPD-750大孔吸附树脂或ADS-17大孔吸附树脂，更优选为HP-20大孔吸附树脂；所述色谱分离用洗脱优选为依次用水、第一质量浓度的醇的水溶液，第二质量浓度的醇的水溶液进行洗脱； 所述第一质量浓度的醇的水溶液为10％～40％的醇的水溶液，优选为质量浓度为25％～30％的醇的水溶液，更优选为质量浓度为30％的醇的水溶液；所述第二质量浓度的醇的水溶液为85％～98％的醇的水溶液，优选为质量浓度为90％～95％的醇的水溶液，更优选为质量浓度为95％的醇的水溶液，所述醇优选为甲醇、乙醇或丙醇。

按照本发明，将步骤1)得到的洗脱液浓缩，得到第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的浓缩物；本发明对浓缩的方法没有特殊限定，本领域公知的浓缩方法均可，优选采用减压的方法进行浓缩，除去醇，得到浓缩物。

按照本发明，将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，即得式(I)结构的化合物；所述色谱分离方法优选为硅胶柱色谱法分离、制备型高效液相色谱法分离或凝胶柱色谱法分离，更优选为凝胶柱色谱法分离，所述凝胶色谱柱用凝胶优选为Sephadex LH-20、Sephadex G-25、Sephadex G-30；分离的洗脱液优选为甲醇溶液。

其中，本发明为了使分离的更充分，本发明所述步骤3)优选为：

3-1)将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集洗脱液中含有分子量为802的化合物的化合物的洗脱液；

3-2)浓缩步骤3-1)得到的含有分子量为802的化合物的洗脱液，将浓缩物再次进行分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，浓缩，即得式(I)结构的化合物。

其中，所述步骤3-1)所述色谱分离优选使用凝胶色谱柱进行分离，收集洗脱液中含有分子量为802的化合物的洗脱液；所述分离用洗脱液优选为甲醇溶液；所述凝胶色谱柱用凝胶优选为Sephadex LH-20、Sephadex G-25、Sephadex G-30；所述洗脱液中分子量为802的化合物的监测用本领域公知的方法即可，优选采用LC-MS进行监测。

浓缩步骤3-1)得到的含有分子量为802的化合物的洗脱液，将浓缩物再次进行分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，浓缩，即得式(I)结构的化合物；所述再次分离的方法优选为硅胶柱色谱法、制备型高效液相色谱法或凝胶柱色谱法，更优选为硅胶柱色谱法或制 备型高效液相色谱法；所述制备型高效液相色谱法用色谱分离的洗脱液优选为乙腈水溶液，所述乙腈与水的体积比优选为(20～80)：(80～20)；所述制备型高效液相色谱法用柱子本领域公知的用于制备型高效液相色谱的柱子即可；所述洗脱液中分子量的监测优选使用高分辨质谱，收集阳离子模式下的主要离子片段为820.8983[M+NH₄]⁺，25.3529[M+Na]⁺，阴离子模式下的主要离子片段为：801.8561[M-H]^-，837.3288[M+Cl]^-，847.3596[M+HCOOH-H]^-。

为了使得到的产品纯度更高，本发明优选还将得到的式(I)结构的化合物进行再次纯化，所述再次纯化的方法优选为色谱法纯化或重结晶；所述色谱法纯化的色谱优选为凝胶色谱；所述洗脱的溶剂优选为甲醇、甲醇水(60％)、乙醇；所述重结晶的溶剂优选为乙酸乙酯、甲醇水(40％)、丙酮。

本发明对得到的化合物进行了结构鉴定，结果参见图1～图9，图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-NMR谱；图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³C-NMR谱；图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的DEPT-135谱；图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱；图7为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱；图8为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的 ¹H-¹H COSY谱；图9为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的NOESY谱。

具体的，通过图1的质谱分析可以得知其m/z为801.3538[M-H]^-(理论计算值为m/z801.3550)，进而确定化合物分子式为C₃₈H₅₈O₁₈，不饱和度为15；通过将式(I)结构的化合物在阳离子模式下得到质谱，结果参见图2，从图2可以得知以下峰，m/z 825.3501[M+Na]⁺、m/z 820.3939[M+NH4]⁺和两个主要离子片段峰(m/z 641.3164和m/z 479.2634)，这两个离子片段分别来自于一个己糖的断裂丢失(m/z 162)和两个己糖的断裂丢失(m/z 324),根据上述分析可推测此化合物结构上具有两个己糖的结构。

同时根据图4可知，¹³C NMR显示具有38个碳信号，结合图5给出的DEPT谱和图6给出的HSQC谱的数据可以推测得到有5个甲基(其中1个 为连氧碳)、7个亚甲基(1个烯碳和连个连氧碳)、21个次甲基碳(13个连氧碳)和5个季碳(1酯羰基、1烯碳和3个连氧碳)，此外，根据¹H-NMR谱谱图数据可知，本发明所述的化合物中含有一组偕二甲基[δ_H 1.16(s,3H)andδ_H1.22(s,3H)]、1个甲氧基[δ_H 3.62(s,3H)],2个连在仲碳上的甲基[δ_H 0.85(d,J＝6.5Hz,3H)，重叠],1组端烯双键信号[δ_H 5.67(m,1H)]、δ_H 5.28(d,J＝17.5Hz,1H)和δ_H 5.24(d,J＝10.6Hz,1H)],1个烯氢信号[δ_H 7.40(s,1H)]和两个典型的β-葡萄糖基上的端基氢信号[δ_H 4.07(d,J＝7.6Hz,1H)和δ_H 4.51(d,J＝7.8Hz,1H)]，通过以上核磁波谱数据显示可以得知，本发明所述的化合物一部分类似于一个倍半萜糖苷类物质(后面称A部分)，另一部分类似于裂环环烯醚萜苷secoxyloganin(后面称B部分)，B部分与裂环环烯醚萜苷secoxyloganin在核磁数据上唯一显著的差别在于secoxyloganin碳谱数据中的C-7’(δ_C172.7)消失了而本发明的B部分核磁数据多出了一组连氧的次甲基信号[δ_H 5.67(m,1H),δ_C101.0]，由此可推本发明的B部分结构为secoxyloganin结构中C-7’的羰基被一连氧的次甲基取代的结构。

而且通过图3～图5的¹HNMR、¹³C NMR和DEPT谱图显示A部分显示出21个碳信号(4个甲基碳、4个亚甲基碳、10个次甲基碳和3个季碳)，和典型的一组β-葡萄糖基的6个碳信号，除了β-葡萄糖基的核磁数据以外，另外15个碳的信号与愈创木烷型倍半萜7α,10α-epoxyguaiane-4α,11-diol的核磁信号相似，进一步的，通过二维核磁共振谱¹H-¹H COSY(图8)和HMBC(图7)对得到的倍半萜糖苷类结构进一步解析，在HMBC谱中，H₃-11与C-1、C-2和C-10相关，H₃-15与C-4、C-5和C-6相关，H₃-13和H₃-14与C-12相关、H₂-6与C-8相关以及β-葡萄糖基上的端基氢与C-2相关构建了B部分结构。A部分为一个愈创木烷型倍半萜糖苷的结构。

虽然在HMBC谱图中没有找到A部分与B部分相连的直接相关信号，但是通过高分辨质谱所测得的本化合物分子式具有10个不饱和度需要A部分与B部分通过C(C-7’)-O-C(C-12)和C(C-7’)-O-C(C-7)连接在一起，此推论进一步通过ROESY谱中的H-7’与H₃-13和H-7’与H-7相关信号得以证实，具体的，该化合物中各个碳氢或氢氢的相对位置关系详见式(II)，式(II)为通过碳 氢相关(HMBC)和氢氢相关(¹H-¹H COSY)得到的碳氢的相对位置关系的结构式，

本化合物的相对构型是通过ROESY谱(图9)得到解析的，通过图9可以得知，ROESY谱中，H-5′/H-9′、H-5′/H-7′、H-7′/H-13、H-7′/H-7和H-7/H-5的相关信号说明H-5′、H-9′、H-7′、H-7和H-5在同一侧并随机取为β向。此外，H-4/H-2、H-4/H₃-11和H₃-11/H-2的相关信号说明H-4、H-2、H₃-11为同一侧(α)向，具体的，化合物相对构型的结构式参见式(III)，

综合以上分析，将化合物的结构鉴定为式(I)结构的化合物，为一个裂环环烯醚萜与倍半萜的二聚体类化合物。该化合物所有的碳氢信号归属参见表1，表1为本发明式(I)结构的化合物的核磁数据，

表1为本发明式(I)结构的化合物的核磁数据

注：测试条件为氘代DMSO,¹H-NMR 400MHz,¹³C-NMR 100MHz。

本发明还提供了一种式(I)所示化合物在制备治疗手足口病药物中的应用，通过本发明实施例可知，本发明所述的化合物对于EV71病毒引起的手足口病具有很好的抑制作用。

本发明还提供了一种用于治疗手足口病的药物，包括式(I)所示化合物以及药物中可接受的辅剂。

本发明通过对热毒宁注射液进行研究，将热毒宁注射液首先经过大孔吸附树脂进行粗分离，并选用水以及不同质量浓度的醇的水溶液进行梯度洗脱，收集特定浓度的醇的水溶液再次通过凝胶柱、硅胶柱进行分离提纯，得到了本发明所述的式(I)结构的化合物，且通过对式(I)结构的化合物进行细胞实验，发现其对手足口病的毒株具有明显抑制作用。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

取热毒宁注射液成品(10L)，经HP-20大孔吸附树脂色谱柱分离，依次以水(30L)、30％乙醇(30L)、95％乙醇(30L)梯度洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位；

取95％乙醇洗脱部位，经Sephadex LH-20柱色谱分离，用甲醇洗脱，每500ml收集一次，依次收集，使用LC-MS测试分析收集后的流份，追踪到含分子量为802的化合物的流份，将含有分子量为802化合物的流份合并，合并后所得组分经制备HPLC进行极性分段，共分为15(B-1至B-15)段，使用LC-MS测试分析追踪到分子量为802化合物存在于B-8组分段中，B-8组分段经Sephadex LH-20柱色谱分离，得到式(I)结构化合物10.5mg。

通过对得到的化合物进行结构鉴定，结果参见图1～图9，图1为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；图2为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱；图3为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-NMR谱；图4为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹³C-NMR谱；图5为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的DEPT-135谱；图6为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HSQC谱；图7为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的HMBC谱；图8为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的¹H-¹H COSY谱；图9为本发明实施例1制得的式(I)结构的化合物的NOESY谱。

通过图1～图9的检测结果分析可知，本发明得到的化合物的结构为式(I)所示的化合物。

实施例2

式(I)化合物(后称药物)体外抗手足口病EV71病毒药物检测

1.材料

1.1毒株手足口病EV71病毒，实验室传代保存。

1.2细胞模型猴肾细胞系Vero,实验室传代保存。培养条件:DMEM+10％胎牛血清，37℃，5％CO₂。

2.原理和方法

2.1药物的细胞毒性检测

采用了(Invitrogen)试剂盒检测药物对细胞的毒性作用。

实验原理：是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸光度变化和荧光信号。易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分 析以及体外细胞毒性研究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱，可以反映细胞活性的高低。

方法步骤：Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细胞维持液(DMEM+5％血清)将药物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯度，每浓度梯度单孔检测。加药培养48h后，加入37℃孵育2h，荧光检测的还原情况，激发光570nm，发射光595nm。细胞活性(％)＝(样品孔-空白对照)/(细胞对照-空白对照)╳100％

2.2药物对EV71病毒的抑制试验

含报告基因GFP的EV71感染Vero细胞后，感染细胞会表达绿色荧光蛋白，通过在荧光显微镜下观察表达GFP绿色荧光的细胞数目，就可以反映出EV71病毒的增殖情况。

方法步骤：

Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物从4倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度；将稀释好的药物加入孔中，4h后加入病毒上清液进行感染，置于37℃细胞培养箱培养24h，在荧光显微镜下拍照，对荧光细胞进行计数。

实验设无药物对照孔(病毒感染后未加药物孔)，阳性药物对照孔(盐酸胍GuHCl)。

抑制率(％)＝(无药物对照孔-样品孔)/无药物对照孔╳100％

3.结果

3.1药物样品对细胞的毒性检测及对EV71抑制活性检测

药物样品稀释所用溶剂，最高溶解浓度，最高测试浓度，CC₅₀，EC₅₀以及SI(选择指数)见表2，表2为药物样品对细胞的毒性检测及对EV71抑制活性检测结果。

表2药物样品对细胞的毒性检测及对EV71抑制活性检测结果

实验结果表明，本发明所述式(I)结构的化合物表现出明显毒性，且在显微镜下观察到大部分细胞变圆并有裂解，在(100μM)时也有明显毒性，其SI值为9.5，显示其对手足口病EV71病毒有一定的抑制作用。

对本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种式(I)结构的化合物，

2.一种式(I)结构的化合物的制备方法，包括：

1)将热毒宁注射液经大孔吸附树脂柱进行色谱分离，用水、第一质量浓度的醇的水溶液，第二质量浓度的醇的水溶液进行洗脱，收集第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的洗脱液，

所述醇为C1～C6的醇，

所述第一质量浓度的醇的水溶液为10％～40％的醇的水溶液，

所述第二质量浓度的醇的水溶液为85％～98％的醇的水溶液；

2)将步骤1)得到的洗脱液浓缩，得到第二质量浓度的醇的水溶液洗脱部位的浓缩物；

3-1)将步骤2)得到的浓缩物进行色谱分离，收集洗脱液中含有分子量为802的化合物的洗脱液；

所述步骤3-1)的色谱分离用分离柱为凝胶色谱柱；

3-2)浓缩步骤3-1)得到的含有分子量为802的化合物的洗脱液，将浓缩物再次进行分离，收集含有分子量为820.8983[M+NH₄]⁺或825.3529[M+Na]⁺的洗脱液，浓缩，即得式(I)结构的化合物；

所述步骤3-2)中的再次分离用分离方法为硅胶柱色谱法分离、制备型高效液相色谱法分离或凝胶柱色谱法分离；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱用大孔吸附树脂为HP-20大孔吸附树脂、DA-201大孔吸附树脂、HPD-750大孔吸附树脂或ADS-17大孔吸附树脂。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一质量浓度的醇的水溶液为25％～30％的醇的水溶液；所述第二质量浓度的醇的水溶液为90％～95％的醇的水溶液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述凝胶色谱柱用凝胶为SephadexLH-20、Sephadex G-25、Sephadex G-30。

6.一种式(I)所示化合物在制备治疗手足口病药物中的应用，

7.一种用于治疗手足口病的药物，包括式(I)所示化合物，