CN115368329B - 二聚倍半萜类化合物、其制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了如下的二聚倍半萜类化合物、其制备方法及用途。所述二聚倍半萜类化合物化学结构新颖、抗疟疾生物活性显著，具有很好的开发前景，有望发展成为新型的无交叉耐药性抗疟药物。
Description
技术领域
本发明属于天然药物制备领域，涉及二聚倍半萜类化合物，其制备方法及其在制备抗疟疾药物中的用途。
背景技术
疟疾是一种由疟原虫造成的，通过以按蚊为主要媒介传播的全球性急性寄生虫传染病，是全球三大传染病之一，严重危害人类健康、社会安定以及经济发展。据世界卫生组织《2019年世界疟疾报告》显示，全世界估计有2.29亿疟疾病例，导致超过40万人死亡，其中5岁以下儿童占比高达67％。在5种致病疟原虫中，以恶性疟原虫(Plasmodium.faleiparum)和间日疟原虫(P.vivax)最为常见，其中又以恶性疟原虫危害最大。虽然疟疾的患病率以及死亡率有了明显的降低，但是在非洲等地区，收入少，医疗水平低下，疟疾防治仍是一大挑战。由于缺少有效的疫苗，目前青蒿素联合治疗法仍是治疗疟疾的最有效手段。然而，随着恶性疟原虫对青蒿素在内的一线抗疟药都产生了临床耐药性，抗疟工作受阻，急需新型的无交叉耐药性抗疟药物。
天然产物是发现治疗重大疾病的药物或先导结构的重要来源。我国对疟疾的认识和治疗有着长久的历史，早在公元2000年前，《黄帝内经素问》中的《疟论篇》和《刺论篇》就对疟疾的病因、症状以及治疗方法进行了专篇论述。青蒿素的发现为世界抗疟工作作出了巨大贡献，也表明从传统药用植物的用途入手，以活性为导向分离提取有效成分，是药物候选物或先导结构的重要来源。
草珊瑚属(Sarcandra)隶属于金粟兰科(Chloranthaceae)，全世界仅有3种，我国有草珊瑚(S.glabra)和海南草珊瑚(S.glabra subsp.brachystachys)两种。海南草珊瑚为我国特有种，主要产于云南、海南和广东，多生长于山坡、沟谷林下荫湿处。
发明内容
本发明人对海南草珊瑚的化学成分进行了系统的研究，发现了一类二聚倍半萜类化合物，并且活性测试显示具有显著抗疟疾作用。一方面，本发明通过对金粟兰科草珊瑚属植物―海南草珊瑚的乙醇提取物进行化学成分研究，提供了一类结构新颖的二聚倍半萜类化合物，包括下述8个结构新颖的二聚倍半萜类化合物：
其中，化合物1-6的结构是两分子乌药烷型倍半萜单体通过endo Diels-Alder环加成形成的二聚体，化合物7和8的结构是一分子乌药烷型倍半萜单体和一分子桉叶烷型倍半萜单体通过endo Diels-Alder环加成形成的二聚体。
本发明另一方面提供一种制备所述二聚倍半萜类化合物的方法，所述方法可以从金粟兰科草珊瑚属植物草珊瑚中分离得到所述二聚倍半萜类化合物，包括如下步骤：
(1)对草珊瑚的全草粉末用乙醇水溶液在室温下提取，减压浓缩提取液得到浸膏；
(2)向步骤(1)得到的浸膏中加入水稀释，然后用乙酸乙酯萃取，有机相经减压浓缩后得到粗提物；
(3)将步骤(2)得到的粗提物经过大孔树脂柱，用体积分数30％、50％、80％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积分数50％的乙醇水溶液洗脱得到的组分A，收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱得到的组分B；将组分A和组分B分别经过MCI柱，用体积比依次为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇与水的混合溶液进行梯度洗脱，收集由组分A用体积比5:5和6:4的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A2，收集由组分A用体积比8:2和9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A4，收集由组分B用体积比9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分B3；
(4)组分A2经硅胶柱层析，使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A2b；
组分A2b经凝胶柱层析纯化后进一步用半制备型HPLC纯化，用体积分数35％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物6；
(5)组分A4经硅胶柱层析，使用体积比500:1、100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A4e；
组分A4e经凝胶柱层析纯化后用半制备型HPLC纯化，用体积分数45％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物5和8；
(6)组分B3经硅胶柱层析，用体积比10:1、8:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的石油醚与丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱后，收集体积比2:1和1:1石油醚与丙酮的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h；
组分B3h经凝胶柱层析纯化，用乙醇洗脱，根据TLC点板监测，按洗脱时间顺序，分为四个组分B3h1～B3h4；
组分B3h1使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h1b；
组分B3h1b进一步用半制备型HPLC纯化，用体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物2和4；
组分B3h3使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h3b；
组分B3h3b经凝胶柱层析纯化，用甲醇洗脱，根据TLC点板监测，按洗脱时间顺序，分为两个组分B3h3b1和B3h3b2；
组分B3h3b1通过半制备HPLC纯化，用体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物1和7；
组分B3h3b2通过半制备HPLC纯化，用体积分数65％甲醇水溶液等度洗脱得到化合物3。
在上述方法中，步骤(1)中所述的乙醇水溶液可以为70％v/v以上的乙醇水溶液，优选为85％v/v以上的乙醇水溶液，更特别为95％v/v以上的乙醇水溶液；室温提取的时间没有特殊限制，例如可以为4小时以上，10小时以上，或24小时以上；提取可以进行一次或多次，例如1、2、3次或3次以上。
对上述化合物1–8进行了抗疟疾活性筛选，具体活性数据见表4。所述化合物化学结构新颖、生物活性显著，具有很好的开发前景，有望发展成为新型的无交叉耐药性抗疟药。
本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包含选自上述二聚倍半萜类化合物中的一种或多种作为活性成分，任选地，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。所述药物组合物可以用作抗疟疾药物。
本发明另一方面还提供了所述二聚倍半萜类化合物或药物组合物在制备抗疟疾药物中的用途。
本发明再一方面还提供了一种治疗疟疾的方法，其包括向需要该治疗的患者给药选自上述二聚倍半萜类化合物中的一种或多种作为抗疟疾活性成分，或者上述药物组合物。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
具体实施方式
以下通过具体实施例来进一步说明本发明化合物的制备步骤和药理实验过程。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围，本领域的技术人员可以对此作出种种修改和变化，在不背离本发明的精神和范围的情况下，所有这些修改都涵盖在所附的权利要求书限定的本发明范围内。
实验仪器和试剂：
仪器和设备：红外：Scientific Nicolet iS 5傅立叶变换红外光谱仪(KBr晶片)；紫外：shimadzu UV-2550紫外-可见分光光度计；旋光：Autopol VI旋光仪；核磁：BrukerAvance III500/600核磁共振色谱仪，以TMS为内标；质谱：LR(±)ESI质谱，BrukerDaltonics Esquire 3000plus型质谱仪；HRESI(±)MS，Waters Q-TOF Ultima Global型质谱仪；半制备HPLC：Waters1525双泵，Waters 2489检测器(210nm)，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×10mm，S-5μm，12nm)。
试剂和材料：预制TLC硅胶板(GF254)和层析硅胶：使用200-300和300-400目硅胶为载体，青岛海洋化学股份有限公司；D101大孔树脂：上海华凌树脂有限公司；CHP20P MCIgel(75–150μM)：三菱化工有限公司；Sephadex LH-20凝胶：Amersham Biosciences；分析纯溶剂：国药集团化学试剂有限公司；HPLC级溶剂：百灵威科技有限公司。
实施例1本发明中化合物1-8的制备
干燥的海南草珊瑚全草粉末(8Kg)用95％乙醇室温提取3次，减压浓缩提取液得到500g浸膏，用适量蒸馏水稀释后用乙酸乙酯萃取4次，乙酸乙酯部位经减压浓缩后得到250g粗提物，该部分经大孔树脂柱梯度洗脱(洗脱液为体积分数依次为30％、50％、80％、95％的乙醇水溶液)后，收集体积分数为50％的乙醇水溶液洗脱得到的组分A(60g)，收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱得到的组分B(65g)，组分A和组分B分别经MCI柱梯度洗脱(洗脱液为体积比依次为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇与水的混合溶液)，收集由组分A用体积比5:5和6:4的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A2(8g)，收集由组分A用体积比8:2和9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A4(10g)，收集由组分B用体积比9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分B3(15g)。
组分A2(8g)经硅胶柱层析(200～300目)(氯仿/甲醇(v/v)：100:1、70:1、50:1、20:1、10:1)梯度洗脱后，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A2b。组分A2b(800mg)经凝胶柱层析(Sephadex LH-20，乙醇洗脱)纯化后进一步用半制备型HPLC纯化(体积分数35％乙腈水溶液等度洗脱)得到化合物6(1.5mg)。
组分A4(10g)经硅胶柱层析(200-300目)(氯仿/甲醇(v/v)：500:1、100:1、70:1、50:1、20:1、10:1)梯度洗脱后，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A4e。组分A4e(400mg)经凝胶柱层析(Sephadex LH-20，甲醇洗脱)纯化后进一步用半制备型HPLC纯化(体积分数45％乙腈水溶液等度洗脱)得到化合物5(5.1mg)和8(2.0mg)。
组分B3(15g)通过硅胶柱层析(200～300目)(石油醚/丙酮(v/v)：10:1、8:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3)梯度洗脱，收集体积比2:1和1:1的石油醚与丙酮的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h。组分B3h(2g)经凝胶柱层析纯化，用乙醇洗脱，按洗脱时间顺序，根据TLC点板监测，分为四个组分B3h1～B3h4。
组分B3h1(500mg)经硅胶柱层析(300～400目)(氯仿/甲醇(v/v)：100:1、70:1、50:1、20:1、10:1)梯度洗脱，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h1b。
组分B3h1b(50mg)最后经半制备HPLC纯化(体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱)得到化合物2(8.1mg)和4(2.1mg)。
组分B3h3(400mg)经硅胶柱层析(300～400目)(氯仿/甲醇(v/v)：100:1、70:1、50:1、20:1、10:1)梯度洗脱，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h3b。
组分B3h3b(150mg)经凝胶柱层析纯化，用甲醇洗脱，按洗脱时间顺序，根据TLC点板监测，分为两个组分B3h3b1和B3h3b2。
组分B3h3b1(30mg)通过半制备HPLC纯化，用体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物1(1.2mg)和7(10.2mg)。
组分B3h3b2(17mg)通过半制备HPLC纯化，用体积分数65％甲醇水溶液等度洗脱得到化合物3(3.0mg)。
化合物的部分物理和化学数据如下：
表1.本发明中化合物1–4的1HNMR(CDCl3)数据
a用600MHz核磁共振仪测量；b用500MHz核磁共振仪测量。
表2.本发明中化合物5–8的1HNMR(600MHz,CDCl3)数据
表3.本发明中化合物1–8的13CNMR(CDCl3)数据
*在相应纵栏中信号可互换；a用125MHz核磁共振仪测量；b用150MHz核磁共振仪测量。
实施例2本发明化合物的抗疟疾活性测试
实验原理：
抗疟实验：对恶性疟原虫(P.falciparum)氯喹啉耐药株系Dd2的剂量-依赖性的生长抑制作用测定是参考现有技术中的方法，即用稍加修改的基于疟疾SYBR Green I的荧光法来测试疟原虫在抑制剂存在下72小时的生长情况，以青蒿素作为阳性对照。操作方法可简单表述为：取疟原虫环状体时期培养基置于96孔板中，加入不同浓度的药液，以实现每孔总容积为100μL，含有1％hematocrit(红细胞血液)和1％parasitaemia(寄生虫感染的血液)。随后将96孔板维持在由5％CO2、5％O2和90％N2组成的混合气体中，在37℃条件下培养72h。72小时候后，培养基中的疟原虫的生存率是通过SYBR Green I荧光检测法测定DNA含量来得到的。半数有效浓度(half-maximum effective concentration,EC50)是使用GraphPad Prism(GraphPad Software,Inc.)软件进行非线性回归曲线拟合，报告的数据是对至少三次平行试验结果的平均值，采用10倍系列稀释法进行测试，给出标准误值(Standard Error of Mean,SEM)。
表4.本发明中化合物1–8的抗疟疾活性结果
本发明中化合物的抗疟疾活性数据如表4所示。其中化合物1的抗疟疾活性非常显著，EC50为0.0043±0.0003nM，比青蒿素(4.0±4.2nM)的活性强1000倍。
Claims (6)
1.选自如下化合物的二聚倍半萜类化合物：
2.一种二聚倍半萜类化合物的制备方法，所述二聚倍半萜类化合物选自以下化合物：
所述制备方法包括如下步骤：
(1)对草珊瑚的全草粉末用乙醇水溶液在室温下提取，减压浓缩提取液得到浸膏；
(2)向步骤(1)得到的浸膏中加入水稀释，然后用乙酸乙酯萃取，有机相经减压浓缩后得到粗提物；
(3)将步骤(2)得到的粗提物经过大孔树脂柱，用体积分数30％、50％、80％、95％的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集体积分数50％的乙醇水溶液洗脱得到的组分A，收集体积分数为80％的乙醇水溶液洗脱得到的组分B；将组分A和组分B分别经过MCI柱，用体积比依次为3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的甲醇与水的混合溶液进行梯度洗脱，收集由组分A用体积比5:5和6:4的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A2，收集由组分A用体积比8:2和9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分A4，收集由组分B用体积比9:1的甲醇与水的混合溶液洗脱得到的组分B3；
(4)组分A2经硅胶柱层析，使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A2b；
组分A2b经凝胶柱层析纯化后进一步用半制备型HPLC纯化，用体积分数35％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物6；
(5)组分A4经硅胶柱层析，使用体积比500:1、100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分A4e；
组分A4e经凝胶柱层析纯化后用半制备型HPLC纯化，用体积分数45％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物5和8；
(6)组分B3经硅胶柱层析，用体积比10:1、8:1、6:1、5:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3的石油醚与丙酮的混合溶剂进行梯度洗脱后，收集体积比2:1和1:1石油醚与丙酮的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h；
组分B3h经凝胶柱层析纯化，用乙醇洗脱，按洗脱时间顺序，根据TLC点板监测，分为四个组分B3h1～B3h4；
组分B3h1使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比50:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h1b；
组分B3h1b进一步用半制备型HPLC纯化，用体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱，得到化合物2和4；
组分B3h3使用体积比100:1、70:1、50:1、20:1、10:1的氯仿与甲醇的混合溶剂进行梯度洗脱，收集体积比70:1的氯仿与甲醇的混合溶剂洗脱的洗脱液得到组分B3h3b；
组分B3h3b经凝胶柱层析纯化，用纯甲醇洗脱，按洗脱时间顺序，根据TLC点板监测，分为两个组分B3h3b1和B3h3b2；
组分B3h3b1通过半制备HPLC纯化，用体积分数55％乙腈水溶液等度洗脱得到化合物1和7；
组分B3h3b2通过半制备HPLC纯化，用体积分数65％甲醇水溶液等度洗脱得到化合物3。
3.一种药物组合物，其包含选自权利要求1所述二聚倍半萜类化合物的一种或多种作为活性成分。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其进一步包括药剂学上可接受的药物辅料。
5.如权利要求3或4所述的药物组合物，其为抗疟疾药物。
6.权利要求1所述的二聚倍半萜类化合物或权利要求3或4所述的药物组合物用于制备抗疟疾药物的用途。
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