CN104072551B

CN104072551B - 一种二聚环烯醚萜苷化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104072551B
Application number: CN201410195134.3A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 姚新生; 李海波; 于洋; 王振中; 姚志红; 戴毅; 高昊
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2014-05-02
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2034-05-02
Also published as: CN104072551A; HK1197914A1

Abstract

本发明公开了一种二聚环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用。制法：(1)取热毒宁注射液成品，经HP‑20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、30％乙醇、90～100％乙醇梯度洗脱，分别收集各洗脱液，浓缩，得到90～100％乙醇洗脱部位；(2)90～100％乙醇洗脱部位，依次经硅胶柱色谱，ODS柱色谱分离，半制备液相HPLC分离，得到本发明化合物。本发明所述化合物可用于治疗手足口病。

Description

一种二聚环烯醚萜苷化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种从现有中成药制剂中提取的二聚环烯醚萜苷化合物及其制备方法和应用。

背景技术

热毒宁注射液(国药准字Z20050217)为江苏康缘药业股份有限公司自主研发的原中药二类新药，其处方为青蒿、金银花、栀子，辅料为聚山梨酯80。热毒宁注射液在外感风热所致感冒、流感、咳嗽、上呼吸道感染等疾病的临床治疗中应用广泛，其作用迅速、效果显著。

研究人员在热毒宁注射液中发现了新的化学成分，并且发现此化合物在各个批次的热毒宁注射液中均稳定存在。经查阅文献可知，这是首次在热毒宁注射液中发现并鉴定出的新的化学成分，并经过Scifinder scholar检索发现该化合物为新化合物。

发明内容

本发明从热毒宁注射液中制备提取出一种具有生物活性的二聚环烯醚萜苷类化合物，并提供了其在制备治疗手足口病药物中的应用。

具体地说，本发明提供了一种二聚环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：

本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂色谱柱分离，依次以水、30％乙醇、90～100％乙醇梯度洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的90～100％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为4∶1的馏分E，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为7∶10的馏分E-5，馏分E-5经半制备液相HPLC分离，得到本发明化合物。

上述制备方法中，步骤(2)所述半制备液相色谱，以比例为40∶60的甲醇-水为流动相，检测波长为254与220nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间为20.9min。

发明人通过理化性质和现代波谱学手段(UV、IR、MS、¹H-NMR、¹³C-NMR和2D-NMR)对分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式I所示的二聚环烯醚萜苷化合物。

本发明的另一个目的在于提供一种式I所示化合物在制备治疗手足口病药物中的应用。发明人发现本发明化合物对手足口病EV71病毒有一定的抑制作用。

本发明的再一个目的在于提供一种药物组合物，包含上述式I所示化合物。

本发明还提供了一种治疗手足口病的药物组合物，含有治疗有效量的上述式I化合物以及一种或多种药学上可接受的载体。

附图说明

图1为化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS

图2为化合物的¹H-NMR谱与京尼平苷和段氧化马钱子苷的¹H-NMR谱的比对

图3为化合物的¹³C-NMR谱与京尼平苷和段氧化马钱子苷的¹³C-NMR谱的比对

图4和图5为化合物的H¹-H¹COSY局部放大谱

图6和图7为化合物的HMBC局部放大谱

图8为化合物的HSQC谱

图9为化合物的主要HMBC(→)和COSY(-)相关信息

图10为本发明化合物结构式

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1本发明化合物的制备

(1)取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂色谱柱分离，依次以水、30％乙醇、95％乙醇梯度洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的95％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为4∶1的馏分E6.2g，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为7∶10的馏分E-5100mg，馏分E-5经半制备液相HPLC分离，以比例为60∶40的甲醇-水为流动相，检测波长为254与220nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间为20.9min，分离所得溶液干燥，得到本发明化合物35.6mg。

实施例2本发明化合物的结构鉴定

该化合物为黄色胶状固体，-21.2(c0.5，MeOH)。ESI-MS(positive)给出m/z781[M+Na]⁺；ESI-MS(negative)给出m/z757[M-H]^-，803[M+HCOO]^-，提示化合物分子量为758。HR-ESI-Q-TOF-MS(见图1)给出m/z759.2714[M+H]⁺(计算值为759.2712)，确定化合物分子式为C₃₄H₄₆O₁₉，计算不饱和度为12。

本化合物的1H-NMR(400MHz，in CD3OD)谱显示了两组氢信号，其中包括两个典型的环烯醚萜类化合物3位上质子信号[δ7.50(1H，d，J＝1.2Hz)和7.44(1H，d，J＝1.2Hz)]，及两个1位半缩醛上质子信号[δ5.53(1H，d，J＝6.1Hz)和δ5.00(1H，d，J＝7.8Hz)]，通过与已经分离得到的化合物京尼平苷与断氧化马钱子苷的图谱进行对比，可以发现本化合物的两组氢信号与这两个化合物非常相似，仅糖区信号存在较大的差异(见图2)，推测本化合物可能为一个二聚的环烯醚萜类化合物。

本化合物的¹³C-NMR(100MHz，in CD₃OD)谱同样显示了两组碳信号，通过与京尼平苷和断氧化马钱子苷的碳谱进行比对，发现仅糖区信号存在较大的差异，其中可见两个糖端基碳信号δ101.0(C-1′)，100.0(C-1″′)，以及其它糖区信号75.6(C-2′)，74.4(C-3′)，81.7(C-4′)，67.9(C-5′)，69.2(C-6′)，74.6(C-2″′)，78.0(C-3″′)，71.6(C-4″′)，78.4(C-5″′)和62.8(C-6″′)，而比较特征的是81.7(C-4′)和69.2(C-6′)与正常葡糖糖信号比对发现了明显的低场位移，此外，还多了一个δ102.6的叔碳信号(见图3)。

在¹H-¹H COSY谱中(见图4和图5)，H-1″′/H-9″′/H-5″′/H-6″′/H-7″′，H-9″′/H-8″′/H-10″′之间具有明显的相关信号，结合HSQC谱，推出骨架片段I：C1″′-C9″′-C5″′-C6″′-C7″′，C9″′-C8″′-C10″′。此外还可以得到其中一个葡萄糖的结构片段。

在HMBC谱(见图6和图7)中，3″位的氢信号(δ.7.44)和碳信号δ169.3，111.5，97.7，29.6都有远程相关，可以确定结构片段II的存在。同时在HMBC谱中，可以观察到甲氧基质子信号δ.3.70和碳信号δ169.3相关，葡萄糖端基质子信号δ.4.66和碳信号δ97.7相关，从而推出化合物6中含有断氧化马钱子苷的结构片段。通过相似的方法，可以得到京尼平苷的结构片段，两个结构片段的连接通过HMBC相关谱实现，京尼平苷结构片段中葡萄糖H-6′与葡萄糖C-4′、以及断氧化马钱子苷结构片段中C-7″具有远程相关，得到结构片段C。

同时，将结构片段C通过与分子式C₃₄H₄₆O₁₉比对，发现多一个氧，少一个不饱和度，推测片段京尼平苷中，葡萄糖C-6′和C-4′上的羟基与断氧化马钱子苷结构片段上C-7″形成半缩醛的六元环结构。化合物6的7″位上的氢的相对构型则是通过ROESY谱(见图8)来确定的，在ROSEY谱中，可见H-7″与H-4′及H-6′a相关，我们确定7″位上的氢为β构型。

综合HSQC和HMBC谱信息(见图9)，对化合物6的全部碳信号和氢信号进行了归属(见表1)。经过SciFinder Scholar网络检索，未发现相关报道，表明本化合物为一个新的二聚环烯醚萜苷化合物，命名为japonicaside A。

表1化合物的核磁数据(氘代甲醇，¹H-NMR400MHz，¹³C-NMR100MHz)

实施例3本发明化合物体外抗手足口病EV71病毒药物检测

1.材料

1.1毒株手足口病EV71病毒，实验室传代保存。

1.2细胞模型猴肾细胞系Vero，实验室传代保存。培养条件：DMEM+10％胎牛血清，37℃，5％CO₂。

2.原理和方法

2.1药物的细胞毒性检测

采用了(Invitrogen)试剂盒检测药物对细胞的毒性作用。

实验原理：是一种氧化还原指示剂，能根据代谢活性产生吸光度变化和荧光信号。易溶于水，其氧化形式进入细胞后经线粒体酶还原产生可测量的荧光及颜色变化，用于细胞活性和细胞增殖的定量分析以及体外细胞毒性研究。这种测定是基于具有代谢活性的细胞将试剂转换成荧光和比色指示剂的能力，受损和无活性细胞具有较低的天然代谢活性，对应的信号较低。因此荧光信号强弱，可以反映细胞活性的高低。

方法步骤：Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。用细胞维持液(DMEM+5％血清)将药物从2倍起始浓度连续3倍梯度稀释6个梯度，每浓度梯度单孔检测。加药培养48h后，加入37℃孵育2h，荧光检测的还原情况，激发光570nm，发射光595nm。

细胞活性(％)＝(样品孔-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100％

2.2药物对EV71病毒的抑制试验

含报告基因GFP的EV71感染Vero细胞后，感染细胞会表达绿色荧光蛋白，通过在荧光显微镜下观察表达GFP绿色荧光的细胞数目，就可以反映出EV71病毒的增殖情况。

方法步骤：

Vero细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用。药物从4倍最高测试浓度起连续3倍梯度稀释6个梯度；将稀释好的药物加入孔中，4h后加入病毒上清液进行感染，置于37℃细胞培养箱培养24h，在荧光显微镜下拍照，对荧光细胞进行计数。

实验设无药物对照孔(病毒感染后未加药物孔)，阳性药物对照孔(盐酸胍GuHCl)。

抑制率(％)＝(无药物对照孔-样品孔)/无药物对照孔×100％

3.结果

3.1药物样品对细胞的毒性检测及对EV71抑制活性检测

药物样品稀释所用溶剂，最高溶解浓度，最高测试浓度，CC₅₀，EC₅₀以及SI(选择指数)如表2所示。

表2实验结果

4.结论

本发明化合物表现出明显毒性，且在显微镜下观察到大部分细胞变圆并有裂解，在(100μM)时也有明显毒性，其SI值为10.3，显示其对手足口病EV71病毒有一定的抑制作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种二聚环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取热毒宁注射液成品，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、30％乙醇、90～100％乙醇这三种溶剂进行洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的90～100％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇比例为4∶1的馏分E，馏分E经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱，收集甲醇-水比例为7∶10的馏分E-5，馏分E-5经半制备液相色谱分离，得到本发明化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述半制备液相色谱，以比例为60∶40的甲醇-水为流动相，检测波长为254与220nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间为20.9min。

4.权利要求1所述化合物在制备治疗手足口病药物中的应用。

5.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物。

6.一种用于治疗手足口病的药物组合物，其特征在于，含有治疗有效量的权利要求1所述化合物和药学上可接受的载体。