CN106946973B - 一种化合物及其制备方法、用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种化合物及其制备方法、用途，即(3β,22α,25R)‑螺旋甾碱烷‑5‑烯基‑3‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→2)‑O‑[β‑D‑木吡喃糖基‑(1→3)]‑O‑β‑D‑吡喃葡萄糖基‑(1→4)‑β‑D‑吡喃半乳糖苷的新用途及其制备方法，所述的化合物可以抑制肺癌细胞，将肺癌细胞生长周期停滞在早期，促使肺癌细胞凋亡，因此，所述化合物可以用于制备抗癌药物，尤其是制备抗肺癌药物。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种化合物及其制备方法、用途，即(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷及其制备方法、用途。
背景技术
(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，白色粉末，难溶于乙醇、水，结构式如下：
(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷未被披露，且在现有技术中还未见关于上述化合物在治疗癌症疾病领域的应用方面的报道，尚未将其开发出来应用于临床治疗癌症，尤其是治疗肺癌疾病方面，然而本申请的申请人在白英药材中提取过程中发现上述化合物，并发现其在治疗癌症尤其是肺癌方面效果显著，为此，本发明提出了一种化合物及其制备方法以及在制备抗癌药物新用途。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于一种的化合物及其制备方法、用途。
为此，本发明提供了一种化合物，具有如式(I)所示的结构，
本发明还提供了一种制备如式(I)所示的化合物的方法，包括如下步骤：
(1)取白英药材加入醇溶液中进行醇提，将获得的醇提取液进行精制，即得白英总碱样品，备用；
(2)将步骤(1)中的制备的白英总碱样品加入醇溶液中加热溶解，以薄层层析硅胶拌样，然后上样于硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为93％～97％乙醇＝(2～3)∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，通过以盐酸水溶液改良的碘化铋钾显色，合并相同的流份，得到极性不同的两种组分，备用；
(3)将步骤(2)中获得的两组分中极性大的组分溶解于极性非质子性溶剂中，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，以1％TFA水溶液为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流动相流速为25～35mL/min；控制柱温为20-30℃；控制进样体积为0.5-1.5mL；收集所述化合物的流出液进行质谱检测成分，收集相对分子质量为1031的成分，得到式(I)所示的化合物。
所述的制备方法，在所述步骤(1)中，在所述步骤(1)中，制备白英总碱样品的具体方法为：将白英干燥全草用体积浓度为65-75％的乙醇水溶液回流提取，过滤，将滤液浓缩至50℃相对密度为1.05的浸膏，加入蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2～4倍柱体积的蒸馏水和2～4倍柱体积的体积浓度为93-97％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为5-7‰的盐酸乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为93-97％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用6～10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为93-97％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得白英总碱。
所述的制备方法，在所述步骤(2)中，称取白英总碱样品30-40重量份，加入300-1000体积份的体积浓度为93-97％的乙醇溶液中在温度为80-100℃下溶解，然后加入10-20重量份的薄层层析硅胶混合均匀，然后上样于加入780-820重量份的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；所述重量份与体积份的关系为g/mL。
所述的制备方法，在所述步骤(2)中，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为95％乙醇＝2.5∶1的洗脱剂进行洗脱。
所述的制备方法，在所述步骤(2)中，所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：
称取碱式硝酸铋0.8～0.9重量份，依次加入9～11体积份的冰醋酸、39～41体积份的水和19～21体积份的碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；
向所述碘化铋钾试液中加入质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
所述的制备方法，在所述步骤(3)中，所述流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％。
本发明提供了一种式(I)所示的化合物在制备抗癌药物的用途。
所述的用途，所述抗癌药物包括抗肺癌药物。优选的，所述抗癌药物为抗非小细胞肺癌药物
本发明还提供了一种抗癌药物，以所述的式(I)所示的化合物为有效成分。
所述的抗癌药物，以所述的式(I)所示的化合物为有效成分，加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、散剂、丸剂、酊剂、酒剂、煎膏剂、锭剂或合剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
1.本发明所述的如式(I)所示的化合物具有明显的抑制癌细胞的作用，尤其是抑制非小细胞肺癌的作用，随着所述化合物浓度的增加，对非小细胞肺癌细胞的抑制作用逐渐增强，将肺癌细胞生长周期停滞在早期如G0/G1期，并且随着所述化合物浓度的增加，滞留作用逐渐增强，同时所述化合物的作用使A549细胞的凋亡率与浓度呈正相关逐渐增加，因此，式(I)所示的化合物可以用于制备抗癌药物，尤其是制备抗肺癌药物。
2.本发明所述的制备如式(I)所示的化合物的方法，包括如下步骤：(1)取白英药材加入醇溶液中进行醇提，将获得的醇提取液进行精制，即得白英总碱样品，备用；(2)将步骤(1)中的制备的白英总碱样品加入醇溶液中加热溶解，以薄层层析硅胶拌样，然后上样于硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为93％～97％乙醇＝(2～3)∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，收集含有目标化合物的流份，备用；(3)将步骤(2)中获得的流份溶解于极性非质子性溶剂中，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，以1％TFA水溶液为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流动相流速为25～35mL/min；控制柱温为20-30℃；控制进样体积为0.5-1.5mL；采用质谱检测器收集成分，得到式(I)所示的化合物；通过上述方法可以从白英药材中分离纯化出式(I)所示的化合物。
3.本发明所述的制备如式(I)所示的化合物的方法，在所述步骤(3)中，所述流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％；通过选择合适的流动相，大大提高了式(I)所示的化合物的分离纯化纯度，降低杂质含量，方便其应用于临床。
4.本发明所述的螺旋甾碱烷型糖苷生物碱的制备方法，在柱层析分离过程中以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，该显色剂的制备方法为：向碱式硝酸铋中依次加入冰醋酸、水和碘化钾溶液，再向混合均匀后的试液中加入质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即制得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液，该制备方法制备得到的显色剂使得以薄层色谱进行检测时，产物组分相对背景色而言显色清楚，容易判断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷结构式；
图2是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷1HNMR谱图；
图3是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷13C NMR谱图；
图4是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷H-H cosy谱图；
图5是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷HMQC谱图；
图6是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷HMBC谱图；
图7是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷Tocsy谱图；
图8是本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷Noesy谱图；
图9为本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对A549、H460、SK-MES-1细胞抑制率的影响效果图；
图10a是在细胞凋亡影响中，空白对照组对A549细胞凋亡影响的流式结果图；
图10b是在细胞凋亡影响中，为含本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的药物的低浓度组对A549细胞凋亡影响的流式结果图；
图10c是在细胞凋亡影响中，为含本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的药物的中浓度组对A549细胞凋亡影响的流式结果图；
图10d是在细胞凋亡影响中，为含本发明实施例1制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的药物的高浓度组对A549细胞凋亡影响的流式结果图。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例中涉及到的仪器如下：Waters 2767/QDa制备液相质谱联用色谱仪：Masslynx4.1色谱工作站，Waters2767样品管理器，Waters2489紫外可见光检测器，Waters2545二元高压色谱泵，QDa质谱检测器，色谱柱为Waters SunFire Prep C18OBD(10μm，19×250mm)Column。
实施例1
本实施例所述的如式(I)所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取10kg白英干燥全草，置于回流瓶中，加入80L体积浓度为70％的乙醇水溶液，于100℃下回流提取3次，每次提取2小时，将获得的醇提取液进行过滤，合并所得的滤液并进行减压浓缩至相对密度为1.05(50℃测)的浸膏，向所述浸膏中加入10倍浸膏质量的蒸馏水进行分散，过滤，将所得滤液加入至D151离子交换大孔吸附树脂柱，然后依次经3倍柱体积的蒸馏水、3倍柱体积的体积浓度为95％的乙醇水溶液洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经4倍柱体积含体积浓度为6‰盐酸的体积浓度为95％乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，向所述洗脱液中加入氨水中和至中性，滤过，将所得滤液减压浓缩至干燥，并用1倍生药量的蒸馏水分散，将分散的药液加至AB-8大孔吸附树脂柱，然后用8倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经4倍柱体积的体积浓度为95％的乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，然后浓缩旋干，喷雾干燥，即得35g白英总碱样品，得率约为3.5‰，备用；
(2)称取步骤(1)中的制备的白英总碱样品35g，加入500ml的体积浓度为95％的乙醇溶液中90℃水浴加热溶解，以15g薄层层析硅胶拌样，然后上样于装有800g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为95％乙醇＝2.5∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂显色，合并相同的流份，得到极性不同的两种组分，备用；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.85g，依次加入10mL冰醋酸、40mL水和20mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液；
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
(3)将步骤(2)中获得的两种组分中极性大的组分溶解于二甲基酰胺(DMF)中，溶解后的样品溶液浓度为100mg/ml，采用0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱为Waters SunFire Prep C18OBD(10μm，19×250mm)Column；以乙腈(制备级)为流动相A，以1％TFA水溶液为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％；控制流动相流速为30mL/min；控制柱温为25℃；控制进样体积为1mL；采用QDa质谱检测器收集成分，收集相对分子质量为1031的成分，制备得到式(I)所示的化合物25mg。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷的1HNMR谱图、13C NMR谱图、H-H cosy谱图、HMQC谱图、HMBC谱图、Tocsy谱图和Noesy谱图分别见图2-8。
本实施例制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷，其结构式如图1所示，其中碳原子编号1-27已经在图1所示的结构式中标出。表1为图2-8的解析结果。
表1图2-8的解析结果
其中，表1中的氢谱和碳谱数据为在1H-NMR(600MHz)和13C-NMR(150MHz)，溶剂为氘代甲醇的条件下得到。
实施例2
本实施例所述的如式(I)所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取10kg白英干燥全草，置于回流瓶中，加60L的体积浓度为65％的乙醇水溶液，于90℃下回流提取2次，每次提取4小时，将获得的醇提取液进行过滤，合并所得的滤液并进行减压浓缩至相对密度为1.05(50℃测)的浸膏，向所述浸膏中加入8倍浸膏质量的蒸馏水进行分散，过滤，将所得滤液加入至D151离子交换大孔吸附树脂柱，然后依次经2倍柱体积的蒸馏水、4倍柱体积的体积浓度为93％的乙醇溶液洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经3倍柱体积含体积浓度为7‰盐酸的体积浓度为93％乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，向所述洗脱液中加入氨水中和至中性，滤过，将所得滤液减压浓缩至干燥，并用1.5倍生药量的蒸馏水分散，将分散的药液加至AB-8大孔吸附树脂柱顶，然后用6倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经5倍柱体积的体积浓度为97％的乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，然后浓缩旋干，喷雾干燥，即得33g白英总碱样品，备用；
(2)称取步骤(1)中的制备的白英总碱样品30g，加入300ml的体积浓度为97％的乙醇溶液中在温度为80℃下水浴溶解，加入20g薄层层析硅胶拌样，然后上样于加入820g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为97％乙醇＝2∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.8g，依次加入11mL冰醋酸、39mL水和21mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
(3)将步骤(2)中获得的两种组分中极性大的组分溶解于二甲基酰胺(DMF)中，溶解后的样品溶液浓度为90mg/ml，采用0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法-质谱联用分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱为Waters SunFire Prep C18OBD(10μm，19×250mm)Column；以乙腈(制备级)为流动相A，以1％TFA水溶液为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％：76％→31％：69％；控制流动相流速为25mL/min；控制柱温为20℃；控制进样体积为0.5mL；采用QDa质谱检测器收集成分，收集相对分子质量为1031的成分，制备得到式(I)所示的化合物25mg。
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以上述制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的胶囊剂。
实施例3
本实施例所述的如式(I)所示的化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取10kg白英干燥全草，置于回流瓶中，加100L的体积浓度为75％的乙醇溶液，于110℃下回流提取3次，每次提取2小时，将获得的醇提取液进行过滤，合并所得的滤液并进行减压浓缩至相对密度为1.05(50℃测)的浸膏，向所述浸膏中加入12倍浸膏质量的蒸馏水进行分散，过滤，将所得滤液加入至D151离子交换大孔吸附树脂柱，然后依次经4倍柱体积的蒸馏水、2倍柱体积的体积浓度为97％的乙醇溶液洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经5倍柱体积含体积浓度为5‰盐酸的体积浓度为97％乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，向所述洗脱液中加入氨水中和至中性，滤过，将所得滤液减压浓缩至干燥，并用0.5倍生药量的蒸馏水分散，将分散的药液加至AB-8大孔吸附树脂柱顶，然后用10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去流出的洗脱液，然后经3倍柱体积的体积浓度为93％的乙醇溶液洗脱，收集流出的洗脱液，然后浓缩旋干，喷雾干燥，即得35g白英总碱样品，得率约为3.5‰，备用；
(2)称取步骤(1)中的制备的白英总碱样品40g，加入1000ml的体积浓度为93％的乙醇溶液中在温度为100℃下水浴溶解，加入10g薄层层析硅胶拌样，然后上样于加入780g的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为93％乙醇＝3∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液为显色剂，以薄层色谱进行检测，合并相同流份，得到极性不同的两种组分；
所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：称取碱式硝酸铋0.9g，依次加入9mL冰醋酸、41mL水和19mL碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；取1mL配置好的碘化铋钾试液，加入2mL质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液；
(3)将步骤(2)中获得的两种组分中极性大的组分溶解于二甲基酰胺(DMF)中，溶解后的样品溶液浓度为105mg/ml，采用0.45um滤膜过滤，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱为Waters SunFire Prep C18OBD(10μm，19×250mm)Column；以乙腈(制备级)为流动相A，以1％TFA水溶液(水为millipore纯水机自制)为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为26％：74％→29％：71％；控制流动相流速为35mL/min；控制柱温为30℃；控制进样体积为1.5mL；采用QDa质谱检测器收集成分，收集相对分子质量为1031的成分，制备得到式(I)所示的化合物25mg。
本实施例还提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以上述制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的片剂。
实施例4
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以实施例1制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分。
实施例5
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以实施例1制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的颗粒剂。
实施例6
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以实施例1制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的丸剂。
实施例7
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以实施例1制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的糖浆剂。
实施例8
本实施例提供了一种抗癌药物，所述抗癌药物以实施例1制备的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷为有效成分加入常规辅料，按照常规工艺制成临床上可接受的煎膏剂。
实验例
本发明实施例1制备的化合物对非小细胞肺癌的抑制率及细胞周期、凋亡的影响
1材料
1.1细胞信息
三种非小细胞肺癌细胞株：人肺腺癌细胞A549，人大细胞肺癌细胞H460，人肺鳞癌细胞SK-MES-1，上述细胞均由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。A549和H460细胞使用的完全培养基为含有体积浓度为90％RPMI640和体积浓度为10％FBS的混合物，SK-MES-1细胞使用的完全培养基为含有体积浓度为90％DMEM和体积浓度为10％FBS的混合物，于37℃、体积浓度5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
1.2主要试剂与耗材
细胞培养瓶(美国FALCON 353014)
Penicillin/streptomycin solution(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGY002)
0.25％Tripsin-EDTA(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGY001)
MTT(美国Amresco 0793)
DMSO(溶解受试药品)(美国SIGMA D2650)
PBS(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGB500)
RPMI-1640(美国GIBCO 31800-105)
DMEM(美国GIBCO 12800-082)
FBS(美国ExCell Biology FBS500)
96 wellcell culture plate(美国Corning Incorporated 3599)
6 wellcell culture plate(Corning Incorporated 3516)
Annexin V-APC/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGA1024)
细胞周期检测试剂盒(中国江苏凯基生物技术股份有限公司KGA511)
1.3主要仪器与设备
超净工作台(中国苏州净化SW-CJ-1FD)
CO2培养箱(日本SANYO XD-101)
生物倒置显微镜(日本OLYMPUS IX51)
台式低速离心机(中国上海医疗器械股份有限公司医疗设备厂80-2)
2.5ul、10ul、200ul、1000ul移液器(德国eppendorf)
立式压力锅(中国上海博讯，YXQ-LS-50)
电热鼓风干燥箱(中国上海圣欣，101AS-3)
酶标仪(美国BioTek ELx800)
振荡器(中国上海沪西分析仪器厂WH-2)
流式细胞仪(美国Becton-Dickinson FACS Calibur)
2方法
2.1细胞培养
(1)培养瓶中的细胞覆盖率达到80％～90％时，把原有培养基吸掉；
(2)加适当的胰蛋白酶(0.25％)，消化1～2min；
(3)细胞都变圆后加入等体积的含血清的培养基终止消化；
(4)用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来，然后将细胞吸到15ml的离心管中，1000rpm离心5min；
(5)倒掉上清液，加1～2ml培养基，将细胞重新悬浮转移至培养瓶中继续培养。
2.2 MTT法检测细胞增殖
(1)分别取对数生长期A549、H460、SK-MES-1细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μl细胞悬液；
(2)将96孔细胞培养板置于37℃，体积浓度为5％CO2培养箱中培养24h；
(3)用完全培养基稀释本发明实施例1制备得到的化合物至表2中所需药物浓度，每孔加入100μl相应浓度的含药培养基，同时设立空白对照组(加入同体积空白培养液)；
(4)将96孔细胞培养板置于37℃，体积浓度为5％CO2培养箱中培养72h；
(5)将96孔板进行MTT染色，λ＝490nm，测定OD值；
A每孔加入20μl MTT(5mg/ml)，在培养箱继续培养4h；
B弃去培养基，每孔加入150μl DMSO溶解，摇床10min轻轻混匀；
Cλ＝490nm，酶标仪读出每孔的吸光度OD值，计算抑制率；
(6)计数各组别抑制率及药物半抑制浓度(IC50)
上式中，A为吸光度。
应用SPSS(Staffstical Package for the Social Science)17.0通过机率单位加权回归法(Bliss法)计算IC50。
2.3 PI单染法检测细胞周期
选择A549细胞进行细胞周期及凋亡的检测，并且通过2.2结果选择三个浓度进行后续试验，细胞共分为四组：空白对照组，低浓度组，中浓度组，高浓度组，上述各组细胞浓度为5×106个/ml的细胞，步骤如下
(1)将对数生长期的A549细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应的含药培养基浓度依次为(空白对照组补以同体积空白培养液)；所述含药培养基为采用完全培养基稀释实施例1制备的化合物，低浓度组的含药培养基中的化合物浓度为10μg/ml，中浓度组为20μg/ml，高浓度组为40μg/ml；
(2)药物作用72h后，分别用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集各组细胞；
(3)用PBS洗涤各种细胞一次(离心2000rpm，5min)，每组收集5×105个细胞，分别配制成细胞浓度为单细胞悬液1ml；
(4)将步骤(3)制备的各组单细胞悬液1ml用体积浓度为70％乙醇固定2h(或过夜)，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液(如需要，细胞悬液用200目筛网过滤一次)；
(5)分别向步骤(4)中各组细胞加100μl的RNase A 37℃水浴30min；
(6)再分别向步骤(5)中的细胞加入400μl的PI染色混匀，4℃避光30min；
(7)上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光。
2.4Annexin-V APC/7-AAD双染法检测细胞凋亡
(1)将对数生长期的A549细胞消化接种到六孔板中，次日，待细胞贴壁后，根据组别设置加入相应浓度的含药培养基，细胞共分为四组：空白对照组，低浓度组，中浓度组，高浓度组；(空白对照组补以同体积空白培养液)；所述含药培养基为采用完全培养基稀释实施例1制备的化合物，低浓度组的含药培养基中的化合物浓度为10μg/ml，中浓度组为20μg/ml，高浓度组为40μg/ml；每组细胞浓度为5×106个/ml的细胞；
(2)药物作用72h后，用0.25％胰酶(不含EDTA)消化收集各组细胞；
(3)用PBS洗涤细胞2次(离心2000rpm，5min)收集5×105个细胞；
(4)加入500μl的Binding Buffer悬浮细胞；
(5)加入5μl Annexin V-APC混匀后，加入5μl的7-AAD，混匀；
(6)室温、避光、反应5～15min；用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况。
3结果
3.1对三种非小细胞肺癌细胞的抑制率
随着所述化合物浓度的增加，对细胞的抑制作用逐渐增强，所述化合物对A549细胞的半抑制浓度为23.22μg/ml，对H460细胞的半抑制浓度为49.94μg/ml，对SK-MES-1细胞的半抑制浓度为55.45μg/ml。具体结果见表2、图9。
表2药物对A549、H460、SK-MES-1细胞抑制率的影响(n＝6)
3.2对A549细胞周期的影响
通过MTT试验选择化合物的低浓度组为10μg/ml，中浓度组为20μg/ml，高浓度组为40μg/ml。所述化合物的作用使A549细胞停滞在了G0/G1期，并且随着所述化合物浓度的增加，这种滞留作用逐渐增强；S期及G2期细胞均相应减少。具体结果见表3。
表3药物对A549细胞周期的影响(n＝3)
3.3对A549细胞凋亡的影响
图10为流式细胞结果图，图中UL代表左上方区域(为碎片及损伤坏死细胞)，UR为右上方区域(为晚期凋亡细胞)，LL为左下方区域(正常存活细胞)，LR是右下方区域(为早期凋亡细胞)，细胞凋亡率＝LR区细胞比例+UR区细胞比例。由流式细胞术检测结果可看出，所述化合物的作用使A549细胞的凋亡率与浓度呈正相关逐渐增加。特别的，使早期凋亡细胞(LR区细胞比例)、晚期凋亡细胞(UR区细胞比例)明显增多，尤其是高浓度组的早期凋亡细胞(空白对照组的早期凋亡细胞为3.08％)达到了34.78％。具体结果见表4。
表4药物对A549细胞凋亡的影响
4.实验结论
本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷对人肺腺癌细胞A549、人大细胞肺癌细胞H460和人肺鳞癌细胞SK-MES-1具有较好的抑制效果，且对人肺腺癌细胞A549的抑制效果比其他两种癌细胞效果好，所述化合物可以影响A549细胞的周期，使其生长周期停滞在早期如G0/G1期，并且随着所述化合物浓度的增加，滞留作用逐渐增强，所述化合物可以促使A549细胞凋亡，随着所述化合物浓度的增加，A549细胞凋亡率越高。由此表明，本发明制备得到的(3β,22α,25R)-螺旋甾碱烷-5-烯基-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→2)-O-[β-D-木吡喃糖基-(1→3)]-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-β-D-吡喃半乳糖苷具有显著的抗癌作用，尤其是用于治疗非小细胞肺癌。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种对肺癌具有抑制作用的化合物，其特征在于，具有如式(I)所示的结构，
2.一种制备如权利要求1所述的对肺癌具有抑制作用的式(I)所示的化合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取白英药材加入醇溶液中进行醇提，将获得的醇提取液进行精制，即得白英总碱样品，备用；
(2)将步骤(1)中的制备的白英总碱样品加入醇溶液中加热溶解，以薄层层析硅胶拌样，然后上样于硅胶层析柱中进行层析分离，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为93％～97％乙醇＝(2～3)∶1的洗脱剂进行洗脱，以薄层色谱检测，以盐酸水溶液改良的碘化铋钾显色，合并相同的流份，得到极性不同的两种组分，备用；
(3)将步骤(2)中获得的两组分中极性大的组分溶解于极性非质子性溶剂中，然后采用高效液相色谱法分离纯化，色谱条件如下：C18液相色谱柱；以乙腈为流动相A，以1％TFA水溶液为流动相B，按照以下程序进行梯度洗脱：0～10min，流动相A：流动相B的体积比为24％～26％：76％～74％→29％～31％：71％～69％；控制流动相流速为25～35mL/min；控制柱温为20-30℃；控制进样体积为0.5-1.5mL；收集所述化合物的流出液进行质谱检测成分，收集相对分子质量为1031的成分，得到式(I)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(1)中，制备白英总碱样品的具体方法为：将白英干燥全草用体积浓度为65-75％的乙醇水溶液回流提取，过滤，将滤液浓缩至50℃相对密度为1.05的浸膏，加入蒸馏水分散，过滤，取滤液加至D151大孔吸附树脂柱，依次用2～4倍柱体积的蒸馏水和2～4倍柱体积的体积浓度为93-97％乙醇水溶液洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为5-7‰的盐酸乙醇水溶液洗脱，所述盐酸乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为93-97％，收集盐酸乙醇洗脱液，用氨水中和至中性，过滤，将滤液浓缩至干，用蒸馏水分散，将分散后的药液加至AB-8大孔吸附树脂，用6～10倍柱体积的蒸馏水洗脱，弃去洗脱液，然后用3～5倍柱体积的体积浓度为93-97％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得白英总碱。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，称取白英总碱样品30-40重量份，加入300-1000体积份的体积浓度为93-97％的乙醇溶液中在温度为80-100℃下溶解，然后加入10-20重量份的薄层层析硅胶混合均匀，然后上样于加入780-820重量份的薄层层析硅胶的硅胶层析柱中进行层析分离；所述重量份与体积份的关系为g/mL。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，以体积比为乙酸乙酯-体积浓度为95％乙醇＝2.5∶1的洗脱剂进行洗脱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，所述盐酸水溶液改良碘化铋钾试液的具体方法为：
称取碱式硝酸铋0.8～0.9重量份，依次加入9～11体积份的冰醋酸、39～41体积份的水和19～21体积份的碘化钾溶液，混合均匀即得碘化铋钾试液；
向所述碘化铋钾试液中加入质量浓度为0.6mol/L的盐酸水溶液，所述碘化铋钾试液与所述盐酸水溶液的体积比为1:2，即得所述盐酸水溶液改良的碘化铋钾试液。
所述重量份与体积份的关系为g/mL。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在所述步骤(3)中，所述流动相A：流动相B的体积比为25％：75％→30％：70％。
8.如权利要求1所述的式(I)所示的化合物在制备抗肺癌药物的用途。
9.一种抗肺癌药物，其特征在于，以权利要求1所述的式(I)所示的化合物为有效成分。
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