KR20150060767A

KR20150060767A - 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법

Info

Publication number: KR20150060767A
Application number: KR1020157009565A
Authority: KR
Inventors: 료타로 미츠마타; 노리유키 이즈타니
Original assignee: 덴카 세이켄 가부시키가이샤
Priority date: 2012-10-05
Filing date: 2013-10-03
Publication date: 2015-06-03
Also published as: US10365277B2; US20150233922A1; EP2905615B1; KR102094727B1; CA2886769A1; AU2013325593B2; JPWO2014054712A1; WO2014054712A1; JP6280868B2; TW201430343A; CN104797934B; CA2886769C; EP2905615A1; CN104797934A; AU2013325593A1; EP2905615A4; TWI507688B

Abstract

2종류의 항헤마글루티닌 항체를 사용하는 샌드위치 면역 측정법보다 단기간에 측정계를 구축할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 신규 측정 방법이 개시되어 있다. 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법은 헤마글루티닌과 결합하지만 항체와 결합하지 않는 렉틴과, 그 헤마글루티닌과 항원항체반응하는 항헤마글루티닌 항체로 그 헤마글루티닌을 샌드위치하는 것을 포함하는 샌드위치 면역 측정법에 의한다.

Description

인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법{METHOD FOR MEASURING HEMAGGLUTININ FROM INFLUENZA VIRUS}

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원인 헤마글루티닌의 측정 방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 오르토믹소 바이러스과에 속하고, 바이러스 내부에 존재하는 핵 단백질 및 매트릭스 단백질의 항원성의 차이로부터 A, B 및 C형으로 분류되는 바이러스이다. 매년 유행이 보여지는 것은 A형 및 B형이며, 특히 A형 바이러스는 입자 표면 항원인 당 단백질의 차이로부터 헤마글루티닌은 16종류, 노이라미니다제는 9종류의 아형으로 분류되고, 항원성의 변이를 일으키기 쉬운 바이러스이다. 따라서, 매시즌 유행을 예측해서 백신주를 선정하지 않으면 안되고, 백신의 주요항원인 헤마글루티닌 측정용 시약도 주의 변경에 따라 준비하지 않으면 안된다.

Mahmood N, Hay AJ., An ELISA utilizing immobilised snowdrop lectin GNA for the detection of envelope glycoproteins of HIV and SIV. J Immunol Methods., 151(1992)9-13 Legastelois I., et al., Avian glycan-specific IgM monoclonal antibodies for the detection and quantitation of type A and B haemagglutinins in egg-derived influenza vaccines. J Virol Methods., 178(2011) 129-136

헤마글루티닌의 고감도이며 검체처리능이 높은 측정법으로서 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 사용한 샌드위치 ELISA법을 들 수 있지만, 주 특이적인 2종류의 항체가 필요하게 되고, 새로운 백신 제조주 또는 판데믹스 바이러스의 헤마글루티닌 측정에 모노클로날 항체를 제공하는 것은 항체 제작 기간을 감안하면 곤란하다. 또한 비특허문헌 2에 기재되는 조류의 당쇄에 특이적인 모노클로날 항체를 사용하는 측정법에서는 특수한 항체로 인해 공급량 등의 문제로부터 보급성이 낮은 측정법이 되고, 또 동물세포에서 증폭한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정에는 사용할 수 없다.

따라서, 본 발명의 목적은 2종류의 항헤마글루티닌 항체를 사용하는 샌드위치 면역 측정법보다 단기간에 측정계를 구축할 수 있는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌의 신규 측정 방법을 제공하는 것이다.

본원 발명자들은 예의 연구의 결과, 렉틴이 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 결합하고, 항체와는 결합하지 않는 것을 찾아내고, 렉틴과 항헤마글루티닌 항체로 헤마글루티닌을 샌드위치하면 필요한 항헤마글루티닌 항체는 1종류만으로 되고, 2종류의 항헤마글루티닌 항체를 사용하는 샌드위치 면역 측정법보다 단기간에 측정계를 구축하는 것이 가능한 것에 착상하여 본 발명을 완성했다.

즉, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 결합하지만 항체와 결합하지 않는 렉틴과, 상기 헤마글루티닌과 항원항체반응하는 항헤마글루티닌 항체로 상기 헤마글루티닌을 샌드위치하는 것을 포함하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법을 제공한다.

(발명의 효과)

본 발명에 의하면, 1종류의 항헤마글루티닌 항체를 이용하여 샌드위치 면역 측정에 의해 정밀도 좋게 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 측정할 수 있다.

도 1a는 부활화 전체 입자 바이러스를 이하의 각 계면활성제로 처리한 후에 자당밀도 구배 원심분리법에 의한 프랙션 해석을 웨스턴 블로팅에 의해 나타내는 도면이다. A．비처리, B. 1.0% TritonX-100처리, C. 1.0% NP-40처리, D. 1.0% Tween80처리, E. 1.0% Brij35처리, F. 1.0% CHAPS처리, G. 1.0% Zwittergent 3-14처리, H. 1.0% CTAB처리, I. 0.3% SDS처리, J. 4.0M Urea처리, K. 3.0M 염산 구아니딘 처리.
도 1b는 동상.
도 2는 하기 실시예에 있어서 행한 샌드위치 면역 측정에 의해 측정된 헤마글루티닌 농도와 흡광도의 관계를 나타낸 도면이다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 방법은 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌(이하, 단지 「헤마글루티닌」이라고 부르는 일이 있다)과 결합하지만 항체와 결합하지 않는 렉틴과, 상기 헤마글루티닌과 항원항체반응하는 항헤마글루티닌 항체로 상기 헤마글루티닌을 샌드위치하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 헤마글루티닌의 측정 방법에 따른다.

본 발명의 방법에 있어서 사용되는 렉틴은 헤마글루티닌과 결합하는 것이다. 헤마글루티닌과의 결합의 유무는 하기 참고예 2에 구체적으로 기재하는 렉틴 블롯법(PVDF 막상에 전사한 헤마글루티닌에 표지 렉틴을 반응시키고, 표지가 검출되는지의 여부)에 의해 확인할 수 있다. 또한 「항체와 결합하지 않는」이란 면역 측정에 사용되는 항체를 구성하고 있는 면역글로블린과 동종, 동급의 면역 글로불린(통상은 마우스, 토끼 또는 양 등의 IgG)과 결합하지 않는 것을 의미하고, 마우스, 토끼 및 양 등의 각 동물 유래의 IgG와는 결합하지 않는 것은 하기 참고예 3에 구체적으로 기재하는 바와 같이 각 동물의 HRP 표지 IgG와의 ELISA에 의해 측정되는 흡광도가 음성대조(blank) 평균값의 2배미만, 바람직하게는 1.5배미만인지의 여부에 의해 확인할 수 있다. 헤마글루티닌과 결합하고, 항체와 결합하지 않는 렉틴의 바람직한 예로서는 흰독말풀 렉틴(DSL), 해동피 렉틴(ECL) 및 피마자콩렉틴(RCA120)을 들 수 있다. 헤마글루티닌과 결합하고, 항체와 결합하지 않는 렉틴은 단독으로 사용할 수도 있고, 2종이상의 것을 조합해서 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법에서는 상기 렉틴을 고상에 고정화해서 샌드위치법을 행하는 것이 바람직하다. 고상으로서는 샌드위치 ELISA 등의 주지의 샌드위치 면역 측정에 있어서 사용되고 있는 어느 것이나 사용할 수 있고, 플레이트, 튜브, 비즈, 멤브레인, 겔 등을 들 수 있다. 재질로서는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 나일론, 라텍스, 유리, 가교 덱스트린, 아가로즈, 가교 아가로즈, 폴리아크릴아미드 등을 들 수 있다.

이들 고상에 렉틴을 흡착시키는 방법으로서는 공유 결합법, 물리적 흡착법, 이온 결합법 및 생화학적 특이 결합법(예를 들면 비오틴 결합 렉틴을 스트렙트아비딘 결합 고상에 결합시키는 등) 등을 채용할 수 있다. 특히 물리적 흡착법 및 생화학적 특이 결합법이 조작이 간편한 점에서 바람직하다.

여기에서, 물리적 흡착법은 예를 들면 렉틴을 0.05% Tween20(상품명)을 포함하는 pH7∼9의 완충액(예를 들면 트리스 염산 완충액 생리식염수, 인산 완충액 생리식염수, 탄산 완충액 등)에 용해해서 고상(예를 들면 마이크로 플레이트의 웰)에 첨가하고, 실온에서 1∼2시간정도 정치하거나, 4℃정도에서 밤새 정치해서 흡착시키는 방법을 들 수 있다. 또한 생화학적 특이 결합법은 스트렙트아비딘 결합 고상(플레이트나 비즈)이 시판되고 있으므로, 예를 들면 렉틴을 0.05% Tween20(상품명)을 포함하는 pH7∼9의 완충액(예를 들면 트리스 염산 완충액 생리식염수, 인산 완충액 생리식염수, 탄산 완충액 등)에 용해해서 시판의 스트렙트아비딘 결합 고상에 첨가하고, 실온에서 1∼2시간정도 정치하거나, 4℃정도에서 밤새 정치해서 흡착시키는 방법을 들 수 있다(하기 실시예 참조). 물리적 흡착법, 생화학적 특이 결합법 중 어느 것에 있어서나 고상과 반응시키는 렉틴의 농도는 특별히 한정되지 않지만, 통상 마지막 농도로 10μg/mL∼60μg/mL정도이다.

렉틴을 흡착시킨 고상 표면에는 이들이 흡착되지 않는 표면부분이 잔존하고 있는 경우가 있고, 그것에 검체중의 헤마글루티닌이나 다른 분자종이 흡착하면 정확한 측정 결과가 얻어지지 않게 될 우려가 있다. 따라서, 검체를 고상과 접촉시키기 전에 블록킹 물질을 첨가해서 렉틴이 흡착되지 않는 부분을 피복해 두는 것이 바람직하다. 이러한 블록킹 물질로서는 포유 동물, 예를 들면 소 등으로부터 채취할 수 있는 혈청 알부민, 카제인, 밀크 단백, 유산 발효물, 콜라겐 및 이들의 분해물질 등을 들 수 있고, 또한 면역 측정에 있어서의 블록킹 물질로서 시판되는 것을 사용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 항헤마글루티닌 항체는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 항원항체반응하는 것이며, 모노클로날 항체이어도 폴리클로날 항체이어도 좋다. 인플루엔자 바이러스의 형특이적으로 측정을 행할 경우에는 통상 각 형의 헤마글루티닌과 특이적으로 항원항체반응하는 항헤마글루티닌 모노클로날 항체가 사용된다.

항헤마글루티닌 항체는 통상 표지되어 있다. 표지에 사용되는 표지물질로서는 효소(퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제, β-갈락토시다아제, 후시페라제, 아세틸콜린에스테라아제 등), 아이소토프(¹²⁵I, ¹³¹I, ³H 등), 형광색소(루미놀, 플루오레세인이소티오시아네이트, 움베리페론, 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산 등), 화학발광물질, 하프텐, 비오틴, 아비딘(예를 들면 스트렙트아비딘 등)을 들 수 있지만, 통상 단백질의 표지에 사용 가능한 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 또, 여기에서 표지물질이란 비오틴과 같이 그 자체를 직접 검출하지 않고, 그 물질과 특이적으로 결합능을 갖는 물질(예를 들면 아비딘)에 검출 가능한 표지를 결합한 것을 조합해서 사용하는 방법에 사용하는 물질도 포함한다.

상술의 항체의 표지방법은 표지물질에 적합한 공지의 방법, 예를 들면 효소를 표지할 때에는 글루탈알데히드법, 과요오드산 가교법, 말레이미드 가교법, 카르보디이미드법, 활성화 에스테르법 등, 방사성 동위물질로 표지할 때에는 클로라민T법, 락토퍼옥시다아제법 등으로부터 적당하게 선택할 수 있다. 또, 표지 항헤마글루티닌 항체는 여러가지의 형에 대한 것이 시판되고 있으므로, 시판품을 사용하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법에서는 통상 상기한 고상화 렉틴과, 표지 항헤마글루티닌 항체와, 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 포함하는 검체를 반응시키고, 세정후, 고상에 결합한 표지를 측정한다.

본 발명의 방법을 적용하는 검체는 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌을 포함하는 것이면 인플루엔자 바이러스 입자를 포함하는 것이라도, 그것으로부터 헤마글루티닌을 추출한 것이라도 좋다. 헤마글루티닌을 추출할 경우에는 헤마글루티닌의 존재 양식에 상관없이 측정 가능하며, 바이러스 입자중에 존재해도 유리 헤마글루티닌으로서 존재해도 측정할 수 있고, 측정 정밀도도 높아지므로 바람직하다. 헤마글루티닌의 추출에는 양이온성 또는 음이온성 계면활성제(이하, 양자를 총칭해서 「이온성 계면활성제」)를 사용할 수 있다. 이온성 계면활성제의 바람직한 예 로서는 도데실 황산나트륨(SDS), 도데실 황산리튬(LｉDS), 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄(CTAB), 염화 헥사데실트리메틸암모늄(CTAC) 및 염화 헥사데실피리디늄(HPC)을 들 수 있고, 특히 바람직하게는 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄(CTAB)이다. 이온성 계면활성제는 단독이어도 2종이상의 것을 조합해서 사용할 수 있다.

이온성 계면활성제에서의 처리 조건은 바람직하게는 검체에 마지막 농도 0.1∼2.0%가 되도록 이온성 계면활성제를 첨가하고, 37℃에서 1∼2시간정도 정치 또는 교반해서 헤마글루티닌을 바이러스입자로부터 추출할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.

고상화 렉틴, 검체 및 표지 항헤마글루티닌 항체는 동시에 반응시켜도 좋고, 우선 고상화 렉틴과 검체를 반응시키고, 세정후, 표지 항헤마글루티닌 항체를 반응시켜도 좋고, 먼저 검체와 표지 항헤마글루티닌 항체를 반응시켜서 면역 복합물을 형성후, 고상화 렉틴과 반응시켜도 좋다. 각 반응은 실온에서 30분∼120분정도에서 행하는 것이 가능하다. 반응계중의 헤마글루티닌의 마지막 농도 범위는 통상 1ng/mL∼1μg/mL정도이며, 표지 항헤마글루티닌 항체의 마지막 농도 범위는 통상 0.2∼50μg/mL정도이다.

반응후, 고상을 세정하고, 고상에 결합한 표지를 측정한다. 세정액으로서는 예를 들면 Tween(상품명)계 계면활성제 등의 계면활성제를 첨가한 완충액(예를 들면 인산 완충액, 인산 완충액 생리식염수, 트리스 염산 완충액, 트리스 염산 완충액 생리식염수) 등을 들 수 있다. 표지물질의 검출법으로서는 사용하는 표지물질에 따라 다르지만, 예를 들면 표지물질에 비오틴을 사용할 경우에는 스트렙트아비딘 등을 통해 퍼옥시다아제 등의 효소를 표지물질로서 비오틴을 포함하는 복합체에 결합시키고, 상기 효소의 기질로서 테트라메틸벤지딘 등의 발색물질 및 과산화 수소물을 첨가하고, 효소반응에 의한 생성물의 발색의 정도를 흡광도의 변화로 측정하는 방법 등을 들 수 있다. 또한 표지물질에 형광물질이나 화학발광물질을 사용할 경우에는 반응후의 용액의 형광이나 발광을 측정하는 방법 등을 들 수 있다.

또, 표지 항헤마글루티닌 항체 대신에 표지하지 않는 항헤마글루티닌 항체를 반응시키고, 또한 표지 항임노글로블린항체를 반응시키고, 세정후, 고상에 결합한 표지를 측정하는 것도 가능하다(간접 항체법). 무엇보다, 간접 항체법에서는 항원항체반응의 횟수가 1회 많아지므로, 신속한 검사가 요구되는 경우에는 앞서 서술한 표지 항헤마글루티닌 항체를 사용하는 직접법이 바람직하다.

본 발명의 측정 방법에 있어서는 검체중의 헤마글루티닌 농도는 미리 기지농도의 헤마글루티닌 표준액을 이용하여 헤마글루티닌과 표지물질의 검출 결과의 관계에 대해서 검량선을 작성하고, 미지농도의 검체에 관한 검출 결과와 상술 검량선을 사용하는 방법에 의해 정량할 수 있다.

본 발명의 측정 방법의 바람직한 일형태를 이하에 설명한다. 우선, 고상에 렉틴을 흡착(코팅)시킨다. 바람직한 흡착 방법은 상기한 바와 같다.

상기 흡착후, 스킴 밀크 등의 블록킹 물질을 포함하는 완충액을 첨가하고, 실온에서 30∼2시간정도 정치하고, 렉틴이 흡착되지 않는 부분을 피복해 두는 것이 바람직하다.

검체중의 헤마글루티닌이 바이러스 입자중에 존재하고 있을 경우, 검체중에 마지막 농도 0.1∼2.0%가 되도록 CTAB를 첨가하고, 37℃에서 1∼2시간정도 정치 또는 교반해서 헤마글루티닌을 바이러스 입자로부터 추출한다.

이어서, 렉틴이 흡착한 고상에 검체 또는 헤마글루티닌 추출 처리를 한 검체를 첨가하고, 예를 들면 실온에서 30∼120분간의 적절한 시간정치 또는 교반하고, 상기 렉틴에 헤마글루티닌을 결합시킨다.

그 후에 이 복합체가 결합한 고상을 Tween계 계면활성제 등을 포함하는 완충액(예를 들면 트리스 염산 완충액 생리식염수, 인산 완충액 생리식염수 등) 등의 세정액으로 세정한다. 또한, 상술한 고상에 표지물질로 표지된 항헤마글루티닌 항체 또는 항헤마글루티닌 항체와 표지물질로 표지된 항항헤마글루티닌 항체를 첨가하고, 예를 들면 실온에서 30∼120분간 정치 또는 교반하고, 헤마글루티닌에 항헤마글루티닌 항체(또는 항헤마글루티닌 항체-항항헤마글루티닌 항체)를 결합시킨다. 이 조작이 의해, 고상-렉틴-헤마글루티닌-항헤마글루티닌 항체(또는 고상-렉틴-헤마글루티닌-항헤마글루티닌 항체-항항헤마글루티닌 항체)로 이루어지는 복합체를 형성시킨다. 다음에 상술한 복합체의 표지물질을 검출해서 헤마글루티닌을 측정한다.

별도로 헤마글루티닌 표준품의 농도와 표지물질의 검출 결과(예를 들면 흡광도)의 관계에 대해서 검량선을 작성하고, 미지시료에 관한 검출 결과와 상기 검량선을 이용하여 미지시료중의 헤마글루티닌을 정량한다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 조금도 한정되는 것은 아니다.

참고예 1 헤마글루티닌 추출용 계면활성제의 검토

발육 계란에서 증폭하고, 한외여과, 자당밀도 구배 원심분리법 및 베타프로피오락톤에 의해 정제 및 불활화한 A/Brisbane/59/2007주의 불활화 전체 입자 바이러스에 마지막 농도가 1.0%가 되도록 TritonX-100(상품명, 시그마 알드리치 재팬사 제품), NP-40(상품명, 나카라이테스크사 제품), Tween80(상품명, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품), Brij35(상품명, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품), CHAPS(상품명, 도우진 카가쿠 켄큐쇼사 제품), Zwittergent 3-14(상품명, Calbiochem사 제품) 및 CTAB(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)를 첨가하고, 마지막 농도가 0.3%가 되도록 SDS를 마지막 농도가 4.0M 및 3.0M이 되도록 Urea(엠피바이오재팬사 제품) 및 염산 구아니딘(엠피바이오재팬사 제품)을 첨가하고, 37℃에서 60분간 정치해서 반응시켰다. 반응 용액에 마지막 농도 20%가 되도록 자당을 첨가하고, 이것을 분획밀도 20∼50w/w%의 자당밀도 구배 원심분리법으로 17프랙션으로 분획했다. 각 프랙션 용액과 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(8% SDS, 40% 글리세롤/250mM Tris-HCI Buffer pH6.8)를 등량 혼합해서 100℃에서 5분간 정치에서 반응시켰다. 반응 용액을 12.5% 폴리아크릴아미드겔(아토사 제품 ePAGEL)로 전기영동하고, 세미 드라이식 전사 장치(아토사 제품)로 PVDF막에의 전사 반응을 행했다. 전사후의 PVDF막을 75mL의 블록킹 버퍼(10% 스킴 밀크 함유 TBS)에 침지하고, 실온에서 4시간의 마스킹 반응을 행했다. 반응후, 적당량의 TBS로 PVDF막을 3회 세정하고, 그 후 PVDF막을 항HA 항체용액(SRD(Single radial immunodiffusion)용 항혈청)에 침지해서 4℃에서 약 16시간 반응했다(1차 항체반응). 1차 항체반응후, Tween20(상품명) 함유 TBS로 PVDF막을 5회 세정하고, HRP 표지 항양항체(Bethyl사 제품) 용액을 첨가해서 실온에서 60분간 반응시켰다 (2차 항체반응). 2차 항체반응후, Tween20(상품명) 함유 TBS로 PVDF막을 5회 세정하고, Super Signal West Pico Cheiluminescent Substrate(상품명, 서모사이엔티픽사 제품)로 헤마글루티닌의 검출을 행했다. 검출에는 LAS-3000(상품명, GE 헬스케어사 제품)을 사용했다.

이에 따라 도 1에 나타내는 바와 같이 비처리의 불활화 전체 입자 바이러스나 단백질 변성제인 Urea나 염산 구아니딘 처리에서는 고밀도영역에만 헤마글루티닌이 검출되고, 비이온성 계면활성제인 TritonX-100(상품명), NP-40(상품명), Tween80(상품명) 및 Brij35(상품명)나 양이온성 계면활성제인 CHAPS(상품명) 및 Zwittergent 3-14(상품명)에서는 고밀도부터 저밀도에 걸쳐서 여러가지 밀도로 헤마글루티닌이 검출되었다. 한편, 이온성 계면활성제인 CTAB나 SDS처리에 의해 저밀도측에 헤마글루티닌의 밴드가 수속되므로 이온성 계면활성제처리가 가장 헤마글루티닌의 가용화·추출 처리에 적합한 것을 알 수 있다.

참고예 2 각종 렉틴과 헤마글루티닌의 결합

MDCK세포 및 발육 계란에서 A/California/7/2009(H1N1), A/Brisbane/59/2007(H1N1), A/Victoria/210/2009(H3N2), A/Uruguay/716/2007(H3N2), B/Brisbane/60/2008(B형 Victoria lineage) 및 B/Florida/4/2006(B형 Yamagata lineage)의 6주의 바이러스 용액을 조제했다. 조제한 바이러스와 SDS-PAGE용 샘플 버퍼(8% SDS, 40% 글리세롤/250mM Tris-HCl Buffer pH6.8)를 등량 혼합해서 100℃에서 5분간 정치로 반응시켰다. 반응 용액을 12.5% 폴리아크릴아미드겔(아토사 제품 ePAGEL)로 전기영동하고, 세미 드라이식 전사 장치(아토사 제품)로 PVDF막에의 전사 반응을 행했다. 전사후의 PVDF막을 75mL의 블록킹 버퍼(10% 스킴 밀크 함유 TBS)에 침지하고, 실온에서 4시간의 마스킹 반응을 행했다. 반응후, 적당량의 TBS로 PVDF막을 3회 세정하고, 각종 비오틴화 렉틴:VECTOR LABORATORIES사 제품)과의 반응을 실온에서 4시간 행했다. 렉틴과의 반응후, Tween20(상품명) 함유 TBS로 PVDF막을 5회 세정하고, HRP 표지 스트렙트아비딘(서모사이엔티픽사 제품) 용액을 첨가해서 실온에서 60분간 반응시켰다. 반응후, Tween20(상품명) 함유 TBS로 PVDF막을 5회 세정하고, Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(상품명, 서모사이엔티픽사 제품)로 헤마글루티닌과 렉틴의 복합체를 검출했다. 검출에는 LAS-3000(상품명, GEhealth kea사 제품)을 사용했다.

그 결과, RCA120, DSL 및 ECL 모두 발현기재로서 MDCK세포 및 발육 계란 중 어느 것을 이용하여 조제한 바이러스 유래의 헤마글루티닌에 대해서도 결합하는 것을 확인할 수 있었다.

참고예 3 각종 렉틴과 IgG의 결합

스트렙트아비딘 코팅한 마이크로 플레이트(Nunc사 제품)에 0.05% Tween20(상품명)/트리스 염산 완충액 생리식염수(TBST)로 마지막 농도가 30μg/mL가 되도록 희석한 각 비오틴화 렉틴을 100μL/웰로 첨가해서 25℃에서 2시간 반응시켰다. 렉틴 반응후, 각 웰을 Wash buffer(TBST) 300μL로 5회 세정했다. 다음에 2.5% 스킴 밀크/TBST를 각 웰에 300μL 첨가하고, 25℃에서 1시간의 블록킹을 행하고, 그 후에 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, 0.5% 스킴 밀크/TBST 또는 0.5% BSA/TBST로 희석한 HRP 표지화 IgG 항체(마우스 항체:BioSS사제 Mouse Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody(H+L), HRP Conjugated, 토끼 항체:Bethyl Laboratories사 제품 Sheep IgG-heavy and light chain antbody 양 항체: Bethyl Laboratores사제 Rabbit IgG-ｈeavy and light chain antibody)를 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 1시간 반응시켰다. 항체반응후, 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, TMB용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 200μL 첨가해서 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 1㏖/L 황산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 50μL 첨가해서 반응을 정지했다. 반응 정지후, 450nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.

결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타내는 바와 같이, RCA120, DSL 및 ECL 어느 것이나 마우스, 토끼 및 양IgG와 반응시켰을 때의 흡광도가 음성대조(blank)의 값의 2배미만이며, 마우스, 토끼 및 양IgG와 반응하지 않는 것을 알 수 있다.

또, RCA120, DSL 및 ECL 어느 것이나 헤마글루티닌과 결합하는 것은 상기 참고예 2에 있어서 확인되고 있으므로, 이들의 렉틴 어느 것을 이용하여도 헤마글루티닌을 샌드위치 면역 측정에 의해 측정 가능하다고 생각되었다.

실시예 1 샌드위치 면역 측정

NIBSC(The National Institute for Biological Standards and Control)로부터 구입한 SRD 시험용 표준항원의 바이알에 1mL의 물을 첨가하고, 5분간 정치 후에 충분하게 교반했다(50μg HA/mL). 50μL의 NIBSC 표준품(50μg HA/mL)과 50μL의 1.0% CTAB를 섞어서 충분히 교반한 후(25μg HA/mL), 37℃에서 2시간 정치했다. 이어서, 10배 희석해서 2.5μｇHA/mL의 헤마글루티닌 용액을 조제했다. 이 표준액을 희석하고, 3.13, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 250ngHA/mL의 헤마글루티닌 용액을 조제했다.

스트렙트아비딘 코팅한 마이크로 플레이트(Nunc사 제품)에 0.05% Tween20(상품명)/트리스 염산 완충액 생리식염수(TBST)로 마지막 농도가 30μg/mL가 되도록 희석한 각 비오틴화 렉틴을 100μL/웰로 첨가해서 25℃에서 2시간 반응시켰다. 렉틴 반응후, 각 웰을 Wash buffer(TBST) 300μL로 5회 세정했다. 다음에 2.5% 스킴 밀크/TBST를 각 웰에 300μL 첨가하고, 25℃에서 1시간의 블록킹을 행하고, 그 후에 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, 조제한 각 농도의 헤마글루티닌 용액을 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 2시간 반응시켰다. 반응후, 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, 0.5% 스킴 밀크/TBST로 마지막 농도 2μg/mL가 되도록 희석한 HRP 표지 항헤마글루티닌 항체(Sino Biological사제 2009H1N1 Infuenza(Swine Flu) Hemagglutinin ELISA kit 첨부)용액을 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 1시간 반응시켰다. 항헤마글루티닌 항체와의 반응후, 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, TMB 용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 200μL 첨가해서 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 1㏖/L 황산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 50μL 첨가해서 반응을 정지했다. 반응 정지후, 450nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.

표 2 및 도 2에 RCA120, DSL 및 ECL을 사용한 ELISA에 의한 헤마글루티닌 측정 결과를 나타내지만, 어느 렉틴에 있어서나 헤마글루티닌(HA) 농도와 흡광도에 양호한 상관을 확인할 수 있었다. 따라서, 헤마글루티닌 결합 렉틴 및 1종류의 항헤마글루티닌 항체로 고감도의 헤마글루티닌 측정법이 가능해진다.

실시예 2 SRD시험의 측정값과의 상관 확인

A/California/07/2009(X-179A), A/Victoria/361/2011(IVR-165) 및 B/Wisconsin/01/2010(BX-41A)의 표준 인플루엔자 HA항원(일원방사 면역확산 시험용국립감염증 연구소)의 각 바이알에 1mL의 물을 첨가하고, 5분간 정치 후에 충분하게 교반했다. 50μL의 표준 인플루엔자 HA항원용액과 50μL의 1.0% CTAB를 섞어서 충분하게 교반한 후, 37℃에서 2시간 정치했다. 이어서, 10배 희석해서 헤마글루티닌 용액을 조제했다. 이 표준액을 희석하고, 1.95, 3.91, 7.81, 31.3, 62.5 및 125ngHA/mL의 헤마글루티닌 용액을 조제해서 이것을 검량선용 표준용액으로 했다. 또한 일원방사 면역확산 시험(SRD시험)에 의해 HA농도를 값부여한 제조 공정액(A/California/07/2009(X-179A)주, A/Victoria/361/2011(IVR-165)주 및 B/Wisconsin/01/2010(BX-41A)주)도 상기 검량선용 표준용액과 마찬가지로 CTAB처리 및 희석 조작을 행해서 측정 검체로 했다.

스트렙트아비딘 코팅한 마이크로 플레이트(Nunc사 제품)에 0.05% Tween20(상품명)/트리스 염산 완충액 생리식염수(TBST)로 마지막 농도가 30μg/mL가 되도록 희석한 비오틴화 ECL을 100μL/웰로 첨가해서 25℃에서 2시간 반응시켰다. 렉틴 반응후, 각 웰을 Wash buffer(TBST) 300μL로 5회 세정했다. 다음에 2.5% 스킴 밀크/TBST를 각 웰에 300μL 첨가하고, 25℃에서 1시간의 블록킹을 행하고, 그 후에 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, 조제한 검량선용 표준용액 및 측정 검체를 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 2시간 반응시켰다. 반응후, 각 웰을 Wash buffer300μL로 5회 세정하고, 0.5% 스킴 밀크/TBST로 2500배 희석한 각 주의 참조 항혈청(일원방사 면역확산 시험용, 국립감염증 연구소)용액을 항헤마글루티닌 항체로서 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 1시간 반응시켰다. 항헤마글루티닌 항체와의 반응후, 각 웰을 Wash buffer 300μL로 5회 세정하고, 0.5% 스킴 밀크/TBST로 2500배 희석한 HRP 표지 항양 IgG 항체(Bethyl Laboratories사)를 각 웰에 100μL 첨가해서 25℃에서 1시간 반응시켰다. 항양 IgG 항체의 반응후, TMB용액(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 200μL 첨가해서 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 1㏖/L 황산(Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 제품)을 각 웰에 50μL 첨가해서 반응을 정지했다. 반응 정지후, 450nm에 있어서의 흡광도를 측정했다.

표 3, 표 4 및 표 5에 A/H1N1 아형(A/California/07/2009 X-179A), A/H3N2 아형(A/Victoria/361/2011 IVR-165) 및 B형(B/Wisconsin/01/2010 BX-41A)의 SRD시험의 측정 결과, 헤마글루티닌 결합 렉틴을 사용한 ELISA의 측정 결과 및 SRD시험의 측정값에 대한 ELISA의 측정값의 비율을 나타낸다. 표에 나타내듯이 SRD시험의 측정값에 대한 본 ELISA 측정값의 비율은 A/H1N1 아형으로 92.2∼111%, A/H3N2 아형으로 96.9%∼132%, B형으로 80.4∼91.6%가 되고, 양호한 상관을 확인할 수 있었다. 따라서, 헤마글루티닌 결합 렉틴을 사용한 본 ELISA에 의해 백신의 액정 가시험인 SRD시험 결과와 상관이 있는 측정값을 얻는 것이 가능하다.

Claims

인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌과 결합하지만 항체와 결합하지 않는 렉틴과, 그 헤마글루티닌과 항원항체반응하는 항헤마글루티닌 항체로 그 헤마글루티닌을 샌드위치하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 렉틴이 고상에 고정화되고, 상기 항헤마글루티닌 항체가 표지되어 있고, 상기 렉틴과 상기 헤마글루티닌을 통해 고상에 결합한 그 표지 항체를 측정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 렉틴은 피마자콩 렉틴, 흰독말풀 렉틴 및 해동피 렉틴으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 헤마글루티닌은 인플루엔자 바이러스를 양이온성 또는 음이온성 계면활성제로 처리함으로써 추출된 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 양이온성 또는 음이온성 계면활성제는 도데실 황산 나트륨, 도데실 황산 리튬, 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄, 염화 헥사데실트리메틸암모늄 및 염화 헥사데실피리디늄으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종인 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.
제 4 항에 있어서,
상기 계면활성제는 브롬화 헥사데실트리메틸암모늄인 것을 특징으로 하는 샌드위치 면역 측정법에 의한 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌 측정 방법.