JPWO2007074811A1 - Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法 - Google Patents
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Abstract
【課題】インフルエンザウイルス強毒株を特異的に迅速かつ簡便に検出できる方法および測定器具を提供する。【解決手段】全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法。【選択図】 図４
Description
本発明は、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を用いたＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法、詳しくは、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置に関するものであり、高病原性鳥インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス強毒株の感染を迅速かつ簡便に診断するために有用な検出法に関する。
高病原性鳥インフルエンザは、鶏などに高致死性の病原性を示すインフルエンザウイルスによる感染症で、家きんペストとも呼ばれ、わが国では家畜伝染病予防法の法定伝染病に指定されており、世界獣医事務局（ＯＩＥ）ではリストＡ疾病として掲げられている。
今までに高病原性鳥インフルエンザを引き起こしたインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスのＨ５亜型及びＨ７亜型のみである。これらの亜型が総て強毒性であるわけではないが、わが国では、強毒性及び弱毒性であるかにかかわらずこれらの亜型に家畜が感染した場合、すべて屠殺処分することとされている。
また人への鳥インフルエンザ感染はＨ５亜型、Ｈ７亜型およびＨ９亜型の感染が報告されている。このうちインフルエンザウイルスが原因で死亡者が報告されているのはＨ５Ｎ１亜型のみである。Ｈ５Ｎ１亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、死に至ることが報告されている。
Ｈ５Ｎ１亜型による高病原性鳥インフルエンザは、１９９７年に香港で流行し、さらに、２００３年から現在までアジアの数カ国で大流行し、人への感染及び死亡例も報告された。
現在、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染は世界規模で問題となっており、Ｈ１Ｎ１亜型、Ｈ３Ｎ２亜型に続く新型インフルエンザとして世界規模で警戒されている。
Ｈ５Ｎ１亜型による高病原性鳥インフルエンザは、１９９７年に香港で流行し、さらに、２００３年から現在までアジアの数カ国で大流行し、人への感染及び死亡例も報告された。
現在、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染は世界規模で問題となっており、Ｈ１Ｎ１亜型、Ｈ３Ｎ２亜型に続く新型インフルエンザとして世界規模で警戒されている。
２００５年１１月１７日のＷＨＯの報告によると、ヒトのインフルエンザＨ５Ｎ１亜型感染確定症例数は１３０例であり、内死亡者は６７例である。２００４年１２月以降、ヒトへの感染確定症例数は急激に増加し、死亡例数も増加している。Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染後の死亡率は５１．３％（６７／１３０）である。
上記からも明らかなように、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染が現実となりつつある現在、Ｈ５Ｎ１亜型感染を迅速に発見することは、大規模なインフルエンザ感染拡大を防ぐ上で重要な課題である。また迅速に診断することは治療においても重要である。
上記からも明らかなように、Ｈ５Ｎ１亜型の人への感染が現実となりつつある現在、Ｈ５Ｎ１亜型感染を迅速に発見することは、大規模なインフルエンザ感染拡大を防ぐ上で重要な課題である。また迅速に診断することは治療においても重要である。
鳥における高病原性鳥インフルエンザ診断は、現状では、ウイルス感染が疑われる病鳥から気管スワブまたはクロアカスワブ（総排泄腔スワブ）を採取し、これを発育鶏卵に接種して培養した後、ウイルスを分離する方法により行われている。しかし、この方法は、結果が得られるまでに数日を要し、迅速に結果が求められない点で不利である。また、近年開発された遺伝子検査（PCR法、LAMP法）を用いることにより、結果を得るまでに要する時間は大幅に短縮されるが、かかる遺伝子検査には特別な機器及び技術を要するため、養鶏現場等で検査を行うことは出来ない。
インフルエンザウイルスはヒト上気道、下気道などに感染し、１〜２日の潜伏期をおいた後、発熱（３８〜３９℃）と共に頭痛、腰痛、筋肉痛、全身倦怠、消化器症状などを引き起こす。インフルエンザで最も問題となる合併症は高齢者の肺炎と小児の脳炎・脳症で、特に小児の脳炎・脳症は高熱、意識障害、痙攣を特徴とし、極めて予後が悪いうえに初発症状から中枢神経系症状の発現及び死に至る期間が極めて短いので、迅速な診断と処置が必要である。
従来は、上記のような臨床症状のみでインフルエンザ様疾患として診断されることが多かったが、近年、インフルエンザウイルス抗原を迅速に検出するキットが開発され普及し始めたことから、インフルエンザウイルス感染症として早期に診断することが可能となってきた。このような迅速診断キットとしては、酵素免疫法（ＥＩＡ）やイムノクロマトグラフィー測定法を原理として用いたものが挙げられ、Ａ型インフルエンザウイルスのみを検出するもの、Ａ型とＢ型をまとめて検出するもの、Ａ型とＢ型をそれぞれ検出するものなどがある。
しかしながら現在行われているインフルエンザ抗原検査はＡ型ウイルス全てに共通な核タンパク（ヌクレオプロテイン）に対する抗体を使用している。そのためインフルエンザＡ型ウイルスであるＨ５亜型感染とＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２亜型感染との鑑別診断ができない。
しかしながら現在行われているインフルエンザ抗原検査はＡ型ウイルス全てに共通な核タンパク（ヌクレオプロテイン）に対する抗体を使用している。そのためインフルエンザＡ型ウイルスであるＨ５亜型感染とＨ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２亜型感染との鑑別診断ができない。
Ｈ５Ｎ１亜型感染は重篤な肺炎を引き起こし、且つ死亡率が非常に高い。初期診断時にＨ５亜型感染を鑑別診断することは、患者に対する治療方針を立てる上でも重要である。さらに新たな感染を防ぐために患者を早期に隔離するなどの処置を講ずることができ、更なるＨ５Ｎ１亜型感染の拡大を防ぐ上でも重要である。
また、近年開発された遺伝子検査（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法）を用いることにより、Ｈ５Ｎ１亜型を鑑別して検出することは可能であるが特別な機器及び技術を要するため簡便な方法ではない。
また、近年開発された遺伝子検査（ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法）を用いることにより、Ｈ５Ｎ１亜型を鑑別して検出することは可能であるが特別な機器及び技術を要するため簡便な方法ではない。
このように、インフルエンザウイルスは感染が速く、発見が遅れると広い範囲にわたって急速に蔓延するので、感染をできる限り早期に、且つ、迅速に発見する必要がある。特にＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型は重篤な肺炎を引き起こし、死亡率も高い。しかしながら、現在のところ、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５亜型は従来のインフルエンザウイルス抗原検出試薬では他のＡ型インフルエンザウイルス感染と鑑別して検出することはできない。
本発明の目的は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型を含むＡ型インフルエンザウイルス強毒株を迅速かつ簡便に鑑別診断できる検出試薬、及びそれを用いた検出法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置を提供することを目的とする。
本発明の目的は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型を含むＡ型インフルエンザウイルス強毒株を迅速かつ簡便に鑑別診断できる検出試薬、及びそれを用いた検出法、とりわけ、サンドイッチ式免疫測定法、特に、イムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置を提供することを目的とする。
本発明者等は、Ａ型インフルエンザウイルスを免疫原としてマウスを免疫して各種抗体を取得し、これらの抗体をイムノクロマトグラフィー測定装置において試験する過程で、インフルエンザウイルス強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するモノクローナル抗体を取得することに成功し、当該抗体を免疫測定法、特にサンドイッチ式免疫測定法、とりわけイムノクロマトグラフィー測定法で使用することにより、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株を検出し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の一局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法が提供される。
この検出法における免疫測定法としては、特に限定されるものではないが、サンドイッチ式免疫測定法、とりわけＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）法、イムノクロマトグラフィー測定法などが好ましい。
したがって、本発明の上記検出法の好ましい実施形態によれば、前記免疫測定法は、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び／又は、前記第二の抗体と該第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法から構成される。これらのサンドイッチ式免疫測定法は、前記第一の抗体および第二または第四の抗体を担体に固定して実施すると好都合である。この場合、担体として膜担体を使用すると、イムノクロマトグラフィー測定法を実施することができる。
したがって、本発明の上記検出法の好ましい実施形態によれば、前記免疫測定法は、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び／又は、前記第二の抗体と該第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法から構成される。これらのサンドイッチ式免疫測定法は、前記第一の抗体および第二または第四の抗体を担体に固定して実施すると好都合である。この場合、担体として膜担体を使用すると、イムノクロマトグラフィー測定法を実施することができる。
したがって、本発明の更に他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固定せしめて形成された第一及び第二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合液、及び、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被験試料との第二の混合液を、それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめるか、または、第一の混合液を前記捕捉部位の双方に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の捕捉部位における第二の抗体との反応が陰性であることをもってＡ型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。
また、本発明の更に他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一及び第二の抗体はそれぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及び第二の捕捉部位を形成し、前記第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第三及び第四の抗体は前記捕捉部位の双方から離隔した位置からそれぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる単一の膜担体からなるものであってもよく、または、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第二の抗体が固定された第二の膜担体とからなるものであってもよいが、後者の方が反応特異性に優れているので好ましい。後者の場合、第三の抗体は第一の膜担体上に用意しておき、第四の抗体は第二の膜担体上に用意しておくと、それぞれの膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合である。第三及び第四の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸させて用意しておくと好都合である。
上記第一の膜担体と第二の膜担体とを備える場合、第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものとし、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を相互に並行して配置させてなる、所謂イムノクトマト法テストストリップの形態にすることができる。別法として、第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものとし、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を放射方向に又は反対方向に配置させてなる、所謂イムノクトマト法テストストリップ又はイムノクトマト法テストキットの形態にすることがきる。
上記第一の膜担体と第二の膜担体とを備える場合、第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものとし、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を相互に並行して配置させてなる、所謂イムノクトマト法テストストリップの形態にすることができる。別法として、第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状すなわち帯状形状を備えるものとし、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を放射方向に又は反対方向に配置させてなる、所謂イムノクトマト法テストストリップ又はイムノクトマト法テストキットの形態にすることがきる。
上記した方法及び装置は、すべて、上記第二の抗体を担体に固定しておく方法である。しかしながら、本発明の好ましい実施形態によれば、上記第二の抗体を担体に固定しない方法を採用することもできる。
すなわち、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用い、前記第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された第一の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第二の抗体と被験試料とを含む第一の混合液、及び、前記第三の抗体と前記被験試料とを含む第二の混合液を、それぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における前記第三の抗体の反応が陽性で且つ前記第一の捕捉部位における前記第二の抗体の反応が陰性であることをもってＡ型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。この測定法では、膜担体は第一の抗体が固定された一種類の膜担体を用意すればよいが、第一の混合液のクロマト展開と第二の混合液のクロマト展開の２回のクロマト展開を必要とし、各クロマト展開用に、膜担体を合計２枚必要とする。
すなわち、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用い、前記第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された第一の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第二の抗体と被験試料とを含む第一の混合液、及び、前記第三の抗体と前記被験試料とを含む第二の混合液を、それぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における前記第三の抗体の反応が陽性で且つ前記第一の捕捉部位における前記第二の抗体の反応が陰性であることをもってＡ型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法が提供される。この測定法では、膜担体は第一の抗体が固定された一種類の膜担体を用意すればよいが、第一の混合液のクロマト展開と第二の混合液のクロマト展開の２回のクロマト展開を必要とし、各クロマト展開用に、膜担体を合計２枚必要とする。
また、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二及び第三の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第二及び第三の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置からそれぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
上記測定装置において、膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第一の抗体が固定された第二の膜担体とから少なくとも構成することが好ましい。そして、第二の抗体を第一の膜担体上に用意しておき、第三の抗体を第二の膜担体上に用意しておくと、両膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合である。第二及び第三の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸させて用意しておくことが好ましい。
上記測定装置において、膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第一の抗体が固定された第二の膜担体とから少なくとも構成することが好ましい。そして、第二の抗体を第一の膜担体上に用意しておき、第三の抗体を第二の膜担体上に用意しておくと、両膜担体に被験試料を注入するだけで測定が行えるので好都合である。第二及び第三の抗体は、それぞれ、第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸させて用意しておくことが好ましい。
本発明の検出法及び測定方法は、キャピリア(登録商標）FluA+B（株式会社タウンズ製）などの市販のＡ型及びＢ型インフルエンザ鑑別測定用のイムノクロマト法テストストリップまたはキットと、上記第一の抗体及び第二の抗体を用いたサンドイッチ式免疫測定装置とを組み合わせて実施できる。
したがって、かかる実施形態のために、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第二の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第一の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
したがって、かかる実施形態のために、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第二の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第一の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
また、同様の実施形態のために、本発明の他の局面によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置が提供される。
本発明で使用する上記第一及び第二の抗体は、それぞれ、インフルエンザウイルスに対する抗体であればよいが、通常、インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体として得られる。上記第一及び第二の抗体は、それぞれ、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、反応特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
上記第一の抗体としては、通常、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する公知のモノクローナル抗体を用いることができる。
上記第二の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する各種モノクローナル抗体について、各種Ａ型インフルエンザウイルス亜型に対する反応性を研究する過程で得られたものである。
上記第一の抗体としては、通常、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する公知のモノクローナル抗体を用いることができる。
上記第二の抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する各種モノクローナル抗体について、各種Ａ型インフルエンザウイルス亜型に対する反応性を研究する過程で得られたものである。
上記ポリクローナル抗体は、第一の抗体の場合、例えば、配列番号６に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のうち、エピトープを構成するアミノ酸残基を含む部分に対応するＤＮＡ断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。第二の抗体の場合、例えば、配列番号６に記載されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列のうち、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型と異なるエピトープを構成するアミノ酸残基を含む部分に対応するＤＮＡ断片をクローニングし、当該クローン化遺伝子を大腸菌などの宿主で遺伝子工学的に発現させて発現蛋白を抽出および精製し、この精製蛋白を抗原として常法に従って動物を免疫し、その抗血清から取得することができる。
モノクローナル抗体は、第一及び第二の抗体の場合、例えば、上記と同様に得られた精製蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株を前記のようにして得られた精製蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより選別することで、取得することができる。
モノクローナル抗体は、第一及び第二の抗体の場合、例えば、上記と同様に得られた精製蛋白を抗原としてマウスのような動物を免疫したのち、この免疫された動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合して得られた融合細胞をＨＡＴ含有培地でセレクトした後に増殖せしめ、増殖せしめた株を前記のようにして得られた精製蛋白を使用して、たとえば、酵素標識免疫法などにより選別することで、取得することができる。
上記第二の抗体として使用されるモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するモノクローナル抗体であり、とりわけ、インフルエンザウイルス強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザに保存されているが、インフルエンザウイルス強毒株において変異して消失しているエピトープ、とりわけ、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクのエピトープを認識するものである。かかるＡ型インフルエンザウイルスのエピトープは、インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１型においては、アミノ酸配列が置換されているか、または、異なる糖鎖修飾が生じたことにより変異しているため、上記第二の抗体によって特異的に認識されないものと考えられる。このようなモノクローナル抗体は従来知られておらず、新規である。
したがって、本発明の他の局面によれば、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するモノクローナル抗体が提供される。とりわけ、該モノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型の核タンパクに対して反応しないが、該Ｈ５Ｎ１亜型以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するものである。
本発明において、イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で使用する第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であればよく、第一の抗体と同一の抗体あってもよく、第一の抗体以外の抗体であってもよい。例えば、該抗原が第一の抗体に対するエピトープを複数備える場合は、第三の抗体として第一の抗体と同一の抗体を使用できる。したがって、第三の抗体は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であってよい。また、第三の抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、反応特異性の点から、モノクローナル抗体、特にインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。
本発明において、イムノクロマトグラフィー測定法などのサンドイッチ式免疫測定法で使用する第四の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に対して反応する抗体であればよく、第二の抗体と同一の抗体あってもよく、第二の抗体以外の抗体であってもよい。例えば、該抗原が第二の抗体に対するエピトープを複数備える場合は、第四の抗体として第二の抗体と同一の抗体を使用できる。したがって、第四の抗体は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であってよく、または、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であってもよい。また、第四の抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいが、反応特異性の点から、モノクローナル抗体、特にインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。第四の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である場合、第四の抗体は第三の抗体と同じ抗体であってもよい。
現在のところ、Ａ型インフルエンザウイルス亜型としてＨ（ヘマグルチニン）蛋白については１６種類、Ｎ（ノイラミダーゼ）蛋白については９種の亜型が知られており、理論上は１６×９＝１４４種の亜型が考えられるが、一般的には、このうち、Ｈ１〜１５亜型の代表例に対して反応する抗体が「全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体」と理解されている。したがって、本明細書において、「全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型」とは、現在知られているＨ１〜１５亜型の代表例を意味し、具体的には、本明細書の後記表２に挙げられた株を意味する。同様に、「強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型」とは、Ｈ１〜１５亜型の代表例、具体的には、本明細書の後記表２に挙げられた株から強毒株を除いた株を意味する。「強毒株」とは、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株を意味する。また、Ａ型インフルエンザウイルスの核タンパクに対する抗体は、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの何れの核タンパクとも交差反応性を示さないものであり、同様に、本発明の第一及び第二の抗体も、Ｂ型及びＣ型インフルエンザウイルスの何れの核タンパクとも交差反応性を示さないものである。
また、本明細書において、「抗体との反応が陽性」とは、抗原が抗体と抗原抗体反応することを意味し、「抗体との反応が陰性」とは、抗原が抗体と抗原抗体反応しないことを意味する。
また、本明細書において、抗体が「Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しない」とは、抗体がＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型並びにＨ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種の何れの部分とも全く抗原抗体反応しないか、抗原抗体反応してもわずかであり、その使用状態、例えば、膜担体などに固定した時に抗原抗体反応を示さない場合も包含する。
また、本明細書において、抗体が「Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しない」とは、抗体がＡ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型並びにＨ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種の何れの部分とも全く抗原抗体反応しないか、抗原抗体反応してもわずかであり、その使用状態、例えば、膜担体などに固定した時に抗原抗体反応を示さない場合も包含する。
本発明によれば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を第一の抗体として用い、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を第二の抗体として用いることによって、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出すること可能となる。この検出法は、インフルエンザウイルス強毒株を選択的すなわち特異的に検出するために使用でき、ヒト、鳥等のインフルエンザウイルス強毒株による感染症の診断に広く適用できる。
また、本発明のイムノクロマトグラフィー測定法およびイムノクロマトグラフィー測定装置によれば、特殊な機器及び熟練した技術を必要とすることなく、病院、養鶏現場等において簡便かつ迅速にインフルエンザウイルス強毒株の検出及び該ウイルスによる感染を診断することが可能となる。
本発明のイムノクロマトグラフィー測定法を実施するために使用できる測定装置は、公知のイムノクロマト法テストストリップの構成に準拠して容易に実施できる。以下、その具体例を図面に基づいて説明する。
（１）単一のイムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図１に示されるテストストリップ１０が挙げられる。図１において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４は捕捉部位、５は吸収用部材、６は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート１の中程に貼り付けられている。膜担体３には、そのクロマト展開始点側、すなわち図１の左側（以下「上流側」と記す。なお、その逆の側、すなわち図１におけるクロマト展開方向側すなわち右側は以下「下流側」と記す。）の末端から下流側に7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体とＡ型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に10.5mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体（図１の装置では、後述のとおり、第三の抗体と同一であってもよい）と強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｂが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に15.0mmの位置に所謂コントロールライン４２が設けられている。このコントロールライン４２は、分析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通常、前記第三及び／又は第四の抗体と免疫学的に特異的に結合する物質（分析対象物質を除く）を膜担体３に固定化することによって形成することができる。例えば、第三及び／又は第四の抗体としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対する抗体を用いることができる。
イムノクロマト法テストストリップの具体例としては、例えば図１に示されるテストストリップ１０が挙げられる。図１において、数字１は粘着シート、２は含浸部材、３は膜担体、４は捕捉部位、５は吸収用部材、６は試料添加用部材を示している。
図示の例では、膜担体３は、幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース製メンブレンフィルターからなり、同幅の粘着シート１の中程に貼り付けられている。膜担体３には、そのクロマト展開始点側、すなわち図１の左側（以下「上流側」と記す。なお、その逆の側、すなわち図１におけるクロマト展開方向側すなわち右側は以下「下流側」と記す。）の末端から下流側に7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体とＡ型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に10.5mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体（図１の装置では、後述のとおり、第三の抗体と同一であってもよい）と強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの核タンパク等のウイルス抗原との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｂが形成されている。さらに、膜担体３の上流側の末端から下流側に15.0mmの位置に所謂コントロールライン４２が設けられている。このコントロールライン４２は、分析対象物質の存否に係わらず反応が行われたことを確認するためのものであり、通常、前記第三及び／又は第四の抗体と免疫学的に特異的に結合する物質（分析対象物質を除く）を膜担体３に固定化することによって形成することができる。例えば、第三及び／又は第四の抗体としてマウス抗体を用いた場合は、該マウス抗体に対する抗体を用いることができる。
図１の装置では、膜担体３は、ニトロセルロース製メンブレンフィルターを用いているが、被験試料に含まれる分析対象物質をクロマト展開可能で、かつ、捕捉部位４を形成する抗体を固定可能なものであれば、いかなるものであってもよく、他のセルロース類膜、ナイロン膜、ガラス繊維膜なども使用できる。
図１の装置において、第一の抗体としては、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。第二の抗体としては、強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
図１の装置において、第一の抗体としては、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。第二の抗体としては、強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることが好ましい。
本発明において、第三の抗体は、第一の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり、好ましくは、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応する抗体であり、多くの場合、第一の抗体と同一の抗体を用いることができる。また、第四の抗体は、第二の抗体が反応する抗原に反応する抗体であり、例えば、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体、及び、強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するモノクローナル抗体を用いることができる。すなわち、第四の抗体は、第一の抗体と同一の抗体であってもよく、また、第二の抗体と同一の抗体であってもよく、また、第三の抗体と同一の抗体であってもよい。図１の装置では、第三及び第四の抗体としては、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異なる抗体が用いられ、多くの場合、第三及び第四の抗体として第一の抗体と同一のモノクローナル抗体を使用することができる。
第三及び第四の抗体は、イムノクロマト法テストストリップ１０とは別体の適当な容器内で、被験試料及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液を図示のイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６に注入して膜担体３をクロマト展開させてもよい。しかし、被験試料と展開溶媒とを混合して調製した混合液を試料添加用部材６に注入した時、第三及び第四の抗体が、該混合液と混合して膜担体３へクロマト展開されるように、イムノクロマト法テストストリップ１０と一体化して配置しておくことが好ましい。このために、図１の装置では、第三及び第四の抗体は、適当な標識物質で予め標識された状態で、膜担体３の上流側の端部に連接した含浸部材２に含浸させてイムノクロマト法テストストリップ１０の一部を構成している。なお、本明細書において、標識された状態の第三の抗体及び／又は第四の抗体を標識抗体と称することがある。
図示の例では、含浸部材２として、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
図示の例では、含浸部材２として、5mm×15mmの帯状のガラス繊維不織布を用いているが、これに限定されるものではなく、例えば、セルロース類布（濾紙、ニトロセルロース膜等）、ポリエチレン、ポリプロピレン等の多孔質プラスチック布類なども使用できる。
第三及び第四の抗体の標識物質としては、使用可能なものであればいかなる物質であってもよく、呈色標識物質、酵素標識物質、放射線標識物質などが挙げられる。
このうち、捕捉部位４での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
含浸部材２は、標識抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
このうち、捕捉部位４での色の変化を肉眼で観察することにより迅速かつ簡便に判定できる点から、呈色標識物質を用いることが好ましい。
呈色標識物質としては、金コロイド、白金コロイド等の金属コロイドの他、赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラテックスなどの合成ラテックスや、天然ゴムラテックスなどのラテックスが挙げられ、このうち、金コロイドなどの金属コロイドが特に好ましい。
含浸部材２は、標識抗体の懸濁液を前記ガラス繊維不織布等の部材に含浸せしめ、これを乾燥させることなどによって作製できる。
イムノクロマト法テストストリップ１０は、図１に示されるように、膜担体３を粘着シート１の中程に貼着し、該膜担体３の上流側の末端の上に、含浸部材２の下流側の末端を重ね合わせて連接するとともに、この含浸部材２の上流側部分を粘着シート１に貼着して作成できる。
さらに、図１の装置では、含浸部材２の上面に試料添加用部材６の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材６の上流側部分を粘着シート１に貼着しており、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材５の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材５の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめてイムノクロマト法テストストリップ１０を構成している。
さらに、図１の装置では、含浸部材２の上面に試料添加用部材６の下流側部分を載置するとともに、該試料添加用部材６の上流側部分を粘着シート１に貼着しており、また、膜担体３の下流側部分の上面に吸収用部材５の上流側部分を載置するとともに、該吸収用部材５の下流側部分を粘着シート１に貼着せしめてイムノクロマト法テストストリップ１０を構成している。
試料添加用部材６としては、例えば、多孔質ポリエチレンおよび多孔質ポリプロピレンなどのような多孔質合成樹脂のシートまたはフィルム、ならびに、濾紙および綿布などのようなセルロース製の紙または織布もしくは不織布を用いることができる。
吸収用部材５は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
吸収用部材５は、液体をすみやかに吸収、保持できる材質のものであればよく、綿布、濾紙、およびポリエチレン、ポリプロピレン等からなる多孔質プラスチック不織布等を挙げることができるが、特に濾紙が最適である。
図１のイムノクロマト法テストストリップ１０は、そのまま、ディップスティック形式の測定装置として用いることもでき、別法としては、適当なプラスチックシートで裏打ち又はサンドイッチしたディップスティック形式の測定装置として提供してもよい。好ましくは、図１のイムノクロマト法テストストリップ１０は、試料添加用部材６と捕捉部位４の上方にそれぞれ被験試料注入部と判定部が開口された適当なプラスチック製ケース内に収容された測定装置として提供される。上述のとおり、本発明において、第三及び第四の抗体は、イムノクロマト法テストストリップ１０とは別体の適当な容器内で、被験試料及び展開溶媒と混合して混合液とした後、この混合液をイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６に注入して膜担体３をクロマト展開させてもよいので、イムノクロマト法テストストリップ１０をケース内に収容させた場合、第三及び第四の抗体は、含浸部材２に含浸させてケース内に収容してもよいし、また、該ケースとは別体の適当な容器内に収容してケース外に収容しておいてもよい。
かくして、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型などの強毒株感染が疑われる患者の生体試料などからなる被験試料を必要に応じて適当な展開溶媒と混合してクロマト展開可能な混合液を得た後、当該混合液を図１に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、抗原抗体反応により該強毒株ウイルスのウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、第二の捕捉部位４１ｂに固定された第二の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。これに対し、該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、第一の捕捉部位４１ａ及び第二の捕捉部位４１ｂの両方において陽性の結果が示される。したがって、第一及び第二の捕捉部位の結果を総合することで、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、抗原抗体反応により該強毒株ウイルスのウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成される。
この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、第二の捕捉部位４１ｂに固定された第二の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。これに対し、該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、第一の捕捉部位４１ａ及び第二の捕捉部位４１ｂの両方において陽性の結果が示される。したがって、第一及び第二の捕捉部位の結果を総合することで、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
陽性か陰性かの判定は、標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が使用されていれば、当該呈色標識物質の集積により第一及び第二の捕捉部位４１ａ，４１ｂが発色するので、直ちに、判定することができる。
図１の装置においては、第二の捕捉部位４１ｂが第一の捕捉部位４１ａの下流側にあるので、第二の捕捉部位４１ｂの検出感度が落ちる傾向があるので、第二の捕捉部位４１ｂに固定する抗体の量を第一の捕捉部位４１ａに固定する抗体の量よりも多くするなどの方法で、感度調整することが好ましい。
図１の装置においては、第二の捕捉部位４１ｂが第一の捕捉部位４１ａの下流側にあるので、第二の捕捉部位４１ｂの検出感度が落ちる傾向があるので、第二の捕捉部位４１ｂに固定する抗体の量を第一の捕捉部位４１ａに固定する抗体の量よりも多くするなどの方法で、感度調整することが好ましい。
被験試料としては、特に制限はないが、例えば、クロアカスワブ、気管スワブ、糞便、鼻腔吸引液、鼻腔ぬぐい液および咽頭ぬぐい液、血液（全血でも、血清でも、血漿でもよい）、唾液、尿、臓器乳剤等が挙げられる。被験試料は、展開溶媒などの適当な希釈液で希釈して膜担体に注入してもよい。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
なお、全血を被験試料として用いるときで、特に標識抗体の標識物質として金コロイドなどの呈色標識物質が用いられる場合、前記試料添加用部材に血球捕捉膜部材を配置しておくことが好ましい。血球捕捉膜部材は、前記含浸部材と前記試料添加用部材との間に積層することが好ましい。これにより、赤血球が膜担体に展開されるのが阻止されるので、膜担体の捕捉部位における呈色標識の集積の確認が容易になる。血球捕捉膜部材としては、カルボキシメチルセルロース膜が用いられ、具体的には、アドバンテック東洋株式会社から販売されているイオン交換濾紙ＣＭ（商品名）や、ワットマンジャパン株式会社から販売されているイオン交換セルロースペーパーなどを用いることができる。
（２）２つのイムノクロマト法テストストリップを用いる実施形態
図２の装置は、２本のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０からなるイムノクロマトグラフィー測定装置である。各イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０は、捕捉部位４及び標識抗体の構成を除いて図１のイムノクロマト法テストストリップ１０の構成と同様である。図２のイムノクロマト法テストストリップ１０は、膜担体３の上流側の末端から7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている点は図１と同様であるが、膜担体３の上流側の末端から10.5mmの位置に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が固定され、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出する捕捉部位４１ｂが設けられている点で図１と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ１０の含浸部材２には、標識された第三の抗体及び標識された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第三の抗体としては、多くの場合、第一の抗体と同様の抗体が使用できる。抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体としては、公知のイムノクロマトグラフィー測定装置に使用されている抗体が使用できる。
図２のイムノクロマト法テストストリップ２０は、膜担体３の上流側の末端から9.0mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｃが形成されている点で図１のイムノクロマト法テストストリップ１０と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ２０の含浸部材２には、標識された第四の抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第四の抗体としては、第二の抗体と同様の抗体が使用されているが、第一の抗体と同様の抗体を使用してもよい。
図２の装置は、２本のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０からなるイムノクロマトグラフィー測定装置である。各イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０は、捕捉部位４及び標識抗体の構成を除いて図１のイムノクロマト法テストストリップ１０の構成と同様である。図２のイムノクロマト法テストストリップ１０は、膜担体３の上流側の末端から7.5mmの位置に第一の抗体が固定され、第三の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第一の捕捉部位４１ａが形成されている点は図１と同様であるが、膜担体３の上流側の末端から10.5mmの位置に抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が固定され、Ｂ型インフルエンザウイルスを検出する捕捉部位４１ｂが設けられている点で図１と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ１０の含浸部材２には、標識された第三の抗体及び標識された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第三の抗体としては、多くの場合、第一の抗体と同様の抗体が使用できる。抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体としては、公知のイムノクロマトグラフィー測定装置に使用されている抗体が使用できる。
図２のイムノクロマト法テストストリップ２０は、膜担体３の上流側の末端から9.0mmの位置に第二の抗体が固定され、第四の抗体と分析対象物質との複合体を捕捉するための第二の捕捉部位４１ｃが形成されている点で図１のイムノクロマト法テストストリップ１０と異なる。そして、イムノクロマト法テストストリップ２０の含浸部材２には、標識された第四の抗体が、標識抗体として含浸されている。ここで、第四の抗体としては、第二の抗体と同様の抗体が使用されているが、第一の抗体と同様の抗体を使用してもよい。
かくして、図１を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図２に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０のそれぞれの試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応により該強毒株ウイルス抗原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該強毒株ウイルス抗原と第四の抗体との複合体は形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応により該強毒株ウイルス抗原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該強毒株ウイルス抗原と第四の抗体との複合体は形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
これに対し、該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応によりそのウイルス抗原と第三の抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においても、該ウイルス抗原と第四の抗体との複合体が形成され、膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達し、そこに固定された第二の抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈する。
また、該混合液中にＢ型インフルエンザウイルスが存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、抗原抗体反応によりそのウイルス抗原と抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体との複合体が形成される。この複合体は、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４に到達し、捕捉部位４１ｂに固定された抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体と抗原抗体反応して捕捉され陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位４１ａに固定された第一の抗体には捕捉されず陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と第四の抗体との複合体が形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達するが、そこに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
したがって、第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
したがって、第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図２の装置は、２つのイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０を少なくとも備えていればよく、２つのストリップが１つのケースに収容されたものであっても、各ストリップが数本ずつ各ケースに収容され、使用時に１つずつ取り出して使用するような形態のものであってもよい。前者の場合、１つのケース中に、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させ、両膜担体を相互に並行して配置させた一体製品としてもよい。
なお、図２のイムノクロマト法テストストリップ１０としては、キャピリア(登録商標）FluA+B（株式会社タウンズ製）などの市販のＡ型及びＢ型インフルエンザ鑑別測定用のイムノクロマト法テストストリップまたはキットをそのまま用いることもできる。したがって、かかる市販のテストストリップまたはキットと併用して本発明の検出法又は測定法を実施できるように、図２のイムノクロマト法テストストリップ２０のみを単品で供給することもできる。
なお、図２のイムノクロマト法テストストリップ１０としては、キャピリア(登録商標）FluA+B（株式会社タウンズ製）などの市販のＡ型及びＢ型インフルエンザ鑑別測定用のイムノクロマト法テストストリップまたはキットをそのまま用いることもできる。したがって、かかる市販のテストストリップまたはキットと併用して本発明の検出法又は測定法を実施できるように、図２のイムノクロマト法テストストリップ２０のみを単品で供給することもできる。
図３の装置は、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０が共通する単一の含浸部材２及び試料添加用部材６を備える以外、図２の構成と同様の構成を備えている。すなわち、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体３は、互いに隣接してほぼ平行に配置され、上流側の末端に幅広の（幅約１２ｍｍ）の単一の含浸部材２が両膜単体３にまたがって連接されている。この含浸部材２には、第三の抗体と第四の抗体と抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体とが上記と同様にクロマト展開可能なように配置されるが、この態様では、図１の装置と同様に、第三の抗体及び第四の抗体の何れも全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体を使用することが好ましく、好都合には、何れも第一の抗体と同じ抗体とすることができる。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図３に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、図２と同様に第一の捕捉部位４１ａにおいて陽性の結果を呈し、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該強毒株ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成されるが、第二の捕捉部位４１ｃに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、第一の捕捉部位４１で陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達し、そこに固定された第二の抗体に捕捉され、陽性の結果を呈する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、図２と同様に第一の捕捉部位４１ａにおいて陽性の結果を呈し、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該強毒株ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成されるが、第二の捕捉部位４１ｃに固定された第二の抗体に捕捉されず陰性の結果を呈する。
該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、第一の捕捉部位４１で陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達し、そこに固定された第二の抗体に捕捉され、陽性の結果を呈する。
また、該混合液中にＢ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、捕捉部位４１ｂで陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位４１ａで陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、図２と同様に、第二の捕捉部位４１ｃにおいて陰性の結果を呈する。
したがって、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図３の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
したがって、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図３の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
図４の装置は、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０が共通する単一の粘着テープ１及び単一の試料添加用部材６を備える以外、図２の構成と同様の構成を備えている。すなわち、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体３は、相互に反対向きにほぼ一直線状に配置されている。具体的には、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０は、両者の含浸部材２の上流側端部が適当な間隔をおいて相互に対向するようにすなわち反対方向に一直線上に配置されており、単一の試料添加用部材６が両含浸部材２の間にまたがって連接するように配置されている。別法として、イムノクロマト法テストストリップ１０及び２０の両膜担体が互いに角度を為して延在するように、放射方向に配置してもよい。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図４に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して両テストストリップ１０及び２０の含浸部材２において、標識抗体と混合する。そして、図２と同様に、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を図４に示されるイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して両テストストリップ１０及び２０の含浸部材２において、標識抗体と混合する。そして、図２と同様に、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図４の装置は、適当なケースに収容した形態のものであってもよい。
図４の装置の変形として、粘着シート１及び試料添加用部材６の他に、含浸部材２をテストストリップ１０及び２０に共通のものとしてもよい。この場合、図３の態様に準じて第三及び第四の抗体を構成して実施することができる。
図４の装置は、上記被験試料を含む混合液がテストストリップ１０及び２０に均等に浸透するので、図１の装置のように第一及び第二の捕捉部位４１ａ，４１ｂの感度調整をする必要がない点で好都合である。
図４の装置の変形として、粘着シート１及び試料添加用部材６の他に、含浸部材２をテストストリップ１０及び２０に共通のものとしてもよい。この場合、図３の態様に準じて第三及び第四の抗体を構成して実施することができる。
図４の装置は、上記被験試料を含む混合液がテストストリップ１０及び２０に均等に浸透するので、図１の装置のように第一及び第二の捕捉部位４１ａ，４１ｂの感度調整をする必要がない点で好都合である。
（３）第二の抗体を標識抗体として用いる実施形態
図２の装置は、第二の抗体を標識抗体として用いた本発明の態様を実施するための装置に改変することができる。かかる装置は、図２の装置において、イムノクロマト法テストストリップ２０の第二の捕捉部位４１ｃに第二の抗体の代わりに第一の抗体を固定し、該ストリップ２０の含浸部材２に含浸させておく標識抗体として第四の抗体の代わりに第二の抗体を使用することによって構成できる。かかる装置において、イムノクロマト法テストストリップ１０の構成は図２のものと全く同じである。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を上記改変した図２の装置のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０のそれぞれの試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
図２の装置は、第二の抗体を標識抗体として用いた本発明の態様を実施するための装置に改変することができる。かかる装置は、図２の装置において、イムノクロマト法テストストリップ２０の第二の捕捉部位４１ｃに第二の抗体の代わりに第一の抗体を固定し、該ストリップ２０の含浸部材２に含浸させておく標識抗体として第四の抗体の代わりに第二の抗体を使用することによって構成できる。かかる装置において、イムノクロマト法テストストリップ１０の構成は図２のものと全く同じである。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を上記改変した図２の装置のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０のそれぞれの試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して含浸部材２において、標識抗体と混合する。
その際、該混合液中にＡ型インフルエンザウイルス強毒株が存在すれば、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、図２と同様に第一の捕捉部位４１ａにおいて陽性の結果を呈し、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該強毒株ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成されず、両者はそれぞれ単独に膜担体３中をクロマト展開されて第二の捕捉部位４１ｃに到達し、強毒株ウイルス抗原は第二の捕捉部位４１ｃに固定された第一の抗体に捕捉されるが、標識抗体が結合していないので、陰性の結果を呈する。
該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、第一の捕捉部位４１で陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４１に到達し、第二の捕捉部位４１ｃにて第一の抗体に捕捉され、陽性の結果を呈する。
該混合液中に強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、第一の捕捉部位４１で陽性の結果を呈するが、捕捉部位４１ｂでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、該ウイルス抗原と標識抗体との複合体が形成され、膜担体３中をクロマト展開されて捕捉部位４１に到達し、第二の捕捉部位４１ｃにて第一の抗体に捕捉され、陽性の結果を呈する。
また、該混合液中にＢ型インフルエンザウイルスが存在すれば、図２と同様に、イムノクロマト法テストストリップ１０においては、捕捉部位４１ｂで陽性の結果を呈するが、第一の捕捉部位４１ａでは陰性の結果を呈する。イムノクロマト法テストストリップ２０においては、第二の捕捉部位４１ｃにおいて陰性の結果を呈する。
したがって、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
したがって、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
図４の装置も、上記と同様の変更を行うことで、第二の抗体を標識抗体として用いた本発明の態様を実施するための装置に改変することができる。すなわち、図４の装置において、イムノクロマト法テストストリップ２０の第二の捕捉部位４１ｃに第二の抗体の代わりに第一の抗体を固定し、該ストリップ２０の含浸部材２に含浸させておく標識抗体として第四の抗体の代わりに第二の抗体を使用することによって改変することができる。なお、イムノクロマト法テストストリップ１０の構成は図４のものと全く同じである。
かくして、図２を参照して上記したと同様の方法で被験試料を含む混合液を得た後、当該混合液を上記改変した図４のイムノクロマト法テストストリップ１０及び２０に共通の試料添加用部材６上に注入すると、該混合液は、該試料添加用部材６を通過して両テストストリップ１０及び２０の含浸部材２において、標識抗体と混合する。そして、上記改変した図２の装置と同様に、前記第一の捕捉部位４１ａ、第二の捕捉部位４１ｃ及び捕捉部位４１ｂにおける結果をもって、強毒株の感染か、強毒株以外のＡ型インフルエンザウイルスの感染か、Ｂ型インフルエンザウイルスの感染かを鑑別判定できる。
下記の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。
実施例１（A型およびB型インフルエンザウイルスの組換え核タンパク（ＮＰ）遺伝子のクローニング）
インフルエンザウイルスA型であるA/Puerto Rico/8/34（H1N1）およびインフルエンザウイルスB型であるB/Lee/40を発育鶏卵に接種し、培養した。数日後に漿尿液を採取しウイルスを得た。このウイルスにRNA抽出試薬（TRIzol Reagent, Invitrogen）を加え、それぞれのウイルスRNAを抽出した。抽出したRNAから逆転写反応を行いNP遺伝子のcDNAを作製した。逆転写反応に用いたプライマーとしてUni 12 Primer : 5’-AGCAAAAGCAGG-3’（配列番号１）を用いた。
インフルエンザウイルスA型であるA/Puerto Rico/8/34（H1N1）およびインフルエンザウイルスB型であるB/Lee/40を発育鶏卵に接種し、培養した。数日後に漿尿液を採取しウイルスを得た。このウイルスにRNA抽出試薬（TRIzol Reagent, Invitrogen）を加え、それぞれのウイルスRNAを抽出した。抽出したRNAから逆転写反応を行いNP遺伝子のcDNAを作製した。逆転写反応に用いたプライマーとしてUni 12 Primer : 5’-AGCAAAAGCAGG-3’（配列番号１）を用いた。
得られたA/Puerto Rico/8/34およびB/Lee/40のNP遺伝子cDNAよりポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法を用いてNP遺伝子を増幅した。プライマーとしてA/Puerto Rico/8/34においては、sense primer: 5’-GGAATTCCATATGGCGTCCCAAGGCACC-3’（配列番号２）およびantisense primer: 5’-CCGCTCGAGTTAATTGTCGTACTCCTCTGC-3’（配列番号３）を用いた。またB/Lee/40においては、sense primer: 5’-CGGGATCCATATGTCCAACATGGATATTG-3’（配列番号４）およびantisense primer: 5’-CCGCTCGAGTTAATAATCGAGGTCATCATA-3’（配列番号５）を用いた。用いたプライマーはベクターpET15bに組み込むためにupper primerとlower primerにそれぞれNde IとXho Iサイトを付加した。
得られたPCR産物の一部をDNA電気泳動で増幅を確認した後、それぞれの増幅産物を制限酵素NdeIおよびXbaIにて切断し、同じ制限酵素で切断したベクターpET15bに挿入した。
得られたPCR産物の一部をDNA電気泳動で増幅を確認した後、それぞれの増幅産物を制限酵素NdeIおよびXbaIにて切断し、同じ制限酵素で切断したベクターpET15bに挿入した。
実施例２（組換え核タンパク（NP蛋白）の発現と精製）
目的遺伝子が挿入された実施例1のベクターpET15bでE.coli BL21CodonPlusを形質転換し、アンピシリン選択培地上で培養し、コロニーを得た。アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(25μg/ml)を含むL-Broth中にて一晩培養を行った後、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-brothに培養液を加えた。37℃にて3時間の培養を行った後、1 M IPTGを最終濃度1 mMになるように添加し組換えNP蛋白の発現を誘導した。IPTGによるタンパク質の発現はSDS-PAGEにて確認した。
遠心分離により回収した菌体を可溶化バッファーに懸濁させた。さらにPMSFおよびリゾチーム処理を行い完全に溶菌させた。得られた溶液の遠心上清から組換えNP蛋白をNi-NTA樹脂を用いたカラムに通し精製した。この精製蛋白をPBSに対して透析し、目的の組換えNP蛋白とした。
目的遺伝子が挿入された実施例1のベクターpET15bでE.coli BL21CodonPlusを形質転換し、アンピシリン選択培地上で培養し、コロニーを得た。アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(25μg/ml)を含むL-Broth中にて一晩培養を行った後、アンピシリン(100μg/ml)を含むL-brothに培養液を加えた。37℃にて3時間の培養を行った後、1 M IPTGを最終濃度1 mMになるように添加し組換えNP蛋白の発現を誘導した。IPTGによるタンパク質の発現はSDS-PAGEにて確認した。
遠心分離により回収した菌体を可溶化バッファーに懸濁させた。さらにPMSFおよびリゾチーム処理を行い完全に溶菌させた。得られた溶液の遠心上清から組換えNP蛋白をNi-NTA樹脂を用いたカラムに通し精製した。この精製蛋白をPBSに対して透析し、目的の組換えNP蛋白とした。
実施例３（モノクローナル抗体の作製）
実施例２で得られたA型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluA NP）およびB型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluB NP）を抗原として、FluA NPおよびFluB NPに対するモノクローナル抗体（抗FluA NP抗体および抗FluB NP抗体）を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。それぞれ100μgの組換えNP蛋白と等量のAdjuvant Complete Freund（Difco）を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）にL-グルタミン0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し（DMEM）、これに牛胎児血清（JRH）を10%となるように加えた培養液を用いた。
実施例２で得られたA型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluA NP）およびB型インフルエンザウイルス組換えNP蛋白（FluB NP）を抗原として、FluA NPおよびFluB NPに対するモノクローナル抗体（抗FluA NP抗体および抗FluB NP抗体）を作出した。モノクローナル抗体の作出は常法に従って行った。それぞれ100μgの組換えNP蛋白と等量のAdjuvant Complete Freund（Difco）を混合して、マウス（BALB/c、5週齢、日本SLC）に3回免疫し、その脾臓細胞を細胞融合に用いた。
細胞融合には、マウスの骨髄腫細胞であるSp2/0-Ag14細胞（Shulmanら、1978）を用いた。細胞の培養には、Dulbecco’s Modified Eagle Medium（Gibco）にL-グルタミン0.3mg/ml、ペニシリンGカリウム100単位/ml、硫酸ストレプトマイシン100μg/ml、Gentacin 40μg/mlを添加し（DMEM）、これに牛胎児血清（JRH）を10%となるように加えた培養液を用いた。
細胞融合は、免疫マウスの脾臓細胞とSp2/0-Ag14細胞を混合し、そこにPolyethylene glycol solution（Sigma）を添加することにより行った。細胞融合はHAT-DMEM（0.1mM Sodium Hypoxanthine、0.4μM Aminopeterinおよび0.016mM Tymidine（Gibco）を含む血清加DMEM）で培養し、抗FluA NP抗体のスクリーニングには、不活化したInfluenza Virus, Type A (H1N1)を固相化したプレートを用いた酵素結合抗体法（ELISA）により培養上清中の抗体産生を確認した。また抗FluB NP抗体のスクリーニングには不活化したInfluenza B virusを固相化したプレートを用い、同様の方法にて培養上清中の抗体産生を確認した。
抗体産生陽性の細胞をHT-DMEM［0.1mM Sodium Hypoxanthineおよび0.016mM Thymidine（Gibco）を含む血清加DMEM］で培養し、さらに血清加DMEMで培養を続けた。ELISA法により抗体産生能の高い細胞を選択しクローニングした。クローニングした細胞は、2,6,10,14-Tetramethylpentadecane（Sigma）を接種しておいたマウス（BALB/c、リタイア、日本SLC）に腹腔内接種し、腹水を採取した。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、モノクローナル抗体を得た。作出したモノクローナル抗体のアイソタイプは、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents（Sigma）を用いてELISAで同定した。
最終的にFluA NPに対するモノクローナル抗体産生細胞3クローンF/169、B/347及びF/211が得られた。このうち、抗体産生細胞F/211は、下記の実施例に示されるように、結果的に、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型に対して反応しないが、該Ｈ５Ｎ１亜型以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体（本発明の第二の抗体）を産生するクローンであった。FluB NPに対するモノクローナル抗体産生細胞が4クローン得られ、以下、F/171のみを用いた。
実施例４（イムノクロマトグラフィー測定装置の作製）
（１）抗FluA NP抗体、抗FluB NP抗体およびH5N1亜型に対し反応性を示さない抗FluA NP抗体の調製
実施例1で得られた抗FluA NP抗体産生細胞F/169およびB/347のそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。また抗FluB NP抗体産生細胞F/171を、マウス腹腔に接種し、抗FluB NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに、抗FluA NP抗体産生細胞F/211を、マウス腹腔に接種し、抗FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、それぞれの抗体を得た。
（１）抗FluA NP抗体、抗FluB NP抗体およびH5N1亜型に対し反応性を示さない抗FluA NP抗体の調製
実施例1で得られた抗FluA NP抗体産生細胞F/169およびB/347のそれぞれを、マウス腹腔に接種し、抗FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。また抗FluB NP抗体産生細胞F/171を、マウス腹腔に接種し、抗FluB NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに、抗FluA NP抗体産生細胞F/211を、マウス腹腔に接種し、抗FluA NP抗体を含んだ腹水を得た。さらに、常法によりプロテインG吸着体を用いたIgG精製を行い、それぞれの抗体を得た。
（2）金コロイド溶液の調製
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
加熱によって沸騰させた超純水99mlに、1%（v/w）塩化金酸水溶液1mlを加え、さらに、その１分後に1%（v/w）クエン酸ナトリウム水溶液1.5mlを加えて加熱し5分間沸騰させた後、室温に放置して冷却した。次いで、この溶液に200mM炭酸カリウム水溶液を加えてpH9.0に調製し、これに超純水を加えて全量を100mlとして金コロイド溶液を得た。
（3）金コロイド標識抗体溶液の調製
上記（1）にて得られた抗体産生細胞B/347由来の抗FluA NP抗体（以下、抗FluA NP抗体B/347）、抗体産生細胞F/171由来の抗FluB NP抗体（以下、抗FluB NP抗体F/171）および抗体産生細胞F/211由来の抗FluA NP抗体（以下、抗FluA NP抗体F/211）を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗FluA NP抗体B/347の蛋白換算重量3μｇと上記（2）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%になるように10%BSA水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600XG、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液を調製した。また抗FluB NP抗体F/171の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗FluB NP抗体F/171溶液を調製した。さらに抗FluA NP抗体F/211の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗FluA NP抗体F/211溶液を調製した。
上記（1）にて得られた抗体産生細胞B/347由来の抗FluA NP抗体（以下、抗FluA NP抗体B/347）、抗体産生細胞F/171由来の抗FluB NP抗体（以下、抗FluB NP抗体F/171）および抗体産生細胞F/211由来の抗FluA NP抗体（以下、抗FluA NP抗体F/211）を下記の手順でそれぞれ金コロイド標識した。
抗FluA NP抗体B/347の蛋白換算重量3μｇと上記（2）の金コロイド溶液1mlとを混合し、室温で2分間静置してこの抗体のことごとくを金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が1%になるように10%BSA水溶液を加え、この金コロイド粒子の残余の表面をことごとくこのBSAでブロックして、金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液を調製した。この溶液を遠心分離（5600XG、30分間）して金コロイド標識抗体を沈殿せしめ、上清液を除いて金コロイド標識抗体を得た。この金コロイド標識抗体を10%サッカロース・1%BSA・0.5%トリトン（Triton）-X100を含有する50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.4）に懸濁して金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液を調製した。また抗FluB NP抗体F/171の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗FluB NP抗体F/171溶液を調製した。さらに抗FluA NP抗体F/211の蛋白換算重量1μｇを上記方法にて金コロイド粒子表面に結合させ金コロイド標識抗FluA NP抗体F/211溶液を調製した。
（4）イムノクロマトグラフィー測定装置の作製
図４に示されるイムノクロマトグラフィー測定装置を下記の手順で作製した。
（4-1）膜担体の第一の捕捉部位の形成
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜を膜担体３として用意した。
抗FluA NP抗体F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ａ（第一の捕捉部位）を形成した。また、抗FluB NP抗体F/171 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から8.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、B型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｂを形成した。
図４に示されるイムノクロマトグラフィー測定装置を下記の手順で作製した。
（4-1）膜担体の第一の捕捉部位の形成
幅5mm、長さ36mmの細長い帯状のニトロセルロース膜を膜担体３として用意した。
抗FluA NP抗体F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、Ａ型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ａ（第一の捕捉部位）を形成した。また、抗FluB NP抗体F/171 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から8.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥し、B型インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｂを形成した。
（4-2）膜担体の第二の捕捉部位の形成
上記（4-1）で用いた膜担体と同様の膜担体３をもう一つ用意した。
抗FluA NP抗体F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｃ（第二の捕捉部位）を形成した。
上記（4-1）で用いた膜担体と同様の膜担体３をもう一つ用意した。
抗FluA NP抗体F/169 1.0mg/mlが含有されてなる溶液0.5μlを、この膜担体３の上流側の末端から5.0mmの位置にライン状に塗布して、これを室温で乾燥させ、インフルエンザウイルス抗原と標識抗体との複合体の捕捉部位４１ｃ（第二の捕捉部位）を形成した。
（4-3）金コロイド標識抗体含浸部材の作製
5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、上記（３）で得られた金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液および金コロイド標識抗FluB NP抗体F/171溶液を混合した溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。また別の5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗FluA NP抗体F/211溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。前者の標識抗体含浸部材をテストストリップ１０の含浸部材３として用い、後者の標識抗体含浸部材をテストストリップ２０の含浸部材３として用い、上記（４−１）で得られた膜担体をテストストリップ１０の膜担体３として用い、上記（４−２）で得られた膜担体をテストストリップ２０の膜担体３として用い、その他、各テストストリップの試料添加用部材６として綿布を、吸収用部材５として濾紙を用いて、図４と同様の配置のイムノクロマトグラフィー測定装置を作製した。
5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、上記（３）で得られた金コロイド標識抗FluA NP抗体B/347溶液および金コロイド標識抗FluB NP抗体F/171溶液を混合した溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。また別の5mmX15mmの帯状のガラス繊維不織布に、金コロイド標識抗FluA NP抗体F/211溶液37.5μｌを含浸せしめ、これを室温で乾燥させて標識抗体含浸部材とした。前者の標識抗体含浸部材をテストストリップ１０の含浸部材３として用い、後者の標識抗体含浸部材をテストストリップ２０の含浸部材３として用い、上記（４−１）で得られた膜担体をテストストリップ１０の膜担体３として用い、上記（４−２）で得られた膜担体をテストストリップ２０の膜担体３として用い、その他、各テストストリップの試料添加用部材６として綿布を、吸収用部材５として濾紙を用いて、図４と同様の配置のイムノクロマトグラフィー測定装置を作製した。
実施例５（インフルエンザウイルスH5N1株（Yamaguchi株）との反応性試験）
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、インフルエンザウイルスH5N1株（A/chichen/Yamaguchi/7/04、Yamaguchi株）に対する反応性試験を実施した。また、インフルエンザウイルスH3N2（A/Aichi/2/68、Aichi株）を対照として用いた。被験試料として、上記インフルエンザウイルス株をそれぞれ発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。なお、上記Yamaguchi株の漿尿液のＨＡ価は1024であり、上記Aichi株の漿尿液のＨＡ価は2048であった。結果を表１に示した。
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、インフルエンザウイルスH5N1株（A/chichen/Yamaguchi/7/04、Yamaguchi株）に対する反応性試験を実施した。また、インフルエンザウイルスH3N2（A/Aichi/2/68、Aichi株）を対照として用いた。被験試料として、上記インフルエンザウイルス株をそれぞれ発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。なお、上記Yamaguchi株の漿尿液のＨＡ価は1024であり、上記Aichi株の漿尿液のＨＡ価は2048であった。結果を表１に示した。
表１の結果より、第二の捕捉部位４１ｃでは、陽性コントロールとして用いたAichi株（H3N2）と比較して、Yamaguchi株（H5N1）に対する反応性がほとんど確認されなかった。このことから、テストストリップ２０の標識抗体として用いた抗FluA NP抗体F/211は、Yamaguchi株（H5N1）に対して反応せず、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型に対して特異的に反応しないことが示唆された。これに対し、第一の捕捉部位４１ａではAichi株（H3N2）およびYamaguchi株（H5N1）に対し同等の反応性が得られた。
実施例６（Ａ型インフルエンザウイルス各種亜型との反応性試験）
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、Ａ型インフルエンザウイルスの15種類の亜型に対する反応性試験を実施した。被験試料として、Ａ型インフルエンザウイルスの各種亜型を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、Ａ型インフルエンザウイルスの15種類の亜型に対する反応性試験を実施した。被験試料として、Ａ型インフルエンザウイルスの各種亜型を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で調製したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）の５段階に区分して判定した。
なお、A型インフルエンザウイルス亜型として、A/Puerto Rico/8/34 (H1N1)、A/Hokkaido/11/02 (H1N1)、A/Singapore/1/57 (H2N2)、A/Aichi/2/68 (H3N2)、A/Hokkaido/1/03 (H3N2)、A/duck/Czech/56 (H4N6)、A/duck/Pennsylvania/1028/83 (H5N2)、A/Hong Kong/156/97 (H5N1)、A/Hong Kong/483/97 (H5N1)、A/turey/Massachusetts/3740/65 (H6N2)、A/seal/Massachusetts/1/80 (H7N7)、A/turey/Ontario/67 (H8N4)、A/turey/Wisconsin/66 (H9N2)、A/chicken/Germany/N/49 (H10N7)、A/duck/England/56 (H11N6)、A/duck/Alberta/60/76 (H12N5)、A/gull/Maryland/704/77 (H13N6)、A/mallard/Astrakhan/263/82 (H14N5)、A/duck/Australia/341/83 (H15N8)を試験に供した。結果を表２に示す。
表２から明らかなように、テストストリップ１０の第一の捕捉部位４１ａにおいては、試験に供したウイルス株全てにおいて顕著な着色が確認され、捕捉部位４１ｂにおいてはいずれのウイルス亜型においても着色は見られなかった。一方、テストストリップ２０の第二の捕捉部位４１ｃにおいては、試験に供したインフルエンザウイルスA型のうち、H5N1株、A/Hong Kong/156/97 (H5N1)、A/Hong Kong/483/97 (H5N1)においてのみ着色が確認されなかったが、試験に供した他のウイルス株およびH5N2亜型であるA/duck/Pennsylvania/1028/83 (H5N2)においては顕著な呈色が確認された。従って、実施例４記載のイムノクロマトグラフィー測定装置は、第一の捕捉部位４１ａにおいては全てのインフルエンザウイルスA型に対して反応性を示し、第二の捕捉部位４１ｃにおいてはインフルエンザウイルスH5N1型に対してのみ反応性を示さないことがわかった。これは、テストストリップ２０の標識抗体として用いた抗FluA NP抗体F/211が、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型に対して反応しないが、該Ｈ５Ｎ１亜型以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であることを示すものである。
したがって、インフルエンザ感染を疑われた患者から採取された検体を実施例４記載のイムノクロマトグラフィー測定装置に供した場合、第一の捕捉部位４１ａ及び第二の捕捉部位４１ｃにおける呈色が確認された場合、インフルエンザウイルスH1N1感染またはH3N2感染が確認され、一般的なインフルエンザ感染であることが疑われる。また、第一の捕捉部位４１ａにおける呈色が確認されるが、第二の捕捉部位４１ｃにおける呈色が確認されない場合は、インフルエンザウイルスH5N1感染が疑われる。したがって、この装置を用いることにより、感染ウイルスの種類に応じて、患者に対し適切な処置を施すとともに、感染拡大を防ぐように勤める事が可能となる。なお、捕捉部位４１ｂにおけるB型判定部位に呈色が認められた場合は、インフルエンザウイルスB型感染の疑いと判定し、どちらの判定部位にも呈色が認められなかった場合はインフルエンザ感染陰性である。
したがって、本発明に従い、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルスＨ５Ｎ１亜型に対して反応しないが、該Ｈ５Ｎ１亜型以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を組み合わせて使用することにより、インフルエンザウイルスH5N1感染を検出することが可能である。
実施例７（各種希釈倍率におけるＡ型インフルエンザウイルス各種亜型との反応性試験）
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、Ａ型インフルエンザウイルスの８種類に対する反応性試験を実施した。被験試料として、Ａ型インフルエンザウイルス各種を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で１０倍、１００倍、１０００倍及び１００００倍に希釈したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）、＋＋＋＋（より顕著な着色）の６段階に区分して判定した。
実施例４にて作製したイムノクロマトグラフィー測定装置を使用し、Ａ型インフルエンザウイルスの８種類に対する反応性試験を実施した。被験試料として、Ａ型インフルエンザウイルス各種を発育鶏卵にて増殖させて得た漿尿液を、検体希釈液で１０倍、１００倍、１０００倍及び１００００倍に希釈したものを用いた。そして、被験試料150μlを実施例４にて得られたテストストリップの試料添加用部材６にマイクロピペットで滴下してクロマト展開し、室温で15分放置後、第一の捕捉部位４１ａおよび第二の捕捉部位４１ｃで捕捉されたウイルス抗原と金コロイド標識抗体との複合体の捕捉量を肉眼で観察した。捕捉量は、その量に比例して増減する赤紫色の呈色度合いを肉眼で、−（着色なし）、±（微弱な着色）、＋（明確な着色）、＋＋（より明確な着色）、＋＋＋（顕著な着色）、＋＋＋＋（より顕著な着色）の６段階に区分して判定した。
なお、A型インフルエンザウイルスとして、A/Vietnam/1194/04 (H5N1)、A/Hong Kong/483/97 (H5N1)、A/Chicken/Suphanburi/1/04 (H5N1)、A/Whooperswan/Mongolia/3/05 (H5N1)、A/Chicken/Ibaraki /1/05 (H5N2)、A/Swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)、A/Chicken/Italy/99 (H7N1)、およびA/Chicken/Netherlands/03 (H7N7)を試験に供した。このうち、A/Swan/Hokkaido/51/96 (H5N3)およびA/Chicken/Netherlands/03 (H7N7)以外は強毒株として知られているものである。結果を、各亜型の漿尿液のＨＡ価とともに、表３−１〜表３−４に示す。
表３−１〜表３−４から明らかなように、１０００倍以下の希釈培率において、テストストリップ１０の第一の捕捉部位４１ａにおいては、試験に供したウイルス株全てにおいて着色が確認された。一方、テストストリップ２０の第二の捕捉部位４１ｃにおいては、試験に供したインフルエンザウイルスA型のうち、Ｈ５Ｎ１亜型の全種及びＨ５Ｎ２亜型強毒株であるA/Chicken/Ibaraki /1/05 (H5N2)については着色が確認されず、Ｈ７Ｎ１亜型強毒株であるA/Chicken/Italy/99 (H7N1)については希釈倍率１０００倍以上で着色が確認されなかったが、試験に供した他のウイルス株については、１０００倍以下の希釈培率において、顕著な呈色が確認された。従って、実施例４記載のイムノクロマトグラフィー測定装置は、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の検出に有効であり、好ましくはＨ５Ｎ１亜型及びＨ５Ｎ２亜型強毒株の検出に有効であり、特に好ましくは、Ｈ５Ｎ１亜型の検出に有効であることが示された。
本発明は、全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法、特に、サンドイッチ式免疫測定法、イムノクロマトグラフィー測定法および測定装置を提供するものであり、インフルエンザウイルス強毒株に属するウイルスを特異的に簡単な方法で迅速に検出できるので、当該ウイルスに起因するヒト、鳥等の疾病を迅速かつ簡便に診断するために有用である。
１ 粘着シート
２ 含浸部材
３ 膜担体
４ 捕捉部位
５ 吸収用部材
６ 試料添加用部材
１０ イムノクロマト法テストストリップ
２０ イムノクロマト法テストストリップ
２ 含浸部材
３ 膜担体
４ 捕捉部位
５ 吸収用部材
６ 試料添加用部材
１０ イムノクロマト法テストストリップ
２０ イムノクロマト法テストストリップ
Claims (65)
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体を用い、第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の抗体との反応が陰性である抗原を免疫測定法によって検出することからなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株の検出法。
- 前記免疫測定法が、前記第一の抗体とこの第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法、及び／又は、前記第二の抗体と該第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体とを用いたサンドイッチ式免疫測定法からなることを特徴とする請求項１に記載の検出法。
- 前記第一の抗体および第二または第四の抗体を担体に固定しておく請求項２に記載の検出法。
- 前記第三の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であり、前記第四の抗体がＡ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である請求項３に記載の検出法。
- 前記第三及び第四の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異なる抗体である請求項３に記載の検出法。
- 前記第一、第二、第三及び第四の抗体がインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体である請求項１乃至５の何れか１項に記載の検出法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項６に記載の検出法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項７に記載の検出法。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体、及び、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体をそれぞれ予め所定位置に固定せしめて形成された第一及び第二の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と被験試料との第一の混合液、及び、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と前記被験試料との第二の混合液を、それぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめるか、または、第一の混合液を前記捕捉部位の双方に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における第一の抗体との反応が陽性で且つ第二の捕捉部位における第二の抗体との反応が陰性であることをもってＡ型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第三の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であり、前記第四の抗体がＡ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である請求項９に記載の測定法。
- 前記第三及び第四の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異なる抗体である請求項９に記載の測定法。
- 前記第一、第二、第三及び第四の抗体がインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体である請求項９乃至１１の何れか１項に記載の測定法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項１２に記載の測定法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項１３に記載の測定法。
- 前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項９に記載の測定法。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項１５に記載の測定法。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、前記第二の抗体が反応する抗原に対して反応する第四の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一及び第二の抗体はそれぞれ予め膜担体の所定位置に固定されて第一及び第二の捕捉部位を形成し、前記第三及び第四の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第三及び第四の抗体は前記捕捉部位の双方から離隔した位置からそれぞれ第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置。
- 前記第三の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体であり、前記第四の抗体がＡ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である請求項１７に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異なる抗体である請求項１７に記載の測定装置。
- 前記第一、第二、第三及び第四の抗体がインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体である請求項１７乃至１９の何れか1項に記載の測定装置。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項２０に記載の測定装置。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項２１に記載の測定装置。
- 前記膜担体は、第一の捕捉部位と第二の捕捉部位とを互いに離隔させて備えてなる単一の膜担体からなる請求項１７に記載の測定装置。
- 前記膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第二の抗体が固定された第二の膜担体とからなる請求項１７に記載の測定装置。
- 前記第三の抗体は前記第一の膜担体上に用意されており、前記第四の抗体は前記第二の膜担体上に用意されている請求項２４に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体は、それぞれ、前記第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸されて用意されている請求項２５に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて相互に並行して配置されている請求項２６に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて放射方向に又は反対方向に配置されている請求項２６に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する互いに同一または異なる抗体であり、第一及び第二の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されている請求項２４に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体は膜担体上に用意されている請求項２９に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体は膜担体上に配置された含浸部材に含浸されて用意されている請求項３０に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体は同一の抗体であり、前記含浸部材は第一の膜担体と第二の膜担体の双方に連接している請求項３１に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて相互に並行して配置されている請求項３２に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて放射方向に又は反対方向に配置されている請求項３２に記載の測定装置。
- 前記第三及び第四の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項１７に記載の測定装置。
- 前記膜担体はニトロセルロース膜である請求項３５に記載の測定装置。
- 前記膜担体はケース内に収容されてなる請求項１７に記載の測定装置。
- 前記第三の抗体及び／又は第四の抗体はケース外又はケース内に収容されている請求項３７に記載の測定装置。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体とを用い、前記第一の抗体を予め所定位置に固定せしめて形成された第一の捕捉部位を備える膜担体を用意し、前記第二の抗体と被験試料とを含む第一の混合液、及び、前記第三の抗体と前記被験試料とを含む第二の混合液を、それぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開せしめ、前記第一の捕捉部位における前記第三の抗体の反応が陽性で且つ前記第一の捕捉部位における前記第二の抗体の反応が陰性であることをもってＡ型インフルエンザウイルス強毒株を検出できるようにしたことを特徴とするイムノクロマトグラフィー測定法。
- 前記第三の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である請求項３９に記載の測定法。
- 前記第一、第二及び第三の抗体がインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体である請求項３９または４０に記載の測定法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項４１に記載の測定法。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項４２に記載の測定法。
- 前記第二及び第三の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項３９に記載の測定法。
- 前記膜担体がニトロセルロース膜である請求項４４に記載の測定法。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、前記第一の抗体が反応する抗原に対して反応する第三の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二及び第三の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第二及び第三の抗体は前記捕捉部位から離隔した位置からそれぞれ第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置。
- 前記第三の抗体が全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する抗体である請求項４６に記載の測定装置。
- 前記第一、第二及び第三の抗体がインフルエンザウイルスの核タンパクに対するモノクローナル抗体である請求項４６または４７に記載の測定装置。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項４８に記載の測定装置。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項４９に記載の測定装置。
- 前記膜担体は、第一の抗体が固定された第一の膜担体と、第一の抗体が固定された第二の膜担体とからなる請求項４６に記載の測定装置。
- 前記第二の抗体は前記第一の膜担体上に用意されており、前記第三の抗体は前記第二の膜担体上に用意されている請求項５１に記載の測定装置。
- 前記第二及び第三の抗体は、それぞれ、前記第一及び第二の膜担体上に配置された含浸部材に含浸されて用意されている請求項５２に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて相互に並行して配置されている請求項５３に記載の測定装置。
- 前記第一の膜担体及び前記第二の膜担体は何れも細長形状を備え、両膜担体の含浸部材を互いに所定の間隔をおいて離隔させて放射方向に又は反対方向に配置されている請求項５３に記載の測定装置。
- 前記第二及び第三の抗体は金属コロイドまたはラテックスで標識されている請求項４６に記載の測定装置。
- 前記膜担体はニトロセルロース膜である請求項５６に記載の測定装置。
- 前記膜担体はケース内に収容されてなる請求項４６に記載の測定装置。
- 前記第二の抗体及び／又は第三の抗体はケース外又はケース内に収容されている請求項５８に記載の測定装置。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第二の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第一の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置。
- 全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第一の抗体と、Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応する第二の抗体と、膜担体とを少なくとも備え、前記第一の抗体は予め膜担体の所定位置に固定されて第一の捕捉部位を形成し、前記第二の抗体は適当な標識物質で標識され、かつ、前記第一の捕捉部位から離隔した位置から該第一の捕捉部位に向けて前記膜担体にてクロマト展開可能なように用意されてなるＡ型インフルエンザウイルス強毒株検出用イムノクロマトグラフィー測定装置。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株に対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型に対して反応するモノクローナル抗体。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株の核タンパクに対して反応しないが、該強毒株以外の全てのＡ型インフルエンザウイルス亜型の核タンパクに対して反応するものである請求項６２に記載のモノクローナル抗体。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型、並びに、Ｈ５Ｎ２亜型及びＨ７Ｎ１型の強毒株からなる群より選ばれた少なくとも１種である請求項６３に記載のモノクローナル抗体。
- Ａ型インフルエンザウイルス強毒株は、Ｈ５Ｎ１亜型である請求項６４に記載のモノクローナル抗体。
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