JP2006265197A

JP2006265197A - 抗原性人工ポリペプチド

Info

Publication number: JP2006265197A
Application number: JP2005088163A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Ozawa; 智小沢
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 2005-03-25
Filing date: 2005-03-25
Publication date: 2006-10-05

Abstract

【課題】特定のウイルスの全ての亜型に共通の抗原性を有する人工ポリペプチドおよび、特定のウイルスの全ての亜型に反応し得る抗体の提供。
【解決手段】ウイルスの表面タンパク質の膜融合領域に相同的なアミノ酸配列を有する人工ポリペプチド、および該人工ポリペプチドを用いることにより得られる抗体。
【選択図】なし

Description

本発明は、ウイルスの表面タンパク質と実質的に同一の抗原性を有する人工ポリペプチドに関する。さらに、本発明はそのような人工ポリペプチドを用いた感染の予防に関する。さらに、本発明はそのような人工ポリペプチドにより惹起された抗体、およびそのような抗体を使用するウイルスの検出に関する。

エンベロープを有するウイルスは、表面タンパク質と呼ばれる、エンベロープの脂質二重層を貫通して外へ突き出したスパイク状のタンパク質を有する。この表面タンパク質は、標的細胞の受容体と結合し、ウイルスのエンベロープと標的細胞の膜との融合に関与しており、ウイルスの感染性獲得において重要な役割を担っている。

ウイルスは、表面タンパク質の抗原性の違いによって異なる亜型に分類される。即ち、ウイルスに特異的な抗体は、通常、亜型ごとに異なる。そのため、ウイルス検査試薬やウイルス吸着素材を製造する場合、抗体を亜型ごとに作製する必要がある。また、ワクチンの製造は、次年に流行が懸念される亜型を予測して行われるため、予測がはずれた場合にはワクチンの効果が期待できない。

エンベロープを有するウイルスは、プロテアーゼの作用によって表面タンパク質が開裂し、活性化されることが分かっている。開裂後の切断末端は、標的細胞の膜と融合する機能を有しており、膜融合領域と呼ばれる。この膜融合領域が標的細胞の膜と融合することにより、ウイルスと標的細胞との膜融合が起こり、ウイルス内の遺伝子が標的細胞内へと侵入し、感染が成立する。

インフルエンザウイルスの表面タンパク質であるヘマグルチニン（ＨＡ）は、プロテアーゼの作用によってＨＡ１とＨＡ２のドメインに開裂することが分かっている。ＨＡ２ドメインのＮ末端側は、標的細胞の膜と融合する機能を有しており、膜融合領域である。

本発明は、特定のウイルスの全ての亜型に共通の抗原性を有する人工ポリペプチドを提供する。さらに、本発明は、特定のウイルスの全ての亜型に反応し得る抗体を提供する。

本発明者らは、ウイルスの表面タンパク質の膜融合領域のアミノ酸配列が亜型間で配列相同性を有することに着目し、この領域を抗原部位として用いることにより、特定のウイルスの全ての亜型に特異的な抗体を惹起し得ることを見いだした。即ち、本発明の人工ポリペプチドは、ウイルス表面タンパク質の膜融合領域と実質的に同一の抗原性を有し、該膜融合領域に特異的な抗体を惹起することができる。具体的には、本発明の人工ポリペプチドは、ウイルスの表面タンパク質の膜融合領域に対して相同的なアミノ酸配列を有する。本発明の抗体は、本発明の人工ポリペプチドを用いて動物を免疫することにより得られる。

本発明の人工ポリペプチドを用いることにより、全ての亜型のウイルスに特異的な抗体を惹起することができる。また、本発明の人工ポリペプチドにより惹起された抗体を用いてウイルスの膜融合領域をブロックすることにより、そのウイルスの膜融合を阻害し、感染を予防することができる。

本発明における「ウイルス」には、ヒトインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パラミクソウイルス、エボラウイルス等、エンベロープを有する任意のウイルスが包含される。

本発明における「表面タンパク質」とは、ウイルスのエンベロープを貫通して表面上に突き出したスパイク状のタンパク質であって、且つ膜融合領域を含むものを意味する。例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク、パラミクソウイルスのＦタンパク、レトロウイルスのＳＵ／ＴＭタンパク、エボラウイルスのＧｐ２タンパク、ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニン等が挙げられる。

本発明における「膜融合領域」は、プロテアーゼの作用により開裂し、標的細胞の膜と融合する機能を有する表面タンパク質の領域をいう。

「膜融合領域と実質的に同一の抗原性」とは、本発明の人工ポリペプチドがその膜融合領域に特異的な抗体によって認識されることをいう。

本発明の人工ポリペプチドは、例えばＦｍｏｃ法、ｔＢｏｃ法等、当業者に周知のペプチド合成法を用いる合成により、製造することができる。抗原性を高めるために、ポリペプチドは修飾してもよい。例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等のキャリアタンパクを結合することができる。また、ＭＡＰ合成法により修飾ポリペプチドを合成することもできる。

本発明において製造する人工ポリペプチドのアミノ酸配列は、特定のウイルスの表面タンパク質に由来する膜融合領域のアミノ酸配列を各亜型間で比較し、相同性の高い残基を選択することによって決定することができる。アミノ酸配列の長さは、合成の便宜上、約２０残基が適当であるが、これに限定されない。また、合成を容易にするために、親水性の高い残基を選択する等、各亜型間の配列相同性を損なわない範囲で他のアミノ酸残基に変更することもできる。さらに、アミノ酸残基の欠失、置換および／または付加を有していてもよく、そのようなアミノ酸残基の欠失、置換または付加を有する変異体も本発明の人工ポリペプチドに包含される。

さらに、上記手順にしたがって決定されたアミノ酸配列に基づいて、そのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを作製し、当業者に周知の組換え技術を用いて、適当なベクターを構築することができる。得られたベクターを、大腸菌等の適当な宿主にトランスフェクトし、所望のポリペプチドを、単独でまたは他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。

本発明のさらなる態様では、本発明によって得られた人工ポリペプチドを用い、当業者に周知の免疫方法を用いて動物を免疫することにより抗体を作製する。

本発明のさらなる態様では、本発明によって得られた抗体を用いてウイルス検出試薬を製造する。例えば、本発明の抗体を、イムノクロマトグラフィーの原理を利用したウイルス診断キットに用いられるような検出用抗体として使用することができる。ウイルス検出試薬の製造に用いられる他の材料および製造方法は当業者に周知である。

また、本発明のさらなる態様では、本発明によって得られた抗体を用いてウイルス吸着材を製造することができる。例えば、本発明の抗体をエアフィルター上に担持させることによりバイオ抗体フィルターを製造し、空気清浄機用フィルターとして利用することができる。このようなウイルス吸着材の製造に用いられる他の材料および製造方法は当業者に周知である。

さらに、本発明のさらなる態様では、本発明によって得られた人工ポリペプチドを用いてワクチンを製造することができる。ワクチンの製造に用いられる他の材料および製造方法は当業者に周知である。

以下に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
合成のためのアミノ酸配列の決定
ヒトインフルエンザＡ型ウイルスヘマグルチニン分子のアミノ酸配列を、国立バイオ技術情報センター(ＮＣＢＩ)のProtein Databaseより入手した。膜融合領域を亜型間で比較した（図１参照）。
使用した配列
亜型ローカス
H1N1 BAA02766
H2N2 BAA02773
H3N2 BAA02778
H4N6 HMIVF4
H5N1 AAC34263
H5N2 AAF04720
H6N1 CAD45198
H7N7 A45591
H9N2 AAP49039
H10N7 HMIV49
H13N6 BAA14338
H14N5 A46339
H15N8 AAA92247

ＨＡ１ドメインのＣ末端の１残基とＨＡ２ドメインのＮ末端側１９残基を含む２０残基を、合成するための領域として選択した。各亜型のアミノ酸配列は以下のとおりである。

H1N1 RGLFGAIAGFIEGGWTGMID （配列番号３）
H2N2 RGLFGAIAGFIEGGWQGMVD （配列番号４）
H3N2 RGIFGAIAGFIENGWEGMVD （配列番号５）
H4N6 RGLFGAIAGFIENGWQGLID （配列番号６）
H5N1 RGLFGAIAGFIEGGWQGMVD （配列番号７）
H5N2 RGLFGAIAGFIEGGWQGMVD （配列番号８）
H6N1 RGLFGAIAGFIEGGWTGMID （配列番号９）
H7N7 RGLFGAIAGFIENGWEGLID （配列番号１０）
H9N2 RGLFGAIAGFIEGGWPGLVA （配列番号１１）
H10N7 RGLFGAIAGFIENGWEGMVD （配列番号１２）
H13N6 RGLFGAIAGFIEGGWPGLIN （配列番号１３）
H14N5 KGLFGAIAGFIENGWQGLID （配列番号１４）
H15N8 RGLFGAIAGFIENGWEGLID （配列番号１５）

以下に示すように、この領域のアミノ酸配列は亜型間で高い配列相同性を有する（配列番号１参照）。

合成の便宜上、親水性の高い残基を選択し、以下の配列を最終の合成候補とした。

Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp（配列番号２）

実施例２
ポリペプチドの合成
実施例１で決定したアミノ酸配列（配列番号２）を有するポリペプチドは、東レリサーチセンターに合成を依頼した。合成は、ＭＡＰ法により行った（例えば、細胞工学別冊「抗ペプチド抗体実験プロトコール −ペプチド合成からタンパク質機能解析まで−」（秀潤社）を参照）。

実施例３
抗体の作製
ＮＺＷウサギ１羽につき、実施例２で得られたＭＡＰ−ペプチド１ｍgを同量（１ｍg）のＦＣＡアジュバントと混合し、２週間ごとに４回、皮下注射により免疫した。最終の免疫から２週間後に採血し、常法に従い抗血清を得た。

実施例４
抗原性の検証
得られた抗血清について、組換えＨ５ヘマグルチニン（Protein Science社製）をコーティングしたＥＬＩＳＡプレートで、結合能力を試験した。得られた抗血清は、２００００倍希釈まで陽性を示し、実施例２で合成したポリペプチドがヘマグルチニン分子を認識することが確認された。

本発明の人工ポリペプチドは、ウイルスに特異的な抗体を製造するために用いることができる。また、本発明の抗体は、ワクチン、ウイルス検査試薬、ウイルス吸着材等に利用することができる。

ヒトインフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニンのアミノ酸配列を、種々の亜型についてアライメントしたものである。ＨＡ１−ＨＡ２開裂部位および膜融合領域を含む領域を抜粋して示す。

Claims

ウイルスの表面タンパク質の膜融合領域と実質的に同一の抗原性を有し、該膜融合領域に特異的な抗体を惹起することができる人工ポリペプチド。
前記ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、パラミクソウイルス、エボラウイルスからなる群から選択される、請求項１記載の人工ポリペプチド。
前記ウイルスがヒトインフルエンザＡ型ウイルスであり、前記表面タンパク質がヘマグルチニンである、請求項１または２記載の人工ポリペプチド。
ヘマグルチニン分子のＨＡ１ドメインを実質的に欠失している、請求項３記載の人工ポリペプチド。
少なくとも配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載の人工ポリペプチド、または少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換および／または付加を有する該人工ポリペプチドの変異体。
少なくとも配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する請求項４記載の人工ポリペプチド、または少なくとも１つのアミノ酸残基の欠失、置換および／または付加を有する該人工ポリペプチドの変異体。
請求項１〜６のいずれかに記載の人工ポリペプチドまたは変異体で動物を免疫することにより得られる抗体。
請求項１〜６のいずれかに記載の人工ポリペプチドまたは変異体を含有するワクチン。
請求項７記載の抗体を含んでなるウイルス吸着材。
請求項７記載の抗体を含んでなるウイルス検出用試薬。
請求項７記載の抗体を用いることを特徴とするウイルスの検出方法。