KR101605520B1

KR101605520B1 - Ｐｔｄ를 포함하는 약독화 재조합 바이러스 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101605520B1
Application number: KR1020120105082A
Authority: KR
Inventors: 강춘; 이화중
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2011-09-22
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2016-04-04
Also published as: KR20130032269A

Abstract

본 발명은 PTD를 포함하는 약독화 재조합 바이러스 및 이의 제조방법 에 관한 것이다. 본 발명에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스는 다양한 아변종 인플루엔자 바이러스 주에 대한 범용면역성을 갖는 범용백신으로 활용될 수 있고, 기존의 인플루엔자 백신 생산시설에 의해 생산 가능하므로 저가의 인플루엔자 바이러스 범용 백신을 제공할 수 있다.

Description

ＰＴＤ를 포함하는 약독화 재조합 바이러스 및 이의 제조방법 {Attenuated recombinant influenza virus comprising PTD and method of producing the same}

본 발명은 PTD를 포함하는 약독화 재조합 바이러스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 매년 겨울철 유행하는 호흡기 감염성 질환으로 인구의 10-20%가 감염되며, 노인 및 만성질환자 등의 고위험군에 속하는 환자군에서는 합병증의 발생과 사망을 초래할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 크게 A, B, C 3가지 형으로 구분되며 표면 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 변화에 따른 항원 변이(Antigenic drift 또는 shift)를 통하여 인구집단에서 기존의 인플루엔자 바이러스에 형성되어 있던 면역을 회피하여 유행을 초래하게 된다. 이에 따라, 세계 각국에서는 신종 및 변종 인플루엔자 바이러스 대유행에 효과적, 적극적으로 대응하기 위하여 백신의 연구개발이 활발히 이루어지고 있고, 궁극적으로는 다양한 아변종의 인플루엔자 바이러스에 대한 면역원성을 갖는 백신의 개발이 절실히 필요하다. 즉, 하나의 인플루엔자 주(influenza strain)에 대해 유도된 면역반응에 의해 다른 인플루엔자 주들에 대해서도 면역력을 획득하는 범용면역성(hetero-subtypic immunity)을 갖는 백신의 개발이 필요하다.

범용 면역백신을 개발하기 위하여, 인플루엔자 바이러스의 아형들 (subtypes)의 유전정보를 분석하여 비교적 변이가 덜한 내부 단백질(internal protein)들인 M2e, NS, NP 단백질의 인플루엔자 바이러스 아형간에 진화적 동일성(evolutional homologue)이 있는 지역들을 타겟으로 항원을 디자인하고 다양한 백신제형(platform)을 이용하여 범용백신으로 적용하고자 하는 많은 시도와 연구들이 있다. 이 중 특히 M2 단백질의 엑토도메인의 경우가 인플루엔자에 대한 범용 백신으로 많이 연구되어 있다.

또한, 인플루엔자 바이러스의 표면항원단백질인 헤마글루티닌을 이용한 범용백신 개발 연구도 이루어지고 있는데, 헤마글루티닌은 크게 면역우성(Immuno-Dominant) 지역인 HA1 (Head 또는 Globular 지역)과 그 외 지역인 HA2 (줄기: Stalk 지역)으로 나뉜다. HA1 지역이 아형간(Subtype)에 상당한 다양성 및 변이를 나타내며(subtype 간에 30%이하의 유사성) 변이에 의해 항원의 대변이(Antigenic shift)를 일으키는 항원 지역인 것에 반해 HA2지역은 진화학적으로 안정화된 (Evolutionary Stable) 지역으로 아형간에 상당한 유사성(Homologue)을 나타내며 낮은 빈도의 변이를 보여준다(인플루엔자 아형간에 60~80%의 유사성). 이러한 HA2 지역의 단백질을 이용하여, 범용 면역성을 형성하여 다양한 아형의 인플루엔자 바이러스에 친화력을 갖는 항체 및 면역반응을 유도하고 또한 이러한 HA2 지역에 반응하는 항체를 생산하여 범용백신으로 적용한 연구 결과들이 있다. 예를 들면, HA2 지역의 경우는 아형간에 변이가 적으며 공통서열을 갖는 지역으로 HA1의 존재 하에서는 상대적으로 약한 면역원성을 지니는 것으로 알려져 있으므로 HA1 지역을 제거함으로써, HA2의 면역원성을 높여 아형간에 공통적으로 작용할 수 있는 항체 및 면역반응이 생성된다면 범용백신으로의 기능을 할 것으로 예측하였다(Journal of General Virology (1996), 77, 1483-1487).

그러나, HA1 지역이 제거된 재조합 Headless HA 단백질의 경우는 숙주 세포에 결합하는 지역을 포함하고 있는 HA1이 제거되어, Headless HA를 갖는 인플루엔자 바이러스 주(Headless HA influenza viral strain)를 제작할 때 egg를 비롯한 세포에서의 감염 및 증식이 어렵게 되는 한계가 있었다. 이는 M2e 단백질의 경우와 마찬가지로 재조합 단백질 백신, 혹은 VLP 등의 제형으로 제작해야 되는 한계점을 지니고 있었다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질인 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입 치환된 재조합 인플루엔자 바이러스 및 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신을 제공한다.

본 발명은 또한, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스를 투여하여 백신화 시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명자들은 면역 우성을 나타내는 HA1 지역을 제거하면 HA2 지역에 대한 면역반응을 생성할 수 있다는 사실과 HA1 지역이 갖는 숙주 결합 및 감염 기능을 PTD 도입으로 유도할 수 있다는 사실에 주목하여, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA의 HA1 지역을 제거하고 PTD로 치환시켜 재조합 인플루엔자 바이러스를 제작하였다. 제조된 재조합 인플루엔자 바이러스의 세포투과성 및 분자적 특성을 확인하였고, 또한 면역학적 특성을 분석한 결과, 본 발명에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스의 다양한 아형에 대해 범용적인 항체 생성을 유도하였다. 본 발명에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스의 제조는 종래 인플루엔자 생산시설에서 생산 가능하고 저가의 생산이 가능한 점에서 경제적 측면에서도 커다란 의의를 갖는다.

본 발명에 있어서, HA 단백질의 HA1 지역은 친수성이고, 헤마글루티닌의 삼량체를 형성하는 데 영향을 주지 않고, 인플루엔자 바이러스의 표면에 위치하고 헤마글루티닌의 말단에 위치하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, HA1 지역은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 HA1의 N-말단으로부터 28-29번째 위치, 30-31번째 위치, 42-43번째 위치, 55-56번째 위치, 또는 서열번호 3으로 표시되는 HA2의 N-말단에서 64-65번째 위치인 것을 특징으로 할 수 있다. 이 때, PTD는 5 가지 위치 모두 또는 5 가지 위치 중에서 선택되는 어느 한 곳 이상에 삽입될 수 있다.

PTD(protein transduction domain)는 TAT (transactivator of transcription), AntHD (Drosophila homeoprotein atennapedia transcription protein) peptide, VP22 (virus protein22) peptide, mph-1-btm (mouse transcription inhibitory factor-1-biomolecule transduction motif), Penetratin, Buforin II, Transportan, Ku70, Prion, pVEC 및 Pep-1로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 인플루엔자 바이러스 게놈의 표면 단백질 HA의 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입하여 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 HA의 HA1이 제거되고 PTD가 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스를 투여하여 백신화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 바이러스의 숙주 결합 및 감염과 관련된 단백질의 영역이 일부 제거되고 이의 기능을 대신할 PTD가 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스를 제공한다.

본 발명자들은 면역 우성을 나타내는 HA1 지역을 제거하면 HA2 지역에 대한 면역반응을 생성할 수 있고 HA1 지역의 제거에 의한 숙주 결합 및 감염 기능 상실을 PTD의 삽입으로 극복할 수 있을 것으로 예측하고, 나아가 HA1 지역의 면역 우성 때문에 항원성 연구가 어려웠던 NA의 항원성 및 면역원성의 연구 역시 가능할 것으로 예상하였다. 이 경우, NA 유전자는 인플루엔자 바이러스가 감염 및 증폭하는 데 필요가 없으므로 NA 유전자를 다른 유전자로 치환하여 유전자 전달(gene delivery)에 활용할 수 있을 것이다.

PTD(protein transduction domain)는 특정 세포에 감염이 되지 않는 바이러스의 수용체에 삽입되어, 세포의 감염을 가능하게 한다고 알려져 있다(Journal of General Medicine(2002), 5:267-276). 이에 본 발명자들은, 인플루엔자 바이러스의 HA1 제거로 의한 숙주 세포로의 결합 및 감염 기능 상실의 문제점을 PTD를 도입함으로써 해결하여, 약독화된 인플루엔자 바이러스를 제조하였다.

본 발명에서 사용된 용어 “인플루엔자 바이러스”는 인플루엔자를 유발할 수 있는 바이러스로, 이에 한정하지는 않지만, A형, B형, C형 인플루엔자 바이러스를 말한다.

본 발명에서 사용된 용어 “범용면역성(hetero-subtypic immunity)”이란 하나의 인플루엔자 바이러스 아형에 대해 유도된 면역반응에 의해 다른 인플루엔자 바이러스 아형에 대하여 면역력을 획득하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 “인플루엔자 바이러스 감염 질환”이란 인플루엔자 바이러스의 감염으로 유발되는 질환으로, 발작적천식, 중이염, 기관지염, 폐렴, 설사 등을 예시할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스는 다양한 아변종 인플루엔자 바이러스 주에 대한 범용면역성을 갖는 범용백신으로 활용될 수 있고, 기존의 인플루엔자 백신 생산시설에 의해 생산 가능하므로 저가의 인플루엔자 바이러스 범용 백신을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 HA1 지역의 기능을 대신할 PTD가 삽입된 재조합 Headless-PTD-HA 단백질의 제조과정을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1N1형의 인플루엔자바이러스인 A/Puerto Rico/8/1934 strain의 구조를 기반으로 디자인 선별된 Headless HA이며, 파란색은 HA2 부위를, 녹색은 제거되고 남은 HA1 부위, 붉은 색은 제거된 HA1을 대신해 삽입된 PTD 펩타이드 모티프를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 2009년 대유행하였던 A(H1N1)pdm09형 바이러스인 crystal 구조를 기반으로 디자인 선별된 Headless HA이고, 파란색은 HA2 부위를, 녹색은 제거되고 남은 HA1 부위를, 붉은 색은 HA1을 대신해 삽입된 펩타이드 모티프를 나타낸다.　
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 H3N2형 인플루엔자바이러스를 대표하는 A/HK/1/1968 바이러스의 구조를 기반으로 디자인 선별된 Headless HA로, 파란색은 HA2 부위를, 녹색은 제거되고 남은 HA1 부위, 붉은 색은 제거된 HA1을 대신해 삽입된 기능성 펩타이드 모티프를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 HA1 및 HA2 지역의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 A(H1N1)pdm09형 바이러스의 Headless HA유전자를 단백질 발현 확인이 가능한 halo-tag 벡터에 옮긴 후 MDCK세포에 형질 전환하고 Halo-tag 특이적인 형광 리간드로 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 H3N2형 바이러스의 HA유전자에서 클로닝된 Headless HA의 발현을 유전자가 형질 전환된 세포 용해물을 SDS-PAGE 후 젤을 Halo-tag 특이적인 형광과 리간드의 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 A(H1N1)pdm09형 바이러스의 HA유전자에서 유래하고 클로닝된 Headless HA의 발현을 유전자가 형질 전환된 세포 용해물을 SDS-PAGE 후 젤을 Halo-tag 특이적인 형광 리간드의 염색을 통해 확인한 결과이다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따른 A(H1N1)pdm09형 바이러스의 HA유전자에서 클로닝된 Headless HA를 대장균 숙주 발현 벡터에 클로닝하여 대장균에 형질전환하고, Headless HA의 발현을 확인하고 발현된 Headless HA가 인플루엔자 H1N1형 바이러스의 HA 대한 다중 클론 혈청과 반응하는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 결과이다.
도 10는 본 발명의 일 실시예에 따른 표면 단백질에 Headless HA를 갖는 pseudo 형태의 바이러스를 제작하고 이를 MDCK세포에 처리하여, pseudo 형태 바이러스에 패키징되어 세포에 있는 루시퍼레이즈의 발현 정도를 측정한 결과로 pseudo 형태의 바이러스가 세포에 침투해 들어가는 정도를 나타낸다.

본 발명에서는 HA1 지역을 제거하여 진화적으로 안정적인 HA2 지역에 대한 면역반응을 가능하게 하고, HA1 지역의 제거에 의한 결합 및 감염 기능 상실을 PTD의 삽입으로 극복함으로써, 숙주 결합 및 감염기능을 가지는 HA2 기반의 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하고, 이를 포함하는 범용 면역성을 가지는 백신을 제조하였다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. HA1 도메인이 제거된 HA 단백질의 제조

인플루엔자바이러스 아형 간에 이질아형(Heterosubtypic) 면역반응을 극대화 시키고 단형(monotypic) 면역반응을 최소화시키기 위한 항원의 제작을 위해, 인플루엔자바이러스 아형간에 변이가 심하고 면역우성(Immuno-dominant)인 HA1지역(Head)의 일부를 제거하고 아형간에 비교적 변이가 적고 다양한 기능성 모티프가 삽입된 Headless HA표면 단백질을 갖는 바이러스성 균주를 제작하였다. Headless HA 단백질의 제작을 위해, HA 단백질 구조(Crystal structure)정보를 바탕으로 세포투과성을 지니게 해주는 모티프인 PTD가 HA1이 제거된 자리에 위치하게 되는 Headless HA를 디자인하였다. Headless HA를 제작하는 과정은 도 1에 도시하였다.

Headless HA 단백질의 구조 예측은 기존의 단백질 구조 정보를 바탕으로 HA1 단백질 서열을 제거하고 삽입되는 모티프가 HA의 HA1이 위치했던 말단에 위치하도록 유전자의 아미노산 서열을 여러 가지 경우로 배열하여 준비하였으며, 이 서열들을 이용하여 단백질 구조 예측 프로그램(I-TASSER)을 사용하여 그 구조를 예측 선별하였다(도 2 내지 도 4).

실시예 2. Headless HA 유전자의 제작

Headless HA의 면역학적 연구 및 이질아형 면역을 유도하는 항원을 개발하기 위하여 다양한 Headless HA를 디자인 하였고, H3N2, H1N1, A(H1N1)pdm09 주들을 사용하여, PCR, 프라이머 오버래핑 PCR 및 돌연변이에 의해 클론 및 유전자를 확보하였다.

상기 실시예 1에 따라 디자인된, HA1 도메인(Head)을 제거하고 HA2 도메인을 근간으로 하는 Headless HA를 생산할 수 있는 재조합 유전자를 제작하였다.

상기 표 1에서 pdmH1N1와 PR8 HA는 각각 A(H1N1)pdm09형 바이러스 HA에서 유래된 Headless HA와, A/Puerto Rico/8/1934의 HA에서 유래된 Headless HA를 나타내며, H3N2는 A/Hongkong/1/1968의 HA이다. PTD는 만들어진 HA 단백질의 세포투과성 및 연이은 CTL반응의 유도의 극대화를 위한 모티프들을 나타낸다. 이렇게 디자인된 27종의 Headless HA유전자들이 제작하였다.

HA1의 제거는 인플루엔자바이러스의 HA가 삼량체를 이루는데 지장이 없는 지역을 제거하였으며 (43 ~ 273, H3 numbering사용), PTD 유전자의 삽입은 HA(hamagglutinin)이 삼량체(trimer)를 형성하는 데 영향을 주지 않고, 인플루엔자 바이러스의 표면에 위치하며 친수성 위치인지, 재조합 HA의 말단에 위치하는지를 고려하여 이루어졌다(도 5). 그 결과, HA1의 N-말단으로부터 28-29번째 위치, 30-31번째 위치, 42-43번째 위치, 55-56번째 위치 및 HA2 N-말단으로부터 71-72번째 위치 중 어느 한 곳에 PTD가 삽입될 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. Headless HA 의 유전자의 단백질 발현

상기 실시예 2에 따라　제작된 Headless HA 유전자를 포유동물세포(MDCK 등)에서 단백질 발현이 가능하고 발현 유무를 확인 할 수 있는 Tag이 존재하는 벡터(pFC14 또는 pFC21 등)로 옮겨 포유동물세포에 형질 전환 후 발현 정도를 세포의 형광염색을 통해 확인하였다(도 6).

또한, 포유동물세포(MDCK 등)에서 단백질 발현이 확인된 Headless HA 유전자가 정확하게 발현되었는지를 확인하기 위해 포유동물세포에 Headless HA를 형질 전환 후 세포를 파쇄하고, 이를 SDS PAGE를 이용해 단백질 크기 별로 분리 한 후 젤을 Halo-tag 특이적인 형광 리간드로 염색하여 형광 이미지 분석기로 분석하였다. 그 결과, Halo tag(33kD)에 Headless HA(대략 40kD)을 더한 크기 정도의 크기(73kD)에서 단백질의 발현이 확인되었다(도 7 및 도 8). 또한, NA TAT, NA, 11R 및 NA Flag의 경우 NA유전자의 엑토 도메인을 제거하고 대신 TAT, 11R, Flag으로 치환한 유전자의 발현을 확인하였다.

실시예 4. 발현된 Headless HA 단백질의 항원-항체 반응

PTD-Headless HA 단백질이 항원으로서의 역할을 할 수 있는지 확인하기 위하여, 공지의 인플루엔자 바이러스 항체와 상기 실시예 2에서 제조된 유전자를 통해 생산한 단백질의 결합 여부를 웨스턴 블롯을 이용하여 확인하였다. A/Puerto Rico/08/1934 인플루엔자의 HA에 대한 다중클론항체로 PR8 HA pAb 를, A(H1N1)pdm09 인플루엔자의 HA에 대한 다중클론항체로 pdm HA pAb 를 사용하였고, 대조군으로는 OVA 및 BSA를 각각 20ug씩 사용하였다.

그 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 상기 PR8 HA pAb 및 pdm HA pAb는 PTD-Headless HA 단백질에만 특이적으로 결합함을 확인할 수 있었다. 상기 사용된 항체들은 인플루엔자 바이러스에 대한 공지의 특이적 항체에 해당하는데, 본 발명의 재조합 바이러스와 결합한 것은, HA1이 제거되고 PTD가 삽입된 본 발명의 재조합 바이러스가 항원으로써 작용하며, 인플루엔자 바이러스의 백신으로써 활용될 수 있음을 보여준다.

실시예 5. 변형된 Headless HA 를 갖는 Pseudo 형태 바이러스의 감염도 실험

　단백질 발현이 확인된 Headless HA 유전자을 이용하여 표면 당단백질이 VSV-G에서 Headless HA 및 다른 유전자의 단백질로 치환되고 루시퍼레이즈의 리포터 유전자가 패키징되어 있는 복제 검출 바이러스성 시스템인 렌티 바이러스성 루시퍼레이즈 리포터 시스템에 적용하였다. 세포 표면에 변형된 Headless HA pseudo 형태의 바이러스를 제작한 후, 이들을 MDCK 세포에 처리 하고, 루시퍼레이즈 활성을 측정하여 감염 정도를 측정하였다. 그 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, pdm H1N1 HA1 Headless 유전자의 경우 음성 대조군(EGFP)에 비해 유의성(p<0,05) 있는 감염도를 보였다.

상기 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> Attenuated recombinant influenza virus comprising PTD and method of producing the same <130> IPDB40137 <150> KR 10-2011-95766 <151> 2011-09-22 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 1 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro 275 280 285 Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 2 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala 35 40 45 Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Thr Ser Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser 115 120 125 Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe 130 135 140 Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 165 170 175 Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr 180 185 190 Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Lys 195 200 205 Lys Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 210 215 220 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile 225 230 235 240 Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 245 250 255 Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val 260 265 270 His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr 275 280 285 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro 290 295 300 Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 305 310 315 320 Val Pro Ser Ile Gln Ser Arg 325 <210> 3 <211> 222 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 3 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly 1 5 10 15 Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile 35 40 45 Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr 50 55 60 Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu 65 70 75 80 Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala 85 90 95 Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp 100 105 110 Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn 115 120 125 Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys 130 135 140 Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro 145 150 155 160 Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val 165 170 175 Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr 180 185 190 Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe 195 200 205 Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 210 215 220 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTD <400> 4 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11R <400> 5 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 6 <211> 349 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Influenza A virus <400> 6 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Gly Gly Gly Gly Cys 50 55 60 Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr Ser Leu Pro 65 70 75 80 Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro Lys Tyr Val 85 90 95 Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Val Pro Ser 100 105 110 Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly 115 120 125 Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Gln Asn 130 135 140 Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser Thr Gln Asn Ala 145 150 155 160 Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Glu Lys Met Asn 165 170 175 Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Tyr Gly Arg Lys Lys 180 185 190 Arg Arg Gln Arg Arg Arg His Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn 195 200 205 Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu 210 215 220 Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser 225 230 235 240 Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn 245 250 255 Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp 260 265 270 Asn Thr Cys Met Glu Ser Val Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys 275 280 285 Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys 290 295 300 Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val 305 310 315 320 Ala Ser Ser Leu Val Leu Val Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp 325 330 335 Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 340 345

Claims

인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 헤마글루티닌(HA)의 HA1 영역 일부인 서열번호 2로 표시되는 HA1의 N-말단으로부터 43-273번째 아미노산이 제거되고, 서열번호 3으로 표시되는 HA2의 N-말단으로부터 71-72번째 위치에 단백질 전달 도메인(PTD: protein transduction domain)이 삽입된 재조합 인플루엔자 바이러스로서, 상기 단백질 전달 도메인은 TAT(transactivator of transcription) 또는 11R(11개의 연속된 아르기닌)인 재조합 인플루엔자 바이러스.
제 1항에 있어서,
삽입된 단백질 전달 도메인은 친수성이고, 헤마글루티닌(hemagglutinin)이 삼량체를 형성하는데 영향을 주지 않고, 인플루엔자바이러스의 표면에 위치하고, 헤마글루티닌의 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
제 1항에 있어서,
상기 헤마글루티닌 단백질은 서열번호 1로 구성된 것임을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
제 1항에 있어서,
상기 단백질 전달 도메인은 서열번호 4로 구성된 것임을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
제 1항에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 HA2의 N-말단으로부터 71 내지 72번째 위치에 서열번호 4 또는 서열번호 5로 표시되는 단백질 전달 도메인이 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 인플루엔자 바이러스.
삭제
인플루엔자 바이러스의 표면 단백질 헤마글루티닌(HA)의 HA1 영역 일부인 서열번호 2로 표시되는 HA1의 N-말단으로부터 43-273번째 아미노산을 제거하고, 서열번호 3으로 표시되는 HA2의 N-말단으로부터 71-72번째 위치에 단백질 전달 도메인을 삽입하여 재조합 인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법으로서, 상기 단백질 전달 도메인은 TAT(transactivator of transcription) 또는 11R(11개의 연속된 아르기닌)인 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함하는 백신.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제