CN104169419A - 用于输送生物活性rna的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

用于将生物活性RNA分子输送至细胞的新型化合物、组合物和方法。具体而言，本发明提供可用于将生物活性RNA输送至细胞的新型核酸分子、多肽和RNA-蛋白复合物，以及编码它们的聚核苷酸。本发明还提供用于表达所述聚核苷酸的载体。另外，本发明提供可用作转染试剂的包含所述新型化合物和载体的细胞和组合物。本发明还提供用于制备所述化合物、载体、细胞和组合物的方法。另外，提供了用于将生物活性RNA分子输送至细胞和/或组织的载体和方法。所述新型化合物、载体、细胞和组合物可用于例如将生物活性RNA分子输送至细胞以便在对受试对象或生物体中的疾病、病症或病况的诊断、预防、缓和和/或治疗中调节靶基因的表达。

Description

用于输送生物活性RNA的组合物和方法
相关申请交叉引用
本申请要求提交于2011年12月23日的美国专利申请系列号61/579,815的权益，本文通过援引在此全部引用。
序列表说明
本申请的序列表仅以电子版提交并附有对比文件。所述序列表上传文本“09-281-US3 SEQLIST.txt”创建于2012年12月21日，大小为45,906字节。
技术领域
本申请提供用于将生物活性RNA分子输送至细胞的化合物、组合物和方法。具体而言，本发明提供可用于将生物活性RNA输送至细胞的新型核酸分子、多肽和RNA-蛋白复合物，以及编码它们的聚核苷酸。本发明还提供用于表达所述聚核苷酸的载体。另外，本发明提供了包含所述新型化合物和载体的细胞和组合物，其可用作转染试剂等等。本发明还提供了制备所述化合物、载体、细胞和组合物的方法。另外，本发明提供了用于将如核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子等生物活性RNA分子输送至细胞和/或组织的载体和方法。所述新型化合物、载体、细胞和组合物可用于例如，在对受试对象或生物体中的疾病、病症或病况的诊断、预防、改善和/或治疗中，将生物活性RNA分子输送至细胞以调节靶基因的表达。
背景技术
RNA分子具有在体外和体内充当基因表达的有力调节物的能力。这些分子能通过许多机制发挥功能，这些机制利用特定的与细胞蛋白的相互作用或与其它RNA分子的碱基配对相互作用。这种调节能与细胞机件体(machinery)起相反作用，如RNA适体会破坏RNA-蛋白和蛋白-蛋白相互作用，或者其能与细胞过程协同作用，如siRNA通过将内源性RNAi机件体重新导向所选的靶标而起作用。由于所形成的调节复合物不论其为RNA-蛋白复合物还是RNA-RNA复合物都往往是高度特异性的，因而经由RNA效应物分子的对基因表达的调节具有很大的治疗潜力(Aagaard等，2007,AdvDrug Deliv Rev.,59:75-86；de Fougerolles等，2007,Nat Rev Drug Discov.,6:443-53；Grimm等，2007,J Clin Invest.,117:3633-411-4；Rayburn等，2008,Drug Discov Today.,13:513-21)。当通过已完善建立的碱基配对规则确定了这种特异性时，可以利用这种调节性机件体向特定基因产物的靶向来引导实验设计。
调节基因表达的RNA分子可以采取许多不同的形式。可能对于所有RNA形式来说最影响最大的实例是反义RNA分子。该抑制性RNA通常是mRNA转录物的直接互补物，其通过对翻译机件体造成障碍以及通过将所述转录物靶向用于由细胞核酸酶进行的降解而靶向和发挥功能。另一类相关和重叠的RNA是小抑制RNA(siRNA)，其通过后转录基因沉默或RNAi途径而起作用。这些RNA通常长度为21-23个核苷酸，且与特定的细胞蛋白结合以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。这些小RNA也其mRNA靶标内的序列互补，并且这些复合物的结合导致转录物的翻译沉默或降解(Farazi等，2008,Development.,135:1201-145-7；Sontheimer等，2005,Nat RevMol Cell Biol.,6:127-38；Zamore等，2005,Science.,309:1519-24)。
两类额外的能调节基因表达和活性的RNA分子是催化性RNA核酶和竞争性RNA适体。核酶是基于RNA的酶，其能催化RNA底物上的化学反应，大多数为磷酸二酯骨架的水解。催化活性位点的形成需要核酶与RNA底物之间的碱基配对，因此也可通过提供适当的指引序列来将核酶活性靶向所需底物(Wood等，2007,PLoSGenet.,3:e109；Scherer等，2007,Gene Ther.,14:1057-64；Trang等，2004,Cell Microbiol.,6:499-508)。当靶向mRNA转录物时，核酶具有切割这些转录物并导致相关蛋白的下调的潜力(Liu等，2007,Cancer BiolTher.,6:697-704；Song等，2008,Cancer Gene Ther.；Weng等，2005,MolCancer Ther.,4:948-55；Li等，2005,Mol Ther.12:900-9)。RNA适体通常根据其与靶分子(通常为蛋白分子)相互作用的能力而选自随机的RNA序列。由于RNA适体的结合不受碱基配对相互作用的限制，因而对RNA适体的工程化没有那么直接，但是一旦发现有效的序列，该结合的特异性和亲和力往往可以与抗体-抗原相互作用相比(Mi等，2008,Mol Ther.,16:66-73；Lee等，2007,Cancer Res.,67:9315-21；Ireson等，2006,Mol Cancer Ther.,12:2957-62；Cerchia等，2005,PLoSBiol.,3:e1230)。RNA适体还具有更大的靶分子范围，以及通过许多不同机制来改变基因活性的潜力。
两种将抑制性RNA分子输送至细胞的方法已经成为了标准实践方法。第一种方法涉及通过使用纯化的聚合酶和DNA模板或者通过直接化学合成来在试管中制备RNA分子。这些RNA分子其后可被纯化并与合成载剂(通常为聚合物、脂质体或肽)混合并输送至靶细胞(Aigner等，2007,Appl Microbiol Biotechnol.,76:9-21；Juliano等，2008,Nucleic Acids Res.,36:4158-71；Akhtar等，2007,J Clin Invest.,117:3623-32)。这些分子被输送至细胞质，在那里它们与其mRNA或蛋白靶标直接结合或通过形成调节性复合物而结合。第二种方法涉及编码生物活性RNA的质粒分子来转染靶细胞。同样地，将纯化的质粒分子与合成载剂在试管中偶联并输送至靶细胞(Fewell等，2005,J Control Release.,109:288-98；Wolff等，2008,Mol Ther.,16:8-15；Gary等，2007,J Control Release.,121:64-73)。
在此情形中，必须将质粒模板输送至细胞核，在细胞核中该DNA被转录为生物活性RNA分子。该RNA其后被输出至细胞质，在那里其尝试靶向调节复合物和特定的mRNA转录物靶标。采用这些方法中的每一种，对细胞集群内的基因调节的程度都受到输送体系的转染效率的限制。未受到生物活性RNA分子或编码生物活性RNA的质粒所转染的细胞不具备用于接收调节性信号的机制。虽然对于生长于培养物中的细胞有可能实现较高的转染效率，但在体内实现类似程度的转染很困难。这一输送问题目前是对基于RNA的疗法在体内应用的主要阻抑因素，因为其限制了在细胞集群中特定的基因可以受到调节的程度。因此，仍然存在对于用于将生物活性RNA有效输送至细胞和组织的有效输送体系的需求。
发明内容
一方面，本发明包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列和组成型转运元件(CTE)。第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含RNA结合域序列和细胞穿透肽序列或真核非经典分泌域序列中至少一个。
另一方面，第一聚核苷酸或者第二聚核苷酸中至少一个可以与可诱导启动子序列可操作性地连接。此外，所述第一聚核苷酸还编码第二生物活性RNA序列。所述第一生物活性RNA序列和第二生物活性RNA序列可以是适体。或者，第一生物活性RNA序列和第二生物活性RNA可以调节靶基因产物的基因表达或者基因活性。
另一方面，本发明涉及包含第一、第二和第三聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列和识别RNA序列。所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含RNA结合域序列和细胞穿透肽序列或者真核非经典分泌域序列中至少一个。所述第三聚核苷酸编码促进RNA-多肽复合物从细胞中分泌的辅助蛋白。所述辅助蛋白可以是例如膜结合蛋白或者细胞溶质蛋白。所述复合物包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和多肽。
一方面，所述第一聚核苷酸可以与第一启动子序列可操作性地连接，并且第二聚核苷酸和第三聚核苷酸中至少一个可以与第二启动子序列可操作性地连接。在另一方面，第一启动子序列和第二启动子序列中至少一个是可诱导启动子序列。此外，所述第一聚核苷酸还可以编码组成型转运元件。
在另一方面，本发明涉及包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列和识别RNA序列。所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含RNA结合域序列和细胞穿透肽序列或者真核非经典分泌域序列中的至少一个。所述第一聚核苷酸和第二聚核苷酸中至少一个与可诱导启动子序列可操作性地连接。所述第一聚核苷酸可以还编码组成型转运元件。
在另一方面，本发明涉及生物反应器细胞，其中本发明的载体可以稳定地整合到生物反应器细胞的细胞DNA中。
在另一方面，本发明涉及从细胞中分泌生物活性RNA的方法。所述方法包括向细胞施用本发明的表达载体。
在另一方面，本发明涉及调节一种或多种靶基因在靶细胞中表达的方法。所述方法包括将本发明的表达载体施用于位于胞外间隙的第二细胞以制造生物反应器细胞。所述生物反应器细胞分泌生物活性RNA在靶细胞中调节一种或多种靶基因的表达。
在另一方面，本发明还涉及诱导从细胞中分泌生物活性RNA的方法。所述方法包括将本发明的表达载体施用于细胞，以及(i)将诱导子分子加入到该细胞中或者(ii)从该细胞中移除抑制子分子中至少一项。
在另一方面，本发明涉及诱导调节一种或多种靶基因在位于胞外间隙的靶细胞中表达的方法。所述方法包括将本发明的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生和分泌生物活性RNA，从而在(i)向所述生物反应器细胞加入诱导子分子，或者(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到靶细胞中。
在另一方面，本发明涉及诱导调节在胞外间隙或所述间隙中靶细胞表面上的一种或多种靶基因功能的方法。所述方法包括将本发明的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞。所述生物反应器细胞产生生物活性RNA，从而在(ⅰ)向生物反应器细胞加入诱导子分子，或者(ⅱ)从生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到胞外间隙或靶细胞表面。
因此，本发明提供了规避目前在生物活性RNA分子向哺乳动物细胞和组织的输送中低转染效率相关的问题的新方法。一种方法涉及使用产生并随后分泌一种或多种生物活性RNA分子的一种或多种“生物反应器”细胞，由此将所述分子输送至胞外间隙(该间隙包含细胞薄膜外的任何间隙，比如，胞外间隙，该间隙包括临近细胞以及靶细胞，还有包围的培养物、组织，或者培养介质。)所述生物活性分子例如为核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)分子以及编码一种或多种生物活性肽的RNA转录物。
因此，一方面本发明是一个转基因细胞疗法，即生物反应器细胞产生并向胞外间隙和周围组织中的靶细胞散布生物活性RNA。通过将一种或多种设计来产生RNA-蛋白复合物的表达载体施用至细胞来产生生物反应器细胞，所述RNA-蛋白复合物包含靶向一种或多种所关注基因的至少一种生物活性RNA分子以及能够将所述生物活性RNA分子输送至胞外间隙的融合蛋白。
RNA-蛋白复合物的RNA部分包含至少一个识别RNA序列以及一个或多个生物活性RNA序列。RNA-蛋白复合物的蛋白部分是包含至少一个RNA结合域和转运肽的融合蛋白。合适的转运肽的实例包括但不限于选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、核内体释放域、受体结合域和促融合肽的一种或多种肽。RNA-蛋白复合物的RNA部分和蛋白部分由一种或多种载体在经转染的生物反应器细胞的核中表达，并被转运至细胞质，在那里融合蛋白得到翻译并且与包含生物活性RNA的RNA序列结合，由此产生所述RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物从生物反应器细胞分泌并在胞外间隙中维持完好。RNA-蛋白复合物能够维持在胞外间隙中，在那里其发挥在胞外间隙内或在相邻靶细胞的细胞表面的调节作用。替代性地，可以将RNA-蛋白复合物设计来使得所述融合蛋白在靶细胞表面促使生物活性RNA输入至靶细胞的细胞质。另外，RNA-蛋白复合物的RNA部分包含输送适体，所述输送适体促使在靶细胞的表面生物活性RNA进入到靶细胞的细胞质中。
RNA-蛋白复合物的分泌可包含其他细胞蛋白，这些蛋白在在生物反应器细胞的细胞质或者细胞膜上通过与RNA蛋白复合物相互作用而提供辅助功效。与其他细胞相比，这些生物反应器辅助蛋白在特定的细胞类别中更加丰富，提供了由细胞背景调节的生物反应器活性。在这些例子当中，生物反应器辅助蛋白的识别以及将这些蛋白加入到生物反应器表达系统中，或者充当生物反应器质粒的组成部分或者作为稳定细胞系，可为内部活性低的细胞提供增强的生物反应器活性。
因此，大体而言，转染的细胞被转化为“生物反应器”，该生物反应器产生作为RNA-蛋白复合物分泌的生物活性RNA分子并将其输送至胞外间隙和/或其它相邻细胞。通过将细胞机件体引导向从质粒模板合成生物活性RNA分子，这种方法利用了对所提供的调节信号的放大。因此，所述调节信号不再受单次输送事件的初始转染效率的限制，而是具有在持续的时段中到达许多细胞的潜力。
通过用本文所述的一种或多种表达载体来转染适当的细胞，此类生物反应器细胞也可以在细胞培养物中产生。大体而言，转染的细胞被转化为在培养基中产生生物活性RNA分子并将其输送至其他细胞的生物反应器。于是，所述生物反应器细胞作为治疗性输送体系具有体内和离体应用，并且作为新型转染剂具有体内和体外应用。
生物反应器细胞的目的是在于将生物活性RNA分子以下述形式分泌至胞外间隙，该形式能够其后在胞外间隙内或在相邻靶细胞的细胞表面处起作用、或能被输送至相邻靶细胞。病毒包装细胞能够达到相同的目的：分泌和输送生物活性RNA分子。但与产生生物反应器的从取自不同来源的个体结构域组装而成的融合蛋白相反的是，病毒颗粒已经针对将核酸从一个细胞转移至另一个细胞的目的而进化(因此造成可移动的遗传学要素)。RNA病毒和DNA病毒均可被用作可能的核酸调节物用载体。在RNA病毒的情形中，编码生物活性RNA分子的聚核苷酸被添加至编码该病毒的非结构性基因的病毒转录物中。该转录物既充当负责病毒过程的病毒蛋白的模板，也充当被包装至病毒颗粒内的基因组。生物活性RNA被偶联至编码非结构性基因的RNA，从而该生物活性RNA被并入病毒颗粒。在DNA病毒的情形中，编码生物活性RNA的DNA片段被添加至病毒DNA，从而病毒转录物的合成亦会产生该生物活性RNA。病毒蛋白从由转录物编码的结构蛋白组装而成，所述转录物产生自辅助质粒。相似地，可以将一个或多个编码生物活性RNA和融合蛋白的聚核苷酸添加至编码非结构性病毒基因的病毒转录物中(在RNA病毒情形中)，或添加至病毒DNA中(在DNA病毒情形中)。因此，可以以与本文所述的生物反应器细胞相同的方式来使用以下述表达载体转染的细胞，所述表达载体包含用于编码病毒非结构性基因的序列和用于编码本发明的生物活性RNA或生物活性RNA-蛋白复合物的序列。
这些方法直接解决了在基于质粒的RNA介导疗法中的关键问题，即与质粒输送相关的低转染效率。使用所述的生物反应器细胞规避了对于高效率转染的需要，因为RNA介导的效应通过生物活性RNA的体内产生和向周围细胞和组织的输送而得到放大。
因此，本发明提供了可用于将生物活性RNA分子输送至哺乳动物细胞和组织的新型核酸分子、多肽、RNA-蛋白复合物、聚核苷酸和载体。另外，本发明提供了包含所述核酸分子、多肽、RNA-蛋白复合物、聚核苷酸和载体的组合物。本发明还提供了包含本发明的核酸分子、多肽、RNA-蛋白复合物、聚核苷酸和载体的细胞。另外，本发明提供了制备本发明的核酸分子、多肽、RNA-蛋白复合物、聚核苷酸、载体、组合物和细胞的方法，以及在体外、离体和体内使用本发明的分子的治疗方法。
本发明提供了可用在本发明的核酸分子、多肽和RNA-蛋白复合物的制备中的新型表达载体。在一个实施方式中，本发明提供了表达本发明的RNA-蛋白复合物的表达载体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种表达载体，该表达载体包含编码一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸，还包含编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽的多肽的聚核苷酸。由所述表达载体表达的RNA-蛋白复合物的RNA部分和蛋白部分在经转染的生物反应器细胞的核中表达，并被分别转运至细胞质，在细胞质中融合蛋白得到翻译并与包含所述生物活性RNA的RNA序列结合，由此产生所述RNA-蛋白复合物。所述RNA-蛋白复合物从本文所讨论的生物反应器细胞分泌。所述一种或多种生物活性RNA序列可以为针对相同基因靶标的一种或多种不同类型的生物活性RNA序列，或可以为针对不同基因靶标的生物活性RNA序列。
在另一个实施方式中，所述表达载体另外包含第一启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列、第二启动子序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码所述第一生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的聚核苷酸与所述第一启动子序列和终止序列可操作性连接，且其中编码所述RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接。启动子序列可选自一些提供持续基因表达的启动子，或者可抑制的/可诱导的启动子，其活性通过加入小分子而被调控。在可抑制的/可诱导的启动子的情况中，在活体外的生物反应器组成部分或者通过加入诱导子分子或者通过从细胞培养介质中移除抑制子分子而进行控制。对于在活体内的用途，诱导子分子可以被口服、被注射，或者被吸入。
所述表达载体在某些特定的实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)，以及编码一种或者多种的生物活性多肽的转录物。在一个具体的实施方式中，所述生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在另一个具体的实施方式中，所述生物活性RNA序列是适体。在某些实施方式中，所述识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在一种实施方式中，所述末端小螺旋序列选自腺病毒VAIRNA分子。在另一种实施方式中，组成型转运元件(CTE)选自梅森-菲舍猴病毒(Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)、鸟类白血病病毒(ALV)或者猴逆转录病毒(SRV)。在某些实施方式中，所述RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。在某些实施方式中，所述一种或多种转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域以及任意组合。在一个具体实施方式中，所述转运肽是细胞穿透肽。在某些具体实施方式中，细胞穿透肽选自穿透素(penetratin)、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在另一个实施方式中，转运肽是病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些具体实施方式中，所述病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌谷氨酰胺转移酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在某一具体实施方式中，转运肽是细胞穿透肽并且一种或多种转运肽选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域。在某一具体实施方式中，所述转运肽是细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些具体实施方式中，病毒非结构基因和结构基因(病毒聚合酶、辅助蛋白、外壳蛋白和促融合蛋白)选自DNA病毒和RNA病毒，包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒、泡沫病毒。
在另一个实施方式中，所述表达载体包含第一抑制/诱导启动子序列、终端序列和可选的一种或多种引物序列，第二抑制/诱导启动子序列，聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的聚核苷酸与第一启动子序列和终止序列可操作性地连接，且其中编码所述RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。在另一个实施方式中，所述表达载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒包含启动子序列、一种或多种针对一种或多种靶基因的生物活性RNA序列、识别RNA序列、输送RNA适体序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、终止序列、以及可选的一种或多种引物序列，其中所述生物活性RNA序列、输送RNA适体序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列与所述启动子序列和终止序列可操作性地连接；并且所述第二表达盒包含启动子序列、RNA结合域序列、转运肽序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述RNA结合域序列和转运肽序列与所述启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。
在另一个实施方式中，所述表达载体还包含第三表达盒，其中所述第三表达盒包含一种或多种启动子序列，比如可诱导或可抑制启动子序列、编码一种或多种最优生物反应器活性所必需的生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列，以及可选的一种或多种引物序列，其中所述编码生物反应器辅助蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。所述包含第三表达盒且第三表达盒包含生物反应器辅助蛋白序列的载体可与包含编码一种或多种细胞溶质生物反应器辅助蛋白和一种或多种膜结合生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的一种或多种表达载体同时使用。在另一个实施方式中，所述包含编码一种或多种细胞溶质生物反应器辅助蛋白和一种或多种膜结合生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体还可进一步包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码细胞溶质生物反应器辅助蛋白和膜结合生物反应器辅助蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。
在另一个实施方式中，所述表达载体还包含编码病毒复制所必须的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述载体另外包含一种或多种启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码所述病毒聚合酶和病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。可以将包含病毒聚合酶和辅助蛋白序列的载体与表达载体一同使用，所述表达载体包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。在另一个实施方式中，包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体还可包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中编码病毒外壳蛋白和病毒促融合蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在另一个实施方式中，所述表达载体还包括一种或多种聚核苷酸序列编码一种或多种来源于外排体富集蛋白的融合蛋白，尤其，所述融合蛋白至少包含RNA结合域和外排体蛋白域。在进一步的实施方式中，所述载体还额外地包含一种或多种启动子序列，比如，可诱导或可抑制的启动子序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述编码所述包含外排体靶定肽的融合蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。所述编码所述包含外排体靶定肽序列的融合蛋白的载体可以与包含编码一种或多种细胞溶质外排体蛋白和一种或多种膜结合外排体蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体一起使用。在进一步的实施方式中，所述包含编码一种或多种细胞溶质外排体蛋白和一种或多种膜结合外排体蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体可以进一步包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码所述细胞溶质外排体蛋白和一种或多种膜结合外排体蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。
在另一个实施方式中，所述表达载体进一步包含一种或多种聚核苷酸序列编码一种或多种膜通道核复合物和一种或多种RNA解旋酶运动复合体。在进一步的实施方式中，所述载体额外包含一种或多种启动子序列，比如，可诱导或可抑制的启动子序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述编码膜通道核复合物和一种或多种RNA解旋酶运动复合体的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。所述包含膜通道核复合物和所述RNA解旋酶运动复合体序列的载体可与包含编码一种或多种膜通道蛋白亚单元和一种或多种RNA解旋酶蛋白亚单元的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体一起使用。在进一步实施方式中，所述包含编码一种或多种膜通道蛋白亚单元和一种或多种RNA解旋酶蛋白亚单元的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体可进一步包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码所述膜通道蛋白亚单元和所述RNA解旋酶蛋白亚单元的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸序列可操作性地连接。
在所述表达载体的某些实施方式中，所述生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个具体实施方式中，所述生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在另一个具体实施方式中，所述生物活性RNA序列是适体。在某些实施方式中，所述识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在一个实施方式中，所述末端小螺旋序列来自腺病毒VA1 RNA分子。在另一个实施方式中，所述组成型转运元件选自梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、鸟类白血病病毒(ALV)或者猴逆转录病毒(SRV)。在某些实施方式中，所述RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。在某些实施方式中，所述一个或多个转运肽选自细胞穿透肽、病毒性、原核或真核非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域以及其任何组合。在一个具体实施方式中，所述转运肽是细胞穿透肽。在某些具体实施方式中，所述细胞穿透肽选自穿透素(penetratin)、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在另一个具体实施方式中，所述转运肽是病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些具体实施方式中，所述病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌谷氨酰胺转移酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在一个具体实施方式中，所述转运肽是细胞穿透肽，且一种或多种转运肽选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域。在一个具体实施方式中，所述转运肽是细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些实施方式中，所述病毒非结构基因和结构基因(病毒聚合酶、辅助蛋白、外壳蛋白和促融合蛋白)选自DNA病毒和RNA病毒，其包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒和泡沫病毒。
在上述实施方式中的任一个中，所述表达载体还可包含额外的聚核苷酸序列，所述聚核苷酸序列编码包含靶向一个或多个基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含一种或多种生物活性RNA序列和RNA识别序列的核酸，所述生物活性RNA序列靶向另一个基因靶标。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述表达载体额外包含编码如下核酸的聚核苷酸：所述核酸包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。在所述编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列中，没有一个包含识别RNA序列。
在另一个实施方式中，所述表达载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中所述第一表达盒包含启动子序列，比如一种可诱导或可抑制的启动子序列、一种或多种针对一种或多种靶基因的生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、终止序列、以及可选的一种或多种引物序列，其中所述生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、和可选的末端小螺旋序列与所述启动子序列和终止序列可操作性连接；并且所述第二表达盒包含启动子序列、RNA结合域序列、转运肽序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述RNA结合域序列和转运肽序列与所述启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接。在另一个实施方式中，所述表达载体额外包含第三表达盒，其中所述第三表达盒包含一种或多种启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、一种或多种编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列、以及可选的一种或多种引物序列，其中所述编码病毒聚合酶和病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。包含含有病毒聚合酶和辅助蛋白序列的第三表达盒的载体可以与包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的聚核苷酸序列的表达载体一同使用。在另一个实施方式中，所述包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的聚核苷酸序列的表达载体还可包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码病毒外壳蛋白和病毒促融合蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在上述表达载体的一个实施方式中，所述包含RNA-蛋白复合物的RNA部分(即，包含RNA识别序列、一种或多种生物活性RNA可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列)的表达盒被结合至融合蛋白(即，RNA结合域和一种或多种转运肽)用表达盒内的人工内含子内。在该表达载体中，在置于编码所述融合蛋白的mRNA序列内的人工内含子内编码Sec-RNA。编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段由PCR制备。编码Sec-RNA分子的DNA片段用包含剪接供体和接受体位点以及用于亚克隆至融合蛋白序列内的独特限制位点内的限制位点的引物来制备。编码融合蛋白的DNA片段用包含用于亚克隆至上述质粒内的限制位点的引物来制备。转录后，通过生物反应器细胞的内源性剪接机件体将Sec-RNA从编码融合蛋白的mRNA释放。
在这些实施方式的任一个中，所述生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。所述识别RNA序列选自U1环、Group II族内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。所述末端小螺旋序列选自腺病毒VA1 RNA分子。所述组成型转运元件选自梅森-菲舍猴病毒(MPMV)/鸟类白血病病毒(ALV)或猴逆转录病毒(SRV)。所述RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。所述一种或多种转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域以及其任意组合。
在上述实施方式的任一个中，所述表达载体还能包含额外的表达盒，其中所述额外表达盒包含一种或多种启动子序列，比如，可诱导或可抑制的启动子序列、编码包含靶向另一个基因转录物的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的一种或多种聚核苷酸序列、以及一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码包含靶向另一个基因转录物的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向另一个基因转录物的一种或多种生物活性RNA序列和RNA识别序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的一个或多个生物活性RNA序列是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸中，均不包含识别RNA序列。
在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的核酸分子。在一个实施方式中，表达载体包含如下聚核苷酸，所述聚核苷酸编码包含一种或多种生物活性RNA序列和一种或多种编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方式中，表达载体包含如下聚核苷酸，所述聚核苷酸编码其中的生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物的核酸分子。在一个具体实施方式中，表达载体包含编码其中生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)的核酸分子的聚核苷酸。在另一个具体实施方式中，表达载体包含编码其中生物活性RNA序列是适体的核酸分子的聚核苷酸。在某些实施方式中，表达载体包含如下的聚核苷酸，所述聚核苷酸编码其中识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列的核酸分子。在一个实施方式中，末端小螺旋序列来自腺病毒VA1 RNA分子。在另一个实施方式中，所述组成型转运元件选自梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、鸟类白血病病毒(ALV)或猴逆转录病毒(SRV)。
本发明还提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽的多肽。在某些实施方式中，RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。在某些实施方式中，所述一种或多种转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域以及其任意组合。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含RNA结合域和细胞穿透肽的多肽。在某些具体实施方式中，细胞穿透肽选自穿透素(penetratin)、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在另一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含RNA结合域和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的多肽。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌谷氨酰胺转移酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含RNA结合域、细胞穿透肽和一种或多种转运肽的多肽，所述转运肽选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码包含RNA结合域、细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的多肽。
因此，本发明提供了包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的CTE和可选的末端小螺旋序列的核酸分子的聚核苷酸的第一表达载体，以及包含编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽(例如，选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域的肽)的多肽的聚核苷酸的第二表达载体。从第一表达载体表达的RNA-蛋白复合物的RNA部分和从第二表达载体表达的RNA-蛋白复合物的蛋白部分表达于经转染的生物反应器细胞的核内，并被分别转运至细胞质，在细胞质中融合蛋白得到翻译并与包含生物活性RNA的RNA序列结合，由此产生所述RNA-蛋白复合物。如本文所讨论，所述RNA-蛋白复合物从生物反应器细胞分泌。
在本发明的表达载体的任一个中，包含识别RNA序列、个体生物活性RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和转运肽以及任何其它序列(包括病毒序列、启动子、引物、终止序列和聚腺苷酸序列)的一种或多种序列直接相连而没有额外添加一种或多种间隔序列或额外序列。替代性地，包含识别RNA序列、个体生物活性RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和转运肽以及任何其它序列(包括病毒序列、启动子、引物、终止序列和聚腺苷酸序列)的一种或多种序列在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在上述实施方式的任一种中，所述个体生物活性RNA序列自身在没有额外添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连，或在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。在上述实施方式的任一种中，所述RNA结合域和各转运肽的任一个在没有额外添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连，或在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。
在本发明的表达载体的任一个中，所述载体选自合适的主链载体。合适的载体的实例包括源自pCI、pET、pSI、pcDNA、pCMV等的那些载体。在某些实施方式中，载体选自pEGEN 1.1、pEGEN 2.1、pEGEN3.1和pEGEN 4.1。pEGEN载体源自pSI(Promega，产品号E1721)、pCI(Promega，产品号E1731)、pVAX(Invitrogen，产品号12727-010)和其它自制构建体。在一个实施方式中，载体包含pUC复制起点。在一个实施方式中，表达载体包含抗药性基因。合适的抗药性基因的非限制性实例包括选自嘌呤霉素、氨苄青霉素、四环素和氯霉素抗性基因以及在本领域中已知和已有描述的任何其它抗药性基因的那些。
本发明还提供了包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物。所述组合物的表达载体可以是本文所述的表达载体中的任一种。在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和含有编码核酸的聚核苷酸以及编码多肽的聚核苷酸的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(例如，细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽)。在一个实施方式中，所述组合物还包含含有如下聚核苷酸序列的第二表达载体，所述聚核苷酸序列编码包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在一个实施方式中，所述聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，该表达载体额外包含编码如下核酸的聚核苷酸，所述核酸包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和表达载体，所述载体包含：编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸序列，编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(例如，细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽)的多肽的聚核苷酸序列，以及编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和表达载体，所述载体包含：编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸序列，编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列的多肽的聚核苷酸序列，以及第一启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列、第二启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列。在该实施方式中，编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的聚核苷酸以及编码RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸与所述第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和表达载体，所述载体包含：编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸，编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列的多肽的聚核苷酸，和编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸，以及第一启动子序列、第一终止序列和可选的一种或多种引物序列、第二启动子序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列、和一种或多种其它启动子序列、一种或多种其它终止序列和一种或多种引物序列。在该实施方式中，编码一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的聚核苷酸与第一启动子序列和第一终止序列可操作性连接，编码RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接，编码靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的聚核苷酸与一种或多种其它启动子序列和一种或多种其它终止序列可操作性连接。
在一个实施方式中，所述组合物包含在药物可接受载剂中的第一表达载体和第二表达载体，所述第一载体包含：编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸，编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列的多肽的聚核苷酸，和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列，所述第二载体包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。在某些实施方式中，这些组合物的表达载体额外包含第一启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列、第二启动子序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列、以及一种或多种其它启动子序列、一种或多种其它聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种其它引物序列，其中，编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的聚核苷酸与第一启动子序列和终止序列可操作性连接，且其中编码RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接，并且其中编码一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接，且其中编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和表达载体，所述表达载体包含编码核酸分子的聚核苷酸，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和表达载体，所述表达载体包含编码多肽的聚核苷酸，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(例如，细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽)。
在一个实施方式中，所述组合物包含第一表达载体、第二表达载体和药物可接受载剂，所述第一表达载体包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的核酸分子的聚核苷酸，所述第二表达载体包含编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(例如，细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽)的多肽的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述组合物还包含第三表达载体，所述第三表达载体包含编码如下核酸分子的聚核苷酸序列，所述核酸分子包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码如下核酸，所述核酸包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述表达载体额外包含编码如下核酸的聚核苷酸，所述核酸包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。
在一个实施方式中，所述组合物在药物可接受载剂中包含含有编码下述核酸的聚核苷酸的第一表达载体和第二表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶核一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列，且所述第二表达载体包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述组合物包含药物可接受载剂和含有第一表达盒和第二表达盒的表达载体，其中，所述第一表达盒包含第一启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、针对一种或多种靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列，且所述第二表达盒包含第二启动子序列,比如可诱导或可抑制的启动子序列、RNA结合域序列、转运肽序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列。在这些实施方式中，所述生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列与所述第一启动子序列和终止序列可操作性连接，且所述RNA结合域序列和转运肽序列与所述第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在另一个实施方式中，所述组合物包含第一表达载体、第一表达载体和药物可接受载剂，所述第一表达载体含有第一表达盒、第二表达盒和第三表达盒，其中所述第一表达盒包含第一启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、针对一种或多种靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列，且所述第二表达盒包含第二启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、RNA结合域序列、转运肽序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，且所述第三表达盒包含一种或多种启动子序列、编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列；且所述第二表达载体包含第四表达盒，所述第四表达盒包含一种或多种启动子序列、编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列。在这些实施方式中，所述生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列与所述第一启动子序列和终止序列可操作性连接，所述RNA结合域序列和转运肽序列与所述第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接，所述编码病毒聚合酶和病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接，且所述编码病毒外壳蛋白和病毒促融合蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
本发明的表达载体和组合物可以用于产生“生物反应器”细胞，所述“生物反应器”细胞可产生本发明的RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物的RNA部分包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列。RNA-蛋白复合物的蛋白部分包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列。转录物被从细胞核输出至细胞质，在细胞质中包含RNA结合域和转运肽序列的转录物得到翻译。经翻译的肽的RNA结合域与RNA部分的识别RNA序列相互作用，从而形成RNA-蛋白复合物。蛋白-RNA复合物随后从细胞分泌出并输入至胞外间隙和/或相邻细胞内，在那里生物活性RNA起到调节基因表达的作用。
在一个实施方式中，本发明提供了包含本文提供的表达载体及其组合物的任何一个的细胞。在一个实施方式中，本发明提供了包含含有编码核酸的聚核苷酸序列和编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体的细胞，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列以及编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述细胞还包含含有编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽。
在一个实施方式中，本发明提供了包含含有编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和额外的聚核苷酸序列的表达载体的细胞，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽，所述额外聚核苷酸序列对包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸进行编码。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列对包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸进行编码。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列、编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列、以及额外聚核苷酸序列的表达载体，所述细胞还包含含有编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽，且所述额外聚核苷酸序列对包含靶向一种或多种其它基因靶标(例如，Dicer和/或Drosha基因靶标)的一种或多种生物活性RNA序列的核酸进行编码。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码包含生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列以及编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述细胞还包含含有编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体和含有编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域序列和一种或多种转运肽。在一个实施方式中，所述细胞还包含第三表达载体，该第三表达载体包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列，所述一种或多种生物活性RNA序列靶向不同于第一表达载体中的生物活性RNA的基因靶标的一种或多种基因靶标。在一个实施方式中，所述第三表达载体包含编码如下核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含RNA识别序列和靶向一种或多种基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在另一个实施方式中，当第一表达载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，第三表达载体包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。
本发明还提供了包含本发明的生物反应器细胞和药物可接受载剂的组合物。所述组合物可以包含本文所述的任何一种生物反应器细胞和药物可接受载剂。在一个实施方式中，所述组合物包含含有本发明的表达载体的一种或多种细胞和药物可接受载剂。所述细胞可以包含本文所述的任何表达载体中的一种或多种。在一个实施方式中，本发明提供了包含表达本发明的RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞和药物可接受载剂。在一个实施方式中，所述组合物包含表达RNA-蛋白复合物的一种或多种细胞，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和一种或多种转运肽序列。在一个实施方式中，所述组合物包含表达RNA-蛋白复合物的一种或多种细胞和药物可接受载剂，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和细胞穿透肽序列。在一个实施方式中，所述组合物包含表达RNA-蛋白复合物的一种或多种细胞和药物可接受载剂，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在一个实施方式中，所述组合物包含表达RNA-蛋白复合物的一种或多种细胞和药物可接受载剂，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域、细胞穿透肽序列和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。
本发明的包含一种或多种表达载体的生物反应器细胞能产生并分泌本发明的RNA-蛋白复合物。所述生物反应器细胞于是可以在体外、离体和体内用作用于将一种或多种生物活性RNA输送至其它靶细胞和组织的新型转染试剂。由此，本发明提供了细胞疗法，其中被输送的治疗剂是在生物反应器细胞内产生并分泌出来从而向周围组织的细胞中散发的生物活性RNA。因此，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域序列和一种或多种转运肽序列(例如，选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽序列)；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达所述RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞；和(c)收集步骤(b)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(d)测试(c)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(e)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。表达载体可以是本文所述的任何表达载体。RNA-蛋白复合物可以是本文所述的任何RNA-蛋白复合物。在一个实施方式中，所述RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是shRNA。在另一个实施方式中，所述RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是适体。在一个实施方式中，用所述表达载体稳定转染步骤(b)的细胞。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和额外聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞；和(c)收集步骤(b)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(d)测试(c)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(e)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；和(d)收集步骤(c)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(e)测试(d)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列、额外聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；和(d)收集步骤(c)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(e)测试(d)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达所述生物活性RNA的一种或多种生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；和(d)收集步骤(c)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(e)测试(d)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了用于制备包含一种或多种生物反应器细胞的转染试剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞；和(d)收集步骤(c)的培养细胞作为所述转染试剂。在一个实施方式中，所述方法还包括(e)测试(d)的细胞以确定表达所述RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将所述生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离开以便用作所述转染试剂。
在另一个实施方式中，本发明提供了从细胞外间隙制备和分泌用于收集的大型RNA分子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种大型RNA分子、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的一种或多种生物反应器细胞；和(d)从所述细胞中收集生长介质以备后续使用或纯化所分泌的大型RNA。在另一个实施方式中，所述方法进一步包含(e)测试(d)步骤中的细胞以确定生物反应器细胞表达RNA-蛋白复合物；和(f)在培养物中把生物反应器细胞与其他细胞分离开并用作RNA的制备剂。
本发明还提供了使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞(包括体外、离体和体内的靶细胞)的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述转运肽序列选自细胞穿透域、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、促融合肽和受体结合域；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(c)收集步骤(b)的培养细胞；和(d)将一种或多种靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，靶细胞是培养物中的细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是已获自受试对象(例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象)的培养物中的细胞。在一个实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的额外聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；(d)收集步骤(c)的培养细胞；和(e)将一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，靶细胞是培养物中的细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是已获自受试对象(例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象)的培养物中的细胞。在一个实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的额外聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达生物活性RNA的生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；(d)收集步骤(c)的培养细胞；和(e)将一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，靶细胞是培养物中的细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是已获自受试对象(例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象)的培养物中的细胞。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)将一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，靶细胞是培养物中的细胞。在另一个实施方式中，靶细胞是已获自受试对象(例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象)的培养物中的细胞。
在一个实施方式中，靶细胞是已从受试对象(例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象)取出的细胞。因此，在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述转运肽序列选自细胞穿透域、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、促融合肽和受体结合域；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(c)收集步骤(b)的培养细胞；和(d)将一种或多种取自受试对象的靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将步骤(d)的细胞施用于受试对象，例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象。在另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用于受试对象之前，将生物反应器细胞从步骤(d)的靶细胞中分离。在一个实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的额外聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；(d)收集步骤(c)的培养细胞；和(e)将一种或多种取自受试对象的靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将步骤(e)的细胞施用于受试对象，例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象。在另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用于受试对象之前，将生物反应器细胞从步骤(e)的靶细胞中分离。在一个实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的额外聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达生物活性RNA的生物反应器细胞(在此情形中，病毒生产细胞)；(d)收集步骤(c)的培养细胞；和(e)将一种或多种取自受试对象的靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将步骤(e)的细胞施用于受试对象，例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象。在另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用于受试对象之前，将生物反应器细胞从步骤(e)的靶细胞中分离。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)将一种或多种取自受试对象的靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：将步骤(e)的细胞施用于受试对象，例如，哺乳动物受试对象，包括人类受试对象。在另一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用于受试对象之前，将生物反应器细胞从步骤(e)的靶细胞中分离。
本发明提供了用于从生物反应器细胞分泌一种或多种生物活性RNA分子的方法和用于调节体内、离体和体外的靶基因表达的方法。本发明提供了设计来产生RNA-蛋白复合物的表达载体和融合蛋白，所述RNA-蛋白复合物包含靶向所关注的一种或多种基因的至少一种生物活性RNA，所述融合蛋白能将所述生物活性RNA分子输送至胞外间隙和/或相邻细胞和组织。所述表达载体向细胞的体内、离体和体外施用将该细胞转化为“生物反应器”，所述“生物反应器”产生生物活性RNA分子(作为RNA-蛋白复合物分泌)并将其输送至胞外间隙和/或其它相邻细胞。因此，通过生物活性RNA分子的产生和向周围细胞和组织的输送，RNA介导的效应得到放大。
在一个实施方式中，本发明提供了调节受试对象中一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括将本发明的一种或多种表达载体施用至所述受试对象。在另一个实施方式中，本发明提供了调节受试对象中一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括将包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物施用至所述受试对象。在另一个实施方式中，本发明提供了调节受试对象中一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含本发明的一种或多种表达载体的细胞和药物可接受载剂。所述表达载体可以是本文所述的本发明的表达载体中的任一种。
在一个实施方式中，本发明提供了调节受试对象中一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括将本发明的一种或多种生物反应器细胞施用至所述受试对象。在另一个实施方式中，本发明提供了调节受试对象中一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括将包含本发明的一种或多种生物反应器细胞和药物可接受载剂(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)、盐水或5％右旋葡萄糖)的组合物施用至所述受试对象。所述生物反应器细胞可以是本文所述的本发明的生物反应器细胞中的任一种。在一个实施方式中，所述生物反应器细胞产生并分泌RNA-蛋白复合物，所述RNA-蛋白复合物包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域序列和一种或多种转运肽序列(例如，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽)。
在本文所述的调节受试对象中的基因表达的任何方法中，所述受试对象可以是哺乳动物受试对象，包括例如人类、啮齿类、鼠科、牛科、犬科、猫科、绵羊、马科和猴科受试对象。
另外，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用本发明的一种或多种表达载体。在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物。在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含本发明的一种或多种表达载体的细胞和药物可接受载剂。所述表达载体可以是本文所述的本发明的表达载体中的任一种。
在一个具体实施方式中，本发明提供了调节靶细胞中的靶基因表达的方法，所述方法包括对所述靶细胞施用本发明的表达载体，其中所述靶细胞产生并分泌本发明的RNA-蛋白复合物，且其中所述RNA-蛋白复合物随后被输送至胞外间隙或输送至其它靶细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了调节靶细胞中的靶基因表达的方法，所述方法包括对所述靶细胞施用包含本发明的表达载体的组合物，其中所述靶细胞产生并分泌本发明的RNA-蛋白复合物，且其中所述RNA-蛋白复合物随后被输送至胞外间隙或输送至其它靶细胞。在另一个实施方式中，本发明提供了调节靶细胞中的靶基因表达的方法，所述方法包括对所述靶细胞施用包含本发明的表达载体的细胞，其中所述靶细胞产生并分泌本发明的RNA-蛋白复合物，且其中所述RNA-蛋白复合物随后被输送至胞外间隙或输送至其它靶细胞。所述表达载体可以是本文所述的本发明的表达载体中的任一种。
本发明还提供了用于调节离体靶细胞中靶基因表达的方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节离体靶细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括对所述离体靶细胞施用本发明的一种或多种表达载体。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节离体靶细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括对所述离体靶细胞施用包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节离体靶细胞中靶基因表达的方法，所述方法包括对所述离体靶细胞施用包含本发明的一种或多种表达载体的生物反应器细胞和药物可接受载剂。所述表达载体可以是本文所述的本发明的表达载体中的任一种。
本发明还提供了用于调节培养物中的细胞中的基因表达的方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节培养物中的细胞中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对所述细胞施用本发明的一种或多种表达载体。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节培养物中的细胞中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对所述细胞施用包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节培养物中的细胞中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对所述细胞施用包含本发明的一种或多种表达载体的生物反应器细胞和药物可接受载剂。所述表达载体可以是本文所述的本发明的表达载体中的任一种。
在一个实施方式中，本发明提供了用于调节培养物中的细胞中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对所述细胞施用第一表达载体和第二表达载体，所述第一表达载体编码包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的核酸，而所述第二表达载体编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(例如，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域和受体结合域)的多肽。
另外，本发明提供了从复制缺陷性或复制无能性病毒颗粒构建的表达载体，所述病毒颗粒携带并分配来自转化的包装细胞的一种或多种生物活性RNA分子。在一个实施方式中，本发明提供了包含编码本文所述的任何核酸分子的聚核苷酸的病毒载体。在一个实施方式中，本发明提供了包含编码下述核酸分子的聚核苷酸的病毒载体，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列和识别RNA序列。在另一个实施方式中，本发明提供了包含编码下述核酸分子的聚核苷酸的病毒载体，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、组成型转运元件(CTE)和末端小螺旋序列。所述生物活性RNA序列可以是本文所述的或者本领域中已知的任何生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述病毒载体包含编码核酸分子的聚核苷酸，在所述核酸分子中的生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个具体实施方式中，所述病毒载体包含编码核酸分子的聚核苷酸，在所述核酸分子中的生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在一个具体实施方式中，所述病毒载体包含编码核酸分子的聚核苷酸，在所述核酸分子中的生物活性RNA序列是适体。识别RNA序列可以是本文所述或者本领域中已知的任何识别RNA序列。在一个实施方式中，所述病毒载体包含编码核酸分子的聚核苷酸，在所述核酸分子中的识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。所述末端小螺旋序列可以是本文所述或者本领域中已知的任何末端小螺旋序列。在一个实施方式中，所述末端小螺旋序列选自腺病毒VA1 RNA分子。在另一个实施方式中，组成型转运元件选自梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、鸟类白血病病毒(ALV)、猴逆转录病毒(SRV)。
在另一个实施方式中，所述病毒载体额外包含编码下述核酸分子的聚核苷酸，所述核酸分子包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述聚核苷酸编码包含单个生物活性RNA序列的核酸分子。在另一个实施方式中，所述聚核苷酸编码包含两个或两个以上生物活性RNA序列的核酸分子。在某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。
在上述的包含本发明的编码核酸分子的聚核苷酸的病毒载体的实施方式中的任一种中，所述聚核苷酸可以包含如下序列，在所述序列中识别RNA序列、各生物活性RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列和任何其它所包含的序列在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连，或在没有添加间隔序列的情况下直接相连。
在另一个实施方式中，病毒载体包含编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域和促融合肽)的多肽的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述编码多肽的聚核苷酸还包含启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列。在另一个实施方式中，所述病毒载体额外包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列的核酸的聚核苷酸。在另一个实施方式中，所述编码核酸分子的聚核苷酸额外包含启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列。在再一个实施方式中，所述病毒载体额外包含编码如下核酸分子的聚核苷酸，所述核酸分子包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列以及可选的启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列、终止序列和一种或多种引物序列。因此，在一个实施方式中，病毒载体包含编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽(选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域和促融合肽)的多肽的聚核苷酸，还包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列的核酸分子的聚核苷酸。在一个实施方式中，该病毒载体还可包含编码如下核酸分子的聚核苷酸，所述核酸分子包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。在这些实施方式的任一个中，所述病毒载体可以可选地包含一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列和一种或多种引物序列。
在上述的病毒载体实施方式的任一个中，所述聚核苷酸可以包含下述序列，在所述序列中的RNA结合域、细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域、促融合肽和任何其它所包含的序列(即，启动子序列、终止序列、引物序列、生物活性RNA序列、识别RNA序列、组成型转运元件(CTE)、末端小螺旋序列等)在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连，或在没有添加间隔序列的情况下直接相连。在上述实施方式的任一种中，所述载体可以包含编码下述多肽的聚核苷酸，在所述多肽中各个域和肽的一个或多个序列在没有添加或添加有一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下相连。
本发明还提供了工程化的复制缺陷性病毒以将生物活性RNA从转化的包装细胞输送至靶细胞。在一个实施方式中，本发明提供了通过用质粒转染接受体细胞而产生的包装细胞，所述质粒编码两个独立的病毒RNA，其中一个编码病毒结构基因，另一个编码非结构基因和生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述病毒非结构基因和结构基因选自DNA病毒和RNA病毒，合适的病毒的非限制性实例为腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒、泡沫病毒。所述生物活性RNA序列可以是本文所述或本领域已知的任何生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个具体实施方式中，所述生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在另一个具体实施方式中，所述生物活性RNA序列是微小RNA(miRNA)。
两种质粒的成功共转染产生能够生成复制缺陷性病毒颗粒的包装胞。在一个实施方式中，本发明提供了通过在体外、离体或体内转染细胞而产生的包装细胞。在另一个实施方式中，所述包装细胞被收集并与靶细胞在体外混合。在另一个实施方式中，所述包装细胞被收集并施用于体内靶细胞。在另一个实施方式中，所述包装细胞被收集并转移至离体靶细胞。
附图说明
图1是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是shRNA。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含识别RNA序列和shRNA的核酸分子和包含RNA结合域(RBD)和细胞穿透肽(CPP)的融合蛋白。融合蛋白在细胞质中得到翻译，在那里翻译的融合蛋白的RNA结合域与核酸的识别RNA序列结合，从而形成RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物被分泌到胞外间隙中并被相邻细胞摄取，在那里shNRA起到调节所关注的靶基因(GOI)的作用。
图2是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是shRNA。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含识别RNA序列和shRNA的核酸分子和包含RNA结合域(RBD)、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域(NCS)和细胞穿透肽(CPP)的融合蛋白。融合蛋白在细胞质中得到翻译，在那里翻译的融合蛋白的RNA结合域与核酸的识别RNA序列结合，从而形成RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物被分泌到胞外间隙中并被相邻细胞摄取，在那里shNRA起到调节所关注的靶基因(GOI)的作用。
图3是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是靶向特定的细胞表面受体的适体。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含识别RNA序列和靶向特定的细胞表面受体的适体的核酸分子和包含RNA结合域(RBD)和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域(NCS)的融合蛋白。融合蛋白在细胞质中得到翻译，在那里翻译的融合蛋白的RNA结合域与核酸的识别RNA序列结合，从而形成RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物被分泌到胞外间隙中。所述适体与靶细胞表面受体结合，从而避免受体配体与该受体结合。
图4是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是靶向特定的胞外间隙蛋白的适体。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含识别RNA序列和靶向特定的胞外间隙蛋白的适体的核酸分子和包含RNA结合域(RBD)和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域(NCS)的融合蛋白。融合蛋白在细胞质中得到翻译，在那里翻译的融合蛋白的RNA结合域与核酸的识别RNA序列结合，从而形成RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物被分泌到胞外间隙中。所述适体与胞外间隙蛋白结合，从而避免该胞外间隙蛋白进入靶细胞。胞外间隙蛋白可以特别为细胞表面受体配体，由此所述适体与该配体结合并避免它与其受体结合(未示出)。
图5显示了主链质粒pEGEN 1.1的示意图。pEGEN 1.1包含SV40启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图6显示了主链质粒pEGEN 2.1的示意图。pEGEN 2.1包含鸡β-肌动蛋白启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图7显示了主链质粒pEGEN 3.1的示意图。pEGEN 3.1包含CMV启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图8显示了主链质粒pEGEN 4.1的示意图。pEGEN 4.1包含人类U6启动子序列(1)、多克隆序列(MCS)、聚腺苷酸终止子序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图9显示了编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物的表达载体pBioR Pol II的示意图。所述载体包含处于Sec-RNA序列(3)的上游的SV40启动子(1)和内含子序列(2)、以及下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。所述载体还包含处于融合蛋白序列(6)上游的β-肌动蛋白启动子(5)和下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。所述载体还包含抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图10显示了编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物的表达载体pBioR Pol III的示意图。所述载体包含处于Sec-RNA序列(3)的上游的hU6启动子上游(1)和内含子序列(2)、以及下游的Pol-III聚T终止子序列(4)。所述载体还包含处于融合蛋白序列(6)上游的β-肌动蛋白启动子(5)和下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。所述载体还包含抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图11显示了编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物的表达载体pBioR Pol III Combo的示意图。所述载体包含β-肌动蛋白启动子(1)、内含子序列(2)、融合蛋白盒(6)、Sec-RNA盒(3)(其具有处于所述融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图12显示了编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物的表达载体pBioR Pol III稳定型的示意图。所述载体包含CTS调节子(9)、PGK启动子(1)、抗嘌呤霉素基因(10)、鸡β-肌动蛋白启动子(5)、融合蛋白盒(6)、Sec-RNA盒(3)(其具有处于所述融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图13显示了编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物的表达载体pBioR Pol III Dicer的示意图。所述载体包含SV40启动子(1)、内含子序列(2)、shRNA序列(3)、hGH聚腺苷酸尾部序列(4)、鸡β-肌动蛋白启动子(5)、融合蛋白盒(6)、Sec-RNA盒(11)(其具有处于所述融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
图14A是显示产生生物反应器细胞并使用CPP-荧光素酶/CPP-碱性磷酸酶报告子体系测试其分泌活性的示例性转染测试的非限制性示意图。图14B表示经TAT介导的荧光素酶报告蛋白从CT26细胞的分泌的结果。CT26细胞由表达荧光素酶或CPP-荧光素酶融合蛋白的质粒转染。所测试的CCP域包括TAT、REV、FHV和穿透素(Pen)。48小时后，用PBS替换细胞培养基并将细胞在37℃额外温育1小时、3小时或6小时。收集PBS上清液并在TENT缓冲液中将细胞裂解。使用标准方法对相等量的溶剂化细胞蛋白和PBS上清液进行荧光素酶活性测定。细胞组分和上清液组分中呈现的相对荧光素酶活性作为在两个组分中观察到的总荧光素酶活性的百分比显示。
图15A和15B显示了用于构建表达分泌的RNA和生物反应器融合蛋白的质粒的示意图。如图15A所示，pE3.1 Sec-报告子包含CMV启动子序列(1)、内含子序列(2)、分泌的RNA报告子编码序列(Box B盒序列和胰高血糖素样肽1)(3)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。如图15B所示，pE1 TAT-RBD包含SV40启动子序列(1)、内含子序列(2)、融合蛋白编码序列(即RNA结合域(RBD)和细胞穿透肽(TAT))(6)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。图15C-15E显示对pE3.1Sec-报告子和pE1 TAT-RBD质粒的限制酶分析。图15C显示对pE3.1Sec-报告子的限制酶分析，其中在新型EcoNI限制位点引入有RNA表达插入物。图15E和15E分别显示两种pE1 TAT-RBD质粒的限制酶分析和PCR分析：一种表达其中TAT细胞穿透肽与蛋白N RNA结合域(TAT+)融合的融合蛋白，另一种表达其中TAT细胞穿透肽与RevRNA结合域(TAT-)融合的融合蛋白。在这些图中，(M)指示尺寸标记物泳道。在图15C中，Sec-报告子(-)是指仅有pE3.1 Sec-报告子质粒，而Sec-报告子(+)是指pE3.1 Sec-报告子质粒与RNA表达插入物。在图15D和15E中，p1.1是指仅有pE1.1质粒，而TAT(-)是指pE1.1质粒和融合蛋白插入物(包含与Rev RNA结合域融合的TAT细胞穿透肽)，且TAT(+)是指pE1.1质粒和融合蛋白插入物(包含与蛋白N RNA结合域融合的TAT细胞穿透肽)。
图16A和16B显示分泌的RNA的表达产物和生物融合蛋白。对于图16A所示的分泌的RNA报告转录物分析，CT26细胞以pE3.1 Sec-报告子(图15A)进行转染。48小时后，从未经处理的对照细胞和经转染的细胞收集总细胞RNA，并使用RT-PCR扩增经纯化的RNA并在3％低熔点琼脂糖凝胶(1X TAE)上分离。未经转染的对照细胞(“U”)仅显示出18S rRNA内部对照(18S)，而经转染的对照细胞显示出18S rRNA产物和亲本报告子RNA产物(“R”)(对应于仅有质粒)，或显示出分泌的报告子RNA产物(“SR”)(对应于质粒和Sec-RNA序列插入物)。图16B显示出融合蛋白表达分析，其中CT26细胞用表达生物反应器融合蛋白的质粒转染。48小时后，将来自未经转染细胞和用pE3.1 Sec-报告子转染的细胞的细胞裂解物，且在PVDF膜上观察到pE1.1 TAT+(与蛋白N RNA结合域和6X组氨酸表位标记融合的TAT)或pE2.1TAT+(TAT fused to a与蛋白N RNA结合域和6X组氨酸表位标记融合的TAT)以及用于对抗体进行印迹的阳性对照蛋白。将印迹物用发色底物显影并用图像记录中心记录。“His+”显示阳性对照结果，而“Unt”显示未经转染的CT26细胞的结果。将印迹物用发色底物显影并用图像记录中心记录。“His+”显示从纯化的组氨酸标记蛋白(阳性对照)获得的发色信号；“Unt”显示用收集自未经转染的CHO细胞的蛋白裂解物的背景信号；pE1.1 TAT+显示采用收集自以pE1.1 TAT–蛋白N–6XHis转染的CHO细胞的蛋白裂解物获得的信号；且pE2.1 TAT+显示采用从以pE2.1 TAT–蛋白N–6XHis转染的CHO细胞收集的蛋白裂解物获得的信号。
图17A和17B显示使用图15A和15B所述的两种组分质粒的生物反应器活性。收集来自未经转染的CT26细胞和用pE3.1 Sec-报告子和pE1TAT-RBD质粒(表达分泌的RNA和生物反应器融合蛋白)，并将其用作RT-PCR扩增反应的模板。RNA还采集自经纯化并扩增的细胞培养基。扩增产物与DNA尺寸标志物一同在3％低熔点琼脂糖凝胶(1XTAE)上分离。图17A和17B显示了采用pE3.1 Sec-报道子以及pE1.1TAT(+)(与正确RBD融合的TAT)或pE1.1 TAT(-)(与阴性对照RBD融合的TAT)的转染测试的结果。图17A的作图显示对采集自用亲本报告子质粒(“R”)转染的细胞的细胞裂解物的RT-PCR产物，所述报告子质粒含有sec-RNA序列插入物(“SR”)，sec-RNA报告子质粒与pE1.1TAT(+)(“TAT(+)”；与蛋白N RNA结合域融合的TAT)或与pE1.1TAT(-)(“TAT(-)”；与充当阴性对照RBD的Rev RNA结合域融合的TAT)共转染。图17A的右侧显示了来自用sec-RNA报告子质粒和pE1.1TAT(+)(“TAT(+)”；与蛋白N RNA结合域融合的TAT)或pE1.1 TAT(-)(“TAT(-)”；与Rev RNA结合域融合的TAT)共转染的细胞的细胞裂解物(“C”)和保外培养基样品(“M”)。图17B显示了与第一测试完全相同的第二测试的结果，其中采取了消除在第一次实验中观察到的18SrRNA的培养基感染的步骤。
图18是显示示例性转染测试的非限制性示意图，所述示例性转染测试是为产生并用GFP报告子体系测试生物反应器细胞的输入活性。
图19A是显示由本发明的生物反应器细胞生成的靶向制瘤素M的适体的分泌和活性的使用图。图19B是显示确定生物反应器细胞的分泌活性的示例性转染测试的非限制性示意图，其使用报告子体系和靶向制瘤素M蛋白(gp130受体介导的信号转导途径的激活子)的分泌的RNA适体。
图20A是显示由本发明的生物反应器细胞产生的靶向HER3的适体的分泌和活性的示意图。图20B是显示确定生物反应器细胞的分泌活性的示例性转染测试的非限制性示意图，其使用报告子体系和靶向HER3的分泌的RNA适体。
图21是显示确定生物反应器细胞的分泌活性和随后向靶细胞的细胞质中输送抑制性shRNA的示例性转染测试的非限制性示意图。
图22是显示产生包含生物活性抑制性RNA分子的病毒包装细胞所需的两种构建体的非限制性示意图。
图23是显示包含病毒颗粒和生物活性RNA分子的病毒包装细胞的生产的非限制性示意图。所述示意图还例示了生物活性RNA分子向靶细胞的转移。
图24是显示包含病毒颗粒、生物反应器融合蛋白和生物活性RNA分子的病毒包装细胞的生产的非限制性示意图。所述示意图还例示了生物反应器表达盒经由病毒颗粒向原生靶细胞(继生生物反应器细胞)的转移和随后的生物活性RNA分子向第二靶细胞的转移。
图25A和图25B显示使用图15A和15B所述的两种组分质粒的生物反应器活性。收集来自未经转染的CHO细胞和用pE3.1 Sec-报告子和Pe1.1NCS-RBD质粒(表达分泌的RNA和生物反应器融合蛋白)，并将其用作RT-PCR扩增反应的模板。还从细胞培养介质收集RNA，并经纯化和扩增。扩增产物与DNA尺寸标志物一同在3％低熔点琼脂糖凝胶(1X TAE)上分离。图25A和图25B显示了采用pE3.1Sec-报告子以及与RBD融合的pE1.1半乳糖凝集素-1(分泌充分)或单独的pE3.1Sec-报告子(分泌不足)的转染结果。图25A显示了培养后0、4、和8小时收集的细胞溶解产物和培养介质的RT-PCR产物与用含有Sec-RNA序列插入物(“SecRNA”)的报道子质粒和用与蛋白N RNA结合域融合的pE1.1半乳糖凝集素-1共转染的细胞的变化。图25B显示了培养后0、4、8小时收集的细胞裂解物“C”和培养介质“M”的RT-PCR产物与作为阴性对照的仅用包含所述Sec-RNA序列插入物(“SecRNA”)的报道子质粒进行转染的细胞的变化。
图26A和图26B使用图11中的一种组分质粒来显示生物反应器活性。在图26A中，来自或者用pE1.1FGF1-蛋白N/OSM适体质粒(阴性对照)转染或者用表达分泌RNA适体和生物反应器融合蛋白的pE1.1半乳糖凝集素-蛋白N/OSM适体质粒转染的HeLa细胞的RNA用Qiagen’s RNEasy试剂盒进行收集并纯化。还从细胞培养介质中收集RNA并纯化，并与来自细胞溶解产物的RNA用作在cDNA合成中的模板，以备随后的qPCR分析。或者对分泌RNA适体或者对18SrRNA(内参照)具有特异性的引物和探针被用于量化生物反应器细胞每次施放量，其为生物反应器融合蛋白的函数。在图26B中，采用针对收集的介质和细胞分解产物中LDH活性的商业测试法评估细胞溶解。结果显示至少从针对所有测试的3次独立试验中获得的平均数和标准偏差。
图27A、27B和图27C显示使用在图11中描述的一种组分质粒进行的制瘤素M信号途径的生物反应器介导的抑制。在图27A中，用OSM/STAT反应性荧光素酶报告子稳定转染的HeLa细胞用pE1.1FGF1-蛋白N/OSM适体质粒(阴性对照)、pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/OSM适体质粒或Pe1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/HER3适体质粒暂时地转染，其中每个都表达所述分泌的RNA适体和所述生物反应器融合蛋白。在转然后48小时以5或40ng/ml的最终浓度将重组OSM蛋白加入到每个转染培养介质中，并于37℃温育5小时。随后，在TENT缓冲液(添加了蛋白酶抑制剂混合物)中收集细胞并被涡流裂解。细胞的碎片通过离心过滤(15分钟16,000x g)被清除掉并通过标准的方法来收集和分析上清液来检测荧光素酶活性。图27B显示荧光素酶活性作为OSM浓度的函数，和图27C显示荧光素酶活性作为活化时间的函数。所有结果显示从至少3次独立试验获得的平均值和标准偏差。
图28A和28B显示用实施例26中描述的稳定的细胞进行的制瘤素M信号途径的生物反应器介导的抑制。在图28A中，CHO细胞和用pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/OSM适体质粒稳定地转染的CHO细胞，和用OSM/STAT反应性荧光素酶报告子稳定地转染的HeLa细胞共同植板(co-plated)。稳定的生物反应器细胞和OSM反应性靶细胞共同用最终浓度为5ng/mL的重组OSM蛋白进行处理。细胞在37℃温育5小时，然后在TENT缓冲液(添加了蛋白酶抑制剂混合物)中收集并被涡流裂解。细胞的碎片通过离心过滤(15分钟16,000x g)被清除掉并通过标准的方法收集和分析上清液来检测荧光素酶活性。图28B显示在共同植板之后作为时间的函数的制瘤素M信号的抑制。
图29A、29B、29C和29D显示用图11中描述的一种组分质粒进行的在图20中阐明的MCF7乳腺癌细胞生长的生物反应器介导的抑制。用pE1.1TAT-Rev/HER3适体质粒(阴性对照)、Pe1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/HER适体质粒或pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/OSM适体质粒暂时转染的HeLa细胞，其中每一个都表达所述的分泌RNA适体和所述的生物反应器融合蛋白。转染细胞在标准的生长培养基中(DMEM+10％血清)或者添加了100mM乳糖的生长培养基中培养24小时。24小时之后，所述条件生长培养基被转移到稳定地表达GFP的MCF7细胞培养物。根据图29A中显示的时间表，在5天生长期中每天进行培养基的更换。用荧光显微镜完成生长抑制的初步表征，用来自阴性对照生物反应器细胞和活性反应器细胞的培养基或培养基+乳糖处理的细胞的代表性帧图在图29B中示出。细胞随后在TENT缓冲液(添加了蛋白酶抑制剂混合物)中被收集并被涡流裂解。细胞的碎片通过离心过滤(15分钟16,000x g)被清除掉并且收集上清液检测GFP衍生荧光信号。图29C显示了比较TRevH/HER3适体质粒和半乳糖凝集素-1-蛋白N/HER3适体质粒的一次实验中的荧光信号。图29D显示添加半乳糖凝集素-1-蛋白N/OSM适体质粒作为额外对照的第二次实验的荧光信号。所有结果显示至少从3个独立的试验中获得的平均值和标准偏差。
图30是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是靶向特定的胞外间隙蛋白的适体。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含识别RNA序列和靶向特定胞外间隙蛋白的适体的核酸分子和包含RNA结合域RBD和外排体蛋白域的融合蛋白。融合蛋白在细胞质中得到翻译，其中经翻译的融合蛋白的RNA结合域与核酸的识别RNA序列结合，从而形成RNA-蛋白复合物。RNA-蛋白复合物被吸收到外排体，随后被分泌到胞外间隙。外排体的内容物包括适体，被释放到胞外间隙，随后在胞外间隙外排体便可以自由地作用于胞外目标。除了其他以外，所述胞外目标可以是细胞表面受体配体，借助适体与配体相结合并阻止其与其受体相结合(未显示)。或者，所述分泌的适体可以通过显示在分泌的RNA分子(未显示)上的可选的输送适体被输送到靶细胞内部。
图31是举例说明基于载体的生物活性RNA分子输送的体内作用机制的非限制性示意图，例示的生物活性RNA分子是靶向特定的胞外间隙蛋白的适体。如图所示，表达载体(pBioR)表达包含靶向特定胞外间隙蛋白的适体的核酸分子和两种融合蛋白，第一种包含RNA结合域、蛋白结合域和RNA解旋酶蛋白域，第二种包含互补蛋白结合域和膜通道蛋白域。融合蛋白在细胞质中得到翻译，于此翻译的融合蛋白组装成功能性复合物并且与此同时膜通道复合物自发地插入到膜内。RNA解旋酶复合物随后通过互补的蛋白结合域与通道复合物联合到一起形成功能性分泌复合物。RNA结合域吸纳分泌的RNA分子到分泌复合物，其在ATP依赖性过程中驱动RNA分泌。所述分泌的RNA适体可以自由地作用于胞外目标。除了其他以外，胞外目标可以是细胞表面受体的配体，借助适体结合与配体相结合并阻止其与其受体相结合(未显示)。或者，所述分泌的适体可以通过显示在分泌的RNA分子(未显示)上的可选的输送适体被输送到靶细胞内部。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“生物活性RNA”意指调节靶向的基因产物的基因表达或基因活性的任何RNA序列。所述生物活性RNA还可以是与靶分子相互作用的RNA适体。
如本文所用，术语“识别RNA序列”意指被包含RNA结合域的肽特异性结合的任何RNA序列。
如本文所用，术语“RNA结合域”意指与对应的识别RNA序列特异性结合的任何蛋白或肽序列。
如本文所用，术语“转运肽”意指有助于一个或多个细胞内附着的承载物的移动(包括帮助承载物移动穿过细胞的细胞膜、从细胞分泌承载物和将承载物从内体释放以及其它的细胞移动方式)的任何肽序列。具体而言但作为非限制性实例的是，所述转运肽可以是源自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌序列、内体释放域、受体结合域和促融合肽的序列。
如本文所用，术语“细胞穿透肽”意指有助于任何附着的承载物穿过脂双层(如细胞膜)的移动的任何肽序列。
如本文所用，术语“病毒类、原核类或真核类非经典分泌序列”意指使得任何附着的承载物经由ER-高尔基体独立途径从细胞分泌的任何蛋白或肽序列。
如本文所用，术语“内体释放域”意指有助于任何附着的承载物从细胞的内体释放的任何肽序列。
如本文所用，术语“受体结合域”意指能够与表面结合细胞受体相互作用的任何RNA或蛋白域。
如本文所用，术语“促融合肽”意指有助于承载物离开细胞的内体的任何肽序列。
如本文所用，术语“sec-RNA”意指本发明的RNA-蛋白复合物的RNA部分。通常，“sec-RNA”包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件。当与本发明的融合蛋白复合时，所述sec-RNA从细胞分泌。
如本文所用，术语“sec-shRNA”意指本发明的RNA-蛋白复合物的shRNA部分。通常，“sec-shRNA”包含一种或多种短发夹RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件。当与本发明的融合蛋白复合时，所述sec-shRNA从细胞分泌。
如本文所用，术语“融合蛋白”意指可操作性连接的至少两个多肽，其通常来自不同的来源。就多肽而言，术语可操作性连接意指两个多肽以每个多肽能够起到其预期功能的方式相连接。通常，两个多肽通过肽键共价连接。融合蛋白可以通过标准重组DNA技术制备。例如，将编码第一多肽的DNA分子与编码第二多肽的另一个DNA分子联接，并在宿主细胞中表达所得杂交DNA分子，从而制备融合蛋白。DNA分子以5’至3’的方向彼此联接，从而在联接后所编码多肽的翻译框架未被改变(即，所述DNA分子彼此在框架内联接)。在一个具体实例中，融合蛋白是指包含RNA结合域序列和一种或多种转运肽序列的肽。
如本文所用，术语“生物反应器辅助蛋白”意指能促进RNA-蛋白复合物分泌的任何内源性细胞蛋白。例如，生物反应器辅助蛋白可以通过促进复合物分泌的方式来与RNA-蛋白复合物相互作用。
如本文所用，术语“生物反应器细胞”或“生物反应器”意指产生并分泌Sec-RNA分子的任何细胞。
如本文所用，术语“pBioR质粒”意指包含编码至少一个RNA结合域序列、转运肽序列的聚核苷酸以及编码生物活性RNA和识别RNA序列的聚核苷酸的任何质粒。
如本文所用，术语“表达盒”意指能够导向特定核苷酸序列的表达的核酸序列，其可包括与所关注核苷酸序列可操作性连接的启动子，所关注核苷酸序列可与终止信号可操作性连接。其还可包含正确翻译所述核苷酸序列所需的序列。编码区可以对所关注的肽编码，也可对所关注的生物活性RNA编码。包含所关注核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的。表达盒还可以是天然存在但已经以可用于异源性表达的重组形式获得的表达盒。在一个具体实例中，表达盒包含含有启动子序列、编码肽序列的聚核苷酸或编码RNA序列和终止序列的聚核苷酸的核酸序列。
本文所用术语“可操作性连接”是指侧翼序列的排列方式，其中所述侧翼序列经设置或组装以便执行其通常功能。与编码序列可操作性连接的侧翼序列可能实现编码序列的复制、转录和/或翻译。例如，编码序列与启动子可操作性连接，此时启动子能够引导该编码序列的转录。侧翼序列不必与编码序列连续，只要其能正常发挥功能即可，因此，例如，间隔的未经翻译但经转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间，并且该启动子序列仍可被认为与该编码序列“可操作性连接”。
基于载体的输送体系的作用机制
本发明提供了基于载体的RNA输送体系，其中质粒将转染的细胞转化为能够产生并分泌生物活性RNA分子的RNA生物反应器。所述质粒通过编码生物活性RNA分子和融合蛋白来实现这一点，所述融合蛋白有助于其从生物反应器分泌并输送至胞外间隙和/或相邻靶细胞。一旦被输送至靶细胞，生物活性RNA分子在任何细胞中发挥其应有功能。该方法直接解决了在基于质粒的RNAi介导疗法的应用中的关键问题，即与质粒输送有关的低转染效率。虽然生物反应器细胞的初始转染可能因为与标准基因输送方法相关的技术难题而受限，但本发明的基于质粒的输送体系的后续表达将减轻传统的限制，因为其使得能够进行持续并且连续的从生物反应器细胞进行的活性RNA和相关蛋白的输送。通过生物活性RNA的生物反应器细胞细胞生产和向胞外间隙即包含细胞膜外的任何间隙比如胞外间隙、所述间隙包含周围的细胞和靶细胞以及周围的培养基、组织和培养介质中的扩散，从而可放大RNA介导的敲弱。
基于质粒的输送体系的中心组分是促进分泌和/或输送的融合蛋白。通过ER-高尔基体的经典蛋白分子输出是共翻译性的，意思是蛋白在其产生时被转运穿过ER膜。这避免了在生物反应器细胞中使用经典输送机制，因为RNA结合域仅短暂地与Sec-RNA分子存在于细胞质中，且穿过膜的运送有可能破坏RNA-蛋白相互作用。与之不同的是，可以将细胞质中经完全翻译和折叠的蛋白随后通过病毒类、原核类或真核类非经典机制与紧随其后的生物活性RNA承载物一同分泌。现在已知越来越多的蛋白经由独立于ER-高尔基体的病毒类、原核类或真核类非经典途径分泌。虽然这些体系的确切输出机制尚未得到完全表征，已知这些蛋白在细胞质中被翻译并因此含有使其能够被分泌的序列基序并适用于生物反应器中。
生物反应器细胞功能中的早期步骤是合成RNA-蛋白复合物的RNA和蛋白组分并将这些组分定位至细胞质。启动子驱动的RNA分子转录通过认可已久的机理进行，并且可以针对用作生物反应器的细胞类型进行优化。编码融合蛋白的转录物的输出遵循经由核孔复合体(nuclear pore complex)的典型Pol-II mRNA途径。替代性地，可以将Sec-RNA分子构建来使得其经由由微小RNA和shRNA利用的输出蛋白-5途径而输出。另外，替代性地，RNA分子可以包含腺病毒VA1小螺旋域以有助于将Sec-RNA从核输出。还可以从Pol-II启动子表达Sec-RNA够简体并用hGH聚腺苷酸化信号终止，从而可以将Sec-RNA封端并经由核孔复合体从核输出。在另一个实施方式中，所述Sec-RNA或Sec-shRNA可以包含一种组成型转运元件。
一旦共同定位于细胞质中，生物活性RNA和融合蛋白必须会合而形成RNA-蛋白复合物。该结合事件涉及提供均匀的稳定组合物群体的特异性的高亲和力相互作用，这通过将处于融合蛋白中的高亲和力RNA结合域和处于包含生物活性RNA分子的核酸中的对应序列特异性识别位点包含在内而实现。RNA结合域和RNA识别序列在生物反应器细胞的细胞质中相互作用并将生物活性RNA序列与分泌和输送至靶细胞的蛋白机件体相偶联。该相互作用的特异性使得生物反应器细胞的其它内源性RNA的分泌最小化，并且所述高亲和力有助于将所述复合物维持在胞外空间。
RNA-蛋白复合物
如上所讨论，本发明提供了基于载体的RNA输送体系，其中质粒将转染的细胞转化为能够产生并分泌生物活性RNA分子的RNA生物反应器。生物反应器质粒有能力编码和分配与输送融合蛋白的识别序列相连的任何生物活性RNA分子。因此，本发明的表达载体包含编码核酸的聚核苷酸序列和/或编码多肽的聚核苷酸序列，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA序列、RNA识别序列和可选的末端小螺旋序列，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列。所述生物活性RNA分子可以根据与其相互作用的细胞组分而通过许多不同的机制来发挥生物作用。大多数生物活性RNA通过与特定的mRNA转录物的碱基配对相互作用而发挥功能，所述mRNA转录物导致mRNA分子的翻译沉默或降解。两种相关的抑制性RNA类别是反义RNA分子和小抑制RNA分子。翻译RNA通常是mRNA转录物的直接补体，其通过给翻译机制造成障碍并还通过将该转录物靶向用于由细胞核酸酶降解来靶向和发挥功能。小抑制RNA(siRNA)分子通过后转录基因沉默(PTGS)途径或通过RNA干扰(RNAi)途径起作用。这些RNA的长度为约22个核苷酸并且与特定的细胞蛋白结合以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。这些小RNA还与其mRNA靶标内的序列互补，并且这些复合物的结合导致转录物的翻译沉默或降解。
能调节基因表达的两种额外RNA分子类别是催化性RNA核酶和RNA适体。核酶是催化RNA底物上的化学反应(大多数为磷酸二酯主链的水解)的基于RNA的酶。催化活性位点的形成要求核酶与RNA底物之间的碱基配对，因此也可通过提供适当的引导序列来将核酶活性靶向所需底物。当靶向mRNA转录物时，核酶具有降解那些转录物并导致相关蛋白的下调的潜力。RNA适体通常选自随机RNA序列的库，根据其与靶分子(通常是蛋白分子)相互作用的能力来进行选择。工程化RNA适体没有那么直接，因为结合不是受碱基配对相互作用的限制，但一旦发现有效序列，则结合的特异性和亲和力都能匹敌抗体-抗原相互作用。RNA适体还具有更大的靶分子范围和通过许多不同机制改变基因活性的潜力。这包括对靶分子的生物化学的直接抑制，而无需降解蛋白或产生该蛋白的mRNA转录物。
在本发明的某些实施方式中，RNA-蛋白复合物的一种或多种生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物以及它们的任意组合。在一个实施方式中，生物活性RNA序列的一种或多种是短发夹RNA(shRNA)。在另一个实施方式中，生物活性RNA序列的一种或多种是适体。对于作为编码一种或多种生物活性肽的转录物的生物活性RNA而言，示例性肽包括选自由肿瘤抑制基因编码的肽、促凋亡因子和癌系统的胞内抗体(intrabody)或者恢复因功能丧失或缺失突变造成的疾病系统中的基因功能的蛋白的那些肽。核酸分子的生物活性RNA序列可以针对任何所关注的靶基因。例如，生物活性RNA可以针对见于任何可公开获取的基因序列数据库的任何基因，包括例如见于美国国家生物技术信息中心(NCBI)的任何数据库。在一个具体实施方式中，生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在另一个具体实施方式中，生物活性RNA是适体。合适的shRNA序列的非限制性实例包括Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、窖蛋白-1(Cav-1)、表皮生长因子受体(EGFR)、Harvey-逆转录病毒相关DNA序列(H-Ras)、B-细胞CCL/淋巴瘤2(Bcl-2)、存活素、粘着斑激酶(FAK)信号转导物和转录激活物3(STAT-3)、人表皮生长因子受体3(HER-3)、β-联蛋白和Src shRNA序列以及其它的本文所述或本领域已知的shRNA序列。表I提供了非限制性示例性生物活性RNA序列的核苷酸序列。在某些实施方式中，生物活性RNA序列包含选自SEQ IDNO:1～15的一种或多种序列。
包含生物活性RNA序列的核酸额外包含识别RNA序列，其序列受位于本发明的融合蛋白中的RNA结合域的识别并与其特异性结合。识别RNA序列(在RNA序列中)和RNA结合域(在蛋白序列中)之间的特异性的高亲和力相互作用的许多实例是本领域中已知和已有描述的。本发明的识别RNA序列可以是本领域中所述已知会与多肽的RNA结合域结合的任何RNA序列。在一个实施方式中，识别RNA序列的长度为至少约10个核苷酸。在一个实施方式中，识别RNA序列为至少约10个核苷酸至250个核苷酸。在某些具体实施方式中，识别RNA序列例如为约10～15个核苷酸、约16～20个核苷酸、约21～25个核苷酸、约26～30个核苷酸、约31～35个核苷酸、约36～40个核苷酸、约41～45个核苷酸、约46～50个核苷酸、约51～75个核苷酸、约76～100个核苷酸、约101～125个核苷酸、约126～150个核苷酸、约151～175个核苷酸、约176～200个核苷酸或约201～250个核苷酸。在一个实施方式中，识别RNA序列的解离常数(Kd)为至少约100nM。在一个具体实施方式中，该解离常数为约100nM～约1pM。识别RNA序列(在RNA序列中)和RNA结合域(在蛋白序列中)之间的特异性的高亲和力相互作用的非限制性实例包括：U1环序列与U1A序列、II组内含子序列的结构域I或结构域IV与CRS1序列、NRE茎环序列与核仁素序列、S1A茎环序列与hRBMY序列、噬菌体BoxBR序列与噬菌体蛋白N,HIV Rev响应元件与HIV Rev蛋白、苜蓿花叶病毒外壳蛋白识别序列(AMVCP)与AMVCP蛋白、以及ARE茎环序列与tristetrapolin序列等等。在某些具体实施方式中，核酸的识别RNA序列包含选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、苜蓿花叶病毒外壳蛋白识别序列(AMVCP)和ARE序列的序列。表II提供了非限制性示例性识别RNA序列的核苷酸序列。在某些具体实施方式中，识别RNA序列包含SEQ ID NO:16～23的任一个的序列。
在某些实施方式中，核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和末端小螺旋序列。末端小螺旋序列是将RNA分子的5’和3’端退火的约17个核苷酸的短序列。据显示，该序列可促进源自Pol-III启动子的RNA分子的细胞核输出并且可以帮助驱动生物反应器细胞中的RNA-融合蛋白复合物的形成。合适的末端小螺旋序列的实例如本文所述或本领域中已知。在一个实施方式中，末端小螺旋序列的长度为至少约17个核苷酸。在一个具体实施方式中，末端小螺旋序列的长度为约10个核苷酸～100个核苷酸。在一个实施方式中，末端小螺旋序列来自腺病毒VA1 RNA分子。
另外，本发明的表达载体可以包含编码多肽的一种或多种聚核苷酸序列，所述聚核苷酸序列包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。这些实施方式中没有任何一个序列含有RNA识别序列。在一种或多种生物活性RNA序列是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)时，此类多肽是有用的。
在某一具体实施方式中，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和组成型转运元件(CTE)。在此描述了合适的CTE序列的例子，以及被本领域技术人员所熟知的其他例子。在一个具体实施方式中，所述CTE序列的长度大约为10核苷酸到35核苷酸。在一个实施方式中，所述CTE序列选自梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、鸟类白血病病毒(ALV)或猴逆转录病毒(SRV)(见表XI)。在一个特别的具体实施方式中，所述CTE选自梅森-菲舍(Mason-Pfizer)猴病毒，其提供位于所述病毒RNA的3’端的169个核苷酸长度的RNA序列(表XI)，促进含有内含子的RNA分子从细胞核向细胞质输出。在瓜蟾蜍卵母细胞上进行RNA剪接和输出试验，显示所述序列还能通过细胞因子促进经处理的内含子套索向细胞质的输出过程。包含该序列的内在的secRNA分子可促进向细胞质的输出并且帮助促进RNA-融合蛋白复合物在生物反应器细胞中的形成。在多个实施方式中，所述CTE包含表XI显示的所述序列的截短或变体，其与表XI显示的序列具有至少85％的同一性，例如至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的同一性。
在上述核酸分子的任一个中，所述核酸分子可以包含如下序列：在该序列中识别RNA序列、各个生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列在没有添加间隔序列或额外序列的情况下直接相连。替代性的，在上述核酸分子的任一个中，所述核酸分子可以包含如下序列：其中包含识别RNA序列、各个生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列的一种或多种序列在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。类似地，在上述核酸分子的任一个中，所述核酸分子可以包含如下序列：其中各个生物活性RNA序列自身在没有添加一种或多种间隔序列或额外序列的情况下直接相连，或在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。
生物反应器细胞分泌生物活性RNA分子和将其输送至相邻细胞的能力源自由pBioR质粒产生的RNA-蛋白复合物的性质。首先，融合蛋白(包含RNA结合域和可选的其它序列)与生物活性RNA(经由RNA识别序列)结合，并从生物反应器细胞分泌。在胞外间隙中，RNA-蛋白复合物保持无损足够长的时间以到达靶细胞。一旦处于靶细胞的表面，融合蛋白就辅助生物活性RNA输入至靶细胞的细胞质。
通过融合蛋白的RNA结合域与Sec-RNA的有效结合来优化RNA-蛋白复合物的分泌。为驱动融合蛋白-Sec-RNA复合物的形成，融合蛋白含有源自病毒或细菌的高亲和力RNA结合域。非天然高亲和力相互作用的利用提高了获得均与的稳定复合物群体的机会，并且受到最小的来自生物反应器细胞的内源性RNA分子的非特异性结合的竞争。
因此，在一个实施方式中，融合蛋白包含RNA结合域和一种或多种转运肽。所述新型融合蛋白的RNA结合域可以为能够识别对应的RNA识别基序的任何氨基酸序列。在一个实施方式中，RNA结合域为约25个氨基酸至约300个氨基酸。在某些具体实施方式中，RNA结合域为例如，25～48个氨基酸、约50～75个氨基酸、约76～100个氨基酸、约101～125个氨基酸、约126～150个氨基酸、约151～175个氨基酸、约176～200个氨基酸、约201～225个氨基酸、约226～250个氨基酸、约251～2750个氨基酸或约276～3000个氨基酸。融合多肽的RNA结合域可以为本领域已知和已有描述的任何RNA结合域。在某些具体实施方式中，融合多肽的RNA结合域包含选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列的氨基酸序列。RNA结合域序列的非限制性实例的氨基酸序列如表III所示。在某些具体实施方式中，RNA结合域包含选自SEQ ID NO:24～31的任一个的序列。
融合蛋白的另一个组分是促进RNA-蛋白复合物的分泌的结构域。遵循病毒类、原核类或真核类非经典分泌途径的蛋白缺乏导向经典输出机制的典型分泌信号，被排除于ER-高尔基体网络之外并能在存在抑制ER-高尔基体输送的药物存在时被分泌。已对病毒类、原核类或真核类非经典分泌途径提出了数种机理，包括膜起泡、囊泡和非囊泡式病毒类、原核类或真核类非经典输送、活性和被动膜输送子和膜翻转。来自进入分泌途径的独立于ER-高尔基体网络的那些蛋白的蛋白的肽序列可用于分泌本发明的生物活性RNA分子。另一组可用于促进RNA-蛋白复合物分泌的序列是细胞穿透肽。这些肽的确切进入机理尚未完全已知，但可能涉及内体途径，但一些数据表明是非内体机理。
融合多肽的转运肽可以是促进将核酸、肽、融合蛋白、RNA-蛋白复合物和/或其它生物分子输送至胞外间隙和/或相邻细胞和组织的任何氨基酸序列。转运肽的一个实例是辅助将Sec-RNA输入靶细胞的细胞穿透肽。在本领域中已知有许多细胞穿透肽，该肽序列能够穿过质膜。此类肽往往存在于转录因子中，例如同源域蛋白和病毒蛋白，如HIV-1的TAT。已通过实验确立了RNA-蛋白复合物经由细胞穿透肽向细胞质的输送。例如已有报道，以由U1A RNA结合域和TAT细胞穿透肽组成的纯化融合蛋白将siRNA输送至CHO细胞。另外的利用生物素-链霉亲和素连接的报道也显示出通过TAT肽成功输送各种承载物分子。虽然TAT介导的承载物分子向靶细胞的细胞质的输送似乎不需要额外的促融合肽来促进内体释放，将此类肽添加至TAT能提高输送效率。促融合肽作为输送体系的一部分的必要性可能依赖于融合蛋白中所用细胞穿透肽的性质。
因此，在一个实施方式中，输送蛋白是细胞穿透肽。通常，这些序列是多阳离子序列或两亲性序列，其富含具有带正电荷的侧基的氨基酸，即如组氨酸、赖氨酸和精氨酸等碱性氨基酸。细胞穿透肽的许多实例在本领域中已知和已有描述。合适的细胞穿透肽的非限制性实例包括源自存在于转录因子中的蛋白膜转导域的那些，例如同源域蛋白和病毒蛋白，如HIV-1的TAT。在一个实施方式中，细胞穿透肽为约10个氨基酸至约50个氨基酸，包括例如，约10～15个氨基酸、约16～20个氨基酸、约21～25个氨基酸、约26～30个氨基酸、约31～35个氨基酸、约36～40个氨基酸、约41～45个氨基酸和约46～50个氨基酸。在某些具体实施方式中，多肽的细胞穿透肽包含选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC氨基酸序列的氨基酸序列。细胞穿透肽序列的非限制性实例的氨基酸序列如表IV所示。在某些具体实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:32～40的任一个的序列。
转运肽的另一个实例是病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。病毒类、原核类或真核类非经典分泌域可以是引导肽和/或其它生物分子经由除经典蛋白分泌途径以外的其它途径来从细胞分泌的任何氨基酸序列。生物分子可以被分泌至胞外间隙和/或可以被输送至周围细胞和组织。病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的许多实例在本领域中已知和已有描述。在一个实施方式中，非经典分泌域为约50个氨基酸至约250个氨基酸。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域为例如，约50～75个氨基酸、约76～100个氨基酸、约101～125个氨基酸、约126～150个氨基酸、约151～175个氨基酸、约176～200个氨基酸、约201～225个氨基酸或约226～250个氨基酸。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域包含选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号氨基酸序列的氨基酸序列。病毒类、原核类或真核类非经典分泌域序列的非限制性实例如表V所示。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域包含选自SEQ ID NO:41～48的任一个的序列。
合适的转运肽的其它实例包括但不限于源自受体结合域、促融合肽和内体释放域的序列。在一个实施方式中，转运肽包含源自受体结合域的序列。受体结合域可以是与靶细胞膜的胞外侧上的表面受体复合物特异性结合的任何氨基酸序列。在某些具体实施方式中，受体结合域包含选自EGF蛋白、VEGF蛋白、血管归巢肽、gp30蛋白(或其它Erb B-2结合蛋白)或半乳糖凝集素-1蛋白(或其它CA125结合蛋白)的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，转运肽包含源自内体释放域的序列。内体释放域可以是促进RNA-蛋白复合物从靶细胞的内体腔室释放的任何氨基酸序列。在某些具体实施方式中，内体释放域包含选自来自流感病毒的血凝素蛋白、来自Semliki森林病毒的E1蛋白或多聚组氨酸基序的氨基酸序列。
在另一个实施方式中，转运肽包含源自促融合肽的序列。表VI提供了合适的促融合肽的非限制性实例。因此，在某些具体实施方式中，促融合肽包含选自SEQ ID NO:50～54的任一个的序列。
在上述的融合蛋白多肽的实施方式的任一个中，所述多肽可以包含其中各个结构域和肽在没有添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连的一个或多个序列。在另一个实施方式中，所述多肽可以包含其中各个结构域和肽在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连的一个或多个序列。
因此，在本发明的表达载体的某些具体实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。RNA结合域包含源自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、AMVCP和tristetrapolin氨基酸序列的氨基酸序列。转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域。合适的细胞穿透肽序列包括但不限于具有源自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC氨基酸序列的氨基酸的那些肽。合适的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域序列包括但不限于具有源自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号氨基酸序列的氨基酸序列的肽。合适的促融合肽序列包括但不限于具有源自来自流感病毒的HA、来自HIV的Gp41、蜂毒素、GALA和KALA的氨基酸序列的肽。
在RNA-蛋白复合物的本文所述实施方式中的任一个中，所述核酸分子可以包含如下的序列：在所述序列中识别RNA序列、各个生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列在没有添加一种或多种间隔序列或额外序列的情况下直接相连。替代性的，在上述RNA-蛋白复合物实施方式的任一个中，所述核酸分子可以包含如下的序列：在所述序列中识别RNA序列、各个生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在上述RNA-蛋白复合物实施方式的任一个中，所述核酸分子可以包含如下的序列：在所述序列中各个生物活性RNA序列自身在没有添加或者添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在上述RNA-蛋白复合物实施方式的任一个中，RNA-蛋白复合物的多肽部分可以包含其中各种结构域和肽的任何一个在没有添加或者添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。
所述RNA-蛋白复合物可包含其他细胞蛋白，其他细胞蛋白通过在生物反应器细胞的细胞质中或细胞膜上的RNA-蛋白复合物相互作用而起到辅助功能。当与其他细胞相比时，所述生物反应器辅助蛋白在某些特定的细胞种类中更加丰富，提供由细胞的背景调节的生物反应器活性。在这些例子中，生物反应器辅助蛋白的识别以及将这些蛋白加入到生物反应器表达系统中，或者充当生物反应器质粒的组成部分或者作为稳定细胞系，可为内部活性低的细胞提供增强的生物反应器活性。合适的生物反应器辅助蛋白可与选择的病毒类、原核类或真核类非经典分泌蛋白配对。这些配对可包含但不限于，所述CA125蛋白同半乳糖凝集素-1真核的非经典分泌蛋白、所述S100A13和Syt1(p40)蛋白同FGF1真核非经典分泌蛋白和所述S100A13蛋白同IL-1α真核的非经典分泌蛋白。
在进一步的实施方式中，所述表达载体包含第一可抑制的/可诱导的启动子序列、终止序列、和可选的一种或多种引物序列、第二可抑制的/可诱导的引物序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列的所述聚核苷酸与第一启动子序列和终止序列可操作性地连接，且其中编码RNA结合域序列和转运肽序列的聚核苷酸可与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。在某个具体实施方式中，所述可抑制/可诱导的启动子体系选自Tet-off四环素抑制体系、Tet-on四环素诱导体系、蜕化素诱导体系、米非司酮诱导体系、糖皮质激素(地塞米松)诱导体系、雷帕霉素诱导体系、大环内脂物(红霉素、克拉霉素、罗红霉素)抑制和诱导体系，并且在细胞系中所有的都可胜任特定的抑制或诱导。
在另一实施方式中，所述表达载体包含第一表达盒和第二表达盒，其中第一表达盒包含启动子序列、针对一种或多种靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别序列、输送RNA适体序列、可选的组成型转运元件(CTE)、可选的末端小螺旋序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述生物活性RNA序列、输送RNA适体序列、识别RNA序列、可选的组成型转运元件(CTE)和可选的末端小螺旋序列可与启动子序列和终止序列可操作性地连接。并且，第二表达盒包含启动子序列、RNA结合域序列、转运肽序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述RNA结合域序列和转运肽序列可与启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。
在进一步的实施方式中，所述表达载体还包含第三表达盒，其中第三表达盒包含一种或多种启动子序列，例如，可诱导或可抑制的启动子序列、编码一种或多种最优生物反应器活性所必需的生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中所述编码所述生物反应器辅助蛋白的聚核苷酸序列可与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。所述包含第三表达盒，且第三表达盒包含生物反应器辅助蛋白序列的载体可以与包含编码一种或多种细胞溶质生物反应器辅助蛋白和一种或多种膜结合生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的一种或多种表达载体同时使用。在进一步的实施方式中，所述包含编码一种或多种细胞溶质生物反应器辅助蛋白和一种或多种膜结合生物反应器辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体还可进一步包含一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列，其中所述编码细胞溶质生物反应器辅助蛋白和膜结合生物反应器辅助蛋白的聚核苷酸序列与一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性地连接。
外排体允许通过ER-Golgi独立机制分泌细胞成分，并潜在地能够支持生物反应器功能。具有能与分泌的RNA相互作用的RNA结合域的融合蛋白与细胞外排体蛋白相结合从而能允许将RNA通过外排体进行分泌。
还可以通过采用与膜孔复合物相耦合的RNA依赖性解旋酶的主动转运机制分泌RNA分子。在此情形下，所述RNA依赖性解旋酶向通过膜孔复合物并向胞外间隙输送分泌的RNA提供动力。可以通过使用蛋白-蛋白相互作用域建立解旋酶和膜孔复合物亚单元之间的相互作用，并且通过RNA-蛋白质相互作用域调节针对分泌的RNA的特异性，其中许多例子业内人士均已熟知。
表达载体
在一方面，本发明涉及包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列、识别RNA序列和组成型转运元件(CTE)。所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含RNA结合域序列和(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典分泌域序列中至少一个。
在另一方面，所述第一聚核苷酸和第二聚核苷酸中至少一个可以与可诱导启动子序列可操作性地连接。此外，所述第一聚核苷酸还编码第二生物活性RNA序列。所述第一生物活性RNA序列和第二生物活性RNA序列中至少有一个是适体。或者，所述第一生物活性RNA序列和第二生物活性RNA序列中至少一个可以调节靶基因产物的基因表达或基因活性。
在另一方面，本发明涉及包含第一、第二和第三聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列和识别RNA序列。所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含RNA结合域序列和(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典分泌域序列中至少一个。所述第三聚核苷酸编码促进RNA-多肽复合物从细胞中分泌的辅助蛋白。所述辅助蛋白可以是例如膜结合蛋白或细胞溶质蛋白。所述复合物包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和多肽。
在一方面，所述第一聚核苷酸可以与第一启动子序列可操作性地连接，以及第二聚核苷酸和第三聚核苷酸中至少一个可以与第二启动子序列可操作性地连接。在另一方面，第一启动子序列和第二启动子序列中至少一个是可诱导启动子序列。
在另一方面，本发明涉及包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体。所述第一聚核苷酸编码第一生物活性RNA序列和识别RNA序列。所述第二聚核苷酸编码RNA结合域序列和至少(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典型分泌域序列中的至少一个。所述第一聚核苷酸和第二聚核苷酸中至少有一个与可诱导启动子序列可操作性地连接。
本发明中的每一个载体都可以与一种或多种表达盒相联。在一个实施方式中，表达载体包含第一表达盒，该第一表达盒包含编码RNA分子的聚核苷酸序列，所述RNA分子包括一种或多种生物活性RNA序列、RNA结合域的识别RNA位点(Sec-RNA)和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件。表达载体还可包含第二表达盒，该第二表达盒包含编码融合蛋白的聚核苷酸序列，所述融合蛋白包含RNA结合域和一种或多种转运肽，其促进RNA-蛋白复合物的分泌和将生物活性RNA输送至胞外间隙或输送至靶细胞。在另一个实施方式中，表达载体额外包含第三表达盒,其中所述第三表达盒包含编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。必要时，表达载体可以额外包含第四表达盒，或者分开的表达载体可以包含含有如下聚核苷酸序列的表达盒，所述聚核苷酸序列编码一种或多种生物活性RNA、可选的识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件。在一个实施方式中，第四表达盒的一种或多种生物活性RNA序列针对某靶基因，该靶基因可能与由第一表达盒的生物活性RNA序列靶向的靶基因相同，也可能不同。在另一个实施方式中，第四表达盒的一种或多种生物活性RNA序列针对生物反应器细胞内的Dicer蛋白和/或Drosha蛋白。该表达盒不含用于RNA结合域的识别RNA序列，因此不从生物反应器细胞分泌。
在一个实施方式中，通过将Sec-RNA序列置于编码融合蛋白的RNA内的人工内含子内来将第一表达盒和第二表达盒合并。该载体提供了减少总质粒尺寸的优势，并且将所有生物反应器组分的转录置于单个启动子的控制下。在将表达载体施用至细胞后，可以将RNA-蛋白复合物作为单个RNA转录物或作为一种或多种RNA转录物而从载体表达。例如，RNA-蛋白复合物可以作为如下单个转录物从载体表达：所述单个转录物包含RNA-蛋白复合物的RNA部分(包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件)和RNA-蛋白复合物的蛋白部分(包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述转运肽序列选自例如，细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、促融合肽和受体结合域)。Sec-RNA在置于5’未翻译区(UTR)或融合蛋白的编码序列内的人工内含子内编码。施用合适的限制位点将Sec-RNA亚克隆于所述人工内含子的剪接供体和剪接受体位点之间。转录后，通过生物反应器细胞的内源性剪接构造物，Sec-RNA从编码融合蛋白的mRNA释放。分开的转录物被从细胞核输出至细胞质，在那里包含RNA结合域序列和可选的其它序列的转录物得到翻译。翻译的肽的RNA结合域与RNA的识别RNA序列相互作用，从而形成RNA-蛋白复合物。
在其它实施方式中，第一表达盒和第二表达盒以及可选的第三表达盒和第四表达盒额外包含选自以下序列的一种或多种序列：启动子序列、包含一个或多个限制酶位点的序列、引物序列、GC碱基对序列、起始密码子、翻译起始位点和终止序列。合适的启动子包括Pol II启动子，包括但不限于猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、泛素和PSA启动子。在另一个实施方式中，启动子是Pol III启动子。合适的Pol III启动子的非限制性实例包括但不限于人H1和人U6启动子。此外，可抑制/可诱导启动子体系选自Tet-off四环素抑制体系、Tet-on四环素诱导体系、蜕化素诱导体系、米非司酮诱导体系、糖皮质激素(地塞米松)诱导体系、雷帕霉素诱导体系、大环内脂物(红霉素、克拉霉素、罗红霉素)抑制和诱导体系，并且在细胞系中所有的都可胜任特定的抑制或诱导。
在另一个实施方式中，所述表达盒额外包含一种或多种终止序列。合适的终止序列的非限制性实例包括但不限于人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列、猴病毒40(SV40)大T聚腺苷酸化序列和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)聚腺苷酸化序列。在一个实施方式中，表达盒额外包含一种或多种引物序列，其可以包含限制酶位点、一种或多种启动子序列和一种或多种终止序列。
在上述表达载体实施方式的任一个中，所述聚核苷酸可以包含如下序列：在所述序列中任何的生物活性RNA序列、识别RNA序列、RNA结合域序列、转运肽序列、病毒多肽和任何其它的所包含序列(即，启动子、终止序列、引物等)在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连，或在没有添加间隔序列的情况下直接相连。在上述实施方式的任一种中，表达载体可以包含编码如下多肽的聚核苷酸：在所述多肽中各个结构域和肽的序列在没有添加或添加有一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下相连。
在其它实施方式中，表达载体额外包含一种或多种多克隆位点序列。此外，表达载体可以额外包含一种或多种抗药性基因序列。合适的抗药性基因包括但不限于抵抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素的基因，以及任何其它在本领域中已知和已有描述的抗药性基因。表达载体可以额外包含pUC复制起点。
使用合适的前向和反向引物，通过对相关序列的PCR扩增，分别从cDNA克隆物或RNA表达质粒制备生物反应器质粒的蛋白或RNA组分的表达盒。引物包含与所关注的结构域或生物活性RNA序列互补的序列、用于亚克隆的限制酶位点，以及处在每个引物的5’端的有助于被限制酶消化的约6个GC碱基对。识别RNA序列被添加至对应于生物活性RNA序列的5’端的引物，以便产生Sec-RNA表达构建体。该表达构建体被合适的限制酶消化以便亚克隆至pEGEN4.1构建体中，该pEGEN4.1构建体将Sec-RNA表达盒置于人U6启动子序列的下游处和Pol III聚T终止序列的上游处。替代性的，Sec-RNA可以被亚克隆至pEGEN3.1中，pEGEN3.1将RNA表达置于CMV Pol-II启动子的控制之下并且由人GH聚腺苷酸化信号终止。
数种示例性表达载体如图5-13所示。一个示例性表达载体是图5所示的pEGEN 1.1。如图所示，pEGEN 1.1包含SV40启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段通过PCR使用包含用于亚克隆至多克隆序列内的限制位点的引物来制备。PCR产物和pEGEN1.1质粒由合适的限制酶消化并在联接前纯化。Sec-RNA分子或编码融合蛋白的mRNA从具有人工内含子和聚腺苷酸尾部序列的SV40启动子序列转录。
另一个示例性表达载体是图6所示的pEGEN 2.1。如图所示，pEGEN 2.1包含鸡β-肌动蛋白启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段通过PCR使用包含用于亚克隆至多克隆序列内的限制位点的引物来制备。PCR产物和pEGEN2.1质粒由合适的限制酶消化并在联接前纯化。Sec-RNA分子或编码融合蛋白的mRNA从具有人工内含子和聚腺苷酸尾部序列的鸡β-肌动蛋白启动子序列转录。
另一个示例性表达载体是图7所示的pEGEN 3.1。如图所示，pEGEN 3.1包含CMV启动子序列(1)、内含子序列(2)、多克隆序列(MCS)、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段通过PCR使用包含用于亚克隆至多克隆序列内的限制位点的引物来制备。PCR产物和pEGEN3.1质粒由合适的限制酶消化并在联接前纯化。Sec-RNA分子或编码融合蛋白的mRNA从具有人工内含子和聚腺苷酸尾部序列的CMV启动子序列转录。
另一个示例性表达载体是图8所示的pEGEN 4.1。如图所示，pEGEN 4.1包含人U6启动子序列(1)、多克隆序列(MCS)、聚T终止子序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段通过PCR使用包含用于亚克隆至多克隆序列内的限制位点的引物来制备。PCR产物和pEGEN4.1质粒由合适的限制酶消化并在联接前纯化。Sec-RNA分子从U6启动子序列转录并以聚T终止子序列终止。
另一个示例性表达载体是pBioR Pol II(图9所示)，其编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物。所述载体包含处于Sec-RNA序列(3)上游的SV40启动子(1)和处于下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。该载体还包含处于融合蛋白序列(6)上游的β-肌动蛋白启动子(5)和处于下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。该载体还包含抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
另一个示例性表达载体是图10所示的pBioR Pol III，其编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物。所述载体包含处于Sec-RNA序列(3)上游的hU6启动子(1)和处于下游的Pol-III聚T终止子序列(4)。该载体还包含处于融合蛋白序列(6)上游的β-肌动蛋白启动子(5)和处于下游的hGH聚腺苷酸序列(4)。该载体还包含抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。
另一个示例性表达载体是图11所示的pBioR Pol II组合型，其编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物。所述载体包含β-肌动蛋白启动子(1)、内含子序列(2)、融合蛋白(6)、Sec-RNA(3)(其具有处于融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。在该表达载体中，Sec-RNA被编码在置于编码融合蛋白的mRNA序列内的人工内含子内。通过PCR制备编码Sec-RNA分子或融合蛋白的DNA片段。编码Sec-RNA分子的DNA片段用下述引物制备：该引物包含剪接供体和受体位点以及用于亚克隆至融合蛋白序列内的独特限制位点内的限制位点。编码融合蛋白的DNA片段用包含用于亚克隆至上述质粒内的限制位点的引物来制备。转录后，通过生物反应器的内源性剪接构造物将Sec-RNA从编码融合蛋白的mRNA释放。
另一个示例性表达载体是图12所示的表达载体pBioR Pol II稳定型，其编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物。所述载体包含CTS调节子(9)、PGK启动子(1)、抗嘌呤霉素基因(10)、鸡β-肌动蛋白启动子(5)、融合蛋白(6)、Sec-RNA(3)(其具有处于融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。Sec-RNA可选自表I和II；融合蛋白序列可选自表III、IV和V。
另一个示例性表达载体是图13所示的表达载体pBioR Pol IIIDicer，其编码本发明的示例性RNA-蛋白复合物。所述载体包含SV40启动子(1)、内含子序列(2)、生物活性RNA序列和识别RNA序列(3)、hGH聚腺苷酸尾部序列(4)、鸡β-肌动蛋白启动子(5)、融合蛋白(6)、Sec-RNA(3)(其具有处于融合蛋白内侧的侧翼内含子(2))、人类生长激素聚腺苷酸尾部序列(4)、抗卡那霉素基因(7)和pUC复制起点(8)。Sec-RNA可选自表I和II；融合蛋白序列可选自表III、IV和V。
在其它实施方式中，表达载体包含编码核酸分子的第一聚核苷酸序列和编码多肽的第二聚核苷酸序列，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列。在另一个实施方式中，表达载体还包含编码如下核酸分子的第三聚核苷酸，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件。在一个实施方式中，第一聚核苷酸和第三聚核苷酸的生物活性RNA靶向一种或多种所关注靶基因。在另一个实施方式中，第一聚核苷酸的生物活性RNA选自靶向一种或多种所关注靶基因的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)和短发夹RNA(shRNA)，而第三聚核苷酸的生物活性RNA靶向Dicer和/或Drosha。
在另一个实施方式中，表达载体额外包含第一启动子序列、比如，一个可诱导或可抑制的启动子序列、终止序列和可选的一种或多种引物序列、第二启动子序列比如一个可诱导或可抑制的启动子序列、聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列的第一聚核苷酸与第一启动子序列和终止序列可操作性连接，且其中编码RNA结合域序列和转运肽序列的第二聚核苷酸与第二启动子序列和聚腺苷酸添加序列可操作性连接。另外，所述载体可额外包含一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码包含一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的第三聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种终止序列可操作性连接。
在另一个实施方式中，表达载体还包含编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。在另一个实施方式中，所述载体额外包含一种或多种启动子序列、一种或多种聚腺苷酸添加序列和可选的一种或多种引物序列，其中编码病毒聚合酶和病毒辅助蛋白的聚核苷酸序列与所述一种或多种启动子序列和一种或多种聚腺苷酸添加序列可操作性连接。
在一个实施方式中，本发明提供了包含编码核酸分子的聚核苷酸的表达载体，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列。在一个实施方式中，表达载体包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列的核酸分子的聚核苷酸，以及编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列。
本发明还提供了包含编码多肽的聚核苷酸的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽。
因此，本发明提供了包含编码核酸分子的聚核苷酸的第一表达载体和包含编码多肽的聚核苷酸的第二表达载体，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽(例如，选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域的肽)。
在本发明的任何表达载体中，包括识别RNA序列、各生物活性RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和转运肽的一种或多种序列以及任何其它序列(包括病毒序列、启动子、引物、终止序列和聚腺苷酸序列)在没有添加一种或多种间隔序列或额外序列的情况下直接相连。替代性的，包括识别RNA序列、各生物活性RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域和转运肽的一种或多种序列以及任何其它序列(包括病毒序列、启动子、引物、终止序列和聚腺苷酸序列)在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在上述实施方式的任一种中，各个生物活性RNA序列自身在没有添加任何间隔序列或额外序列的情况下直接相连或在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在上述实施方式的任一种中，识别RNA序列和任何生物活性RNA在没有添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连，或在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。在上述实施方式的任一种中，RNA结合域和各转运肽的任一个在没有添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连，或在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。
在所述表达载体的某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个具体实施方式中，生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)。在另一个具体实施方式中，生物活性RNA序列是适体。在某些实施方式中、识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在一个实施方式中，末端小螺旋序列来自腺病毒VA1RNA分子。在某些实施方式中，RNA结合域选自a U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。在某些实施方式中，所述一种或多种转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域及其任意组合。在一个具体实施方式中，转运肽是细胞穿透肽。在某些具体实施方式中，细胞穿透肽选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在另一个具体实施方式中，转运肽是病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在一个具体实施方式中，转运肽是细胞穿透肽和选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域的一种或多种转运肽。在一个具体实施方式中，转运肽是细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在某些实施方式中，病毒非结构基因和结构基因(病毒聚合酶、辅助蛋白、外壳蛋白和促融合蛋白)选自DNA病毒和RNA病毒，包括但不限于腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒、辛德毕斯病毒、泡沫病毒。
另外，本发明提供了从复制竞争性或复制非竞争性病毒颗粒构建的表达载体，所述病毒颗粒携带并分配来自转化的包装细胞的一种或多种生物活性RNA分子。在一个实施方式中，本发明提供了包含部分病毒基因组的病毒载体和包含部分病毒基因组和编码本文所述的任何核酸分子的聚核苷酸的第二病毒载体。在一个实施方式中，本发明提供了包含编码核酸分子的聚核苷酸和编码多肽的聚核苷酸的病毒载体，所述核酸分子包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含一种或多种融合蛋白，即RNA结合域和一种或多种转运肽。生物活性RNA序列可以是本文所述或者本领域已知的任何生物活性RNA序列。在一个实施方式中，病毒载体包含编码其中的生物活性RNA序列选自以下序列的核酸分子的聚核苷酸：核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个具体实施方式中，病毒载体包含编码其中的生物活性RNA序列是短发夹RNA(shRNA)的核酸分子的聚核苷酸。在一个具体实施方式中，病毒载体包含编码其中的生物活性RNA序列是适体的核酸分子的聚核苷酸。识别RNA序列可以是本文所述或者本领域已知的任何识别RNA序列。在一个实施方式中，病毒载体包含编码其中的识别RNA序列选自以下序列的核酸分子的聚核苷酸：U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。末端小螺旋序列可以是本文所述或者本领域已知的任何末端小螺旋序列。本发明还提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码含有RNA结合域和一种或多种转运肽的多肽。在某些实施方式中，RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、苜蓿花叶病毒外壳蛋白(AMVCP)和tristetrapolin氨基酸序列。在某些实施方式中，一种或多种转运肽选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域及其任意组合。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码含有RNA结合域和细胞穿透肽的多肽。在某些具体实施方式中，细胞穿透肽选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在另一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码含有RNA结合域和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的多肽。在某些具体实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码含有RNA结合域、细胞穿透肽和一种或多种转运肽(选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、促融合肽和内体释放域)的多肽。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下聚核苷酸的表达载体，所述聚核苷酸编码含有RNA结合域、细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的多肽。
在另一个实施方式中，病毒载体额外包含部分病毒基因组和下述核酸分子的聚核苷酸，所述核酸分子包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列。这些聚核苷酸中没有一个编码结合域。在一个实施方式中，所述聚核苷酸编码包含单个生物活性RNA序列的核酸分子。在另一个实施方式中，所述聚核苷酸编码包含两个或两个以上生物活性RNA序列的核酸分子。在某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。
生物反应器细胞
生物反应器细胞通过将本发明的表达载体(例如，pBioR质粒)体外转染至接受细胞系内而产生。任何细胞类型都能充当表达载体(包括任何pBioR质粒)的接受细胞。潜在生物反应器细胞的来源根据融合蛋白中所用结构域的性质和被靶向用于基因敲弱的细胞的性质而有所不同。生物反应器能够产生融合蛋白、产生Sec-RNA、通过融合蛋白结合Sec-RNA和分泌RNA-蛋白复合物。融合蛋白的产生可以通过基于RT-PCR的测试和检测蛋白自身的基于抗体的测试来验证，所述基于RT-PCR的测试检测编码蛋白的源自质粒的mRNA转录物。成功的Sec-RNA产生包括RNA(生物活性RNA和识别RNA序列)转录和该转录物从细胞核的输出。RT-PCR测试可以用于显示源自质粒的Sec-RNA分子的产生，而细胞分级可以用于证实RNA在细胞质中的累积。Sec-RNA分子与融合蛋白的结合可以通过使用针对融合蛋白的结构域之一的抗体进行免疫沉淀来证实，或替代性地，通过将表位标记(FLAG、HA等)添加至融合蛋白序列来证实。RNA-蛋白复合物的分泌可以通过在胞外间隙中或在培养基中(在培养基中的细胞的情形中)检测Sec-RNA而进行验证。如上所述，通过免疫沉淀可以将无损的RNA-蛋白复合物从培养基分离，或可以使用Tri试剂(Sigma-Aldrich，产品号T9424)来制备总RNA。通过RNA印迹或如上所述通过RT-PCR来检测Sec-RNA。
生物反应器细胞可以通过用本发明的表达载体对合适细胞进行瞬时转染或通过稳定转染的细胞的发育而产生，其中质粒被整合在生物反应器细胞的基因组中。使用本文所述或本领域已知的方法，可以通过脂质体或聚合物输送剂或通过电穿孔用本发明的表达载体瞬时转染细胞。这类转染的效率排除了对将生物反应器细胞(即转染细胞)从未经转染的细胞纯化的需要，后者在后续输送步骤中充当惰性起始材料。相反，用本发明的表达载体稳定转染并且表达来自接受细胞基因组的融合蛋白和Sec-RNA的细胞系的发育要求将单独的转染细胞集落隔离，其各自代表单个的整合事件并且产生均匀的生物反应器细胞群。这些细胞连续产生分泌复合物，且可用于体外和体内应用。
生物反应器细胞可以用作转染剂以促进Sec-RNA向细胞的输送。出于敲弱Sec-RNA分子所靶向的基因产物的目的，还可将生物反应器细胞在体外、离体或体内应用于靶细胞。转染中所用的具体的表达载体和接受细胞由所关注的基因靶标和靶细胞性质所确定。类似地，生物反应器细胞与靶细胞的最佳比例对于每种细胞体系和基因靶标通过经验确定。在添加生物反应器细胞后24小时至72小时，从靶细胞收集RNA和/或担保样品，以便分别测试mRNA转录物或蛋白的敲弱。靶基因的mRNA水平可以通过RT-PCR、RNA印迹和本领域已知的其他方法来测定。靶基因的蛋白水平可以使用如蛋白质印迹和免疫沉淀等已知方法来测定。
生物反应器细胞可以通过施用本发明的一种或多种表达载体来产生。在一个实施方式中，本发明提供了包含本文所提供的任何表达载体及其组合物的生物反应器细胞。在一个实施方式中，本发明提供了包含含有编码核酸的聚核苷酸序列和编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体的细胞，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体、以及包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽。
在一个实施方式中，本发明提供了包含如下表达载体的细胞，所述表达载体包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和额外聚核苷酸序列，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽，所述额外聚核苷酸序列对包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸进行编码。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码如下核酸，所述核酸包含RNA识别序列和靶向另一种基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列以及额外聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域序列和转运肽，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向一种或多种其它基因靶标(例如，Dicer和/或Drosha基因靶标)的一种或多种生物活性RNA序列的核酸；所述细胞还包含含有编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体。
在一个实施方式中，本发明提供了一种细胞，所述细胞包含含有编码包含生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，还包含含有编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体。
在一个实施方式中，本发明提供了包含含有编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体和含有编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽RNA结合域序列和一种或多种转运肽。在一个实施方式中，所述细胞还包含第三表达载体，该第三表达载体包含编码包含一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列，所述一种或多种生物活性RNA序列靶向一种或多种基因靶标，所述一种或多种基因靶标不同于第一表达载体的生物活性RNA的基因靶标。在一个实施方式中，第三表达载体包含编码如下核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含RNA识别序列和靶向一种或多种基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在另一个实施方式中，当第一表达载体种的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，第三表达载体包含编码含有靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸序列。
本文所述的生物反应器细胞可以特别用于将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域和一种或多种转运肽序列，所述转运肽序列选自细胞穿透域、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、促融合肽和受体结合域；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(c)收集步骤(b)的培养细胞；(d)测试(c)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(e)将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离；和(f)将一种或多种靶细胞与步骤(e)中分离的生物反应器细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，(f)的靶细胞是细胞培养物中的靶细胞。在一个实施方式中，(f)的靶细胞是提取自包括哺乳动物的生物体的靶细胞。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在一个实施方式中，表达载体可以是本文所述的任何表达载体。RNA-蛋白复合物可以是本文所述的任何RNA-蛋白复合物。在一个实施方式中，RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是shRNA。在另一个实施方式中，RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是适体。在一个实施方式中，步骤(b)的细胞由表达载体稳定转染。在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)测试(d)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离；和(g)将一种或多种靶细胞与步骤(f)中分离的生物反应器细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是细胞培养物中的靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是提取自包括哺乳动物的生物体的靶细胞。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在一个实施方式中，步骤(c)的细胞由表达载体稳定转染。
在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)测试(d)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离；和(g)将一种或多种靶细胞与步骤(f)中分离的生物反应器细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是细胞培养物中的靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是提取自包括哺乳动物的生物体的靶细胞。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在一个实施方式中，步骤(c)的细胞由表达载体稳定转染。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)测试(d)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；和(f)将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离；和(g)将一种或多种靶细胞与步骤(f)中分离的生物反应器细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是细胞培养物中的靶细胞。在一个实施方式中，(g)的靶细胞是提取自包括哺乳动物的生物体的靶细胞。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类。在一个实施方式中，步骤(c)的细胞由表达载体稳定转染。
在另一个实施方式中，所述方法包括制备和施用第三表达载体的方法，第三表达载体包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当第一载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
本发明还提供了离体使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的离体方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域和一种或多种靶标肽序列；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(c)收集步骤(b)的培养细胞；(d)从受试对象获取靶细胞；(e)将在步骤(d)中获得的一种或多种靶细胞与步骤(c)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(f)将步骤(e)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用至受试对象前将生物反应器细胞从靶细胞分离。在一个实施方式中，步骤(f)的受试对象是与步骤(d)中靶细胞所获自的受试对象相同的受试对象。在一个实施方式中，步骤(f)的受试对象是与步骤(d)中靶细胞所获自的受试对象不同的受试对象。在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列、编码多肽的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)从受试对象获取靶细胞；(f)将在步骤(e)中获得的一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(g)将步骤(d)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用至受试对象前将生物反应器细胞从靶细胞分离。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象相同的受试对象。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象不同的受试对象。
在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)从受试对象获取靶细胞；(f)将在步骤(e)中获得的一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(g)将步骤(d)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(g)将步骤(d)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用至受试对象前将生物反应器细胞从靶细胞分离。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象相同的受试对象。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象不同的受试对象。
在另一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)从受试对象获取靶细胞；(f)将在步骤(e)中获得的一种或多种靶细胞与步骤(d)中收集的培养细胞混合以将生物活性RNA输送至靶细胞。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(g)将步骤(d)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：(g)将步骤(d)中的细胞施用至受试对象。在一个实施方式中，所述方法还包括以下步骤：在将靶细胞施用至受试对象前将生物反应器细胞从靶细胞分离。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象相同的受试对象。在一个实施方式中，步骤(g)的受试对象是与步骤(e)中靶细胞所获自的受试对象不同的受试对象。
在上述方法的任一种中，所述方法还可包括以下步骤：在从受试对象获取靶细胞之前，测试(c)或(d)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞并将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离。
在这些方法的任一种中，各步骤的受试对象是哺乳动物，包括人类。在本文所述的离体方法的任一种中，靶细胞所获自的受试对象和细胞所施用的受试对象是哺乳动物受试对象，包括例如人类受试对象。表达载体可以是本文所述的任何表达载体。RNA-蛋白复合物本文所述的任何RNA-蛋白复合物。在一个实施方式中，RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是shRNA。在另一个实施方式中，RNA-蛋白复合物的生物活性RNA是适体。在一个实施方式中，表达载体所编码的RNA-蛋白复合物包含病毒类、原核类或真核类非经典分泌域序列。在另一个实施方式中，表达载体所编码的RNA-蛋白复合物包含细胞穿透肽。在另一个实施方式中，表达载体所编码的RNA-蛋白复合物包含细胞穿透肽和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。在一个实施方式中，步骤(b)或步骤(c)的细胞由表达载体稳定转染。
本发明还提供了在体内使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞和/或组织的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的体内方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域和一种或多种转运肽序列(即选自细胞穿透域、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、促融合肽和受体结合域)；(b)将步骤(a)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(c)收集步骤(b)的培养细胞；(d)将步骤(c)的细胞施用于受试对象。在一个实施方式中，步骤(d)的受试对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类受试对象。
在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
本发明还提供了在体内使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞和/或组织的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的体内方法包括以下步骤：(a)制备编码RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域和一种或多种转运肽序列以及编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)将步骤(d)的细胞施用于受试对象。在一个实施方式中，步骤(e)的受试对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类受试对象。
在所述方法的某些实施方式中，步骤(a)的表达载体还包含编码下述核酸的聚核苷酸序列，所述核酸包含靶向一种或多种其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列。在一个实施方式中，所述额外聚核苷酸序列编码包含RNA识别序列和靶向其它基因靶标的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。在另一个实施方式中，当载体中的生物活性RNA序列中的一个是短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)时，所述额外聚核苷酸序列编码包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的核酸。
本发明还提供了在体内使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞和/或组织的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的体内方法包括以下步骤：(a)制备包含编码包含一种或多种生物活性RNA的核酸的聚核苷酸序列和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(b)制备包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)将步骤(d)的细胞施用于受试对象。在一个实施方式中，步骤(e)的受试对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类受试对象。
本发明还提供了在体内使用生物反应器细胞来将生物活性RNA输送至靶细胞和/或组织的方法。在一个实施方式中，将生物活性RNA输送至靶细胞的体内方法包括以下步骤：(a)制备包含编码核酸的聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件；(b)制备包含编码多肽的聚核苷酸序列的表达载体，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列；(c)将步骤(a)的表达载体和步骤(b)的表达载体施用于培养物中的细胞以产生表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞；(d)收集步骤(c)的培养细胞；(e)将步骤(d)的细胞施用于受试对象。在一个实施方式中，步骤(e)的受试对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类受试对象。
在上述方法的任一种中，所述方法还可包括以下步骤：在将细胞施用于受试对象之前，测试(c)或(d)的细胞以确定表达RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞并将生物反应器细胞与培养物中的其它细胞分离。在一个实施方式中，步骤(e)的受试对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是人类受试对象。
治疗方法
在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用本发明的表达载体。在预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法中，可以使用任何本文所述的表达载体。
在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含编码核酸的聚核苷酸和编码多肽的聚核苷酸的表达载体，所述核酸包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(即，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域和受体结合域)。在一个实施方式中，表达载体还包含编码含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的另一种核酸的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述另一种核酸的靶基因选自Dicer和/或Drosha。
在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含编码核酸的聚核苷酸、编码多肽的聚核苷酸和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体、以及包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列。在一个实施方式中，表达载体还包含编码含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的另一种核酸的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述另一种核酸的靶基因选自Dicer和/或Drosha。
在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用包含编码含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体、以及包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体；
在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对所述受试对象施用第一表达载体和第二表达载体，第一表达载体编码包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸，第二表达载体编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽序列(即，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域和受体结合域)的多肽。在一个实施方式中，所述方法还包括对受试对象施用第三表达载体，第三表达载体编码包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸。在一个实施方式中，第二种核酸的靶基因选自Dicer和/或Drosha。
在上述方法的任一种中，表达载体可以作为包含表达载体和药物可接受载剂的组合物施用。
另外，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对受试对象施用本发明的一种或多种生物反应器细胞。在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对受试对象施用包含本发明的一种或多种生物反应器细胞和药物可接受载剂(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、盐水或5％右旋葡萄糖)的组合物。生物反应器细胞可以是本文所述的任何本发明的生物反应器细胞。在一个实施方式中，生物反应器细胞编码RNA-蛋白复合物，所述RNA-蛋白复合物包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列和一种或多种转运肽序列(选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽)。
在另一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对受试对象施用包含一种或多种生物反应器细胞和药物可接受载剂(包括但不限于磷酸盐缓冲盐水、盐水或5％右旋葡萄糖)的组合物，其中所述生物反应器细胞产生并分泌RNA-蛋白复合物并且还产生包含针对Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列的RNA，所述RNA-蛋白复合物包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列和一种或多种转运肽序列(选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽)。
在上述预防、改善和/或治疗与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法中的任一种中，合适的基因靶标包括Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras、Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src。
因此，在一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对受试对象施用包含一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物，其中所述表达载体编码RNA-蛋白复合物，所述RNA-蛋白复合物包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列以及选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽的一种或多种序列。示例性靶基因包括Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras、Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src。
在另一个实施方式中，本发明提供了预防、改善和/或治疗受试对象的与缺陷性基因表达和/或活性相关的疾病或病况的方法，所述方法包括对受试对象施用包含一种或多种生物反应器细胞和药物可接受载剂的组合物，其中所述缺陷性基因表达和/或活性选自缺陷性的Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras、Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src表达和/或活性，且其中所述生物反应器细胞产生并分泌RNA-蛋白复合物，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列以及选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽的一种或多种序列，其中所述生物活性RNA针对选自Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras、Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src的基因，且其中所述生物活性RNA靶向具有缺陷性表达和/或活性的基因。
本发明的聚核苷酸和多肽
本发明提供了可用于制备将生物活性RNA输送至细胞的核酸分子、多肽、RNA-蛋白复合物和包含其的表达载体的新型聚核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了编码包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸分子的分离聚核苷酸。在一个具体实施方式中，所述分离的聚核苷酸编码包含一种或多种短发夹RNA、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸分子。在另一个实施方式中，所述分离的聚核苷酸编码包含一种或多种适体、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸分子。在另一个实施方式中，所述分离的聚核苷酸编码包含一种或多种核酶、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸分子。在另一个实施方式中，所述分离的聚核苷酸编码包含一种或多种反义核酸、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸分子。另外，本发明提供了编码包含靶向Dicer的一种或多种生物活性RNA序列的核酸分子的分离聚核苷酸，例如，包含SEQ ID NO:49的聚核苷酸。
另外，本发明提供了新型融合蛋白，其包含与上述核酸序列的识别RNA序列结合的氨基酸序列(RNA结合域)，还包含促进上述生物活性RNA从细胞输送和分泌的氨基酸序列(转运肽)。因此，在一个实施方式中，所述融合蛋白包含RNA结合域和一种或多种转运肽。所述融合多肽的转运肽可以是促进将核酸、肽、融合蛋白、RNA-蛋白复合物和/或其它生物分子输送至胞外间隙和/或相邻细胞和组织的任何氨基酸序列。
本发明还提供了编码本文所述的任何多肽分子的分离聚核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了编码包含RNA结合域的氨基酸序列的多肽和包含一种或多种转运肽序列(例如，选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、细胞穿透肽、受体结合域、内体释放域和促融合肽)的氨基酸序列。
在上述的本发明的编码核酸或多肽的分离聚核苷酸的实施方式的热一个中，所述分离聚核苷酸可以包含其中各个序列、结构域和肽在没有添加一种或多种连接子、间隔子或其它序列的情况下直接相连或在添加有一种或多种连接子、间隔子和/或其它序列的情况下相连。
本发明还提供了本部分和本申请中其它部分所述的任何聚核苷酸的互补序列。如本文所用，术语“互补”是指核苷酸之间的杂交或碱基配对，例如，在两条双链聚核苷酸之间或在寡核苷酸引物和待扩增或测序的单链聚核苷酸的引物结合位点之间。在两条单链核苷酸分子的一条链(最优地用适当的核苷酸插入、缺失或取代进行比对)的核苷酸与另一条链的核苷酸的至少约80％配对时，称这两条单链核苷酸分子互补。
本发明的“聚核苷酸”还包括能在严格杂交条件下与本文所述的任何聚核苷酸或其补体杂交的那些聚核苷酸。“严格杂交条件”通常被选择为在限定的离子强度和pH下比特定序列的热熔点(TM)低约5℃。严格杂交条件的一个实例是指在包含50％甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl，75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×登哈特溶液、10％硫酸右旋糖苷和20μg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中于42℃过夜温育，并随后在约65℃的0.1×SSC中洗涤过滤物。
本发明还涉及包含其全长与本发明的任何聚核苷酸具有至少约80％同一性(例如，至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性和至少99％同一性)的核苷酸序列的聚核苷酸。因此，在某些具体实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:1～15的一种或多种序列和选自SEQ ID NO:16～23的序列的核酸分子的聚核苷酸具有至少80％同一性(即，至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)。
在一个实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:24～31的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸具有至少80％同一性(即，至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性)。在另一个实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:24～31的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:32～40的序列的多肽的聚核苷酸具有至少80％同一性。在一个实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:50～54的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸具有至少80％同一性。在另一个实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:24～31的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:41～48的序列的多肽的聚核苷酸具有至少80％同一性。在另一个实施方式中，本发明提供了包含如下核苷酸序列的分离聚核苷酸，所述核苷酸序列在其全长上与编码包含选自SEQ ID NO:24～31的氨基酸序列、选自SEQ ID NO:32～40的序列和选自SEQ ID NO:41～48的序列的多肽的聚核苷酸具有至少80％同一性。
本发明还涉及聚核苷酸和多肽变体。“聚核苷酸变体”是指与本发明的聚核苷酸不同但保留其重要性质的聚核苷酸。相似地，“多肽变体”是指与本发明的多肽不同但保留其重要性质的多肽。在某些实施方式中，本发明提供了选自SEQ ID NO:1～23的序列的聚核苷酸变体。在某些实施方式中，本发明提供了编码选自SEQ ID NO:24～54的序列的多肽变体的聚核苷酸。
变体包括但不限于剪接变体和等位基因变体以及添加、缺失、截短和取代变体。“等位基因变体”是天然存在的变体，其指在生物体的染色体上占据给定基因座的基因的数种可替换形式中的一种(Genes II,Lewin,B.编著，John Wiley&Sons,New York(1985))。这些等位基因变体可以在聚核苷酸和/或多肽水平变化。替代性地，可以通过诱变技术或通过直接合成来产生非天然存在的变体。
变体可以包含具有“保守氨基酸取代”的序列，术语“保守氨基酸取代”是指以非天然残基取代天然氨基酸残基从而对该位置处的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有或没有影响。例如，在多肽中将非极性残基以任何其它非极性残基替代会导致保守取代。保守取代的另一个实例是将酸性残基以另一个酸性残基替代。变体还可以包含“直系同源物”，术语“直系同源物”是指与从不同物种鉴定出的多肽相对应的多肽。
在一个具体实施方式中，转运多肽包含一种或多种取代、缺失、截短、添加和/或插入，从而天然转运多肽的生物活性未受到显著减弱。换言之，转运多肽变体的生物活性可能相对于天然蛋白减弱了小于50％且优选小于20％。
优选地，转运多肽变体含有保守取代。“保守取代”是其中氨基酸被另一个具有相似性质的氨基酸取代的取代，从而肽化学领域技术人员可以预期多肽的二级结构和憎水性质基本没有变化。氨基酸取代可能通常在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性相似的基础上进行。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的亲水值相似的极性头基的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。变体还可以或替代性地含有非保守变化。在一个具体实施方式中，变体多肽因氨基酸的取代、缺失或添加而不同于天然序列。变体还可以(或替代性地)被例如对多肽的二级结构和憎水性质具有最小影响的氨基酸缺失或添加所修饰。
本发明提供了从生物样品分离或回收编码具有转运多肽活性的多肽的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供用于扩增编码所关注多肽的核酸的扩增引物序列对，其中所述引物对能够扩增本发明的核酸；(b)从生物样品分离核酸或处理生物样品以便所述样品中的核酸可以与所述扩增引物对杂交；和(c)将步骤(b)的核酸与步骤(a)的扩增引物对合并并且从生物样品扩增核酸，由此从生物样品分离或回收编码具有转运多肽活性的多肽的核酸。扩增引物序列对中的一个或每一个都可以包含含有本发明的序列的至少约10～50个连续碱基的寡核苷酸。在一方面，生物样品可以源自细菌细胞、原生动物细胞、昆虫细胞、酵母菌细胞、植物细胞、真菌细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了产生编码具有转运多肽活性的转运多肽的核酸的变体的方法，所述方法包括如下步骤：(a)提供包含本发明的核酸的模板核酸；和(b)在模板序列中修饰、缺失或添加(或其组合)一个或多个核苷酸以产生模板核酸的变体。在一方面，所述方法还可包括表达变体核酸易产生变体转运多肽。所述修饰、添加或缺失可以通过包括以下方法的方法引入：易出错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、表达盒诱变、递归系综诱变(recursiveensemble mutagenesis)、指数系综诱变、定点诱变、基因重组装、基因位点饱和型诱变(GSSM)、合成联接重组装(SLR)或其组合。在另一方面，所述修饰、添加或缺失通过包含以下方法的方法引入：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、间隔型双链诱变、点错配修复诱变、修复缺乏性主链诱变、化学诱变、放射原性诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、系综诱变、嵌合核酸多聚体创建及其组合。
在一方面，可以对所述方法进行反复重复，直到制备出与由模板核酸编码的多肽相比具有改变的或不同的活性或者改变的或不同的稳定性的转运多肽。在一方面，可以对所述方法进行反复重复，直到制备出与由模板核酸相比具有改变的密码子用法的转运蛋白编码序列。在另一方面，可以对所述方法进行反复重复，直到制备出与由模板核酸编码的蛋白相比具有更高或更低的信号表达或稳定性的转运蛋白。
本发明提供了用于修饰编码具有转运蛋白活性的多肽的核酸中的密码子以增加其在宿主细胞中表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供编码具有转运蛋白活性的多肽的本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中非优选或较不优选的密码子，并用优选的或中立使用的编码相同氨基酸的密码子作为替代密码子将其替代，由此修饰所述核酸以增加其在宿主细胞中的表达，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过多的密码子，而非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过少的密码子。
本发明提供了用于修饰编码具有转运蛋白活性的多肽的核酸中的密码子的方法；所述方法包括以下步骤：(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的密码子并用编码相同氨基酸的不同密码子作为替代密码子将其替代，由此修饰编码转运蛋白的核酸中的密码子。
本发明提供了用于修饰编码具有转运蛋白活性的多肽的核酸中的密码子以增加其在宿主细胞中表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供编码转运蛋白多肽的本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中非优选或较不优选的密码子，并用优选的或中立使用的编码相同氨基酸的密码子作为替代密码子将其替代，由此修饰所述核酸以增加其在宿主细胞中的表达，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过多的密码子，而非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过少的密码子。
本发明提供了用于修饰编码具有转运蛋白活性的多肽的核酸中的密码子以减少其在宿主细胞中表达的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供本发明的核酸；和(b)鉴定步骤(a)的核酸中的至少一个优选密码子，并用非优选的或较不优选的编码相同氨基酸的密码子作为替代密码子将其替代，由此修饰所述核酸以减少其在宿主细胞中的表达，其中优选密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过多的密码子，而非优选或较不优选的密码子是在宿主细胞的基因中的编码序列中出现过少的密码子。在一方面中，宿主细胞可以是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、酵母菌细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
本发明提供了用于产生编码多个修饰的转运蛋白活性位点或底物结合位点的核酸库的方法，其中所述修饰的活性位点或底物结合位点源自包含编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列的第一核酸，所述方法包括以下步骤：(a)提供编码第一活性位点或第一底物结合位点的序列的第一核酸，其中第一核酸序列包含在严格杂交条件下与本发明的核酸杂交的序列，且所述核酸编码转运蛋白活性位点或底物结合位点；(b)在第一核酸序列中的多个靶密码子处提供一组编码天然存在的氨基酸变体的诱变寡核苷酸；和(c)使用所述诱变寡核苷酸组来产生一组编码活性位点或编码底物结合位点的变体核酸，所述变体核酸在每个被诱变的氨基酸密码子处编码一系列氨基酸变异体，由此制备编码多个修饰的转运蛋白活性位点或底物结合位点的核酸库。在一方面，所述方法包括通过包括下述方法的方法来诱变步骤(a)的第一核酸：优化定向进化体系、基因位点饱和诱变(GSSM)、合成联接重组装(SLR)、易出错PCR、改组、寡核苷酸定向诱变、组装PCR、有性PCR诱变、体内诱变、表达盒诱变、递归系综诱变、指数系综诱变、定点诱变、基因重组装、基因位点饱和型诱变(GSSM)、合成联接重组装(SLR)及其组合。在另一方面，本发明包括通过包括下述方法的方法来诱变步骤(a)的第一核酸或变体：重组、递归序列重组、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、含尿嘧啶模板诱变、间隔型双链诱变、点错配修复诱变、修复缺乏性主链诱变、化学诱变、放射原性诱变、缺失诱变、限制-选择诱变、限制-纯化诱变、人工基因合成、系综诱变、嵌合核酸多聚体创建及其组合。
因此，本发明包括编码本发明的核酸或聚核苷酸的那些聚核苷酸，包括所述的取代、缺失、截短和插入变体，以及等位基因变体、剪接变体、片段、衍生物和直系同源物。因此，本发明的聚核苷酸序列既包括天然存在的序列也包括变体形式。类似地，本发明的多肽涵盖了天然存在的蛋白及其变异形式和修饰形式。此类变体会继续拥有所需的活性。据预期，本文所涵盖的多肽序列的缺失、插入和取代不会产生显著的多肽性质的变化。然而，当难以在进行取代、缺失或插入之前预测其确切效应时，本领域技术人员可以认为该效应可通过常规筛选测试来评估。
表达载体的施用
将本发明的表达载体施用于细胞和/或哺乳动物受试对象以便调节，例如在对与缺陷性靶基因表达和/或活性相关的病症的治疗、预防和/或改善中的靶基因表达。
本发明的表达载体及其制剂可以通过局部施用或系统施用而输送，并且能通过多种途径施用，包括口服、表面、职场或经由胃肠外、鼻内、皮内、动脉内、静脉内和肌肉内途径，以及直接注射至患病组织内。术语胃肠外意在包括经皮、皮下、血管内、肌肉内以及鞘内注射或输注技术等。表达载体可以被直接注射至脑内。替代性地，对于脑和脊髓病况，可以将载体于鞘内引入。在另一个实例中，可以将载体于肌肉内引入。可以使用标准针头和注射器方法或通过已知的无针技术来进行本发明的载体的直接注射，不论是皮下、肌肉内还是皮内。传统的CNS输送方法是已知的且包括例如，鞘内和脑室内施用、导管和泵植入、损伤或病变位点直接注射或灌注、向脑动脉系统的注射、或者通过化学方法或血脑屏障的渗透开口。本发明的载体及其制剂可以通过肺输送来施用，例如通过吸入由吸入装置或喷雾器施用的气溶胶或喷雾干燥制剂，从而使得载体被快速局部摄取至相关的肺组织中。如本领域所已知，本发明的组合物还可被配制并用作乳液、凝胶、喷雾、油和其它合适的组合物以用于表面、皮肤或透皮施用。
给药频率将取决于所用制剂中的表达载体的药代动力学参数。通常，临床医师施用组合物直至达到可实现所需效果的剂量。因此，组合物可以作为单次剂量施用，或随时间作为两次以上的剂量(其可以含有相同量的所需载体或不含相同量的所需载体)施用，或作为连续输注通过植入装置或导管施用。对适当剂量的进一步精细化由本领域普通技术人员常规进行，并且落在他们常规执行的任务范围内。因此，根据例如接受者的生理学状况、施用目的是治疗性还是预防性以及技术实践人员已知的其他因素，本发明的表达载体的施用可以以一次剂量生效，或可以在整个治疗过程中连续或间断性的施用。本发明的表达载体的施用可以为在预先选定的时段中基本连续地进行或可以以一系列间隔剂量进行。
待添加的载体的有效量可以通过经验确定。确定最有效的施用方式和剂量的方法是本领域技术人员公知的，并且会随载体、靶细胞和待治疗的受试对象而有所不同。例如，待施用量取决于以下数种因素，包括但不限于RNA-蛋白复合物、病症、哺乳动物的体重、物理状况和年龄以及是要实现预防还是治疗。此类因素可以由临床医师采用动物模型或其它本领域公知的测试系统来容易地确定。例如，可以通过施用合适的剂量响应数据来确立合适的剂量。因此，可以以由进行治疗的内科医师所选的剂量水平和模式进行单次和多次施用。药物有效剂量是预防、抑制疾病状态的出现或对其进行治疗(减轻症状)所需的剂量。一般而言，如上所述，药物有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、施用途径、受治疗的哺乳动物类型、所考虑的特定哺乳动物的物理特性、同时施用的药物以及医学领域技术人员了解的其他因素。通常，施用的活性成分的量为0.1mg/kg体重/日～100mg/kg体重/日。
另外，可能理想的是离体使用本发明的载体的药物组合物。在这种情况下，将已从受试对象移除的细胞、组织或器官与载体药物组合物接触，其后将所述细胞、组织和/或器官随即植入回该受试对象中。
药物组合物
本发明提供了在可接受载剂(例如稳定剂、缓冲剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂)中包含本发明的一种或多种表达载体的药物组合物。优选的是，可接受的制剂材料是在所采用的剂量和浓度对于接受体无毒的。可以通过任何标准方式在由或没有稳定剂和缓冲剂等的情况下将本发明的载体施用于受试对象从而形成药物组合物。药物组合物或制剂是指允许将本发明的载体以合适的使用形式(例如，系统或局部施用)有效分配至细胞或受试对象(包括例如人类)中的组合物或制剂。合适的形式部分地取决于用途或进入途径，例如，口服、透皮或通过注射。此类形式应施用于最适合于所需活性的物理位置，并且不应阻止组合物或制剂到达靶细胞。在一个实施方式中，药物组合物包含足以产生治疗有效量(即足以减轻或改善所考虑的疾病状态的症状的量或足以赋予所需益处的量)的RNA-蛋白复合物的载体。药物组合物还可含有药物可接受赋形剂，例如，山梨糖醇、Tween80和如水、盐水、甘油和乙醇等液体。可以在其中包含药物可接受盐，例如，矿物酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐等。另外，在此类赋形物种可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂和pH缓冲物质等。
在某些实施方式中，药物组合物可以包含用于修饰、维持或保持组合物的pH、渗透压、粘度、澄清性、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性溶解或释放速率、吸附或穿透的制剂材料。在此类实施方式中，合适的制剂材料包括但不限于：氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲剂(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露糖醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))、配位剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基β-环糊精)；填充剂；单糖类；二糖类；和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白(如血清白蛋白、凝胶蛋白或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、尼泊金丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如Pluronics、PEG、失水山梨糖酯、聚山梨酸酯如聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、Triton、氨基丁三醇、卵磷脂、胆固醇、Tyloxapal)；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨糖醇)；紧张性增强剂(tonicity enhancing agent)(如碱金属卤化物、右旋氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；输送赋形物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES，第18版，(A.R.Gennaro编著)，1990，Mack PublishingCompany。
本发明的表达载体及其制剂可以以含有常规无毒药物可接受载剂、佐剂和/或赋形物的剂量单元制剂经口服、表面、胃肠外、通过吸入或喷雾或经直肠施用。用于口服用途的组合物可以根据药物组合物制备领域已知的任何方法来制备，且这类组合物可以含有一种或多种所述甜味剂、调味剂、着色剂或防腐剂，以便提供顺口的制备物。
水性悬浮液将活性材料包含在与适于制备水性悬浮液的赋形剂的混合物中。此类赋形剂包括例如：悬浮剂，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芪胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，可为天然存在的磷脂(如卵磷脂)、或氧化烯与脂肪酸的缩合产物(如聚氧化乙烯硬脂酸酯)、或氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物(如十七乙烯氧基鲸蜡醇、或氧化乙烯与源自脂肪酸和己糖醇的部分酯的缩合产物(如聚氧化乙烯山梨糖醇单油酸酯)、或氧化乙烯与源自脂肪酸和脱水己糖醇的部分酯的缩合产物(如聚氧化乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(如蔗糖或糖精)。
可以用例如甘油、丙二醇、山梨糖醇、葡萄糖或蔗糖等甜味剂来配制糖浆剂和酏剂。此类制剂还可含有缓和剂、防腐剂、调味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射水性悬浮液或油状悬浮液的形式。该悬浮液可以根据已知技术使用上述的合适分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制备物还可以是处在无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受赋形物和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌不挥发性油用作溶剂或悬浮介质。为此，可以采用任何温和的不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，在可注射制备物中可使用如油酸等脂肪酸。
基因表达调节方法
本发明的表达载体和本发明的生物反应器可以在体外、离体和体内使用以调节所关注靶基因的表达。本发明提供了设计用以制备RNA-蛋白复合物的表达载体，所述RNA-蛋白复合物包含靶向一种或多种所关注基因的至少一种生物活性RNA分子和能够将生物活性RNA分子输送至胞外间隙和/或相邻细胞和组织的融合蛋白。表达载体向细胞的体内、离体和体外施用将细胞转化为“生物反应器”，所述生物反应器产生作为RNA-蛋白复合物分泌的生物活性RNA分子并将其输送至胞外间隙和/或其它相邻细胞。
本发明提供了用于调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对受试对象施用本发明的一种或多种表达载体或其组合物。在一个实施方式中，调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法包括对受试对象施用包含编码核酸的聚核苷酸和编码多肽的聚核苷酸的表达载体，所述核酸包含生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽(即，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽的序列)。在一个实施方式中，表达载体还包含另一种核酸，其含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，其中所述另一种核酸的靶基因不同于第一核酸的靶基因。在一个实施方式中，靶基因选自Dicer和/或Drosha。
在一个实施方式中，调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法包括对受试对象施用包含编码核酸的聚核苷酸、编码多肽的聚核苷酸和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体、以及包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体，所述核酸包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，所述多肽包含RNA结合域和一种或多种转运肽。在一个实施方式中，表达载体还包含另一种核酸，其含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、可选的识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件，其中所述另一种核酸的靶基因不同于第一核酸的靶基因。在一个实施方式中，靶基因选自Dicer和/或Drosha。
在一个实施方式中，调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法包括对受试对象施用包含编码含有一种或多种生物活性RNA序列的核酸的聚核苷酸和编码病毒复制所必需的一种或多种病毒聚合酶和一种或多种病毒辅助蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体、以及包含编码一种或多种病毒外壳蛋白和一种或多种病毒促融合蛋白的一种或多种聚核苷酸序列的表达载体。
在一个实施方式中，调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法包括对受试对象施用第一表达载体和第二表达载体或包含两种载体的组合物，第一表达载体编码包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸，而第二表达载体编码包含RNA结合域和一种或多种转运肽(即，选自细胞穿透肽序列、非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽)的多肽。所述方法还可以包括对受试对象施用另一种表达载体，该表达载体编码含有针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA结合域和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件的核酸，其中靶基因选自Dicer和/或Drosha。
本发明还提供了用于调节受试对象中的一种或多种靶基因的表达的方法，所述方法包括对受试对象施用本发明的一种或多种生物反应器细胞及其组合物，其中所述生物反应器细胞产生并分泌RNA-蛋白复合物，所述RNA-蛋白复合物包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列、一种或多种转运肽(即，选自细胞穿透肽序列、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽的序列)。
受试对象可以是哺乳动物受试对象，包括例如人类、啮齿类、鼠科、牛科、犬科、猫科、绵羊、马科和猴科受试对象。生物活性RNA序列可以是核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物；识别RNA序列可以是U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体Box BR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列；RNA结合域可以是U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、AMVCP和tristetrapolin序列；细胞穿透肽可以是穿透素、转运素、MAP、HIVTAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列；而病毒类、原核类或真核类非经典分泌域可以是半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号核苷酸序列。生物反应器细胞可以是本文所述的任何生物反应器细胞。
所述方法可以用于预防、改善和/或治疗受试对象中与缺陷性基因表达和/或活性有关的疾病或病况。合适的基因靶标包括例如Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras,Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src。与这些基因的缺陷性表达相关的病症列于表V中。
本发明还提供了用于调节离体靶细胞中的靶基因表达的方法。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节离体靶细胞中的靶基因表达的方法，所述方法包括对离体靶细胞施用本发明的一种或多种表达载体或其组合物。在一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：(a)从受试对象获取靶细胞；(b)将包含本发明的一种或多种表达载体和药物可接受载剂的组合物施用于步骤(a)的靶细胞，其中所述表达载体编码本发明的RNA-蛋白复合物；和(c)将步骤(b)的细胞施用于所述受试对象。在另一个实施方式中，本发明提供了用于调节离体靶细胞中的靶基因表达的方法，所述方法包括对离体靶细胞施用本发明的一种或多种生物反应器细胞或其组合物，其中所述方法包括以下步骤：(a)从受试对象获取靶细胞；(b)将本发明的一种或多种生物反应器细胞施用于步骤(a)的靶细胞，其中所述生物反应器细胞产生并分泌本发明的RNA-蛋白复合物；和(c)将步骤(b)的细胞施用于所述受试对象。
本发明还提供了用于调节培养物中的细胞中的基因表达的方法，所述方法包括将本发明的一种或多种表达载体或其组合物施用于细胞。另外，本发明提供了用于调节培养物中的细胞中的一种或多种靶基因表达的方法，所述方法包括将本发明的一种或多种生物反应器细胞或其组合物施用于细胞。
基于病毒的输送体系的作用机制
基于病毒的RNA输送体系利用经工程化的复制竞争性或复制缺陷性病毒来将生物活性RNA从转化的包装细胞输送至靶细胞。该体系利用了病毒颗粒所具有的能力以在体外(Lund PE等，Pharm Res.2009Dec9；Koerber JT等，Mol Ther.2008Oct；16(10):1703-9；Cascante A,Gene Ther.2007Oct；14(20):1471-80；Ring CJ；J Gen Virol.2002Mar；83(Pt3):491-502；Parada C等，Cancer Gene Ther.2003Feb；10(2):152-60；Tiede A等，Gene Ther.2003Oct；10(22):1917-25；Lee YJ,Cancer Gene Ther.2001Jun；8(6):397-404；Nestler U等，Gene Ther.1997Nov；4(11):1270-7)和体内(Tseng JC,et al。Gene Ther.2009Feb；16(2):291-6；Kikuchi E等，Clin Cancer Res.2007Aug1；13(15Pt1):4511-8；Bourbeau D等，Cancer Res.2007Apr1；67(7):3387-95；Hiraoka K等，Cancer Res.2007Jun1；67(11):5345-53；Hiraoka K等，Clin Cancer Res.2006Dec1；12(23):7108-16；Varghese S等，Cancer Res.2007Oct1；67(19):9371-9；Varghese S等，Clin Cancer Res.2006May1；12(9):2919-27；Qiao J等，Gene Ther.2006Oct；13(20):1457-70；Heinkelein M等，Cancer Gene Ther.2005Dec；12(12):947-53)将核酸有效地输送至靶细胞内部。许多研究已证实，siRNA病毒输送体系在体外和体内产生有效的RNAi响应(Anesti AM,et al.,Nucleic Acids Res.2008Aug；36(14):e86；Gorbatyuk M等，Vision Res.2007Apr；47(9):1202-8；Scherr M等，Nucleic Acids Res.2007；35(22):e149；Chen W等，J Virol.2006Apr；80(7):3559-66；Raoul C等，Nat Med.2005Apr；11(4):423-8；Bromberg-White JL等，J Virol.2004May；78(9):4914-6；Scherr M,et al.,Cell Cycle.2003May-Jun；2(3):251-7)。本发明提供了构建体质粒载体(pVir)，其在转染至哺乳动物细胞内时产生病毒颗粒(或假病毒粒子)。这些病毒携带有所关注的生物活性RNA靶向基因作为部分病毒基因组的一部分，从而使得能够通过病毒或宿主表达机制来表达这些抑制性序列。当病毒包装细胞被添加至靶细胞或组织时，所输送的RNA可以其后调节每个受感染的靶细胞内的基因表达。对于复制竞争性病毒，将自杀基因添加至病毒序列，从而可以通过添加前药来抑制病毒复制。这使得可以使用前药来避免不受控的病毒复制。对于复制缺陷性病毒，病毒颗粒专门在用于向周围组织分配的包装细胞中产生；经包装的病毒基因组包含生物活性RNA但缺乏病毒颗粒形成所需的结构基因。这种设置避免了不受控的病毒的复制。这种体系利用了高效的病毒感染效率和复制机制来输送和放大抑制信号。如此，该方法是对本发明的基于质粒的生物反应器输送体系的直接补充。
为了使病毒包装细胞可充当输送体系，必须对病毒颗粒进行包装并分配生物信号，例如抑制信号。该生物信号可以采取生物RNA自身或编码该生物RNA的DNA分子的形式。因此，用于构建基于病毒的输送体系的主链载体包括DNA病毒和RNA病毒，前者包括适当的用于表达的启动子和终止子，后者提供了有效的Dicer底物。RNA病毒仅需将部分病毒基因组(包含生物RNA)输送至靶细胞的细胞质；DNA病毒需要DNA基因组被输送至细胞核以便从DNA模板转录生物RNA。虽然采用RNA病毒的细胞质输送可能更为有效，但细胞核输送提供了额外放大的机会，因为从单个模板分子可以产生多个生物活性RNA。
病毒包装细胞通过用编码两种独立病毒RNA的质粒转染接受体细胞而产生，其中一种质粒编码病毒结构基因，另一种编码非结构基因和生物活性RNA分子。采用两种质粒进行的成功共转染生成能够产生复制缺陷性病毒颗粒的包装细胞。DNA或RNA病毒基因组的包装受天然病毒过程的驱动，其从包装细胞的分泌和向靶细胞的输入也是如此。一旦进入靶细胞内，细胞机制就根据特定生物分子的性质来接管特定的生物过程。该输送体系可以容纳本文所述的起着调节靶细胞基因表达的作用的任何生物活性RNA。
可以将基于病毒的输送与基于蛋白的输送在DNA病毒中结合，从而以pVir质粒进行的初始转染导致产生携带有用于生物活性RNA的表达盒和用于融合蛋白的表达盒的病毒。在这方面，从病毒包装细胞释放的病毒感染原生靶细胞并将其转化为基于病毒的生物反应器细胞。这些生物反应器细胞然后产生融合蛋白和生物活性RNA用于分泌并分配至继生靶细胞。用于生物活性RNA和融合蛋白的表达盒可以是本文所述的任何表达盒。
病毒主链
DNA病毒和RNA病毒均被用作潜在的抑制信号用载体。许多常用病毒载体可适用于这类应用并如上所述已在体外和体内应用中得到表征。特定病毒体系的应用取决于所需靶细胞，并且可能在从通过与过表达的层粘连蛋白受体的特异性相互作用的辛德毕斯病毒颗粒的肿瘤特异性输送(Tseng JC等，Gene Ther.2009Feb；16(2):291-6；Tseng JC等，J Natl Cancer Inst.2002；94:1790-1802)乃至如用泡沫病毒颗粒进行的向广谱组织的非特异性输送(Heinkelein M等，Cancer Gene Ther.2005Dec；12(12):947-53；Falcone V等，Curr Top Microbiol Immunol.2003；277:161-180)之间而有所不同。生物RNA被整合至用于非结构病毒基因的表达盒内以便最终包装至复制缺陷性病毒颗粒内。
在其中需要进行基因敲弱但不希望靶细胞裂解的情形中，适当的是使用复制缺陷性病毒。这些表达有效地将其核酸承载物输送至细胞内部，包括生物RNA模板或分子。然而，考虑到所输送的核酸不含能产生新的病毒颗粒的完整基因组，因而不存在病毒复制或后续细胞裂解。在其中期望靶细胞裂解的情形中(如癌细胞)，使用复制竞争性溶瘤病毒可能是最适当的。这些病毒在癌靶细胞被选择性复制从而导致其最终裂解(Ring CJ,J Gen Virol.2002Mar；83(Pt3):491-502,Varghese S等，Cancer Res.2007Oct1；67(19):9371-9；Varghese S等，Clin Cancer Res.2006May1；12(9):2919-27；Reinblatt M.et al.,Surgery2004；136:579-584)。在避免使可能对于人类是天然宿主的病毒存在的抗体中和时，使用能感染人细胞但正常情况下不会如此的病毒可能是有用的，诸如来自其它灵长类的病毒(Lund PE等，Pharm Res.2009Dec9；Lund PE等，Pharm Res.2009Dec9；Heinkelein M等，Cancer Gene Ther.2005Dec；12(12):947-53；Falcone V等，Curr Top Microbiol Immunol.2003；277:161-180)。
病毒包装细胞的体内应用
在体外生长的病毒包装细胞中产生的病毒颗粒最终被从包装细胞释放至培养基中。这些颗粒被从生长培养基常规地收集、浓缩并用作生物活性RNA用转染试剂(Heinkelein M等，Cancer Gene Ther.2005Dec；12(12):947-53；Anesti AM等，Nucleic Acids Res.2008Aug；36(14):e86；Gorbatyuk M等，Vision Res.2007Apr；47(9):1202-8；Scherr M等，Nucleic Acids Res.2007；35(22):e149；Chen W等，J Virol.2006Apr；80(7):3559-66；Raoul C等，Nat Med.2005Apr；11(4):423-8；Bromberg-White JL等，J Virol.2004May；78(9):4914-6；Scherr M等，Cell  Cycle.2003May-Jun；2(3):251-7)。通过将病毒生产细胞和靶细胞物理分离但允许两种培养物共享通用培养基，可以在不对培养基进行任何处理的情况下从病毒包装细胞感染在培养基中生长的靶细胞。这可通过施用设计来匹配细胞培养板的插入物或通过手动将培养基从病毒生产细胞转移至靶细胞来实现。在此情形中，包装细胞的性质仅针对病毒产生进行优化。对病毒主链进行选择来优化细胞培养基中的颗粒稳定性和不进行浓缩时的最高可能滴度。
病毒包装细胞还用于通过直接将包装细胞添加至靶细胞而转染在体外生长的细胞。在一方面，通过使用所述类型的病毒生产细胞与用报告质粒转染的靶细胞的共培养，可直接转移病毒输送的生物RNA(没有进行立即浓缩的步骤)。特定报告子的存在无须对病毒生产细胞和靶细胞进行区分，而是提供对生物活性RNA的基于病毒的输送的直接读出(readout)。当使用病毒体系来靶向内源性基因时，对由生物活性RNA的基因表达调节的读出必须是对于靶细胞而言独特的，且不能与病毒生产细胞共享，这与采用基于蛋白的生物反应器细胞的实验类似。病毒输送体系的接受体细胞由靶细胞的性质所指定，从而物种特异性读出简化了对mRNA和病毒敲弱的分析。对于每种靶细胞和靶基因的组合，通过经验确定最佳的病毒包装细胞与靶细胞之比。
体内基因调节
病毒包装细胞对体内系统的应用遵循为小鼠模型系统的蛋白分子过表达开发的反真核(transkaryotic)植入方法。如同基于蛋白的生物反应器细胞那样，使用了利用带有源自小鼠的病毒包装细胞的小鼠肿瘤细胞系(SCCVII或Renka)共植入的体内测试体系(参见实施例29和30)。通过皮下注射至小鼠的后侧来植入这些细胞类型的混合物。病毒颗粒输送靶向VEGF或Mmp2的shRNA。通过对植入区中靶基因的成功敲弱或通过对肿瘤生长和转移的生理学影响来测试活性。
源自小鼠的病毒包装细胞(NIH3T3成纤维细胞或mESC)也被植入小鼠以便测试向周围小鼠组织的病毒分泌和输送。在该情形中，含生物活性RNA分子的病毒颗粒靶向针对人类疾病的小鼠模型的内源性组织(参见实施例31-32)。从每只小鼠收集相关疾病组织，并使用RT-PCR在转录水平评估靶基因表达或使用ELISA测试在蛋白水平评估靶基因表达。此外还测定了对疾病进程的生理学测试并且在受治疗的和未经治疗的对照小鼠之间进行比较，以便评估基于病毒的输送体系的功能和基因靶标对治疗疾病的效力。
试剂盒
本发明还提供了可用在本文所述的方法中的试剂盒。例如，本发明提供了用于构建表达载体的试剂盒，其中表达载体表达本发明的RNA-蛋白复合物。在一个实施方式中，试剂盒包含编码核酸分子的第一聚核苷酸和编码多肽的第二聚核苷酸，所述核酸分子包含识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件(下文称作“RNA序列”)，所述多肽包含RNA结合域和可选的一种或多种转运肽序列(选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、细胞穿透肽、受体结合域和内体释放域)(下文称作“蛋白序列”)。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含编码下述核酸分子的第三聚核苷酸，所述核酸分子包含靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列(下文称作“Dicer/Drosha序列”)。
因此，在一个实施方式中，试剂盒还包含用于扩增编码所述RNA序列(包括RNA结合序列)的聚核苷酸的一种或多种引物序列。在一个实施方式中，所述引物序列包含与编码所述RNA序列(包括RNA结合序列)的聚核苷酸互补的一种或多种序列、一种或多种限制酶位点序列和可选的一种或多种包含至少4个GC碱基对的序列。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含适用于表达编码所述RNA序列(包括RNA结合序列)的聚核苷酸的启动子序列，比如可诱导或可抑制的启动子序列。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含适用于表达编码所述RNA序列(包括RNA结合序列)的聚核苷酸的终止序列。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含用于扩增编码所述蛋白序列的聚核苷酸的一种或多种引物序列。在一个实施方式中，所述引物序列包含与编码所述蛋白序列的聚核苷酸互补的一种或多种序列、一种或多种限制酶位点序列和可选的一种或多种包含至少4个GC碱基对的序列。在另一个实施方式中，引物序列还包含一种或多种启示密码子序列和一种或多种翻译起始位点序列。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含适用于表达编码所述蛋白序列的聚核苷酸的启动子序列。在另一个实施方式中，试剂盒额外包含适用于表达编码所述蛋白序列的聚核苷酸的终止序列。
在替代性实施方式中，试剂盒包含含有识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、可选的一种或多种生物活性RNA序列、一种或多种引物序列、一种或多种启动子序列，例如，可诱导或可抑制的启动子序列和一种或多种终止序列的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述聚核苷酸包含一种或多种生物活性RNA序列，其中所述生物活性RNA选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。生物活性RNA可以靶向任何所关注的基因靶标，包括例如VEGF、VEGFR、MMP2、Cav-1、EGFR、H-RAs、Bcl-2、存活素、FAK、STAT3、Her-3、β-联蛋白、hRET受体酪氨酸激酶。在另一个实施方式中，核苷酸不包含生物活性RNA序列，该序列由试剂盒的个体使用者提供。在一个实施方式中，所述引物序列包含与编码所述RNA序列(包括生物活性RNA)的聚核苷酸互补的一种或多种序列、一种或多种限制酶位点序列和可选的一种或多种包含至少4个GC碱基对的序列。在另一个替代性实施方式中，试剂盒还包含含有RNA结合域、一种或多种选自病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、细胞穿透肽、受体结合域、内体释放域的序列、一种或多种引物序列、一种或多种启动子序列和一种或多种终止序列的聚核苷酸。在一个实施方式中，所述引物序列包含与编码所述蛋白序列的聚核苷酸互补的一种或多种序列、一种或多种限制酶位点序列、可选的一种或多种包含至少4个GC碱基对的序列、一种或多种起始密码子序列和一种或多种翻译起始位点序列。在另一个替代性实施方式中，试剂盒还包含含有靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列、一种或多种引物序列、一种或多种启动子序列和一种或多种终止序列的聚核苷酸。
在所述试剂盒实施方式的任一个中，编码RNA序列(包括生物活性RNA)的聚核苷酸可以包含如下的序列：其中识别RNA序列、各生物活性RNA序列、可选的末端小螺旋序列和任何其它所包含序列直接相连或在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。在所述试剂盒的实施方式的任一个中，编码蛋白序列的聚核苷酸可以包含如下的序列：其中RNA结合域和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、细胞穿透肽、受体结合域和内体释放域序列以及任何其它所包含序列直接相连或在添加有一种或多种间隔序列或额外序列的情况下相连。因此，在某些实施方式中，试剂盒额外包含用于将编码RNA序列的聚核苷酸与编码蛋白序列的聚核苷酸的各个序列和结构域连接的连接子序列。
在所述试剂盒实施方式的任一个中，识别RNA序列可以选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在所述试剂盒的实施方式的任一个中，RNA结合域可以选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、AMVCP和tristetrapolin序列。在所述试剂盒实施方式的任一个中，细胞穿透肽可以选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC序列。在所述试剂盒实施方式的任一个中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域可以选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在试剂盒实施方式的任一个中，启动子是Pol II启动子。合适的Pol II启动子的非限制性实例包括但不限于猴病毒40(SV40)、巨细胞病毒(CMV)、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、泛素和PSA启动子。在另一个实施方式中，启动子是Pol III启动子。合适的Pol III启动子的实例包括但不限于人H1启动子和人U6启动子。合适的终止序列的非限制性实例包括但不限于人生长激素(hGH)聚腺苷酸化序列、牛生长激素(BGH)聚腺苷酸化序列、猴病毒40(SV40)大T聚腺苷酸化序列和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)聚腺苷酸化序列。
在又一个实施方式中，试剂盒还包含一种或多种主链载体，其中可插入编码RNA序列(包括生物活性RNA)的聚核苷酸和/或编码蛋白序列的聚核苷酸和/或编码Dicer/Drosha序列的聚核苷酸。在一个实施方式中，编码RNA序列的聚核苷酸被插入第一主链载体，而编码蛋白序列的聚核苷酸插入第二主链载体。在另一个实施方式中，编码RNA序列的聚核苷酸和编码蛋白序列的聚核苷酸被插入单个主链载体。在一个实施方式中，编码Dicer/Drosha序列的聚核苷酸可以被插入第三主链载体。在另一个实施方式中，编码Dicer/Drosha序列的聚核苷酸可以插入与编码RNA序列的聚核苷酸相同的载体。合适的主链载体的非限制性实例包括pCI、pET、pSI、pcDNA、pCMV等。在上述实施方式的任一个中，主链载体额外包含pUC复制起点。在一个实施方式中，主链载体额外包含选自抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
在其它实施方式中，试剂盒额外包含可用于扩增、克隆和/或表达编码RNA序列(包括生物活性RNA)的聚核苷酸、编码蛋白序列的聚核苷酸和编码Dicer/Drosha序列的聚核苷酸的缓冲剂、酶和溶液，包括例如，一种或多种限制酶、磷酸酶、激酶、连接酶和聚合酶。
在另一个实施方式中，试剂盒额外包含构建表达载体的说明，包括例如聚核苷酸序列图谱和质粒图谱。
在另一个实施方式中，试剂盒额外包含用于包装试剂盒作商业用途的材料。
另外，本发明提供了包含可用于调节靶基因表达的表达载体的试剂盒。所述试剂盒提供了一种或多种表达载体，其可产生可用于在体内、离体或体外调节基因表达的本发明的RNA-蛋白复合物。在一个实施方式中，试剂盒包含分开的表达载体以用于表达RNA-蛋白复合物的RNA部分和RNA-蛋白复合物的融合蛋白部分。包含分开的用于RNA-蛋白复合物的RNA部分和蛋白部分的表达载体的试剂盒的优点之一在于，可以通过将包含生物活性RNA的载体转染至靶细胞来验证生物活性RNA的活性。在不存在表达融合蛋白的载体时，可以在靶细胞中直接验证表达生物活性RNA的载体的基因调节作用。在另一个实施方式中，试剂盒包含表达RNA-蛋白复合物的单个表达载体。
在一个实施方式中，所述试剂盒提供了表达载体，该表达载体包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列，例如可诱导或可抑制启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，其中生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列在启动子序列的下游。生物活性RNA可以是本文所述或本领域中已知的任何生物活性RNA。生物活性RNA序列可以选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。生物活性RNA可以靶向任何所关注的基因靶标，包括例如VEGF、VEGFR、MMP2、Cav-1、EGFR、H-RAs、Bcl-2、存活素、FAK、STAT3、Her-3、β-联蛋白、hRET受体酪氨酸激酶。在另一个实施方式中，表达载体不含生物活性RNA序列，而该序列由试剂盒的个体使用者供应。因此，在一个实施方式中，试剂盒提供了表达载体，该表达载体包含识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，其中识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列在启动子序列的下游。限制酶位点被定位来使得可提供便利的克隆位点以便使用者的生物活性RNA序列的插入。在另一个替代性实施方式中，试剂盒还包含含有靶向Dicer和/或Drosha的一种或多种生物活性RNA序列、一种或多种引物序列、一种或多种启动子序列和一种或多种终止序列的聚核苷酸。
在上述实施方式的任一个中，识别RNA序列可以选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxB、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在一个实施方式中，启动子序列是polIII启动子。合适的polIII启动子的实例包括人U6 polIII启动子和人H1polIII启动子。在一个实施方式中，启动子序列是polII启动子。合适的polII启动子的非限制性实例包括SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，生物活性RNA序列和识别RNA序列与启动子序列可操作性连接。在一个实施方式中，终止序列是Pol-III聚T终止子序列。
在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含pUC复制起点。在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含一种或多种抗药性基因。合适的抗药性基因的实例包括但不限于抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
在一个实施方式中，试剂盒额外包含含有RNA结合域和选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域和促融合肽的一种或多种序列的表达载体，还额外包含一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列、可选的GC碱基对序列、起始密码子和翻译起始位点，其中所述RNA结合域及细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域和促融合肽在启动子序列的下游。在一个实施方式中，启动子序列是Pol II启动子。合适的polII启动子的非限制性实例包括SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子。终止序列可以是聚腺苷酸化序列，例如源自hGH的聚腺苷酸化序列。在某些实施方式中，RNA结合域包含选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、AMVCP和tristetrapolin氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，细胞穿透肽包含选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC氨基酸序列的氨基酸序列。在某些实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域包含选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号氨基酸序列的氨基酸序列。
在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含pUC复制起点。在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含一种或多种抗药性基因，所述抗药性基因选自抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
在一个实施方式中，试剂盒可选地还包含下述表达载体，所述表达载体包含一种或多种生物活性RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，其中所述生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列处于启动子序列的下游，且其中生物活性RNA序列靶向Dicer和/或Drosha。在某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个实施方式中，启动子序列是polIII启动子，包括例如人U6 polIII启动子和人H1 polIII启动子。在一个实施方式中，启动子序列是polII启动子，包括例如SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，终止序列是Pol-III聚T终止子序列。在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含pUC复制起点。在上述实施方式的任一个中，表达载体额外包含一种或多种抗药性基因，所述抗药性基因选自抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
在另一个实施方式中，试剂盒额外包含用于包装试剂盒作商业用途的说明和材料。
替代性地，试剂盒包含编码本发明的RNA-蛋白复合物的单个表达载体。在一个实施方式中，试剂盒包含含有第一表达盒、第二表达盒和可选的第三表达盒的表达载体。第一表达盒包含针对靶基因的一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列，例如可诱导或可抑制的启动子序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，其中所述生物活性RNA序列、识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列处在启动子序列的下游。在某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。靶基因可以是任何靶基因，包括例如Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras、Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src基因靶标。在某些实施方式中，识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在一个实施方式中，启动子序列是polIII启动子，包括例如选自人U6 polIII启动子和人H1 polIII启动子的启动子。在一个实施方式中，启动子序列是polII启动子，包括例如选自SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子的启动子。
试剂盒的表达载体还包含第二表达盒，其中第二表达盒包含RNA结合域序列、选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、an内体释放域和促融合肽的一种或多种序列、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列、GC碱基对序列、起始密码子和翻译起始位点，其中RNA结合域与细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、受体结合域、内体释放域和促融合肽处在启动子序列的下游。在某些实施方式中，RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIV Rev、AMVCP和tristetrapolin序列。在某些实施方式中，细胞穿透肽选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC氨基酸序列。在某些实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列。在一个实施方式中，启动子序列是Pol II启动子，包括例如选自SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子的启动子。在一个实施方式中，终止序列是聚腺苷酸化序列。在一个实施方式中，聚腺苷酸化序列源自hGH。
试剂盒的表达载体可选地还包含第三表达盒，其中第三表达盒包含一种或多种生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，其中生物活性RNA序列和可选的末端小螺旋序列处在启动子序列的下游。在上述表达载体的某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。在一个实施方式中，一种或多种生物活性RNA序列针对Dicer和/或Drosha。在一个实施方式中，启动子序列是polIII启动子。合适的polIII启动子的非限制性实例包括人U6 polIII启动子和人H1 polIII启动子。在一个实施方式中，启动子序列是polII启动子。合适的polII启动子的非限制性实例包括SV40、β-肌动蛋白、人白蛋白、人HIF-α、人凝溶胶蛋白、人CA-125、人泛素、PSA和巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，生物活性RNA序列与启动子序列可操作性连接。在一个实施方式中，终止序列是Pol-III聚T终止子序列。
表达载体额外包含pUC复制起点。在一个实施方式中，表达载体额外包含一种或多种抗药性基因，所述抗药性基因选自抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
在一个，试剂盒包含含有第一表达盒、第二表达盒和可选的第三表达盒的表达载体，其中第一表达盒包含识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，且其中识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列处在启动子序列的下游。该试剂盒不含生物活性RNA序列，而该序列由试剂盒使用者提供。试剂盒可选地包含含有限制酶位点的一种或多种引物序列，所述引物序列可以与生物活性RNA序列联接以便于克隆至表达载体内。第二表达盒和可选的第三表达盒可以是上述的第二和第三表达盒的任一种。
在一个替代性实施方式中，试剂盒包含含有第二表达盒和可选的第三表达盒的表达载体。试剂盒额外包含含有可以与表达载体联接的第一表达盒的分离聚核苷酸，其中第一表达盒包含识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、一种或多种启动子序列、一种或多种终止序列、限制酶位点、引物序列和可选的GC碱基对序列，且其中识别RNA序列和可选的末端小螺旋序列处在启动子序列的下游。试剂盒不含生物活性RNA序列，而该序列由试剂盒使用者提供。试剂盒可选地包含一种或多种引物序列，所述引物序列可以与生物活性RNA序列联接以便于克隆至第一表达盒内。第一表达盒其后可以被克隆至包含第二表达盒和第三表达盒的表达载体内。试剂盒可选地包含含有与表达载体相容的限制位点的一种或多种引物序列，所述引物序列可以与第一表达盒联接以便于克隆至表达载体内。第二表达盒和第三表达盒可以是上述的第二和第三表达盒的任一种。在其中表达载体仅包含第二表达盒的实施方式中，试剂盒可以额外包含含有能联结至表达载体内的第三表达盒的分离聚核苷酸。第三表达盒可以是上述的第三表达盒的任一种。试剂盒可选地包含含有与表达载体相容的限制位点的一种或多种引物序列，所述引物序列可以与第三表达盒联接以便于克隆至表达载体内。
在这些实施方式的任一个中，表达载体额外包含pUC复制起点。在一个实施方式中，表达载体额外包含一种或多种抗药性基因，所述抗药性基因选自抗卡那霉素、氨苄青霉素、嘌呤霉素、四环素和氯霉素基因以及在本领域中已知和已有描述任何其它抗药性基因的一种或多种抗药性基因。
本发明还提供了包含一种或多种生物反应器细胞的试剂盒，所述生物反应器细胞产生可以用于在体内、离体和体外调节基因表达的本发明的RNA-蛋白复合物。本发明提供了可产生和分泌RNA-蛋白复合物的生物反应器细胞溶液，所述RNA-蛋白复合物包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列和/或组成型转运元件、RNA结合域序列和选自细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域和促融合肽序列的一种或多种序列。在一个实施方式中，生物反应器细胞产生包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域序列和细胞穿透肽序列的RNA-蛋白复合物。在另一个实施方式中，生物反应器细胞产生包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域序列和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域序列的RNA-蛋白复合物。在再一个实施方式中，生物反应器细胞产生包含一种或多种生物活性RNA序列、识别RNA序列、可选的末端小螺旋序列、RNA结合域序列、细胞穿透肽序列和病毒类、原核类或真核类非经典分泌域序列的RNA-蛋白复合物。
在上述包含生物反应器细胞的试剂盒的某些实施方式中，生物活性RNA序列选自核酶、反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码一种或多种生物活性肽的转录物。生物活性RNA序列可以靶向任何基因，包括但不限于Mmp2、血管内皮生长因子(VEGF)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、Cav-1、表皮生长因子受体(EGFR)、H-Ras,Bcl-2、存活素、FAK、STAT-3、HER-3、β-联蛋白和Src基因靶标。在上述细胞的某些实施方式中，识别RNA序列选自U1环、II组内含子、NRE茎环、S1A茎环、噬菌体BoxBR、HIV Rev响应元件、AMVCP识别序列和ARE序列。在上述细胞的某些实施方式中，RNA结合域选自U1A、CRS1、CRM1、核仁素RBD12、hRBMY、噬菌体蛋白N、HIVRev、AMVCP和tristetrapolin序列。在上述细胞的某些实施方式中，细胞穿透肽包含选自穿透素、转运素、MAP、HIV TAT、Antp、Rev、FHV外壳蛋白、TP10和pVEC氨基酸序列的序列。在上述细胞的某些实施方式中，病毒类、原核类或真核类非经典分泌域包含选自半乳糖凝集素-1肽、半乳糖凝集素-3肽、IL-1α、IL-1β、HASPB、HMGB1、FGF-1、FGF-2、IL-2信号、分泌性转谷氨酰胺酶、膜联蛋白-1、HIV TAT、疱疹VP22、硫氧还蛋白、硫氰酸酶和纤溶酶原激活信号序列的序列。
合适的细胞的非限制性实例包括NIH 3T3、Cos-1、Cos-7、SCCVII、HEK293、PC-12、Renka、A549、CT26、CHO、HepG2、Jurkat和HeLa细胞，以及在本领域中已知和已有描述的任何其它细胞。
显而易见，除了前述说明和下属实施例中所具体描述的，本发明还可以以其他方式实践。根据本文的教导本发明可以具有许多改良形式和变化形式，且这些改良形式和变化形式因此处于所附权利要求的范围内。
实施例
表达载体和由所述表达载体输送的RNA的例子在USSN61/160287和61/160288(例1-46)都有描述，上述两个参考文献均被选为本说明书的对比文件。
实施例1.本发明的生物反应器质粒的一般性构建
对于RNA(sec-RNA)和蛋白(融合蛋白)组分，从分离的质粒主链和PCR扩增表达盒构建表达载体。合适的主链载体的实例包括源自pCI、pET、pSI、pcDNA、pCMV等的那些。表达载体应该包含至少以下组分：用于在细菌中复制的复制起点、抗生素可选择标记物、RNA表达用启动子(Pol-II或Pol-III)、适于该启动子序列的终止序列、用于融合蛋白表达的启动子和聚腺苷酸尾部序列。合适的主链载体的一个实例选自本文所述的各种主链载体，其源自pSI(Promega，产品号E1721)、pCI(Promega，产品号E1731)、pVAX(Invitrogen，产品号12727-010)和其它自制构建体。pEGEN载体(例如，pEGEN 1.1、pEGEN 2.1、pEGEN3.1和pEGEN 4.1)含有pUC复制起点和抗卡那霉素基因，所述抗卡那霉素基因允许载体在细菌中复制并在卡那霉素存在时培养。其它合适的主链载体时公知且可商购的，例如，pCI、pSI、pcDNA、pCMV等。通过标准热休克法将pEGEN载体转化至XL1-Blue竞争性细胞中。通过在LB-卡那霉素板上生长来选择转化的细胞，将单个集落用于接种5mL LB-卡那霉素液体培养物并在37℃过夜生长。使用标准方法将所得培养物用于制备纯化的质粒储备液。
使用合适的前向和反向引物，通过对来自cDNA克隆体的相关序列的PCR扩增来制备生物反应器质粒的蛋白组分的表达盒。引物通常包括与所关注的结构域(例如，RNA结合域、细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽等)互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和位于每个引物的5’端的有助于限制酶消化的至少4个GC碱基对。其它有用的引物可以包含与所关注结构域(例如，RNA结合域、细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽等)互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和在侧翼包围用于重组克隆的限制位点的载体序列的15个碱基(In-fusion Advantage PCR克隆试剂盒，Clontech，目录号639620)。其它合适的引物包含与蛋白结构域互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和位于每个引物5’端的6个GC碱基对。起始密码子和优化的Kozak翻译起始位点被添加至每个引物对应于转录物的5’端以促进每个融合蛋白的N-端结构域的翻译。限制位点被添加至引物对应于转录物的3’端以促进输送结构域与RNA结合域的组装。典型PCR反应含有10mM Tris-HCl pH9.0、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.1％Triton X-100、200μM每种dNTP、1.0μM正义引物、1.0μM反义引物、100ng DNA模板和1.0U Taq聚合酶/50μL反应液。反应通过3个温度步骤循环：95℃进行30秒的变形步骤、50℃-60℃进行30秒的退火步骤和72℃进行1分钟的延伸步骤。通常，循环总数根据具体扩增反应为20至35次循环。
可以将结构域彼此直接相连或经由编码α螺旋连接子或其它连接子域的序列相连。这些连接子在两个功能域之间提供分隔以避免可能的位阻问题。在每种情形中，对编码每个结构域的DNA的限制消化产生相容性末端以用于定向联接。典型的限制消化反应含有10mM Tris(pH8.0)、100mM NaCl、5mM MgCl2、1mM DTT、0.1单元-1单元的每种限制酶和1μg DNA，并在37℃消化1小时。将产物在1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上纯化，并使用Qiagen的Qiaex II凝胶纯化系统回收切下的条带。使用与所关注的插入物匹配的限制酶来将这些表达盒克隆至pEGEN载体的多克隆位点内。典型的连接反应含有30mMTris(pH7.8)、10mM MgCl2、10mM DTT、1mM ATP、100ng DNA载体、100ng-500ng DNA插入物、1单元T4DNA连接酶，并在16℃联接过夜。另一种典型重组反应含有1×In-fusion反应缓冲液、100ng线性化质粒、50ng-200ng插入物、1单元In-fusion酶，其首先在37℃温育15分钟，然后在50℃温育15分钟。该过程将表达盒置于强力PolII启动子序列的下游和hGH聚腺苷酸信号序列的上游。如图5-7所示，pEGEN 1.1的Pol II启动子包含SV40启动子，pEGEN 2.1的Pol II启动子包含鸡β-肌动蛋白启动子，而pEGEN 3.1的Pol II启动子包含CMV启动子。使用具有侧面包围插入点的酶的限制图谱作图和使用采用对插入序列具有特异性的引物的PCR，可以确认将PCR产物成功克隆至质粒载体内(例如参见图15)。
包含融合蛋白盒的载体可以与包含下述的本发明的包含Sec-RNA的载体结合用于转染细胞。
使用合适的前向和反向引物，通过对来自DNA表达质粒的相关序列的PCR扩增来制备生物反应器质粒的RNA组分(例如，识别RNA序列和生物活性RNA序列，包括例如，反义核酸、等位酶、适体、短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)和编码生物活性肽的RNA转录物)的表达盒。引物包括与生物活性RNA序列互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和位于每个引物的5’端的有助于限制酶消化的至少4个GC碱基对。其它合适的引物可以包含与所关注结构域(例如，RNA结合域、细胞穿透肽、病毒类、原核类或真核类非经典分泌域、内体释放域、受体结合域、促融合肽等)互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和在侧翼包围用于重组克隆的限制位点的载体序列的15个碱基(In-fusion AdvantagePCR克隆试剂盒，Clontech，目录号639620)。在一个具体实例中，引物包含与生物活性RNA序列互补的序列、用于亚克隆的限制酶的位点和位于每个引物5’端的6个GC碱基对。识别RNA序列被添加至引物对应于生物活性RNA序列的5’端以便产生Sec-RNA表达构建体。该表达构建体被适当的限制酶消化以便克隆至pEGEN4.1构建体内，这将Sec-RNA表达盒置于强力Pol-III启动子序列(对于pEGEN4.1为人U6启动子，对于pEGEN5.1为人H1启动子)的下游和Pol III聚T终止子序列的上游。参见图8。替代性地，表达构建体被亚克隆至pEGEN5.1构建体内，这将Sec-RNA表达盒置于启动子序列人H1启动子序列(Pol-III启动子)的下游和Pol III聚T终止子序列的上游。替代性地，可以将Sec-RNA表达盒亚克隆至pEGEN1.1、pEGEN2.1或pEGEN3.1内，这将RNA表达分别置于SV40、β-肌动蛋白和CMV Pol-II启动子的控制之下，并用人GH聚腺苷酸化信号终止。替代性地，可以将Sec-RNA表达盒亚克隆至pEGEN 6.1～11.1的任一个中。
包含Sec-RNA表达盒的载体可以与包含上述的本发明的包含融合蛋白的载体结合用于转染细胞。
使用具有侧面包围插入点的位点的酶的限制图谱和使用采用对插入序列具有特异性的引物的PCR，可以确认将PCR产物成功克隆至质粒载体内。例如，图15显示了对sec-RNA质粒(15C)和融合蛋白质粒(15D和15E)的限制酶分析(15C和15D)和PCR扩增分析(15E)。图15C显示了对pE3.1 Sec-报告子的限制酶分析，其中引入有新型EcoNI限制位点与RNA表达插入物。图15D和15E分别显示了对两个pE1TAT-RBD质粒的限制酶分析和PCR分析。在图15C中，Sec-报告子(-)是指仅有pE3.1 Sec-报告子质粒，而Sec-报告子(+)是指pE3.1 Sec-报告子质粒与sec-RNA表达插入物。在图15D和15E中，p1.1是指仅有pE1.1质粒，TAT(-)是指pE1.1质粒和融合蛋白插入物(包含与Rev RNA结合域融合的TAT细胞穿透肽)，且TAT(+)是指pE1.1质粒和融合蛋白插入物(包含与蛋白N RNA结合域融合的TAT细胞穿透肽)。采用XcmI和AleI酶(其侧包围插入位点)对每个质粒的限制性消化使得可以进行琼脂糖凝胶分析，这区分了空的亲本质粒(99bp的产物)和插入物的成功亚克隆(245bp的产物)。使用一个退火至融合蛋白插入物的编码链的引物和退火至聚腺苷酸序列的非编码链的第二引物对插入位点的PCR扩增产生了正确定向的插入物的416bp产物。质粒插入物性质通过DNA测序来证实。
在其中Sec-RNA表达盒和融合蛋白表达盒在单个载体中的本发明的那些实施方式中，最终亚克隆步骤将融合蛋白表达盒与Sec-RNA表达盒在单个质粒载体(pBioR质粒)中连接。在一个实施方式中，Sec-RNA表达盒(例如，引物、启动子、识别RNA序列、生物活性RNA和终止序列)被连接至包含融合蛋白的pEGEN质粒以产生完整pBioR质粒。例如如图中所示，位于表达盒两侧的限制位点，pEGEN4.1(图8)或pEGEN5.1(未示出)的Sec-RNA将插入物从质粒释放，其后在于1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上纯化并用例如Qiagen的Qiaex II凝胶纯化系统回收切下的条带。采用侧包围Sec-shRNA表达盒的相同限制酶对含有融合蛋白的表达盒的质粒进行消化。然后将Sec-RNA表达盒连接至含有融合蛋白的质粒中以产生完整pBioR质粒。
实施例2.生物反应器质粒pBioR(1)的构建以及由CPP-RBD融合蛋白对Sec-shRNA的输送
此处对能够表达生物反应器融合蛋白和分泌的shRNA(Sec-shRNA)的表达载体进行描述。靶向表I和表VII中所列任何基因靶标以及任何其它靶mRNA的Sec-shRNA的生成和输送由质粒pBioR(1)完成，该质粒从两个亲本质粒构建。第一亲本质粒pEGENFP表达融合蛋白，并且其通过使用实施例1所述质粒和方法将包含来自表III的RNA结合域序列和来自表IV的细胞穿透肽序列的融合蛋白表达盒克隆至来自表VIII的pEGEN载体的多克隆位点而构建。在一个实施方式中，该过程将融合蛋白盒置于强力Pol II启动子序列(鸡β-肌动蛋白启动子)的下游和hGH聚腺苷酸信号序列的上游。可以在具有或没有α螺旋连接子域的情况下将RNA结合域和细胞穿透肽融合蛋白组装。该载体可以与pEGENSR载体联合转染至细胞内。
第二亲本质粒pEGENSR表达分泌的RNA，并且其通过使用实施例1所述质粒和方法将包含来自表II的RNA识别元件和来自表I的生物活性RNA的分泌的RNA表达盒克隆至pEGEN4.1或pEGEN5.1载体(见表VIII)的多克隆位点而构建。该过程将Sec-RNA盒置于Pol III启动子序列(对于pEGEN4.1为人U6启动子，对于pEGEN5.1为人H1启动子)的下游和Pol III聚T终止序列的上游。该载体可以与pEGENFP载体联合转染至细胞内。替代性地，采用合适的限制酶将该Sec-shRNA的表达盒(例如，引物、启动子、来自表II的识别RNA发夹、shRNA和Pol III聚T终止序列)从pEGENSR质粒释放并连接至包含融合蛋白的pEGEN FP载体以创建最终质粒pBioR(1)。
通过各种CPP-RBD融合蛋白输送的各种Sec-shRNA的具体实例如表I所示，并进一步描述于USSN 61/160287和61/160288中(实施例1～20)，本文通过援引并入其全部内容。
此外，可以将不同的生物活性RNA序列(如反义序列、核酶、适体、等位酶、siRNA、miRNA或本文所述的任何其它生物活性分子)用于取代所示pEGENSR载体中的shRNA序列。
实施例3.生物反应器质粒pBioR(2)的构建以及由CPP-NCS-RBD融合蛋白对Sec-shRNA的输送
靶向来自表I和表VII的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-shRNA的输送也由质粒pBioR(2)完成，该质粒使用与实施例1和2中相同的方法来构建。pBioR 2编码融合蛋白，其包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的细胞穿透肽融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域。该融合蛋白在具有或没有α螺旋连接子或其它连接子域的情况下组装。使用实施例1和2中所述的方法将用于融合蛋白和用于Sec-shRNA的表达盒连接在来自表VIII的pEGEN质粒中。
实施例4.生物反应器质粒pBioR(3)的构建以及由CPP-NCS-RBD融合蛋白对Sec-shRNA的输送
靶向来自表I和表VII的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-shRNA的输送也由质粒pBioR(3)完成。质粒pBioR(3)使用与实施例1的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且与pBioR(2)相似，其不同之处在于其含有额外的编码靶向生物反应器细胞的Dicer蛋白的shRNA分子的表达盒。靶向Dicer的shRNA具有以下序列：TTGGCTTCCTCCTGGTTATGTTCAAGAGACATAACCAGGAGGAAGCCAA。[SEQ ID NO:49]
使用实施例1和2中所述的方法将用于融合蛋白和用于Sec-shRNA的表达盒连接在来自表VIII的pEGEN质粒中。靶向Dicer的shRNA从人H1启动子表达并以Pol-III聚T终止子终止。具有编码靶向Dicer蛋白的shRNA分子的额外表达盒的质粒的实例如图13所示。
实施例5.生物反应器质粒pBioR(14)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-shRNA的输送
靶向来自表I和表VII的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-shRNA的输送也由质粒pBioR(14)完成。质粒pBioR(14)使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且与pBioR(2)相似，其不同之处在于Sec-shRNA表达盒的位置。Sec-shRNA伴随包含来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域(其与来自表III的RNA结合域和来自表IV的细胞穿透肽融合)的融合蛋白。在该质粒中，Sec-shRNA采用置于5’未翻译区(UTR)中或置于融合蛋白的编码序列内的人工内含子编码。使用合适的限制位点将Sec-shRNA序列亚克隆至该人工内含子的剪接供体和剪接受体位点之间。多功能转录物从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止。具有此类构建的质粒实例如图11和12所示。
实施例6.生物反应器质粒pBioR(15)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-核酶的输送
靶向来自表I和表VII的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-核酶的输送由质粒pBioR(15)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建并且编码包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的细胞穿透肽融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-核酶包含来自表II的RNA识别元件和靶向表I和表VII所列基因靶标的任何mRNA转录物的RNA核酶。将用于融合蛋白和用于Sec-核酶的表达盒连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止，而Sec-核酶以人U6启动子表达并以Pol-III聚T终止子终止。
实施例7.生物反应器质粒pBioR(16)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-反义RNA(Sec-asRNA)的输送
靶向来自表I和表VI的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-asRNA的输送由质粒pBioR(16)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建并且编码包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的细胞穿透肽融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-asRNA包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列基因靶标的任何mRNA转录物互补的反义RNA。融合蛋白的表达盒被连接在pEGEN1.1质粒中且从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止。Sec-asRNA的表达盒被联结至pEGEN1.1质粒中并以SV40启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止。如实施例2所述，该Sec-asRNA的表达盒(引物、U6启动子、来自表II的识别RNA发夹、asRNA和Pol III聚T终止序列)由适当的限制酶从pEGEN1.1释放并被联结至包含融合蛋白的pEGEN 2.1/FP载体，以创建最终质粒pBioR(16)。
实施例8.生物反应器质粒pBioR(17)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-反义RNA(Sec-asRNA)的输送
靶向来自表I和表VII的任何基因靶标以及任何其它基因靶标的Sec-asRNA的输送由质粒pBioR(17)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建并且编码包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的细胞穿透肽融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-asRNA包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列基因靶标的任何mRNA转录物互补的反义RNA。融合蛋白和Sec-asRNA的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中且从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止。在该质粒中，Sec-asRNA被置于5’未翻译区(UTR)中或置于融合蛋白的编码序列内的人工内含子编码。该多功能转录物从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止。
实施例9.生物反应器质粒pBioR(18)的构建以及由NCS-RBD融合蛋白对Sec-适体的分泌
靶向表I和表VII所列胞外受体蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(18)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白从鸡β-肌动蛋白启动子表达并以人生长激素聚腺苷酸化信号终止，而Sec-适体以人U6启动子表达并以Pol-III聚T终止子终止。
实施例10.生物反应器质粒pBioR(19)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-适体的分泌
靶向表I和表VII所列任何细胞蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(19)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建并且编码包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的的细胞穿透肽融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞内蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例11.生物反应器质粒pBioR(20)的构建以及由NCS-RBD-CPP融合蛋白对Sec-适体的分泌由可诱导启动子表达。
靶向表I和表VII所列任何细胞蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(20)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域和来自表IV的的细胞穿透肽融合的来自Table V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞内蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体以相同方式构建并以表VIII中所列的可诱导的启动子表达。
实施例12.确认在细胞培养物中由可诱导体系中产生和分泌RNA-蛋白复合物的实验。
采用实施例11中描述的方法用可诱导pBioR表达载体或空载体对细胞进行转染。生物反应器细胞的成功产生是通过试验来确认的，该实验验证以下一种或多种小分子诱导物的加入：(1)融合蛋白的产物、(2)Sec-RNA的产物、(3)通过融合蛋白结合Sec-RNA和(4)RNA-蛋白复合物的成功分泌。通过将诱导子加入到细胞培养介质中诱导生物反应器组分之后，融合蛋白的产生可以通过基于RT-PCR和基于抗体的试验验证，所述基于RT-PCR的试验检测编码融合蛋白的质粒衍生mRNA转录物，所述基于抗体的试验检测融合蛋白本身。出于检测融合蛋白的目的，可以在融合蛋白的序列中包含可以被商售抗体识别的短“蛋白标签”。这些蛋白标签可用来验证生物反应器细胞的功能且并非必须包含在功能性生物反应器融合蛋白中。所述RNA-蛋白复合物的成功分泌可利用RT-PCR或qPCR试验检测胞外间隙中，或者在培养基细胞的情况下检测培养介质中的Sec-RNA来验证。通过改变培养介质组分、血清、细胞密度等将RNA分泌评估为诱导子浓度、诱导时间和诱导条件的函数。
实施例13.生物反应器质粒pBioR(21)的构建以及由NCS-RBD融合蛋白对自主输送Sec-shRNA的分泌。
靶向表1和表VII所列任何细胞蛋白以及其他任何细胞蛋白的Sec-shRNA的分泌由质粒pBioR(21)完成，其使用与实施例1和实施例2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别原件以及靶向表I和表VII所列的任何细胞内蛋白的来自表IX和shRNA序列的输送适体。融合蛋白和Sec-shRNA以实施例1和实施例2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例14.生物反应器质粒pBioR(22)的构建以及由NCS-RBD融合蛋白和膜相连生物反应器辅助蛋白CA125对Sec-适体的分泌。
靶向表I和表VII所列胞外受体蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(22)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白，并编码膜界生物反应器辅助蛋白，CA125。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接到pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例15.生物反应器质粒pBioR(23)的构建以及由NCS-RBD融合蛋白对包含CTE的自主输送Sec-shRNA的分泌。
靶向表I和表VII所列任何细胞蛋白以及其他细胞蛋白的Sec-shRNA分泌由质粒pBioR(23)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件、来自表XI的CTE、来自表IX的输送适体和靶向表I和表VII所列的胞内蛋白的shRNA序列。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例16.生物反应器质粒pBioR(24)的构建及由外排体域-RBD融合蛋白对Sec-适体的分泌。
靶向表I和表VII所列任何胞外受体蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(24)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的外排体联合蛋白域。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例17.生物反应器质粒pBioR(25)的构建及由外排体域-RBD融合蛋白分泌的自主输送Sec-shRNA。
靶向表I和表VII所列任何胞内蛋白以及其它胞内蛋白的Sec-shRNA的输送由质粒pBioR(25)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域的融合的来自表X的外排体联合蛋白域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例18.生物反应器质粒pBioR(26)的构建及由RNA解旋酶/膜通道孔复合物对Sec-适体的分泌。
靶向表I和表VII所列任何胞外受体蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(26)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含RNA结合域、RNA解旋酶蛋白域和来自表X的蛋白结合域的融合蛋白，也编码与第二蛋白结合域相融合的能结合第一蛋白结合域的膜通道蛋白域。伴随该特定融合蛋白的Sec-适体包含来自表II的RNA识别元件和与靶向表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例19.生物反应器质粒pBioR(27)的构建及由RNA解旋酶/膜通道孔复合物分泌的自主输送的Sec-shRNA。
靶向表I和表VII所列任何胞内蛋白以及其它胞内蛋白的Sec-shRNA的输送由质粒pBioR(27)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含RNA结合域、RNA解旋酶蛋白域和来自表X的蛋白结合域的融合蛋白，也编码与第二蛋白结合域相融合的能结合第一蛋白结合域的膜通道蛋白域。伴随该特定融合蛋白的Sec-shRNA包含来自表II的RNA识别元件、来自表IX的输送适体和与靶向表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的适体序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-shRNA以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例20.以制造大型RNA分子为目的的生物反应器质粒pBioR(28)的构建。
为收集和作为重组RNA试剂使用而向胞外间隙输送Sec-RNA由质粒pBioR(27)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-shRNA包含来自表II的RNA识别元件和大型RNA序列。融合蛋白和Sec-适体的表达盒被连接在pEGEN2.1质粒中。融合蛋白和Sec-shRNA以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例21.以功能性选择新型RNA适体为目的生物反应器质粒pBioR(29)的构建。
靶向表I和表VII所列任何胞外受体蛋白以及其它胞外受体蛋白的Sec-适体的输送由质粒pBioR(29)完成，其使用与实施例1和2的用于pBioR(1)构建的相同方法来构建，并且编码包含与来自表III的RNA结合域融合的来自表V的病毒类、原核类或真核类非经典分泌域的融合蛋白。伴随该特定融合蛋白的Sec-shRNA包含来自表II的RNA识别元件和与靶向表I和表VII所列的任何胞外受体蛋白的潜在RNA适体库。融合蛋白和Sec-适体以实施例1和2中所述用于pBioR(1)的相同方式构建并以与其相同的启动子表达。
实施例22.使用聚合物介导转染将生物反应器质粒向培养物中的HeLa细胞的施用
生物反应器细胞通过将pEGENFP和pEGENSR(见实施例2)在体外共转染至接受细胞系(例如HeLa细胞)内而产生。在制备用于由聚合物输送剂的转染时，HeLa细胞在六孔板中于DMEM+10％胎牛血清(总体积2mL)中培养至80％汇合的密度。从细胞除去生长培养基并以预热至37℃的仅1mL DMEM(无血清)替换。通过在DMEM中于室温温育20分钟来在输送试剂和pBioR质粒之间形成转染复合物(DNA和试剂浓度对于每次应用进行优化)。通过逐滴添加至每个培养物来讲转染复合物添加至HeLa细胞并返回37℃温育箱中。在5小时温育后，将DMEM+20％血清添加至转染培养基易产生最终浓度10％的血清和最终体积为2mL。瞬时转染细胞可待通过添加至靶细胞而用作生物反应器。
实施例23.使用聚合物介导转染将生物反应器质粒向培养物中细胞的施用
生物反应器细胞通过将pBioR质粒(本文申请其它部分和前述实施例中所述的任何质粒)在体外共转染至接受细胞系内而产生。用于产生瞬时转染的生物反应器细胞的转染方案与实施例22-25中用于产生基于生物反应器的HeLa细胞的方案相似。合适的培养物中的接受细胞的非限制性实例包括A549细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、NIH3T3细胞、Renka细胞、CT26细胞、PC-12细胞、Cos-1细胞、Cos-7细胞和CHO细胞。可以将实施例22-25中所述方法应用于这些培养细胞以及其它已知的确立细胞系。
实施例24.使用电穿孔介导转染将生物反应器质粒向培养物中的HeLa细胞的施用
通过借助电穿孔用pBioR质粒转染，从HeLa接受细胞产生生物反应器细胞。在制备用于电穿孔时，将HeLa细胞在100mm培养皿中于DMEM+10％胎牛血清(总体积15mL)中培养至80％汇合的密度。用胰蛋白酶将细胞从板孔释放并通过离心收集(500×g于4℃5分钟)。将细胞沉淀物重悬于生长培养基中并使用血细胞计数器测定细胞密度；用生长培养基调节最终体积以产生5×106细胞/mL。将细胞与20μgpBioR质粒一同转移至电穿孔皿并置于电极之间。电穿孔器在260V放电(电容＝1000μF，无限内阻)并使电穿孔皿静止2分钟。然后将经电穿孔的细胞转移至培养皿并用生长培养基润洗电穿孔皿2次。细胞在37℃的5％CO2中生长48小时。
通过如上所述用pBioR质粒转染可以从其它接受体细胞生产生物反应器细胞以用于产生基于生物反应器的HeLa细胞。合适的培养物中接受细胞的非限制性实例包括A549细胞、Jurkat细胞、HepG2细胞、NIH3T3细胞、Renka细胞、CT26细胞、PC-12细胞、Cos-1细胞、Cos-7细胞和CHO细胞。展现生物反应器细胞功能的测试如实施例27中所述。
实施例25.使用病毒介导转染将生物反应器质粒向培养物中的HeLa细胞的施用
病毒质粒从分离的质粒主链、病毒的结构和非结构组分的表达盒以及生物活性RNA的表达盒构建。表达盒的PCR扩增、表达盒向质粒主链的亚克隆、所得的产生载体的病毒的扩增和分离以及对质粒序列的后续验证均如实施例1所述进行。病毒载体从数种DNA病毒表达盒(如腺病毒和腺相关病毒(2-3、7、11、19、21)和单纯疱疹病毒(5、14-15、18))或RNA病毒表达盒(如慢病毒(6,20,22,24)、辛德毕斯病毒(9)、小鼠白血病病毒(10、12-13、16)或泡沫病毒(8、17))之一以及本申请其它部分和前述实施例所述的任何生物活性RNA分子来构建。对于每种病毒，将编码病毒外壳蛋白和促融合蛋白的结构基因亚克隆至任何pEGEN主链质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir1。单独地将编码聚合酶和辅助蛋白的非结构基因与生物活性RNA序列及融合蛋白序列偶联，并亚克隆至第二pEGEN质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir2。将质粒pVir1和pVir2共转染至接受体细胞以产生病毒生产细胞。然后可将病毒颗粒纯化并浓缩以用于将生物反应器表达盒施用至生物反应器细胞。
实施例26.使用聚合物介导转染将生物反应器质粒向培养物中的HeLa细胞的施用以及稳定细胞系的产生
生物反应器细胞如实施例22-25所述通过用pBioR质粒转染从HeLa接受细胞产生。通过在选择性培养基中延长生长来实现pBioR质粒在接受体细胞基因组内的稳定整合。用于稳定整合的pBioR质粒除pUC源和抗卡那霉素基因外还含有抗嘌呤霉素基因或G418/抗新霉素基因。让新转染的细胞在完整的非选择性培养基中恢复48小时。然后将这些细胞转移至选择性培养基并在37℃的5％CO2中生长并且每3天更换培养基。将各个具有稳定整合的质粒的细胞分离物移至个体板孔中并进行扩展。然后对扩展的细胞系的最佳生物反应器活性进行测试分析。展示生物反应器细胞功能的测试如实施例16中所述。
实施例27.用于证实细胞培养物中RNA-蛋白复合物的产生和分泌的测试
使用实施例22-25所述的方法以pBioR表达载体或空载体转染细胞。生物反应器细胞的成功产生由可验证一种或多种以下情况的测试所证实：(1)融合蛋白的产生，(2)Sec-RNA的产生，(3)Sec-RNA与融合蛋白的结合，和(4)RNA-蛋白复合物的成功分泌。融合蛋白的产生可以通过基于RT-PCR的测试和基于抗体的测试进行验证，所述基于RT-PCR测试检测源自质粒的编码融合蛋白mRNA转录物，所述基于抗体的测试检测融合蛋白自身。出于检测融合蛋白的目的，可以将由商购抗体所识别的短“蛋白标签”包含在融合蛋白的序列中。这些蛋白标签用于验证生物反应器细胞的功能，而不是必须包含在功能性生物反应器融合蛋白内的。
为检测源自质粒的mRNA转录物，使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)并根据制造商手册，从pBioR转染的细胞、空载体转染的细胞和未经转染的细胞(即HeLa细胞或本文所述或本领域已知的任何其他细胞)制备总RNA。使用聚T引物从总RNA制备cDNA库并用作PCR扩增用模板。在PCR反应中包含用于两种不同扩增反应的引物(其各自产生一种不同大小的产物)：(1)扩增来自内部对照基因(如β-肌动蛋白或GAPDH)的引物，和(2)扩增对于编码融合蛋白的mRNA具有特异性的序列的引物。将产物在于1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上或在于1×TBE中操作的10％丙烯酰胺凝胶上进行解析。通过用溴乙锭染色并用302nm处的紫外光照射，对未经转染的细胞(阴性对照)、用空载体(没有融合蛋白的主链载体)转染的细胞和潜在的生物反应器(即用pBioR转染的细胞)的产物进行比较。未经转染的对照细胞具有内部对照基因的单个PCR产物，而成功的生物反应器具有内部对照基因的产物和编码融合蛋白的转录物的产物。
对融合蛋白的直接检测通过从pBioR转染的细胞、空载体转染的细胞和未经转染的细胞以及这些细胞所生长的培养基收集总蛋白来完成。对每个样品通过丙酮沉淀浓缩总蛋白，并将浓缩的蛋白重悬在ELISA分析用天然缓冲液或蛋白印迹分析用变性缓冲液中。每个测试均采用标准方法和对于内部对照基因(β-肌动蛋白或GAPDH)具有特异性的抗体以及融合蛋白中存在的蛋白标签。如上所讨论，蛋白标签被包含在融合蛋白中作为用以验证生物反应器细胞的功能的便利手段。未经转染的对照细胞和空载体转染的对照细胞具有针对内部对照基因检测到的单个蛋白，而成功的生物反应器既具有内部对照蛋白也具有融合蛋白。
成功的Sec-RNA产生包括RNA的转录和该转录物从细胞核的输出。将RT-PCR测试用于显示源自质粒的Sec-RNA分子的产生，而细胞分级用于展示细胞质中RNA的累积。细胞分级采用PARIS RNA分离试剂盒(Ambion，产品号1921)根据制造商手册来进行。使用随机六聚体非特异性引物从分级的RNA制备cDNA库并将其用作PCR扩增的模板。在PCR反应中包含用于两种不同扩增反应的引物(其各自产生一种不同大小的产物)：(1)扩增来自内部对照基因(如β-肌动蛋白或GAPDH)的引物，和(2)扩增对于Sec-RNA具有特异性的序列的引物。将产物在于1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上或在于1×TBE中操作的10％丙烯酰胺凝胶上进行解析。通过用溴乙锭染色并用302nm处的紫外光照射，对空载体转染的细胞、未经转染的细胞(阴性对照)和潜在的生物反应器(即用pBioR转染的细胞)的产物进行比较。空载体转染的细胞和未经转染的对照细胞具有内部对照基因的单个PCR产物，而成功的生物反应器具有内部对照基因的产物和Sec-RNA的产物。
图16显示了对Sec-RNA和融合蛋白的表达的确认的实验结果。对于图16A中所述的分泌RNA报告转录物分析，用pE3.1 Sec-报告子(图15A)转染CT26细胞。48小时后，使用Quigen的RNEasy试剂盒根据制造商推荐方案从未经转染的对照细胞和转染的生物反应器细胞收集总细胞RNA，并使用RT-PCR扩增经纯化的RNA并在3％低熔点琼脂糖凝胶(1×TBE)上分离。sec-RNA的RT-PCR反应包括用于扩增18SrRNA(内部对照，196bp产物)和分泌的RNA报告子(100bp产物)的探针和引物。未经转染的对照细胞(“U”)仅显示18S rRNA内部对照(18S)，而转染的细胞显示18S rRNA产物和亲本报告子RNA产物(“R”)(对应于仅有质粒)或者分泌的报告子RNA产物(“SR”)(对应于质粒和Sec-RNA序列插入物)。图16B显示了融合蛋白表达分析，其中用表达生物反应器融合蛋白的质粒转染CT26细胞。48小时后，将细胞收集在TENT缓冲液中，煮沸5分钟，并在16,000×G旋转15分钟以除去细胞残留物和允许收集细胞裂解物(总蛋白)。将来自未经转染的细胞和用pE3.1 Sec-报告子以及pE1.1 TAT+(与蛋白N RNA结合域和6×组氨酸表位标签融合的TAT)或pE2.1TAT+(与蛋白N RNA结合域和6×组氨酸表位标签融合的TAT)转染的细胞的细胞裂解液等分试样与阳性对照蛋白一同点在PVDF膜上以对抗体进行印迹。用显色底物将印迹显影并用图像存档中心记录。
通过经由上述肽标签对RNA-蛋白复合物的免疫沉淀显示出Sec-RNA分子与融合蛋白的结合。将对于内部对照基因(β-肌动蛋白或GAPDH)或者融合蛋白中存在的蛋白标签具有特异性的抗体与蛋白-A琼脂糖(PAS)珠或蛋白-G琼脂糖(PGS)珠偶联。将珠在细胞裂解缓冲液中再水化并将抗体通过与珠在4℃过夜温育来偶联。将非特异性抗体(通常为免疫前血清)用作免疫沉淀测试的阴性对照。将偶联有抗体的珠悬出溶液(1500×g，5分钟)，除去上清液，并用细胞裂解缓冲液洗涤偶联有抗体的珠。从pBioR转染的细胞、空载体转染的细胞和未经转染的细胞以及这些蛋白所生长的培养基制备蛋白。在天然细胞裂解缓冲液中收集蛋白以便维持RNA-蛋白复合物，其确切组成根据具体纯化情况进行调节。典型的细胞裂解缓冲液组成20mM Tris(pH7.5)、150mMNaCl、1mM EDTA和0.05％Nonidet P-40。将蛋白提取物添加至偶联有抗体的珠并在对于每个反应优化过的条件下进行免疫沉淀。典型的沉淀在室温温育2-4小时。将分离的RNA-蛋白复合物旋出溶液并收集上清液作为沉淀输入物(precipitation input)。反复洗涤珠以除去非特异性结合的蛋白；对于每次沉淀根据经验确定洗涤总次数。用与融合蛋白标签匹配的肽将分离的复合物从珠洗出，所述肽竞争抗体上存在的结合位点。然后如上所述通过RNA印迹或通过RT-PCR检测分离的RNA。
通过在胞外间隙中或在培养基中(培养物中细胞的情形中)检测Sec-RNA来验证成功的RNA-蛋白复合物的分泌。如上所述，可以通过免疫沉淀将无损的RNA-蛋白复合物从培养基分离，或可以使用Tri-Reagent根据制造商手册(Sigma-Aldrich，产品号T9424)来制备总RNA。Sec-RNA通过RNA印迹或通过RT-PCR检测。
图17显示了证实RNA-蛋白复合物从生物反应器细胞分泌的实验结果。在转染48小时后，使用Qiagen的RNEasy试剂盒根据制造商推荐方案来收集总细胞RNA，其来自未经转染的对照CT26细胞和用pE3.1 Sec-报告子和表达分泌RNA的pE1TAT-RBD质粒转染的CT26细胞。也从细胞培养基收集RNA并使用RNAeasy试剂盒纯化。将纯化的RNA用作RT-PCR扩增反应的膜拜，并将扩增产物连同DNA尺寸标准物在3％低熔点琼脂糖凝胶(1×TBE)上分离。采用用于18S rRNA(内部对照)和分泌的RNA报告子的探针和引物来进行RT-PCR。图17A和17B显示了采用pE3.1 Sec-报告子以及pE1.1 TAT(+)(与正确RBD融合的TAT)或pE1.1 TAT(-)(与阴性对照RBD融合的TAT)的转染测试的结果。图17A的左图显示了收集自用亲本报告子质粒(“R”)、含有sec-RNA序列插入物的报告子质粒(“SR”)、与pE1.1 TAT(+)或与pE1.1TAT(-)共转染的sec-RNA报告子质粒转染的细胞的RT-PCR产物。图17A的右图显示了来自用sec-RNA报告子质粒和pE1.1 TAT(+)或pE1.1TAT(-)共转染的细胞的细胞裂解物(“C”)和胞外培养基样品(“M”)。如图所示，在用pE3.1 Sec-报告子和pE1TAT(+)质粒转染的细胞中，RNA-蛋白复合物被分泌至培养基中，而在用pE3.1 Sec-报告子和pE1TAT(-)质粒(TAT与阴性RBD对照融合)转染的细胞中，融合蛋白(sec-RNA)在培养基中不存在。图25(A和B)显示在CHO细胞内进行的相似研究结果表明胞外RNA的时间依赖性积累。图26A显示从CHO细胞内的RNA分泌物依赖于在融合蛋白中有合适的病毒类、原核类或真核类非经典分泌肽。采用Qiagen’s RNEasy试剂盒收集和纯化来自HeLa细胞的RNA，所述HeLa细胞或者用pE1.1FGF1-蛋白N/OSM适体质粒，或者用表达分泌的RNA适体和生物反应器融合蛋白的的pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白-N/OSM适体质粒进行转染。RNA也从细胞培养物介质中收集和纯化，并与细胞裂解而产生的RNA一起作为cDNA合成的模板以供随后进行qPCR分析。对分泌的RNA适体或18S rRNA(内部对照)具有特异性的引物和探针被用来量化每次从生物反应器细胞中释放的量，并作为生物反应器融合蛋白的函数。如图所示，在用pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白-N/OSM适体质粒转染的细胞中，RNA-蛋白复合物被分泌到介质中，而在用pE1.1FGF1-蛋白N/OSM适体质粒转染的细胞中，融合蛋白(sec-RNA)并不存在于介质中。图26B作为对照研究显示胞外RNA的聚集不是由细胞裂解造成的。
实施例28.对荧光素酶/碱性磷酸酶报告基因的CPP-介导分泌活性的测试
图14A是显示产生生物反应器细胞并使用CPP-荧光素酶/CPP-碱性磷酸酶报告子体系测试其分泌活性的示例性转染测试的非限制性示意图。将细胞穿透肽融合至荧光素酶报告基因的融合蛋白盒通过PCR产生。这些PCR产物包含处在DNA的每个末端的限制位点以便有助于亚克隆至pEGEN1.1质粒内、将融合蛋白盒置于SV40启动子和hGH聚腺苷酸尾部序列之间。如实施例22-25所述，将所得质粒体外转染至许多不同的细胞类型以产生生物反应器报告细胞。从生长培养基和细胞收集总蛋白，并在两者中测定荧光素酶活性以确立细胞内部和外部的经标记的荧光素酶分子的分布。通过与仅包含荧光素酶/碱性磷酸酶的对照蛋白和包含与乱序的CPP域融合的荧光素酶/碱性磷酸酶的对照蛋白进行比较，确立了分泌的要求。
图14B表示经CPP介导的荧光素酶报告蛋白从用报告质粒转染和在体外培养的细胞的分泌。CT26细胞由表达荧光素酶或TAT-荧光素酶融合蛋白的质粒转染。48小时后，用PBS替换细胞培养基并将细胞在37℃额外温育3小时。收集PBS上清液并在TENT缓冲液中将细胞裂解。使用标准方法对相等量的溶剂化细胞蛋白和PBS上清液进行荧光素酶活性测定。细胞组分和上清液组分中呈现的相对荧光素酶活性作为在两个组分中观察到的总荧光素酶活性的百分比显示。荧光素酶报告蛋白中TAT细胞穿透肽的添加使荧光素酶活性分布偏移离开转染的细胞而进入上清液。
实施例29.对CPP介导的分离GFP报告基因的输送的测试
图18是显示产生并用GFP报告子体系测试生物反应器细胞的输入活性的示例性转染测试的非限制性示意图。将细胞穿透肽融合至分离GFP报告体系的分离域的融合蛋白盒通过PCR产生。单独的PCR反应产生编码GFP互补片段的蛋白盒。这些PCR产物每个都包含处在DNA的每个末端的限制位点以便有助于亚克隆至pEGEN1.1质粒内、将融合蛋白盒和GFP互补片段盒置于SV40启动子和hGH聚腺苷酸尾部序列之间。将所得质粒在体外独立转染至细胞内以产生表达CPP-GFP融合蛋白的生物反应器报告细胞和表达GFP互补片段的靶细胞。通过将生物反应器细胞与靶细胞混合来开始反应。在通过所得GFP信号将活化域和GFP互补片段对接后，可以检测CPP融合蛋白从生物反应器细胞的分泌和随后向靶细胞的输入。
实施例30.出于培养物中mRNA转录物敲弱的目的的生物反应器细胞转染试剂向HeLa细胞的应用
出于敲弱Sec-RNA分子所靶向的基因产物的目的，将生物反应器细胞(如实施例22-25所生成的并使用实施例27所述方法证实的那些)直接应用于靶细胞。通过所关注的基因靶标和靶细胞性质确定转染中所用的具体pBioR质粒和接受细胞。在本实施例中，HeLa靶细胞用分泌Sec-shRNA-融合蛋白复合物(具有靶向VEGF转录物的shRNA)的NIH3T3生物反应器细胞转染。在使用源自小鼠的生物反应器转染人源靶细胞时，可以通过使用物种特异性引物集合来观察到人靶细胞中VEGF转录物的敲弱。也可使用对于人蛋白具有特异性的VEGF抗体在培养基中检测人细胞中VEGF的耗尽和随后所分泌蛋白量的减少。
如实施例22-25所述，通过用pBioR质粒转染NIH3T3细胞从NIH3T3接受细胞产生生物反应器细胞。也可采用实施例27所述的测试验证生物反应器功能。没有必要在瞬时转染NIH3T3细胞后分离或纯化生物反应器细胞。HeLa细胞在6孔板中于DMEM+10％胎牛血清(总体积2mL)中培养至50％汇合的密度。通过胰蛋白酶化和离心(500xg，5分钟)来收集生物反应器细胞。将细胞沉淀物重悬在用于HeLa靶细胞的相同生长培养基中，并用血细胞计数器测定细胞密度。将生物反应器细胞添加至HeLa靶细胞，并将合并的培养物在37℃的5％CO2中温育。根据经验对于每个细胞和基因靶标体系确定生物反应器细胞与靶细胞的最佳比例。在添加生物反应器细胞48-96小时后从每个细胞培养物收集RNA或蛋白样品，以便分别测试mRNA转录物或蛋白的敲弱，如实施例27所述。
实施例31.生物反应器介导的RNA适体向胞外间隙的输送
本实施例描述了确定分泌适体(例如，靶向制瘤素M蛋白的适体，其为gp130受体介导的信号转导途径的激活子)的生物反应器细胞的分泌活性的示例性转染测试(见图19)。所述测试采用报告子体系和分泌的靶向制瘤素M蛋白的RNA适体。用于融合蛋白的表达质粒(pEGENFP,实施例2)和用于靶向制瘤素M蛋白的RNA适体的表达质粒(pEGENSR,实施例2)被体外转染至许多不同细胞类型以产生分泌RNA适体的生物反应器细胞，如实施例22-25所述。在响应于gp130介导的STAT3信号转导途径的启动子元件(SABiosciences,CignalReporter Assays，目录号CCS-9028)的控制下表达荧光素酶蛋白蛋白的报告质粒被体外转染至HepG2细胞(gp130表达细胞)以产生靶标(报告子)细胞。48小时后，从分泌制瘤素M用适体的生物反应器细胞收集细胞培养基并与重组制瘤素M蛋白(0.2ng/mL-20ng/mL)室温温育3小时以使分泌的适体与靶蛋白结合。然后将培养基转移至靶标(报告子)细胞并在37℃培养24小时。对照包括：直接向报告子细胞添加重组制瘤素M蛋白、与来自未经转染的细胞的培养基温育的制瘤素M、与来自仅用表达错配RNA结合域的细胞的培养基温育的制瘤素M以及用从pEGENSR转染细胞纯化的RNA适体处理的制瘤素M。荧光素酶测试如实施例28中所述进行。
如图27A所示，与含有靶向制瘤素M的适体的培养基温育的报告细胞会比仅与制瘤素M温育的报告细胞或与制瘤素M及对照培养基温育的报告细胞具有更低的荧光素酶活性。使用相似方法和适当的荧光素酶或其它报告载体体系可以对来自生物反应器细胞的其它适体的分泌进行测试。图27B显示荧光素酶活性作为OSM聚集的函数，以及图27C显示荧光素酶作为激活时间的函数。来自生物反应器细胞的其他适体的分泌可以用与合适的荧光素酶或其他报告子载体体系相似的方法来试验。
通过用实施例22-25中的pBioR质粒转染的HeLa受体细胞来产生生物反应器细胞。通过在选择性培养物介质中继续生长实现pBioR质粒稳定地整合到受体细胞的基因组中。用于稳定整合的包含pUC源以及卡那霉素抗性基因的pBioR质粒与包含嘌呤霉素抗性基因的质粒进行共转染。新转染的细胞可以在完整的无选择性的的培养基介质中48小时后重新收获。所述这些细胞然后可以被转移到选择性培养物介质中，在5％的CO2、37℃的培养物介质中生长，介质每三天更换一次。具有稳定整合质粒的独立细胞分离体被转移到独立板孔中并扩张。
如图28A所示，CHO细胞和用pE1.1半乳糖凝集素-1-蛋白N/OSM适体质粒稳定转染的CHO细胞，与用OSM/STAT反应性荧光素酶报告稳定转染的HeLa细胞共同植板。稳定的生物反应器细胞和OSM反应性用靶细胞用最终浓度为5ng/ml的重组OSM蛋白处理。细胞在37℃培养5小时然后被收集到TENT缓冲液(加入蛋白酶抑制剂混合物)中并通过涡流被裂解。细胞残留物可以通过(15分钟16,000x g)离心分离而清除，收集上清液并用标准方法测量荧光酶活性。图28B显示了制瘤素-M信号的抑制作用，其为共植板后时间的函数。
实施例32.生物反应器介导的RNA适体向胞外间隙的输送
本实施例描述了确定分泌适体(例如，靶向HER3的适体，其为gp130受体介导的信号转导途径的激活子)的生物反应器细胞的分泌活性的示例性转染测试(见图19)。所述测试采用报告子体系和分泌的靶向HER3蛋白的RNA适体。用于融合蛋白的表达质粒(pEGENFP,实施例2)和用于靶向制瘤素M蛋白的RNA适体的表达质粒(pEGENSR,实施例2)被体外转染至许多不同细胞类型以产生分泌RNA适体的生物反应器细胞，如实施例22-25所述。表达HER3受体蛋白(例如MCF7)的报告细胞单独培养。48小时后，从分泌HER3用适体的生物反应器细胞收集细胞培养基并转移至HER3表达报告子细胞并在37℃温育24-72小时。对照包括：添加来自未经转染的细胞的培养基、添加来自仅用RNA适体表达质粒(pEGENSR)转染的生物反应器细胞的培养基、来自表达错配RNA结合域的细胞和具有pEGENSR转染细胞纯化的RNA适体的培养基。使用Promega的CellTiter96水性非放射活性细胞增殖测试(目录号G5421)根据制造商说明来监测细胞生长。与含有靶向HER3的适体的培养基温育的报告细胞会比与对照培养基温育的报告细胞显示出更低的细胞生长。使用相似方法和适当的报告载体体系可以对来自生物反应器细胞的其它适体的分泌进行测试。
例如，图29总结了利用HER3靶向适体进行研究的结果。根据图29A所示，在五天的生长期中每天都要更换培养基介质。用荧光显微镜完成生长抑制的初步表征，用来自阴性对照生物反应器细胞和活性反应器细胞的培养基或培养基+乳糖处理的细胞的代表性帧图在图29B中示出。细胞随后被收集并裂解，检测GFP衍生荧光信号。与荧光图像一致，在同对照图图29C和图29D比较时，用来自于活性生物反应器体系的培养基介质处理的细胞中量化的GFP荧光明显较少。
实施例33.生物反应器介导的shRNA向靶细胞细胞质的输送
本实施例描述了确定生物反应器细胞的分泌活性和后续向靶细胞细胞质的抑制性shRNA输送的示例性转染测试(见图21)。所述测试采用报告子体系和分泌的靶向HER3蛋白的RNA适体。用于融合蛋白的表达质粒(pEGENFP,实施例2)和用于shRNA的表达质粒(pEGENSR,实施例2)被体外转染至许多不同细胞类型以产生生物反应器细胞，如实施例22-25所述。表达shRNA靶向的mRNA转录物的靶细胞单独培养。48小时后，从生物反应器细胞收集细胞培养基并转移至靶细胞并在37℃温育24-72小时。对照包括：添加来自未经转染的细胞的培养基、来自仅用shRNA表达质粒(pEGENSR)转染的生物反应器细胞的培养基、来自表达错配RNA结合域的细胞和具有从pEGENSR转染细胞纯化的shRNA的培养基。从靶细胞制备总RNA并如实施例27所述进行RT-PCR分析。通过与未经靶向的内部对照基因比较来评估靶细胞的敲弱。替代性地，如果RT-PCR测试中所用引物和探针不识别对应的生物反应器细胞中的转录物，可以在实验期间将生物反应器细胞和靶细胞共培养。这最容易通过对生物反应器细胞使用源自一个物种的细胞系而对靶细胞使用来自另一个物种的细胞系来实现。在该情形中，可以在转染后24小时收集生物反应器细胞并与靶细胞混合以便直接通过RT-PCR分析来测试生物反应器活性。表达shRNA靶向的mRNA转录物的靶细胞分开培养。可以使用相似的方法和适当的靶细胞来对来自生物反应器细胞的其他shRNA的分泌进行测试。
实施例34.pBioR表达载体向细胞的离体施用
如实施例22-25所述，通过用pBioR质粒转染从NIH3T3接受细胞生成生物反应器细胞。采用实施例27所述的测试验证生物反应器功能。在本实施例中，NIH3T3生物反应器细胞分泌具有靶向VEGF转录物的shRNA的Sec-shRNA-融合蛋白复合物。将生物反应器细胞与SCCVII靶细胞(小鼠鳞状细胞癌系)混合并通过皮下注射将混合物移植到裸鼠(免疫缺陷型)的后胁内。生物反应器活性通过评估与对照相比的移植位点周围的组织中VEGF转录物和蛋白水平来监测。也可通过将生物反应器/SCCVII移植物中的肿瘤生长与仅接受SCCVII细胞或接受SCCVII细胞与非功能性生物反应器细胞(非特异性shRNA或输送缺陷型融合蛋白)的对照小鼠进行比较来在体内评估生物反应器功能。
实施例35.生物反应器细胞向小鼠肌肉组织的体内施用
如实施例22-25所述，通过用pBioR质粒转染从原生小鼠成肌细胞接受细胞生成生物反应器细胞。采用实施例27所述的测试验证生物反应器功能。在本实施例中，生物反应器细胞分泌具有靶向肌肉生长抑制素(骨骼肌生长阴性调节物)的mRNA转录物的shRNA的Sec-shRNA-融合蛋白复合物。将生物反应器细胞移植至mdx小鼠的胫骨肌肉内(Li S,Kimura E,Ng R,Fall BM,Meuse L,Reyes M,FaulknerJA,Chamberlain JS.,A highly functional mini-dystrophin/GFP fusion genefor cell and gene therapy studies of Duchenne muscular dystrophy.,Hum Mol Genet.2006May15；15(10):1610-22)。生物反应器活性通过评估移植位点周围的组织中肌肉生长抑制素转录物和蛋白水平来监测。使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)从采集自未受处理小鼠、移植有分泌非特异性Sec-shRNA的生物反应器细胞的小鼠和移植有分泌靶向肌肉生长抑制素转录物的shRNA的生物反应器细胞的小鼠的胫骨肌肉制备RNA和蛋白样品。然后可如实施例27所述分别通过RT-PCR或ELISA评估肌肉生长抑制素转录物和蛋白的相对水平。也可通过对生物反应器移植物中的体重、肌肉重量、肌肉尺寸和肌肉强度与未接受生物反应器细胞或接受非功能性生物反应器细胞的对照小鼠的比较来进行生物反应器功能的体内评估(Bogdanovich S,Krag TO,Barton ER,Morris LD,Whittemore LA,Ahima RS,Khurana TS.,Functionalimprovement of dystrophic muscle by myostatin blockade.,Nature.2002Nov28；420(6914):418-21)。
实施例36.生物反应器细胞向小鼠神经组织的体内施用
如实施例22-25所述，通过用pBioR质粒转染从小鼠神经干细胞(mNSC)生成生物反应器细胞。采用实施例27所述的测试验证生物反应器功能。在本实施例中，生物反应器细胞分泌具有靶向突变亨廷顿(htt)蛋白的CAG重复片段扩展物的mRNA转录物的shRNA的Sec-shRNA-融合蛋白复合物。将生物反应器细胞移植至亨廷顿病的小鼠模型的脑中，以评估生物反应器介导的对htt蛋白突变形式的mRNA转录物的敲弱的效力。使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)从采集自未受处理小鼠、移植有分泌非特异性Sec-shRNA的生物反应器细胞的小鼠和移植有分泌靶向突变亨廷顿蛋白转录物的shRNA的生物反应器细胞的小鼠的小鼠脑组织制备RNA样品。然后可如实施例27所述通过RT-PCR评估亨廷顿蛋白转录物的相对水平。亨廷顿病的小鼠模型也展现出纹状体组织中的异常蛋白积累和步伐异常，这均可提供生物反应器活性的生理学解读。参见Yang CR,Yu RK.,Intracerebraltransplantation of neural stem cells combined with trehalose ingestionalleviates pathology in a mouse model of Huntington's disease.,J Neurosci Res.2008Aug5；87(1):26-33.；DiFiglia M,Sena-Esteves M,Chase K,SappE,Pfister E,Sass M,Yoder J,Reeves P,Pandey RK,Rajeev KG,Manoharan M,Sah DW,Zamore PD,Aronin N.,Therapeutic silencing ofmutant huntingtin with siRNA attenuates striatal and corticalneuropathology and behavioral deficits.,Proc Natl Acad Sci U S A.2007Oct23；104(43):17204-9。
实施例37.生物反应器细胞向人滑液的输送
如实施例22-25所述，通过用pBioR质粒转染从人滑液成纤维细胞生成生物反应器细胞。采用实施例27所述的测试验证生物反应器功能。在本实施例中，成纤维细胞生物反应器细胞分泌具有靶向IL-1β、IL-6或IL-18促炎性细胞因子的mRNA转录物的shRNA的Sec-shRNA-融合蛋白复合物。将转染细胞扩展用于注射瞬时转染的细胞或通过与抗生素选择性生长而产生稳定细胞。将生物反应器细胞重悬于1×PBS(没有Ca2+或Mg2+)，并注射至关节炎患者的关节内(Evans CH,RobbinsPD,Ghivizzani SC,Wasko MC,Tomaino MM,Kang R,Muzzonigro TA,Vogt M,Elder EM,Whiteside TL,Watkins SC,Herndon JH.,Gene transferto human joints:progress toward a gene therapy of arthritis.,Proc NatlAcad Sci U S A.2005Jun14；102(24):8698-703)。由成纤维细胞生物反应器细胞产生的Sec-shRNA-融合蛋白复合物会被输送至产生白细胞介素的单核细胞以减少滑液中存在的细胞因子的量。通过监测滑液中存在的IL-1β、IL-6或IL-18和TNFα蛋白的量以及疾病的生理学迹象来评估生物反应器功能(Khoury M,Escriou V,Courties G,Galy A,Yao R,Largeau C,Scherman D,Jorgensen C,Apparailly F.,Efficient suppressionof murine arthritis by combined anticytokine small interfering RNAlipoplexes.,Arthritis Rheum.2008Aug；58(8):2356-67)。
实施例38.病毒载体的构建
从分离的质粒主链、病毒的结构性和非结构性组分的表达盒和生物活性RNA的表达盒来构建病毒载体。表达盒的PCR扩增、表达盒向质粒主链的亚克隆、所得的产生载体的病毒的扩展和分离以及后续对质粒序列的验证均如实施例1所述进行。病毒载体从数种DNA病毒表达盒(如腺病毒和腺相关病毒(2-3、7、11、19、21)和单纯疱疹病毒(5、14-15、18))或RNA病毒表达盒(如慢病毒(6,20,22,24)、辛德毕斯病毒(9)、小鼠白血病病毒(10、12-13、16)或泡沫病毒(8、17))之一以及本申请其它部分和前述实施例所述的任何生物活性RNA分子来构建。对于每种病毒，将编码病毒外壳蛋白和促融合蛋白的结构基因亚克隆至任何pEGEN主链质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir1。单独地将编码聚合酶和辅助蛋白的非结构基因与生物活性RNA序列及融合蛋白序列偶联，并亚克隆至第二pEGEN质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir2。pVir2内的启动子序列的排列可能因不同病毒主链而有所不同。病毒非结构基因和生物活性RNA分子的模板可以从天然病毒的内源性的或来自表VIII的普通或独立启动子序列表达。将质粒pVir1和pVir2共转染至接受体细胞以产生病毒生产细胞。
成功的病毒生产细胞的产生可以通过许多不同实验测试来验证。病毒结构基因的表达可以使用采用对于病毒转录物特异的引物的RT-PCR以及采用对病毒蛋白特异的抗体的ELISA来评估。病毒非结构基因的表达可以通过采用对病毒转录物特异的引物以及采用将非结构基因与生物活性RNA桥连的引物的RT-PCR来进行评估。病毒颗粒的分泌可以通过收集其中生长有病毒生产细胞的培养基、从该培养基分离蛋白、DNA或RNA然后使用ELISAs、PCR或RT-PCR对病毒蛋白或核酸进行测试。通过利用携带辅助病毒的细胞系的噬菌斑测试可以检测功能性病毒颗粒。
实施例39.病毒包装细胞向培养物中的靶细胞的施用
如实施例22-25所述，通过用pVir质粒转染从MDCK接受体细胞生成病毒包装细胞。采用实施例27所述的测试验证病毒包装功能。在该实施例中，病毒包装细胞产生携带有靶向VEGF蛋白的shRNA的复制缺陷性病毒。这些病毒生产细胞用于敲弱HeLa细胞中的VEGF蛋白，从而提供用于区分病毒生产性小鼠细胞与人类靶细胞的机制。人细胞中VEGF mRNA转录物的耗尽和后续分泌蛋白量的减少可以通过在RT-PCR中使用物种特异性引物集合和在ELISA中使用物种特异性抗体分别进行检测。HeLa细胞在6孔板中于DMEM+10％胎牛血清(总体积2mL)中培养至50％汇合的密度。通过胰蛋白酶化和离心(500×g，5分钟)来收集病毒包装细胞。将细胞沉淀物重悬在用于HeLa靶细胞的相同生长培养基中，并用血细胞计数器测定细胞密度。将病毒包装细胞添加至HeLa靶细胞，并将合并的培养物在37℃的5％CO2中温育。根据经验对于每个细胞和基因靶标体系确定病毒包装细胞与靶细胞的最佳比例。在添加病毒包装细胞48-96小时后从每个细胞培养物收集RNA或蛋白样品，以便分别测试mRNA转录物或蛋白的敲弱。
实施例40.用于确认细胞培养物中重组病毒的产生和分泌的测试
采用实施例22-25所述的方法，使用pVir表达载体或空载体转染细胞。病毒包装细胞的成功产生由可验证一种或多种以下情况的测试所证实：(1)病毒包装组分的产生，(2)含有生物活性RNA模板或分子的部分病毒基因组的产生，(3)Sec-RNA在病毒颗粒内的包封，和(4)病毒颗粒从病毒生产细胞的成功释放。病毒蛋白组分的产生可以通过检测源自质粒的编码所述蛋白的mRNA转录物的基于RT-PCR的测试和检测蛋白自身的基于抗体的测试进行验证。出于检测融合蛋白的目的，可以将由商购抗体所识别的短“蛋白标签”包含在病毒蛋白的序列中。这些蛋白标签用于验证病毒生产细胞的功能，而不是必须包含在功能性病毒颗粒内的。
为检测源自质粒的mRNA转录物，使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)并根据制造商手册，从pVir转染的细胞、空载体转染的细胞和未经转染的细胞(即HeLa细胞或本文所述或本领域已知的任何其他细胞)制备总RNA。使用聚T引物从总RNA制备cDNA库并用作PCR扩增用模板。在PCR反应中包含用于两种不同扩增反应的引物(其各自产生一种不同大小的产物)：(1)扩增来自内部对照基因(如β-肌动蛋白或GAPDH)的引物，和(2)扩增对于编码融合蛋白的mRNA具有特异性的序列的引物。将产物在于1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上或在于1×TBE中操作的10％丙烯酰胺凝胶上进行解析。通过用溴乙锭染色并用302nm处的紫外光照射，对未经转染的细胞(阴性对照)、用空载体(没有融合蛋白的主链载体)转染的细胞和潜在的病毒生产细胞(即用pVir转染的细胞)的产物进行比较。未经转染的对照细胞具有内部对照基因的单个PCR产物，而成功的生物反应器具有内部对照基因的产物和编码融合蛋白的转录物的产物。
对病毒蛋白的直接检测通过从pVir转染的细胞、空载体转染的细胞和未经转染的细胞以及这些细胞所生长的培养基收集总蛋白来完成。对每个样品通过丙酮沉淀浓缩总蛋白，并将浓缩的蛋白重悬在ELISA分析用天然缓冲液或蛋白印迹分析用变性缓冲液中。每个测试均采用标准方法和对于内部对照基因(β-肌动蛋白或GAPDH)具有特异性的抗体以及病毒蛋白中存在的蛋白标签。如上所讨论，蛋白标签被包含在病毒蛋白中作为用以验证病毒生产细胞的功能的便利手段。未经转染的对照细胞和空载体转染的对照细胞具有针对内部对照基因检测到的单个蛋白，而成功的病毒生产细胞具有内部对照蛋白和病毒蛋白。
成功的含有生物活性RNA模板或分子的部分病毒基因组的产生可以通过对DNA或RNA产物的扩增来验证。将RT-PCR测试用于显示源自部分病毒基因组的质粒的产生，而细胞分级用于展示该核酸在细胞质中的累积。细胞分级采用PARIS RNA分离试剂盒(Ambion，产品号1921)根据制造商手册来进行。使用随机六聚体非特异性引物从分级的RNA制备cDNA库并将其用作PCR扩增的模板。在PCR反应中包含用于两种不同扩增反应的引物(其各自产生一种不同大小的产物)：(1)扩增来自内部对照基因(如β-肌动蛋白或GAPDH)的引物，和(2)扩增对于部分病毒基因组具有特异性的序列的引物。将产物在于1×TAE中操作的2％琼脂糖凝胶上或在于1×TBE中操作的10％丙烯酰胺凝胶上进行解析。通过用溴乙锭染色并用302nm处的紫外光照射，对空载体转染的细胞、未经转染的细胞(阴性对照)和潜在的病毒生产细胞的产物进行比较。空载体转染的细胞和未经转染的对照细胞具有内部对照基因的单个PCR产物，而成功的病毒生产细胞具有内部对照基因的产物和部分病毒基因组。
部分病毒基因组和抑制性RNA模板或分子的包封通过经CsCl梯度超速离心对病毒颗粒的分离来展示。从pVir转染的、空载体转染的和未经转染的细胞收集病毒颗粒并对其进行CsCl梯度纯化。从分离的病毒颗粒制备核酸并将其用作PCR分析(DNA病毒主链)或RT-PCR(RNA病毒主链)的模板。通过在胞外间隙或培养基(培养物中细胞的情形)中的病毒蛋白或部分病毒基因组来验证病毒颗粒的成功释放。无损的病毒颗粒可以从培养基纯化并浓缩，并将核酸纯化和用作PCR或RT-PCR分析的模板，如上所述。
实施例41.产生携带有完整生物反应器盒的重组病毒的病毒载体在细胞培养物中的构建
从分离的质粒主链、病毒的结构性和非结构性组分的表达盒以及生物活性RNA和融合蛋白的表达盒来构建病毒载体。表达盒的PCR扩增、表达盒向质粒主链的亚克隆、所得的产生载体的病毒的扩展和分离以及后续对质粒序列的验证均如实施例1所述进行。这些病毒载体利用DNA病毒(实施例25中所列的任何DNA病毒)从而病毒颗粒携带生物反应器表达盒。对于每种病毒，将编码病毒外壳蛋白和促融合蛋白的结构基因亚克隆至任何pEGEN主链质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir1。单独地将编码聚合酶和辅助蛋白的非结构基因与生物活性RNA序列及融合蛋白序列偶联，并亚克隆至第二pEGEN质粒以便从Pol-II启动子序列表达从而产生pVir3。将质粒pVir1和pVir3共转染至接受体细胞以产生病毒生产细胞。使用实施例22-25所述的方法将细胞用pVir表达载体或空载体转染。
实施例42.用于证实携带有完整生物反应器盒的重组病毒在细胞培养物中的产生和分泌的测试
用pVir质粒转染的细胞成为病毒生产细胞并产生病毒颗粒，所述病毒颗粒在感染靶细胞后将该靶细胞转化为生物反应器细胞。病毒生产细胞的成功产生由可验证一种或多种以下情况的测试所证实：(1)病毒蛋白组分的产生，(2)含有生物活性RNA模板或分子以及融合蛋白模板的部分病毒基因组的产生，(3)生物活性RNA模板和融合蛋白模板在病毒颗粒内的包封，(4)病毒颗粒从病毒生产细胞的成功释放，和(5)受感染的靶细胞内生物反应器活性的成功产生。病毒蛋白组分的产生使用实施例27所述的测试进行验证。病毒基因组和生物反应器表达组分的产生使用实施例40所述的测试进行验证。所需核酸的包封使用实施例40所述的测试进行验证。病毒颗粒的成功释放和受感染的靶细胞内生物反应器活性的产生使用实施例27所述的测试进行验证。
实施例43.出于培养物中mRNA转录物敲弱的目的的病毒生产细胞向HeLa细胞的施用
出于敲弱生物活性RNA分子所靶向的基因产物的目的，将病毒生产细胞(如实施例38-39所生成的并使用实施例40-42所述方法证实的那些)直接应用于靶细胞。通过所关注的基因靶标和靶细胞性质确定转染中所用的具体pVir质粒和接受细胞。在本实施例中，将HeLa靶细胞与MDCK病毒生产细胞共转染，后者产生携带生物反应器融合蛋白表达盒和分泌的靶向VEGF(或表VII中所列任何转录物)的shRNA表达盒的病毒颗粒。感染的HeLa细胞于是成为能产生融合蛋白-Sec-shRNA复合物并将该复合物分泌至生长培养基的生物反应器细胞。其后可将该培养基转移至第二靶细胞(HeLa或其它细胞系)以进行转染和随后的VEGF敲弱。替代性地，可以通过在应用于靶细胞之前将融合蛋白-Sec-shRNA复合物通过用6x组蛋白表位标签沉淀来纯化。可以通过使用物种特异性引物集合和RT-PCR来观察到人靶细胞中VEGF转录物的敲弱。也可使用对于人蛋白具有特异性的VEGF抗体在培养基中检测人细胞中VEGF蛋白的耗尽和随后所分泌蛋白量的减少。
实施例44.病毒包装细胞的体内施用
如实施例22-25所述，通过用pVir质粒转染从NIH3T3接受细胞生成病毒包装细胞。采用实施例40所述的测试验证病毒包装功能。在本实施例中，NIH3T3病毒包装细胞产生携带靶向VEGF蛋白的shRNA的复制缺陷性病毒。将病毒包装细胞与SCCVII靶细胞(小鼠鳞状细胞癌系)混合并通过皮下注射将混合物移植到裸鼠(免疫缺陷型)的后胁内。活性通过评估移植位点周围的组织中VEGF转录物和蛋白水平来监测。使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)从收集自未经处理的小鼠、移植有分泌非特异性Sec-shRNA的生物反应器细胞的小鼠和移植有分泌靶向VEGF转录物的shRNA的生物反应器细胞的小鼠的后胁收集的组织制备RNA样品。然后可如实施例27所述通过RT-PCR评估VEGF转录物的相对水平。也可通过将病毒生成/SCCVII移植物中的肿瘤生长与仅接受SCCVII细胞或接受SCCVII细胞与非功能性病毒生产细胞(非特异性shRNA或输送缺陷型病毒)的对照小鼠进行比较来在体内评估病毒包装功能。
实施例45.病毒包装细胞向小鼠肌肉组织的体内施用
如实施例22-25所述，通过用pVir质粒转染从原生小鼠成肌细胞接受细胞生成病毒包装细胞。采用实施例29所述的测试验证病毒包装功能。在本实施例中，病毒包装细胞产生具有靶向肌肉生长抑制素(骨骼肌生长阴性调节物)的mRNA转录物的shRNA的复制无能性病毒颗粒。将病毒包装细胞移植至mdx小鼠(Duchenne肌肉萎缩症的模型体系)的胫骨肌肉内(Li S,Kimura E,Ng R,Fall BM,Meuse L,Reyes M,Faulkner JA,Chamberlain JS.,A highly functional mini-dystrophin/GFPfusion gene for cell and gene therapy studies of Duchenne musculardystrophy.,Hum Mol Genet.2006May15；15(10):1610-22)。病毒活性通过评估移植位点周围的组织中肌肉生长抑制素转录物和蛋白水平来监测。使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)从采集自未受处理小鼠、移植有具有非特异性shRNA的产生病毒生产细胞的病毒颗粒的小鼠和移植有具有靶向肌肉生长抑制素转录物的shRNA的病毒包装细胞的小鼠的胫骨肌肉制备RNA和蛋白样品。然后可如实施例27所述分别通过RT-PCR或ELISA评估肌肉生长抑制素转录物和蛋白的相对水平。也可通过对病毒包装细胞移植物中的体重、肌肉重量、肌肉尺寸和肌肉强度与未接受病毒包装细胞或接受非功能性病毒包装细胞的对照小鼠的比较来进行病毒功能的体内评估(Bogdanovich S,Krag TO,Barton ER,Morris LD,Whittemore LA,Ahima RS,Khurana TS.,Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade.,Nature.2002Nov28；420(6914):418-21)。
实施例46.病毒包装细胞向小鼠神经组织的体内施用
如实施例22-25所述，通过用pVir质粒转染从小鼠神经干细胞(mNSC)生成病毒包装细胞。采用实施例40所述的测试验证病毒包装功能。在本实施例中，mNSC病毒包装细胞产生携带靶向突变亨廷顿(htt)蛋白的CAG重复片段扩展物的mRNA转录物的shRNA的复制缺陷性病毒。将病毒包装细胞移植至亨廷顿病的小鼠模型的脑中，以评估病毒介导的对htt蛋白突变形式的mRNA转录物的敲弱的效力。使用Tri-Reagent(Sigma-Aldrich，产品号T9424)从采集自未受处理小鼠、移植有含有非特异性shRNA的产生病毒包装细胞的病毒颗粒的小鼠和移植有具有靶向突变亨廷顿蛋白转录物的shRNA的病毒生产细胞的小鼠的小鼠脑组织制备RNA样品。然后可如实施例27所述通过RT-PCR评估亨廷顿蛋白转录物的相对水平。
此处通过援引并入所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊文章、摘要、实验手册、书或其它公开)的完整公开内容。此外，本文通过援引并入一并提交的序列表的全部内容。
虽然已经参考本发明的实施方式具体显示并描述了本发明，但本领域技术人员可以在不背离所附权利要求所涵盖的本发明范围的情况下对其进行形式和细节上的各种变化。
显而易见，除了前述说明书和实施例中所具体描述以外，还可以其它方式实践本发明。根据上述教导可以对本发明进行各种修改和变化，并且这些修改和变化因此处在所附权利要求的范围内。
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Claims (30)

1.包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体，其中
所述第一聚核苷酸编码
第一生物活性RNA序列；
识别RNA序列；
和组成型转运元件(CTE)；且
所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含
RNA结合域序列，和
(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典分泌域序列中至少一个。
2.所述权利要求1中的表达载体，其中所述第一聚核苷酸和第二聚核苷酸中至少一个与可诱导启动子序列可操作性地连接。
3.如权利要求1所述的表达载体，其中所述第一聚核苷酸还编码第二生物活性RNA序列。
4.如权利要求3所述的表达载体，其中所述第一生物活性RNA序列或第二生物活性RNA序列中至少有一个是适体。
5.如权利要求3所述的表达载体，其中所述第一生物活性RNA序列或第二生物活性RNA序列中至少一个调节靶基因产物的基因表达或基因活性。
6.包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体，其中
所述第一聚核苷酸编码
第一生物活性RNA序列，和识别RNA序列,
所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含：
RNA结合域序列，和(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典分泌域序列中至少一个，和
编码辅助蛋白的第三聚核苷酸，所述辅助蛋白促进RNA-多肽复合物从细胞中的分泌，所述RNA-多肽复合物包含生物活性RNA序列、识别序列和多肽。
7.如权利要求6所述的表达载体，其中所述第一聚核苷酸与第一启动子序列可操作性地连接，以及其中第二聚核苷酸和第三聚核苷酸中的至少一个与第二启动子序列可操作性地连接。
8.如权利要求7所述的表达载体，其中所述第一启动子序列和第二启动子序列中至少有一个是可诱导启动子序列。
9.如权利要求6所述的表达载体，其中所述第一聚核苷酸还编码组成型转运元件。
10.如权利要求6所述的表达载体，其中所述辅助蛋白是膜结合蛋白或细胞溶质蛋白。
11.包含第一聚核苷酸和第二聚核苷酸的表达载体，其中
所述第一聚核苷酸编码
第一生物活性RNA序列，
识别RNA序列；以及
所述第二聚核苷酸编码多肽，所述多肽包含：
RNA结合域序列，和(a)细胞穿透肽序列或(b)真核非经典分泌域序列中至少一个，
其中所述第一聚核苷酸和第二聚合苷酸中至少有一个与可诱导启动子序列可操作性地连接。
12.如权利要求6所述的表达载体，其中所述第一聚核苷酸还编码组成型转运元件。
13.包含如权利要求1所述的表达载体的细胞，其中所述表达载体稳定地融入生物反应器细胞的细胞DNA。
14.包含如权利要求6所述的表达载体的细胞，其中所述载体稳定地融入生物反应器细胞的细胞DNA。
15.包含如权利要求11所述的表达载体的细胞，其中所述载体稳定地融入生物反应器细胞的细胞DNA。
16.从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的表达载体施用于所述细胞。
17.从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求6所述的表达载体施用于所述细胞。
18.从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求11所述的表达载体施用于所述细胞。
19.调节一种或多种靶基因在靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求1所述的表达载体施用于位于胞外间隙的第二细胞以制造分泌生物活性RNA的生物反应器细胞，其中所述胞外间隙包含靶细胞，其中所述生物活性RNA调节一种或多种靶基因在靶细胞中的表达。
20.调节一种或多种靶基因在靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求6所述的表达载体施用于位于胞外间隙的第二细胞以制造分泌生物活性RNA的生物反应器细胞，其中所述胞外间隙包含靶细胞，其中所述生物活性RNA调节一种或多种靶基因在靶细胞中的表达。
21.调节一种或多种靶基因在靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求11所述的表达载体施用于位于胞外间隙的第二细胞以制造分泌生物活性RNA的生物反应器细胞，其中所述胞外间隙包含靶细胞，其中所述生物活性RNA调节一种或多种靶基因在靶细胞中的表达。
22.诱导从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求2所述的的表达载体施用于所述细胞，以及(i)将诱导子分子加入到该细胞中或(ii)从该细胞中移除抑制子分子中至少一项。
23.诱导从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求8所述的的表达载体施用于所述细胞，以及(i)将诱导子分子加入到该细胞中或(ii)从该细胞中移除抑制子分子中至少一项。
24.诱导从细胞中分泌生物活性RNA的方法，所述方法包括将如权利要求11所述的表达载体施用于所述细胞，以及(i)将诱导子分子加入到该细胞中或(ii)从该细胞中移除抑制子分子中至少一项。
25.诱导调节一种或多种靶基因在位于胞外间隙的靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求2所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生和分泌生物活性RNA，从而在(i)向所述生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到靶细胞中。
26.诱导调节一种或多种靶基因在位于胞外间隙的靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求8所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生和分泌生物活性RNA，从而在(i)向生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到靶细胞中。
27.诱导调节一种或多种靶基因在位于胞外间隙的靶细胞中表达的方法，所述方法包括将如权利要求11所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生和分泌生物活性RNA，从而在(i)向生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到靶细胞中。
28.诱导调节在胞外间隙或所述间隙中靶细胞表面上的一种或多种靶基因功能的方法，所述方法包括将如权利要求2所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生生物活性RNA，从而在(i)向生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到胞外间隙或靶细胞表面。
29.诱导调节在胞外间隙或所述间隙中靶细胞表面上的一种或多种靶基因功能的方法，所述方法包括将如权利要求8所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生生物活性RNA，从而在(i)向生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到胞外间隙或靶细胞表面。
30.诱导调节在胞外间隙或所述间隙中靶细胞表面上的一种或多种靶基因功能的方法，所述方法包括将如权利要求11所述的表达载体施用于位于所述间隙的第二细胞来产生生物反应器细胞，其中所述生物反应器细胞产生生物活性RNA，从而在(i)向生物反应器细胞加入诱导子分子或(ii)从所述生物反应器细胞中移除抑制子分子至少之一时将生物活性RNA输送到胞外间隙或靶细胞表面。
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