CN1968959B - 用于抑制流行性感冒病毒感染的短干扰rna、短发夹rna及编码它们的载体，相关组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供基于RNA干扰(RNAi)现象来抑制流行性感冒传染和/或复制的方法和组合物，以及用于鉴别有效地抑制流行性感冒病毒的siRNA和shRNA的系统，和用于研究流行性感冒病毒传染机制的系统。本发明还提供用于抑制其它传染病病原体的感染、致病性及/或复制的方法和组合物，尤其是用于那些感染可从体外直接接近的细胞(例如，皮肤细胞或粘膜细胞)的传染病病原体。此外，本发明还提供包含RNAi诱导体(例如，一靶向于流行性感冒病毒转录物的siRNA、shRNA或RNAi诱导载体)和任何一种输送剂的组合物。本发明进一步包含使用该等组合物治疗流行性感冒的方法。

Description

用于抑制流行性感冒病毒感染的短干扰RNA、短发夹RNA及编码它们的载体,相关组合物及其应用

对相关申请案之交叉参照

本申请案主张优先于2002年9月28日提出申请的美国临时专利申请案第60/414,457号及2003年2月10日提出申请的美国临时专利申请案第60/446,377号之权利。所提及的这两个申请案中任一申请案之内容皆以引用方式并入本文中。 

政府支持

美国政府已提供可用于本发明研发的许可支持(grant support)。具体而言，美国国立卫生研究院许可号第5-RO1-AI44477号、第5-RO1-AI44478号、第5-ROI-CA60686号及第1-RO1-AI50631号已为本发明之研发提供了支持。美国政府可拥有本发明中的某些权利。 

技术领域

本发明提供基于RNA干扰(RNAi)现象来抑制流行性感冒传染和/或复制的方法和组合物，以及用于鉴别有效地抑制流行性感冒病毒的siRNA和shRNA的系统，和用于研究流行性感冒病毒传染机制的系统。本发明还提供用于抑制其它传染病病原体的感染、致病性及/或复制的方法和组合物，尤其是用于那些感染可从体外直接接近的细胞(例如，皮肤细胞或粘膜细胞)的传染病病原体。此外，本发明还提供包含RNAi诱导体(例如，一靶向于流行性感冒病毒转录物的siRNA、shRNA或RNAi诱导载体)和任何一种输送剂的组合物。本发明进一步包含使用该等组合物治疗流行性感冒的方法。 

背景技术

流行性感冒是世界上传播最广泛的感染之一。其可导致死亡：据估测在1918年有两千万到四千万人死于世界大流行的流行性感冒A病毒。在美国，每年有两万到四万人死于流行性感冒A病毒感染或其并发症。在疾病流行期间，因患流行性感冒而入院治疗的人数仅一个冬季就可达300,000以上。 

流行性感冒病毒的若干特点皆可导致流行性感冒病毒的流行。首先，其易于在人和人之间通过空气传播(飞沫传染)。其次，流行性感冒病毒抗原经常会发生少量改变(抗原性漂移)，因而会使病毒易于逃脱由先前暴露于该病毒之一不同变体所诱导的保护免疫性。第三，流行性感冒病毒的新菌株可易于通过不同菌株之间基因物质的重配或混合而产生(抗原性转变)。对于流行性感冒A病毒而言，此混合可发生于能够感染不同物种的亚型或菌株之间。发生于1918年的大流行据信是由猪和人流行性感冒A病毒之间的重配所产生的病毒之杂交菌株引起的。 

尽管人们付出了巨大的努力，但仍不能对流行性感冒病毒感染进行有效的治疗，并且现有疫苗亦仅具有有限的价值，此部分由于抗原性漂移及上述转变所致。为此，多年来一直对流行性感冒A病毒进行着全球性监督，并且美国国立卫生研究院将其指定为最优先生物防御致病原之一。虽然当前基于灭活病毒的疫苗能够防止年龄在65岁以下的健康个体中约70-80％的人致病，但在年龄更大或免疫力低下的人群中此百分比大大降低。此外，与疫苗投与相关的费用及潜在副作用使得此方法不能成为最优方法。尽管当前在美国获准用于治疗及/或预防流行性感冒的四种抗病毒药物非常有帮助，但其应用却因副作用、依从性以及可能的耐受菌株突变等问题而受到限制。因此，仍需要研发有效的治疗方案来治疗及预防流行性感冒感染。 

发明内容

本发明提供了基于RNA干扰(RNAi)现象的新颖治疗方案来治疗由A型、B型及C型流行性感冒病毒引起的流行性感冒。具体而言，本发明提供了短干扰 RNA(siRNA)及/或短发夹RNA(shRNA)分子，其可靶向一或多种参与病毒产生、病毒复制、病毒感染及/或病毒RNA转录等过程的目标转录物。此外，本发明提供了若干载体，其在一细胞中之存在可造成一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA之转录，从而形成可抑制至少一种参与病毒产生、病毒复制、病毒感染及/或病毒mRNA转录等过程的目标转录物之表达的shRNA或siRNA。 

本发明进一步提供了各种包含siRNA、shRNA及/或本发明载体的组合物。在本发明的某些实施例中，siRNA包含两条具有互补区域的RNA链，因而这两条链可彼此杂交以形成一长度约为19个核苷酸的双螺旋结构，其中每一条链可视情况包括一单股突出端。在本发明的某些实施例中，shRNA包含一个具有若干互补区域的RNA分子，该等区域可彼此杂交以形成一发夹(茎/环)结构，该结构具有一长度约为19个核苷酸的双螺旋部分及一单链环。据认为该等RNA分子可自杂交。shRNA可视情况在该RNA的5′及/或3′部分包括一或多个不成对部分。本发明进一步提供了包含本发明siRNA、shRNA及/或载体的组合物以及用于输送该等组合物之方法。 

因此，本发明的一方面提供了一靶向于一目标转录物的siRNA或shRNA，其中此目标转录物是一种传染病病原体特异性转录物，此转录物参与一传染病病原体的产生、复制、致病性及/或感染，并且/或者参与传染病病原体特异性RNA的转录。为了便于描述，如果一siRNA或shRNA可抑制一参与一传染病病原体的产生、复制、致病性及/或感染的目标转录物之表达，并藉此抑制该传染病病原体的产生、复制、致病性及/或感染，则将此siRNA或shRNA称作可抑制该传染病病原体。根据本发明的一些实施例，所述传染病病原体为一病毒。根据本发明的某些较佳实施例，所述传染病病原体为一可感染呼吸道及/或肺细胞(例如，呼吸道上皮细胞)的病毒，例如一流行性感冒病毒。根据本发明的某些实施例，所述目标转录物可编码一选自由下述组成的群组的蛋白质：聚合酶、核壳蛋白、神经氨酸酶、血凝素、基质蛋白及非结构蛋白。根据本发明的某些实施例，所述目标转录物可编码一选自由下述组成的群组的流行性感冒病毒蛋白 质：血凝素、神经氨酸酶、膜蛋白1、膜蛋白2、非结构蛋白1、非结构蛋白2、聚合酶蛋白PB1、聚合酶蛋白PB2、聚合酶蛋白PA、聚合酶蛋白NP。 

本发明的另一方面提供了一种包括一核酸的载体，其中该核酸以有效方式连接于细胞中的活动表达信号(例如，一启动子或启动子/增强子)，因此，当此构造被引入所述细胞中时可在此宿主细胞内产生一靶向一传染病病原体特异性转录物的siRNA或shRNA，此转录物参与一传染病病原体之产生、复制及/或感染，及/或参与传染病病原体特异性RNA的转录。在本发明的某些实施例中，所述传染病病原体为一病毒，例如，一流行性感冒病毒。在本发明的一些较佳实施例中，所述siRNA或shRNA可抑制流行性感冒病毒。此siRNA或shRNA可靶向上述的任何一种转录物。一般而言，载体可为DNA质粒或病毒载体，例如可为反转录病毒(例如，慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒等，其在一细胞中之存在可造成一或多个可自杂交或彼此相互杂交的核糖核酸(RNA)之转录，从而形成可抑制至少一种流行性感冒病毒转录物在细胞中之表达的短发夹RNA(shRNA)或短干扰RNA(siRNA)。在本发明的某些实施例中，所述载体包括一以有效方式连接于一启动子的核酸片断，从而可藉此启动子之转录(即，由该启动子引导的转录)来合成一包含若干可杂交互补区域的RNA，从而形成一靶向目标转录物的shRNA。在本发明的某些实施例中，慢病毒载体包括一核酸片段，其相对两端位置具有两个启动子，其中该等启动子以有效方式连接于所述核酸片段上，从而可藉该等启动子之转录来合成两个互补的RNA，该等RNA可彼此杂交以形成一靶向目标转录物的siRNA。本发明进一步提供了包含该载体的组合物。 

本发明亦提供了包含本发明siRNA、shRNA及/或本文所述载体的组合物，其中所述组合物进一步包含任何一种可有利于输送及/或吸收所述siRNA、shRNA或载体的物质(在本文中称作输送剂)。该等物质包括阳离子型聚合物；肽分子转运蛋白(包括富精氨酸肽及富组氨酸肽)；阳离子型及中性脂质；脂质体；某些非阳离子型聚合物；碳水化合物；以及表面活性剂材料。本发明亦涵盖使用经各种方式修饰(例如，通过将一输送增强部分加至输送剂上)的输送剂。 

在本发明的某些实施例中，输送剂可经任何一种方式修饰以增强稳定性、促进组合物的细胞内吸收、促进siRNA、shRNA及/或载体在细胞内的输送、降低细胞毒性或将组合物导入一特定类型细胞、组织或器官中。 

例如，在本发明的某些实施例中，输送剂为一经修饰的阳离子型聚合物(例如，经一或多个选定用于降低聚合物阳离子性质从而降低细胞毒性的基团取代的阳离子型聚合物)。在本发明的某些实施例中，输送剂包括一输送增强部分，例如，一抗体、抗体片段或配体，其特异性结合于一存在于一细胞(例如，呼吸道上皮细胞)表面的分子上。 

本发明进一步提供了通过在暴露于一传染病病原体之前、当此暴露正发生时、在此暴露发生之后或在一个体表现出由该传染病病原体所致疾病的症状期间的一适宜时间窗内将任何一种本发明之组合物投与一个体来治疗或预防传染性疾病尤其是呼吸系统传染性疾病(例如，流行性感冒)的方法。siRNA或shRNA可以化学方式合成、采用体外转录产生、在体外合成、在细胞内产生，等等。该等组合物可以各种途径投与，包括静脉内投与、吸入、鼻内投与、作为一气雾剂投与、腹膜腔內投与、肌内投与、真皮内投与、口服等等。 

本发明还通过采用基因治疗提供了用于治疗或预防由一传染病病原体所致疾病(例如，由流行性感冒病毒引起的疾病)的其它方法。根据该等方法中的某些方法，通过改造或操纵细胞(受到感染或未受感染的细胞)来合成本发明之siRNA或shRNA。根据本发明的某些实施例，该等细胞被改造为包含一载体，其中该载体在细胞中之存在可造成一或多个可在细胞内自杂交或彼此相互杂交的RNA之合成，从而形成一或多个靶向一适宜传染病病原体特异性目标转录物的shRNA或siRNA。该等细胞可于活体外改造或当存在于欲治疗个体的体内(例如，存在于患者的呼吸道内)时改造。 

本发明的另一方面提供了用于选择及设计较佳siRNA或shRNA序列来抑制一传染病病原体的方法。本发明提供了用于选择及设计siRNA及shRNA来抑制传染病病原体的方法，其中该等传染病病原体的特征在于其同时存在传染病病 原体的多个不同菌株或变体，尤其是其中菌株可通过基因重配或混合而发生改变。该等方法特别适用于选择及设计siRNA及shRNA序列以战胜其基因组是由多个不同片段组成的传染病病原体，其中基因重配可通过一个亚型与另一个亚型之间的整个基因组片段替代而快速且不可预料地发生。因此，本发明的该等方面特别适用于其基因组是由多个独立片段组成的传染病病原体，即，该基因组由物理上不同且彼此未共价结合的核酸分子组成。本发明亦特别适用于那些通过质粒(例如，编码可将耐受性赋予治疗用化合物的基因的质粒)转移来交换遗传信息的传染病病原体。 

本发明亦提供了一种用于鉴别组合物的系统，其中该等组合物包含一或多种RNAi诱导体(例如，靶向一流行性感冒病毒转录物的siRNA及/或shRNA)及/或包含载体，该等载体在一细胞中之存在可导致产生一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA，从而形成一靶向一流行性感冒病毒转录物的shRNA或siRNA，其中该等组合物可用于抑制流行性感冒病毒。 

本发明进一步提供了一种用于分析及定性流行性感冒病毒之复制机制及/或流行性感冒病毒RNA之转录机制以及用于定性及分析参与病毒生命周期之相病毒组成的系统。 

本发明的再一方面提供了用于设计siRNA及/或shRNA的方法，以便在存在一传染病病原体的多个变体时用来抑制此传染病病原体。例如，本发明提供了一种用于设计一其具有一双螺旋部分的siRNA或shRNA分子之方法，该方法包括以下步骤：(i)鉴别一目标转录物的一部分，该部分在一传染病病原体的多个变体中高度保守且包含至少15个连续核苷酸；及(ii)选择一siRNA或shRNA，其中所述siRNA的有义链或所述shRNA的有义部分包含此高度保守的序列。 

本发明的另一方面提供了siRNA和siRNA以及用于设计该等siRNA和siRNA的方法，其中所述siRNA或shRNA是靶向一转录物，其抑制可造成多个(或全部)其它病毒转录物的抑制。具体而言，本发明提供了siRNA及shRNA组合物，该等组合物中包含靶向编码病毒聚合酶(DNA或RNA聚合酶)或核壳蛋白的转录 物之siRNA或shRNA。 

本申请案中提及多个专利、杂志论文及其它出版物，所有该等皆以引用方式并入本文中。此外，下述标准参考著作亦以引用方式并入本文中：CurrentProtocols in Molecular Biology，Current Protocols in Immunology，CurrentProtocols in Protein Science，及Current Protocols in Cell Biology，JohnWiley & Sons，N.Y.，2002年7月版；Sambrook、Russell及Sambrook，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，2001。 

附图说明

图1A如本文各处所提及是摘自Julkunen，I.，等人之文献，该图展示流行性感冒病毒的示意图。 

图IB如本文各处所提及是摘自Fields′Virology之文献，该图展示流行性感冒病毒的基因组结构及衍生自该流行性感冒基因组的转录物。在mRNA的5′及3′末端处的细线表示未经转译的区域。阴影或阴影线区域分别表示0或+1读取框中的编码区域。内含子以V形线表示。mRNA 5′末端的小矩形表示共价结合于病毒核酸上的异源细胞RNA。A(n)代表polyA尾端(聚腺嘌呤尾端)。 

图2如本文各处所提及是摘自Julkunen，I.，等人之文献，该图展示流行性感冒病毒复制周期。 

图3展示在果蝇(Drosophila)属系中观测到的siRNA结构。 

图4显示果蝇中RNA干扰所涉及的步骤之示意图。 

图5显示可根据本发明使用的各种实例性siRNA及shRNA结构。 

图6示出另一抑制途径的图形，其中DICER酶可解离一种茎中具有一碱基失配的物质，以产生一结合于目标转录物3′UTR处且可抑制转译的抑制性产物。 

图7示出一构造之一实例，此构造可用来引导一本发明siRNA的两条链的转录。 

图8示出一构造之一实例，此构造可用来引导一个RNA分子的转录物，所述RNA分子可杂交以形成本发明之一shRNA。 

图9显示6株来源于人宿主的流行性感冒病毒A菌株之间的序列比对。深色阴影区域用来设计如实例2所述进行测试的siRNA。碱基序列为菌株A/PuertoRico/8/34的序列。浅色阴影字母指示不同于此碱基序列的核苷酸。 

图10显示2株来源于人宿主的流行性感冒病毒A菌株与5株来源于动物宿主的流行性感冒病毒A菌株之间的序列比对。深色阴影区域用来设计如实例2所述进行测试的siRNA。碱基序列为菌株A/Puerto Rico/8/34的序列。浅色阴影字母指示不同于此碱基序列的核苷酸。 

图11A-11F显示的实验结果表明siRNA可抑制MDCK细胞中产生流行性感冒病毒。通过电穿孔将6个靶向各种病毒转录物的不同siRNA引入MDCK细胞中，8小时以后这些细胞受到病毒感染。图11A显示了在以0.01的感染复数(MOI)(无论是否存在各种siRNA或对照siRNA)用病毒菌株A/PR/8/34(H1N1)(PR8)感染后的各个时刻通过血凝素分析测得的培养物上清液中病毒效价随时间之变化情况。图11B显示了在以0.01之感染复数(MOI)(无论是否存在各种siRNA或对照siRNA)用病毒菌株A/WSN/33(H1N1)(WSN)感染后的各个时刻通过血凝素分析测得的培养物上清液中病毒效价随时间之变化情况。图11C显示一噬菌斑测定，该测定显示经siRNA NP-1496转染或模拟转染的病毒感染细胞培养物上清液中的病毒效价。图11D显示在不同siRNA剂量下对流行性感冒病毒产生之抑制。MDCK细胞用所示量NP-1496 siRNA转染并随后用PR8病毒以0.01之MOI感染。感染后48小时测量病毒效价。其中显示了两个实验之一的代表性数据。图11E显示通过在病毒感染后投与siRNA对流行性感冒病毒产生之抑制。MDCK细胞用PR8病毒以0.01之MOI感染2小时并随后用NP-1496(2.5nmol)转染。感染后在指定时间测量病毒效价。其中显示了两个实验之一的代表性数据。 

图12显示12株来源于人或动物宿主的流行性感冒病毒A亚型菌株或分离菌株中NP序列3′区域之一部分之间的序列比对。阴影区域用来设计如实例2及3所述进行测试的siRNA。碱基序列为菌株A/Puerto Rico/8/34的序列。阴影字母指示不同于此碱基序列的核苷酸。

图13显示各siRNA相对于流行性感冒病毒基因片段的位置，其与抑制流行性感冒病毒的有效性相关。 

图14A是鸡胚发育示意图，其指示用于注射siRNA及siRNA/输送剂组合物的区域。 

图14B显示各siRNA在发育鸡胚中抑制流行性感冒病毒产生的能力。 

图15是一显示核蛋白与病毒RNA分子相互作用的示意图。 

图16A及16B显示了用来说明流行性感冒病毒vRNA、mRNA及cRNA(模板RNA)之间的差异及其之间相互关系的示意图。图16B显示每一流行性感冒A病毒vRNA片段3′末端处的12个保守核苷酸及5′末端处的13个核苷酸。mRNA包含一m7GpppNm帽结构且平均含有10到13个衍生自宿主细胞RNA子集合的核苷酸。mRNA的聚腺苷酸化发生于mRNA中对应于vRNA片段5′末端之前第15至22核苷酸(SEQ ID NO：272)位置处的位点处。箭头指示专用于各类RNA的引物之位置(摘自参考文献(1))。 

图17显示了用病毒感染后的各个时刻病毒NP及NS RNA物质在受感染前6至8小时经siRNA NP-1496转染或模拟转染的细胞中的量。 

图18A显示对流行性感冒病毒产生之抑制需要在双螺旋siRNA中具有一野生型(wt)反义链。MDCK细胞首先用形成于wt及经修饰(m)链的siRNA来转染，并在8小时后用PR8病毒以0.1之MOI感染。感染后24小时分析培养物上清液中的病毒效价。其中显示了两个实验之一的代表性数据。图18B显示M特异性siRNA可抑制特定mRNA的聚集。用M-37转染MDCK细胞，用PR8病毒以0.01之MOI进行感染并加以培养以供在感染后1、2及3小时实施RNA分离。使用RNA特异性引物通过逆转录并随后实施实时PCR来测量M特异性mRNA、cRNA及vRNA的含量。将各类病毒RNA物质的含量标准化至相同样品中γ-肌动蛋白mRNA(底 图)的含量。RNA的相对含量以平均值±S.D.的形式显示。其中显示了两个实验之一的代表性数据。 

图19A-D显示NP特异性siRNA不仅可抑制NP特异性mRNA、vRNA及cRNA的聚集，而且可抑制M及NS特异性mRNA、vRNA及cRNA的聚集。用NP-1496转染MDCK(A-C)及Vero(非洲绿猴肾细胞)(D)细胞，用PR8病毒以0.1之MOI进行感染并加以培养以供在感染后1、2及3小时实施RNA分离。使用RNA特异性引物通过逆转录并随后实施实时PCR来测量NP、M及NS特异性mRNA、cRNA及vRNA的含量。将各类病毒RNA物质的含量标准化至相同样品中γ-肌动蛋白mRNA(未图示)的含量。图中示出RNA的相对含量。其中显示了三个实验之一的代表性数据。 

位于各图右侧的图19E-G显示PA特异性siRNA不仅可抑制PA特异性mRNA、vRNA及cRNA的聚集，而且可抑制M及NS特异性mRNA、vRNA及cRNA的聚集。用PA-1496转染MDCK细胞，用PR8病毒以0.1之MOI进行感染并加以培养以供在感染后1、2及3小时实施RNA分离。使用RNA特异性引物通过逆转录并随后实施实时PCR来测量PA、M及NS特异性mRNA、cRNA及vRNA的含量。将各类病毒RNA物质的含量标准化至相同样品中γ-肌动蛋白mRNA(未图示)的含量。图中示出RNA的相对含量。 

图19H显示NP特异性siRNA可抑制PB1特异性mRNA(上图)、PB2特异性mRNA(中图)及PA特异性mRNA(下图)的凝集。用NP-1496转染MDCK细胞，用PR8病毒以0.1之MOI进行感染并加以培养以供在感染后1、2及3小时实施RNA分离。使用RNA特异性引物通过逆转录并随后实施实时PCR来测量PB1、PB2及PA特异性mRNA的含量。将各类病毒RNA物质的含量标准化至相同样品中γ-肌动蛋白mRNA(未图示)的含量。图中示出RNA的相对含量。 

图20A显示siRNA CD8-61序列及其发夹衍生物CD8-61F。 

图20B显示CD8-61及CD8-61F对CD8α表达之抑制。通过电穿孔法用CD8-61或CD8-61F来转染一CD8+CD4+T细胞系。48小时后，通过流式细胞仪来测量 CD8α之表达。 

未标记细胞系：模拟转染。 

图20C显示pSLOOP III载体之示意图，其中CD8-61F发夹RNA之表达由H1RNA pol III启动子驱动。 

终止子：终止信号序列。 

图20D所示曲线显示出可使用pSLOOP III使HeLa细胞中之CD8α沉默。未经转染的细胞不表达CD8α。用CD8α表达载体及一无启动子的pSLOOPIII-CD8-61F构造、合成siRNA或一含有启动子的pSLOOP III-CD8-61F来转染细胞。 

图21A显示NP-1496与GFP-949 siRNA及其发夹衍生物/前驱体之示意图。 

图21B显示了NP-1496H及GFP-949H在两种不同次序下的串联阵列。 

图21C显示了pSLOOP III表达载体。单独在pSLOOP III载体中(上图)、在串联阵列中(中图)或同时使用独立启动子及终止序列(下图)克隆siRNA的发夹前驱体。 

图22A为一曲线，其显示当在用流行性感冒病毒感染之前与阳离子聚合物PEI同时投与时，siRNA可抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。填充方框(未处理)；空方框(GFP siRNA)；空圆(30μg NP siRNA)；填充圆(60μg NP siRNA)。每一符号代表一动物个体，其中显示了不同组之间的p值。 

图22B为一曲线，其显示当在用流行性感冒病毒感染之前与阳离子聚合物PLL同时投与时，siRNA可抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。填充方框(未处理)；空方框(GFP siRNA)；填充圆(60μg NP siRNA)。每一符号代表一动物个体，其中显示了不同组之间的p值。 

图22C为一曲线，其显示当在用流行性感冒病毒感染之前与阳离子聚合物jetPEI同时投与时，siRNA可较投与PBS中更有效地抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。空方框(未处理)；空三角(GFP siRNA于PBS中)；填充三角(NPsiRNA于PBS中)；空圆(GFP siRNA与jetPEI)；填充圆(NP siRNA与jetPEI)。 每一符号代表一动物个体，其中显示了不同组之间的p值。 

图23为一曲线，其显示当在用流行性感冒病毒感染之前同时投与时，靶向流行性感冒病毒NP及PA转录物的siRNA展示出加性效应。填充方框(未处理)；空圆(60μg NP siRNA)；空三角(60μg PA siRNA)；填充圆(60μg NP siRNA+60μg PA siRNA)。每一符号代表一动物个体，其中显示了不同组之间的p值。 

图24为一曲线，其显示当在用流行性感冒病毒感染之后同时投与时，siRNA可抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。填充方框(未处理)；空方框(60μg GFPsiRNA)；空三角(60μg PA siRNA)；空圆(60μg NP siRNA)；填充圆(60μgNP+60μg PA siRNA)。每一符号代表一动物个体，其中显示了不同组之间的p值。 

图25A是表达shRNA的慢病毒载体之示意图。shRNA的转录由U6启动子驱动。EGFP表达由CMV启动子驱动。SIN-LTR、ψ、cPPT及WRE皆为慢病毒组份。图中显示了NP-1496 shRNA的序列。 

图25B显示流式细胞仪测量结果曲线，其表明经图25B所示慢病毒感染的Vero细胞可以一剂量相依方式表达EGFP。慢病毒由编码NP-1496a shRNA的共转染DNA载体及封装载体产生于293T细胞中。使用培养物上清液(0.25ml或1.0ml)来感染Vero细胞。通过流式细胞仪分析所得Vero细胞系(Vero-NP-0.25及Vero-NP-1.0)和对照(未感染)Vero细胞之GFP表达。图中显示出Vero-NP-0.25细胞(图中上部分)和Vero-NP-1.0细胞(图中下部分)的平均荧光强度。阴影曲线表示对照(未感染)Vero细胞的平均荧光强度。 

图25C为一曲线，其显示在表达NP-1496 shRNA的Vero细胞中对流行性感冒病毒产生之抑制。用PR8病毒以0.04、0.2及1之MOI来感染亲代细胞及表达NP-1496 shRNA的Vero细胞。在感染48小时后用血凝反应(HA)分析来测定上清液中的病毒效价。 

图26为一曲线，其显示可通过投与表达靶向流行性感冒病毒转录物的siRNA 之DNA载体来抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。将60μg DNA编码RSV、NP-1496(NP)或PB1-2257(PB1)shRNA与40μl Infasurf混合后通过滴注法投与小鼠中。对于未处理(NT)组，将60μl 5％葡萄糖滴注投与小鼠。13小时后，用PR8病毒通过鼻内感染小鼠，感染剂量为12000pfu/小鼠。感染24小时后通过MDCK/血凝素分析测量肺中的病毒效价。每一数据点表示一只小鼠，图中给出了各组之间的p值。 

图27A显示通过电泳迁移率变动分析检测siRNA与聚-L-赖氨酸(PLL)之间的复合物形成结果。SiRNA-聚合物复合物通过在室温下将150ng NP-1496siRNA与大量聚合物(0-1200ng)混合30分钟来形成。然后使反应混合物通过4％的琼脂糖凝胶并通过溴化乙锭染色来观察siRNA。 

图27B显示通过电泳迁移率变动分析检测siRNA与聚-L-精氨酸(PLA)之间的复合物形成结果。SiRNA-聚合物复合物通过在室温下将150ng NP-1496siRNA与大量聚合物(0-1200ng)混合30分钟来形成。然后使反应混合物通过4％的琼脂糖凝胶并通过溴化乙锭染色来观察siRNA。 

图28A为一显示siRNA/PLL复合物之细胞毒性的曲线。使用siRNA(400pmol)/聚合物复合物对96-孔板中的Vero细胞实施6小时处理。然后以DMEM-10％FCS代替此含聚合物的介质。24小时后使用MTT分析来测量细胞的代谢活动。方框＝PLL(MW-8K)；圆＝PLL(MW-42K)；填充方框＝25％；空三角＝50％；填充三角＝75％；X＝95％。所示数据为三次测量值的平均值。 

图28B为一显示siRNA/PLA复合物之细胞毒性的曲线。使用siRNA(400pmol)/聚合物复合物对96-孔板中的Vero细胞实施6小时处理。然后以DMEM-10％FCS代替此含聚合物的介质。24小时后使用MTT分析来测量细胞的代谢活动。所示数据为三次测量值的平均值。 

图29A为一曲线，其显示PLL可刺激siRNA的细胞吸收。将24-孔板中的Vero细胞与转染试剂Lipofectamine+siRNA(400pmol)或siRNA(400pmol)/聚合物复合物一起培养6小时。然后对这些细胞进行洗涤并用PR8病毒以0.04 之MOI加以感染。感染后在不同的时间点通过HA分析测量培养物上清液中的病毒效价。其中示出聚合物与siRNA之比率。空圆＝未处理；填充方框＝Lipofectamine；填充三角＝PLL(MW-42K)；空三角＝PLL(MW-8K)。 

图29B为一曲线，其显示PLA可刺激siRNA的细胞吸收。将24-孔板中的Vero细胞与siRNA(400pmol)/聚合物复合物一起培养6小时。然后对这些细胞进行洗涤并用PR8病毒以0.04之MOI加以感染。感染后在不同的时间点通过HA分析测量培养物上清液中的病毒效价。其中示出聚合物与siRNA之比率。0、25、50、75及95％分别指PLL上被咪唑乙酰基取代的ε-氨基的百分比。填充圆＝未转染；空圆＝Lipofectamine；空方框及填充方框＝0％及25％(注意：0％及25％时的数据点相同)；填充三角＝50％；空三角＝75％；X＝95％。 

缩写 

DNA：脱氧核糖核酸 

RNA：核糖核酸 

vRNA：流行性感冒病毒基因组中的病毒粒子RNA，负链 

cRNA：互补RNA，vRNA的一直接转录物，正链 

mRNA：自vRNA或细胞基因转录的信使RNA，用于蛋白质合成的一种模板 

dsRNA：双链RNA 

siRNA：短干扰RNA 

shRNA：短发夹RNA 

RNAi：RNA干扰 

定义 

一般而言，术语抗体指一种天然的或以完全或部分合成方式制造的免疫球蛋白。在本发明的某些实施例中，此术语亦涵盖任何包含免疫球蛋白结合域的任何蛋白质。该等蛋白质可衍生自天然来源，或部分或完全以合成方式制造。 抗体可为任何类别免疫球蛋白中的一个成员，包括任何人类免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。抗体可为一抗体片段，例如，Fab′、F(ab′)2、scFv(单链可变)或其它保留有抗原结合位点的片段；或一以重组方式产生的scFv片段，包括以重组方式产生的片段。参见(例如)Allen，T.于Nature Reviews Cancer中之文献(Vol.2，750-765，2002)及其中提及的参考文献。在本发明的某些实施例中，该术语包括“人源化”抗体，其中(例如)一来源于啮齿类动物抗体的可变域融合于来源于人类抗体的恒定域上，因而保留了啮齿类动物抗体的特异性。应注意，来源于人类抗体的域不需直接来源于人类，只要其首先是在人体内合成的即可。反之，“人类”域可在其基因组中纳入有人类免疫球蛋白基因的啮齿类动物中产生。参见(例如)Vaughan等人(1998)于NatureBiotechnology(16：535-539)中之文献。抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体，但为本发明之目的单克隆抗体通常较佳。 

当提及一数值时，本文所用术语大约或约应视为包括在任一方向上(大小或小于)位于该数值5％范围内的数值，但上下文中另有明确说明或指明者除外(不包括此数值超过一可能数值的100％的情况)。当提及范围时，两端数值均包括在所述范围内，但上下文中另有明确说明或指明者除外。 

本文所用术语杂交是指两个互补核酸序列之间的相互作用。短语在高度严格的条件下杂交所描述的是一种可在业内公认的高度严格条件下保持充分稳定性的相互作用。进行杂交反应的指南可参见(例如)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley & Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1989)及最近更新的各期杂志，其全部内容皆以引用方式并入本文中。亦可参见Sambrook、Russell及Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，2001。文献中描述了水性及非水性方法，可使用二者中的任何一种。一般地，对于长度超过约50-100个核苷酸的核酸序列而言，对各种程度的严格条件进行了定义，例如低严格条件(例如，在约45℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在至少50℃下 于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤两次(对于中等-低严格条件而言，此洗涤温度可提高到55℃))；中等严格条件(例如，在约45℃下6X SSC，随后在60℃下于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一或多次)；高度严格杂交条件(例如，在约45℃下6X SSC，随后在65℃下于0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一或多次)；及极高度严格杂交条件(例如，在65℃下0.5M磷酸钠，0.1％SDS，随后在65℃下于0.2X SSC，1％SDS中洗涤一或多次)。在高度严格条件下杂交仅发生于具有极高互补性的序列之间。熟习此项技术者将认识到，不同程度严格条件的参数通常会因各种因素而有所不同，例如，杂交序列的长度、其是否含RNA或DNA等等。例如，较短序列(例如，寡核苷酸)在高度、中等或低严格条件下的适宜杂交温度要低于较长序列。 

本文所用术语流行性感冒病毒是指能够在动物或人类个体中引起疾病的任何流行性感冒病毒菌株或实验分析感兴趣的候选菌株。流行性感冒病毒阐述于Fields，B.，等人，Fields′Virology，第4版，Philadelphia：LippincottWilliams及Wilkins；ISBN：0781718325，2001。具体而言，该术语涵盖能够在动物或人类个体中引起疾病的任何流行性感冒A病毒菌株或实验分析感兴趣的候选菌株。大量的流行性感冒病毒A分离菌株已被部分或完全定序。附录A仅列出了部分流行性感冒A病毒基因组片段的完整序列，其已保藏于公众数据库(流行性感冒序列数据库(ISD)，参见Macken，C.，Lu，H.，Goodman，J.，&Boykin，L.，″The value of a database in surveillance and vaccineselection.″，刊于Options for the Control of流行性感冒IV.A.D.M.E.Osterhaus，N.Cox & A.W.Hampson(Eds.)Amsterdam：Elsevier Science，2001，103-106)中。此数据库中亦含有流行性感冒病毒B及C基因组片段的完整序列。可通过万维网站点URL http：//www.flu.lanl.gov/登录该数据库，其中还设有方便的搜索引擎，可供用户按基因组片段、被病毒感染的物质及分离年份来进行搜索。流行性感冒病毒序列亦可自Genbank(基因库)获得。因此，熟习此项技术者可易于获得或确定流行性感冒病毒基因序列。 

本文所用术语经分离的是指：1)自至少某些通常存在于自然界中的组份进行分离；2)通过一人工制程来制备或纯化；及/或3)未存在于自然界中。 

本文所用术语配体是指一通过抗原-抗体相互作用以外的其它机制特异性结合于第二分子上的分子，通常为多肽或其一部分，例如，碳水化合物部分。该术语涵盖(例如)天然的或合成的多肽、肽及小分子，包括其结构已由人类创造出来的分子。尽管该术语通常用于受体及与其相互作用且通常会调节其活性的分子(例如，促效剂或拮抗剂)之场合，但本文所用的这一术语可用于更广泛的范围。 

本文所用术语可有效连接是指两个核酸序列之间的关系，其中一个核酸序列的表达受到另一核酸序列的控制、调控、调节等等。例如，一核酸序列的转录由一可有效连接的启动子序列引导；一核酸序列的转录后处理由一可有效连接的处理序列引导；一核酸序列的转译由一可有效连接的转译调控序列引导；一核酸或多肽的转运或定位由一可有效连接的转运或定位序列引导；以及一多肽的转译后处理由一可有效连接的处理序列引导。较佳地，一可操作性地连接到第二核酸序列的核酸序列是以直接或间接方式共价连接于此一序列上，但亦可接受任何有效的三维联系。 

本文所用术语经纯化的是指自许多其它化合物或物质中进行分离。一种化合物或特质可以是部分纯化的、基本纯化的或纯净的，当其实质上自所有其它化合物或物质中分离出来时为纯净物，即，较佳至少为约90％、更佳至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或高于99％的纯净物。 

本文所用术语调控序列用于描述可引导、增强或抑制其有效连接的序列之表达(尤其指转录，但在某些情况下亦指诸如剪接或其它处理等其它事件)的核酸序列区域。该术语包括启动子、增强子及其它转录控制单元。在本发明的某些实施例中，调控序列可引导核苷酸序列的组成型表达；在其它实施例中，调控序列可引导组织特异性表达及/或可诱导表达。例如，适用于哺乳动物细胞的组织特异性启动子的非限制性实例包括淋巴特异性启动子(参见(例如) Calame等人，Adv.Immunol.43：235，1988)，例如T细胞受体启动子(参见(例如)Winoto等人，EMBO J.8：729，1989)及免疫球蛋白(参见(例如)Banerji等人，Cell 33：729，1983；Queen等人，Cell 33：741，1983)；及神经元特异性启动子(例如，神经丝启动子；Byrne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473，1989)。亦涵盖发育调控启动子，包括(例如)鼠同位序列基因(HOX)启动子(Kessel等人，Science 249：374，1990)及α-胎蛋白启动子(Campes等人，Genes Dev.3：537，1989)。在本发明的某些实施例中，调控序列可引导核苷酸序列仅在已被一传染病病原体感染的细胞中的表达。例如，调控序列可包括一启动子及/或增强子，例如一可被一病毒蛋白(例如，一病毒聚合酶、转录因子等)识别的病毒特异性启动子或增强子。或者，调控序列可包括一在鼻通道、呼吸道及/或肺的上皮细胞中呈活性的启动子及/或增强子。 

本文所用术语RNAi诱导体涵盖其在细胞中之存在可导致RNAi并会引起该RNAi诱导体所靶向的一转录物减量表达的RNA分子及载体(不包括未经人工修饰的天然分子)。该术语具体包括siRNA、shRNA及RNAi诱导载体。 

本文所用术语RNAi诱导载体是一种其在细胞中之存在可导致一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA之转录以形成一shRNA或siRNA的载体。在本发明的各实施例中，该术语涵盖质粒，例如，DNA载体(其序列可包括衍生自一病毒的序列单元)或病毒(不包括未经人工修饰的天然病毒或质粒)，其在一细胞中之存在可导致一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA之产生，从而形成一shRNA或siRNA。一般而言，该载体包含一可操作性地连接到表达信号上的核酸，从而在该载体存在于一细胞中时可使一或多个可自杂交或杂交以形成一shRNA或siRNA的RNA分子进行转录。因此，该载体可为RNA或多个RNA或其前驱体的细胞内合成提供一模板。为了诱导RNAi，在一细胞中纳入一病毒基因组(例如，在病毒包膜与细胞膜融合之后)即被视为足以构成病毒于细胞中之存在。此外，为了诱导RNAi，当一载体被引入细胞、进入细胞或自一亲代细胞沿袭而来时，无论该载体随后是否会在该细胞中受到修饰或处理，均认为该载体存在 于此细胞内。如果一RNAi诱导载体在一细胞中之存在可导致一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA之产生，从而形成一靶向一转录物的shRNA或siRNA，亦即，如果该载体在一细胞中之存在可导致一或多个靶向一转录物的siRNA或shRNA之产生，则认为该载体是靶向该转录物。 

短干扰RNA(siRNA)包含一长约19个碱基对的RNA双螺旋且视情况可进一步包含一个或两个单股突出端。siRNA可由两个杂交在一起的RNA分子形成，或可由一个包括一自杂交区域的RNA分子产生。一般而言，较佳的情况是siRNA分子的自由5′末端具有磷酸基团，并且自由3′末端具有羟基基团。一siRNA的双螺旋部分可以包含但通常并不包含一或多个突出部，该等突出部由一或多个不成对的核苷酸组成。siRNA的一条链包括一可与一目标转录物杂交的部分。在本发明的某些较佳实施例中，siRNA的一条链与一目标转录物的一区域完全互补，也就是说，该siRNA可与该目标转录物杂交且不会发生任何失配。在本发明的其它实施例中，siRNA与目标转录物的目标部分可能会存在一或多处失配。在大多数其中并未达成完美互补性的本发明实施例中，通常较佳的情况是任何失配皆位于或靠近siRNA的末端。 

术语短发夹RNA是指一RNA分子，其包含至少两个已杂交或能够杂交的互补部分以形成一足够长(通常至少含有19个碱基对)从而可调介RNAi的双链(双螺旋)结构，以及至少一个单链部分，该部分的长度通常介于约1至10个核苷酸之间并形成一环状结构。该双螺旋部分可以包含但通常并不包含一或多个突出部，该等突出部由一或多个不成对的核苷酸组成。如下所述，shRNA被认为是通过保守的细胞RNAi机制处理于siRNA之中。因此，shRNA是siRNA的前驱体且通常同样能够抑制一目标转录物之表达。 

本文所用术语特异性结合是指一靶多肽(或，更一般而言，一靶分子)与一结合分子(例如，一抗体、配体、促效剂或拮抗剂)之间的相互作用。该相互作用通常依赖于该靶多肽是否存在一可被该结合分子识别的特定结构特性，例如，抗原决定基或表位。例如，如果一抗体对于表位A为特异性，则在一包 含自由标记A及其抗体二者的反应中，含表位A的多肽之存在或自由未标记A的存在将会降低结合于此抗体上的标记A的量。应了解，特异性并非是绝对的，而是通常视其中需进行结合的情况而定。例如，业内已知许多抗体除了可与靶分子中存在那些表位反应之外，还可与其它表位发生交叉发应。此交叉反应性是否可接受需视应用抗体的场合而定。熟习此项技术者能够选择出具有足够程度的特异性因而可在任何给定应用中适当发挥作用的抗体(例如，用于检测一靶分子，用于治疗目的，等等)。亦应了解，应结合其它因素(例如，结合分子对靶多肽的亲和性与结合分子对诸如竞争者等其它靶物的亲和性)对特异性进行评价。如果一结合分子展示出对一期望检测的靶分子具有高亲和性且对非靶分子具有低亲和性，则抗体可作为一种可接受的免疫诊断试剂。如果已确定一结合分子在一或多种情况下的特异性，则可将其用于其它情况(较佳为相似情况)且无需重新评价其特异性。 

本文所用术语个体是指易于受一传染病病原体感染的个体，例如，易于受诸如流行性感冒病毒等病毒感染的个体。该术语包括禽类及动物，例如，家禽及饲养动物(例如，鸡；哺乳动物，包括猪、马、狗、猫等等)、及野生动物、灵长目动物及人类。 

如果：1)当存在一siRNA或shRNA时一目标转录物的稳定性较不存在此siRNA或shRNA时降低；及/或2)此siRNA或shRNA表现出与一序列片段(其包含至少约15个、更佳至少约17个、尤佳至少约18个或19至约21至23个核苷酸)的目标转录物至少约90％、更佳至少约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的精确序列互补性；及/或3)此siRNA的一条链或此shRNA的一个自互补部分在用于体外杂交小(＜50个核苷酸)RNA分子的严格条件下及/或在哺乳动物的细胞质或细胞核中常见的条件下与目标转录物杂交，则认为此siRNA或shRNA或此siRNA或shRNA序列靶向本文所述目的的目标转录物。如果一RNA诱导载体在一细胞中之存在可导致一靶向一转录物的siRNA或shRNA之产生，则认为此载体亦靶向目标转录物。由于靶向一转录物的结果是降低或抑 制可引导此转录物合成的基因之表达，因此，亦认为一靶向一转录物的siRNA或shRNA靶向该可引导此转录物合成的基因，即使并不认为该基因本身(即，基因组DNA)与该siRNA、shRNA或细胞沉默机制组份相互作用。因此，本文所用的靶向一转录物的siRNA、shRNA或RNAi诱导载体应理解为靶向可为此转录物合成提供模板的基因。 

本文所用术语治疗包括逆转、减缓、抑制适用此术语的疾病、病症或状况之发展、预防或降低所述疾病、病症或状况、或所述疾病、病症或状况的一或多种症状或征象发生的可能性。 

一般而言，术语载体是指能够调介第二核酸分子进入(例如，转移、转运等)一细胞中的核酸分子。经转移的核酸通常连接于(例如，插入)此载体核酸分子上。载体可包括引导自动复制的序列，或可包括足以允许整合于宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括(例如)质粒(通常为DNA分子，但RNA质粒亦为人们所熟知)、粘粒及病毒载体。如业内所熟知，术语病毒载体可指包括其通常有利于核酸分子转移或整合的病毒衍生核酸成份之核酸分子(例如，质粒)(其实例包括逆转录病毒载体或慢病毒载体)或可指能够调介核酸转移的病毒或病毒颗粒(其实例包括逆转录病毒或慢病毒)。如业内熟习此项技术者所熟知，病毒载体可包括除核酸之外的各种病毒组份。 

具体实施方式

I.流行性感冒病毒生命周期及特性 

流行性感冒病毒是属于正粘病毒科的包膜负链RNA病毒。其分为A型、B型及C型流行性感冒病毒，其中A型流行性感冒病毒的致病性最强，并且被认为是唯一能与动物菌株进行重配的一种类型。A型、B型及C型流行性感冒可根据其核蛋白及基质蛋白质差异而加以区分(参见图1)。如下文之进一步论述，流行性感冒病毒A亚型根据其血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)基因的变异来定义且通常由结合于相应蛋白质上的抗体加以区分。 

流行性感冒A病毒基因组由分布于8个RNA片段中的10个基因组成。该等基因可编码10种蛋白质：包膜糖蛋白血凝素(HA)及神经氨酸酶(NA)；基质蛋白质(M1)；核蛋白(NP)；三种聚合酶(PB1、PB2及PA)，其为RNA相依性RNA转录酶的组份，本文中亦称为聚合酶或聚合酶复合物；离子通道蛋白质(M2)及非结构性蛋白质(NS1及NS2)。关于流行性感冒A病毒及其分子病理学方面的其它详细内容，请参阅Julkunen，I.，等人刊于Cytokine and Growth FactorReviews(12：171-180，2001)中的文献。亦可参见Fields，B.，等人刊于Fields′Virology，第4版，Philadelphia：Lippincott Williams及Wilkins；ISBN：0781718325，2001中之文献。流行性感冒B病毒基因组的结构与流行性感冒A病毒极为相似，而流行性感冒C病毒基因组包含7个RNA片段且缺少NA基因。 

流行性感冒A病毒是基于血凝素(H1-H15)和神经氨酸酶(N1-N9)基因分类的。世界卫生组织(WHO)命名法根据每一病毒菌株的动物宿主来源(若非人类，应指明)、产地、菌株编号、分离年份及HA和NA抗原描述来定义各病毒菌株。例如，以A/Puerto Rico/8/34(H1N1)命名菌株A，分离菌株8，其于1934年来源于Puerto Rico地区的人类中且具有HA和NA的抗原亚型1。另一实例为，以A/Chicken/Hong Kong/258/97(H5N1)命名菌株A，分离菌株258，其于1997年来源于香港地区的鸡中且具有HA的抗原亚型5及NA的抗原亚型1。HA型中的H1、H2及H3病毒和NA型中的N1及N2病毒已在人类中引起过流行病。 

如上所述，在流行性感冒病毒A中，基因变异主要由两种机制产生。基因漂移通过点诱变发生，点诱变通常由于来自宿主免疫应答的选择性压力及基因改变(亦称为重配)(包括一个亚型的整个病毒基因组片段对另一亚型的基因组片段之取代)而发生于抗原有效位置。许多不同类型的动物物种(包括人类、猪、禽类、马、水生哺乳动物及其它动物)皆可受到流行性感冒A病毒的感染。某些流行性感冒A病毒仅限于特定物种且通常不会感染不同物种。然而，某些流行性感冒A病毒则可感染若干不同的动物物种，主要为禽类(尤其为迁徙性水鸟)、猪及人类。此能力被视为引起流行性感冒A病毒中主要抗原性转变的原 因。例如，假定一猪受到一来源于人类的流行性感冒A病毒的感染且同时受到一来自鸭的不同流行性感冒A病毒的感染。当这两种不同的病毒在猪细胞中复制时，人类菌株和鸭子菌株的基因可能会“混合”，从而产生一种具有特殊RNA片段组合的新病毒。该过程被称为基因重配。(注意，该类型的基因重配不同于减数分裂期间发生在染色体之间的基因信息交换)。 

如同其它病毒和某些细菌种类一样，流行性感冒病毒可于细胞内复制。流行性感冒A病毒在上呼吸道的上皮细胞中进行复制。然而单核细胞/巨噬细胞及其它白细胞亦可受到感染。许多具有细胞表面糖蛋白(含唾液酸)的其它类型细胞易于在体外受到感染，这是因为病毒会使用这些分子作为受体。 

流行性感冒A感染/复制周期以示意图形式示于图1中。如图1A所示，流行性感冒A病毒粒子100包含基因组101，基因组101由8个负链RNA片段组成：PB2(102)，PB1(103)，PA(104)，HA(105)，NP(106)，NA(107)，M(108)，及NS(109)。传统上将其按自1至8来编号，其中PB2＝1，PB1＝2，PA＝3，HA＝4，NP＝5，NA＝6，M＝7，及NS＝8。基因组RNA片段封装于膜蛋白M1 120的一层内，膜蛋白M1 120周围环绕有一脂质双层130，包膜糖蛋白HA 140及NA 150和离子通道蛋白M2 160的细胞外域伸出该脂质双层130。RNA片段102至108覆盖有核蛋白MP 170(在图15中以示意图形式详细示出)且包含病毒聚合酶复合物180，该病毒聚合酶复合物180由聚合酶PB1、PB2及PA组成。在病毒粒子中亦可发现非结构性蛋白质NS2 190。在受到感染的细胞中发现有非结构性蛋白质NS1(未图示)。 

图1B显示流行性感冒病毒及产生于该流行性感冒基因组的转录物(未按比例图示)之基因组结构。8个基因组RNA片段中的6个片段(PB1(102)、PB2(103)、PA(104)、HA(105)、NP(106)及NA(107))各用作一编码相应蛋白质的单一非剪接转录物的模板。三种mRNA转录物已被鉴别为衍生自流行性感冒病毒A片段M(108)：一编码M1蛋白质的共线性转录物191、一编码M1蛋白质且包含一689核苷酸内含子的已剪接mRNA 192、及另一交替剪接的mRNA 193 (其可能编码一尚未在受病毒感染的细胞中检出的9氨基酸肽(M3))。两种mRNA转录物衍生自流行性感冒病毒A片段NS：一编码NS1蛋白质的未剪接mRNA 194及一编码NS2蛋白质且包括一473核苷酸内含子的已剪接mRNA 195。 

当病毒粒子100通过与一含细胞表面蛋白质的唾液酸相互作用而藉由其血凝素附着于易感细胞表面时，感染周期即开始了(图2)。附着病毒通过依赖网格蛋白的内呑作用被内吞至包膜泡囊200中。核内体中的低pH值会触发病毒及核内体膜的融合，从而使病毒核糖核蛋白(vRNP)复合物(病毒核壳蛋白)210释放于细胞质中。病毒核壳蛋白被引入细胞核中，并且随后由病毒RNA聚合酶复合物(其由PB1、PB2及PA聚合酶组成)引发一级病毒mRNA合成。由PB2蛋白在宿主细胞前体mRNA上的内切核酸酶活动产生的引物可用来以病毒RNA(vRNA)220为模板来引发病毒mRNA的合成。PB1蛋白可催化病毒特异性mRNA 230的合成，该等mRNA 230被转运至细胞质中进行转译。 

新合成的聚合酶NP、NS1及NS2被转运至细胞核中并用来调节合成复制和二级病毒mRNA的合成。病毒RNA(vRNA)的补链RNA(cRNA)240的合成由PB1、PB2、PA及NP引发，随后会合成新的vRNA分子250。病毒聚合酶复合物使用该等vRNA作为模板来合成二级mRNA 260。由此，病毒编码转录酶进行的vRNA转录可产生mRNA，此mRNA用作合成病毒蛋白的模板且可产生因缺少5′封端及3′聚A尾端而不同于mRNA的补链RNA(cRNA)，并且可用作一模板来合成更多的vRNA以产生新病毒粒子。在感染末期，NS1蛋白调节M及NS mRNA的剪接，由此导致M2及NS2 mRNA的产生。病毒mRNA被转运至细胞质中，并于此处产生病毒结构蛋白质270。蛋白质PB1、PB2、PA及NP被转运至细胞核中，亦即组装vRNP复合物(核壳)280的位点。M1及NS2蛋白亦被转运至细胞核中，其在此处与vRNP相互作用并调节其核输出。病毒vRNA-M1蛋白复合物在细胞质膜处与HA及NA分子的细胞质部分相互作用，成熟病毒粒子将于此处出芽并释放病毒颗粒。 

流行性感冒A病毒在细胞中的复制非常迅速，此会导致宿主细胞因细胞溶 解效应或细胞凋亡作用而死亡。感染将会引起多种细胞内活动及过程(包括对宿主细胞基因表达的抑制)的改变。在细胞核中，病毒聚合酶复合物结合至新合成的细胞聚合酶II转录物上并解离细胞聚合酶II转录物。NS1蛋白阻断细胞前体mRNA剪接并抑制宿主mRNA的核输出。细胞mRNA的转译将会受到很大抑制，而病毒mRNA则会得到有效转译。病毒mRNA的有效转译部分通过细胞干扰素(IFN)应答(一种宿主应答，其作用通常用来抑制受病毒感染细胞中的转译病毒)的病毒下调来维持。具体而言，病毒NS1蛋白结合于IFN诱导的PKR上并抑制其活性。因此，很明显，使用流行性感冒病毒来进行感染会导致细胞生物合成的深层变化，包括细胞mRNA的处理及转译方面的变化。 

受感染细胞可以多种方式应答以限制病毒的传播。多个转录因子系统均会被激活，其中包括核因子kB(NFkB)、活化蛋白(AP)-1、干扰素调节因子、信号转导和转录激活因子(STAT)及核因子-IL-6。这些转录因子途径的激活会导致产生趋化细胞因子、促炎性细胞因子及抗病毒细胞因子，该等因子又会促进炎性细胞到感染位点的迁移、产生多种抗病毒效应并在对病毒感染的免疫应答中扮演角色。I型(IFN-α/β)、RANTES、MCP-1及IL-8均为受流行性感冒A病毒感染的上皮细胞所产生的细胞因子。受流行性感冒A病毒感染的单核细胞/巨噬细胞可产生多种其它细胞因子，包括MIP-1α/β/MIP-3α、MCP-1、MCP-3、IP-10、IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-18。 

通常在受流行性感冒A病毒感染后约20至40内会发生由病毒复制、病毒颗粒的产生、病毒蛋白质的持续合成及宿主蛋白质合成的关闭所导致的细胞溶解死亡。诸如染色质凝聚、DNA断裂、细胞萎缩以及巨噬细胞对凋亡细胞的清理作用等细胞凋亡特征改变亦非常明显。 

II.siRNA的选择、设计及合成 

本发明提供了包含靶向一或多种流行性感冒病毒转录物的siRNA及/或shRNA的组合物。如上文对流行性感冒病毒复制周期的描述所示，各种类型的病毒RNA转录物(一级和二级vRNA、一级和二级病毒mRNA及病毒cRNA)皆会出 现于受流行性感冒病毒感染的细胞中并在病毒的生命周期中扮演重要角色。任何一种该等转录物均可作为适宜靶物用于由siRNA根据本发明的直接或间接机制调介的抑制作用。靶向任何一种病毒mRNA转录物的siRNA及shRNA皆可通过一直接方式(例如，通过使转录物降解)来特异性降低转录物自身的含量。此外，如下文所述，靶向某些病毒转录物(例如，NA、PA、PB1)的siRNA及shRNA可间接导致并非由其特别靶向的病毒转录物含量的降低。在可能进行交替剪接的情况下，例如对于可编码M1及M2的mRNA及可编码NS1及NS2的mRNA而言，未剪接转录物或剪接转录物可作为目标转录物。 

可作为本发明RNAi治疗的靶物之潜在病毒转录物包括，例如，1)任何流行性感冒病毒基因组片段；2)可编码任何病毒蛋白质的转录物，包括可编码PB1、PB2、PA、NP、NS1、NS2、M1、M2、HA或NA蛋白质的转录物。应了解，一个siRNA或shRNA可以转录物的vRNA、cRNA及/或mRNA等形式来靶向转录物，尽管如下文之进一步论述，本发明之发明人已获得数据证实病毒mRNA是RNAi的唯一或主要靶物。 

对于任何选定的特定基因靶物而言，最好根据某些导则对用于本发明的siRNA或shRNA进行设计。一般而言，人们期望靶向那些对病毒(与宿主相比较而言)具有特异性的序列且较佳靶向那些对病毒发挥作用具有重要或实质意义的序列。尽管某些病毒基因尤其是那些编码HA及NA的病毒基因的特征在于其具有高突变率且能够耐受某些突变，但其某些区域及/或序列趋于保守。根据本发明的某些实施例，该等序列可为特别适宜的靶物。如下文进一步所述，该等保守区域可通过例如查阅流行性感冒病毒基因序列(大量的流行性感冒病毒基因序列可公开获得)的文献及/或相似性来鉴别。此外，在许多情况下，提供至本发明细胞中的试剂可能会在变成有效抑制剂之前经历一或多个处理步骤(见下文中的进一步论述)；在该等情况下，熟习此项技术者应了解，较佳将相关试剂设计成包括其处理可能必需的那些序列。 

本发明的发明人已发现，当将使用本文所述设计参数选择的大部分序列包 括于一siRNA或shRNA中并按下文所述进行测试时证明该等序列是有效的抑制序列。在受测试的siRNA中，约有15％在受PR8或WSN流行性感冒病毒菌株感染的细胞中表现出很强的作用并可有效地抑制病毒的产生；约40％表现出具有显著作用(即，当在受PR8及/或WSN感染的细胞中存在siRNA及不存在siRNA时病毒产生之间存在统计学显著差异(p＜0.5))；约45％表现出无作用或作用很小。因此，本发明提供了可抑制病毒在受到至少两种不同的流行性感冒病毒亚型中之一感染的细胞中之产生的siRNA及shRNA。 

现在阐述本发明的siRNA及shRNA的一般特征及具体特征。短干扰RNA(siRNA)首先是在对果蝇属中的RNA干扰(RNAi)现象进行研究中发现的，如WO 01/75164中所述。具体而言，人们发现，在果蝇属中，一种被称为DICER的RNA酶I11样酶(Bernstein等人，Nature 409：363，2001)可将较长的双链RNA处理成由两条21nt链组成的较小dsRNA中，这两条链中的每一条皆具有一个5′磷酸根基团和一个3′羟基，并且各包括一个与另一条链完全互补的19nt区域，因此存在一个其末端为2nt-3′突出端的19nt双螺旋区域。图3显示在果蝇属中发现的siRNA之示意图。该结构包括一个19核苷酸双链(DS)部分300，该部分包含一条有义链310和一条反义链315。每条链具有一2nt 3′突出端320。 

该等短dsRNA(siRNA)可用于任何其包括一与dsRNA链中之一互补的区域的基因之沉默表达，据推测这是因为解旋酶活性可解旋siRNA中的19bp双螺旋结构，从而使该siRNA的一条链与目标转录物之间形成另一双螺旋结构。然后，该新双螺旋结构将内切核酸酶复合物RISC引导至靶物RNA中，并在一个位置解离(“剪接”)该靶物RNA，由此产生不受保护的RNA末端，并且该等末端会立即受到细胞机制的降解(图4)。如下文所述，人们亦已知由短RNA物质(微小RNA)引导的其它沉默机制(参见，例如，Ruvkun，G.，Science，294，797-799，2001；Zeng，Y.等人，Molecular Cell，9，1-20，2002)。应注意，对机制的讨论以及展示该等机制的图并非意欲对本发明的作用机制进行任何限制。 

在多个物种(从秀丽线虫(C.elegans)到人类)中均已发现了DICER酶的 同系物(Sharp，Genes Dev.15；485，2001；Zamore，Nat.Struct.Biol.8：746，2001)，提出了RNAi样机制可能使多种不同类型细胞(包括哺乳动物或者甚至是人类细胞)中的基因表达沉默的可能性。然而，已知长dsRNA(例如，具有一其长度超过约30至50个核苷酸的双链区域的dsRNA)可激活哺乳动物细胞中的干扰素应答。因此，哺乳动物细胞中存在长dsRNA并非是为了达成利用果蝇属RNAi机制所观测到的特异性基因沉默，而是期望达成由干扰素调介的非特异性转译抑制，从而可能赞成细胞死亡。因此，并不认为长dsRNA对于抑制特定基因在哺乳动物细胞中的表达有用。 

然而，本发明的发明人及其它人已发现，当将siRNA引入哺乳动物细胞中时，siRNA可有效降低靶基因包括病毒基因的表达。本发明的发明人已发现，靶向多种流行性感冒病毒RNA(包括编码RNA相依性RNA转录酶及核蛋白NP的RNA)的siRNA可大大降低受感染哺乳动物中的病毒产生水平(实例2、4、5、6)。本发明的发明人亦已发现，靶向流行性感冒病毒转录物的siRNA可抑制流行性感冒病毒在完好生物体内即受流行性感冒病毒感染的鸡胚内的复制(实例3)。此外，本发明的发明人已证实，当在病毒感染之前或之后投与靶向流行性感冒病毒转录物的siRNA时可抑制病毒在小鼠中的产生(实例12及14)。此外，本发明的发明人已发现，投与可自其表达siRNA前驱体(shRNA)的DNA载体能够抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。因此，本发明证实使用siRNA、shRNA或使用其在一细胞中之存在可导致siRNA或shRNA之表达的载体进行治疗是抑制流行性感冒病毒感染及/或复制的有效策略。 

尽管不希望受限于任何理论，本发明的发明人仍提出此发现在细胞活性(例如，在受到上述流行性感冒病毒感染后产生的代谢及生物合成活性)的深层改变方面特别重要。流行性感冒病毒感染可抑制诸如细胞内mRNA剪接、转运及转译等基本细胞内过程并可抑制细胞内蛋白质的合成。尽管存在这些变化，但靶向流行性感冒病毒转录物的siRNA可抑制病毒复制这一发现表明，可进行RNAi调介的基因表达抑制的细胞内机制能够在受到流行性感冒病毒(其量足以抑制 流行性感冒病毒基因表达)感染的细胞中继续发挥作用。 

用于本发明的较佳siRNA及shRNA包括一长约19nt的碱基成对区域且可视情况具有一或多个自由或环状末端。例如，图5示出可用作本发明之siRNA或shRNA的各种结构。图5A显示了发现在上述果蝇属系中具有活性的结构且该结构可代表在哺乳动物细胞中呈活性的siRNA种类。本发明涵盖将一具有图5A所示结构的siRNA投与哺乳动物细胞以治疗或预防流行性感冒传染。然而，不需要所投与试剂具有此结构。例如，所投与的组合物可包括任何能够被体内处理成图5A所示结构中的结构，只要所投与试剂不会引起不期望的或有害的事件，例如，诱导干扰素应答(注意，当术语体内与siRNA或shRNA的合成、处理或活性一起使用时一般指发生于一细胞内的事件，此不同于无细胞系统。一般地，细胞可保持于组织培养物中或可为一完好生物的一部分。)。本发明亦可包括投与未精确处理成图5A所示结构的试剂，只要投与该等试剂足以降低病毒转录物的含量，如本文所论述。 

图5B及5C示出了可用来调介RNA干扰的其它结构。该等发夹(茎-环)结构可作为抑制性RNA直接发挥作用或可经细胞内处理以产生一诸如图5A所示结构的siRNA结构。图5B显示一包含一RNA分子的试剂，该RNA分子包含两个可彼此杂交以形成一其被表征为茎400、环410及突出端320的双螺旋区域的互补区域。该等分子据说可自杂交，并且此类结构被称为shRNA。较佳地，茎的长度约为19bp，环的长度约为1至20nt，较佳约为4至10nt且最佳约为6至8nt及/或突出端的长度约为1至20nt，并且较佳约为2至15nt。在本发明的某些实施例中，茎的长度最少为19个核苷酸且最长可不超过约29个核苷酸。熟习此项技术者应了解，由4个核苷酸组成的环或更大的环与较短环相比可能会受到更少的空间限制，因而可能是更佳的。在某些实施例中，突出端包括一5′端磷酸根及一3′端羟基。如下文所论述，一具有图5B所示结构的试剂可易于通过体内或体外转录产生；在若干较佳实施例中，转录物尾端可包括于突出端中，以通常使突出端包括多个U残基，例如，1至5个U残基。应注意，已在哺乳动 物系统中研究的合成siRNA通常具有2个突出U残基。另请参见图20及21中的shRNA结构实例。环可位于与期望抑制的目标转录物互补的区域的5′或3′末端(即，shRNA的反义部分)。 

图5C显示一包括RNA圆环的试剂，该RNA圆环包括足以形成约19bp长的茎400的互补单元。此一试剂可显示出较本文所述其它各种siRNA为高的稳定性。 

在描述siRNA时通常会很方便地提及siRNA的有义链和反义链。一般而言，siRNA有义链双螺旋部分的序列实质上与目标转录物的靶向部分相同，而siRNA的反义链实质上与该区域中的目标转录物互补，如下文之进一步论述。尽管shRNA包含一个可自杂交的RNA分子，但应了解，可认为所形成的双螺旋结构包括有义链及反义链或其部分。因此，本文为方便起见将提及shRNA的有义链及反义链或有义链及反义链部分，其中所述反义链或部分是可形成或能够形成一双螺旋结构的分子之片段且实质上与目标转录物的靶向部分互补，所述有义链或部分是可形成或能够形成一双螺旋结构的分子之片段且实质上与目标转录物的靶向部分相同。 

为描述之目的，下文中的论述通常指siRNA而不是siRNA或shRNA。然而，正如熟习此项技术者所显见，与一siRNA的有义链及反义链相关的教示通常亦适用于一相应shRNA的茎环部分的有义链及反义链部分。因此，一般而言，下文所考虑的内容亦适用于本发明shRNA的设计、选择及输送。 

熟习此项技术者应了解，具有图5中所示任一结构或本文所述任何其它有效结构的试剂可完全由天然RNA核苷酸构成，或相反可包括一或多种核苷酸类似物。业内已熟知多种该等类似物；在治疗研究中最常用的核酸是硫代磷酸酯(关于使用硫代磷酸酯时所涉及的某些要点论述请参见，例如，Agarwal，Biochim.Biophys.Acta 1489：53，1999)。具体而言，在本发明的某些实施例中，可能会期望通过(例如)在一或多个自由链端纳入核苷酸类似物来稳定siRNA结构，从而减少由(例如)外切核酸酶导致的消化。在一或多个自由端纳入脱 氧核苷酸(例如，嘧啶，如脱氧胸苷)即可达成此目的。或者或另外，可能希望纳入一或多种核苷酸类似物以增加或降低19bp茎的稳定性，具体是指与任何可通过siRNA的一条链(或shRNA茎环部分的一条链)与目标转录物的相互作用形成的杂交体相比而言的稳定性。 

根据本发明的某些实施例，可在一siRNA的有义链或反义链中选择性使用各种核苷酸修饰。例如，较佳可在反义链中使用未经修饰的核糖核苷酸，同时在有义链的某些或全部位置使用经修饰的核糖核苷酸及/或经修饰或未经修饰的脱氧核糖核苷酸。参见实例5，其中描述了使用在有义链中2′核苷酸位置加以修饰的siRNA来确定siRNA是否靶向病毒mRNA、vRNA及/或cRNA。根据本发明的某些实施例，在siRNA的反义链及/或有义链的双螺旋部分中仅使用未经修饰的核糖核苷酸，而反义链及/或有义链的突出端可包括经修饰的核糖核苷酸及/或脱氧核糖核苷酸。在本发明的某些实施例中，一或两条siRNA链中可包括一或多种经O-甲基化的核糖核苷酸。 

业内已知多种核苷酸类似物及核苷酸修饰并已对其对于诸如杂交和核酸酶抗性等特性的影响进行了研究。例如，已在选定位置将各种对碱基、糖键及核苷间键引入寡核苷酸中，并对照未经修饰的寡核苷酸对其产生的作用进行了比较。许多修饰已表明可改变寡核苷酸的一或多个方面，例如其与一互补核酸杂交的能力、其稳定性等等。例如，有用的2′-修饰包括卤素、烷氧基及烯氧基。美国专利第6,403,779号、第6,399,754号、第6,225,460号、第6,127,533号、第6,031,086号、第6,005,087号、第5,977,089号以及其中提及的参考文献中揭示了可用于实施本发明的多种核苷酸类似物及修饰。另请参见Crooke，S.(ed.)″Antisense Drug Technology：Principles，Strategies，andApplications″(第一期)，Marcel Dekker；ISBN：0824705661；第一期(2001)及其中提及的参考文献。正如熟习此项技术者所了解的那样，可使用(例如)本文所述的分析或其它适宜分析来测试类似物及修饰，从而选择出可有效减少病毒基因表达的类似物及修饰。关于已发现对于siRNA有用的修饰之进一步论 述，请参见参考文献第137至139。本发明涵盖使用该等修饰。 

在本发明的某些实施例中，类似物或修饰可使siRNA的吸收率增高(例如，使穿过一粘液层的吸收率增高、使口服吸收增高等等)、使血流或细胞中的稳定性增高、使跨细胞膜的能力增加等等。正如熟习此项技术者所了解的那样，类似物或修饰可使Tm改变，此会导致容许siRNA序列及靶物间的更高失配率，同时仍会达成有效的抑制或可对期望目标转录物产生更高或更低的特异性。 

熟习此项技术者仍应了解，用于本发明的有效siRNA试剂可包含一或多个其不为核苷酸或核苷酸类似物的部分。 

一般而言，本发明siRNA的一条链较佳包括一个实质上与可在目标转录物的一部分中发现的区域互补的区域(“抑制区域”)，从而可在siRNA的一条链或部分(反义链)与目标转录物之间于体内形成一精确的杂交体。在其中使用shRNA结构的那些本发明实施例中，该实质上互补的区域较佳包括图5B中所示的大部分或全部茎结构。在本发明的某些较佳实施例中，siRNA或shRNA的相关抑制区域较佳与目标转录物互补；在其他实施例中，一或多个非互补残基位于siRNA/模板双螺旋结构内。较佳能够避免该siRNA/模板双螺旋结构的中心部分中之失配(参见，例如，Elbashir等人，EMBO J.20：6877，2001，其以引用形式并入本文中)。 

一般地，较佳siRNA可与一包括目标转录物中的外显子序列的靶位点杂交。亦不排除与内含子序列杂交，但此在哺乳动物细胞中通常较不佳。在本发明的某些较佳实施例中，siRNA仅与外显子序列杂交。在本发明的某些实施例中，siRNA与一仅包括一个外显子中的序列的靶位点杂交；在其它实施例中，靶位点通过一级转录物的剪接或其它修饰产生。通常，可用于与siRNA杂交从而导致转录物切片及降解的任何位点皆可用于本发明。尽管如此，熟习此项技术者应了解，在某些情况下，可能会期望选择特定的目标转录物区域作为siRNA杂交靶。例如，可能期望避免若干段可能被其它转录物(其降解是人们所不希望的)所共用的目标转录物。一般而言，编码区域及距转录物3′末端较距5′末端为近 的区域皆较佳。 

siRNA可根据多种方法选择。一般地，如上所述，本发明siRNA较佳包括一可与目标转录物的一部分(“靶部分”)中所发现的区域完全互补或实质互补的区域(“抑制区域”或“双螺旋区域”)，从而可于siRNA的反义链和目标转录物之间于体内形成一杂交体。应了解，该双螺旋区域(亦被称为“核心区域”)不包括突出端，尽管突出端(若存在)亦可能与目标转录物互补。较佳地，此完全或实质互补区域包括图3、4及5中所示的大部分或全部双链结构。siRNA的相关抑制区域较佳与目标转录物完全互补。然而，包括一或多个非互补残基的siRNA亦显示可调介沉默，但其抑制程度可能低于利用具有可与目标转录物完全互补的双螺旋部分之siRNA所能达成的程度。一般而言，siRNA双螺旋部分的3′端部分中的失配所造成的抑制效应看来会低于siRNA双螺旋部分的5′端部分中的失配所造成的抑制效应。 

为本文阐述之目的，假定一siRNA核心部分的长度为19个核苷酸，一19核苷酸序列被称为N19。然而，此核心部分的长度可自15至29个核苷酸。此外，假定所选的siRNA N19抑制区域可使siRNA反义链的核心区域(即，与目标转录物互补的部分)与目标转录物完全互补，尽管如上文所述一或多个失配是可容许的。一般地，如果期望一siRNA能够通过传统途径最大程度地，则需要避免其双螺旋区域中的失配。然而，如下文所述，可能期望选择一其降低目标转录物表达的能力要低于其最大能力的siRNA，或可能期望使用一通过另一途径作用的siRNA。在该等情况下，可能需要在该siRNA的双螺旋部分中纳入一或多个失配。一般而言，在所述抑制区域中较佳少于4个残基或者少于约15％的残基与靶物失配。 

在某些情况下，所选siRNA序列能够使整条反义链(包括3′突出端，若存在)与目标转录物完全互补。然而，突出端不一定必须与目标转录物互补或相同。然而，任何期望序列(例如，UU)可能仅简单地连接于一siRNA的反义链及/或有义链19bp核心区域的3′末端以产生3′突出端。一般使用包含一或多 个嘧啶(通常为U、T或dT)的突出端。当合成siRNA时，可能使用T较使用U更为方便，而使用dT代替使用T可赋与更高的稳定性。如上所述，突出端可视情况存在，并且当其存在时，其无需与目标序列本身具有任何关系。应注意，由于shRNA仅具有一个3′端，因此，在进行处理以形成siRNA之前仅可能存在一个3′突出端。 

概言之，一siRNA通常可通过下述进行设计：选择目标转录物中任一适宜长度(例如，19nt)的核心区域；及选择一具有一反义链和一有义链的siRNA，所述反义链的序列与所述核心区域实质上或完全互补，所述有义链的序列与所述siRNA的反义链互补。然后，可将诸如上文所述的3′突出端添加至该等序列上以产生一siRNA结构。因此，不需要反义链中的突出端与目标转录物互补或有义链中的突出端与目标转录物中的序列相同。应了解，一般而言，当目标转录物为一mRNA时，可根据双链cDNA的相应序列而不是根据所述mRNA序列自身来选择siRNA序列，这是因为根据本发明，除了所述cDNA包含T而不是U之外，此cDNA的有义链皆与所述mRNA相同(注意，当涉及流行性感冒病毒复制周期时，不产生双链cDNA，并且细胞中存在的cDNA为单链且与病毒mRNA互补)。 

并非所有siRNA皆可同样有效地降低或抑制任何特定靶基因的表达(参见，例如，Holen，T.等人，Nucleic Acids Res.，30(8)：1757-1766，reportingvariability in the efficacy of different siRNAs)，并且可考虑各种因素来提高所选siRNA的有效性。，例如，较佳可选择外显子而非内含子中的靶部分。一般地，靠近目标转录物3′端的靶部分可能较靠近目标转录物5′端或中间位置的靶部分为佳。siRNA通常可根据Technical Bulletin #003-B版中的“siRNAOligo核苷酸for RNAi Applications”(可自Dharmacon Research公司(Lafayette，CO 80026)获得，该公司是RNA试剂的供货商)中所述的原则进行设计。Technical Bulletins #003(可自Dharmacon的万维网网址www.dharmacon.com/tech/tech003B.html获得)及#004(可自www.dharmacon.com/tech/tech004.html获得)中含有与siRNA设计参数、合成 等有关的各种信息，并且以引用方式并入本文中。亦可能使用的其它要素阐述于Semizarov，D.等人之Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.100，No.11，pp.6347-6352中。 

本发明的一个方面是认识到当一传染病病原体存在多个其基因组序列不同的菌株、亚型等等(统称为变体)时，通常期望选择及/或设计可靶向不同变体中高度保守区域的siRNA及shRNA。具体而言，通过对照足够数量的序列及选择高度保守的区域，可以通过一个siRNA(其双螺旋部分包括此一高度保守区域)来靶向多个变体。一般地，该等区域应足够长以包括所述siRNA的整个双螺旋部分(例如，19个核苷酸)及视情况一或多个3′突出端，但亦可使用其长度短于双螺旋部分总长度的区域(例如，15、16、17或18个核苷酸)。根据本发明的某些实施例，如果一个区域在各变体中是相同的，则此区域是高度保守的。根据本发明的某些实施例，如果一个区域(其可具有能够被包括于siRNA双螺旋部分中的任何长度，例如，15、16、17、18或较佳地，19个核苷酸)在各变体中最多差别一个核苷酸(即，0或1个核苷酸)，则此区域是高度保守的。根据本发明的某些实施例，如果一个区域在多个变体中最多差别两个核苷酸(即，0、1或2个核苷酸)，则此区域是高度保守的。根据本发明的某些实施例，如果一个区域在多个变体中最多差别三个核苷酸(即，0、1、2或3个核苷酸)，则此区域是高度保守的。根据本发明的某些实施例，一siRNA包括一双螺旋部分，此双螺旋部分可靶向一个在至少5个变体中、至少10个变体中、至少15个变体中、至少20个变体中、至少25个变体中、至少30个变体中、至少40个变体中或至少50或更多个变体中高度保守的区域。 

可采用下列步骤来确定一组多个变体中的一区域是否是高度保守的。将该组序列中的一个成员选择为基本序列，即其它序列欲与其对照的序列。通常，此基本序列的长度等于siRNA双螺旋部分的期望长度，例如，15、16、17、18或较佳地，19个核苷酸。根据本发明的不同实施例，该基本序列可为该欲对照组中的一个序列或可为一个通过(例如)确定该组序列中每一位置处最常见的 核苷酸得到的共有序列。 

选定一基本序列后，该组多个变体中每一成员的序列皆与此基本序列进行对照。使用此基本序列与该组多个变体中的任一成员在一序列区域之间的差异数量来确定该基本序列与该成员在所述特定的感兴趣区域内是否是高度保守的。如上所述，在本发明的各个实施例中，如果两个区域之间的序列差异数量为0；0或1；0、1或2；或0、1、2或3，则认为该等区域是高度保守的。在发生差异的位置处，可将siRNA序列选择为与所述基本序列相同或与其它序列之一相同。通常选择存在于所述基本序列中的核苷酸。然而，在本发明的某些实施例中，具体而言，如果发现存在于该组欲对照序列中第二序列的特定位置处的核苷酸较所述基本序列中的核苷酸更多地存在于多个欲对照序列中，则可将siRNA序列选择为与该第二序列相同。此外，根据本发明的某些实施例，如果发生差异位置处的共有核苷酸(最常出现的核苷酸)不同于所述基本序列中的核苷酸，则可使用此共有核苷酸。注意，此可产生一不同于任一欲对照序列的序列(此时以共有序列作为基本序列)。 

实例1显示了根据一组来自6株人类宿主来源的流行性感冒A病毒菌株的序列之对照及一组来自6株不同动物宿主来源(包括人类)的流行性感冒A病毒菌株的序列之对照来选择siRNA序列。应了解，可使用不同的方法来选择高度保守的区域。然而，本发明涵盖其双螺旋部分(及，视情况，包含于siRNA中的任何突出端)是根据高度保守区域(其符合本文提供的标准)进行选择的siRNA，而不管该等高度保守区域是如何选择的。亦应了解，本发明涵盖靶向流行性感冒病毒转录物部分(其不符合本文所述的高度保守区域标准)的siRNA。尽管该等SiRNA与靶向高度保守区域的那些SiRNA相比较不佳，但该等SiRNA对于那些其转录物为该等SiRNA所靶向的病毒而言仍为有效的流行性感冒病毒产生抑制剂。 

表1A列出了在每一个病毒基因片段的一组流行性感冒病毒序列中为高度保守的21-核苷酸区域。表1A中的序列沿5′端至3′端方向列出，其中除了使用T 代替U之外皆与病毒mRNA中存在的序列相同。其中的数字指示序列在病毒基因组中的位置。例如，PB2-117/137表示片段PB2中一自位置17延伸至位置137的序列。根据本发明的某些实施例，为了根据该等序列设计siRNA，将核苷酸3至21选择为siRNA有义链序列的核心区域。一由dTdT组成的2nt 3′突出端被添加至各序列上。一与各序列的核苷酸1至21互补的序列被选择为相应的反义链。例如，为了根据高度保守序列PA-44/64亦即AATGCTTCAATCCGATGATTG(SEQID NO：22)设计一siRNA，选择一具有序列TGCTTCAATCCGATGATTG(SEQ ID NO：109)的19nt核心区域。添加一由dTdT组成的2nt 3′突出端，获得(当T由U代替后)序列5′-UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT-3′(SEQ ID NO：79)。此为siRNA有义链序列。siRNA反义链序列(沿5′端至3′端方向)与SEQ ID NO：22亦即CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQ ID NO：80)互补，其中除2nt 3′突出端以外T已由U代替，该突出端中的T由dT代替。有义及反义siRNA序列可以相似方式自列于表1A中的各序列获得。表2中列出了20个该等siRNA序列。 

列于表1A中的每一序列皆包括一19nt区域(nt 3至21)及一初始2nt序列，该初始序列不存在于相应siRNA的有义链中，而是与siRNA反义链的3′突出端互补。应了解，所述19nt区域可用作有义链来设计各种具有有义链及反义链之一或二者中不同3′突出端的siRNA分子。列于表1A中的每一序列中的核苷酸3至21对应于siRNA的有义序列，自左向右沿5′端至3′端方向列出。相应的反义序列与所列序列的核苷酸1至21互补。因此，具有该等序列的有义链和反义链的杂交(同时将一个3′OH突出端添加至有义链序列上并在两个序列中以U代替T)可产生一具有19个碱基对核心双螺旋区域的siRNA，其中每一条链皆具有一个2核苷酸3′OH突出端。然而，根据上文所述，可使用表1A中给出的序列来设计各种并不精确地具有该结构的siRNA。例如，突出端序列可改变，并且突出端之一或二者之存在对于siRNA调介的有效基因表达抑制而言说并不一定是必需的。此外，尽管一siRNA的双螺旋部分的较佳长度可为19个核苷酸，但较短或较长的的双螺旋部分亦有效。因此，根据表1A中给出的高度 保守序列设计的siRNA可在siRNA有义链中位置3与21之间的区域中仅包括那些核苷酸中的一部分(注意，当一数值范围跟随词语“之间”时，应认为该范围包括两端数值在内)。 

表1B列出了根据流行性感冒病毒的高度保守区域设计的其它siRNA。有义链及反义链二者皆沿5′端至3′端方向列出。一dTdT 3′突出端连接于每一链上。表1B中列出的每一有义链序列中的核苷酸1至19具有一与流行性感冒病毒转录物之高度保守区域相同的序列。相应的反义序列与有义链互补。为下文阐述之目的，一“高度保守区域”是指表1A中所列任何序列中的核苷酸3至21或表1B中所链任何有义链的核苷酸1至19。该等是以双链形式存在于本发明siRNA或shRNA中的区域。该等区域的序列被称为“高度保守序列”。 

本发明提供了其有义链具有包括表1A及1B中所列高度保守序列之全部或一部分的序列之siRNA。本发明进一步提供了其有义部分具有包括表1A及1B中所列高度保守序列之全部或一部分的序列之shRNA。为简便起见，下文论述中阐述了siRNA。然而，应了解，本发明涵盖相应的shRNA，其中shRNA的有义部分包括表1A及1B中所列高度保守序列之全部或一部分。 

一般而言，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之有义链序列包括所列高度保守序列中的至少10个连续核苷酸，较佳为至少12个连续核苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸。一般而言，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之反义链序列包括至少10个与所列高度保守序列的一部分序列完全互补的连续核苷酸，较佳为至少12个连续核苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸。因此，本发明涵盖其相对于与siRNA互补的目标转录物部分而言“偏离”表1A或表1B中的高度保守序列1或多个核苷酸(例如，可达9个核苷酸)的siRNA。 

在本发明的某些实施例中，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之有义链序列包括至少10个连续核苷酸，较佳为至少12个连续核 苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸的高度保守序列，其中此序列与所列序列相差一个核苷酸。在本发明的某些实施例中，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之反义链序列包括至少10个与所述高度保守序列的一部分完全互补(除了可能会有一个核苷酸不同之外)的连续核苷酸，较佳为至少12个连续核苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸。 

在本发明的某些实施例中，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之有义链序列包括所列高度保守序列中的至少10个连续核苷酸，较佳为至少12个连续核苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸，此序列与所列序列相差两个核苷酸。在本发明的某些实施例中，一根据表1A或表1B中给出的高度保守序列设计的siRNA之反义链序列包括至少10个与所述高度保守序列完全互补(除了可能会有两个核苷酸不同之外)的连续核苷酸，较佳为至少12个连续核苷酸，更佳为至少15个连续核苷酸，尤佳为至少17个连续核苷酸，并且最佳为19个连续核苷酸。 

根据本发明的某些实施例，siRNA包括一在可自然传染至少两种不同种类生物的变体中为高度保守的双螺旋部分。根据本发明的某些实施例，siRNA包括一在来源于至少两种不同种类生物的变体中为高度保守的双螺旋部分。根据本发明的某些实施例，siRNA包括一在来源于至少三种不同种类、至少四种不同种类或至少五种不同种类生物的变体中为高度保守的双螺旋部分。该等物种可包括人类、马类(马)、禽类(例如，鸭、鸡)、猪及其它种类。在本发明的某些实施例中，该等物种包括人类。对于许多传染病病原体(例如，许多先前已鉴别的流行性感冒A病毒亚型)而言，人们已熟知此亚型感染一特定物种宿主的能力。此外，人们亦已知许多流行性感冒病毒亚型的物种来源，其反映于该等亚型的名称中。熟习此项技术者能够通过查阅文献或根据已用于流行性感冒A病 毒亚型的方法来确定一传染病病原体是否可自然传染任何特定宿主物种及/或确定此因子的物种来源。可能亦期望选择在不同年份分离的变体及/或可表达不同NA及HA亚型的变体。例如，用来选择siRNA/shRNA双螺旋部分之高度保守序列的变体(如实例所述)包括自人类及多种不同动物来源分离的变体。该等变体包括在不同年份分离的病毒并包括表达几乎所有已知HA及NA亚型的病毒。 

根据本发明的某些实施例，传染病病原体是一其基因组包含多个独立核酸片段(例如，多个独立的RNA片段)的因子。一般而言，此双螺旋部分包括至少10个在多个变体中为高度保守的连续核苷酸，较佳为12个连续核苷酸，并且更佳为至少15个连续核苷酸。较佳地，所述双螺旋部分包括至少17个在多个变体中为高度保守的连续核苷酸。根据本发明的某些实施例，此双螺旋部分包括19个在多个变体中为高度保守的连续核苷酸。除了此双螺旋部分外，siRNA亦可包括一3′突出端于一或多条链上。siRNA有义链中的一突出端可以(但根据本发明的某些实施例不必)与存在于靶区域目标转录物3′端中的序列相同。siRNA反义链中的一突出端可以(但根据本发明的某些实施例不必)与恰位于目标转录物靶部分5′端的核苷酸互补。突出端的长度可为1个核苷酸、2个核苷酸或更多核苷酸，如本文其它各处所述。 

熟习此项技术者应了解，siRNA可根据上述原则展示一解链温度(Tm)及解离温度(Td)范围。Tm被定义为在溶液中50％的核酸及其完全补体呈双螺旋结构时的温度，而Td被定义为在一特定盐浓度及总链浓度下50％的寡核苷酸及其完全滤膜结合补体呈双螺旋结构时的温度，该温度与一个分子被固定于一滤膜上的具体情况有关。可接受Tm的代表性实例可易于使用业内已知的方法(或者以实验方法或使用适宜的经验或理论公式)并基于本文实例中所揭示的siRNA序列来确定。 

一种用于确定实际Tm的常用方法是在一UV分光光度计中使用经恒温的细胞。如果将温度对吸收率作图，则可观察到一条具有两个高原区的S形曲线。在此两个高原区中间处读取的吸收率即对应于Tm。最简单的Td公式是Wallace 法则：Td＝2(A+T)+4(G+C)(Wallace，R.B.；Shaffer，J.；Murphy，R.F.；Bonner，J.；Hirose，T.；Itakura，K.，Nucleic Acids Res.6，3543(1979))。固定化靶链的性质可提供所观测Tm相对于当靶物及探针在溶液中呈自由状态时的数值之净降低量。此降低量约为7-8℃。另一有用的DNA公式(此公式适用于长于50个核苷酸的序列，pH值为5至9且在适宜单价阳离子浓度值范围内)为：Tm＝81.5+16.6 log M+41(XG+XC)-500/L-0.62F，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，XG及XC是序列中G和C摩尔百分比，L是双螺旋结构中最短链的长度，并且F是甲酰胺的摩尔浓度(Howley，P.M；Israel，M.F.；Law，M-F.；Martin，M.A.，J.Biol.Chem.254，4876)。可用于RNA的类似公式为：Tm＝79.8+18.5log M+58.4(XG+XC)+11.8(XG+XC)2-820/L-0.35F，并且对于DNA-RNA杂交体而言为：Tm＝79.8+18.5log M+58.4(XG+XC)+11.8(XG+XC)2-820/L-0.50F。该等公式得自固定化靶杂交体。若干研究已使用用于最近邻迭代的热力学基本设定得出了精确的Tm公式。用于DNA及RNA的公式为：Tm＝(1000AH)/A+ΔS+Rln(Ct/4)-273.15+16.6ln[Na+]，其中ΔH(Kcal/mol)是杂交体最近邻焓变的和，A(eu)是一包含螺旋线初始相关性的常数，ΔS(eu)是最近邻熵变的和，R是气体常数(1.987cal deg″1mol′1)且Ct是链的总摩尔浓度。如果链为自杂交，则Ct/4由Ct代替。热力学参数值可自文献中获得。关于DNA，请参见Breslauer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，3746-3750，1986。关于RNA：DNA双螺旋结构，请参见Sugimoto，N.等人，Biochemistry，34(35)：11211-6，1995。关于RNA，请参见Freier，S.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.83，9373-9377，1986；Rychlik，W.等人，Nucl.Acids Res.18(21)，6409-6412，1990。用来计算Tm的各种计算机程序可自广泛途径获得。参见，例如，其URL为www.basic.nwu.edu/biotools/oligocalc.html的网址。 

某些siRNA与一包括整个3′UTR序列或由此3′UTR序列组成的靶位点杂交。该等siRNA可容许siRNA/模板双螺旋结构中存在大量的失配，具体而言， 可容许双螺旋结构的中央区域内的失配。例如，一或两条链可包括一或多个可形成一如图6中所示突出部的“额外”核苷酸。通常，完全互补序列的长度至少为5个核苷酸，例如，6、7或多个核苷酸，而失配区域的长度可为(例如)1、2、3或4个核苷酸。当与目标转录物杂交时，该等siRNA通常会包括两个完全互补序列，其间以一失配区域分隔开。可采用各种结构。例如，siRNA可包括多个不一致(失配)区域。不一致(失配)区域不需要对称，即，不需要靶物及siRNA二者皆包括不成对核苷酸。 

某些失配可能是人们期望的，因为siRNA/模板双螺旋在3′UTR中的形成可能会通过一种与传统RNA抑制相关但又不同于传统RNA抑制的机制来抑制由模板转录物编码的蛋白质之表达。具体而言，有证据表明结合于模板转录物3′UTR的siRNA可能会降低转录物的转译而不是降低其稳定性。尤其如图6中所示，已知可在上述果蝇属系亦及各种生物中产生siRNA的DICER酶亦能够将一小模板RNA(stRNA)基质处理成抑制剂，此抑制剂可在结合于目标转录物3′UTR内时阻断转录物的转译(参见Grishok，A.等人，Cell 106，23-24，2001；Hutvagner，G.等人，Science，293，834-838，2001；Ketting，R.等人，Genes Dev.，15，2654-2659)。为本发明之目的，本文所述的任何部分或全部双螺旋的短RNA(其一条链结合于一目标转录物并可降低其表达(即，降低转录物的含量及/或降低由此转录物编码的多肽之合成))可被视为一siRNA，而无论此RNA是通过触发降解、通过抑制转译还是通过其它手段来发挥作用。在本发明的某些实施例中，降低转录物的表达涉及转录物的降解。此外，任何可在体内(即在一细胞或生物内)进行处理以产生此一siRNA的前驱体结构(例如，一短发夹RNA，如本文所述)皆可用于实施本发明。 

熟习此项技术者应易于了解，本发明的RNAi诱导剂可采用任何可用技术制备，包括但不限于化学合成、体内或体外酶解或化学解离或体内或体外模板转录。如上所述，本发明的RNA诱导剂可作为包括自互补部分的单一RNA分子(即，可在细胞内处理以产生一siRNA的shRNA)输送，或作为两条彼此杂交的链输送。 例如，可产生两条单独的21nt RNA链，其中每一条链包括一与另一条链互补的19nt区域，并且各条链可杂交在一起以产生一诸如图5A中所示的结构。 

或者，每条链可通过一启动子进行体内或体外转录而产生。例如，可提供一包含两个单独可转录区域的构造，每一可转录区域皆产生一21nt转录物，此转录物中包含一与另一条链互补的19nt区域。或者，可使用一包含相对启动子P1及P2和终止子t1及t2的构造，其中终止子t1及t2之定位能够产生两个如图7所示的不同转录物，其中每一转录物至少与另一转录物部分互补。 

在另一实施例中，通过(例如)一个可编码自互补区域的转录单元之转录来产生一本发明RNA诱导剂作为一单一转录物。图8示出一个此类的本发明实施例。如本文所述，使用一包含第一及第二互补区域且视情况包括一环状区域的模板。通过适宜选择启动子(及视情况其它调控单元，例如终止子)，可使用此一模板进行体外或体内转录。本发明涵盖可编码一或多条siRNA链的构造。 

体外转录可使用各种系统来进行，该等系统包括T7、SP6及T3启动子/聚合酶系统(例如，那些可自Promega，Clontech，New England Biolabs等购得的系统)。正如熟习此项技术者所了解，使用T7或T3启动子通常需要一在其5′端具有两个G残基的siRNA序列，而使用SP6启动子通常需要一在其5′端具有一个GA序列的siRNA序列。包括T7、SP6或T3启动子在内的载体已为业内所熟知且可易于修饰以引导siRNA之转录。当在体外合成siRNA时，可允许其在转染一个体或输送至一个体之前杂交。应了解，本发明siRNA组合物不需要完全由双链(杂交)分子组成。例如，siRNA组合物可包括一较小比例的单链RNA。例如，当已杂交及未杂交分子之间因有义及反义RNA链的不同比率、转录在两部分自互补RNA的合成之前终止等原因而达到平衡时会发生此种情况。一般而言，较佳组合物包括至少约80％的双链RNA，至少约90％的双链RNA，至少约95％的双链RNA，或甚至至少约99-100％的双链RNA。然而，siRNA组合物可包含少于80％的杂交RNA，条件是其包含足量的有效双链RNA。 

熟习此项技术者应了解，当拟于体内产生本发明的siRNA或shRNA剂时， 通常较佳的是其通过一或多个转录单元的转录而产生。可视情况对一级转录物进行处理(例如，通过一或多种细胞酶)以产生可达成基因抑制的最终试剂。应进一步了解，可易于选择适宜启动子及/或调控单元以使相关转录单元在哺乳动物细胞中表达。在本发明的某些实施例中，可能期望使用一可调控启动子。在其它实施例中，可能期望组成性表达。应注意，当提及siRNA或siRNA前驱体的合成(转录)时本文所用术语“表达”并不隐示经转录RNA的转译。 

在本发明的某些较佳实施例中，用于引导一或多个siRNA或shRNA转录单元之体内表达的启动子是用于RNA聚合酶III(Pol III)的启动子。Pol III可引导小转录物的合成，当遇到模板中一由4至5个T残基组成的序列时此合成会终止。某些Pol III启动子(例如，U6或H1启动子)在转录区域内不需要顺式作用调控单元(除了首先转录的核苷酸之外)，并且因而在本发明的某些实施例较佳，这是因为其易于允许选择期望的siRNA序列。对于天然的U6启动子而言，首先转录的核苷酸是鸟苷；而对于天然的H1启动子而言，首先转录的核苷酸是腺嘌呤(参见，例如，Yu，J.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，99(9)，6047-6052(2002)；Sui，G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，99(8)，5515-5520(2002)；Paddison，P.等人，Genes and Dev.，16，948-958(2002)；Brummelkamp，T.等人，Science，296，550-553(2002)；Miyagashi，M.及Taira，K.，Nat.Biotech，20，497-500(2002)；Paul，C.等人，Nat.Biotech.，20，505-508(2002)；Tuschl，T.等人，Nat.Biotech.，20，446-448(2002))。因此，在本发明的某些实施例中，例如，当转录由U6启动子驱动时，较佳的5-核苷酸siRNA序列是G。在本发明的某些实施例中，例如，当转录由H1启动子驱动时，5′核苷酸可为A。 

根据本发明的某些实施例，用于Pol II的启动子也可以如(例如)Xia，H.等人在Nat.Biotechnol.，20，第1006-1010页，2002中所述来使用。如其中所述，可使用某些构造，其中一发夹序列靠近并且并列于一转录起始位点并跟随有一polyA盒，从而导致在转录发夹中产生最少的突出端甚至无突出端。在 本发明的某些实施例中，可以使用组织特异性启动子、细胞特异性启动子或可诱导的Pol II启动子，但条件是必须满足上述要求。此外，在本发明的某些实施例中，用于Pol I的启动子也可以如(例如)(McCown 2003)中所述来使用。 

应了解，为siRNA或shRNA的合成提供模板的构造(例如，如图7和图8中所示的构造)的体内表达较佳可以通过将构造引入到一载体(例如，一DNA质粒或病毒载体)中并将此载体引入到哺乳动物细胞中来完成。可选择任何一种载体，但在某些实施例中可能期望选择一种可将构造输送到一个或更多个易受流行性感冒病毒感染的细胞中的载体。本发明涵盖包含siRNA和/或shRNA转录单元的载体，以及包含该等载体的细胞或经过其它改造包含可编码一条或更多条siRNA或shRNA链的转录单元的细胞。在本发明的某些优选实施例中，本发明载体为基因治疗载体，其适合将siRNA或shRNA表达构造输送到哺乳动物细胞(例如，饲养动物的细胞)并且最优选为人类细胞中。该等载体可以在一个体暴露于流行性感冒病毒之前或之后投与此个体，从而预防或治疗由此病毒感染引起的疾病或病症。本发明的RNAi诱导载体可以在一含有任一种下文所述输送剂的组合物内输送。 

因此，本发明提供了各种病毒和非病毒载体，其在一细胞中的存在可导致一个或更多个自杂交或彼此相互杂交的RNA的转录，从而形成抑制至少一种流行性感冒病毒转录物在此细胞中的表达的shRNA或siRNA。在本发明的某些实施例中，两条单独的互补siRNA链是使用一种包含两个启动子的载体来转录的，其中每一启动子均可以引导一条siRNA链的转录，即，每一启动子均操作性地连接到一siRNA模板上致使转录发生。该等两个启动子可位于同一方位，在此情况下，每一启动子均操作性地连接到一条siRNA链的模板上。或者，该等启动子可位于相反方位作为一个模板的两端，致使从该等启动子进行转录，合成两条互补的RNA链。 

在本发明的其它实施例中，可使用一包含一启动子(其可驱动一个包含有两个互补区域的RNA(例如，shRNA)分子的转录)的载体。在本发明的某些实 施例中，使用包含多个启动子的载体，其中每一启动子可驱动一个包含有两个互补区域的RNA分子之转录。或者，可通过一个启动子或通过多个启动子来转录多个不同的shRNA。各种组态均是可能的。例如，一个启动子可引导一包含有多个自互补区域的RNA转录物之合成，其中每一个自互补区域皆可通过杂交产生多个茎-环结构。该等结构可在体内通过(例如)DICER解离以产生多个不同的shRNA。应了解，该等转录物较佳在转录物的3′端而不是在各shRNA单元之间包含一个终止信号。亦应了解，自其可产生多个siRNA的单一RNA无需于体内产生，而是可代之以化学合成或体外转录等方式产生及通过外源提供。 

在本发明的另一实施例中，载体包括多个启动子，每一启动子皆可引导一可通过杂交形成一shRNA的自互补RNA分子之合成。该等多个shRNA可全部靶向相同的转录物，或其可靶向不同的转录物。其可靶向任何病毒转录物的组合。实例11提供了在本发明的某些实施例中通过DNA载体转录用于抑制流行性感冒病毒感染的shRNA之设计和测试的详细内容。另请参见图21。一般而言，根据本发明的某些实施例，在细胞中表达的siRNA及/或shRNA包括一长约19个核苷酸的碱基成对(双螺旋)区域。 

熟习此项技术者应进一步了解，本发明siRNA或shRNA的体内表达可产生能够长期(例如，长于数天，较佳至少数周至数月，更佳至少至少一年或更长，如果可能在其寿命期限内)产生siRNA或shRNA的细胞。该等细胞可无限期地不受流行性感冒病毒的影响。 

用于所述组合物中以提供siRNA及shRNA之细胞内表达的较佳病毒载体包括(例如)逆转录病毒载体和慢病毒载体。参见，例如，Kobinger，G.P.等人，Nat Biotechnol 19(3)：225-30，2001，其中阐述了一基于线状病毒包膜蛋白质-假型HIV载体的载体，此载体可通过顶面有效转导完好的呼吸道上皮细胞。另请参见Lois，C.等人，Science，295：868-872，2002年2月1日，其中阐述了FUGW慢病毒载体；Somia，N.等人，J.Virol.74(9)：4420-4424，2000；Miyoshi，H.等人，Science 283：682-686，1999；及美国专利第6,013,516号。 

在本发明的某些实施例中，载体是慢病毒载体，其在一细胞中之存在可导致一或多个可自杂交或彼此相互杂交的RNA之转录，从而形成可抑制至少一种转录物在细胞中之表达的ShRNA或siRNA。为阐述之目的，假定此载体为慢病毒载体，例如，阐述于Rubinson，D.等人，Nature Genetics，Vol.33，pp.401-406，2003中的那些载体。然而，应了解，亦可使用其它逆转录病毒载体和慢病毒载体。根据本发明的某些实施例，慢病毒载体可为一慢病毒转移质粒或一慢病毒颗粒，例如，一能够感染细胞的慢病毒。在本发明的某些实施例中，慢病毒载体包含一操作性地连接到一启动子的核酸片段，因而可通过此启动子之转录(即，由此启动子引导的转录)合成一包含有可杂交互补区域的RNA从而形成一靶向目标转录物的shRNA。根据本发明的某些实施例，shRNA包含一长约19个核苷酸的碱基成对区域。根据本发明的某些实施例，RNA可包含两个以上的互补区域，因而可通过自杂交产生多个碱基成对区域，其间以环或单链区域间隔。该等碱基成对区域可具有相同或不同的序列，并且因而可靶向单一转录物的相同或不同区域或靶向不同的转录物。 

在本发明的某些实施例中，慢病毒载体包含一核酸片段，该片段的两端为两个呈相反方位的启动子，其中该等启动子有效连接至此核酸片段上，因而可通过该等启动子的转录合成两个可通过彼此杂交以形成一靶向目标转录物的siRNA之互补RNA。根据本发明的某些实施例，siRNA包含一长约19个核苷酸的碱基成对区域。在本发明的某些实施例中，慢病毒载体包含至少两个启动子及至少两个核酸片段，其中每一启动子皆操作性地连接到一核酸片段上，因而可通过该等启动子之转录来合成两个可通过彼此杂交以形成一靶向目标转录物的siRNA之互补RNA。 

如上所述，慢病毒载体可为慢病毒转移质粒或慢病毒颗粒(例如，慢病毒或假型慢病毒)。参见(例如)美国专利第6,013,516号及参考文献第113至117以获得关于慢病毒转移质粒、慢病毒颗粒及慢病毒表达系统的进一步论述。如业内所知，慢病毒具有一RNA基因组。因此，当慢病毒载体为慢病毒颗粒时(例 如，一传染性慢病毒)，病毒基因组必须进行逆转录及第二链合成以产生能够引导RNA转录的DNA。此外，当本文提及诸如启动子、调控单元等单元时，应了解，该等单元的序列在本发明的慢病毒颗粒中是以RNA形式存在，并且在本发明的慢病毒转移质粒中是以DNA形式存在。此外，当一RNA的合成模板由存在于慢病毒颗粒中的RNA“提供”时，应了解，此RNA必须进行逆转录及第二链合成以产生能够作为RNA合成(转录)模板的DNA。当将可为siRNA或shRNA提供合成模板的载体引入其中发生此合成的细胞中时，认为该等载体能够提供siRNA或shRNA。 

本发明的siRNA或shRNA可通过任何可用方法引入细胞中。例如，siRNA、shRNA或编码其的载体可通过传统的转化或转染技术引入细胞中。本文所用术语“转化”及“转染”意指各种业内公认的用于将外来核酸(例如，DNA或RNA)引入一细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀技术、DEAE-葡萄聚糖调介的转染、脂转染法、注射或电穿孔。如下文所述，本发明的一方面包括各种输送剂于将siRNA、shRNA及/或可为siRNA或shRNA提供合成模板的载体(DNA载体或病毒载体)引入细胞中之用途，该等输送剂包括但不限于：阳离子聚合物；各种肽分子转运蛋白，包括富精氨酸肽、富组氨酸肽及阳离子和中性脂质；各种非阳离子性聚合物；脂质体；碳水化合物；及表面活性材料。本发明亦涵盖经任何一种方式(例如，通过将一输送加强部分添加至输送剂)修饰的输送剂之用途，如下文之进一步阐述。 

本发明涵盖任何经操作以包含本发明siRNA、shRNA或可为本发明siRNA或shRNA提供合成模板的载体之细胞。较佳地，所述细胞为哺乳动物细胞，尤佳为人类细胞。最佳地，所述细胞为呼吸道上皮细胞。视情况，该等细胞亦可包含流行性感冒病毒RNA。在本发明的某些实施例中，所述细胞为一生物体内的非人类细胞。例如，本发明涵盖经改造以包含或表达本发明siRNA或shRNA的转基因动物。该等动物可用于研究本发明siRNA及shRNA的功能及/或活性、及/或用于研究流行性感冒病毒感染/复制系统。本文所用术语“转基因动物”为非人 类动物，其中所述动物的一或多个细胞包括转基因。转基因是一外源DNA或内源染色体DNA的重配(例如，缺失)，其较佳整合于或发生于转基因动物细胞的基因组中。转基因可引导一编码siRNA产物在转基因动物的一或多种细胞或组织中之表达。较佳的转基因动物是非人类哺乳动物，更佳的是啮齿类动物(例如，小鼠或大鼠)。转基因动物的其它实例包括非人类灵长类动物、绵羊、狗、奶牛、山羊、禽类(例如，鸡)、两栖动物及诸如此类。根据本发明的某些实施例，转基因动物有许多种类，可用作动物模型(例如，鼠类、雪貂或灵长类动物)来测试潜在的流行性感冒治疗方案。 

III.病毒RNA累积的广泛抑制 

RNAi调介的基因表达抑制的一个普遍特性是其特异性。换句话说，靶向特定转录物序列的siRNA通常并不会导致其它转录物的降解。然而，如实例6中所述，本发明的发明人已发现，靶向NP、PA或PB1转录物的siRNA亦会造成其它病毒RNA(包括其序列与NP或PA序列不相关的RNA)的含量降低。此外，如实例5所示，尽管siRNA的直接靶物看起来可能是病毒mRNA，但投与靶向NP、PA的siRNA除了可抑制NP或PA mRNA的累积外，亦可抑制相应vRNA及cRNA的累积。如实例7中所示，该等效应并不是由干扰素应答或由病毒调介的病毒转录物降解造成的。此外，此效应对于病毒转录物而言具有特异性，因为其对于多种细胞内转录物仅有很小的影响或并没有影响。实例6中论述了可能调介此效应的潜在机制。无论究竟是何种机制在起作用，但该等发现表明，在某些条件下投与一靶向第二转录物的siRNA亦可能会影响第一转录物或不由此siRNA靶向的转录物，包括(例如)对此第二转录物缺乏显著同一性或同源性的第一转录物。具体而言，当由所述第二转录物编码的蛋白质(或可能是该转录物本身)参与所述第一转录物的合成、处理或稳定性时会发生此种情况。 

因此，本发明提供了一种抑制第一转录物的方法，该方法包括投与一靶向第二转录物的siRNA，其中对所述第二转录物的抑制会导致对所述第一转录物的抑制。一般而言，第一及第二转录物至少在所靶向的第二转录物部分中是不相 同的或非同源的。然而，在本发明的各种实施例中，第一及第二转录物可能会在所靶向的第二转录物部分(例如，一对应于siRNA的19核苷酸双螺旋部分的部分)中共用一个具有同源性或同一性的区域。如果siRNA并不包括一个对第一转录物(其至少由5个连续核苷酸组成)具有同一性或同源性的区域，则此siRNA并不靶向第一转录物。一般而言，靶向第二转录物的siRNA并不靶向第一转录物。如果存在一个具有同源性或同一性的共用区域，则此区域可以但不一定必须包括靶序列的一部分或全部。适宜的第二转录物(目标转录物)包括可编码诸如RNA结合蛋白等蛋白质或在稳定RNA方面发挥作用的任何其它蛋白质的那些转录物。一般而言，词语“抑制”是指转录物含量或量的降低。然而，亦包括其它抑制机制。抑制方法可为直接方法或间接方法。 

如实例6中的进一步论述，尽管不希望受限于任何理论，本发明的发明人仍提出，靶向NP的转录物在降低NS、M、NS、PB1、PB2及PA基因转录物的mRNA、vRNA及cRNA累积水平方面之能力很可能是由于NP蛋白质在结合及稳定该等转录物方面的重要性所致，而不是因为NP特异性siRNA非特异性靶向RNA降解所致。此外，尽管不希望受限于任何理论，本发明的发明人仍提出，靶向PA的转录物在降低NS、M、NS、PB1、PB2及PA基因转录物的mRNA、vRNA及cRNA累积水平方面之能力很可能是由于PA蛋白质在合成病毒转录物方面的重要性所致，而不是因为PA特异性siRNA非特异性靶向RNA降解所致。当存在PA特异性siRNA时，新转录的PA mRNA将被降解，从而导致对PA蛋白质合成的抑制。尽管针对每个流行性感冒病毒粒子(1)会存在约30至60份PA蛋白质(RNA转录酶)，但是，当没有新合成的PA蛋白质时，亦可能会抑制进一步的病毒转录和复制。人们认为，某些siRNA在降低不由其特异性靶向的转录物的含量方面之能力尚未在其它系统中得到证实。 

本发明的发明人已认识到，编码其在稳定其它RNA分子方面或在合成RNA方面发挥作用的蛋白质的目标转录物可能是用于抑制一传染病病原体的生长、复制、感染性等方面的较佳靶物。因此，本发明提供了一种抑制一传染病病原 体的生长、感染性或复制的方法，该方法包括投与一靶向一目标转录物的siRNA，其中对此目标转录物的抑制会造成对至少一种其它转录物的抑制，其中所述其它转录物具有传染病病原体特异性。此目标转录物可为但不必为一传染病病原体特异性转录物。该至少一种其它转录物可以但不一定必须与所述目标转录物共用一个具有同源性或同一性的区域。如果存在一个具有同源性或同一性的共用区域，则此区域可以但不一定必须包括靶序列的一部分或全部。适宜的目标转录物包括可编码诸如RNA结合蛋白等蛋白质或在稳定RNA方面发挥作用的任何其它蛋白质的那些转录物。适宜目标转录物亦包括那些在RNA合成或处理方面发挥作用的转录物，例如，聚合酶、逆转录酶等等。 

本文所述的结果表明，一般而言，靶向可编码RNA或DNA结合蛋白(其通常结合于传染病病原体特异性核酸(DNA或RNA))的转录物之siRNA很可能具有广泛作用(例如，对其它传染病病原体特异性转录物的作用)而不是仅仅降低所靶向RNA的含量。同样地，本文所述的结果表明，一般而言，靶向传染病病原体聚合酶基因(RNA聚合酶、DNA聚合酶或逆转录酶)的siRNA很可能具有广泛作用(例如，对其它传染病病原体特异性转录物的作用)而不是仅仅降低聚合酶RNA的含量。 

可编码能够特别稳定传染病病原体RNA而非那些宿主细胞RNA的蛋白质之目标转录物为选择性降低传染病病原体特异性转录物的含量提供了机会，同时并不影响宿主细胞转录物的含量。因此，该等siRNA之输送不会对宿主生物细胞产生负面影响。该方法并不限于可编码能够特别稳定传染病病原体RNA而非那些宿主细胞RNA的蛋白质之转录物，而且亦适用于可编码能够特别参与传染病病原体特异性转录物(即，其模板为传染病病原体基因组而非宿主细胞基因组的一部分的转录物)而非宿主细胞转录物的处理、合成及/或转译中任一方面的蛋白质之转录物。该等蛋白质包括但不限于参与传染病病原体特异性转录物而非宿主细胞转录物的合成、剪接及/或封端的蛋白质。 

IV.可抑制流行性感冒病毒的siRNA及shRNA之鉴别和测试 

如上所述，本发明提供了一种用于鉴别可用作流行性感冒病毒感染及/或复制抑制剂的siRNA之系统。如上所述，由于是在细胞内对shRNA进行处理以产生其双螺旋部分具有与shRNA的茎结构序列相同的序列之siRNA，因此，该系统同样可用于鉴别可用作流行性感冒病毒感染抑制剂的shRNA。为阐述之目的，该部分论述皆指siRNA，但该系统亦涵盖相应的shRNA。本发明尤其证实了靶向病毒基因的siRNA之成功制剂可阻断或抑制病毒感染及/或复制。本文所述的技术和试剂可易于应用于设计潜在的新颖siRNA、靶向其它基因或基因区域及测试其在抑制流行性感冒病毒感染及/或复制方面的活性，如本文中所论述。人们预期流行性感冒病毒会继续突变并经历重配，因此人们期望继续开发并测试不同靶向的新颖siRNA。 

在本发明的各种实施例中，潜在的流行性感冒病毒抑制剂可通过在以流行性感冒病毒基因组或其部分转染之前、与此同时或在此之后(例如，在若干分钟、小时或最多若干天内)或者在以流行性感冒病毒感染之前、与此同时或在此之后将候选siRNA引入细胞中(例如，通过外源投与或通过将一可引导siRNA之内源合成的载体或构造引入细胞中)来进行测试。或者，潜在的流行性感冒病毒抑制剂可通过将候选siRNA引入经流行性感冒病毒生产性感染的细胞(即，产生子代病毒的细胞)中来进行测试。然后可对候选siRNA在降低目标转录物含量及/或抑制或阻抑病毒生命周期中一或多个方面或特性(例如，病毒复制、致病性及/或感染性)方面的能力进行评价。例如，病毒颗粒的产生及/或病毒蛋白质的产生等可使用业内已知的方法直接或间接进行评价。 

其中已输送有本发明siRNA组合物的细胞(测试细胞)可与未接收到本发明组合物的相似或相当细胞(对照细胞，例如，未接收到siRNA或接收到对照siRNA(例如，靶向一诸如GFP等非病毒转录物的siRNA)的细胞)进行比较。测试细胞对流行性感冒病毒感染的易感性可与对照细胞对感染的易感性进行比较。可相对于对照细胞来比较测试细胞中病毒蛋白质及/或子代病毒的产生。可以类似方式比较病毒感染性、复制、致病性等方面的其它指征。标准体外病毒 分析可使用噬菌斑抑制、病毒细胞病变效应(CPE)、及病毒血凝素或其它蛋白质、病毒产率抑制等来进行。CPE可以目测方式通过染色吸收来测定。参见，例如，Sidwell，R.W.及Smee，D.F，“In vitro and in vivo assay systems forstudy of influenza virus inhibitors”Antiviral Res 2000 Oct；48(1)：1-16，2000。一般而言主，测试细胞及对照细胞来自同一物种且具有相似或相同的细胞类型。例如，可对来自相同细胞系的细胞进行比较。当测试细胞为一原代细胞时，通常对照细胞亦为一原代细胞。通常使用相同的流行性感冒病毒菌株来比较测试细胞和对照细胞。 

例如，如实例2所述，候选siRNA抑制流行性感冒病毒产生的能力可通过以下方便地测得：(i)将候选siRNA输送至细胞(可在暴露于流行性感冒病毒之前、同时或之后进行)；(ii)使用血凝素分析来评价病毒血凝素的产生；及(iii)比较存在siRNA时产生的血凝素量及不存在siRNA时产生的血凝素量(该测试不需要包括一其中不存在siRNA的对照，但可能使用以前获得的关于在不存在抑制时所产生血凝素量的信息。)。血凝素量的减少强烈表明了病毒产生量的减少。此分析可用来测试靶向任何病毒转录物的siRNA且并不限于靶向可编码病毒血凝素的转录物之siRNA。 

候选siRNA减少目标转录物量的能力亦可通过使用(例如)北方墨点法、核酸酶保护分析、逆转录(RT)-PCR、实时RT-PCR、微阵列分析等测量目标转录物的量来进行评价。候选siRNA抑制目标转录物编码(以转录时含量或转录后含量)多肽之产生的能力可使用各种基于抗体的方法来测量，该等方法包括但不限于西方墨点法、免疫分析、ELISA、流式细胞术、蛋白微阵列等等。一般而言，可使用任何用于测量目标转录物量或目标转录物编码多肽量的方法。 

一般而言，某些较佳流行性感冒病毒抑制剂可将目标转录物含量降低至少约2倍，较佳至少约4倍，更佳至少约8倍，至少约16倍，至少约64倍或甚至为一相对于不存在抑制剂时(例如，在一不存在抑制剂的对照细胞中)的含量更大的程度。通常，某些较佳的流行性感冒病毒抑制剂可抑制病毒复制，因 而，含此抑制剂的细胞中的复制水平较不含此抑制剂的对照细胞中的复制水平低至少约2倍、较佳至少约4倍、更佳至少约8倍、至少约16倍、至少约64倍、至少约100倍、至少约200倍或甚至更大的程度。具体而言，如实例2所述，本发明的发明人已发现，通过血凝素产生所测得的病毒效价在受流行性感冒病毒菌株A/PR/8/34(H1N1)感染后投与单剂量siRNA(PB1-2257)的细胞中降低了256倍还要多，在受流行性感冒病毒菌株A/WSN/33(H1N1)感染后投与单剂量siRNA(NP-1496及其它)的细胞中降低了120倍还要多。当在一0.001之MOI下通过噬菌斑分析进行测量时，抑制倍数甚至可以更高，即，至少约30,000倍。即使在一0.1之MOI下，NP-1496亦可将病毒产生抑制约200倍。 

某些较佳流行性感冒病毒抑制剂可抑制病毒复制，因而，在细胞受到感染及投以siRNA后的至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少60小时内不能测得可测出的病毒效价。某些较佳流行性感冒病毒抑制剂可在投与siRNA后的至少24小时、至少36小时、至少48小时或至少60小时内防止(即，降低至不可测出水平)或显著降低病毒复制。根据本发明的各种实施例，病毒复制的显著降低指一较不存在siRNA时的可能存在量低约90％的降低，一较不存在siRNA时的可能存在量低约75％的降低，一较不存在siRNA时的可能存在量低约50％的降低，一较不存在siRNA时的可能存在量低约25％的降低，或一较不存在siRNA时的可能存在量低约10％的降低。病毒复制的降低可使用任何适宜方法来测量，包括但不限于HA效价测量。 

潜在的流行性感冒病毒抑制剂亦可使用任何一种已开发出的动物模型来测试。包含候选siRNA、能够引导该等siRNA在一宿主细胞中之合成的构造或载体、或经改造或操作以包含候选siRNA的细胞的组合物可在受流行性感冒病毒的感染之前、同时或之后投与。评价所述组合物在受到流行性感冒病毒感染但尚未接受所述潜在流行性感冒抑制剂的动物中防止病毒感染及/或延缓或防止流行性感冒相关症状之出现及/或减轻该等症状严重程度等方面的能力。该等模型包括但不限于鼠类、鸡、雪貂及非人类灵长类动物等用于流行性感冒病毒感染的 模型，所有该等皆为业内所熟知并可用于测试潜在流行性感冒治疗及疫苗的效用。参见，例如，上文引用的Sidwell，R.W.及Smee，D.F。该等模型可能涉及使用天然的流行性感冒病毒菌株及/或经修饰或修改以存在于特定宿主中的菌株(例如，WSN或PR8菌株，其经修改以在小鼠中进行复制)。参见实例6、7、8、9及10，以获得对siRNA组合物体外及体内测试方法的进一步论述。 

V.用于改进siRNA、shRNA及RNA诱导载体之输送的组合物 

本发明的发明人已认识到，有效的RNAi治疗(通常包括对流行性感冒病毒感染的预防及治疗)可通过将siRNA、shRNA及/或RNAi诱导载体高效输送于通常会发生流行性感冒感染的呼吸道细胞中而得到加强。对于流行性感冒病毒而言，必须将该等试剂引入通常会发生感染的呼吸道细胞中。当用于人类中时，较佳使用可有利于siRNA或shRNA之细胞内吸收的非病毒方法。因此，本发明提供了包含任何一种非病毒输送剂以增强siRNA、shRNA及/或RNAi诱导载体于完好生物体(例如，哺乳动物及禽类)细胞中之输送的组合物。本文所用概念“输送”包括siRNA、shRNA或RNAi诱导载体自其机体进入位点至其将发挥作用的细胞位置之转运、所述siRNA、shRNA或载体的细胞内吸收以及随后使siRNA或shRNA可用于细胞内RNAi机制所涉及的任何步骤(例如，siRNA或shRNA自核内体的释放)。 

因此，本发明涵盖包含一RNAi诱导剂(例如，siRNA、shRNA或RNAi诱导载体)及任何一种输送剂的组合物，所述RNAi诱导剂于一细胞中之存在可导致siRNA或shRNA之产生，其中所述siRNA或shRNA靶向一流行性感冒病毒转录物，并且所述输送剂包括但不限于阳离子聚合物、经修饰的阳离子聚合物、肽分子转运蛋白(包括富精氨酸肽或富组氨酸肽)脂质(包括阳离子脂质、中性脂质及其组合)、脂质体、聚脂复合体、非阳离子性聚合物、适合引入肺部的表面活性剂等等。(应注意，上文中及各处所用词语“其中”意指所述除那些因细胞中存在一载体而产生的siRNA或shRNA之外的组合物中之siRNA或shRNA。)某些输送剂经修饰以引入一可增强siRNA、shRNA或RNAi诱导载体至细胞(所述 siRNA、shRNA或RNAi诱导载体欲于该等细胞中抑制一流行性感冒病毒的转运)之输送或增强其选择性输送的部分。在本发明的某些实施例中，输送剂可生物降解。在下文以及与本案同目申请且名称为“Compositions and Methods forDelivery of Short Interfering RNA and Short Hairpin RNA to Mammals(用于将短干扰RNA及短发夹RNA输送至哺乳动物中的组合物和方法)”的同在申请中的美国专利申请案中阐述了某些适用于本发明的输送剂，此专利案以引用方式并入本文中。 

A.阳离子聚合物及经修改的阳离子聚合物 

人们经研究得出可使用基于阳离子聚合物的系统作为DNA转染载剂(35)。人们认为，阳离子聚合物促进DNA细胞内吸收的能力部分地产生于其结合至DNA及将大质粒DNA分子缩合成较小DNA/聚合物复合物以便于更高效内吞的能力。DNA/阳离子聚合物复合物亦因其与细胞表面糖蛋白中带负电荷的唾液酸残基之间的静电相互作用而可用作生物粘结剂(36)。此外，某些阳离子聚合物很明显可促进内体膜的破裂因而可促进DNA于胞质溶胶中的释放(32)。因此，本发明提供了包含下述的组合物：(i)一靶向一流行性感冒病毒转录物的RNAi诱导体；及(ii)一阳离子聚合物。本发明进一步提供了用于抑制靶基因表达的方法，该方法包括将一种组合物投与一哺乳动物个体，其中所述组合物中包含一靶向一流行性感冒病毒转录物的RNAi诱导体。具体而言，本发明提供了用于治疗及/或预防流行性感冒病毒感染的方法，该方法包括将一种组合物投与一哺乳动物个体，其中所述组合物中包含一靶向一流行性感冒病毒转录物的RNAi诱导体及一阳离子聚合物。在本发明的各种实施例中，RNAi诱导体为一siRNA、shRNA或RNAi诱导载体。 

一般地，一阳离子聚合物为一其在约生理pH值时带正电荷的聚合物，此生理pH值例如可介于约7.0至7.6之间，较佳介于约7.2至7.6之间，更佳为约7.4。该等阳离子聚合物包括但不限于聚赖氨酸(PLL)、聚精氨酸(PLA)、聚组氨酸、聚乙烯亚胺(PEI)(37)(包括线性PEI及低分子量PEI，如例如于(76) 中所述)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(38)及脱乙酰壳多糖(39，40)。应了解，某些该等聚合物包含伯胺基、亚氨基、胍基及/或咪唑基。较佳的阳离子聚合物具有较低的毒性及较高的DNA转染效率。 

适宜阳离子聚合物亦包括含有任一上述聚合物之亚单元的共聚物，例如，赖氨酸-组氨酸共聚物等等。各种亚单元在共聚物中的百分比不需要相同，而是可进行选择以便(例如)最优化诸如与核酸形成复合物同时使细胞毒性最小化的能力等性质。此外，该等亚单元不需以一种规律形式交替。实例中阐述了用来评价各种聚合物期望性质的适宜分析。较佳的阳离子聚合物亦包括诸如上述的聚合物，其中可进一步纳入任何一种修饰。适宜修饰如下文所述，其包括但不限于乙酰基、琥珀酰基、酰基或咪唑基(32)。 

尽管不希望受限于任何理论，据信诸如PEI等阳离子聚合物可与DNA缩合或缩聚成带正电荷的颗粒，该等颗粒能够在细胞表面与阴离子蛋白多糖类相互作用并通过内吞作用进入细胞。该等聚合物可具有作为“质子海绵”之性质，其可缓冲内体pH并防止DNA降解。连续流入的质子量亦可诱发核内体渗透溶胀及破裂，此可为DNA颗粒提供一至细胞质的逃逸机制。(关于可用于实施本发明的PEI及其它阳离子聚合物的进一步信息，请参见，例如，参考文献85-87；U.S.S.N.6,013,240；WO9602655)。根据本发明的某些实施例，其中使用的市售PEI试剂的商品名为jetPEI^TM(Qbiogene，Carlsbad，CA)，其为一种线性形式的(U.S.S.N.6,013,240)。 

如实例12所述，本发明的发明人已发现，当在受流行性感冒病毒感染之前或之后将包含靶向一流行性感冒病毒RNA的PEI、PLL或PLA及siRNA的组合物静脉内投与小鼠时，该等组合物可显著抑制流行性感冒病毒在小鼠中的产生。此抑制具有剂量相依性，并且当使用两种靶向不同流行性感冒病毒RNA的siRNA时展现出加性效应。因此，当siRNA与一阳离子聚合物(例如，PEI、PLL或PLA)组合时能够到达肺部、进入细胞并有效抑制病毒复制周期。据信，该等发现首次报告了使用siRNA来抑制感染性病毒在一哺乳动物中之产生的效能(此不同 于(例如)在一病毒复制周期中抑制病毒转录物或中间体的产生)。 

应注意，人们已尝试使用被称作流体动力转染的技术在静脉内将siRNA输送于体内实体器官及组织中(参见，例如，McCaffrey 2002；McCaffrey 2003；Lewis，D.L.等人)，该项技术涉及将较大体积的流体快速输送于小鼠尾部静脉中且已表明可导致大量质粒DNA在实体器官(尤其是肝脏)中的聚集(Liu 1999；Zhang 1999；Zhang 2000)。此项技术可涉及输送几乎等于动物总血液体积之流体体积，例如对于体重为18至20克的小鼠而言为1.6ml，约为体重的8-12％，此不同于涉及仅注射约200μl流体的传统技术(Liu 1999)。此外，使用流体动力转染方法的注射可在一较短时间间隔内发生(例如，5秒)，此对于有效表达所注射的转基因而言是必需的(Liu 1999)。 

尽管人们并不完全清楚流体动力转染在肝脏中达成所注射转基因之转移及高水平表达的机制，但人们认为其是由暂时心脏充血使大量DNA溶液通过肝门静脉回流入肝脏中所致(Zhang 2000)。在人类中使用与此相当的方法进行治疗看来是不可行的。与此相反，本发明的发明人使用传统体积的流体(例如，200μl)并已证实可在希望即使在肝脏(此为最易于使用流体动力转染达成表达之部位)中达成所注射转基因之最低量表达的条件下将siRNA有效输送至肺部。 

因此，本发明提供了一种抑制一病毒转录物(例如，一流行性感冒病毒转录物)在一哺乳动物个体细胞中之表达的方法，该方法包括使用一种传统注射技术(例如，一种使用传统压力及/或传统流体体积的技术)将一组合物引入所述个体血管系统中之步骤，其中所述组合物包含一靶向目标转录物的RNAi诱导体。RNAi诱导体可为一siRNA、shRNA或RNAi诱导载体。在本发明的某些较佳实施例中，所述组合物包括一阳离子聚合物。在本发明的较佳实施例中，将所述组合物纳入其量低于10％个体体重的流体体积中。在本发明的某些实施例中，流体体积的量低于个体体重的5％、2％、1％或.1％。在本发明的某些实施例中，该方法可于一除肝脏外的体组织或器官的细胞中达成有效量siRNA或shRNA的输送。在本发明的某些较佳实施例中，所述组合物通过(例如)静脉注射引入静 脉中。然而，亦可使用一诸如导管、留置静脉管等输送装置将该组合物投与动脉中。在本发明的某些较佳实施例中，RNAi诱导体可抑制病毒的产生。 

如实例15所述，本发明的发明人亦已发现，阳离子聚合物PLL及PLA能够与siRNA形成复合物并促进功能性siRNA在培养细胞中的吸收。使用PLL与NP-1496的复合物或PLA与NP-1496siRNA的复合物进行转染可抑制流行性感冒病毒在细胞中的产生。该等结果及在小鼠中获得的上述结果表明了使用阳离子聚合物及siRNA的混合物来将siRNA输送于一哺乳动物个体体内细胞中的可行性。实例15中阐述的方法可用来测试其它聚合物，尤其是通过添加基团(例如，乙酰基、琥珀酰基、酰基或咪唑基)进行修饰以降低细胞毒性及优化那些初始有效性质的聚合物。一般而言，某些较佳修饰可导致阳离子聚合物的正电荷减少。某些较佳修饰可将伯胺转化成二级胺。业内已熟知若干种用于修饰阳离子聚合物以纳入该等额外基团的方法(参见，例如，参考文献32)。例如，在合成聚合物后，各种残基的ε-氨基可通过(例如)共轭作用由一期望修饰基团来取代。一般而言，期望选择的取代百分比能够相对于未经取代的聚合物而言足以达成适宜细胞毒性降低同时不会过分降低此聚合物增强RNAi诱导体之输送能力。因此，在本发明的某些实施例中，聚合物中有25％至75％的残基受到取代。在本发明的某些实施例中，聚合物中约有50％的残基受到取代。应注意，通过使适当选择的单体亚单元(即，其中某些已纳入期望修饰的亚单元)初步形成共聚物可达成相似的效果。 

亦可使用各种其它阳离子聚合物。人们已研发出自二丙烯酸盐及胺单体形成的大型新颖阳离子聚合物及寡聚物库并在DNA转染中进行了测试。该等聚合物在本文中被称为聚(β-氨基酯)(PAE)聚合物。例如，文献(34)中阐述了一个由140个自7个二丙烯酸盐单体及20个胺单体形成的聚合物构成的库，并且可使用相似或相同的方法来产生更大的库。在该库的140个成员中，人们发现有70个可充分溶于水中(2mg/ml，25mM乙酸盐缓冲液，pH＝5.0)。在这70个水溶性聚合物中有56个可与DNA相互作用，如电泳迁移率变动分析所示。 最为重要的是，此6个聚合物中有2个可调介DNA于COS-7细胞中的转染。该等新颖聚合物的转染效率较PEI高4至8倍且等于或优于Lipofectamine 2000。因此，本发明提供了包含至少一种siRNA分子及一种阳离子聚合物的组合物，其中所述阳离子聚合物是聚(β-氨基酯)；且提供了通过投与该等组合物来抑制靶基因表达的方法。聚(β-氨基酯)进一步阐述于Anderson(2003)及美国公开专利申请案第20020131951号中，该案由Langer等人于2002年9月19日提出申请，其名称为“Biodegradable poly(beta-amino esters)and usesthereof(可生物降解的聚(β-氨基酯)及其用途)”。应注意，可对用于促进RNAi诱导体输送的阳离子聚合物加以修饰以使其纳入一或多个除构成此聚合物的主要单体亚单元之外的残基。例如，可将一或多个其它残基添加至聚合物末端，或通过一除构成此聚合物的主要单体之外的残基来连接聚合物。 

亦可用来增强本发明RNAi诱导体之输送的其它阳离子聚合物包括聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状高分子、聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯(pDMAEMA)及其季胺类似物聚甲基丙烯酸(2-三甲氨基)乙酯(pTMAEMA)、聚[a-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸(PAGA)以及聚(4-羟基-1-脯氨酸酯)。关于该等试剂的进一步说明，请参见Han(2000)。 

B.肽分子转运蛋白 

研究表明，各种肽皆能够用作核酸输送剂(若本文所用多肽的长度短于约50个氨基酸，则此多肽被视为肽)。例如，转录因子，包括HIV Tat蛋白(42，43)、单纯疱疹病毒的VP22蛋白(44)及果蝇属的触角足蛋白(45)，可自细胞表面穿透细胞质膜。用于膜穿透的肽片段由11至34个氨基酸残基组成，其中富含大量精氨酸并通常被称为富精氨酸肽(ARP)或细胞膜穿透肽(penetratin)。当与更大多肽共价连接时，ARP能够使融合多肽转运通过细胞质膜(46-48)。同样地，当寡核苷酸共价连接于ARP时，其可被细胞更加快速地吸收(49，50)。最近的研究已表明，一由8个精氨酸形成的聚合物足可用于此跨膜转运(51)。如同阳离子聚合物一样，ARP亦带有正电荷且同样能够结合siRNA，此表明可能 不需要将siRNA共价连接于ARP上。 

因此，本发明提供了包含至少一种siRNA诱导体及一种肽分子转运蛋白的组合物，其中所述siRNA诱导体靶向一流行性感冒病毒转录物；且提供了通过投与该等组合物来抑制靶基因表达的方法。本发明提供了若干用于治疗及/或预防流行性感冒病毒感染的方法，该等方法包括将所述组合物投与可能患有或患有流行性感冒的个体。肽分子转运蛋白包括但不限于阐述于参考文献46至51、120及134至136中的那些转运蛋白及其为熟习此项技术者所了解的那些变化形式。富精氨酸肽包括仅由精氨酸残基构成的肽。 

一般而言，较佳肽分子转运蛋白的长度短于约50个氨基酸。根据本发明的某些实施例，肽分子转运蛋白是一其长度为约7至34个氨基酸的肽。许多较佳的肽富含精氨酸。根据本发明的某些实施例，如果一个肽包括至少20％、至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％或至少70％、或至少80％、或至少90％精氨酸，则该肽为富精氨酸肽。根据本发明的某些实施例，肽分子转运蛋白是包括6至20个精氨酸残基的富精氨酸肽。根据本发明的某些实施例，富精氨酸肽由6至20个精氨酸残基组成。根据本发明的某些实施例，siRNA及肽分子转运蛋白共价结合在一起，而在本发明的其它实施例中，siRNA及肽分子转运蛋白是混合在一起而非彼此共价结合在一起。根据本发明的某些实施例，其中使用富组氨酸肽(88)。根据本发明，富组氨酸肽可展示如富精氨酸肽中所述的长度及组氨酸残基百分比。因此，本发明提供了包含至少一种siRNA诱导体及一种富组氨酸肽的组合物，其中所述siRNA诱导体靶向一流行性感冒病毒转录物；且提供了通过投与该等组合物来抑制目标转录物表达的方法。本发明提供了若干用于治疗及/或预防流行性感冒病毒感染的方法，该等方法包括将所述组合物投与可能患有或患有流行性感冒的个体。 

有利于将RNAi诱导体输送于个体细胞中的其它肽或修饰肽亦可用于本发明组合物。例如，有人曾阐述了一族富赖氨酸肽，该族肽通常含有8至约50个赖氨酸残基(McKenzie 2000)。尽管该等肽可增强组织培养细胞对核酸的吸收， 但其在一个体体内是比较长多肽(例如，包含50个以上赖氨酸残基的PLL)低效的核酸输送剂。这可能部分地是由于核酸/肽复合物在体内的稳定性不足所致。在肽内的各种位置插入多个胱氨酸可产生低分子量DNA缩合肽，该等肽在结合质粒DNA后将会氧化以形成肽间二硫键。当使用该等交联DNA输送媒剂将质粒输送至细胞时其较未交联的肽DNA缩合物而言是更高效的基因表达诱导剂(McKenzie 2002)。此外，包含供形成二硫键用巯基残基的肽可纳入聚乙二醇(PEG)，据信此PEG可养活对血清蛋白的非特异性键合(Park 2002)。 

包含诸如半乳糖或甘露糖残基等部分的糖肽亦可用于增强本发明RNAi诱导体的选择性吸收，如下文之进一步论述。该等糖肽亦可包括供形成二硫键用的巯基基团(Park 2002)。本发明涵盖投与各种可增强核酸自内吞泡脱离的各种试剂。该等试剂包括氯奎宁(Chloroquine)(Zhang 2003)及布比卡因(bupivacaine)(Satishchandran 2000)。脱离增强剂可以系统方式、口服及/或局部施用(例如，在或靠近期望作用位点)等方式投与。其可与本发明siRNA、shRNA或RNAi诱导载体一同或分别输送。 

C.其它聚合物输送剂 

本发明提供了除了包含上述物质以外还包含本发明RNAi诱导体及任何一种聚合物输送剂(包括经修饰聚合物)的组合物。本发明进一步提供了用于抑制流行性感冒病毒转录物在一细胞中之表达的方法及通过投与该等组合物来治疗或预防流行性感冒病毒感染的方法。适宜输送剂包括各种已表明可增强DNA至细胞之输送的试剂。该等包括经修饰的各种型式的阳离子聚合物，例如，上文所述的那些型式，例如，聚(L-组氨酸)-接枝-聚(L-赖氨酸)聚合物(Benns 2000)，聚组氨酸-PEG(Putnam 2003)、叶酸盐-PEG-接枝-聚乙烯亚胺(Benns 2002)、聚乙烯亚胺-硫酸葡聚醣(Tiyaboonchai 2003)等。该等聚合物可具支链或为线性且可接枝或不接枝。根据本发明，该等聚合物可与本发明RNAi诱导体形成复合物，并随后投与一个体。所述复合物可被称为纳米颗粒或纳米复合材料。可对该等聚合物中的任何一种进行修饰以纳入PEG或其它亲水性聚合物，以此 来降低补体活化和对其它血浆蛋白质的结合。可对阳离子聚合物进行多种修饰。例如，可对一阳离子聚合物进行修饰以纳入一可降低此聚合物负电荷的部分(例如，咪唑)且可用一第二部分(例如，PEG)进一步对其加以修饰。 

此外，亦可使用与上述阳离子聚合物不同的各种聚合物和聚合物基质。该等聚合物包括多种非阳离子性聚合物，即，在生理pH下不带正电荷的聚合物。该等聚合物可能具有某些优点，例如，可降低细胞毒性，并且在某些情况下为FDA所认可。许多适宜聚合物已表明可在其它情况下增强药物和基因的输送。该等聚合物包括例如聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PLG)及聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(Panyam 2002)，其可调配成纳米颗粒以供输送本发明RNAi诱导体。亦可使用共聚物以及上述之组合。在本发明的某些实施例中，是使用一种阳离子聚合物来缩合siRNA、shRNA或载体，缩合所得的复合物由PLGA或另一非阳离子性聚合物来保护。其它可用聚合物包括非缩合聚合物，例如，聚乙烯醇或聚(溴化N-乙基-4-乙烯基吡啶鎓)，其可与Pluronic 85形成复合物。可用于本发明的其它聚合物包括阳离子聚合物和非阳离子性聚合物的组合。例如，可使用聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-接枝聚(L-赖氨酸)(Jeong 2002)及其它组合，包括PLA、PLG、或PLGA以及如上文所述的任何一种阳离子聚合物或经修饰的阳离子聚合物。 

D.纳入输送增强部分的输送剂 

本发明涵盖对任何输送剂加以修饰以纳入一可增强输送剂至细胞之输送及/或可增强输送剂至其欲于其中抑制一目标转录物的细胞之选择性输送的部分。可使用多种部分中的任何一种，包括但不限于，(i)特异性结合于由一细胞(欲于其中施以抑制，例如，一呼吸道上皮细胞)表达的分子上的抗体或抗体片段；(ii)特异性结合于由一细胞(欲于其中施以抑制)表达的分子上的配体。较佳地，所述分子在细胞表面表达。单克隆抗体通常是首选。对于呼吸道上皮细胞而言，适宜的部分包括特异性结合于诸如p2Y2嘌呤受体及舒缓激肽受体等受体上的抗体、尿激酶纤溶酶原激活因子R或丝氨酸蛋白酶复合物，其可结合于 各种上述输送剂上以增强至呼吸道上皮细胞的输送及对呼吸道上皮细胞的选择性。同样地，用于该等各种分子的配体可共轭结合于输送剂上以增强至呼吸道上皮细胞的输送及对呼吸道上皮细胞的选择性。参见，例如(Ferrari 2002)。在本发明的某些较佳实施例中，对抗体或配体的结合可诱发所结合复合物的内化。在本发明的某些实施例中，输送增强剂(例如，抗体、抗体片段或配体)共轭结合于一RNAi诱导载体(例如，一DNA载体)上以增强输送或增强输送选择性。本文所述的用于将抗体或配体共轭结合于核酸上或各种输送剂上的方法已为业内所熟知。参见，例如，“Cross-Linking”(Pierce(hemical TechnicalLibrary，其可自URL为www.piercenet.com的万维网站点获得，首先公开于1994-95 Pierce Catalog)与其中引用的参考文献以及Wong SS之Chemistry ofProtein Conjugation and Crosslinking(CRC Press Publishers，Boca Raton，1991)。 

E.适合引入肺部中的表面活性剂 

天然的内源表面活性剂是一种由磷脂、中性脂质及蛋白质(表面活性剂蛋白A、B、C及D)构成的化合物，其可在肺泡及肺泡气体的表面之间形成一层并通过降低肺泡中的表面张力来减少肺泡气体逃逸(77-84)。表面活性剂分子在液体膜中扩散从而润湿肺泡壁的整个细胞覆盖面，并在其上产生实质为单分子的全面弥漫层。早产儿中的表面活性剂缺乏通常会造成呼吸窘迫综合症(RDS)。因此，人们研制出各种表面活性剂制剂以供用于治疗及/或预防此状况。表面活性剂可自动物肺灌洗液及人类羊水中提取，或可自合成材料产生(参见，例如，U.S.S.N.4,338,301；4,397,839；4,312,860；4,826,821；5,110,806)。各种表面活性剂调配物皆有市售，包括Infasurf

(由ONY公司，Amherst，NY生产)、Survanta

(Ross Labs，Abbott Park，IL)及Exosurf Neonatal

 (GlaxoSmithKline，Research Triangle Park，NC)。 

本文所用短语“适合引入肺部中的表面活性剂”包括市售表面活性剂产品和上文专利申请案中阐述及提出的本发明组合物中使用的特定调配物及其等效 物。在本发明的某些实施例中，此短语包括含有占全部表面活性剂10-20％之蛋白质和80-90％之脂质的制剂，所述脂质由占该脂质约10％的中性脂质(例如，磷脂酰胆碱，胆固醇)及约90％的磷脂组成，而磷脂酰胆碱成份占总磷脂的86％，其中的“％”及“部分”皆以干物质计(参见U.S.S.N.4,388,301及4,397,839)。 

在本发明的某些实施例中，此短语包括合成组合物，其中可完全或实质不含蛋白质，例如，实质包含二棕榈酰磷脂酰胆碱和脂肪醇或由其组成的组合物，其中所述二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)构成此表面流行性剂组合物的主要部分，而脂肪醇仅构成其一小部分，其中视情况可包括诸如四丁酚醛等无毒非离子表面活性剂(参见U.S.S.N.4,312,860；4,826,821；及5,110,806)。熟习此项技术者能够通过上述专利及文献中所述的测试来确定任何特定表面活性剂组合物是否适合引入肺部。尽管不希望受限于任何理论，但表面活性剂扩散和覆盖肺泡的能力仍可能有利于肺内细胞对siRNA及/或载体的吸收，并且表面活性剂本身的组成可能有利于肺内细胞对siRNA及/或载体的吸收。 

Infasurf是一种无菌的无热原肺部表面活性剂，其仅拟用于气管內滴注。其是来自小牛肺的天然表面活性剂的提取物，其中包括磷脂、中性脂质及疏水性表面活性剂相关的蛋白质B及C。Infasurf已由美国食品与药品管理局(U.S.Food and Drug Administration)批准用于治疗呼吸窘迫综合症，因此是一种可投与呼吸道及肺部的安全且可耐受的媒剂。Survanta亦是一种自牛肺获得的提取物，而Exosurf Neonatal是一种不含蛋白质的肺部用合成表面活性剂，其含有二棕榈酰磷脂酰胆碱、十六烷醇及四丁酚醛。这两种表面活性剂调配物皆已由U.S.F.D.A.批准用于治疗呼吸窘迫综合症。 

如实例14所述，本发明的发明人已发现，用作靶向流行性感冒病毒RNA的shRNA之合成模板的DNA载体当与Infasurf混合并通过鼻内滴注投与小鼠时可抑制流行性感冒病毒的产生。此外，如实例3所述，本发明的发明人发现，以表达相同shRNA的慢病毒进行感染可抑制流行性感冒病毒在组织培养细胞中的产生。该等结果表明，靶向流行性感冒病毒RNA的shRNA可输送至细胞中并处 理成对流行性感冒病毒感染的治疗及/或预防有效的siRNA。该等结果亦表明，表面活性剂材料(例如，Infasurf，例如，其组成及/或性质类似于肺中那些天然表面活性剂的材料)是用于将shRNA输送至肺部的适宜媒剂。此外，该等结果强烈表明，当将靶向流行性感冒病毒的siRNA输送至肺部及/或呼吸道中时其亦可有效地抑制流行性感冒病毒的产生。因此，本发明提供了一种包含下述的组合物：(i)至少一种RNAi诱导体，其中所述RNAi诱导体靶向一流行性感冒病毒转录物；及(ii)一种适合引入肺部的表面活性剂材料。包含表面活性剂及一RNAi诱导体的本发明组合物可以任何一种方法引入肺中，该等方法包括滴注、吸入、喷雾剂等。应注意，所述组合物可包含不足100％的表面活性剂。例如，该组合物可包含约10至25重量％的表面活性剂，约25至50重量％的表面活性剂，约50至75重量％的表面活性剂，约75及100重量％的表面活性剂。本发明提供了用于治疗或预防流行性感冒的方法，其包括将上述组合物投与一可能患有或患有流行性感冒的个体。 

F.用于将RNAi诱导体输送至肺中的其它试剂 

本发明涵盖使用各种其它试剂及方法来增强本发明RNAi诱导体至肺上皮细胞之输送。该等方法包括在载体输送或与EGTA一起投与之前对载体进行CaP04沉淀，以发生钙螯合作用。亦可与洗涤剂和触变溶液一起投与。全氟化学品液体亦可用作输送媒剂。关于该等方法及其在基因转移方面的适用性的进一步论述请参见(Weiss 2002)。此外，本发明涵盖使用纳入有本发明RNAi诱导体的蛋白质/聚乙烯亚胺复合物来输送至肺部。该等复合物包含聚乙烯亚胺与白蛋白(或其它可溶蛋白)之组合。含有基因转移质粒的类似复合物已表明可在血管内投与后达成至肺组织之输送(Orson 2002)。含有本发明RNAi诱导体的蛋白质/PEI复合物亦可用于增强至肺外细胞之输送。 

G.脂质 

如实例3所述，本发明的发明人已发现，当存在被称为Oligofectamine^TM 的脂质试剂时，通过注射将靶向一流行性感冒病毒转录物的siRNA投与完好鸡 胚中可有效地抑制流行性感冒病毒的产生，而在不含Oligofectamine^TM时投与相同的siRNA并不会达成有效的抑制。该等结果表明了脂质输送剂对于增强完好生物体中siRNA之效用的用途。因此，本发明提供了一种包含下述的组合物：(i)至少一种RNAi诱导体，其中此RNAi诱导体靶向一流行性感冒病毒转录物；及(ii)一种脂质。此外，本发明提供了用于抑制流行性感冒病毒产生的方法及用于治疗流行性感冒感染的方法，其包括将本发明组合物投与一个体。 

VI.流行性感冒病毒感染/复制分析 

如上所述，本发明RNAi诱导体的一种用途是可用于分析及定性流行性感冒病毒感染/复制周期及各种病毒蛋白对宿主细胞的作用。siRNA及shRNA可设计成靶向任何一种参与病毒感染/复制周期之一或多个阶段的病毒基因及/或可影响宿主细胞功能或活动(例如，代谢、生物合成、细胞因子释放等等)的病毒基因。siRNA、shRNA或RNAi诱导载体可在病毒感染之前、期间或之后引入细胞中，并且其对感染/复制周期各个阶段及细胞流行性和功能的影响可根据需要进行评价。 

VII.治疗应用 

如上所述，包含本发明RNAi诱导体的组合物可用于抑制或减轻流行性感冒病毒感染或复制。在该等应用中，在暴露于流行性感冒病毒之前、与此同时或在此之后将一有效量的本发明组合物输送至一细胞或生物体中。较佳地，RNAi诱导体的量能够足以减轻或延缓一或多种流行性感冒病毒感染症状。为了阐述之目的，该部分所述皆指本发明siRNA，但应了解，本发明涵盖靶向流行性感冒病毒转录物的其它RNAi诱导体的类似应用。 

含有本发明siRNA的组合物可包含一种靶向单一目标转录物中的一个位点的siRNA，或可包含多种不同的靶向一或多种目标转录物中的一或多个位点的siRNA。实例8阐述了用来系统鉴别当其单独或组合使用时具有抑制流行性感冒病毒产生之优异能力的siRNA的一般方法。 

在本发明的某些实施例中，期望使用含有靶向不同基因的多种不同siRNA 的组合物。例如，可能希望使用针对不同病毒转录物的多种siRNA在病毒生命周期的多个时间点攻击病毒。根据本发明的某些实施例，所述siRNA组合物包含一种靶向各病毒基因组片段的siRNA。 

根据本发明的某些实施例，本发明siRNA组合物可包含一种以上靶向单一病毒转录物的siRNA。一个实例是，其可能期望包括至少一种靶向一目标转录物之若干编码区域的siRNA及至少一种靶向3′UTR的siRNA。此方案可提供额外保证不会产生由相关转录物编码的产物，这是因为所述组合物中的至少一种siRNA将靶向此转录物以进行降解，而至少另外一种用来抑制可避免降解的任何转录物的转译。 

如上所述，本发明涵盖“混合治疗”，此包括但不限于其中投与多种siRNA寡核苷酸的方法及其中单一载体可引导若干siRNA(其能够抑制多个靶物)之合成或若干RNA(其可经处理产生多个siRNA)之合成的方法。关于进一步的详细内容请参见实例11。根据本发明的某些实施例，所述组合物包括靶向至少一种流行性感冒病毒A转录物及至少一种流行性感冒病毒B转录物的siRNA。根据本发明的某些实施例，所述组合物包括多种具有不同序列的siRNA，其中该等序列靶向一特定片段的相同部分。根据本发明的某些实施例，所述组合物包含多种可抑制不同流行性感冒病毒菌株或亚型的siRNA。 

重要的是，本发明的发明人已证实了siRNA调介的对流行性感冒病毒复制的有效抑制，正如使用完整的感染病毒与(例如)转染基因、整合转基因、整合病毒基因组、感染分子细胞系等进行对比后发现HA的产生大大降低所证明的那样。 

应了解，流行性感冒病毒可经历抗原性漂移及抗原性转变二者。因此，可能会出现对治疗剂的抗性。因而，可以预期，在本发明组合物已使用了一段时间后可能会发生突变及/重配，此可能会产生一种不受所提供特定siRNA抑制的变体。因此本发明涵盖发展的治疗方案。例如，在一特定情况下，可根据一特定突变或重配来选择一或多种新颖siRNA。例如，通常可设计一新颖siRNA，其 除了纳入已发生的某种突变或靶向一新获得的RNA片段之外皆与原siRNA相同；在其它情况下，期望靶向相同转录物中的一新序列；在另外一些情况下，期望靶向整个新转录物。 

通常期望同时投与本发明siRNA与一或多种其它抗病毒剂，以抑制、减轻或预防一或多种感染症状或特征。在本发明的某些较佳实施例中，本发明siRNA是与一或多种其它抗病毒剂组合，例如，金刚烷胺或金刚乙胺(二者皆可抑制参与病毒脱壳的离子通道M2蛋白)、及/或扎那米韦(zanamivir)、奥司他韦(oseltamivir)、帕拉米韦(peramivir)(BCX-1812，RWJ-270201)Ro64-0796(GS 4104)或RWJ-270201(其皆为NA抑制剂且可防止病毒颗粒自细胞质膜的正确释放)。然而，本发明siRNA组合物亦可与一或多种试剂组合投与，该等试剂包括(例如)流行性感冒疫苗(例如采用流行性感冒病毒或病毒抗原的传统疫苗以及DNA疫苗)，其中的许多种已为人们所熟知。有关用于或研究用于流行性感冒治疗和预防的各种试剂的进一步信息，请参见P.及Garcia-Sastre，2002；Cheung及Lieberman，2002，Lèuscher-Mattli，2000；及Stiver，2003。在本发明的不同实施例中，术语“与...组合”或“与...同时”可指siRNA与其它试剂存在于相同混合物中或指一个体治疗方案中包括siRNA及其它试剂二者，其无需在同一混合物中或在同一时间输送。根据本发明的某些实施例，抗病毒剂是一种由美国食品与药品管理局批准的试剂，例如，金刚烷胺、金刚乙胺、罗伦泽(Relenza)或特敏福(Tamiflu)。 

本发明siRNA提供了一种可与接种互补的方案且其可投与那些已经或尚未接种任何一种目前可用疫苗或研发中疫苗的个体(参阅Palese，P.及Garcia-Sastre，A.，J.Clin.Invest.，110(1)：9-13，2002)。美国当前的疫苗调配物包括灭活病毒且其必须通过肌内注射投与。此疫苗为三联疫苗且包含来自两种当前市售的流行性感冒A病毒亚型的代表性菌株(H3N2和H1N1)以及一B型流行性感冒病毒。每一季节均会具体建议鉴别特定菌株用于该季节的疫苗中。其它疫苗方法包括冷适应流行性感冒活病毒，其可通过鼻喷雾剂投 与；经基因改造的流行性感冒活病毒疫苗，其包含病毒基因组中的缺失或其它突变；复制缺陷型流行性感冒病毒；以及DNA疫苗，其中可编码一或多种病毒蛋白的质粒DNA可通过肌内或局部投与(参见，例如，Macklin，M.D.等人，JVirol，72(2)：1491-6，1998；Illum，L.等人，Adv DrugDeliv Rev，51(1-3)：81-96，2001；Ulmer，J.，Vaccine，20：S74-S76，2002)。应注意，免疫力低下的患者及年龄较大的个体可能会特别受益于基于RNAi的治疗，因为该等治疗之效用不需要有效的免疫应答。 

在本发明的某些实施例中，可能期望将本发明siRNA组合物定向投与受流行性感冒病毒感染的细胞中，或者至少投与易受流行性感冒病毒感染的细胞中(例如，表达含唾液酸受体的细胞)。在其它实施例中，期望具有最广泛的输送选择。 

如上所述，本发明治疗方案包括在暴露于流行性感冒病毒之前、与此同时或在此之后投与一有效量的siRNA。例如，未受感染的个体可在暴露于流行性感冒之前使用一本发明组合物获得“免疫”；易感个体(例如，年龄较大的、免疫力低下的个体，最近与怀疑、可能或已知受流行性感冒病毒感染的个体接触的人群，等等)可与一可疑或已知暴露实质同期(例如，在48小时内，较佳在24小时内，并且更佳在12小时内)接受治疗。当然，已知受到感染的个体可在任何时间接受本发明治疗。 

基因治疗方案可包括在流行性感冒病毒感染之前、实质与此同期或在此之后将一有效量能够引导抑制性siRNA之表达的基因治疗载体投与一个体。另一可选用或与上述方法组合使用的方法是自一个体分离一群细胞(例如，干细胞或免疫系统细胞)，视情况可在组织培养中扩展该等细胞，并以体外方式将一能够引导抑制性siRNA之表达的基因治疗载体投与该等细胞中。随后，可使该等细胞返回此个体中。视情况，可在将表达siRNA的细胞(其可由此而变得对流行性感冒病毒感染具有抗性)引入个体之前对其进行体外选择。在本发明的某些实施例中，可使用一群细胞，该等细胞可来自一细胞系或来自一非所述个体 的个体。用于自一个体分离干细胞、免疫系统细胞等细胞并使其返回所述个体的方法已为业内所熟知。该等方法可用于(例如)接受化学治疗患者中的骨髓移植、外周血干细胞移植等。 

在再一方法中，可使用口服基因治疗。例如，美国专利第6,248,720号阐述了若干方法和组合物，其中受控于启动子的基因以受保护方式包含于微粒中并以有效形式输送至细胞，由此达成无损伤的基因输送。在口服该等微粒后，该等基因将被吸收于上皮细胞(包括吸收性肠道上皮细胞)中、吸收于肠道相关的淋巴组织中且甚至可转运至远离粘膜上皮的细胞中。如该方法所述，该等微粒可将基因输送至远离粘膜上皮的位点，即，该等微粒可透过上皮屏障并进入全身循环中，由此转染其它位置处的细胞。 

如上所述，流行性感冒病毒除人类外还可感染许多物种。本发明包括使用本发明siRNA组合物来治疗非人类物种，尤其是诸如鸡、猪和马等物种。 

VIII.医药调配物 

本发明组合物可调配用于经任何可用途径输送，包括但不限非经肠(例如，静脉内)途径、皮内途径、皮下注射、口服、经鼻途径、支气管途径、眼内途径、经皮(局部)途径、经粘膜途径、直肠途径阴道途径。较佳的输送途径包括非经肠途径、经粘膜途径、经鼻途径、支气管途径及口服。本发明医药组合物通常包括一siRNA或其它试剂(例如，其输送后可产生siRNA的载体)与一医药上可接受的载剂之组合。本文所用词语“医药上可接受的载剂”包括溶剂、分散介质、包覆层、抗菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂以及诸如此类可适于医药投与的试剂。该等组合物中亦可包括附加活性化合物。 

可将一医药组合物调配成适于其拟用投与途径。用于非经肠(例如，静脉内)、肌内、皮内或皮下投与的溶液或悬浮液可包括下述组份：无菌稀释剂(例如，注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成剂)；抗菌剂(例如，苄醇或对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(例如，抗坏血酸或亚硫酸氢钠)；螯合剂(例如，乙二胺四乙酸)；缓冲剂(例如，醋酸盐、柠檬酸盐 或磷酸盐)以及用于调节张力的试剂(例如，氯化钠或葡萄糖)。pH值可用酸及碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。非经肠制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。 

适于注射用的医药组合物通常包括无菌水性溶液(当可溶于水时)或供临时配制无菌注射溶液或分散液用的分散剂及无菌粉末。对于静脉内投与而言，适宜载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF，Parsippany，NJ)或经磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在各种情况下，所述组合物皆应无菌并应为可易于注射的流体状态。较佳的医药调配物在生产及储存条件下是稳定的，并且必须防止其受到诸如细菌及真菌等微生物的污染作用。一般而言，相关载剂可为包含(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液态聚乙二醇，以及诸如此类)等物质的溶剂或分散介质及其适宜混合物。通过使用(例如)一诸如卵磷脂的包覆层、通过保持所需的粒径(对于分散剂而言)以及通过使用表面活性剂可保持适当的流动性。通过各种抗菌剂和抗真菌剂(例如，对氧苯甲酸、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、乙基汞硫代水杨酸钠以及诸如此类)可防止微生物的作用。在许多情况下，较佳于所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇(例如，甘露醇、山梨醇)、氯化钠。通过在所述组合物中纳入可延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射组合物的吸收。 

无菌可注射溶液可通过下述来制备：将所需量活性化合物纳入含有上述一种成份或多种成份之组合(视需要而定)的适宜溶剂中，随后进行无菌过滤。较佳地，注射溶液中不含内毒素。一般而言，分散液通过将化性化合物纳入一无菌媒剂中来制备，所述媒剂中包含一基本分散介质及来自上文所述的所需其它成份。对于使用无菌粉末来制备无菌可注射溶液的情况而言，较佳的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其可产生由活性成份及任何所需附加成份(其来自先前经无菌过滤的该等成份之溶液)构成的粉末。 

口服组合物一般包括一惰性稀释剂或一可食用载剂。为了口服治疗之目的，可将活性化合物和赋形剂结合在一起并以锭剂、片剂或胶囊(例如明胶胶囊) 等形式使用。口服组合物亦可使用一漱口用流体载剂来制备。亦可在所述组合物中纳入医药上相容的粘结剂及/或佐剂材料作为所述组合物的一部分。锭剂、丸剂、胶囊、片剂及诸如此类可包含下述任一种成份或性质相似的化合物：一粘结剂(例如，微晶纤维素、黄蓍胶或明胶)；一赋形剂(例如，淀粉或乳糖)；一崩解剂(例如，海藻酸、羟乙酸淀粉钠或玉米淀粉)；一润滑剂(例如，硬脂酸镁或Sterote)；一助流剂(例如，胶状二氧化硅)；一甜味剂(例如，蔗糖或糖精)；或一矫味剂(例如，薄荷、水杨酸甲酯或橙味矫味剂)。经口输送的调配物较佳可纳入能够提高胃肠内稳定性及/增强吸收的试剂。 

对于吸入投与而言，本发明siRNA、shRNA或载体较佳以包含于一压力容器或分配器(其包含一适宜推进剂，例如，一诸如二氧化碳的气体)或一喷雾器中之喷雾剂的形式输送。本发明特别涵盖使用经鼻喷雾剂来输送siRNA组合物。鼻内投与针对流行性感冒病毒的DNA疫苗表现出可诱导CD8 T细胞应答，此表明当通过此途径输送时至少呼吸道中的某些细胞可吸收DNA(参见，例如，K.Okuda，A.Ihata，S.Watabe，E.Okada，T.Yamakawa，K.Hamajima，J.Yang，N.Ishii，M.Nakazawa，K.Okuda，K.Ohnari，K.Nakajima，K.-Q.Xin，“Protective immunity against Influenza A virus induced by immunizationwith DNA plasmid containing Influenza M gene”，Vaccine19：3681-3691，2001)。siRNA远小于质粒DNA(例如，用于疫苗中的DNA)，此意味着会达到甚至更高的siRNA吸收。此外，根据本发明的某些实施例，医药组合物中包括可有利于呼吸道中细胞对核酸吸收的输送剂(参见，例如，S.-O.Han，R.I.Mahato，Y.K.Sung，S.W.Kim，″Development of biomaterials forgene therapy″，Molecular Therapy 2：302317，2000.)。根据本发明的某些实施例，siRNA组合物被调配为较大多孔颗粒供气溶胶投与，如实例10中之详述。 

系统投与亦可通过经粘膜或经皮途径达成。对于经粘膜或经皮投与而言，在调配物中可使用适于穿越拟透过屏障的渗透剂。该等渗透剂已为业内所熟知，并且包括(例如)用于经粘膜投与的洗涤剂、胆汁盐类及梭链孢酸衍生物。经 粘膜投与可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来达成。对于经皮投与而言，是将活性化合物调配成业内通常已知的软膏、油膏或乳霜。 

亦可将所述化合物制备成栓剂(例如，使用诸如可可油及其它甘油脂等常规栓剂基质)或保留灌肠剂形式供直肠输送。 

除了上述输送剂之外，在本发明的某些实施例中，活性化合物(siRNA、shRNA或载体)与可防止所述化合物自体内快速排除的载剂制备在一起，例如，一受控释放调配物，包括植入物及微胶囊化的输送系统。可使用可生物降解及生物相容的聚合物，例如，乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、骨胶原、聚原酸酯及聚乳酸。用于制备该等调配物的方法为熟习此项技术者所熟知。该等材料亦可自Alza公司及Nova Pharmaceuticals公司购得。脂质悬浮液(包括靶向受感染细胞的脂质体及针对病毒抗原的单克隆抗体)亦可用作医药上可接受的载剂。该等可使用业内熟知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号所述。 

为了易于投与及达成剂量均匀性，较佳以剂量单元形式调配口服或非经肠组合物。本文所用剂量单元形式指适于作为单位剂量供拟受治疗个体使用的物理分散单元；每一单元包括一预定量的活性化合物，此预定量经计算可与所需的医药载剂一起产生期望的治疗效果。 

该等化合物的毒性和治疗效用可在细胞培养物或实验动物中通过标准医药程序来测定，例如，用于测定LD50(可导致群体中的50％死亡的剂量)及ED50(对群体中的50％具有治疗效果的剂量)的程序。毒性和治疗效果之间的剂量比即为治疗指数，其可表示为比率LD50/ED50。可展示高治疗指数的化合物较佳。尽管可使用展示毒性副作用的化合物，但应注意设计一可使该等化合物靶向受影响组织位点的输送系统，以便最小化可能对未受感染细胞造成的损伤并由此减轻副作用。 

自细胞培养分析和动物研究获得的数据可用于调配一适用于人类的剂量范围。该等化合物的剂量较佳位于具有较低毒性或无毒性的循环浓度(包括ED50) 范围内。所述剂量可根据所用剂型及所用投与途径在此范围内变化。对于本发明方法中使用的任何一种化合物而言，皆可通过细胞培养分析来初步估测治疗有效剂量。可在动物模型中调配一剂量以达成一循环细胞质浓度范围(包括IC50，即，可对症状达成半数最大抑制的测试化合物的浓度，如在细胞培养物中之测定)。此调配物可用于更精确地确定可用于人类的剂量。细胞质中的含量可通过(例如)高效液相色谱来测量。 

一医药组合物的治疗有效量通常介于约0.001至30mg/kg体重之间，较佳介于约0.01至25mg/kg体重之间，更佳介于约0.1至20mg/kg体重之间，并且尤佳介于约1至10mg/kg体重、2至9mg/kg体重、3至8mg/kg体重、4至7mg/kg体重或5至6mg/kg体重之间。所述医药调配物可以各种时间间隔及在不同时间段内(视需要而定)投与，例如，每日投与多次；每日一次；隔日一次；在约1至10周内、2至8周内、约3至7周内、约4、5或6周内每周一次等等。部队建设习此项技术者应了解，某些因素可能会影响有效治疗一患者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重程度、先前所用的治疗、此患者的总体健康状况及存在的其它疾病。一般而言，使用本文所述的siRNA、shRNA或载体来治疗一患者可包括单一治疗，或者在很多情况下可包括一系列治疗。 

实例性剂量包括毫克或微克量的本发明siRNA/每千克患者体重或样本重量(例如，约1微克/千克至约500毫克/千克、约100微克/千克至约5毫克/千克、或约1微克/千克至约50微克/千克体重)。对于局部投与而言(例如，鼻内)，可使用远小于该等剂量的剂量。应进一步了解，一siRNA的适宜剂量取决于此siRNA的效能，并且可视情况根据特定接受者来确定，例如，通过投与逐渐增加的剂量直至获得一预定的期望反应为止。应了解，适用于任何特定动物个体的具体剂量水平皆可能会取决于各种因素，包括所用具体化合物的活性、所述个体的年龄、体重、总体健康状况、性别及饮食、投与时间、投与途径、排泄速度、任何药物组合以及表现程度或拟调节的活性。 

如上所述，本发明包括使用本发明siRNA组合物来治疗非人类动物，包括但不限于马、猪及禽类。因此，投与剂量及方法可根据已知的兽药学原则及用药原则来加以选择。有关指南可参见(例如)Adams，R.(ed.)，VeterinaryPharmacology and Therapeutics，第8版，Iowa State University Press；ISBN：0813817439；2001中所述。 

如上所述，可将用作siRNA或shRNA的转录模板的核酸分子插入可用作基因治疗载体的载体中。一般而言，基因治疗载体可通过(例如)静脉注射、局部投与或通过立体定位注射输送至一个体(参见，例如，Chen等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3054-3057)。在本发明的某些实施例中，包含基因治疗载体及一输送剂的组合物可经口或以吸入方式投与且可进行封包或以其它方式进行操作以防止其降解等。包含一基因治疗载体的组合物可包括一可接受稀释剂，或可包括一其中埋置有基因输送媒剂的缓释基质。或者，当可自重组细胞中产生完好且完整的基因输送载体(例如，逆转录病毒载体或慢病毒载体)时，此医药制剂可包括一或多种能够产生此基因输送系统的细胞。 

本发明医药组合物可与投药说明书一起置于一容器、封装或分配器中。 

其它实施例 

应了解，本文提供的许多教示可易于应用于传染病病原体感染而非流行性感冒病毒感染中。因此，本发明提供了通过投与一RNAi诱导体(例如，siRNA、shRNA或RNAi诱导载体)来抑制由任何传染病病原体所致的感染及/复制的方法及组合物，所述诱导体可抑制一或多个参与此传染病病原体生命周期的传染病病原体特异性基因的表达或活性。具体而言，本发明提供了用于抑制由传染病病原体所致的感染及/复制的方法及组合物，所述传染病病原体可感染易于自体外接触的细胞。该等细胞包括皮肤细胞及粘膜细胞，例如，呼吸道、尿道及眼部粘膜细胞。 

该等状况包括由病毒、原生动物及/或真菌试剂所致的感染。适于使用本文 所述的本发明siRNA组合物治疗的呼吸道感染包括但不限于，汉坦病毒(hantavirus)、腺病毒、单纯疱疹病毒及球胞子菌和组织胞浆菌感染。适于使用RNAi诱导组合物治疗的尿道及皮肤感染包括但不限于，乳头瘤病毒(其可导致子宫颈癌及其它病症)及疱疹病毒。 

尤其应注意，基于RNAi的治疗可能特别适用于下述情况的感染：(i)不存在有效的疫苗；及/或(ii)不存在其它有效的药物及/或现有治疗方案需时过长或非常麻烦；及/或(iii)传染病病原体发生了基因改变，此可能会使旧治疗方案或疫苗无效。该等因子包括许多用作生物武器候选者的因子，因此，人们非常有兴趣研发有效的预防及治疗方法。锥体虫通常可通过基因重组事件来改变表面抗原。迅速设计靶向编码新表面抗原的转录物之siRNA和shRNA之能力所提供的灵活性意味着，基于RNAi的治疗可适用于由可迅速改变表面抗原并因此而躲避开基于免疫系统的方法之生物所导致的疾病。 

在各种情况下，熟习此项技术者皆可选择一或多种对于所述因子的有效感染、存活、复制、成熟等而言是必需的或非常重要的传染病病原体特异性转录物。传染病病原体特异性转录物意指一种具有一不同于转录物序列(通常可见于一未受感染的宿主细胞中一足够长且用作RNAi靶物的区域中)之序列的转录物。一般而言，此一区域的长度至少为15个核苷酸。注意，其中包括有衍生自宿主细胞mRNA的序列的流行性感冒病毒mRNA被视为传染病病原体特异性转录物。传染病病原体特异性转录物可存在于传染病病原体基因组中或在感染过程期间随后产生。然后，可根据本文所述的依据来设计一或多个siRNA。 

候选siRNA抑制目标转录物之表达及/或抑制作为治疗剂的siRNA之潜在效用之能力可使用适宜的体外及/体内(例如，动物)模型来测试，以选择出那些能够抑制所述目标转录物之表达及/或减轻或预防传染病病原体的感染性、致病性、复制等方面的siRNA。适宜模型将根据传染病病原体的不同而改变，并且熟习此项技术者可易于作出选择。例如，对于某些传染病病原体且为了达成某些目的需要提供宿主细胞，而在其它情况下，可在不存在宿主细胞时评价siRNA 对所述传染病病原体的作用。如上所述，对于流行性感冒感染而言，可设计靶向任何一种参与所述感染及/复制周期中一或多个阶段的传染病病原体特异性基因之siRNA。该等siRNA可在感染之前、期间或之后引入细胞中，并且可根据需要来评价其对感染及/复制周期中各个阶段的效用。 

重要的是，本发明的发明人使用完整的感染病毒与(例如)转染基因、整合转基因、整合病毒基因组、感染分子细胞系等进行对比后已证实了RNAi调介的对目标转录物表达及传染病病原体进入和复制的有效抑制。本发明涵盖一种靶向一传染病病原体特异性转录物的RNAi诱导体，所述转录物参与一传染病病原体的复制、致病性或感染。根据本发明，可被靶向的较佳传染病病原体特异性转录物包括传染病病原体基因组及/或任何其它在传染病病原体生命周期期间产生的转录物。较佳靶物包括对传染病病原体具有特异性且不存在于宿主细胞中的转录物。例如，较佳靶物可包括传染病病原体特异性聚合酶、σ因子、转录因子等。该等分子已为业内所熟知，并且熟习此项技术者能够根据对传染病病原体生命周期的了解而选择出适宜的靶物。关于此方面的有用信息可参见(例如)Fields′Virology，第4版，Knipe，D.等人(eds.)Philadelphia，Lippincott Williams & Wilkins，2001；Marr，J.等人，Molecular MedicalParasitology；及Georgi′s Parasitology for Veterinarians，Bowman，D.等人，W.B.Saunders，2003。 

在本发明的某些实施例中，一较佳转录物是一种其与传染病病原体毒力尤其相关的转录物，例如，一毒力基因的表达产物。用于鉴别毒力基因的各种方法已为业内所熟知，并且已对多种该等基因进行了鉴别。大量致病性及非致病性病毒、细菌等的基因组序列的可用性可有利于鉴别毒力基因。同样地，用来确定及比较致病性及非致病性菌株及/或单一菌株在其生命周期中各不同阶段之基因和蛋白表达特性的方法使得能够鉴别其表达与毒力相关的基因。参见，例如，Winstanley，“Spot the difference：applications of subtractivehybridisation to the study of bacterial pathogens”，J Med Microbiol 2002 Jun；51(6)：459-67；Schoolnik，G，“Functional and comparative genomicsof pathogenic bacteria”，Curr Opin Microbiol 2002 Feb；5(1)：20-6。例如，可编码对宿主细胞具有毒性的蛋白质的传染病病原体基因被视为毒力基因且可作为较佳的RNAi靶物。在本发明的某些实施例中，与传染病病原体对常规治疗之抗性相关的转录物亦为较佳的靶物。在此方面应注意，在本发明的某些实施例中，目标转录物不需由传染病病原体基因组编码，而是代之以可由一质粒或传染病病原体内的其它染色体外因子来编码。 

在本发明的某些实施例中，所述病毒是一种除呼吸道融合瘤病毒之外的病毒。在本发明的某些实施例中，所述病毒是一种除小儿麻痹病毒之外的病毒。 

RNAi诱导体可具有上文所述的各种结构(例如，两条互补的RNA链、发夹、结构等)。其可以化学方式合成、通过体外转录产生或在一宿主细胞内产生。 

实例 

实例1：设计抑制流行性感冒A病毒的siRNA 

对来自一组流行性感冒病毒菌株的基因组序列进行比较，鉴别各区段最保守的区域。该组病毒包括来自鸟类、猪、马及人类的病毒。为实施比较，将12至15种在不同年份分离且来自不同动物(非人)的流行性感冒A病毒菌株的个体区段序列与12至15种在不同年份分离且来自人类的菌株的区段序列进行比对。所选菌株涵盖多种HA和NA亚型。选择在不同菌株间相差0、1或2个核苷酸的区域。举例而言，使用下列菌株选择靶向NP转录物的siRNA，每个菌株名称前的编号指NP序列的编号，并且所比较的序列部分由核苷酸号指示。 

以下列表中的条目次序为：编号、菌株名称、所比较序列部分、年份、亚型。其它基因组区段的编号不同，但可容易地在上述数据库中找到。所比较菌株为： 

NC_002019     A/Puerto Rico/8/34                         1565  1934  H1N1 

M30746        A/Wilson-Smith/33                          1565  1933  H1N1 

M81583        A/Leningrad/134/47/57                      1566  1957  H2N2 

AF348180      A/Hong Kong/1/68                           1520  1968  H3N2 

L07345        A/Memphis/101/72                           1565  1972  H3N2 

D00051        A/Udorn/307/72                             1565  1972  H3N2 

L07359        A/Guangdong/38/77                          1565  1977  H3N2 

M59333        A/Ohio/201/83                              1565  1983  H1N1 

L07364        A/Memphis/14/85                            1565  1985  H3N2 

M76610        A/Wisconsin/3623/88                        1565  1988  H1N1 

U71144        A/Akita/1/94                               1497  1994  H3N2 

AF084277      A/Hong Kong/483/97                         1497  1997  H5N1 

AF036359      A/Hong Kong/156/97                         1565  1997  H5N1 

AF250472      A/AquaA/水禽/Hong Kong/M603/98                   1998  H11N1 

ISDN13443     A/Sydney/274/2000                          1503  2000  H3N2 

M63773        A/DucA/鸭/Manitoba/1/53                          1953  H10N7 

M63775        A/DucA/鸭/Pennsylvania/1/69                      1969  H6N1 

M30750        A/EquA/马/London/1416/73                         1973  H7N7 

M63777        A/GullA/海鸥/Maryland/5/77                       1977  H11N9 

M30756        A/gull/A/海鸥/Maryland/1815/79                   1979  H13N6 

M63785        A/Mallard/Astrakhan(Gurjjcv)/263/82  1565        1982  H14N5 

M27520        A/whaA/鲸/Maine/328/84                           1984  H13N2 

M63768        A/SwiA/猪/Iowa/17672/88                          1988  H1N1 

Z26857        A/turkA/火鸡/Germany/3/91                        1991  H1N1 

U49094        A/DucA/鸭/Nanchang/1749/92                       1992  H11N2 

AF156402      A/ChicA/鸡/Hong Kong/G9/97                       1997  H9N2 

AF285888      A/SwiA/猪/Ontario/01911-1/99                     1999  H4N6 

图9显示一在6种流行性感冒A变体(全部来自人类宿主)间选择PA转录物的某些高度保守区域的实例，其中如果区域有0、1或2个核苷酸不同，则将其视为高度保守。(注意，序列以DNA而非RNA形式列出，因此含有T而非U。)选择菌株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的序列作为基本序列，即其它序列与之相比较的序列。该组中的其它成员为A/WSN/33(H1N1)、A/Leningrad/134/17/57 (H2N2)、A/Hong Kong/1/68(H3N2)、A/Hong Kong/481/97(H5N1)及A/HongKong/1073/99(H9N2)。该图显示由计算机程序CLUSTAL W(1.4)产生的多序列比对。不同于该基本序列的核苷酸显示为阴影。 

图10显示5种流行性感冒A变体(所有皆来自不同的动物宿主)及2种来自人类宿主的菌株间PA转录物的某些高度保守区域，其中有0、1或2个核苷酸不同的区域将被视为高度保守。(注意，序列以DNA而非RNA形式列出，因此含有T而非U。)选择菌株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的序列作为基本序列，即其它序列与之相比较的序列。该组的其它成员为A/WSN/33(H1N1)、A/鸡/FPV/Rostock/34(H7N1)、A/火鸡/California/189/66(H9M2)、A/马/London/1416/73(H7N7)、A/海鸥/Maryland/704/77(H13N6)及A/猪/HongKong/9/98(H9N2)。不同于该基本序列的核苷酸显示为阴影。 

注意，在图9和10的序列比较中，可选择许多不同的高度保守区域，因为序列的大部分皆可达到高度保守的标准。然而，在5′端具有AA的序列在互补(反义)siRNA链中提供一19个核苷酸的核心序列及一2个核苷酸的3′UU突出端。因此，对高度保守的区域进行搜索以鉴别21个核苷酸部分，这些核苷酸部分在其5′端具有AA以便在siRNA反义链上存在的互补核苷酸为UU。举例而言，每一阴影序列在其5′端皆具有AA。注意，所得siRNA分子反义链中的UU3′突出端可由TT或dTdT代替，如表2中所示。然而，该反义链的2nt 3′突出端不必为UU。 

为了进一步举例说明该方法，图12显示对12种流行性感冒A病毒亚型或分离菌株中NP序列3′区域的一部分间的序列比较，这些亚型或分离菌株来自人类或动物宿主。下划线序列及下划线序列下的相应序列部分用于设计siRNANP-1496(见下文)。这些序列示于图12中。该基本序列为菌株A/PuertoRico/8/34的序列。阴影字母表示不同于该基本序列的核苷酸。 

表1列出对7种其它病毒基因区段及PA区段进行比较后获得的在该组流行性感冒病毒序列中为高度保守的21核苷酸区域。这些序列中的许多个皆达到以 下额外标准，即它们在其5′端具有AA，以便在该互补链中产生3′UU突出端。对于PA区段，在存在1或2个核苷酸差异的情况下，siRNA的序列系基于A/PR8/34(H1N1)菌株，序列PA-2087/2107 AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA(SEQ ID NO：30)除外，其基于A/WSN/33(H1N1)菌株。注意，在位置20处，6个序列中有5个含有G而该基本序列含有A。因此，在这种情况下，该基本序列的序列不用于siRNA设计。 

为基于表1A中所列序列设计siRNA，选择核苷酸3-21作为siRNA有义链序列的核心区域，将一由dTdT组成的2nt 3′突出端加至每一所得序列。选择一与每一序列的核苷酸1-21互补的序列作为相应的反义链。举例而言，为基于高度保守序列PA-44/64即AATGCTTCAATCCGATGATTG(SEQ ID NO：22)设计siRNA，选择一具有序列TGCTTCAATCCGATGATTG(SEQ ID NO：109)的19nt核心区域。加入一由dTdT组成的2nt 3′突出端，产生(T由U代替后)序列5′-UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT-3′(SEQ ID NO：79)，其为iRNA有义链的序列。相应反义siRNA链序列的序列与SEQ ID NO：22即CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQID NO：80)互补，其中T已由U代替，2nt 3′突出端除外，其中T由dT代替。 

表1B列出基于流行性感冒病毒转录物的另外高度保守区域设计的siRNA。该些序列的第一个19nt序列为由高度保守区域构成的序列，在表1B中表示为“有义链”。有义链siRNA序列显示为在3′端具有一dTdT突出端，该突出端并不对应于流行性感冒病毒序列，为siRNA的一可选特征。亦显示相应的反义链，作为一可选特征，其亦在3′端纳入一dTdT突出端。名称如表1B中所示。举例而言，PB2-4/22有义表示一siRNA，其有义链的序列为PB2转录物的核苷酸4-22。PB2-4/22反义表示与PB2-4/22有义对应的互补反义链。对于靶向一转录物中跨越一剪接位点的位点之siRNA，指示该未剪接转录物内的位置。举例而言，M-44-52/741-750表示，在剪接mRNA中，靶向对应于44-52和741-750基因组序列的核苷酸。 

图9和10中的阴影区域表示21个核苷酸区域中某些达到高度保守标准的 区域。siRNA基于该些上述序列设计。所检测的实际siRNA序列列于表2中。 

表1A.：用于siRNA设计以干扰流行性感冒A病毒感染的保守区域 

区段1：PB2 

PB2-117/137               AATCAAGAAGTACACATCAGG    (SEQ ID NO：1) 

PB2-124/144               AAGTACACATCAGGAAGACAG    (SEQ ID NO：2) 

PB2-170/190               AATGGATGATGGCAATGAAAT    (SEQ ID NO：3) 

PB2-195/215               AATTACAGCAGACAAGAGGAT    (SEQ ID NO：4) 

PB2-1614/1634             AACTTACTCATCGTCAATGAT    (SEQ ID NO：5) 

PB2-1942/1962             AATGTGAGGGGATCAGGAATG    (SEQ ID NO：6) 

PB2-2151/2171             AAGCATCAATGAACTGAGCAA    (SEQ ID NO：7) 

PB2-2210/2230             AAGGAGACGTGGTGTTGGTAA    (SEQ ID NO：8) 

PB2-2240/2260             AACGGGACTCTAGCATACTTA    (SEQ ID NO：9) 

PB2-2283/2303             AAGAATTCGGATGGCCATCAA    (SEQ ID NO：10) 

区段2：PB1 

PB1-6/26                  AAGCAGGCAAACCATTTGAAT    (SEQ ID NO：11) 

PB1-15/35                 AACCATTTGAATGGATGTCAA    (SEQ ID NO：12) 

PB1-34/54                 AATCCGACCTTACTTTTCTTA    (SEQ ID NO：13) 

PB1-56/76                 AAGTGCCAGCACAAAATGCTA    (SEQ ID NO：14) 

PB1-129/149               AACAGGATACACCATGGATAC    (SEQ ID NO：15) 

PB1-1050/1070             AATGTTCTCAAACAAAATGGC    (SEQ ID NO：16) 

PB1-1242/1262             AATGATGATGGGCATGTTCAA    (SEQ ID NO：17) 

PB1-2257/2277             AAGATCTGTTCCACCATTGAA    (SEQ ID NO：18) 

区段3：PA 

PA-6/26                   AAGCAGGTACTGATCCAAAAT    (SEQ ID NO：19) 

PA-24/44                  AATGGAAGATTTTGTGCGACA    (SEQ ID NO：20) 

PA-35/55                  TTGTGCGACAATGCTTCAATC    (SEQ ID NO：21) 

PA-44/64                  AATGCTTCAATCCGATGATTG    (SEQ ID NO：22) 

PA-52/72                  AATCCGATGATTGTCGAGCTT    (SEQ ID NO：23) 

PA-121/141                AACAAATTTGCAGCAATATGC    (SEQ ID NO：24) 

PA-617/637                AAGAGACAATTGAAGAAAGGT    (SEQ ID NO：25) 

PA-711/731                TAGAGCCTATGTGGATGGATT    (SEQ ID NO：26) 

PA-739/759                AACGGCTACATTGAGGGCAAG    (SEQ ID NO：27) 

PA-995/1015               AACCACACGAAAAGGGAATAA    (SEQ ID NO：28) 

PA-2054/2074              AACCTGGGACCTTTGATCTTG    (SEQ ID NO：29) 

PA-2087/2107              AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA    (SEQ ID NO：30) 

PA-2110/2130              AATGATCCCTGGGTTTTGCTT    (SEQ ID NO：31) 

PA-2131/2151              AATGCTTCTTGGTTCAACTCC    (SEQ ID NO：32) 

区段4：HA 

HA-1119/1139              TTGGAGCCATTGCCGGTTTTA    (SEQ ID NO：33) 

HA-1121/1141              GGAGCCATTGCCGGTTTTATT    (SEQ ID NO：34) 

HA-1571/1591              AATGGGACTTATGATTATCCC    (SEQ ID NO：35) 

区段5：NP 

NP-19/39                  AATCACTCACTGAGTGACATC    (SEQ ID NO：36) 

NP-42/62                  AATCATGGCGTCCCAAGGCAC    (SEQ ID NO：37) 

NP-231/251                AATAGAGAGAATGGTGCTCTC    (SEQ ID NO：38) 

NP-390/410                AATAAGGCGAATCTGGCGCCA    (SEQ ID NO：39) 

NP-393/413                AAGGCGAATCTGGCGCCAAGC    (SEQ ID NO：40) 

NP-708/728                AATGTGCAACATTCTCAAAGG    (SEQ ID NO：41) 

NP-1492/1512              AATGAAGGATCTTATTTCTTC    (SEQ ID NO：42) 

NP-1496/1516      AAGGATCTTATTTCTTCGGAG     (SEQ ID NO：43) 

NP-1519/1539      AATGCAGAGGAGTACGACAAT     (SEQ ID NO：44) 

区段6：NA 

NA-20/40          AATGAATCCAAATCAGAAAAT     (SEQ ID NO：45) 

NA704/724         GAGGACACAAGAGTCTGAArG     (SEQ ID NO：46) 

NA-861/881        GAGGAATGTTCCTGTTACCCT     (SEQ ID N0：47) 

NA-901/921        GTGTGTGCAGAGACAATTGGC     (SEQ ID NO：48) 

区段7：M 

M-156/176         AATGGCTAAAGACAAGACCAA     (SEQ ID NO：49) 

M-175/195         AATCCTGTCACCTCTGACTAA     (SEQ ID NO：50) 

M-218/238         ACGCTCACCGTGCCCAGTGAG     (SEQ ID NO：51) 

M-244/264         ACTGCAGCGTAGACGCTTTGT     (SEQ ID NO：52) 

M-373/393         ACTCAGTTATTCTGCTGGTGC     (SEQ ID NO：53) 

M-377/397         AGTTATTCTGCTGGTGCACTT     (SEQ ID N0：54) 

M-480/500         AACAGATTGCTGACTCCCAGC     (SEQ ID N0：55) 

M-584/604         AAGGCTATGGAGCAAATGGCT     (SEQ ID NO：56) 

M-598/618         AATGGCTGGATCGAGTGAGCA     (SEQ ID NO：57) 

M-686/706         ACTCATCCTAGCTCCAGTGCT     (SEQ ID NO：58) 

M-731/751         AATTTGCAGGCCTATCAGAAA     (SEO ID NO：59) 

M-816/836         ATTGTGGATTCTTGATCGTCT     (SEQ ID N0：60) 

M-934/954         AAGAATATCGAAAGGAACAGC     (SEQ ID N0：61) 

M-982/1002        ATTTTGTCAGCATAGAGCTGG     (SEQ ID NO：62) 

区段8：NS 

NS-101/121        AAGAACTAGGTGATGCCCCAT     (SEQ ID N0：63) 

NS-104/124        AACTAGGTGATGCCCCATTCC     (SEQ ID NO：64) 

NS-128/148        ATCGGCTTCGCCGAGATCAGA     (SEQ ID NO：65) 

NS-137/157        GCCGAGATCAGAAATCCCTAA     (SEQ ID NO：66) 

NS-562/582        GGAGTCCTCATCGGAGGACTT     (SEQ ID NO：67) 

NS-589/609        AATGATAACACAGTTCGAGTC     (SEQ ID NO：68) 

表1B：用于设计用来干扰流行性感冒A病毒感染的siRNA的保守区域 

区段1：PB2 

区段2：PB1

PB1-1124/114有义        AAAUACCUGCAGAAAUGCUdTdT  (SEQ ID NO：206) 

PB1-1124/114反义        AGCAUUUCUGCAGGUAUUUdTdT  (SEQ ID NO：207) 

PB1-1618/163有义        AACAAUAUGAUAAACAAUGdTdT  (SEQ ID NO：208) 

PB1-1618/163反义        CAUUGUUUAUCAUAUUGUUdTdT  (SEQ ID NO：209) 

区段7：PA 

PA-3/2有义              CGAAAGCAGGUACUGAUCCdTdT  (SEQ ID NO：210) 

PA-3/2反义              GGAUCAGUACCUGCUUUCGdTdT  (SEQ ID NO：211) 

PA-544/56有义           AGGCUAUUCACCAUAAGACdTdT  (SEQ ID NO：212) 

PA-544/56反义           GUCUUAUGGUGAAUAGCCUdTdT  (SEQ ID NO：213) 

PA-587/60有义           GGGAUUCCUUUCGUCAGUCdTdT  (SEQ ID NO：214) 

PA-587/60反义           GACUGACGAAAGGAAUCCCdTdT  (SEQ ID NO：215) 

PA-1438/146有义         GCAUCUUGUGCAGCAAUGGdTdT  (SEQ ID NO：216) 

PA-1438/146反义         CCAUUGCUGCACAAGAUGCdTdT  (SEQ ID NO：217) 

PA-2175/219有义         GUUGUGGCAGUGCUACUAUdTdT  (SEQ ID NO：218) 

PA-2175/219反义         AUAGUAGCACUGCCACAACdTdT  (SEQ ID NO：219) 

PA-2188/220有义         UACUAUUUGCUAUCCAUACdTdT  (SEQ ID NO：220) 

PA-2188/220反义         GUAUGGAUAGCAAAUAGUAdTdT  (SEQ ID NO：221) 

区段5：NP 

NP-14/3有义             UAGAUAAUCACUCACUGAGdTdT  (SEQ ID NO：222) 

NP-14/3反义             CUCAGUGAGUGAUUAUCUAdTdT  (SEQ ID NO：223) 

NP-50/6有义             CGUCCCAAGGCACCAAACGdTdT  (SEQ ID NO：224) 

NP-50/6反义             CGUUUGGUGCCUUGGGACGdTdT  (SEQ ID NO：225) 

NP-1505/152有义         AUUUCUUCGGAGACAAUGCdTdT  (SEQ ID NO：226) 

NP-1505/152反义         GCAUUGUCUCCGAAGAAAUdTdT  (SEQ ID NO：227) 

NP-1521/153有义         UGCAGAGGAGUACGACAAUdTdT  (SEQ ID NO：228) 

NP-1521/153反义         AUUGUCGUACUCCUCUGCAdTdT  (SEQ ID NO：229) 

NP-1488/15有义          GAGTAATGAAGGATCTTATdTdT  (SEQ ID NO：230) 

NP-1488/150反义         ATAAGATCCTTCATTACTCdTdT  (SEQ ID NO：231) 

区段7：M 

M-3/2有义               CGAAAGCAGGUAGAUAUUGdTdT  (SEQ ID NO：232) 

M-3/2反义               CAAUAUCUACCUGCUUUCGdTdT  (SEQ ID NO：233) 

M-13/3有义              UAGAUAUUGAAAGAUGAGUdTdT  (SEQ ID NO：234) 

M-13/3反义              ACUCAUCUUUCAAUAUCUAdTdT  (SEQ ID NO：235) 

M-150/15有义            UCAUGGAAUGGCUAAAGACdTdT  (SEQ ID NO：236) 

M-150/15反义            GUCUUUAGCCAUUCCAUGAdTdT  (SEQ ID NO：237) 

M-172/1有义             ACCAAUCCUGUCACCUCUGdTdT  (SEQ ID NO：238) 

M-172/1反义             CAGAGGUGACAGGAUUGGUdTdT  (SEQ ID NO：239) 

M-211/2有义             UGUGUUCACGCUCACCGUGdTdT  (SEQ ID NO：240) 

M-211/2反义             CACGGUGAGCGUGAACACAdTdT  (SEQ ID NO：241) 

M-232/2有义             CAGUGAGCGAGGACUGCAGdTdT  (SEQ ID NO：242) 

M-232/2反义             CUGCAGUCCUCGCUCACUGdTdT  (SEQ ID NO：243) 

M-255/2有义             GACGCUUUGUCCAAAAUGCdTdT  (SEQ ID NO：244) 

M-255/2反义             GCAUUUUGGACAAAGCGUCdTdT  (SEQ ID NO：245) 

M-645/6有义             GUCAGGCUAGGCAAAUGGUdTdT  (SEQ ID NO：246) 

M-645/6反义             ACCAUUUGCCUAGCCUGACdTdT  (SEQ ID NO：247) 

M-723/7有义             UUCUUGAAAAUUUGCAGGCdTdT  (SEQ ID NO：248) 

M-723/7反义             GCCUGCAAAUUUUCAAGAAdTdT  (SEQ ID NO：249) 

M-808/8有义             UCAUUGGGAUCUUGCACUUdTdT  (SEQ ID NO：250) 

M-808/8反义             AAGUGCAAGAUCCCAAUGAdTdT  (SEQ ID NO：251) 

M-832/8有义             UGUGGAUUCUUGAUCGUCUdTdT  (SEQ ID NO：252) 

M-832/8反义             AGACGAUCAAGAAUCCACAdTdT  (SEQ ID NO：253) 

M-986/100有义                UGUCAGCAUAGAGCUGGAGdTdT  (SEQ ID NO：254) 

M-986/100反义                CUCCAGCUCUAUGCUGACAdTdT  (SEQ ID NO：255) 

M-44-52/741-7有义            GTCGAAACGCCTATCAGAAdTdT  (SEQ ID NO：256) 

M-44-52/741-7反义            UUCUGAUAGGCGUUUCGACdTdT  (SEQ ID NO：257) 

区段8：NS 

NS-5/2有义                   AAAAGCAGGGUGACAAAGAdTdT  (SEQ ID NO：258) 

NS-5/2反义                   UCUUUGUCACCCUGCUUUUdTdT  (SEQ ID NO：259) 

NS-9/2有义                   GCAGGGUGACAAAGACAUAdTdT  (SEQ ID NO：260) 

NS-9/2反义                   UAUGUCUUUGUCACCCUGCdTdT  (SEQ ID NO：261) 

NS-543/56有义                GGAUGUCAAAAAUGCAGUUdTdT  (SEQ ID NO：262) 

NS-543/56反义                AACUGCAUUUUUGACAUCCdTdT  (SEQ ID NO：263) 

NS-623/64有义                AGAGAUUCGCUUGGAGAAGdTdT  (SEQ ID NO：264) 

NS-623/64反义                CUUCUCCAAGCGAAUCUCUdTdT  (SEQ ID NO：265) 

NS-642/66有义                CAGUAAUGAGAAUGGGAGAdTdT  (SEQ ID NO：266) 

NS-642/66反义                UCUCCCAUUCUCAUUACUGdTdT  (SEQ ID NO：267) 

NS-831/84有义                UUGUGGAUUCUUGAUCGUCdTdT  (SEQ ID NO：268) 

NS-831/83反义                GACGAUCAAGAAUCCACAAdTdT  (SEQ ID NO：269) 

实例2：靶向病毒RNA聚合酶或核蛋白的siRNA抑制流行性感冒A病毒的产生 

材料和方法 

细胞培养：Madin-Darby犬肾脏细胞(MDCK)由Dr.Peter Palese，MountSinai School of Medicine，New york，NY友情赠送，将其生长于含10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酸、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素的DMEM培养基中。细胞在37℃、5％CO2下生长。对于电穿孔，将细胞保持在不含血清的RPMI1640培养基中。在感染培养基(DMEM、0.3％牛血清白蛋白(BSA，Sigma，St.Louis，MO)、10mM Hepes、100单位/ml青霉素及100μg/ml链霉素)中进行病毒感染。 

病毒流行性感冒病毒A/PR/8/34(PR8)和A/WSN/33(WSN)为H1N1亚型，其由Dr.Peter Palese，Mount Sinai School of Medicine友情赠送，使其在10天受精鸡卵(Charles River laboratories，MA)中37℃生长48小时。接种病毒48小时后收获尿囊液并于-80℃存储。 

SiRNA：如上述设计siRNA。除符合实例1中所述选择标准外，通常根据Technical Bulletin#003-Revision B，“siRNA寡核苷酸s for RNAiApplications”(自RNA试剂商业供应商Dharmacon Research公司，Lafayette，CO 80026获得)中所述标准设计siRNA。Technical Bulletin#003(可于环球 网上在www.dharmacon.com/tech/tech003B.html上获得)和自Dharmacon于www.dharmacon.com/tech/tech004.html上获得的Technical Bulletin#004含有大量关于siRNA设计参数、合成等的信息，其以引用方式并入本文中。所检测的有义和反义序列列于表2中。 

表2：siRNA序列 

名称name	siRNA序列(5′-3′)-3’)
		PB2-2210(有义)sense)	GGAGACGUGGUGUUGGUAAdTdT(SEQ ID NO：69)
PB2-22(反义)sense)	UUACCAACACCACGUCUCCdTdT(SEQ ID NO：70)
		PB2-2240(有义)sense)	CGGGACUCUAGCAUACUUAdTdT(SEQ ID NO：71)
PB2-2240(反义)sense)	UAAGUAUGCUAGAGUCCCGdTdT(SEQ ID NO：72)
		PB1(有义)sense)	GCAGGCAAACCAUUUGAAUdTdT(SEQ ID NO：73)
PB1(反义)sense)	AUUCAAAUGGUUUGCCUGCdTdT(SEQ ID NO：74)
		PB1-12(有义)sense)	CAGGAUACACCAUGGAUACdTdT(SEQ ID NO：75)
PB1-12(反义)sense)	GUAUCCAUGGUGUAUCCUGdTdT(SEQ ID NO：76)
		PB1-2257(有义)sense)	GAUCUGUUCCACCAUUGAAdTdT(SEQ ID NO：77)
PB1-2257(反义)sense)	UUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT(SEQ ID NO：78)
		PA-(有义)sense)	UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT(SEQ ID NO：79)
PA-(反义)sense)	CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT(SEQ ID NO：80)
		PA-73(有义)sense)	CGGCUACAUUGAGGGCAAGdTdT(SEQ ID NO：81)
PA-73(反义)sense)	CUUGCCCUCAAUGUAGCCGdTdT(SEQ ID NO：82)
		PA-2087/21(有义)sense)	GCAAUUGAGGAGUGCCUGAdTdT(SEQ ID NO：83)
PA-2087/21((反义)sense)	UCAGGCACUCCUCAAUUGCdTdT(SEQ ID NO：84)
		PA-2110(有义)sense)	UGAUCCCUGGGUUUUGCUUdTdT(SEQ ID NO：85)
PA-2110(反义)sense)	AAGCAAAACCCAGGGAUCAdTdT(SEQ ID NO：86)
		PA-2131(有义)sense)	UGCUUCUUGGUUCAACUCCdTdT(SEQ ID NO：87)
PA-2131(反义)sense)	GGAGUUGAACCAAGAAGCAdTdT(SEQ ID NO：88)
		NP-23(有义)sense)	UAGAGAGAAUGGUGCUCUCdTdT(SEQ ID NO：89)
NP-23(反义)senes)	GAGAGCACCAUUCUCUCUAdTdT(SEQ ID NO：90)
		NP-39(有义)sense)	UAAGGCGAAUCUGGCGCCAdTdT(SEQ ID NO：91)
NP-39(反义)sense)	UGGCGCCAGAUUCGCCUUAdTdT(SEQ ID NO：92)
		NP-1496(有义)sense)	GGAUCUUAUUUCUUCGGAGdTdT(SEQ ID NO：93)
NP-1496(反义)sense)	CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT(SEQ ID NO：94)
		NP-1496/(有义)sense)	GGAUCUUAUUUCUUCGGAGAdTdT(SEQ ID NO：188)
NP-1496/(反义)sense)	UCUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT(SEQ ID NO：189)
		M-(有义)sense)	CCGAGGUCGAAACGUACGUdTdT(SEQ ID NO：95)
M-(反义)sense)	ACGUACGUUUCGACCUCGGdTdT(SEQ ID NO：96)
		M-48(有义)sense)	CAGAUUGCUGACUCCCAGCdTdT(SEQ ID NO：97)
M-48(反义)sense)	GCUGGGAGUCAGCAAUCUGdTdT(SEQ ID NO：98)
		M-59(有义)sense)	UGGCUGGAUCGAGUGAGCAdTdT(SEQ ID NO：99)
M-59(反义)sense)	UGCUCACUCGAUCCAGCCAdTdT(SEQ ID NO：100)
		M-93(有义)sense)	GAAUAUCGAAAGGAACAGCdTdT(SEQ ID NO：101)
M-93(反义)sense)	GCUGUUCCUUUCGAUAUUCdTdT(SEQ ID NO：102)
		NS-12(有义)sense)	CGGCUUCGCCGAGAUCAGAdAdT(SEQ ID NO：103)
NS-12(反义)sense)	UCUGAUCUCGGCGAAGCCGdAdT(SEQ ID NO：104
		NS-562/58(有义)sense)	GUCCUCCGAUGAGGACUCCdTdT(SEQ ID NO：105)
NS-562/58(反义)sense)	GGAGUCCUCAUCGGAGGACdTdT(SEQ ID NO：106)
		NS-58(有义)sense)	UGAUAACACAGUUCGAGUCdTdT(SEQ ID NO：107)
NS-58(反义)sense)	GACUCGAACUGUGUUAUCAdTdT(SEQ ID NO：108)

[0466] 所有siRNA皆由Dharmacon Research(Lafayette，CO)使用2′ACE保护化学法合成。将该些siRNA链根据制造商的说明去保护，以等摩尔比率混合并通过以下退火：加热至95℃，然后缓慢地通过每30秒降低1℃直至35℃，再以每分钟降低1℃直至5℃。 

siRNA电穿孔使对数期MDCK细胞培养物受胰蛋白酶作用，洗涤并以每ml2X 107细胞悬浮在不含血清的RPMI 1640中。将0.5ml细胞放入一0.4cm比色皿中并使用一Gene Pulser装置(Bio-Rad)在400V、975μF下用2.5nmolsiRNA进行电穿孔。电穿孔效率为大约活细胞的30-40％。将经电穿孔的细胞于含有10％FCS的DMEM培养基中分配到6-孔板的3个加样孔中并在37℃、5％CO2下培养。 

病毒感染：在电穿孔后6至8小时，洗掉含血清的培养基并将100μl PR8或WSN病毒以合适的感染复数接种到这些加样孔，每个加样孔含约106细胞。将细胞用1,000PFU(每1,000个细胞1个病毒；MOI＝0.001)或10,000PFU(每100个细胞1个病毒；MOI＝0.01)的病毒感染。在室温下培育1小时后，向每个加样孔中加入2ml含4μg/ml胰蛋白酶的感染培养基，并将细胞在37℃、5％CO2下培养。以规定次数自受感染培养基收集上清液并通过鸡红细胞(50μl，0.5％，Charles River laboratories，MA)的血凝反应来测定病毒效价。 

测量病毒效价：在感染后24、36、48及60小时后收集上清液。使用如KnipeDM，Howley，PM，Fundamental Virology，4th edition，p34-35所述的标准血凝素分析法来测量病毒效价。血凝分析在一V形底96孔板中进行。用一等体积的0.5％的鸡红细胞悬浮液(Charles River Laboratories)在冰上将每一试样的系列2倍稀释液培养1小时。含有红细胞粘性均质层的加样孔评记为阳性。对于噬菌斑分析，如Fundamental Virology，4th edition，p.32(在本文中其它处引用)中所述及此项技术中所常规测定每一试样的系列10倍稀释液的病毒效价。 

结果 

为研究使用siRNA抑制流行性感冒病毒复制的可行性，以各种流行性感冒病毒A RNA为目标。特定而言，利用容易感染且广泛用于研究流行性感冒病毒的MDCK细胞系。通过电穿孔将每个siRNA单个引入MDCK细胞群中。使用靶向GFP的siRNA(有义：5′-GGCUACGUCCAGGAGCGCAUU-3′(SEQ ID NO：110)；反义：5′-UGCGCUCCUGGACGUAGCCUU-3′(SEQ ID NO：111))作为对照。该siRNA称作GFP-949。在随后的实验中(在下列实例中说明)，用dTdT代替两股链的UU突出端对结果并无影响。亦实施一模拟电穿孔作为对照。电穿孔后8小时，将细胞用流行性感冒A病毒PR8或WSN以0.1或0.01的MOI感染，此后使用一标准血凝分析法在不同时间点(24、36、48、60小时)上分析病毒的产生情况。使用标准方法通过流式细胞术分析GFP表达。 

图11A和11B比较了几个实验的结果，在这些实验中通过测量HA效价测定个体siRNA抑制流行性感冒病毒A菌株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)(图11A)或流行性感冒病毒A菌株A/WSN/33(H1N1)(图11B)复制的能力。因此，一高HA效价表示缺乏抑制，而一低HA效价表示有效抑制。以0.01的MOI感染MDCK细胞。对于该些实验，测试一种靶向PBl区段(PB1-2257/2277)的siRNA、一种靶向PB2区段(PB2-2240/2260)的siRNA、一种靶向PA区段(PA-2087/2107(G))的siRNA及靶向NP基因组和转录物(NP-231/251、NP-390/410及NP-1496/1516)的3种不同siRNA。注意图11A和11B上的图例仅列示siRNA的5′核苷酸。 

图11A和11B中的符号如下：填充方框代表未接受siRNA的对照细胞。空方框代表接受GFP对照siRNA的细胞。填充圆代表接受siRNA PB1-2257/2277的细胞。空圆代表接受siRNA PB2-2240/2260的细胞。空三角代表接受siRNAPA-2087/2107(G)的细胞。X符号代表接受siRNA NP-231/251的细胞。+符号代表接受siRNA NP-390/410的细胞。填满三角代表接受siRNA NP-1496/1516的细胞。注意，在这些图中，某些符号有时相叠加。举例而言，在图11B中，空三角和填充三角相叠加。有关说明可查阅表3和表4，其中列出了每个点的数值。 

如图11A和11B(表3和4)中所示，在不存在siRNA(模拟TF)或存在对照 (GFP)siRNA的情况下，病毒的效价随时间而增加，在感染后约48-60小时达到峰值。相反，在存在任一siRNA的情况下，在60小时时，病毒效价显著较低。举例而言，在菌株WSN中，在存在siRNA PB2-2240或NP-231时HA效价(其反映病毒含量)约为对照中的一半。尤其是，在此两种菌株中，在存在siRNA NP-1496的情况下病毒含量皆低于检出限(10,000PFU/ml)。这表现为，在PR8菌株中降低至1/60，在WSN菌株中降低至1/120。在存在siRNA PA-2087(G)的情况下，菌株WSN中的病毒含量亦低于检出限(10,000PFU/ml)，而菌株PR8中的病毒含量极低。即使自最早的测量时间点上亦能明显看出siRNA可抑制病毒的产生。已在感染后长达72小时的时间点上观察到有效抑制，包括将病毒的产生抑制至不可检测水平(如通过HA效价所检测)。 

表5概述了60小时时在MDCK细胞中的siRNA抑制分析结果，以抑制倍数表示。因此，一低值表示缺乏抑制而一高值表示有效抑制。siRNA在病毒基因内的位置由基因名称后的数字表示。如同本文中其它处，该数字代表基因中siRNA的起始核苷酸。举例而言，NP-1496表示一对NP具特异性的siRNA，第一个核苷酸在该NP序列的核苷酸1496处开始。所示值(抑制倍数)通过将自模拟转染获得的血凝素单位除以自用所示siRNA转染获得的血凝素单位计算；数值为1表示无抑制。 

已在MDCK细胞系系统中总共对20种靶向流行性感冒病毒基因组的6个区段(PB2、PB1、PA、NP、M及NS)的siRNA进行检测(表5)。约15％的所检测siRNA(PB1-2257、PA-2087G及NP-1496)显示一强效应，不论是使用PR8病毒还是WSN病毒，在MOI＝0.001下大多数情况时皆将病毒产生抑制至原来的1/100，而在MOI＝0.01下皆将病毒产生抑制至原来的1/16至1/64。具体而言，当使用siRNANP-1496或PA-2087时，抑制效果非常明显，使得在培养物上清液中检测不到血凝素活性。这些强效siRNA靶向3个不同的病毒基因区段：PB1和PA(其与RNA转录酶复合物有关)及NP(其係一单链RNA结合核蛋白)。与在其它系统中的发现一致，这些siRNA所靶向的序列的位置皆相对靠近编码区域的3-起始端(图 13)。 

约40％的siRNA可显著抑制病毒产生，但抑制程度视某些参数而不同。不管是使用PR8病毒还是WSN病毒，皆有约15％的siRNA可强效抑制病毒产生。然而，在某些siRNA的情况下，抑制程度根据是使用PR8还是WSN而略有变化。某些siRNA仅在早期时间点(感染后24至36小时)或仅在较低感染剂量(MOI＝0.001)下显著抑制病毒产生，例如PB2-2240、PB1-129、NP-231及M37。这些siRNA靶向不同的病毒基因区段，相应的序列的位置或靠近编码区域的3-起始端或靠近5-起始端(图13和表5)。 

约45％的siRNA对病毒效价的影响不可检出，表明它们对在MDCK细胞中干扰流行性感冒病毒的产生无效。特别是，靶向NS基因区段的四个siRNA中没有一个显示任何抑制效应。 

为更精确评估病毒效价，实施培养物上清液噬菌斑分析(60小时时)，上清液从已经受模拟转染或用NP-1496转染的病毒感染细胞获得。在模拟上清液中检测到约6×10pfu/ml噬菌斑，而在未经稀释的NP-1496上清液中未检测到噬菌斑(图11C)。由于噬菌斑分析的检出限为约20pfu(噬菌斑形成单位)/ml，NP-1496对病毒产生的抑制程度至少为约30,000倍。即使在0.1的MOI下，NP-1496对病毒产生的抑制程度亦为约200倍。 

为测定siRNA的功效，将标定量的NP-1496转染入MDCK细胞中，随后用PR8病毒感染。通过血凝素分析测量上清液中的病毒效价。当siRNA量降低时，上清液中的病毒效价增强，如图11D中所示。然而，即使仅使用25pmol的siRNA进行转染，与模拟转染相比，亦能检测到约4倍的病毒产生抑制作用，表明NP-1496siRNA对流行性感冒病毒产生具有抑制功效。 

对于治疗，较佳情况为siRNA能够有效抑制已存在的病毒感染。在一典型流行性感冒病毒感染中，感染后约4小时开始释放新的病毒粒子。为确定在已存在感染的情况下siRNA是否能降低或消除由新释放病毒造成的感染，将MDCK细胞用PR8病毒感染2小时，然后用NP-1496siRNA转染。如图11E中所示， 病毒效价在模拟转染后的时间上稳定增加，而在NP-1496转染细胞中病毒效价仅略微增加。因此在病毒感染后施用siRNA有效。 

概言之，这些结果显示，(i)某些siRNA可强效抑制流行性感冒病毒产生；(ii)流行性感冒病毒的产生可由对不同病毒基因(包括彼等编码NP、PA及PB1蛋白质的基因)具特异性的siRNA抑制；及(iii)除在施用siRNA的同时或其后感染的细胞外，siRNA抑制亦发生于先前已感染的细胞中。 

表3：siRNA对病毒菌株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的产生的抑制 

表4：siRNA对病毒菌株A/WSN/33(H1N1)产生的抑制 

表5：20种siRNA对MDCK细胞中流行性感冒病毒产生的效应 

实例3：靶向病毒RNA聚合酶或核蛋白的siRNA抑制鸡胚中流行性感冒A病 毒的产生 

材料和方法 

SiRNA-oligofectamine复合物形成和鸡胚接种：如上所述制备SiRNA。将鸡卵维持在标准条件下。将30μl Oligofectamine(产品号：12252011，来自Life Technologies，现Invitrogen)与30μl Opti-MEM I(Gibco)混合并室温培育5分钟。将2.5nmol(10μl)siRNA与30μl Opti-MEM I混合并添加至稀oligofectamine中。将该siRNA和oligofectamine室温培育30分钟。将10天龄的鸡卵同时用siRNA-oligofectamine复合物及100μl PR8病毒(5000pfu/ml)接种。将卵在37℃下培育规定时间并收获尿囊液。如上述通过HA分析检测尿囊液中的病毒效价。 

结果 

为证实在MDCK细胞中的结果，亦对siRNA在受精鸡卵中抑制流行性感冒病毒产生的能力进行分析。由于电穿孔不能用于卵，因此使用Oligofectamine，其为一脂质基试剂，已显示其可于体外促进DNA寡核苷酸及siRNA的细胞内吸收(25)。简言之，将PR8病毒单独(500pfu)或病毒加siRNA-oligofectamine复合物注射到10天龄鸡卵的尿囊腔中，如图14A中以示意方式显示。17小时后收集尿囊液，通过血凝素分析量测病毒效价。如图14B中所示，当单独注射病毒时(存在Oligofectamine)，容易地检测到高病毒效价。共同注射GFP-949未显著影响病毒效价。(当略去Oligofectamine时未观察到病毒效价显著降低。) 

注射对流行性感冒病毒具特异性的siRNA所示结果与在MDCK细胞中所观察到的结果一致。在MDCK细胞中抑制流行性感冒病毒产生的同一siRNA(NP-1496、PA2087和PB1-2257)在鸡卵中亦抑制病毒产生，而在MDCK细胞中不太有效的siRNA(NP-231、M-37和PB1-129)在感染鸡卵中无效。因此，siRNA在感染鸡卵中亦可有效干扰流行性感冒病毒的产生。 

实例4：SiRNA在mRNA水平抑制流行性感冒病毒产生 

材料和方法 

SiRNA制备如上所述。 

RNA提取、转录和实时PCR：将1×107MDCK细胞用2.5nmol NP-1496实施电穿孔或对其实施模拟电穿孔(无siRNA)。8小时后，将流行性感冒A PR8病毒以MOI＝0.1接种入细胞中，在感染后1、2和3小时后，除去上清液，将细胞用Trizol试剂(Gibco)溶解。根据制造商说明书纯化RNA。根据制造商说明书，在一20μl反应混合物中使用200ng总RNA、特异性引物(见下文)及Omniscript反转录酶套组(Qiagen)于37℃实施反转录(RT)1小时。对mRNA、NP vRNA、NPcRNA、NS vRNA或NS cRNA具特异性的引物如下： 

mRNA，dT18＝5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT_-3′(SEQ ID NO：112) 

NP vRNA，NP-367：5′-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：113)。 

NP cRNA，NP-1565R： 

5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3′(SEQ ID NO：114)。 

NS vRNA，NS-527：5′-CAGGACATACTGATGAGGATG-3′(SEQ ID NO：115)。 

NS cRNA，NS-890R： 

5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3′(SEQ ID NO：116)。 

将1μl RT反应混合物(即，通过实施反转录获得的试样)及序列特异性引物用于实时PCR，实时PCR使用SYBR Green PCR master mix(AB AppliedBiosystems)包括SYBR Green I双链DNA结合染料。在一ABI PRISM 7000序列检测系统(AB Applied Biosystmes)中循环进行PCR并用ABI PRISM 7000 SDS软件(AB Applied Biosystems)分析。PCR反应在50℃下实施2分钟，95℃下10分钟，然后95℃下15秒，60℃下分钟，实施50个循环。在一0.2荧光单位的读数下分析循环次数。所有反应皆重复一次。弃去两次重复反应间变化大于1.0的循环次数。然后平均重复循环次数，自其减去β-肌动蛋白的循环次数，以获得一标准值。 

PCR引物如下。 

对于NP RNA： 

NP-367：5′-CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3′(SEQ ID NO：117)。 

NP-460R：5′-AGATCATCATGTGAGTCAGAC-3′(SEQ ID NO：118)。 

对于NS RNA： 

NS-527：5′-CAGGACATACTGATGAGGATG-3′(SEQ ID NO：119)。 

NS-617R：5′-GTTTCAGAGACTCGAACTGTG-3′(SEQ ID NO：120)。 

结果 

如上所述，在流行性感冒病毒复制期间，vRNA转录形成cRNA(其用作更多vRNA合成的模板)及mRNA(其用作蛋白质合成的模板)(1)。尽管已知RNAi以一序列特异性方式靶向mRNA的降解(16-18)，但由于流行性感冒A病毒的vRNA对核酸酶敏感，因此vRNA和cRNA亦有可能是siRNA的靶(1)。为研究siRNA对各种RNA种类的降解的效应，使用序列特异性引物进行反转录并随后实施实时PCR，以此来定量vRNA、cRNA及mRNA的含量。图16显示流行性感冒病毒vRNA、mRNA及cRNA之间的关系。如图16A及16B中所示，cRNA为vRNA的确切补体，便mRNA在5′端含有一帽结构及另外10至13个源自宿主细胞mRNA的核苷酸，而mRNA在3′端含有一polyA序列，自一与vRNA区段下游位点15-22核苷酸互补的位点开始。因此与vRNA和cRNA相比，mRNA在3′端缺少15至22核苷酸。为区别此3种病毒RNA种类，在第一反转录反应中使用对vRNA、cRNA及mRNA具特异性的引物(图16B)。对于mRNA而言，使用poly dT18(SEQ ID NO：112)作为引物。对于cRNA而言，使用一与mRNA缺失的RNA之3′端互补的引物。对于vRNA，该引物可为沿RNA的任一处，只要其与vRNA互补且不太靠近5′端。所产生的仅自该些RNA之一转录的cDNA通过实时PCR扩增。 

在流行性感冒病毒感染后，新的病毒粒子开始被包装并在约4小时后释放。为确定siRNA对第一波mRNA和cRNA转录的效应，在感染后早期分离RNA。简言之，将NP-1496电穿孔入MDCK细胞中。亦实施一模拟电穿孔(无siRNA)。6至8小时后以MOI＝0.1感染PR8。然后在感染后1、2和3小时溶解细胞并分离出RNA。通过反转录(使用每一RNA种类的引用)并随后实施实时PCR来测定MRNA、vRNA 和cRNA含量。 

图17显示在用病毒转染后各个不同时间上病毒NP和NS RNA种类的量，这些细胞经模拟转染或在转染前约6至8小时用siRNA NP-1496转染。如图17中所示，感染后1小时，用或未用NP siRNA转染的试样间NP mRNA的量没有显著差异。感染后2小时，在模拟转染组中NP mRNA就增加到原来的38倍，而在用siRNA转染的细胞中NP mRNA的含量未增加(或甚至略微降低)。感染后3小时，在模拟转染中mRNA转录物含量继续增加，而在接受siRNA处理的细胞中观察到NP mRNA的量持续降低。NP vRNA和cRNA显示一类似模式，不同之处为在模拟转染中vRNA和cRNA的量在感染后3小时才变得显著。尽管不欲受任何理论限制，但此现象可能是由于流行性感冒病毒的生命周期造成，其中mRNA转录的初始周期在cRNA及进一步地vRNA合成前发生。 

该等结果表明，与通过血凝素分析或噬菌斑分析测量完好活病毒的结果一致，用NP siRNA处理亦使所有NP RNA种类的量显著降低。尽管已知siRNA主要调介mRNA的降解，但该实验的数据并未排除siRNA调介NP cRNA和vRNA的降解的可能性，尽管下述结果表明，由NP mRNA降低导致的NP蛋白质含量的降低使NP cRNA及/或vRNA的稳定性降低。 

实例5：鉴别RNA干扰的靶 

材料和方法 

如上述实施未经修改siRNA的SiRNA制备。未经修饰RNA寡核苷酸亦由Dharmacon合成，其中在有义链或反义链的每个核苷酸残基或有义链和反义链二者的每个核苷酸残基处皆用2′-O-甲基基团取代2′-羟基。如针对未经修饰寡核苷酸所述，将经修饰寡核苷酸去保护并退火。通过凝胶电泳来分析siRNA双螺旋是否已形成。 

细胞培养、用siRNA转染及用病毒感染这些基本如上所述实施。简言之，对于涉及经修饰NP-1496siRNA的实施，首先将MDCK细胞用自野生型(wt)和经修饰(m)链形成的NP-1496siRNA(2.5nmol)转染，8小时后用PR8病毒以 0.0的MOI感染。感染后24小时测定培养上清液中的病毒效价。对于涉及M-37siRNA的实验而言，将MDCK细胞用M-37siRNA(2.5nmol)转染，然后用PR8病毒以0.01的MOI感染，并在感染后1、2和3小时收获来分离RNA。关于M-37有义和反义序列参见下表2。 

RNA提取、反转录及实时PCR基本如上所述实施。用于反转录的对mRNA、M-特异性vRNA及M-特异性cRNA中任一种具特异性的引物如下： 

mRNA，dT18＝5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′(SEQ ID NO：112) 

M vRNA：5′-CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG-3′(SEQ ID NO：161) 

M cRNA：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3′(SEQ ID NO：162)。 

M RNA的PCR引物如下： 

M正向：5′-CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG-3′(SEQ ID NO：163) 

M反向：5′-TAACTAGCCTGACTAGCAACCTC-3′(SEQ ID NO：164) 

结果 

为研究siRNA除干扰mRNA外亦干扰vRNA及/或cRNA的可能性，合成其中有义(S或+)或反义(AS或-)链经修饰的NP-1496siRNA。该修饰是在每个核苷酸残基中用2′-O-甲基取代2′-羟基，此并不影响双螺旋形成的碱基配对，但经修饰RNA链不再支持RNA干扰。换句话说，一其中有义链经修饰但反义链为野生型(mS：wtAS)的siRNA将支持具有一与该反义链互补的序列而不是具有一与该有义链互补的序列的RNA的降解。相反，一其中有义链为野生型但反义链经修饰(wtS：mAS)的siRNA将支持具有一与该有义链互补的序列的RNA之降解，而不支持具有一与该反义链互补的序列的RNA之降解。该现象更详细地阐述于名称为“Reducing RNAi Background(降低RNAi本底)”且共同待决的临时专利申请案第60/446,387号中。 

MDCK细胞或经模拟转染或用NP-1496siRNA转染，在NP-1496siRNA中有义链(mS:wtAS)或反义链(wtS:mAS)经修饰而另一链为野生型。亦将细胞用其中两条链皆经修饰的NP-1496siRNA(mS:mAS)。然后将细胞用PR8病毒感染， 测量上清液中的病毒效价。如图18A中所示，在经受模拟转染的培养物中检测到高病毒效价。如所预期情况一样，在用野生型siRNA(wtS:wtAS)转染的培养物中检测到极低的病毒效价，但在用其中两条链皆经修饰的siRNA(mS:mAS)转染的培养物中检测到高病毒效价。在用其中反义链经修饰的siRNA(wtAS:mAS)转染的培养物中病毒效价较高，而在用其中仅有义链经修饰的siRNA(mS:wtAS)转染的培养物中病毒效价较低。虽然不欲受任何理论限制，但本发明的发明人提出，siRNA双螺旋的反义(-)链抑制流行性感冒病毒产生这一必要条件表明，RNA干扰的靶或为mRNA(+)或为cRNA(+)或同时为二者。 

为进一步辨别这些可能性，检测siRNA对相应mRNA、vRNA和cRNA积聚的效应。为跟踪在一群同时受感染细胞中的转录情况，在感染后1、2和3小时(在新的病毒粒子释放及再感染之前)收获经siRNA转染MDCK细胞来分离RNA。首先使用特异性引物通过反转录将病毒mRNA、vRNA及cRNA独立转化成cDNA。然后，通过实时PCR定量每一cDNA的含量。如图18B中所示，当使用M特异性siRNA M-37时，在感染后1或2小时几乎检测不到M特异性mRNA。在不存在M-37的情况下，感染后3小时容易地检测到M特异性mRNA。在用M-37转染的细胞中M特异性mRNA的含量降低约50％。相反，存在M-37并不会抑制M特异性vRNA和cRNA的含量。虽然不欲受任何理论限制，但这些结果表明，病毒mRNA可能为sRNA所调介干扰的靶。 

实例6：某些siRNA结病毒RNA积聚的广泛效应 

结果 

SiRNA制备如上所述实施。 

RNA提取、反转录及实时PCR如实例3中所述实施。对mRNA、NP vRNA、NPcRNA、NS vRNA、NS cRNA、M vRNA或M cRNA具特异性的引物如实例4和5中所述。用于反转录的对PB1 vRNA、PB1 cRNA、PB2 vRNA、PB2 cRNA、PA vRNA或PA cRNA的引物如下： 

PB1 vRNA：5′-GTGCAGAAATCAGCCCGAATGGTTC-3′(SEQ ID NO：165) 

PB1 cRNA：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3′(SEQ ID NO：166) 

PB2 vRNA：5′-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3′(SEQ ID NO：167) 

PB2 cRNA：5′-ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3′(SEQ ID NO：168) 

PA vRNA：5′-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3′(SEQ ID NO：169) 

PA cRNA：5′-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3′(SEQ ID NO：170) 

PB1、PB2和PA RNA PCR的引物如下： 

PB1正向：5′-CGGATTGATGCACGGATTGATTTC-3′(SEQ ID NO：171) 

PB1反向：5′-GACGTCTGAGCTCTTCAATGGTGGAAC-3′(SEQ ID NO：172) 

PB2正向：5′-GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3′(SEQ ID NO：173) 

PB2反向：5′-AATCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAG-3′(SEQ ID NO：174) 

PA正向：5′-GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3′(SEQ ID NO：175) 

PA反向：5′-CCGAGAAGCATTAAGCAAAACCCAG-3′(SEQ ID NO：176) 

结果 

为确定NP-1496是否专门靶向NP基因区段的降解或除NP外的病毒RNA的含量亦受影响，使用对具特异性的引物进行RT及实时PCR来如上所述(实例4)测量不同NS RNA种类(mRNA、vRNA、cRNA)的量。如图19中所示，NS mRNA、vRNA和cRNA中的变化显示与所观察到的NP RNA的变化模式相同的模式。感染后3小时，在模拟转染细胞中可观察到所有NS RNA种类皆显著增加，而在接受NP-1496siRNA的细胞中，未看到NS RNA含量出现显著改变。该结果表明，不同病毒RNA的转录及复制至少相对于NP RNA经协同调控。协同调控意指一种转录物的含量直接或间接影响另一转录物的含量。此并不意指特别机制。当siRNA处理使NP转录物降低时，病毒RNA亦降低。 

为进一步研究NP siRNA对其它病毒RNA的影响，在已用NP-1496处理的细胞中测量所有病毒基因mRNA、vRNA和cRNA的积聚情况。如图19A(顶部组)中所示，在感染后1或2小时，NP特异性mRNA较低。在感染后3小时，在不存在NP-1496的情况下可容易地检测到NP mRNA，而在存在NP-1496的情况下，NP mRNA 的含量维持在本底水平，表明siRNA抑制特定mRNA的积聚。如图19A(中间及底部组)所示，在存在NP-1496的情况下，NP特异性及NS特异性vRNA和cRNA的含量受到明显抑制。这些结果确认了实例4中所述结果。另外，在NP-1496处理细胞中，M、NS、PB1、PB2及PA基因的mRNA、vRNA及cRNA亦受到抑制(图19B、19C及19H)。此外，对于PA-2087亦观察到广泛抑制效应。图19E、19F及19G左侧顶部、中部及底部组所示结果与图19A、19B和19C中所示相同，表明NP-1496siRNA可抑制病毒mRNA的转录及病毒vRNA和cRNA的复制。图19E、19F及19G右侧的顶部、中部及底部组显示在相同浓度下使用PA-2087siRNA实施的相同实验的结果。如图19E中右侧上、中及下组分别所示，感染后3小时，在不存在PA-2087的情况下容易地检测到PA、M及NS mRNA，而PA-2087的存抑制PA、M及NS mRNA的转录。如图19F中右侧上、中及下组分别所示，在感染后3小时，在不存在PA-2087的情况下可容易地检测到PA、M及NS vRNA，而PA-2087的存在抑制PA、M及NS vRNA的积聚。如图19G右侧上、中及下组分别所示，在感染后3小时，在不存在PA-2087的情况下可容易地检测到PA、M及NS cRNA，而PA-2087的存在抑制PA、M及NS cRNA的积聚。另外，图19H显示NP特异性siRNA抑制PB1-(顶部组)、PB2-(中部组)及PA-(底部组)特异性mRNA。 

虽然不欲受任何理论限制，但本发明的发明人提出，NP siRNA的广泛效应可能由NP在结合及稳定vRNA和cRNA中的重要性导致，而非因为NP特异性siRNA非特异性地靶向RNA降解。流行性感冒病毒中的NP基因区段编码一单链RNA结合核蛋白，该单链RNA结合核蛋白可结合至vKNA和cRNA二者(参见图15)。在病毒生命周期中，NP mRNA首先被转录及转译。NP蛋白质的主要功能是壳体化病毒基因组以进行RNA转录、复制及包装。若不存在NP蛋白质，则vRNA和cRNA二者的全长合成皆严重受损。当NP siRNA引发NP RNA的降解时，NP蛋白质合成受损，造成缺乏足够的NP蛋白质，此随后影响其它病毒基因区段的合成。在该测定中，NP siRNA可在一极早阶段强效抑制病毒产生。 

已假定感染细胞中NP蛋白质分子的数量可调节mRNA合成相对基因组RNA(vRNA和cRNA)复制的水平(1)。使用在NP蛋白质中的温度敏感突变，先前研究已显示，cRNA而非mRNA合成在体外及体内皆对温度敏感(70、71)。已证明新生cRNA和vRNA转录物的延长及抗终止皆需要NP蛋白质(71、72)。上述结果显示，NP特异性siRNA抑制感染细胞中所有病毒RNA的积聚。虽然不欲受任何理论限制，但似乎在存在NP特异性siRNA的情况下可使新转录的NP mRNA降解，从而抑制病毒感染后NP蛋白质的合成。在无新合成NP的情况下，进一步的病毒转录及复制且由此新病毒粒子产生受到抑制。 

同样，在存在PA特异性siRNA的情况下，新近转录的PA mRNA降解，导致产生PA蛋白质合成的抑制。尽管每一种流行性感冒病毒粒子(1)存在30-60个RNA转录酶复制体，然而在无新合成RNA转录酶的情况下，进一步的病毒转录和复制极有可能受到抑制。使用对PB1具特异性的siRNA可获得类似结果。相反，到病毒感染后期才需要基质(M)蛋白质(1)。因此，M特异性siRNA可抑制M特异性mRNA而非vRNA、cRNA或其它病毒RNA的积聚。概言之，这些发现表明，在流行性感冒病毒RNA转录及复制中极其需要新合成的核蛋白及聚合酶蛋白质。NP-、PA-和PB1-特异性siRNA用以干扰mRNA积聚和其它病毒RNA转录的mRNA-和病毒特异性机制表明，这些siRNA可能尤其为流行性感冒病毒感染的强效抑制剂。具体而言，本文所述结果表明，通常，靶向编码RNA或DNA结合蛋白质(通常结合至病原体特异性核酸(DNA或RNA))的转录物的siRNA极有可能具有广泛效应(例如对其它病原体特异性转录物的效应)而非仅仅降低所靶向RNA的水平。同样，本文所述结果表明，通常，靶向传染病病原体之聚合酶基因(RNA聚合酶、DNA聚合酶或反转录酶)的siRNA极有可能具有广泛效应(例如对其它病原体特异性转录物的效应)而非仅仅降低聚合酶RNA的含量。 

实例7：某些siRNA对病毒RNA积聚的广泛抑制作用并非由干扰素应答或由病毒引发的RNA降解造成。 

材料和方法 

测量RNA含量：在标准条件下使用PCR测量RNA含量。使用下列PCR引物测量γ-肌动蛋白RNA。 

γ-肌动蛋白 正向：5′-TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3′(SEQ ID NO：177) 

γ-肌动蛋白 反向：5′-AAATGCAAACCGCTTCCAAC-3′(SEQ ID NO：178) 

根据下文所引述参考文献中所述标准技术培养Vero细胞并测量磷酸化PKR。 

结果 

造成对病毒RNA广泛抑制作用的一可能原因为在存在siRNA时感染细胞的干扰素应答(23、65、66)。因此，在Vero细胞中重复上述实验，在Vero细胞中缺少完整的IFN基因座，包括所有的α、β及ω基因(67、68)(Q.G.和J.C.，数据未公开)。如同在MDCK细胞中，NP-、M-及NS-特异性mRNA的积聚全部受到NP-1496抑制(图19D)。另外，使用PCR测定siRNA对细胞基因的转录物(包括P-肌动蛋白、γ-肌动蛋白和GAPDH)的效应。在不存在siRNA的情况下未检测到转录物水平间存在显著差异(图18C，底部组，显示M-37siRNA对γ-肌动蛋白siRNA不具有效应，数据未示出)，表明siRNA的抑制效应对病毒RNA具特异性。这些结果表明，某些siRNA对病毒RNA积聚的广泛抑制作用不是由细胞干扰素应答造成的。 

在流行性感冒病毒感染后，dsRNA的存在亦可激活一靶向RNA的细胞降解途径(23)。为检测siRNA对激活该途径的效应，我们分析该途径的最重要组份即磷酸化蛋白激酶R(PKR)的含量(23)。在不存在病毒感染的情况下用NP-1496转染MDCK细胞不影响经激活PKR的含量(数据未显示)。用流行性感冒病毒感染导致磷酸化PKR含量升高，这与先前研究一致(65、66、69)。然而，在存在siRNA的情况下对病毒RNA积聚的广泛抑制并非是由病毒引发的降解增强的结果。 

实例8：系统性鉴别具有可单独或组合抑制流行性感冒病毒产生的超强能力的siRNA 

该实例描述一种鉴别具抑制流行性感冒病毒产生这一超强能力的siRNA的方法。尽管该实例涉及siRNA，但应理解，该方法亦可用于评价shRNA，这些shRNA 的双螺旋部分与下述siRNA的双螺旋部分完全相同且其含有一其序列可变化的环，如上所述。 

基本原理：为了达成预防及治疗这两个目的，需要鉴别出可展示超强抑制流行性感冒病毒感染功效的siRNA。如上所述，已设计并测试20种siRNA，其中19种基于在5′端包括AA二-核苷酸的高度保守序列。尽管最初认为在该位置存在AA二-核苷酸对于siRNA功能很重要，但最近的发现表明，它们并非必不可少，因为基于在该位置含有其它核苷酸的序列的siRNA同样有效(22，28)。因此，将对基于不从AA开始的序列设计的其它siRNA进行设计及检测，以鉴别可有效抑制流行性感冒病毒产生的其它siRNA。 

现已有几种强效抑制性siRNA，此使得它们可组合在一起使用。最近一项关于siRNA对小儿麻痹病毒抑制性的研究显示，使用单一siRNA导致现有的变种小儿麻痹病毒过度生长，而不能由siRNA靶向(24)。因为已知流行性感冒病毒突变速率高(4)，因此使用单一siRNA可能促进变种病毒过度生长，以致在一段时间后有可能造成该siRNA变得无效。另一方面，若同时使用两种或更多不同siRNA，尤其是那些对不同病毒RNA具特异性的siRNA，则可以数个数量级降低出现变种病毒的可能性。因此，将以两种或更多种的组合的形式对siRNA进行测试，以找出更能效的组合。 

该实例描述一种可达成下列目标的系统性方法： 

1)设计及测试另外的siRNA，以使流行性感冒病毒基因组的整个保守区域由非重叠siRNA覆盖一次。 

2)通过用逐渐增加的高感染复数(MOI)筛选siRNA来鉴别效力最强的siRNA。 

3)鉴别效力最强的有效siRNA的组合以防止出现抗性病毒。 

设计并检测另外的siRNA设计对未由实例1中所述siRNA覆盖的病毒基因组保守区域具特异性的另外siRNA。该目的是用非重叠siRNA覆盖该病毒基因组的保守区域一次。选择非重叠siRNA有两个原因。首先，同时施用重叠siRNA 可能不能提供最有效的组合，因为某些靶序列系共有。重叠区域中的突变极有可能使两种siRNA皆无效。第二，对于一广泛筛选而言，重叠siRNA的数目可能过大，以致在一适当时间段内无法测试。该目的是对于PA、PB1、PB2、NP、M及NS中的每一个获得至少一种强效siRNA。(通过RNA剪接，M和NS基因各编码两种蛋白质。若可能，设计对两种来自同一基团的转录物皆具特异性的siRNA。)早已鉴别出对NP、PA及PB1具特异性的强效siRNA(表5)，因此将集中在测试更多对PB2、M及NS具特异性的侯选siRNA上。若测试非重叠siRNA未揭示针对该些基因的强效siRNA，则将对侯选重叠siRNA进行测试。获得对6种基因的每一种具特异性的强效抑制性siRNA将促进对最有效组合的鉴别。 

为设计另外的非重叠siRNA，使用与实例1及实施方式中所述相同的标准，不同之处为不需要起始AA二-核苷酸。基于该些标准，据估计可能需要测试约40种siRNA。单链RNA寡核苷酸以商业方式合成并退火至其互补链。检测所得siRNA双螺旋在MDCK细胞中干扰流行性感冒病毒产生(PR8、WSN或二者)的能力，通过血凝素分析测量。在鸡胚中进一步评价那些在该细胞系中有效的siRNA。优先选择在细胞及胚胎二者中对两种病毒亚型显示一致抑制效应的SiRNA进行进一步研究。 

比较各siRNA的效力一旦鉴别出显著抑制流行性感冒病毒产生的siRNA，立即对它们在相同分析中的效力进行比较，以鉴别最有效的siRNA。在大多数使用MDCK细胞的上述分析法中，以0.001或0.01的MOI使用病毒。发现，通过血凝素分析皆检测不到两种试样(NP-1496和PA-2087)中的病毒效价，而在一种试样(NP-1496)中通过噬菌斑分析检测不到病毒效价。为区别这些siRNA(尤其是对同一基因具特异性的siRNA)的效力，感染MDCK所用的MOI将增加至0.1或更高。亦在鸡胚中测试siRNA。使用噬菌斑分析来更精确地测量病毒效价。 

另外，通过用滴定法测量转染所用siRNA的量来比较siRNA的效力。简言之，将不同量的siRNA(例如0.025、0.05、0.1及0.25nmol)电穿孔入MDCK细胞(1×107)中。用PR8或WSN病毒以固定MOI(例如0.01)感染细胞，60小 时后收获上清液，通过测量血凝病毒效价。自这些实验获得的结果将有助于确定每一siRNA的效力以及最大抑制所需的最小量。后者对确定在下述组合中所用每一siRNA的量有用。 

鉴别最有效的siRNA组合同时使用两种或多种不同siRNA可能对防止变种病毒的出现相当有用，这些变种病毒能逃脱一单个siRNA的干扰。一旦鉴别出对8种病毒基因中的多个有效的siRNA，立即对其呈组合形式的效能进行检查。较佳鉴别出靶向至少2种基因的有效siRNA。更佳地，鉴别出靶向至少3、4、5、6、7或甚至全部8种基因的有效siRNA。然而，理想情况为最初将测试限制为少于全部8种基因，例如5或6种基因。对于这些研究而言，下列因素较为重要：i)同一混合物中所用siRNA的数量，ii)“混合剂”中所用每一siRNA的最小量，及iii)鉴别最强效组合的最有效方法。 

据估计，流行性感冒病毒的突变速率为每一感染周期1.5×10-5(4)。若同时使用两种对不同基因具特异性的siRNA，则出现抗性病毒的可能性为2.25×10-10。考虑到siRNA有时可容许一个核苷酸失配(26)，尤其在未端(28)及反义链的3′半部分，同时使用两种siRNA应能十分有效地防止出现抗性病毒。保守地说，三种siRNA组合使用应足够。该计算假定混合物中的每一siRNA皆独立起作用。最初，将如上所测定的单独使用该siRNA时达成对流行性感冒病毒产生的最大抑制所需siRNA最小量用于组合中。某些研究已显示哺乳动物细胞和果蝇(Drosophila)中的RNAi机制可能有限(27、29、30)。若RNA干扰流行性感冒病毒产生的情况似乎确是如此，则将测试降低数量的组合中的每一siRNA，例如为半数最大剂量的两种siRNA组合中的每一siRNA。 

首先，以系统方式测试两种siRNA的测试组合。该方法的优点在于，不仅会产生两种siRNA的最有效组份，而且有希望产生在3种siRNA的组合中的有效组份。尽管对不同病毒基因或病毒生命周期中不同步骤具特异性的两种siRNA的组合可能因协同效应而更为理想，但亦值得测试对该转录酶的不同组份具特异性的siRNA之组合，因为该转录酶的不同组份为非高丰度蛋白质且对病毒产 生至关重要。假定对于每一基因(PA、PB1、PB2、NP、M及NS)要鉴别一种有效siRNA，则必须测试15种组合才能覆盖两种siRNA的所有可能组合。 

将siRNA逐个或两种一组通过电穿孔引入MDCK细胞中。8小时后，用PR8或WSN病毒以一预定MOI感染细胞，60小时后收获培养上清液，通过血凝反应测定病毒效价。通过噬菌斑分析来确定具有实质低血凝素单位的试样中的精确效价。在鸡胚中测定siRNA的组合来证实自细胞系获得的结果。 

该系列实验的结果将揭示两种siRNA之组合的相对效力以及两种siRNA的组合是否具有协同效应。举例而言，若NP-1496与PA-2087的组合比单个NP-1496加PA-2087的加性效应更为有效，则该组合将具有协同效应。该些结果将指示三种siRNA的组合中的哪一组合极有可能最为有效。举例而言，假定NP-1496与PA-2087比单独的NP-1496或PA-2087更为有效，并且PA-2087与PB1-2257的组合比单独的PA-2087或PB1-2257更为有效，则3种siRNA在一含有NP-1496、PA-2087及PB1-2257的混合剂中将有希望特别有效。测量至少3种在MDCK细胞和鸡胚中最有可能有效的siRNA混合剂的效力。若自两种siRNA的组合获得的结果没有帮助，则以所述测试2种siRNA混合剂的方法系统性测量3种siRNA混合剂的效力。为涵盖所有可能性，需要测试10种不同的组合。 

概言之，自所提议实验获得的结果将有希望自8种流行性感冒病毒基因中若干种的保守区域鉴别最有效的siRNA及其最能有效抑制流行性感冒病毒产生的组合。 

实例9：评价可促进siRNA细胞吸收的非病毒输送剂。该实例阐述了测试多种非病毒输送剂增强siRNA细胞吸收的能力。以下实例提供的数据显示测试多种聚合物的正性结果，这些聚合物如下或实例本身中所述测试。可以类似方法测试其它输送剂。 

阳离子聚合物：据信，阳离子聚合物具有促进DNA细胞内吸收的能力部分是由于其能结合至DNA并将大质粒DNA分子凝聚成更小的DNA/聚合物复合物以便于更有效内吞。siRNA双螺旋较短(例如，长度仅为21个核苷酸)，表明其可 能不能更进一步凝聚。诸如shRNA等siRNA前驱体亦相对较短。然而阳离子聚合物结合带负电荷的siRNA并与带负电荷的细胞表面相互作用的能力可促进siRNA和shRNA的细胞内吸收。因此，常规阳离子聚合物(包括但不限于PLL、经修饰的PLL(例如，用酰基、琥珀酰基、乙酰基或咪唑基团修饰(32))、聚乙烯亚胺(PEI)(37)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(38)及脱乙酰壳多糖(39，40))为有希望的候选siRNA和shRNA输送剂。 

另外，Robert Langer实验室开发的阳离子聚合物和寡聚物为有希望的候选输送剂。已研究出自二丙烯酸酯及胺单体合成及测试新颖阳离子聚合物和寡聚物的大型文库用于DNA转染的有效方法。这些聚合物在本文中称为(P-氨基酯)(PAE)聚合物。在一第一研究中，自7种二丙烯酸单体及20种胺单体合成140种聚合物并对其进行测试(34)。在该等140种成员中，发现70种可充分溶于水(2mg/ml，25mM乙酸盐缓冲剂，pH＝5.0)。在该等70种水溶性聚合物有有56种与DNA相互反应，如通过电泳迁移率变动分析所示。最重要的是，发现此56种聚合物中有2种聚合物调介DNA转染入COS-7细胞中。该些聚合物的转染效率为PEI的4至8倍高且优于Lipofectamine 2000。 

自初始研究后，已构筑并筛选一由2,400种阳离子聚合物构成的文库，并已获得另外约40种可促进DNA转染的聚合物(118)。由于结构变化可对DNA结合及转染效能产生显著影响，(33)，需要对多种聚合物的促进siRNA细胞内吸收的能力进行测试。此外，通过研究聚合物体内性能即吸收、分布、代谢及排泄(ADME)发现，在转移至一体内系统即哺乳动物个体中时，某些聚合物极有可能受到排斥。因此，在完好有机体中的测试极为重要。 

概言之，在siRNA转染实验中至少测试约50种阳离子聚合物。这些聚合物中的大多数将为上述经PAE和咪唑基团改质的PLL。PEI、PVP和脱乙酰壳多糖将自商业来源购得。为快速并有效地筛选这些聚合物，已将可成功转染细胞的PAE聚合物文库转移至溶液中加至96孔板中。以该标准96孔板形式存储聚合物容许使用一无菌Labcyte EDR 384S/96S自动微量移液器直接进行半自动筛选。 以滴定方式测量聚合物的量(使用一预定量的siRNA)来界定适当的聚合物-siRNA比率及量有效的输送条件。视具体分析而定，半自动筛选将与下述略有不同。 

siRNA/聚合物复合物的定性：对于促进siRNA细胞内吸收的各种不同阳离子聚合物而言，其应能与siRNA形成复合物。本文将根据类似于(34)中所述的方案通过电泳迁移率变动分析(EMSA)对此进行检测。简言之，使用自动微量移液器将NP-1496siRNA与约50种聚合物中的每一种在96孔板中以1∶0.1、1∶0.3、1∶0.9、1∶2.7、1∶8.1及1∶24.3(siRNA/聚合物，w/w)的比率混合。使用一多道移液器将这些混合物加入4％琼脂糖凝胶平板中，该平板可分析高达500份试样。通过溴化乙锭染色观察siRNA的迁移模式。若在存在一聚合物的情况下一siRNA的迁移率降低，则该siRNA与该聚合物形成复合物。基于siRNA与聚合物的比率，可鉴别中和比率。不与siRNA结合的聚合物较不佳。进一步的检测将集中在确实与siRNA结合的聚合物上。 

已在细胞系中测量单独或呈与DNA复合的复合物形式的咪唑基团改质PLL、PEL、PVP、脱乙酰壳多糖及某些PAE聚合物的细胞毒性。由于细胞毒性随所结合分子而改变，因此将在MDCK细胞中测量各种聚合物及改质聚合物的细胞毒性，这些聚合物呈与siRNA复合的复合物形式。简言之，使用无菌Labcyte自动微量移液器将NP-1496与不同数量的上述聚合物混合。将这些复合物施加到96孔板中的MDCK细胞中4小时。然后，用正常生长培养基代替含聚合物的培养基。24小时后，使用MTT分析(41)以96孔板形式测量细胞的代谢活性。在最低使用剂量下杀死90％或更多细胞的聚合物较不佳，进一步研究将集中于在最低使用剂量下杀死不超过90％细胞的聚合物上。 

虽然在某些情况下已使用DNA/聚合物组合物实施类似研究，但重要的是确定使用RNA/聚合物组合物是否可获得类似结果(例如细胞毒性、对细胞吸收的促进)。 

经培养细胞的siRNA吸收一旦已定性siRNA/聚合物复合物，则立即对其促 进siRNA细胞吸收的能力进行检测，使用两种不同分析系统自经培养细胞开始。在第一种方法中，在表达GFP的MDCK细胞上检测一GFP特异性siRNA(GFP-949)，因此通过测量荧光强度可容易地定量GFP表达的降低。简言之，将GFP-949/聚合物以与上述相同的比率施加至96孔板中的MDCK细胞中。作为阴性对照，使用NP-1496或不使用siRNA。作为阳性对照，通过电穿孔将GFP-949引入细胞中。36小时后，细胞将溶解在96孔板中，通过一荧光平板读数器测量荧光强度。不同聚合物促进siRNA细胞吸收的能力通过GFP强度的总降低指示。或者，使用一装备成可处理呈96孔形式的试样的流式细胞仪来分析细胞的GFP表达。各种聚合物促进siRNA细胞吸收的能力通过GFP强度降低了的细胞的百分比及GFP强度的降低程度表示。自这些分析获得的结果亦清楚地表明适合最有效转染的最佳siRNA∶聚合物比率。 

在第二种方法中，直接测量对MDCK细胞中流行性感冒病毒产生的抑制程度。如上所述，将不同比率的NP-1496siRNA/聚合物施加在96孔板中的MDCK细胞中。作为阳性对照，通过电穿孔将siRNA引入到MDCK细胞中。作为阴性对照，使用GFP-949或不使用siRNA。8小时后，用PR8或WSN病毒以一预定MOI感染细胞。60小时后收获培养物上清液并在96孔板中通过血凝反应在未经稀释的情况下对病毒进行分析。稀释在初始分析中具有低病毒效价的细胞的上清液(由此指示该siRNA/聚合物组合物抑制病毒产生)并通过血凝反应进行分析。或者，通过MTT分析60小时时受感染培养物的代谢活性。因为受感染细胞最终溶解，所以代谢活性的相对水平也可以指示对病毒感染的抑制程度。 

如果用siRNA/聚合物处理的培养物中的病毒效价或代谢活性显著低于未经处理的培养物，那么可得出以下结论，即该聚合物促进siRNA转染。通过比较其中siRNA是通过电穿孔引入的培养物中的病毒效价，可以估测siRNA和siRNA/聚合物组合物的相对转染效率。 

通过滴定测量siRNA和聚合物两者而在96孔板中用病毒感染分析验证从最初两次筛选获得的多种最有效阳离子聚合物。基于所得结果，在24孔板和6孔 板中的MDCK细胞中进一步分析在最有效的siRNA∶聚合物比率下该等6种聚合物的能力。选择多种最有效的聚合物如实例10中所述在小鼠中进行进一步研究。 

替代方法：作为用于有效促进所培养细胞中siRNA的细胞内吸收的阳离子聚合物的替代物，在siRNA转染实验中对富精氨酸肽进行研究。因为认为ARP通过与带负电荷的磷脂相互作用而直接渗透质膜(48)，而认为大多数目前所用阳离子聚合物是通过内吞作用促进DNA的细胞吸收的，所以对ARP促进siRNA细胞内吸收的效能进行研究。如同阳离子聚合物一样，ARP和聚精氨酸(PLA)也带相反电荷，极易结合siRNA，表明可能无需将siRNA共价结合于ARP或PLA。因此，用类似于其它阳离子聚合物的方式处理ARP或PLA。如上所述测定来自Tat的ARP和不同长度的PLA(自Sigma获得)促进siRNA细胞吸收的能力。 

实例10：在小鼠中测试siRNA和siRNA/输送剂组合物 

基本原理：评价所鉴别聚合物促进siRNA由小鼠呼吸道中细胞吸收的能力，并检验siRNA在预防及治疗小鼠中流行性感冒病毒感染方面的效能。SiRNA在小鼠中展示抑制流行性感冒病毒感染作用将为其用于人类预防或治疗流行性感冒病毒感染(例如，通过鼻内或肺施用siRNA)的潜在用途提供证据。该实例阐述用于鉴别可有效将siRNA输送至细胞且可有效治疗或预防流行性感冒病毒感染的含siRNA组合物的方法。简言之，该实例阐述siRNA/聚合物组合物的测试。可使用类似方法测试其它siRNA/输送剂组合物，例如siRNA/阳离子聚合物组合物、siRNA/富精氨酸肽组合物等。 

用药途径：由于流行性感冒病毒感染上呼吸道及肺的上皮细胞，因此将集中阐述将siRNA输送入呼吸道上皮细胞中的方法。已使用多种不同方法将小分子药物、蛋白质及DNA/聚合物复合物输送至小鼠的上呼吸道及/或肺中，包括滴注、气雾剂(液体及干粉末二者)吸入、气管内给药及静脉内注射。滴注时，通常将小鼠略微麻醉并保持垂直挺立。将少量(通常30-50μl)治疗剂(即siRNA/聚合物复合物)缓慢施加至一个鼻孔，该液体自此吸入(52)。将动物短时间保持直立位置，以容许滴注液体到达肺部(53)。滴注法可有效地将治疗剂同时输送 至上呼吸道及肺部且可对同一只小鼠重复实施数次。 

使用气雾剂时，液体及干粉末通常以不同方式施用。通过一喷雾器产生液体气雾剂并喷入一密封塑料袋中，将小鼠放入(52)。由于气雾剂在动物呼吸时吸入，所以该方法可能无效且不精确。干粉末气雾剂通常通过对麻醉小鼠强制通气施用。只要气雾剂颗粒大而多孔，该方法便十分有效(见下文)(31)。对于气管内给药，通过一试管将含治疗剂的溶液注入到麻醉小鼠的肺部(54)。尽管其可十分有效地将治疗剂输送到肺部，但却错过上呼吸道。已证明，静脉内注射呈与蛋白质和聚乙烯亚胺复合的复合物形式的少量DNA(约1μg)会转染内皮细胞及肺间质组织中的细胞(55)。基于此考虑，首先将siRNA/聚合物复合物通过滴注施用至小鼠。亦研究静脉内输送及使用多孔大颗粒的气雾剂输送。另外，亦检测其它输送输送方法，包括静脉内及腹膜腔内注射。 

呼吸道中细胞的siRNA吸收：对如实例9中所述鉴别的多种最有效聚合物进行检测，以确定其促进siRNA在小鼠呼吸道中的细胞内吸收的能力。为便于进行研究，将利用GFP-特异性siRNA(GFP-949)在表达GFP的转基因小鼠中对GFP表达的抑制。使用GFP-特异性siRNA的优点最初在于，分析的简化及精确可加速鉴别在小鼠中有效的聚合物。另外，所获得结果可清楚显示体内吸收siRNA的细胞区域及类型。后一信息可用于改进输送剂及用于以最优方式将siRNA输送至呼吸道上皮细胞中的方法。 

简言之，通过滴注法将标定剂量的GFP-949/聚合物复合物(以实例9中所测定的最有效比率)投与GFP转基因小鼠。作为对照，仅给予小鼠siRNA，或仅给与聚合物，或不施用任何药物，或施用非特异性siRNA/聚合物复合物。在施用siRNA后36至48小时自上呼吸道及肺采集组织，包埋于OCT中并冷冻。于一荧光显微镜下观察切片的GFP强度，并将相邻切片用苏木精/伊红(H/E)染色。或者，将组织固定在多聚甲醛中并包埋在OCT中。将某些切片用H&E染色并将相邻切片用HRP共轭抗GFP抗体染色。利用组织重叠及GFP影像(或抗-GFP染色)能够鉴别其中GFP表达受抑制的区域或细胞类型。敏感性增加时，可通过共焦 显微镜术鉴别GFP强度降低的区域。 

基于自通过滴注转染DNA获得的发现(52，56)，可预测siRNA将最有可能由呼吸道表面上的上皮细胞吸收。若与对照小鼠相比在用GFP-949/聚合物治疗的小鼠中观察到GFP强度显著降低，则此表明该特定聚合物可促进体内siRNA细胞吸收。 

SiRNA对小鼠中流行性感冒病毒感染的抑制：除上述在GFP转基因小鼠中的GFP-949研究外，使用对流行性感冒病毒具特异性的siRNA(例如NP-1496)或更合适地使用2或3种siRNA“混合剂”检测多种在促进小鼠中siRNA吸收方面最有效的聚合物。对于初始研究，通过在滴注前混合siRNA/聚合物复合物与病毒将siRNA/聚合物复合物与流行性感冒病毒同时加入小鼠中。使用标定剂量的siRNA/聚合物复合物与PR8病毒(一预定剂量下)。作为对照，对小鼠单独施用siRNA，或单独施用聚合物，或不施用任何物质，或施用GFP-949/聚合物。在感染后不同时间上(例如感染后2-3天或更长时间，例如数天或1周或更长)，制备鼻腔灌洗液，将肺脏均质化，通过冷冻及解冻洗提病毒。通过血凝反应测量灌洗液及肺脏中的病毒效价。若效价过低以致血凝素分析检测不到，则在血凝素分析前在MDCK细胞中扩增病毒。为了更精确地测定病毒效价，对所选试样实施噬菌斑分析。 

若单次剂量的siRNA/聚合物不能有效抑制流行性感冒感染，则对siRNA的多次投与(相对高的剂量)进行研究以确定多次投与是否更有效，举例而言，在初始siRNA/聚合物和病毒投与后，每12小时将siRNA/聚合物给予小鼠，共给予2天(4份剂量)。在初始感染后的不同时间点上测量肺脏及鼻腔灌洗液中的病毒效价。 

该些实验的结果将显示siRNA是否能有效抑制上呼吸道和肺的流行性感冒病毒感染，并指示最有效的单次剂量。据预期，在治疗流行性感冒病毒感染方面，多次投与siRNA/聚合物极有可能比单次投与更有效。亦可使用其它聚合物或输送剂以及输送siRNA/聚合物的不同方法，例如下文所述者。 

使用多孔大颗粒输送siRNA/聚合物：另一输送至上呼吸道及肺部的有效输送输送方法是使用多孔大颗粒，其最初由Robert Langer氏集团研制。不同于基于液体的滴注法，后一种方法依靠吸入载有治疗剂的多孔大颗粒(干粉末)。在最初研究中，显示治疗剂和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)或聚(乳酸-共-赖氨酸-接枝-赖氨酸)(PLAL-Lys)的双乳液溶剂蒸发可产生多孔大颗粒(31)。该些颗粒具有小于0.4gram/cm3的质量密度及超过5μm的平均直径。因为其密度低，因此可高效地将其深吸入肺中。肺中的巨噬细胞亦很难有效地清除该些颗粒(57)。大鼠吸入含胰岛素的多孔大颗粒可导致胰岛素的全身水平升高并抑制全身的葡萄糖含量达96小时，而无孔小颗粒仅为4小时。 

已提出一产生多孔大颗粒的方案，其使用FDA批准用于吸入的赋形剂或肺的内源性赋形剂(或同时使用二者)(58)。在该方案中，将水溶性赋形剂(即，乳糖、白蛋白等)及治疗剂溶于蒸馏水中。将该溶液加至一Niro AtomizerPortable Spray Dryer(携带式雾化喷雾干燥器)(Niro，Inc.，Colombus，MD)中生成干粉末，粉末的平均几何直径介于3和15μm之间且振实密度在0.04和0.6g/cm3之间。 

该喷雾干燥方法用于产生Langer所述的载有siRNA/聚合物的多孔低密度大颗粒，不同之处为治疗剂由siRNA/聚合物代替。所得颗粒的孔隙率、密度及大小如(31、58)中所述表征。使用一Harvard呼吸器通过强制通气将达到上述标准的颗粒施用至麻醉小鼠。根据是否使用一对GFP或流行性感冒病毒具特异性的siRNA，将实施不同的分析，如上所述。若在接受了多孔大颗粒形式之特异性siRNA/聚合物的小鼠中的GFP表达或病毒效价显著低于对照小鼠，则经由多孔大颗粒的气雾剂吸入法看来是一有效的一siRNA输送输送方法。 

siRNAs/聚合物复合物的预防及治疗性应用：检测siRNA/聚合物复合物预防或治疗小鼠中流行性感冒病毒感染的效能。假定一单次剂量的siRNA/聚合物复合物有效，则评价于其施用后siRNA在干扰流行性感冒感染上保持有效的时间长度。通过滴注或多孔大气雾剂(视哪种方法更为有效，如上所述测定)将siRNA/ 聚合物复合物投与小鼠。立即或在1、2或3天后用流行性感冒病毒感染小鼠，在病毒感染后24或48小时测量鼻腔灌洗液或肺脏中的病毒效价。若发现siRNA在3天后仍有效，则在投与siRNA/聚合物后第4、5、6及7天感染小鼠，在感染后24小时采集组织来分析病毒效价。该些实验的结果有希望揭示siRNA投与后可有效干扰小鼠中病毒产生的持续时间，从而指导在人类中的应用。 

为评价siRNA的疗效，将小鼠用流行性感冒病毒感染并在感染后不同时间上给予siRNA/聚合物复合物。具体而言，以鼻内方式感染小鼠，然后立即或在1、2或3天后施用有效剂量(如上所述测定)的siRNA/聚合物。作为对照，在感染后立即给予小鼠GFP-949或不施用任何siRNA。SiRNA给药24或48小时后测量鼻腔灌洗液及肺脏中的病毒效价。 

另外，用致死量的流行性感冒病毒感染小鼠并将小鼠分成5组(每组5-8只小鼠)。第1组立即接受有效剂量的siRNA/聚合物复合物。第2至4组在感染后1至3天接受有效剂量的siRNA/聚合物复合物。第5组在感染后立即接受GFP-特异性siRNA并用作对照。跟踪受感染小鼠的存活情况。该些实验的结果有希望揭示感染后多长时间施用siRNA仍能对小鼠产生疗效。 

实例11：由DNA载体或慢病毒所提供模板转录的siRNA对流行性感冒病毒感染的抑制 

基本原理：对流行性感冒病毒感染的有效siRNA治疗取决于将充足量的siRNA输送至体内适宜细胞中的能。为防止出现抗性病毒，较佳将2或3种siRNA一起使用。将2或3种siRNA同时输送到相同细胞中需要一有效的输送系统。作为上述方法的替代方法，对使用DNA载体将siRNA前驱体转录并处理成有效siRNA进行研究。 

先前已显示，由一DNA载体转录的siRNA抑制CD8α表达的程度与引入相同细胞中的合成siRNA相同，特定而言，我们发现，设计成靶向CD8α基因的5种siRNA之一(称为CD8-61)于一小鼠CD8+CD4+T细胞系中抑制CD8而非CD4的表达(27)。通过对CD8-61siRNA的各种发夹衍生物进行测验，发现CD8-61F具 有一类似于CD8-61的抑制活性(图20A和20B)(59)。CD8-61F的发夹结构使其可构筑入一DNA载体pSLOOP III(图20C)中，在pSLOOP III中CD8-61F由HIRNA启动子驱动。HI RNA启动子紧结(60)且由聚合酶III(pol III)转录。之所以使用Pol III启动子是因为其通常转录短RNA且先前已用于产生siRNA-型沉默(61)。为测试该DNA载体，使用已用一CD8α表达载体转染的海拉细胞(HeLa细胞)。如图20D中所示，将pSLOOP III-CD8-61F质粒瞬时转染入表达CD8α的海位细胞导致CD8α表达降低，降低程度与用合成CD8-61siRNA转染的海拉细胞相同。相反，转染一无启动子载体并不显著降低CD8α表达。该些结果显示，RNA发夹可自一DNA载体转录且然后被处理成siRNA用于RNA沉默。使用一类似方法来设计表达对流行性感冒病毒具特异性的siRNA前驱体的DNA载体。 

研究经培养细胞中自DNA模板转录的siRNA：为自一DNA载体表达siRNA前驱体，设计siRNA的可被处理成siRNA双螺旋的发夹衍生物(对流行性感冒病毒具特异性)。另外，产生自其可转录2种或更多种siRNA前驱体的载体。为加快该些研究的速度，将GFP-949和NP-1496siRNA用于表达GFP的MDCK细胞中。在CD8-61F设计后，合成GFP-949和NP-1496的发夹衍生物(分别称为GFP-949H和NP-1496H)(图21A)。 

将GFP-949和GFP-949H皆通过电穿孔引入表达GFP的MDCK细胞中。NP-1496电穿孔或模拟电穿孔用作阴性对照。24和48小时后，通过流式细胞术分析细胞的GFP表达情况。若给予GFP-949H的培养物中的GFP-阳性细胞的百分率及GFP含量强度显著降低，则展示出该发夹衍生物的效力。其效能通过比较接受了标准GFP-949的细胞中的GFP强度来指示。 

同样，将NP-1496和NP-1496H通过电穿孔引入MDCK细胞中。GFP-949电穿孔或模拟电穿孔用作阴性对照。转染后8小时，将细胞用PR8或WSN病毒感染。感染后60小时通过血凝反应测量培养上清液中的病毒效价。若接受NP-1496H的培养物中的病毒效价显著降低，则该发夹衍生物抑制病毒产生。根据对CD8-61F的研究可预计，该些发夹衍生物将起作用。若并非如此，则合成并测试 类似于(59、61、62)中所述发夹衍生物的不同设计。 

设计DNA载体并在经培养细胞中对其进行检测：当显示GFP-949H和NP-1496H起作用，则构筑相应的表达载体。GFP-949H和NP-1496H将在pSLOOP III载体中的H1启动子之后进行个别克隆(图21C，顶部)。所得载体通过电穿孔瞬时转染入表达GFP的MDCK细胞中。分析经转染细胞的GFP强度，或将其用病毒感染并对病毒产生情况进行分析。已显示U6 Pol III启动子可驱动高水平的siRNA前驱体表达，对其及其它启动子进行检测以鉴别出一种可用于siRNA前驱体转录的强效启动子。 

当证明转录一单个siRNA前驱体的载体为有效载体时，构筑可转录两种siRNA前驱体的载体。对于该目的，将GFP-949H和NP-1496H二者以串联形式克隆入pSLOOP III载体中，或者GFP-949H在5′端而NP-1496H在3′端，或者相反(图21C，中部)。在所得载体中，两种siRNA前驱体通过发夹结构中所含的额外核苷酸连接(图21B)。由于不清楚两种siRNA是否可仅自一个转录体处理而成，因此亦构筑其中GFP-949H和NP-1496H由独立的启动子转录的载体(图21C，底部)。 

由于MDCK细胞中的转染效率为约50％，瞬时转染对于评价编码两种siRNA前驱体的载体而言并不理想。因此，通过用线性化载体加一新抗性载体将表达GFP的MDCK细胞电穿孔来建立稳定的转染子。自多个转染子中分离出DNA，以通过南方印迹证实siRNA表达载体的存在。分析阳性转染子的GFP表达来确定自稳定整合载体转录的GFP-特异性siRNA是否可抑制GFP表达。将其中GFP表达受抑制的转染子用PR8或WSN病毒感染并通过血凝反应。测量病毒效价。若发现相当一部分转染子中GFP表达和病毒产生二者皆受抑制，则可确定这两种siRNA前驱体可自一单个DNA载体转录和处理而成。 

构筑一单个siRNA前驱体自其转录的载体应简单明了，因为一类似方法已成功用于先前研究中(59)。由于许多研究已显示，使用完全相同的启动子和终止序列可自同一载体独立转录两种基因，因此两种siRNA前驱体有希望自同一 载体转录。在后一种方法中，独立转录siRNA前驱体。所得dsRNA前驱体的长度极有可能小于50个核苷酸。相反，当两种siRNA前驱体以串联形式转录时(图21B和C)，所得dsRNA前驱体的长度将大于50个核苷酸。长度大于50个核苷酸的dsRNA之存在可激活哺乳动物细胞中的干扰素应答(22、23)。因此，自同一载体独立转录两种siRNA前驱体的另一优点在于可避免干扰素应答。干扰素可抑制病毒感染，因此可能有用，但干扰素反应亦可关闭许多代谢途径，因此会干扰细胞功能(63)。 

为确定是否已在用各种不同DNA载体转染的MDCK细胞中引发干扰素应答，对总的及磷酸化dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)进行分析，因为PKR的磷酸化对于干扰素应答必不可少(23)。将自载体转染细胞和模拟转染细胞制得的细胞溶解产物在SDS-PAGE上分级分离。将蛋白质转移到膜上，用对磷酸化PKR或总PKR具特异性的抗体探测该膜。若测定的敏感性不够高，则在免疫沉淀反应后实施西方印迹。若未检测到经激活PKR水平有差异，则转录自DNA载体的dsRNA前驱体不激活干扰素应答。用于siRNA细胞内合成的较佳DNA载体不激活干扰素应答，因此本发明提供该等载体。 

在小鼠中研究DNA载体  一旦得知转录自DNA载体的siRNA可在MDCK细胞中抑制流行性感冒病毒产生，即在小鼠中对它们的效能进行研究。为将所引入质粒整合至细胞基因组中的程度降至最低，使用超螺旋DNA进行瞬时表达。瞬时表达的另一优点在于，表达的水平往往会较高，这可能是因为整合前每个细胞的质粒拷贝数较高。为促进小鼠中的DNA转染，使用已用于基因治疗的阳离子聚合物，包括实例8中所述经咪唑基团改质的PLL、PEI、PVP和PAE。 

特定而言，将表达DNA载体的GFP-949H或NP-1496H单独或NP-1496H和GFP-949H二者同时与特定聚合物以一预定比率混合。通过滴注将标定量的复合物加PR8或WSN病毒引入麻醉的GFP转基因小鼠中。作为对照，将DNA单独施予小鼠，或将聚合物单独施予小鼠，或不施用任何物质。在感染后2和3天，如实例10中所述收获鼻腔灌洗液和肺脏来分析病毒效价。另外，检查上呼吸道 和肺脏切片，以确定GFP表达是否降低。 

DNA/聚合物复合物亦可多次投与，例如首先与病毒一起投与，在接下来的2天每天投与一次。在感染后第3天检查多次投与的效果。另外，构筑可编码2或3种流行性感冒特异性siRNA前驱体的DNA载体，并在小鼠中检测它们抑制流行性感冒感染的效能。 

慢病毒：将上述构造插入慢病毒转移质粒中并用于产生感染性慢病毒。该些慢病毒由此可在感染有病毒的细胞内提供合成shRNA的模板。如上关于DNA载体所述，在组织培养物和小鼠中检测慢病毒载体抑制流行性感冒病毒产生的能力。使用本发明输送剂或先前用于投与慢病毒或病毒基因治疗载体的输送剂中的任一种将该些慢病毒投与小鼠。 

实例12：通过siRNA抑制小鼠中的流行性感冒病毒产生 

该实例阐述些等实验，该些实验显示，施用靶向流行性感冒病毒NP或PA转录物的siRNA可在小鼠中抑制流行性感冒病毒的产生，该等siRNA是在流行性感冒病毒感染前或感染后施用。该抑制作用具剂量依赖性，并且当两种靶向两种不同流行性感冒病毒基因所表达转录物的siRNA一起使用时显示加性效果。 

材料和方法 

SiRNA制备：如上所述制备SiRNA。 

SiRNA输送：室温下在5％葡萄糖中将siRNA(30或60μg GFP-949、NP-1496或PA-2087)用jetPEITM(寡核苷酸阳离子聚合物转染剂，N/P比＝5，Qbiogene，Inc.，Carlsbad，CA；Cat.No.GDSP20130；N/P指该jetPEI试剂中每一核苷酸磷酸所对应的氮残基数目)或用聚-L-赖氨酸(MW(vis)52,000；MW(LALLS)41,800，Sigma Cat.No.P2636)培养20分钟。将混合物静脉注射入小鼠中，注射至眼窝后静脉中，每只小鼠200μl，每组4只小鼠。将200μl 5％葡萄糖注射入对照(无治疗)小鼠中。在siRNA或鼻内感染前用2.5％ Avertin麻醉小鼠。 

病毒感染：用PR8病毒经鼻内感染B6小鼠(保持在标准实验室条件下)，感染通过用移液管将含病毒缓冲液滴入小鼠鼻子中实施，每只小鼠30μl(12,000 pfu)。 

测定病毒效价：在感染后不同时间上将小鼠杀死，获取肺脏。将肺脏匀浆化并将匀浆冷冻和解冻两次，释放病毒。通过MDCK细胞的感染测定受感染肺脏中PR8病毒的效价。以每一加样孔3×104MDCK细胞接种平底96孔板，24小时后移除含血清的培养基。将25μl肺匀浆(未经稀释或自1×10-1稀释至1×10-7)接种入加样孔中(一式三份)。培养1小时后将175μl含4μg/ml胰蛋白酶的感染培养基加入每一加样孔中。在37℃下培养48小时后，利用受感染细胞的上清液通过鸡RBC的血凝反应测定是否存在病毒。血凝反应在2倍稀释的V形底96孔板中实施。将上清液的系列2倍稀释液与等体积的0.5％鸡红细胞悬浮液(vol/vol)(Charles River Laboratories)混合并在冰上培养1小时。含有红细胞粘性均质层的加样孔评记为阳性。病毒效价通过用Reed和Muench的方法内插感染50％加样孔的稀释终点测定(TCID50)。将任一2组的数据与Student t检验进行比较，Student t检验在整个本文所述实验中用于评价显著性。 

结果 

图22A显示一实验结果，证实靶向病毒NP转录体的siRNA在感染前投与可在小鼠中抑制流行性感冒病毒产生。如上文在材料和方法中所述，用jetPEI培养30或60μg GFP-949或NP-1496siRNA，静脉注射入小鼠中。3小时后，用PR8病毒鼻内感染小鼠，每只小鼠12,000pfu。感染后24小时获取肺脏。如图22A中所示，未接受siRNA治疗(NT；填充方框)或接受一靶向GFP的siRNA治疗(GFP 60μg；空方框)的小鼠，其肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.2。在用30μg靶向NP的siRNA(NP 30μg；空圆)和jetPEI预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.9。在用60μg靶向NP的siRNA(NP 60μg；填充圆)和jetPEI预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.2。未接受治疗的组和接受60μg NP siRNA治疗的组之间，肺脏匀浆中的病毒效价差异的显著性为P＝0.0002。个体小鼠的数据列于表6A中(NT＝未治疗)。 

图22B显示另一实验的结果，其证实，当于一含阳离子聚物PLL的组合物 中在感染前以静脉内方式投与时，靶向病毒转录物的siRNA在小鼠中可抑制流行性感冒病毒产生。如上文在材料和方法中所述，将30或60μg GFP-949或NP-1496siRNA用PLL培养并静脉注射入小鼠中。3小时后，用PR8病毒鼻内感染小鼠，每只小鼠12,000pfu。感染后24小时获取肺脏。如图22B中所示，未接受siRNA治疗(NT；填充方框)或接受一靶向GFP的siRNA治疗(GFP 60μg；空方框)的小鼠，其肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.1。在用60μg靶向NP的siRNA(NP 60μg；填充圆)和PII预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.0。接受60μg GFP的组和接受60μg NP siRNA的组之间，肺脏匀浆中的病毒效价差异的显著性为P＝0.001。个体小鼠的数据列于表6A(NT＝未治疗)中。这些数据表明，当在病毒感染前投与时，靶向流行性感冒NP转录物的siRNA可降低肺脏中的病毒效价。其亦表明，当通过静脉注射投与时，siRNA和阳离子聚合物的混合物为抑制流行性感冒病毒的有效药剂，而无需诸如流体转染等技术。 

表6A siRNA和阳离子聚合物对小鼠中流行性感冒病毒产生的抑制 

图22C显示一第三实验的结果，其证实，当在感染前投与时，靶向病毒NP转录物的siRNA可抑制小鼠中的流行性感冒病毒产生，亦展示存在一阳离子聚合物可显著增强siRNA的抑制效能。如上文在材料和方法中所述，将60μgGFP-949或NP-1496siRNA用磷酸缓冲盐溶液(PBS)或jetPEI培养，并静脉注射入小鼠中。3小时后，用PR8病毒鼻内感染小鼠，每只小鼠12,000pfu。感染 所24小时获取肺脏。如图22C中所示，未接受siRNA治疗(NT；空方框)的小鼠，肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.1，而接受一于PBS中靶向GFP的siRNA治疗(GFP PBS；空三角)的小鼠，其肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.4。在用60μg于PBS中靶向NP的siRNA(NP PBS；空圆)预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.2，相对于未经治疗或用一靶向GFP的siRNA治疗而言，在效能上仅略微增强。在用60μg于jetPEI中靶向GFP的siRNAtargeted to GFP(GFP PEI；空圆)预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为4.2。然而，在接受60μg于jetPEI中靶向NP的siRNA(NP PEI；填充圆)和jetPEI的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.9。在用60μg靶向NP的siRNA和jetPEI(NP PEI；填充圆)预处理的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.2。接受于PBS中的GFP siRNA的组与接受于PBS中的NP siRNA的组之间，病毒效价的差异显著性为P＝0.04，而在接受GFP siRNA和jetPEI的组与接受NP siRNA和jetPEI的组之间，肺脏匀浆中病毒效价的差异显著性较高，为P＝0.003。个体小鼠的数据列于表6B中(NT＝未治疗)。 

表6B：siRNA和阳离子聚合物在小鼠中显示可增强对流行性感冒病毒产生抑制的效能 

图23显示一实验的结果，证实靶向不同流行性感冒病毒转录物的siRNA展示一加性效应。如上文中材料和方法中所述，将60μg NP-1496siRNA、60μgPA-2087siRNA或60μg NP-1496siRNA+60μg PA-2087siRNA用jetPEI培养并静脉注射入小鼠中。3小时后，用PR8病毒鼻内感染小鼠，每只小鼠12,000pfu。感染后24小时获取肺脏。如图23中所示，未接受siRNA治疗(NT；填充 方框)的小鼠，肺脏均浆的平均log10TCID50为4.2。在接受60μg靶向NP的siRNA(NP 60μg；空圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.2。在接受60μg靶向PA的siRNA(PA 60μg；空三角)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.4。在接60μg靶向NP的siRNA+60μg靶向PA的siRNA(NP+PA；填充圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为2.4。在未接受治疗的组与接受60μg NP siRNA、60μg PA siRNA或60μg NP siRNA+60μg PAsiRNA的组之间，肺脏匀浆中病毒效价的差异显著性分别为P＝0.003、0.01和0.0001。在接受60μg NP siRNA或60μNP siRNA的组与接受60μg NP siRNA+60μg PA siRNA的组间，肺脏匀浆中的差异显著性为P＝0.01。个体小鼠的数据列于表7中(NT＝未治疗)。这些数据表明，用靶向流行性感冒NP或PA转录物的siRNA预处理可降低随后用流行性感冒病毒感染的小鼠肺中的病毒效价。这些数据进一步表明，靶向不同病毒转录物的siRNA的组合展示一加性效应，此表明，相对于达成相等效能所需的单个siRNA的量，用靶向不同转录物的siRNA组合进行治疗可降低每一siRNA的剂量。某些靶向不同转录物的siRNA可能展示协同效应(即，大于加性效应的效应)。用于鉴别强效siRNA和siRNA组合的系统性方法可用于鉴别其中各siRNA展示协同效应的siRNA组合物。 

表7：siRNA在小鼠中抗流行性感冒病毒的加性效应 

图24显示一实验结果，其证明当在感染后投与时，靶向病毒NP转录物的siRNA可抑制小鼠中的流行性感冒病毒产生。用500pfu PR8病毒感染小鼠。如上文材料和方法中所述，用jetPEI培养60μg GFP-949siRNA、60μg PA-2087siRNA、60μg NP-1496siRNA或60μg NP siRNA+60μg PA siRNA并于5小 时后静脉注射入小鼠中。SiRNA投与后28小时获取肺脏。如图24中所示，未接受siRNA治疗(NT；填充方框)或接受GFP-特异性siRNA GFP-949(GFP；空方框)的小鼠，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.0。在接受60μg靶向PA的siRNA(PA60μg；空三角)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为2.2。在接受60μg靶向NP的siRNA(NP 60μg；空圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为2.2。在接受60μg NP siRNA+60μg PA siRNA(PA+NP；填充圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为1.8。在未接受治疗的组与接受60μg PA、NP siRNA或60μg NP siRNA+60μg PA siRNA的组之间，肺脏匀浆中病毒效价差异的显著性分别为P＝0.09、0.02和0.003。在接受NP siRNA与PA+NPsiRNA的组之间，肺脏匀浆中的病毒效价具有为0.2的P值。个体小鼠的数据列于表8中(NT＝未治疗)。这些数据表明，在病毒感染后投与靶向流行性感冒NP及/或PA转录物的siRNA降低肺脏中的病毒效价。 

表8：siKNA对受感染小鼠中流行性感冒病毒产生的抑制 

实例13：通过投与一为shRNA产生提供模板的慢病毒抑制细胞中的流行性感冒病毒产生 

材料和方法 

细胞培养：于1ml DMEM-10％FCS中将Vero细胞以每加样孔4×105个细胞接种在24孔板中，并于37℃在5％CO2下培养。 

产生为shRNA产生提供模板的慢病毒：如图25中以示意方式所绘示，在慢病毒载体pLL3.7(Rubinson，D.等人，Nature Genetics，Vol.33，pp.401-406， 2003)的U6启动子和终止序列间克隆一寡核苷酸，该寡核苷酸用作NP-1496ashRNA合成的模板(参见图25A)。该寡核苷酸插入pLL3.7多克隆位点内的HpaI与XhoI限制酶切位点之间。该慢病毒载体亦表达EGFP，通过EGFP可容易地监控受转染/感染细胞。共转染包含一产生NP-1496a shRNA用模板的DNA载体，并将该些载体包装入293T细胞中，由此可产生慢病毒。48小时后，收集含慢病毒的上清液，4℃下在2000rpm下旋转7分钟，通过一0.45μm滤器过滤。将Vero细胞以每加样孔1×105个细胞接种在24孔板中。过夜培养后，在存在8μg/ml聚凝胺的情况下，将含插入区段的上清液(0.25ml或1.0ml)添加至加样孔中。然后室温于2500rpm下将孔板离心1小时，并重新培养。感染24小时后，通过流式细胞术分析所得Vero细胞系(Vero-NP-0.25和Vero-NP-1.0)以及亲本(未感染)Vero细胞的GFP表达。注意到，NP-1496a不同于NP-1496，这是由于无意中在有义部分的3′端加入一额外(A)且在反义部分的5′端加入一互补核苷酸(U)，导致一长度为20nt的双螺旋部分，而在NP-1496中双螺旋部分的长度为19nt(参见表2)。本发明的其它实施例使用NP-1496序列而非NP-1496a序列。另外，NP-1496a shRNA的环部分不同于图21中所示NP-1496shRNA的环部分。 

流行性感冒病毒感染和病毒效价的测定：以0.04、0.2和1的MOI用PR8病毒感染对照Vero细胞和感染有含插入区段之慢病毒的Vero细胞(Vero-NP-0.25和Vero-NP-1.0)。感染48小时后，如实例12中所述通过血凝反应(HA)分析来测定上清液中的流行性感冒病毒效价。 

结果 

检验含供产生NP-1496a shRNA用模板的慢病毒在Vero细胞中抑制流行性感冒病毒产生的能力。NP-1496a shRNA包括两条互补链，这两条互补链能形成一包含一双链部分的茎环结构，该双链部分具有与上述NP-1496a siRNA相同的序列。如图25B中所示，将含慢病毒的上清液和Vero细胞培养过夜可产生EGFP的表达，表明Vero细胞被慢病毒感染。阴影区线代表对照细胞(未感染)中的 平均荧光强度。当使用1ml上清液时，几乎所有的细胞皆变得EGFP阳性且平均荧光强度较高(1818)(Vero-NP-1.0)。当使用0.25ml的上清液时，大多数细胞(-95％)皆为EGFP阳性且平均荧光强度较低(503)(Vero-NP-0.25)。 

然后用流行性感冒病毒以0.04、0.2和0.1的MOI感染亲本Vero细胞和经慢病毒感染的Vero细胞，在流行性感冒病毒感染后48小时测定病毒效价。随着MOI增加，亲本Vero细胞培养物的上清液中病毒效价增加(图25C)。相反，Vero-NP-1.0细胞培养物上清液中的病毒效价仍保持很低，表明在这些细胞中流行性感冒病毒产生受到抑制。同样，Vero-NP-0.25细胞培养物中的流行性感冒病毒产生亦部分受到抑制。病毒效价列于表9中。这些结果表明，自慢病毒载体表达的NP-1496shRNA可被处理成siRNA，来抑制Vero细胞中的流行性感冒病毒产生。抑制程度看来与每一细胞的病毒感染程度(由EGFP水平表示)成正比。 

表9：在组织培养物细胞中表达的siRNA对流行性感冒病毒产生的抑制 

实例14：通过鼻内投与一DNA载体(自其可转录siRNA前驱体)在小鼠中抑制流行性感冒产生 

材料和方法 

构筑用作shRNA之模板的质粒：实例13中阐述自其表达NP-1496a shRNA的质粒的构筑。如实例13和图25A中针对NP-1496a shRNA所述及所示，在慢病毒载体pLL3.7的U6启动子与终止序列间克隆用作合成PB1-2257shRNA或RSV-特异性shRNA的模板的寡核苷酸。该些寡核苷酸的序列如下： 

NP-1496a有义： 

5′-TGGATCTTATTTCTTCGGAGATTCAAGAGATCTCCGAAGAAATAAGATCCTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：179) 

NP-1496a反义： 

5′-TCGAGAAAAAAGGATCTTATTTCTTCGGAGATCTCTTGAATCTCCGAAGAAATAAGATCCA-3′(SEQ ID NO：180) 

PB1-2257有义： 

5′-TGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGAGATTCAATGGTGGAACAGATCTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：181) 

PB1-2257反义： 

5′-TCGAGAAAAAAGATCTGTTCCACCATTGAATCTCTTGAATTCAATGGTGGAACAGATCA-3′(SEQ ID NO：182) 

RSV有义： 

5′-TGCGATAATATAACTGCAAGATTCAAGAGATCTTGCAGTTATATTATCGTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：183) 

RSV反义： 

5′-TCGAGAAAAAACGATAATATAACTGCAAGATCTCTTGAATCTTGCAGTTATATTATCGCA-3′(SEQ ID NO：184) 

自包含上述寡核苷酸的载体表达的RSV shRNA在体内受到处理，产生一具以下序列的有义及反义链的siRNA： 

有义：5′-CGATAATATAACTGCAAGA-3′(SEQ ID NO：185) 

反义：5′-TCTTGCAGTTATATTATCG-3′(SEQ ID NO：186) 

可使用以下寡核苷酸以类似方式构筑一PA-特异性发夹： 

PA-2087有义： 

5′-TGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGAGATCAGGCACTCCTCAATTGCTTTTTTC-3′(SEQ ID NO：187) 

PA-2087反义： 

5′-TCGAGAAAAAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATCTCTTGAATCAGGCACTCCTCAATTGCA-3′(SEQ ID NO：270) 

病毒感染和病毒效价的测定：该等如实例12中所述实施。 

DNA输送将可用作NP-1496a shRNA、PB1-2257shRNA或RSV-特异性shRNA表达模板的质粒DNA(各60μg)分别与40μl Infasurf

(ONY，Inc.，AmherstNY)和20μl 5％葡萄糖混合并经鼻内投与各小鼠，每组4只小鼠，如上所述。将40μl Infasurf和20μl 5％葡萄糖的混合物投与未接受治疗(NT)组中的小鼠。13小时后用PR8病毒鼻内感染小鼠，每只小鼠12,000pfu，如上所述。感染后24小时获取肺脏并测定病毒效价。 

结果 

检验自DNA载体表达的shRNA在小鼠中抑制流行性感冒病毒感染的能力。在这些实验中，将质粒DNA与Infasurf混合，Infasurf为一种自牛肺脏提取的天然表面活性剂，其类似于先前所示可促进肺脏中基因转移的媒剂(74)。通过使用一移液管将混合物滴入鼻腔中将DNA/Infasurf混合物滴注入小鼠中。13小时后用PR8病毒感染小鼠，每只小鼠12,000pfu。在流行性感冒病毒感染24小时后，获取肺脏，通过MDCK/血凝素分析测量病毒效价。 

如图26中所示，在未接受质粒DNA或接受一表达呼吸道合胞病毒(RSV)-特异性shRNA的DNA载体的小鼠中，病毒效价较高。当小鼠接受表达NP-1496a shRNA或PB1-2257shRNA的质粒DNA时，观察到较低的病毒效价。当小鼠同时接受两种流行性感冒-特异性质粒DNA(一种表达NP-1496a shRNA而另一种表达PB1-2257shRNA)时，病毒效价更显著降低。未接受治疗(NT；空方框)或接受编码RSV-特异性shRNA的质粒(RSV；填充方框)的小鼠，其肺脏匀浆的平均log10TCID50分别为4.0或4.1。在接受可用作NP-1496a shRNA模板的质粒(NP；空圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.4。在接受可用作PB1-2257shRNA模板的质粒(PB；空三角)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.8。在接受可用作NP和PB shRNA模板的质粒(NP+PB1；填充圆)的小鼠中，肺脏匀浆的平均log10TCID50为3.2。在未接受治疗或接受RSV-特异性shRNA质粒的组与接受NP shRNA质粒、PB1 shRNA质粒或NP和PB1 shRNA质粒的组之间，肺脏匀浆中的病毒效价差异具有分别为0.049、0.124和0.004的P值。个体小 鼠的数据列于表10中(NT＝未治疗)。在存在PBS或jetPEI但不存在Infasurf的情况下，涉及鼻内投与NP-1496siRNA而非NP shRNA的初步实验并未产生对流行性感冒病毒的有效抑制。这些结果显示，自DNA载体表达的shRNA可在小鼠中被处理成siRNA来抑制流行性感冒病毒产生，亦证明Infasurf为输送自其表达shRNA的质粒的适宜媒剂。特定而言，这些数据表明，当在病毒感染后投与时，靶向流行性感冒NP及/或PB1转录物的shRNA可降低肺脏中的病毒效价。 

＞＞产生。 

表10：在小鼠中表达的shRNA对流行性感冒病毒的抑制 

实例15：阳离子聚合物促进siRNA的细胞吸收 

材料和方法 

试剂：具两种不同平均分子量的聚-L-赖氨酸[聚-L-赖氨酸(MW(vis)52,000；MW(LALLS)41,800，Cat.No.P2636)和聚-L-赖氨酸(MW(vis)9,400；MW(LALLS)8,400，Cat.No.P2636)、聚-L-精氨酸(MW 15,000-70,000Cat.No.P7762)及溴化3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑盐(MTT)购自Sigma。为了便于说明，假定分子量是使用LALLS方法获得，但应了解，由于该些聚合物在大小上展示某种不均匀性，因此分子量为大约值。 

凝胶阻滞分析：通过将10μl siRNA(10pmol于10mM Hepes缓冲液中，pH 7.2)与10μl含不同数量聚合物的聚合物溶液混合形成siRNA-聚合物复合物。允许复合物在室温下形成30分钟，此后将20μl复合物在4％琼脂糖凝胶上电泳。用溴化乙锭染色观察带型。 

细胞毒性分析：通过在室温下将等量(50pmol)siRNA(于10mM Hepes缓冲液中，pH 7.2)与含不同数量聚合物的聚合物溶液混合30分钟形成siRNA-聚合物复合物。细胞毒性通过MTT分析评价。于0.2ml含10％胎牛血清(FCS)的DMEM中将细胞以每-加样孔30,000个细胞接种在96孔板中。在37℃过夜培养后，移除培养基并用0.18ml OPTI-MEM(GIBCO/BRL)代替。将于20μl Hepes缓冲液中的siRNA-聚合物复合物添加到细胞中。在37℃下培养6小时后，移除含聚合物培养基并用DMEM-10％FCS代替。24小时后根据制造商的说明书使用MTT分析测量细胞的代谢活性。实验重复实施三次，将数据平均。 

细胞培养、转染、siRNA-聚合物复合物形成及病毒效价测定：于5％CO2/95％空气气氛及37℃下在含10％热灭活FCS、2mM L-谷氨酰胺、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中生长Vero细胞。对于转染实验，于1mlDMEM-10％FCS中将对数期Vero细胞以每一加样孔4×105个细胞接种在24孔板中。在37℃下过夜培养后，通过将50μl siRNA(400pmol(约700ng)，于10mMHepes缓冲液中，pH 7.2)添加到50μl聚合物中并旋转来形成siRNA-聚合物复合物。使用不同浓度的聚合物以在siRNA和聚合物间形成完整的复合物。将混合物在室温下培养30分钟以形成完全的复合物。就在添加复合物前移除细胞生长培养基并用OPTI-MEMI(Life Technologies)代替。 

于37℃5％CO2下用该些复合物培养细胞6小时后，移除含复合物的培养基并向每一加样孔中添加200μl于感染培养基中的PR8病毒(MOI＝0.04)，感染培养基由DMEM、0.3％BSA(Sigma)、10mM Hepes、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素组成。在不断摇晃的条件下室温培育1小时后，向每一加样孔中添加0.8ml含4μg/ml胰蛋白酶的感染培养基并将细胞在37℃5％CO2下培养。在感染后不同时间点，自受感染培养物获取上清液并如上所述通过血凝(HA)分析测定病毒效价。 

根据制造商关于粘性细胞系的说明用Lipofectamine 2000(LifeTechnology)转染siRNA。简言之，于1ml DMEM-10％FCS中将对数期Vero细胞 以每一加样孔4×105个细胞接种在24孔板中，并在37℃5％CO2下培养。第二天，将50μl在OPTI-MEM I中的稀Lipoffectamine 2000添加到50μl siRNA(400pmol，于OPTI-MEM I中)形成复合物。洗涤细胞并用不含血清的培养基培养。将该些复合物施加到细胞中并在如上所述洗涤和用流行性感冒病毒感染前将细胞在37℃下培养6小时。在感染后不同时间点上，自受感染培养物获取上清液并通过血凝(HA)分析测定病毒效价，如上所述。 

结果 

检测聚-L-赖氨酸(PLL)和聚-L-精氨酸(PLA)与siRNA形成复合物及促进siRNA由经培养细胞吸收的能力。为确定PLL及/或PLA是否可与siRNA形成复合物，将固定量的NP-1496siRNA与渐增量的聚合物混合。然后在4％琼脂糖凝胶中通过电泳观察聚合物/siRNA复合物和形成。随着聚合物的数量不断增加，siRNA电泳迁移率受到阻碍(图27A和27B)，表明形成复合物。图27A和27B分别显示在siRNA与PLL(41.8K)或PLA之间形成复合物。每组中所用聚合物的量从左到右增加。在图27A和27B的每一组中，可在左侧泳道中观察到条带，表明缺少复合物形成，因此导致siRNA进入凝胶中并随后迁移。再观察一下右侧，会发现条带消失，表明形成了复合物，复合物未能进入凝胶并迁移。 

为研究siRNA/聚合物复合物的细胞毒性，将不同比率的siRNA与PLL或PLA的混合物加至96孔板中的Vero细胞中。通过MTT分析测量细胞的代谢活性(74)。实验重复实施三次，将数据平均。当PLL(MW-42K)的量逐渐增加时，细胞生存力显著降低，而PLL(-8K)显示明显更低的毒性，当PLL/siRNA比率高达4∶1展示最小毒性或无毒性(图28A；圆＝PLL(MW-8K)；方框＝PLL(MW-42K))。虽然如图28B中所示，当PLA/siRNA比率增加时细胞生存力降低，但当PLA/siRNA比率高达4.5∶1时，生存力仍保持在80％以上。聚合物/siRNA比率在图28A和28B中在x-轴上显示。图28A和28B中绘示的数据列于表11和12中。在表11中，数字表示，相对于未经处理细胞的％存活力，在用聚合物/siRNA复合物处理后细胞的％生存力。ND＝未实施。在表12中，数字表示所示PLA/siRNA比率、 ％存活率和标准偏差。 

图11：PLL/siRNA复合物的毒性(％存活率) 

表12：PLA/siRNA复合物的毒性(％存活率) 

为确定PLL或PLA是否可促进siRNA的细胞吸收，将不同量的聚合物和NP-1496以可使所有siRNA皆与聚合物复合的比率混合。在每一情况下皆使用等量的siRNA。-42K PLL比-8K PLL所用聚合物/siRNA比率低，因为已证明前者对细胞的毒性更大。将该等复合物添加到Vero细胞中，6小时后用PR8病毒感染培养物。在感染后不同时间点上，收获培养上清液并通过HA分析对病毒进行分析。图29A为在接受各种不同转染处理的细胞中病毒效价对时间的曲线图(圆＝未处理；方框＝Lipofectamine；填充三角＝PLL(-42K，PLL/siRNA比率＝2)；空三角＝PLL(-8K，PLL/siRNA比率＝8)。如图29A中所示，在未转染培养物中，病毒效价随时间而增加。在用NP-1496/Lipofectamine转染的培养物中病毒效价显著较低，在用PLL/NP-1496复合物处理的培养物中病毒效价更低。图29A中所绘示数据列于表13中(NT＝未处理；LF2K＝Lipofectamine)。PLL：siRNA比率在括号中注明。 

用类似方式以多种聚合物/siRNA比率检测PLA。图29B为在接受多种不同转染处理的细胞中病毒效价对时间的曲线图(填充方框＝模拟转染；填充圆＝Lipofectamine；空方框＝PLA，PLA/siRNA比率＝1；空圆＝PLA，PLA/siRNA 比率＝2；空三角＝PLA，PLA/siRNA比率＝4；填充三角＝PLA，PLA/siRNA比率＝8)。如图29B中所示，在对照(模拟转染)培养物和用1∶1的PLA/siRNA处理的培养物中，病毒效价随时间而增加。在用NP-1496/Lipofectamin e转染的培养物中病毒效价显著较低，在用PLA/siRNA复合物处理的培养物(含PLA/siRNA比率为4∶1或更高的复合物)中病毒效价更低。聚合物数量增加可更大程度上降低病毒效价。图29B中所绘示数据列于表14中。 

表13：聚合物/siRNA复合物对流行性感冒病毒产生的抑制 

表14：聚合物/siRNA复合物对流行性感冒病毒产生的抑制 

因此，阳离子聚合物可于细胞系中促进siRNA的细胞吸收并抑制流行性感冒病毒产生，并且比广泛使用的转染剂Lipofectamine更为有效。这些结果亦表明，可容易地鉴别可刺激siRNA细胞吸收的另外阳离子聚合物，并阐述鉴别这些聚合物的方法。PLL和PLA可用作该等鉴别的阳性对照。 

等效物 

所属领域的技术人员将认识到或仅使用常规实验即可确定本文所述本发明 具体实施例的许多等效物。本发明的范围并不意欲限于上述说明，而是如随附权利要求书中所阐述。 

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Claims (31)

1.一种适于投与哺乳动物的组合物，其包含一靶向于流行性感冒病毒转录物的siRNA或shRNA，所述组合物经投与所述哺乳动物能抑制所述病毒的产生，其中所述siRNA或shRNA选自SEQ ID NOS：69至108、188和189。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA的存在浓度足以将流行性感冒病毒的复制或产生抑制至少2倍。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA包含一至少15个核苷酸长的碱基成对区域。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA包含一至少15个核苷酸长的碱基成对区域和至少一个单链3起始端突出端。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA选自SEQ ID NOS：89及90。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA选自SEQ ID NOS：91及92。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA选自SEQ ID NOS：93及94。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA选自SEQ ID NOS：188及189。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA选自SEQ ID NOS：83及84。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA选自SEQ ID NOS：77及78。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述siRNA选自SEQ ID NOS：71及72。

12.根据权利要求1所述的组合物，进一步包括复数个靶向于所述目标转录物的siRNA或shRNA。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA靶向于复数个目标转录物，所述目标转录物对应于两个或多个流行性感冒病毒转录物。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述siRNA或shRNA靶向于同一个流行性感冒病毒转录物的两个或多个区域。

15.根据权利要求1所述的组合物，进一步包含一为所述siRNA或shRNA提供一合成模板的载体。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述载体选自由DNA载体和病毒载体组成的群组。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、及腺相关病毒载体组成的群组。

18.根据权利要求15所述的组合物，所述载体包含一核酸，所述核酸操作性地连接以表达在一宿主细胞上活跃的信号，且操作性地连接到RNA聚合酶III的一启动子上。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述载体选自由DNA载体和病毒载体组成的群组。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述病毒载体选自由逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、及腺相关病毒载体组成的群组。

21.根据权利要求5-11中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含一种输送剂，其选自由下述各物组成的群组：阳离子聚合物、肽分子转运蛋白、适合引入肺部的表面活性剂、中性或阳离子脂质、脂质体、非阳离子性聚合物、布比卡因(bupivacaine)及氯奎宁。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述阳离子聚合物为经修饰的阳离子聚合物。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述非阳离子性聚合物为经修饰的非阳离子性聚合物。

24.根据权利要求21所述的组合物，其进一步包括输送增强部分，该输送增强部分包含一抗体、抗体片段或配体，其特异性结合于一由呼吸上皮细胞所表达的分子上。

25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述阳离子聚合物选自由聚赖氨酸、聚精氨酸、聚乙烯亚胺、聚乙烯吡咯烷酮、脱乙酰壳多糖和聚(β-氨基酯)聚合物组成的群组。

26.一种制备如权利要求1所述的组合物的方法，所述方法包括下述步骤：提供复数个单链RNA，及杂交所述单链RNA。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述单链RNA的长度范围为21-23个核苷酸。

28.一种根据权利要求1所述的组合物用于制造医药组合物的用途，所述医药组合物用于治疗或预防由流行感冒病毒引起的感染。

29.根据权利要求28所述的用途，其中所述医药组合物能被通过静脉内、鼻内或吸入方式投药。

30.一种根据权利要求15所述的组合物用于制造医药组合物的用途，所述医药组合物用于治疗或预防由流行感冒病毒引起的感染。

31.一种医药组合物，其包含根据权利要求1所述的组合物及一种医药上可接受的载剂，其中所述组合物被调配成一种气溶胶、鼻用喷雾剂、或者用于经静脉投与。

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