MXPA05003287A

MXPA05003287A - Influenza terapeutica.

Info

Publication number: MXPA05003287A
Application number: MXPA05003287A
Authority: MX
Inventors: Ge Qing
Original assignee: Massachusetts Inst Technology
Priority date: 2002-09-28
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2005-07-05
Also published as: AU2003279010A8; AU2003279004B2; WO2004028471A2; JP2006512906A; HK1104302A1; AU2003279010A1; NO20052058D0; AU2010202770A1; WO2004029213A3; US20050008617A1; WO2004029213A2; NO20052058L; CA2500468A1; WO2004028471A3; EP1658304A4; AU2003279004A1; KR20050084607A; EP1658304A2

Abstract

La presente invencion proporciona metodos y composiciones para inhibir la infeccion y/o replicacion por influenza con base en el fenomeno de interferencia de ARN (ARNi) asi como sistemas para identificacion de los ARNsi y ARNsh efectivos para inhibir el virus de la influenza y sistemas para estudiar los mecanismos infecciosos del virus de la influenza. La invencion tambien proporciona metodos y composiciones para inhibir la infeccion, patogenicidad y/o replicacion de otros agentes infecciosos, particularmente aquellos que infectan celulas que son directamente accesibles del exterior del cuerpo, por ejemplo, celulas de la piel o celulas mucosas. Ademas, la invencion proporciona composiciones que comprenden una entidad inductora de ARNi, por ejemplo, un vector inductor del ARNsi, ARNsh o ARNi dirigido a un transcrito del virus de la influenza y cualesquiera de una diversidad de agentes de suministro. La invencion incluye ademas metodos de uso de las composiciones para el tratamiento de la influenza.

Description

WO 2004/028471 A2 ] di II !ifilii (I IÍI1II li!idllB !!lli III I [I (II IIIÍI ÍIIIÍ llill lilli II Ilf lili DIII» illi lífl IIÍ Eurasian patent (AM, AZ, B Y, KG, KZ, MD, RU, TJ, TM), For two-letter codes and other abbreviations, refer to the "Guid- European patent (AT, BE, BG, CH, CY, CZ, DE, DK, EE, ance Notes on Codes andAbbrevi tions" appearing at the begin- ES, FI, FR, GB, GR, HU, IE, IT, LU, MC, NL, PT, RO, ning of each regular issue of the PCI Gazette. SE, SI, SK, TR), OAPI patent (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, GQ, GW, ML, MR, NE, SN, TD, TG). Published: — withoul intemational search repon and to be republished upon receipt of that repon 1 TERAPEUTICO PARA INFLUENZA Antecedentes de la Invención La influenza es una de las infecciones más difundidas a nivel mundial. Esta puede ser mortal: un estimado reveló que alrededor de 20 a 40 millones de personas murieron durante la pandemia del virus A de la influenza en 1918. En los Estados Unidos, entre 20 y 40 mil personas mueren a causa de la infección del virus A de la influenza o debido a sus complicaciones cada a o. Duran e la epidemia, el número de hospitalizaciones relacionadas con la influenza puede alcanzar hasta 300,000 tan solo en la época de invierno. Distintas propiedades contribuyen al éxito epidemiológico del virus de la influenza. Primero, se extiende fácilmente de persona a persona mediante aerosoles (infección de la gota) . Segundo, es frecuente que se presenten pequeños cambios en los antigenos del virus de la influenza (tendencia antigénica) de modo que el virus escapa fácilmente de la inmunidad protectora inducida por una exposición previa a una variante distinta del virus. Tercera, nuevas cepas del virus de la influenza pueden generarse fácilmente debido al reordenamiento o combinación de material genético entre distintas cepas (desplazamiento antigénico) . En el caso del virus A de la influenza, tal combinación puede presentarse entre subtipos o cepas que afectan a especies EF: 162984 1 TERAPEUTICO PARA INFLUENZA Antecedentes de la Invención La influenza es una de las infecciones más difundidas a nivel mundial. Esta puede ser mortal: un estimado reveló que alrededor de 20 a 40 millones de personas murieron durante la pandemia del virus A de la influenza en 1918. En los Estados Unidos, entre 20 y 40 mil personas mueren a causa de la infección del virus A de la influenza o debido a sus complicaciones cada año. Durante la epidemia, el número de hospitalizaciones relacionadas con la influenza : puede alcanzar hasta 300,000 tan solo en la época de invierno. Distintas propiedades contribuyen al éxito epidemiológico del virus de la influenza. Primero, se extiende fácilmente de persona a persona mediante aerosoles (infección de la gota) . Segundo, es frecuente que se presenten pequeños cambios en los antigenos del virus de la influenza (tendencia antigénica) de modo que el virus escapa fácilmente de la inmunidad protectora inducida por una exposición previa a una variante distinta del virus. Tercera, nuevas cepas del virus de la influenza pueden generarse fácilmente debido al reordenamiento o combinación de material genético entre distintas cepas (desplazamiento antigénico) . En el caso del virus ? de la influenza, tal combinación puede presentarse entre subtipos o cepas que afectan a especies 2 diferentes. Se piensa que la pandemia de 1918 pudo haber sido provocada por una cepa híbrida de virus derivada de un reordenamiento entre un cerdo y un virus A de la influenza humana . A pesar de los intensos esfuerzos que se han hecho, no existe aún una terapia efectiva para la infección del virus de la influenza y las vacunas existentes están limitadas en valor, en parte debido a las propiedades de desplazamiento y tendencia antigénica descritas anteriormente. Debido a estas razones, la atención global del virus A de la influenza ha sido puesta en marcha durante muchos años y los Institutos Nacionales de la Salud lo designan como uno de los patógenos de prioridad principal para la defensa de la vida. Aun cuando las vacunas actuales basadas en virus inactivados tienen la capacidad de prevenir enfermedades en aproximadamente el 70-80% de los individuos saludables menores a 65 años, este porcentaje es remotamente inferior en los ancianos o en los que están inmunocomprometidos . Además, los efectos secundarios potenciales y costosos asociados con la administración de vacunas hace a esta metodología menos que óptima. A pesar de que cuatro fármacos antivirales actualmente aceptados en los Estados Unidos para el tratamiento y/o profilaxis de la influenza son útiles, su uso está limitado debido a que hay preocupación sobre los efectos secundarios, cumplimiento, y posibles emergencias de las 3 cepas resistentes. Por lo tanto, persiste la necesidad del desarrollo de terapias efectivas para el tratamiento y prevención de la infección de la influenza.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona nuevos terapéuticos para el tratamiento de la influenza debido a los tipos de virus A, B y C de la influenza basados en el fenómeno de la interferencia del ARN (ARNi) . En particular, la invención proporciona ARN de interferencia cortos (AR si) y/o moléculas de ARN de horquilla corta (ARNsh) dirigidas a uno o más transcritos de direccionamientos involucrados en la producción del virus, replicación del virus, infección del virus, y/o transcripción del ARN viral, etc. Además, la invención proporciona vectores cuya presencia dentro de una célula resulta en la transcripción de uno o más ARN que se , auto-hibridizan o hibridizan entre si para formar un ARNsh o ARNsi que inhibe la expresión de al menos un transcrito de direccionamiento involucrado en la producción del virus, infección del virus, replicación del virus, y/o transcripción del ARNm viral, etc. La invención además proporciona una variedad de composiciones que contienen los ARNsi, ARNsh y/o vectores de la invención. En ciertas modalidades de la invención, el ARNsi incluye dos hebras de ARN que tienen regiones 4 complementarias de manera que las hebras produzcan híbridos entre sí para formar una estructura doble de aproximadamente 19 nucleótidos en longitud, en donde cada una de las hebras incluye opcionalmente una proyección formada por hebras simples. En ciertas modalidades de la invención, el ARNsh comprende una molécula de ARN simple que tiene regiones complementarias que producen híbridos entre sí para formar una estructura en forma de horquilla (troncal/rizo) con una porción doble de aproximadamente 19 nucleótidos en longitud y un rizo de hebra simple. Se dice que tales moléculas de ARN se auto hibridizan. El ARNsh puede incluir opcionalmente una o más porciones no apareadas en la porción 5' y/o 3' del ARN. La invención además proporciona composiciones que comprenden a los ARNsi, ARNsh y/o vectores inventivos, y métodos para el suministro de tales composiciones. Asi, en un aspecto, la invención proporciona un ARNsi o ARNsh dirigido a un transcrito de direccionamiento, en donde el transcrito de direccionamiento es un transcrito de agentes específico, un transcrito que está involucrado en la producción de, la replicación de, patogenicidad de, y/o infección mediante un agente infeccioso, y/o está involucrado en la transcripción de un ARN de agentes específico. Para propósitos de la descripción de un ARNsi o ARNsh que .inhibe la expresión de un transcrito de direccionamiento involucrado en la producción de, la replicación de, patogenicidad de, y/o 5 infección mediante un agente infeccioso, inhibiendo asi la producción de, replicación de, patogenicidad de, y/o infección mediante el agente infeccioso se dirá que inhibe al agente infeccioso. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el agente infeccioso es un virus. De acuerdo a ciertas modalidades preferidas de la invención, el agente infeccioso es un virus que infecta a las células de los conductos respiratorios y/o pulmones, por ejemplo, células epiteliales respiratorias tales como el virus de la influenza. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, los transcritos de direccionamiento codifican a una proteina seleccionada del grupo que consiste de: una polimerasa, una proteina de nucleocápsida, una neuraminidasa, una hemaglutinina, una proteina de matriz y una proteina no estructural. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, los transcritos de direccionamiento codifican a una proteina del virus de la influenza seleccionada del grupo que consiste de hemaglutina, neuraminidasa, proteina 1 de membrana, proteina 2 de membrana, proteina 1 no estructural, proteina 2 no estructural, proteina PB1 de polimerasa, proteina PB2 de polimerasa, proteina PA de polimerasa y proteina NP de polimerasa . En otro aspecto, la invención proporciona un vector que consta de un ácido nucleico enlazado operablemente a las señales de expresión (por ejemplo, un promotor o 6 promotor/mej orador) activas en una célula de manera que cuando el constructo se introduzca en las células, un ARNsi o ARNsh se produzca en el interior de la célula hospedera que esta dirigida a un transcrito de agentes especifico, en donde el transcrito está involucrado en la producción de, replicación de, y/o infección mediante un agente infeccioso, y/o transcripción de un ARN de agentes especifico. En ciertas modalidades de la invención, el agente infeccioso es un virus, por ejemplo, un virus de la influenza. En ciertas modalidades preferidas de la invención, el ARNsi o ARNsh inhibe el virus de la influenza. El ARNsi o ARNsh pueden dirigirse a cualquiera de los transcritos mencionados arriba. En general, el vector puede ser un plásmido de ADN o un vector viral tal como un retrovirus (por ejemplo, un lentivirus), adenovirus, virus asociado con los adeno, etc. cuya presencia dentro de una célula resulta en la transcripción de uno o más ácidos ribonucleicos (ARN) que se autohibridizan o producen hibridos entre si para formar un ARN en forma de horquilla corta (ARNsh) o ARN de interferencia corto (ARNsi) que inhibe la expresión de al menos un transcrito de virus de la influenza en la célula. En ciertas modalidades de la invención, el vector comprende un segmento de ácidos nucleicos enlazados operablemente a un promotor, de manera que la transcripción del promotor (es decir, la transcripción dirigida por el promotor) resulta en la síntesis de un ARN que comprende 7 regiones complementarias que producen híbridos para formar un ARNsh dirigida a los transcritos de direccionamiento . En ciertas modalidades de la invención, el vector lentiviral comprende un segmento de ácidos nucleicos flanqueado por dos promotores con una orientación opuesta, en ' donde los promotores se enlazan operablemente al segmento de ácidos nucleicos, de manera que la transcripción de los promotores den como resultado la síntesis de dos ARN complementarios que producen híbridos entre sí para formar un ARNsi dirigido al transcrito de direccionamiento. La invención proporciona además, composiciones que incluyen al vector. La invención proporciona también, composiciones que comprenden ARNsi inventivo, ARNsh y/o vectores descritos en la presente, en donde la composición incluye además, cualquiera de una variedad de sustancias (referidas - en la presente como agentes de suministro) que facilitan el suministro y/o absorción del ARNsi, ARNsh o vector. Estas sustancias incluyen polímeros catiónicos, transportadores moleculares de péptidos que incluyen péptidos ricos en arginina y péptidos ricos en histidina, lípidos neutros y catiónicos, liposomas; ciertos polímeros no catiónicos, carbohidratos y materiales tensoactivos . La invención abarca también el uso de agentes de suministro que han sido modificados en cualquiera de una variedad de formas, por ejemplo, mediante la adición de una porción que mejora el 8 suministro para el agente de suministro. En ciertas modalidades de la invención, el agente de suministro se modifica en cualquiera de una variedad de formas para mejorar la estabilidad, promover la absorción celular de la composición, promover la liberación de ARNsi, ARNsh y/o vectores dentro de la célula, reducir la citotoxicidad o dirigir la composición para un tipo celular en particular, tejido u órgano. Por ejemplo, en ciertas modalidades de la invención, el agente de suministro es un polímero catiónxco modificado (por ejemplo, un polimero catiónico sustituido con uno o más grupos seleccionados para reducir la naturaleza catiónica del polimero y reducir asi, la citotoxicidad) . En ciertas modalidades de la invención, el agente de suministro comprende una porción que mejora el suministro tal como un anticuerpo, fragmento de anticuerpos o ligandos que enlazan específicamente a una molécula que está presente en la superficie de una célula tal como una célula epitelial respiratoria. La presente invención proporciona además, métodos para tratar o prevenir enfermedades infecciosas, en particular, enfermedades infecciosas del sistema respiratorio, por ejemplo, la influenza, mediante la administración de cualquiera de las composiciones inventivas para un sujeto dentro de una ventana de tiempo apropiado, previo a la 9 exposición del agente infeccioso, mientras se presenta la exposición, o siguiendo la exposición en cualquier punto durante el cual un sujeto muestra síntomas de una enfermedad provocada por el agente infeccioso. El ARNsi o ARNsh puede ser sintetizado químicamente, producido usando una transcripción in vitro, sintetizado in vitro, o ser producido intracelularmente, etc. La composición puede ser administrada mediante una variedad de vías que incluyen, intravenosa, inhalación, intranasalmente, como en aerosol, intraperitonealmente , intramuscularmente, intradermalmente, oralmente, etc. La invención proporciona métodos adicionales para tratar o prevenir una enfermedad provocada por un agente infeccioso, por ejemplo, una enfermedad provocada por el virus de la influenza empleando una terapia de genes . De acuerdo a ciertos métodos, las células (ya sea infectadas o no infectadas) son diseñadas o manipuladas para sintetizar el ARNsi o ARNsh. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, las células son generadas mediante ingeniería para contener un vector cuya presencia dentro de la célula resulta en la síntesis de uno o más ARN que producen híbridos entre si o se autohibridizan dentro de la célula para formar uno o más ARNsi o ARNsh dirigidos a un transcrito de direccionamiento de agentes específico. Las células pueden ser generadas mediante ingeniería in vitro o mientras están 10 presentes dentro del sujeto que va a ser tratado, por ejemplo, dentro de los conductos respiratorios del sujeto. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para seleccionar y diseñar las secuencias de ARNsi o ARNsh preferidas para inhibir un agente infeccioso. La invención proporciona métodos para seleccionar y diseñar ARNsi ARNsh para inhibir agentes infecciosos caracterizados en que existen distintas cepas múltiples o variantes del agente infeccioso, en particular, cuando la variación de la cepa puede presentar una combinación o reordenamiento genético. Estos métodos encuentran un uso particular en la selección y diseño de secuencias de ARNsi y ARNsh para combatir agentes infecciosos cuyos genomas consisten de diferentes segmentos múltiples, en los cuales puede presentarse rápidamente e impredeciblemente un reordenamiento genético mediante la sustitución de un segmento genómico completo de un subtipo a otro. Por lo tanto, los aspectos de la invención son particularmente adecuados para agentes infecciosos cuyo genoma consiste de segmentos independientes múltiples, esto significa que el genoma consiste de moléculas de ácidos nucleicos físicamente distintos que no están unidos covalentemente uno a otro. La invención puede también, encontrar utilidad particular para los agentes infecciosos que intercambian información genética mediante la transferencia de plásmidos, por ejemplo, plásmidos que codifican genes que confieren resistencia a los compuestos terapéuticos . La presente invención proporciona también, un sistema para identificar composiciones que comprenden una o más entidades que inducen ARNi tales como ARNsi y/o ARNsh dirigidos a un transcrito del virus de la influenza, y/o que comprenden vector (es) cuya presencia dentro de una célula resulta en la producción de uno o más ARN que forman híbridos entre si o se autohibridizan para formar un ARNsi o ARNsh que se dirige a un transcrito del virus de la influenza, en donde las composiciones son útiles para la inhibición del virus de la influenza. La presente invención proporciona además, un sistema para el análisis y caracterización del mecanismo de replicación de la influenza y/o transcripción del ARN del virus de la influenza, así como para la caracterización y análisis de los componentes virales relevantes involucrados en el ciclo de vida viral. En otro aspecto, la invención proporciona métodos para diseñar ARNsi y/o ARNsh para inhibir un agente infeccioso en casos en donde existen variantes múltiples del agente infeccioso. Por ejemplo, la invención proporciona un método para diseñar una molécula de ARNsi o ARNsh que tiene una porción doble, el método comprende las etapas de (i) identificar una porción de un 12 transcrito de direccionamiento , cuya porción se conserva favorablemente entre una pluralidad de variantes de un agente infeccioso y comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos; y (ii) seleccionar un ARNsi o ARNsh, en donde la hebra sentido del ARNsi o la porción sentido del ARNsh comprende la secuencia altamente conservada. En otro aspecto, la invención proporciona ARNsi y ARNsh y métodos para diseñar los mismos, en donde el ARNsi o ARNsh se dirige a un transcrito cuya inhibición resulta en la inhibición de otros múltiples (o todos) transcritos virales. En particular, la invención proporciona composiciones de ARNsi y ARNsh que comprenden ARNsi o ARNsh dirigidos a los transcritos que codifican a la polimerasa viral (polimerasa de ARN o ADN) o proteínas de nucleocápsida . Esta solicitud se refiere a varias patentes, artículos del diario y otras publicaciones, todas incorporadas en la presente por la referencia. Además, los siguientes trabajos de referencia estándar se incorporan en la presente por la referencia: Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocole in Immunology, Current Protocols in Protein Science, y Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, N. Y., edición de Julio de 2002; Sambrook, Russell y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra 13 edición. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1A adaptada de Julkunen, I., et al., mencionada en otra parte dentro de la presente, muestra un esquema del virus de la influenza. La figura 1B-1C adaptada de Fields' Virology mencionada en otra parte dentro de la presente, muestra la estructura del genoma del virus de la influenza y los transcritos derivados del genoma de la influenza. Las lineas delgadas en el término 5' y 3r del ARNm representan las regiones no traducidas. Las áreas cubiertas o sombreadas representan las regiones de codificación en las estructuras de lectura 0 o +1, respectivamente. Los intrones se describen por las lineas en forma de V. Los rectángulos pequeños en los extremos 5' del ARNm representa a los ARN celulares heterogéneos enlazados covalentemente a los ácidos nucleicos virales. A(n) simboliza el extremo poliA . La figura 2, adaptada de Julkunen, I., et al., mencionada en otra parte dentro de la presente, muestra el ciclo de replicación del virus de la influenza. La figura 3 muestra la estructura de ARNsi observada en el sistema Drosophila . La figura 4 presenta una representación esquemática de 14 las etapas involucradas en la interferencia del ARN en Drosophila . La figura 5 muestra una variedad de ejemplos de estructuras ARNsi y ARNsh útiles, de acuerdo con la presente invención. La figura 6 presenta una representación de una trayectoria inhibidora alternativa, en la cual la enzima DICER desdobla un substrato que tiene una base desigual en la troncal para generar un producto inhibidor que enlaza al UTR 3' de un transcrito de direccionamiento e inhibe su tranducción. La figura 7 presenta un ejemplo de un constructo que puede ser usado para dirigir la transcripción de ambas hebras de un ARNsi inventivo. La figura 8 describe un ejemplo de un constructo que puede ser usado para dirigir el transcrito de una molécula de ARN simple que forma híbridos para formar un ARNsh de acuerdo con la presente invención. La figura 9 muestra una comparación de secuencias entre seis cepas del virus A de la influenza que tienen una hospedera de origen humano. Las áreas sombreadas oscuras se usaron para diseñar ARNsi que se probaron como se describe en el Ejemplo 2. La secuencia base es la secuencia de la cepa A/Puerto Rico/8/34. Las letras ligeramente sombreadas indican nucleótidos que difieren de la secuencia base. 15 La figura 10 muestra una comparación de secuencias entre dos cepas del virus de la influenza que tienen una célula hospedera de humano y cinco cepas del virus A de influenza que tienen una célula hospedera de origen animal. Las áreas sombreadas oscuras se usaron para diseñar ARNsi que se probaron como se describe en el Ejemplo 2. La secuencia base es la secuencia de la cepa A/Puerto Rico/8/34. Las letras sombreadas ligeramente indican que los nucleótidos difieren de la secuencia base. Las figuras 11A -11E muestran los resultados de los experimentos que indican que el ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza en células MDCK. Se introdujeron seis ARNsi diferentes que dirigen distintos transcritos virales en células MDCK mediante electroporación, y las células se infectaron con el virus 8 días después. La figura HA es un curso del tiempo que muestra una concentración viral en los sobrenadantes del cultivo medida por un ensayo de hemaglutinina varias veces después de la infección con la cepa viral A/PR/8/34 (H1N1) (PR8), en una multiplicidad de infección (MOI) de 0.01 en presencia o ausencia de varios ARNsi o un ARNsi control. La figura 11B es un curso del tiempo que muestra la concentración viral en los sobrenadantes de cultivo medida por un ensayo de hemaglutinina varias veces después de la infección con la cepa del virus de la influenza A/ SN/33 (H1N1) (WSN) en un 16 MOI de 0.01 en presencia o ausencia de varios ARNsi o ARNsi control. La figura 11C muestra un ensayo de placa que muestra una concentración viral en los sobrenadantes del cultivo de las células infectadas con el virus que son tanto transfectadas por simulación o transfectadas con ARNsi NP-1496. La figura 11D muestra la inhibición de la producción del virus de la influenza en dosis diferentes de ARNsi. Las células MDCK se transfectaron con la cantidad del ARNsi NP-1496 seguido por la infección con el virus PR8 en un MOI de 0.01. La concentración del virus se midió 48 horas después de la infección. Se muestran los datos representativos de uno de dos experimentos. La figura 11E muestra la inhibición de la producción del virus de la influenza mediante el ARNsi administrado después de la infección del virus. Las células MDCK se infectaron con el virus PR8 en un MOI de 0.01 durante 2 horas y después se transfectó con NP-1496 (2.5 nmol) . La concentración del virus se midió en los tiempos indicados después de la infección. Se muestran los datos representativos de uno de dos experimentos. La figura 12 muestra una comparación de secuencias entre una porción de la región 3' de las secuencias NP entre doce subtipos del virus A de la influenza o aislados que tienen una hospedera ya sea de origen animal o humana. El área sombreada se usó para diseñar ARNsi que se probó como se describe en los ejemplos 2 y 3. La secuencia base es la 17 secuencia de la cepa ?/Puerto Rico/8/34. Las letras sombreadas indican los nucleótidos que difieren de la secuencia base. La figura 13 muestra las posiciones de varios ARNsi relativos a los segmentos del gen del virus de la influenza, correlacionados con la efectividad para inhibir al virus de la influenza. La figura 14A es un esquema del desarrollo del embrión de un pollo que indica el área de inyección del ARNsi y composiciones de agentes ARNsi/suministro. La figura 14B muestra la capacidad de varios ARNsi para inhibir la producción del virus de la influenza en el desarrollo de embriones de pollo. La figura 15 es un esquema que muestra la interacción de las nucleoproteinas con las moléculas de ARN. Las figuras 16? y 16B muestran diagramas esquemáticos que ilustran las diferencias entre el virus de la influenza ARNv, ARNm, ARNc (plantilla del ARN) y relaciones entre ellos. Los 12 nucleótidos conservados en el extremo 3' y los 13 nucleótidos en el extremo 5' de cada segmento ARNv del virus A de la influenza se indican en la figura 16B. Los ARNm contienen una estructura de cierre m7GpppNm y, en promedio, 10 a 13 nucleótidos derivados de un subconjunto de ARN de células hospederas . La poliadenilación de los ARNm se presenta en un sitio en el ARNm que corresponde a una 18 ubicación de 15 a 22 nucleótidos delante del extremo 5' del segmento de ARNv. Las flechas indican las posiciones de los cebadores específicos para cada una de las especies del ARN (Adaptado por la ref. (1)) . La figura 17 muestra cantidades de especies de ARN NS y NP virales varias veces después de la infección con virus, en células que son transfectadas por simulación o transfectadas con NP-1496 de AR si 6-8 horas antes de la infección. La figura 18A muestra que la inhibición de la producción del virus de la influenza requiere de una hebra antisentido del tipo silvestre (wt) en el ARNsi doble. Las células MDCK se transfectaron primero con el AR si formado a partir de wt y hebras modificadas (m) e infectadas 8 horas después con el virus PR8 en el MOI de o.l. Las concentraciones del virus en los sobrenadantes del cultivo se ensayaron 24 horas después de la infección. Se muestran los datos representativos de uno de dos experimentos. La figura 18B muestra que el ARNsi específico de M inhibe la acumulación del ARNm específico. Las células MDCK se transfectaron con M-37, infectadas con el virus PR8 en mOI de 0.01, y se cosecharon por el aislamiento del ARN, 1, 2 y 3 horas después de la infección. Los niveles del ARNm M-específico, ARNc y ARNv se midieron mediante la transcripción inversa usando cebadores de ARN específicos, seguido por PCR en tiempo real. Los niveles de cada especie de ARN viral se normalizan para el nivel del ARNm del ?- 19 actina (panel inferior) en la misma muestra. Los niveles relativos del ARN se muestran como un valor medio + S.D. Se muestran los datos representativos de uno de los dos experimentos . Las figuras 19 A a la 19D muestran que el ARNsi de NP especifico inhibe la acumulación no solo de NP sino también de ARNm, ARNv y ARNc de M- y Ns- específicos- Las células MDCK (A-c) y Vero (D) se transfectaron con NP-1496, se infectaron con el virus PR8 en el MOI de 0.1, y se cosecharon para el aislamiento de ARN, 1, 2 y 3 horas después de la infección. Los niveles de ARNm, ARNc y ARNv específicos para NP, M y NS se midieron mediante la transcripción inversa usando cebadores de ARN específicos seguido por PCR en tiempo real. El nivel de cada especie de ARN viral se normaliza para el nivel de ARNm de ?-actina (no se muestra) en la misma muestra. Se muestran los niveles relativos de ARN. Se muestran los datos representativos de uno de tres experimentos . Las figuras 19 E a la 19G, lado derecho en cada figura, muestra que el ARNsi de PA específico inhibe la acumulación de no solo PA sino también de ARNm, ARNv y ARNc de M y NS específicos. Las células MDCK se transfectaron con PA-1496, infectadas con el virus PR8 en MOI de 0.1, y se cosecharon para el aislamiento del ARN, 1, 2 y 3 horas después de la infección. Los niveles de ARNm, ARNv y ARNc para PA, M y NS 20 específicos se midieron mediante la transcripción inversa usando cebadores de ARN específicos seguido por PCR en tiempo real. El nivel de cada especie de ARN viral se normaliza para el nivel del ARNm ?-actina (no se muestra) en la misma muestra. Se muestran los niveles relativos de ARN. La figura 19H muestra que el ARNsi de NP específico inhibe la acumulación de PBl- (panel superior) , PB2- (panel medio) y PA- (panel inferior) del ARNm específico. Las células MDCK se transfectaron con NP-1496, se infectaron con el virus PR8 en el mOI de 0.1, y se cosecharon para el aislamiento del ARN, 1, 2 y 3 horas después de la infección. Los niveles del ARNm específico para PBl, PB2 y PA del ARNm se midieron mediante transcripción inversa usando cebadores de ARN específico seguido por PCR en tiempo real. El nivel de cada especie de ARN viral se normaliza para el nivel de ARNm ?-actina (no se muestra) en la misma muestra. Se muestran los niveles relativos al ARN. La figura 20A muestra las secuencias del CD8-61 del ARNsi y su derivado CD8-61F de horquilla. La figura 20B muestra la inhibición de la expresión CD8a por CD8-61 y CD8-61F. Una línea celular T CD8+CD4+ se transfectó tanto con CD8-61 como con CD8-61F mediante electroporación . La expresión CD8oc se ensayó mediante citometría de flujo 48 horas después. La línea no etiquetada simula la transfección. 21 La figura 20C muestra un diagrama esquemático del vector pSLOOP III cuya expresión del ARN de horquilla CD8-61F se maneja por el promotor Hl ARN pol III. Secuencia de señal de terminación, terminador . La figura 20D presenta gráficas que muestran el silenciamiento de CD8a en las células HeLa usando pSLOOP III. Las células no transíectadas no expresan CD8oc. Las células se transfectaron con el vector de expresión CD8oc ya sea con un constructo pSLOOP III-CD8-61F menos promotor, AR si sintético o un promotor que contiene pSLOOP III-CD8-61F. La figura 21A muestra diagramas esquemáticos de ARNsi NP-1496 y GFP-949 y sus precursores/derivados de horquilla. La figura 21B muestra filas en tándem de NP-1496H y GFP-949H en dos órdenes distintos. La figura 21 C muestra vectores de expresión pSLOOP III.

Los precursores de horquilla del ARNsi se clonan solo en el vector pSLOOP III (superior) , en filas en tándem (medio) , o simultáneamente con un promotor independiente y secuencia de terminación (inferior) . La figura 22? es una gráfica que muestra que el ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra con el polímero PEI catiónico antes de la infección con el virus de la influenza. Los cuadrados rellenos (sin tratamiento), cuadrados en blanco (ARNsi' GFP) , círculos en blanco (30 µg de ARNsi NP) , círculos rellenos (60 22 µg de ARNsi de NP) . Cada símbolo representa un animal en particular. Se muestran los valores o entre grupos diferentes La figura 22B es una gráfica que muestra que el ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra junto con el polímero PLL catiónico previo a la infección con el virus de la influenza. Los cuadrados rellenos (sin tratamiento) , cuadrados en blanco (ARNsi GFP) , círculos rellenos (60 µg de ARNsi de NP) . Cada símbolo representa un animal en particular. Se muestran los valores o entre diferentes grupos. La figura 22C es una gráfica que muestra que el ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra junto con el polímero jetPEI del polímero catiónico previo a la infección con el virus de la influenza significativamente más efectivo que cuando se administró en PBS . Los cuadrados en blanco (sin tratamiento), triángulos en blanco (ARNsi de GFP en PBS), triángulos rellenos (ARNsi de NP en PBS) , círculos en blanco (ARNsi de GFP con PEIjet) , círculos rellenos (ARNsi de NP con PEijet) . Cada símbolo representa un animal en particular. Se muestran los valores p entre diferentes grupos. La figura 23 es una gráfica que muestra que el ARNsi dirigido al virus NP de la influenza y a los transcritos PA exhiben un efecto aditivo cuando se administran juntos previo a la infección con el virus de la influenza. Los cuadrados 23 rellenos (sin tratamiento), circuios en blanco (60 µg de NP de ARNsi), triángulos en blanco (60 µg de ?? ARNsi) , circuios rellenos (60 µg de NP ARNsi + 60 µg de PA ARNsi). Cada símbolo representa un animal en particular. Se muestran los valores p entre los diferentes grupos. La figura 24 es una gráfica que muestra que el ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra después de la infección con el virus de la influenza. Los cuadrados rellenos (sin tratamiento), círculos en blanco (60 µg de GFP ARNsi), triángulos en blanco (60 µg de PA ARNsi), círculos en blanco (60 µg de NP ARNsi), círculos rellenos (60 µg de NP ARNsi + 60 µg de PA ARNsi) . Cada símbolo representa un animal en particular. Se muestran los valores p entre los diferentes grupos. La figura 25 A es un diagrama esquemático de un vector lentiviral que expresa un ARNsh. La transcripción del ARNsh se conduce por el promotor de U6. La expresión de EGFP se conduce por el promotor CMV. Los SIN-LTR, ?, cPPT y WRE son componentes lentivirus. Se muestra la secuencia del ARNsi NP-1496. La figura 25B presenta una gráfica de los resultados de la citometría de flujo demostrando que las células Vero infectadas con el lentivirus descrito en la figura 25B expresa EGFP en una forma que depende de la dosis. El 24 lentivirus se produjo por la co-transfección del vector de ADN que codifica el NP-1496a del ARNsi y vectores de empaquetado en las células 293T. Los sobrenadantes del cultivo (0.25 mi o 1.0 mi) se usaron para infectar células Vero. Las líneas celulares Vero resultantes (Vero-NP-0.25 y Vero-NP-1.0) y células Vero control (no infectadas) se analizaron para la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Se muestra la intensidad de fluorescencia media de Vero-NP-0.25 (porción superior de la figura) y células Vero-NP-1.0 (porción inferior de la figura). La curva sombreada representa la intensidad de fluorescencia media de las células Vero control (no infectadas) . La figura 25 C es una gráfica que muestra la inhibición de la producción del virus de la influenza en las células Vero que expresan NP-1496 de ARNsh. El ARNsh NP-1496 y parental que expresa a las células Vero se infectaron con el virus PR8 en MOI de 0.04, 0.2 y 1. La concentración del virus en los sobrenadantes se determinaron mediante el ensayo de hemaglutinación (HA) 48 horas después de la infección. La figura 26 es una gráfica que muestra que la producción del virus de la influenza en ratones se inhibe por la administración de los vectores de ADN que expresan ARNsi dirigido a los transcritos del virus de la influenza. Sesenta µ? de ADN que codifica RSV, NP-1496 (NP) o PB1-2257 (PB1) de ARNsh se mezclaron con 40 µ? de Infasurf y se administraron 25 en ratones por instilación. Para el grupo (NT) sin tratamiento, los ratones se instilaron con 60 µ? de glucosa al 5%. Trece horas después, los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 12000 pfu por ratón. Las concentraciones del virus en los pulmones se midieron 24 horas después de la infección mediante un ensayo de MDCK/hemaglutinina . Cada punto de datos representa un ratón. Se indican los valores p entre los grupos. La figura 27 A muestra los resultados de un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética para detectar la formación compleja entre ARNsi y poli-L-lisina (PLL) . Los complejos del polímero ARNsi se formaron mediante el mezclado de 150 ng de NP-1496 del ARNsi con cantidades incrementadas del polímero (0-1200 ng) durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Las mezclas reactivas se corrieron entonces en un gel de agarosa al 4% y ARNsi se visualizaron con el teñido con bromuro de etidio. La figura 27 B muestra los resultados de un ensayo de desplazamiento de la movilidad electroforética para detectar la formación compleja entre ARNsi y poli-L-arginina (PLA) . Los complejos del polímero de ARNsi se formaron mezclando 150 ng de NP-1496 de ARNsi con las cantidades incrementadas del polímero (0-1200 ng) durante 30 minutos a la temperatura ambiente. Las mezclas de reacción se corrieron entonces en un gel de agarosa al 4% y ARNsi se visualizaron con el teñido 26 del bromuro de etidio. La figura 28 A es una gráfica que muestra la citotoxicidad de los complejos de ARNsi/PLL. Las células Vero se trataron en placas de 96 pozos con complejos ARNsi (400 pmol) /polímero durante 6 horas. El medio que contiene el polímero se reemplazó entonces con FCS con DMEM al 10%. La actividad metabólica de las células se midió 24 horas después de usar el ensayo MTT. Los cuadrados = PLL (MW ~8K) , círculos = PLL (MW ~42K) cuadrados rellenos = 25%, triángulos en blanco = 50%, triángulos rellenos = 75%, X = 95%. Se muestran los datos como el promedio de los triplicados. La figura 28 B es una gráfica que muestra la citotoxicidad de los complejos de ARNsi/PLA. Las células Vero se trataron en placas de 96 pozos con complejos de ARNsi (400 pmol) /polímeros durante 6 horas. El medio que contienen polímeros se reemplazó después con DMEM-10% de FCS. La actividad metabólica de las células se midió 24 horas después usando el ensayo de MTT. Los datos se muestran como el promedio de los triplicados. La figura 29 A es una gráfica que muestra que PLL estimula la absorción celular de ARNsi. Las células Vero en placas de 24 pozos se incubaron con Lipofectamina + ARNsi (400 pmol) o con complejos de ARNsi (400 pmol) /polímero durante 6 horas. Las células se lavaron entonces y se infectaron con el virus PR8 en una mOI de 0.04. Las 27 concentraciones del virus en los sobrenadantes del cultivo en diferentes puntos del tiempo después de la infección se midieron por el ensayo de HA. Se indican las relaciones de ARNsi del polímero. Círculos en blanco = sin tratamiento, cuadrados rellenos = Lipofectamina, Triángulos rellenos = PLL (MW ~42 ) , triángulos en blanco = PLL ( W ~8 K) . La figura 29 B es una gráfica que muestra que la poli-L-arginina estimula la absorción celular de ARNsi. Las células Vero en placas de 24 pozos se incubaron con complejos de ARNsi (400 pmol) /polímeros durante 6 horas. Las células se lavaron e infectaron después con el virus PR8 en un MOI de 0.04. La concentración del virus en los sobrenadantes del cultivo en distintos puntos de tiempo después de la infección se midieron por el ensayo HA. Se indican las relaciones de ARNsi del polímero. El 0, 25, 50, 75 y 95% se refieren al porcentaje de los grupos e-amino en el PLL sustituido con grupos acetil amidazol. Círculos en blanco = sin transíección, círculos en blanco = Lipofectamina, cuadrados rellenos y en blanco = 0% y 25% (Note que los puntos de los datos para 0% y 25% son idénticos), triángulos rellenos = 50%, triángulos abiertos = 75%, X = 95%. Abreviaturas ADN: ácido desoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico ARNv: ARN virión en el genoma del virus de la influenza, 28 hebra negativa ARNc: ARN complementario, un ARNv de transcrito dirigido, hebra positiva. ARNm: ARN mensajero transcrito para el ARNv o genes celulares, una plantilla para la síntesis de la proteína. ARNds= ARN de hebra doble ARNsi: ARN de interferencia corta ARNsh: ARN de horquilla corta ARNi: ARN de interferencia.

Definiciones En general, el término anticuerpo se refiere a una inmunoglobulina, que se produce ya sea de forma parcial o totalmente sintética, o de manera natural. En ciertas modalidades de la invención, el término abarca también cualquier proteína que comprende un dominio que enlaza inmunoglobulina. Estas proteínas pueden derivarse de fuentes naturales, o producirse parcialmente o completamente de manera sintética. El anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina que incluyen cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. El anticuerpo puede ser un fragmento de un anticuerpo tal como un Fab' , F(ab' )2, Fvsc (variable de cadena simple) u otro fragmento que retiene un sitio de enlace antígeno o un fragmento Fvsc producido recombinantemente que incluye fragmentos producidos 29 recombinantemente . Ver por ejemplo, Alien, T. , Nature Reviews Cáncer, Vol.2, 750-765, 2002, y referencias de estas. En ciertas modalidades de la invención, el término incluye anticuerpos "humanizados" en los cuales, por ejemplo, un dominio variable de origen roedor se fusiona a un dominio constante de origen humano, asi, se retiene la especificidad del anticuerpo del roedor. Se nota que el dominio de origen humano no necesariamente debe originar de un humano en el sentido de que primero se sintetiza en un humano. Por el contrario, los dominios de "humano" pueden generarse en roedores cuyo genoma incorpora genes de inmunoglobulina de humano. Ver por ejemplo, Vaughan, et al ., (1998), Nature Biotechnology, 16: 535-539. ün anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal, aun cuando para los propósitos de la presente invención se prefieren generalmente anticuerpos monoclonales . Como se usa en la presente, los términos aproximadamente o alrededor con respecto a un número, se usan generalmente para incluir números que caen dentro del rango del 5% en la dirección (mayor que o menor que) el número, a menos que se establezca lo contrario u otra cosa evidente del "contexto (excepto en donde tal número excedería el 100% de un valor posible) . Cuando se establecen los rangos, los puntos finales se incluyen dentro del rango, a menos que se establezca lo contrario u otra cosa evidente del contexto. 30 El término hibridizar, como se usa en la presente, se refiere a la interacción entre dos secuencias de ácidos nucleicos complementarios. La frase híbridizar bajo condiciones de severidad alta describe una interacción que es suficientemente estable que se mantiene bajo condiciones de severidad altas reconocidas en la técnica. La guia para realizar reacciones de hibridización pueden encontrarse por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 6.3.1-6.3.6, 1989, y ediciones actualizadas más recientes, todas incorporadas en la presente por las referencias. Ver también, Sambrook, Russell y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ra edition, Cold Spring harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, 2001. Los métodos acuosos y no acuosos se describen en la referencia y cualquiera puede usarse. Típicamente, para las secuencias de ácidos nucleicos aproximadamente de 50-100 nucleótidos en longitud, se definen varios niveles de severidad, tal severidad baja (por ejemplo, 6x de cloruro de sodio (citrato de sodio (SSC) aproximadamente a 45 °C, seguido por dos lavados en 0.2 X de SSC, 0.1% de SDS al menos a 50 °C (la temperatura de los lavados pueden incrementarse a 55 °C mediante condiciones de severidad medio bajas) ) , severidad media (por ejemplo 6x de SSC aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x de SSC, 0.1% de SDS a 60°C, hibridización de severidad alta (por ejemplo, 6x de SSC 31 aproximadamente a 45°C, seguido por uno o más lavados en 0.2 x de SSSc, 0.1% de SDS a 65°C, y condiciones de hibridización de severidad muy altas (por ejemplo, fosfato de sodio 0.5 M, 0.1% de SDs a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0.2X de SSC, 1% de SDS a 65°C). La hibridación bajo condiciones de severidad altas solo se presenta entre las secuencias con un grado muy elevado de complementariedad. Un experto ordinario en la técnica reconocerá que los parámetros para distintos grados de severidad diferirá generalmente en base a distintos factores tal como la longitud de las secuencias de hibridización, que contienen ya sea ARN o ADN, etc. Por ejemplo, las temperaturas apropiadas para la hibridización de severidad baja, media o alta será generalmente inferior para las secuencias más cortas al igual que en los oligonucleótidos que tienen secuencias más grandes. El término virus de la influenza se usa en la presente para referirse a cualquier cepa del virus de la influenza capaz de provocar una enfermedad en un animal o sujeto humano, o que es un candidato de interés para el análisis experimental. Los virus de la influenza se describen en los campos, B., et al., Fields' Virology, 4 edición, Filadelfia: Lippincott Williams y Wilkins; ISBN: 0781718325, 2001. En particular, el término abarca cualquier cepa del virus ? de la influenza que es capaz de provocar la enfermedad en un 32 animal o sujeto humano, o que es un candidato de interés para el análisis experimental. Un gran número de aislados ? de la influenza han sido formados parcialmente o completamente en secuencias. El apéndice ? representa simplemente una lista parcial de secuencias completas para los segmentos del genoma A de la influenza que han sido depositados en una base de datos pública (La Base de Datos de la Secuencia de la Influenza (ISD) , ver Macken, C, Lu, H., Goodman, J., & Boykin, L., "The valué of a datábase in surveillance and vaccine selection". en Options for the Control of Influenza IV. A.D.M.E. Osterhaus, N. Cox & A.W. Hampson :(Eds.) Ámsterdam: Elsevier Science, 2001, 103-106) . Esta base de datos contiene también secuencias completas para los segmentos del genoma C y B de la influenza. La base de datos está disponible en la Red Amplia Mundial en el sitio de la Red que tiene URL http: //www.flu.lanl.gov/ junto con un buscador conveniente que permite al usuario buscar por segmentos del genoma, por especies infectadas por el virus y por año de aislamiento. Las secuencias de la influenza se encuentran también disponibles en Genbank. Las secuencias de los genes de la influenza se encuentran por lo tanto, disponibles por los expertos en la técnica. Aislado, como se usa en la presente, significa 1) separado de al menos algunos de los componentes con los que se asocia usualmente en la naturaleza, 2) preparado o 33 purificado por un proceso que involucra la mano del hombre, y/o 3) no se presenta en la naturaleza. Ligando, como se usa en la presente, significa una molécula que se enlaza específicamente a una segunda molécula, típicamente un polipéptido o porción del mismo, tal como una porción de carbohidratos, .a través de un mecanismo diferente al de una interacción entre el antígeno y el anticuerpo. El término abarca por ejemplo, polipéptidos, péptidos y moléculas pequeñas que se sintetizan o que se presentan naturalmente, que incluyen moléculas cuya estructura ha sido inventada por el hombre. A pesar de que el término se usa frecuentemente en el contexto de receptores y moléculas con los que interactúan y que modulan típicamente su actividad (por ejemplo, agonistas o antagonistas), el término como se usa en la presente, aplica de manera más general. Enlazado operablemente, como se usa en la presente, se refiere a una relación entre dos secuencias de ácidos nucleicos en donde la expresión de una de las secuencias de ácidos nucleicos se controla mediante, regula por, modula por, etc., a la otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos se dirige mediante una secuencia promotora enlazada operablemente, el proceso post-transcripcional de un ácido nucleico se dirige mediante una secuencia del proceso enlazado operablemente, la traducción de una secuencia de 34 ácidos nucleicos se dirige mediante una secuencia reguladora traduccional el transporte o localización de un ácido nucleico o polipéptido se dirige mediante un transporte enlazado operablemente o secuencia de localización, y proceso post-traduccional de un polipéptido se dirige a una secuencia del proceso enlazado operablemente. Preferiblemente, una secuencia de ácidos nucleicos que se enlazan operablemente a una segunda secuencia de ácidos nucleicos se enlazan covalen emente, ya sea directamente o indirectamente a tal secuencia, a pesar de que es aceptable cualquier asociación tridimensional efectiva. Purificado, como se usa en la presente, significa separado de cualquiera de otros compuestos o entidades . Un compuesto o entidad puede ser parcialmente purificado, sustancialmente purificado, o puro, en donde este es puro cuando se remueve de sustancialmente otros compuestos o entidades, es decir, es preferiblemente al menos de aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos de aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor que 99% puro. El término secuencia reguladora se usa en la presente para describir una región de una secuencia de ácidos nucleicos que dirige, mejora, o inhibe la expresión (particularmente la transcripción, pero en algunos casos otros eventos tales como empalmes u otros procesos) de la 35 secuencia (s) con los que se enlazan operablemente. El término incluye promotores, mejoradores y otros elementos de control transcripcional . En algunas modalidades de la invención, las secuencias reguladoras pueden dirigir la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, en otras modalidades, secuencias reguladoras pueden dirigir el tejido especifico y/o la expresión inducible. Por ejemplo, los ejemplos no limitantes de promotores específicos del tejido apropiados para usarse en células de mamíferos incluyen promotores específicos de linfoides (ver por ejemplo, Caíame et al., Adv., Immunol. 43:235, 1998) tal como los promotores de los receptores de células T (ver por ejemplo, Winoto et al., E BO J. 8:729, 1989) e inmunoglobulinas (ver por ejemplo, Banerji et al., Cell 33:729, 1983; Queen et al., Cell 33:729, 1983) , y promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos ; Byrne et al., Proc. Nati. Acad. Sel. USA 86:5473, 1989) . Son abarcados también los promotores regulados en su crecimiento, que incluyen por ejemplo, promotores hox de murina (Keseel et al., Science 249:374, 1990) y el promotor de a-fetoproteína (Campes et al., Genes Dev. 3:537, 1989). En algunas modalidades de la invención, las secuencias reguladoras pueden dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos solo en células que han sido infectadas con un agente infeccioso. Por ejemplo, la secuencia reguladora puede comprender un promotor y/o 36 mej orador tal como un promotor especifico del virus o mej orador que se reconoce por una proteina viral, por ejemplo, una polimerasa viral, un factor de transcripción,- etc. Alternativamente, la secuencia reguladora puede comprender un promotor y/o mej orador que es activo en células epiteliales en los conductos nasales, tracto respiratorio y/o los pulmones . Como se usa en la presente, el término entidad que induce ARNi abarca moléculas de ARN y vectores (distintos a las moléculas que se presentan naturalmente no modificadas por la mano del hombre) cuya presencia dentro de una célula resulta en ARNi y conduce a una expresión reducida de un transcrito al cual se dirige la entidad que induce ARNi. El término incluye específicamente ARNsi, ARNsh y vectores que inducen ARNi. Como se usa en la presente, un vector que induce ARNi es un vector cuya presencia dentro de una célula resulta en la transcripción de uno o más ARN que se autohibridizan o producen híbridos entre sí para formar un ARNsh o ARNsi . En varias modalidades de la invención este término abarca plásmidos, por ejemplo, vectores de ADN (cuya secuencia puede comprender elementos de secuencias derivados de un virus), o virus, (virus distintos a los que se presentan naturalmente o plásmidos que no han sido modificados por la mano del hombre) , cuya presencia dentro de una célula resulta en la producción 37 de uno o más ARN que se autohibridizan o producen híbridos entre sí para formar un ARNsi o ARNsh. En general, el vector comprende un ácido nucleico enlazado operablemente a una señal (es) de expresión para que una o más moléculas de ARN que producen híbridos o autohibridizan formen un ARNsi o ARNsh se transcribieran cuando el vector este presente en la célula. Así, el vector proporciona una plantilla para la síntesis intracelular del ARN o ARNs o precursores de los mismos. Para propósitos de inducir ARNi, la presencia de un genoma viral en una célula (por ejemplo, después de la fusión de la envolvente viral con la membrana celular) se considera suficiente para constituir la presencia del virus dentro de la célula. Además, para propósitos de inducir ARNi, un vector se considera para estar presente dentro de una célula si se introduce dentro de la célula, entra a la célula, o se hereda de una célula parenteral con respecto a si se modifica o procesa posteriormente dentro de la célula. Un vector que induce ARNi se considera para ser dirigido a un transcrito si la presencia del vector dentro de una célula resulta en la producción de uno o más ARNs que forman híbridos entre sí o autohibridizan para formar un ARNsi o ARNsh que se dirige al transcrito, es decir, si la presencia del vector dentro de una célula resulta en la producción de uno o más ARNsi o ARNsh dirigidos al transcrito. Un ARN de interferencia corta (ARNsi) incluye un ARN 38 doble que tiene aproximadamente 19 pares de bases juntos y opcionalmente comprenden además una o dos colgantes de hebra simple. Un ARNsi puede formarse a partir de dos moléculas de ARN que hibridizan al mismo tiempo, o pueden generarse alternativamente a partir de una molécula de ARN simple que incluye una porción autohibridizante. Se prefiere generalmente que los extremos 5' libres de las moléculas de ARNsi tengan grupos fosfato, y los extremos 3' libres tengan grupos hidroxilo. La porción doble de un ARNsi puede, pero típicamente no, contener uno o más protuberancias que consisten de uno o más nucleótidos no apareados . Una hebra de un ARNsi incluye una porción que hibridiza con un transcrito de direccionamiento . En ciertas modalidades preferidas de la invención, una hebra del ARNsi se complementa precisamente con una región del transcrito de direccionamiento, esto significa que el ARNsi hibridiza al transcrito de direccionamiento sin una no coincidencia simple. En otras modalidades de la invención, pueden existir una o más no coincidencias entre el ARNsi y la porción dirigida al transcrito de direccionamiento. En la mayoría de las modalidades de la invención en la cual no se obtiene una complementariedad perfecta, se prefiere generalmente que cualquiera de las no coincidencias se localicen en o cerca del término ARNsi . El término ARN de horquilla corta se refiere a una 39 molécula que comprende al menos dos porciones hibridizadas complementarias o capaces de formar híbridos para formar una estructura (doble) de doble hebra suficientemente larga para mediar el ARNi (típicamente al menos 19 pares de bases en longitud) , y al menos una porción de hebra simple, típicamente entre aproximadamente 1 y 10 nucleótidos en longitud que forman un rizo. La porción doble puede, pero típicamente no, contener uno o más protuberancias que consisten de uno o más nucleótidos no apareados. Como se describe adicionalmente abajo, se piensa que los ARNsh se procesan dentro de los ARNsi mediante el mecanismo del ARNi celular conservado. Así, los ARNsh son precursores de ARNsi y son, en general, similarmente capaces para inhibir la expresión de un transcrito de direccionamiento . Como se usa en la presente, el término enlace específico se refiere a una interacción entre un polipéptido objetivo (o, más generalmente a una molécula objetivo) y una molécula que enlaza tal como un anticuerpo, ligando, agonista o antagonista. La interacción depende típicamente de la presencia de una característica estructural particular del polipéptido objetivo tal como un antigénico determinante o epítopo reconocido por la molécula que enlaza. Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítopo A, la presencia de un polipéptido que contiene un epítopo ? o la presencia del A no etiquetado libre en una reacción que 40 contiene tanto la etiqueta libre A como el anticuerpo de éste, reducirá la cantidad de ? etiquetado que enlaza al anticuerpo. Se comprende que la especificidad no necesita ser absoluta pero se refiere generalmente al contexto en el cual se realiza el enlace. Por ejemplo, se conoce bien en la técnica que numerosos anticuerpos que reaccionan en forma cruzada con otros epitopos además de aquellos presentes en la molécula objetivo. Tal reactividad cruzada puede ser aceptable dependiendo de la aplicación para la cual el anticuerpo será usado. Un experto en la técnica será capaz de seleccionar anticuerpos que tengan un grado suficiente de especificidad para realizar apropiadamente en cualquier aplicación dada (por ejemplo, para la detección de una molécula objetivo, para propósitos terapéuticos, etc) . También será entendido que la especificidad puede evaluarse en el contexto de factores adicionales tales como la afinidad de la molécula de enlace para el polipéptido objetivo contra la afinidad^ de la molécula que enlaza a otros objetivos, por ejemplo, competidores. Si una molécula que enlaza exhibe una afinidad alta para una molécula objetivo que se desea detectar y un afinidad baja para las moléculas no objetivo, el anticuerpo probablemente será un reactivo aceptable para los propósitos inmunodiagnósticos . Una vez que la especificidad de una molécula que enlaza se establece en uno o más contextos, puede emplearse en otros contextos, de preferencia similares 41 sin re-evaluar necesariamente su especificidad. El término sujeto, como se usa en la presente, se refiere a un individuo susceptible a una infección con un agente infeccioso, por ejemplo, un individuo susceptible a una infección con un virus tal como el virus de la influenza. El término incluye aves y animales, por ejemplo, aves domesticadas y animales (tales como pollos, mamíferos que incluyen porcinos, caballos, perros, gatos, etc) , y animales silvestres, primates no humanos y humanos. Un ARNsi o ARNsh o una secuencia ARNsi o ARNsh se considera que va a ser dirigida a un transcrito de direccionamiento para los propósitos descritos en la presente si 1) la estabilidad del transcrito de direccionamiento se reduce en presencia del ARNsi o ARNsh comparada con su ausencia, y/o 2) el ARNsi o ARNsh muestra al menos aproximadamente 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de complementariedad precisa de la secuencia con el transcrito de direccionamiento para una extensión de al menos aproximadamente 15, más preferiblemente al menos de aproximadamente 17, más preferiblemente al menos de aproximadamente 18 o 19 hasta aproximadamente 21-23 nucleótidos, y/o 3) una hebra del ARNsi o una de las porciones autocomplementarias del ARNsh que hibridiza al transcrito de direccionamiento bajo condiciones severas para 42 la hibridización de moléculas de ARN pequeñas (< 50 nucleótidos) in vitro y/o bajo condiciones encontradas típicamente dentro del citoplasma o núcleo de las células de mamíferos . Un vector que induce al ARN cuya presencia dentro de una célula resulta en la producción de un ARNsi o ARNsh que se dirige a un transcrito se considera también que va a dirigir al transcrito de direccionamiento . Puesto que el efecto de dirigir a un transcrito es reducir o inhibir la expresión del gen que dirige la síntesis del transcrito, un ARNsi o ARNsh que se dirige a un transcrito se considera también que dirige al gen que dirige la síntesis del transcrito a pesar de que el mismo gen (es decir, ADN genómico) no piense interactuar con el ARNsi, ARNsh o componentes del mecanismo de silenciamiento celular. Así, como se usa en la presente, un ARNsi, ARNsh o vector que induce ARNi que dirige a un transcrito, se entiende por objetivo al gen que proporciona una plantilla para la síntesis del transcrito. Como se usa en la presente, tratar incluye invertir, aliviar, inhibir el progreso de, prevenir o reducir la probabilidad de la enfermedad, trastorno o condición para la cual tal término aplica, uno o más síntomas o manifestaciones de tal enfermedad, trastorno o condición. En general, el término vector se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de mediar la entrada de por ejemplo, 43 transferir, transportar, etc., una molécula de ácidos nucleicos secundaria dentro de la célula. El ácido nucleico transferido se enlaza generalmente a, por ejemplo, insertado en el vector de la molécula del ácido nucleico. Un vector puede incluir secuencias que dirigen la replicación autónoma, o pueden incluir secuencias suficientes para permitir la integración dentro del ADN de la célula hospedera. Los vectores útiles incluyen por ejemplo, plásmidos (típicamente moléculas de ADN a pesar de que se conocen también plásmidos de ARN) , cósmidos y vectores virales. Como se conoce en la técnica, el término vector viral puede referirse ya sea a una molécula de ácidos nucleicos (por ejemplo, un plásmido) que incluye elementos de ácidos nucleicos derivados de virus que facilitan típicamente la transferencia o integración de la molécula de los ácidos nucleicos (ejemplos de estos incluyen, vectores lentivirales o retrovirales ) o un virus o partícula viral que median la transferencia de los ácidos nucleicos (ejemplos incluyen retrovirus o lentivirus) . Como, será evidente para un experto en la técnica, los vectores virales pueden incluir varios componentes virales además del ácido (s) nucleico .

Descripción detallada de ciertas modalidades preferidas de la invención I. Ciclo de Vida Viral de la Influenza y Características 44 Los virus de la influenza son envueltos en los virus de ARN de hebras negativas de la familia del Orthomyxoviridae. Estos son clasificados como los tipos A, B y C de la influenza, de los cuales el tipo A de la influenza es el más patogénico y se cree que es el único tipo capaz de experimentar un reordenamiento o reclasificación con cepas animales. Los tipos A, B, y C de la influenza pueden distinguirse mediante diferencias en su nucleoproteina y sus proteínas de matriz (ver la figura 1) . Como se mencionó anteriormente, los subtipos A de la influenza se definen por la variación en sus genes hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) y se distinguen normalmente por los anticuerpos que enlazan a las proteínas correspondientes . El genoma viral A de la influenza consiste de diez genes distribuidos en ocho segmentos de ARN. Los genes codifican 10 proteínas: las glicoproteínas incluyen hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) , proteínas de matriz (MI) , nucleoproteínas (NP) , tres polimerasas (PBl, PB2, y PA) que son componentes de una transcriptasa de ARN dependiente del ARN también referida en la presente como una polimerasa o complejo de polimerasas; proteínas de canales de ión (M2) y proteínas no estructurales (NS1 y NS2) . Ver Julkunen, I., et al., Cytokine and Growth Factor Reviews, 12: 171-180, 2001 para detalles adicionales con respecto al virus A de la influenza y su patogénesis molecular. Ver también, Fields, B., et al., 45 Fields' Virology, 4ta edición, Philadelphia:Lippincott Williams y Wilkins; ISBN: 07818325, 2001. La organización del genoma viral B de la influenza es muy similar al tipo A de la influenza en donde el genoma viral C de la influenza contiene siete segmentos de ARN y carece del gen NA. La clasificación del virus A de la influenza se basa en la hemaglutinina (H1-H15) y los genes (N1-N9) de la neuraminidasa . La nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud (WHO por sus siglas en inglés) define cada cepa del virus por su hospedera de origen animal (especificada no siendo humana) , origen geográfico, número de cepa, año de aislamiento y descripción antigénica del HA y NA. Por ejemplo, como A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) se designa a la cepa A, aislado 8, que aparece en humanos en Puerto Rico en el año de 1934 y tiene subtipos antigénicos 1 de Ha y NA. Otro ejemplo, como ?/Chicken/Hong Kong/258/97 (H5N1) se designa a la cepa A, aislado 258, que aparece en pollos en Hong Kong en el año de 1997 y tiene un subtipo 5 antigénico de HA y 1 de NA. Las epidemias humanas han sido provocadas por virus con HA tipos Hl, H2, y H3 y NA tipos NI y N2. Como se mencionó anteriormente, la variación genética ocurre mediante dos principales mecanismos en el virus A de la influenza. La desviación genética se presenta vía las mutaciones de punto, que presentan frecuentemente posiciones antigénicamente significativas debido a la presión selectiva 46 de las respuestas inmunes hospederas, y el desplazamiento genético (también referido como reordenamiento) , que involucra la sustitución de un segmento del genoma viral completo de un subtipo por otro. Muchos tipos distintos de especies animales que incluyen humanos, porcinos, pájaros, caballos, mamíferos acuáticos y otros, pueden volver a infectarse con los virus A de la influenza. Algunos virus A de la influenza se restringen a especies particulares y no infectarán normalmente a las distintas especies. Sin embargo, algunos virus A de la influenza pueden infectar varias especies animales, principalmente pájaros (particularmente aves acuáticas migratorias), cerdos y humanos. Se considera esta capacidad como la responsable del principal desplazamiento antigénico en el virus A de la influenza. Por ejemplo, se supone que un cerdo se vuelve a infectar con un virus A de la influenza de un humano y al mismo tiempo se vuelve a infectar con un virus A de la influenza distinta de un pato. Cuando los dos distintos virus se reproducen en las células del cerdo, los genes de la cepa humana y la cepa de pato puede "mezclarse" resultando en un virus nuevo con una combinación única de segmentos de ARN. Este Proceso se llama reordenamiento genético (Note que este tipo de reordenamiento genético se distingue del intercambio de la información genética que se presenta entre los cromosomas durante la meiosis ) . 47 Al igual que otros virus y ciertas especies bacterianas, los virus de la influenza se replican intracelularmente . Los virus A de la influenza se replican en las células epiteliales del tracto respiratorio superior. Sin embargo, los monocitos/macrófagos y otras células de glóbulos blancos pueden también ser infectadas . Otros numerosos tipos celulares con glicoproteinas de superficie celular que contienen ácido siálico son susceptibles a la infección in vitro puesto que el virus usa estas moléculas como un receptor. El ciclo de la infección/replicación del tipo A de la influenza se describe esquemáticamente en la figura 1. Como se muestra en la figura 1A, el virión 100 del tipo A de la influenza incluye el genoma 101, que consiste de ocho segmentos de ARN de hebras negativas: PB2 (102), PB1 (103), PA (104), HA (105), NP (106), NA (107), (108), y NS (109). Se enumera convencionalmente a partir de 1 a 8, con PB2 = 1, PB1 = 2, PA = 3, HA = 4, NP = 5, NA = 6, = 7, y NS = 8. Los segmentos de ARN genómico se empaquetan dentro de una capa de proteina de membrana MI 120 que esta rodeada por una bicapa lipida 130 en la cual los dominios extracelulares de las glicoproteinas envolventes HA 140 y NA 150 y el un canal de ión M2 160 sobresale. Los segmentos de ARN 102-108 están cubiertos con una nucleoproteína MP 170 (descrita esquemáticamente con mayor detalle en la figura 15) y 48 contienen el complejo 180 de polimerasas virales que consiste de polimerasas PB1, PB2 y ??. La proteina NS2 190 no estructural se encuentra también dentro de los viriones. La proteina NSI no estructural (no se muestra) se encuentra dentro de las células infectadas. La figura IB muestra la estructura del genoma del virus de la influenza y los transcritos generados a partir del genoma de la influenza (no está dibujado a escala) . Seis de ocho segmentos de ARN genómicos (PB1 (102), PB2 (103), PA (104), HA (105), NP (106) y NA (107)) sirven cada uno como plantilla para un transcrito no empalmado simple, que codifica a la proteina correspondiente. Han sido identificados tres transcritos de ARNm derivados del segmento M (108) del virus tipo A de la influenza: un transcrito 191 colineal que codifica a la proteina ?, un ARNm empalmado 192 que codifica a la proteina M2 y contienen un intron de 689 nucleótidos y otro ARNm 193 empalmado alternativamente que tiene el potencial para codificar a 9 péptidos de aminoácidos (m3) que no han sido detectados en las células infectadas con el virus. Dos transcritos de ARNm se derivan del segmento NS del virus A de la influenza: un ARNm 194 no empalmado que codifica a la proteina NSi y un ARNm 195 empalmado que codifica a la proteina S2 e incluye un intron de 473 nucleótidos. El ciclo de infección (figura 2) se inicia cuando el 49 virión 100 se une vía su hemaglutinina a la superficie de una célula susceptible a través de la interacción con ácido siálico que contiene una proteina de superficie celular. El virus unido se somete a endocitosis dentro de vesículas revestidas 200 vía la endocitosis dependiente de la clatrina. El pH bajo en las endosomas , activan la fusión de las membranas endosomales y virales que resultan en la liberación de complejos de ribonucleoproteína viral (RNPv) (nucleocápsidas ) 210 dentro del citoplasma. Las nucleocápsidas virales se importan en el núcleo celular siguiendo la síntesis del ARNm viral principal que se inicia por un complejo de la polimerasa de ARN viral que consiste de las polimerasas PBl, PB2 y PA. Los cebadores producidos por la actividad de la endonucleasa de la proteina PB2 ¦ en la célula hospedera del pre-ARNm se usan para iniciar la síntesis del ARNm usando el ARn viral (ARNv) como una plantilla. La proteína PBl cataliza la síntesis de los ARNm 230 específicos del virus que se transportan dentro del citoplasma y se traduce. Las polimerasas NP, NS1 y NS2 sintetizadas recientemente se transportan dentro del núcleo y regulan la replicación y la síntesis del ARNm viral secundario. La síntesis del ARN complementario (ARNc) 240 del ARN viral (ARNv) se inicia por PBl, PB2, PA y NP después de que las nuevas moléculas de ARNv 250 se sintetizan. El complejo de la polimerasa viral usa 50 estos ARNv como plantillas para la síntesis de ARNm 260 secundario. Así, la transcripción del ARNv mediante la transcriptasa codificada por el virus produce ARNm que sirve como una plantilla para la síntesis de las proteínas virales y produce también ARN complementaria (ARNc) que difiere del ARNm que carece del cierre 5' y el extremo A poli 3' y sirve como una plantilla para sintetizar más ARNv para una nueva producción de viriones. En la última infección, la proteína NS1 regula el empalme de los ARNm NS y M que resulta en la producción de los ARNm M2 y Ns2. Los ARNm vírales se transportaron dentro del citoplasma, en donde se producen las proteínas 270 estructurales virales. Las proteínas PBl, Pb2, PA y NP se transportan dentro del núcleo, el sitio de reunión de los complejos RNPv (nucleocápsidas ) 280. Las proteínas MI y NS2 se transportan también dentro del núcleo, en donde interactúan con los RNPv y regulan su exportación nuclear. Los complejos de la proteína Ml-ARNv viral interactúan con la porción citoplásmica de las moléculas HA y NA en la membrana del plasma, en donde brotan viriones maduros y se presenta una liberación de partículas virales. El virus tipo A de la influenza se replica rápidamente en las células, resultando en una muerte de células hospederas debido a los efectos citolíticos o apoptosis. La infección provoca cambios en una amplia variedad de actividades celulares y procesos que incluyen la inhibición 51 de la expresión del gen de las células hospederas. El complejo de las polimerasas virales enlaza y desdobla a los transcritos de la polimerasa II celular sintetizados recientemente en el núcleo. La proteína NS1 bloquea el empalme pre-ARNm celular e inhibe la exportación nuclear del ARNm hospedador. La traducción del ARNm celular se inhibe ampliamente, en donde el ARNm viral se traduce eficientemente El mantenimiento de la traducción eficiente de los ARNm virales se obtienen en parte a través de la subregulación de la respuesta de la interferona celular (IFN) , una respuesta hospedera que actúa típicamente para inhibir la traducción en células infectadas viralmente. En particular, la proteína NS1 viral enlaza PKR inducida por IFN e inhibe su actividad. Así, es evidente que la infección con el virus de la influenza resulta en cambios profundos en la biosíntesis celular, que incluye cambios en el procesamiento y traducción del ARNm celular . Las células infectadas responden en una variedad de formas para limitar la propagación del virus. Se activaron varios sistemas del factor de transcripción incluyendo el factor nuclear B kappa (NFKB) , proteína de activación (AP)-l, factores reguladores de la interferona, transductores y activadores de la transcripción (STAT) y factor-IL-6 nuclear entre otros. La activación de estas trayectorias del factor de transcripción conduce a la producción de citocinas 52 quimiotácticas, proinflamatorias y antivirales que estimulan la migración de las células inflamatorias en el sitio de la infección, ejerce una variedad de efectos antivirales y juega un papel importante en la respuesta inmune a la infección viral. Entre las citocinas producidas por las células epiteliales infectadas por el virus A de la influenza se encuentran (IFN - a/ß) Tipo 1, RANTES, MCP-1 e IL-8. Los monolitos/macrófagos infectados por el virus A de la influenza produce una variedad de citocinas adicionales que incluyen MIP-1 a/ß, ???-3a, MCP-1, MCP-3, IP-10, IL-?ß, IL-6, TNF-CC e IL-18. La muerte citolitica de las células se presenta en general aproximadamente de 20 a 40 horas después de la infección con el virus A de la influenza como una consecuencia de la replicación viral, la producción de las partículas virales se continuó por la síntesis de la proteína viral y se interrumpió la síntesis de la proteína hospedera. También son evidentes los cambios característicos .de la apoptosis, por ejemplo, condensación de la cromatina, fragmentación del ADN, reducción celular y despeje de las células apoptóticas mediante los macrofagos.

II. Selección, Diseño y Síntesis de los ARNsi La presente invención proporciona composiciones que contienen ARNsi y/o ARNsh dirigidos a uno o más transcritos 53 del virus de la influenza. Como lo demuestra la descripción del ciclo replicativo del virus de la influenza presentada anteriormente, varios tipos de transcritos de aRN viral (ARNv primario y secundario, ARNm viral primario y secundario y ARNc viral) se presentan dentro de células infectadas con el virus de la influenza y juegan un papel importante en el ciclo de vida viral. Cualquiera de estos transcritos son objetivos apropiados para la inhibición del ARNsi mediada ya sea por el mecanismo directo o indirecto de acuerdo con la presente invención. Los ARNsi y ARNsh que dirigen cualquier transcrito del ARNm reducirá específicamente el nivel del mismo transcrito en forma directa, es decir, provocando la degradación del transcrito. Además, como se discutió anteriormente, los ARNsi y ARNsh que dirigen ciertos transcritos virales (por ejemplo, NA, PA, PBl) provocarán indirectamente la reducción en los niveles de los transcritos virales que no son dirigidos específicamente. En situaciones en las cuales el empalme sea posible, en cuanto al ARNm que codifica Mi y M2 y el ARNm que codifica Si y NS2, el transcrito no empalmado o el transcrito empalmado pueden servir como un transcrito de direccionamiento . Los transcritos virales potenciales que pueden servir como un objetivo para el ARNsi basado en la terapia de acuerdo a la presente invención incluyen por ejemplo, 1) cualquier segmento genómico del virus de la influenza; 2) los 54 transcritos que codifican cualquiera de las proteínas virales que incluyen transcritos que codifican a las proteínas PB1, PB2, PA, NP, NS1, NS2, Mi, M2, HA o NA. Como se apreciará, los transcritos pueden ser dirigidos en sus formas ARNv, ARNc y/o ARNm mediante una ARNsi o ARNsh simple, a pesar de que como se discutió anteriormente, los inventores han obtenido datos que sugieren que el ARNm viral es el único o el objetivo principal del ARNi . Para cualquier objetivo del gen en particular que se selecciona, el diseño del ARNsi o ARNsh para usarse de acuerdo con la presente invención seguirá preferiblemente ciertos lineamientos . En general, es deseable para las secuencias objetivo que sean específicas para el virus (comparada con la hospedera) , y que, preferiblemente, son importantes o esenciales para la función viral. A pesar de que ciertos genes virales, particularmente aquellos HA y NA que codifican, se caracterizan por una proporción de mutación alta y con capacidad para tolerar las mutaciones, ciertas regiones y/o secuencias que tienden a conservarse. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, tales secuencias pueden ser objetivos particularmente apropiados. Como se describe adicionalmente abajo, pueden ser identificadas tales regiones conservadas, por ejemplo, a través de la revisión de la literatura y/o comparaciones de las secuencias del gen de la influenza, una gran variedad que se encuentra disponible 55 públicamente. También, en muchos casos, el agente que se suministra a una célula de acuerdo a la presente invención puede experimentar una o más etapas del proceso antes de volverse un agente de supresión activo (ver adelante para una discusión adicional) ; en tales casos, aquellos expertos en la técnica apreciarán que el agente relevante se diseñará preferiblemente para incluir secuencias que pueden ser necesarias para su proceso. Los inventores han encontrado que una proporción significativa de las secuencias seleccionadas que usan los parámetros de diseño descritos en la presente demuestran ser secuencias de supresión eficientes cuando se incluyen en un ARNsi o ARNsh y se prueban como se describe abajo. Aproximadamente el 15% de los ARNsi probados mostraron un efecto fuerte e inhibieron potencialmente la producción del virus en células infectadas ya sea con cepas PR8 o WSN del virus de la influenza; aproximadamente 40% mostró una efecto significativo (es decir, una diferencia estadísticamente significativa (p < 0.5) entre la producción del virus en la presencia contra la ausencia de ARNsi en células infectadas con WSN) , aproximadamente 45% no mostró o tuvo un ¡efecto mínimo. Así, la invención proporciona ARNsi o ARNsh que inhibe la producción del virus en células infectadas ya sea con al menos dos subtipos distintos del virus de la influenza Se describirán ahora las características específicas y 56 generales de los ARNsi y ARNsh de acuerdo con la invención. Los ARN de interferencia corta (ARNsi) se descubrieron primero en estudios del fenómeno de la interferencia del ARN (ARNi) en Drosophila, como se describe en WO 01/75164. En particular, se encontró que, en Drosophila, los ARN de hebra doble extensos se procesan mediante una enzima tipo III de RNasa llamada DICER (Bernstein et al., Nature 409:363, 2001) dentro de ARNds más pequeños de dos hebras 21 nt, en las que cada una de las cuales tiene un grupo 5' fosfato y un hidroxilo 3' e incluye una región de 19 nt complementarias precisamente con la otra hebra, de manera que existe una región doble de 19 nt flanqueada por colgantes 2 nt-3' . La figura 3 muestra un diagrama esquemático de los ; ARNsi encontrados en Drosophila. La estructura incluye una porción 300 (DS) de doble hebra de 19 nucleótidos, que comprende una hebra 310 sentido y una hebra 315 antisentido. Cada hebra tiene un colgante 320 de 2 nt 3' . Estos ARNds cortos (ARNsi) actúan para silenciar la expresión de cualquier gen que incluye una región complementaria para una hebra ARNds, presumiblemente debido a que la actividad de la helicasa desenrolla el doble de- 19 pb en el ARNsi, permitiendo una duplicidad alternativa para formar una hebra del ARNsi y el transcrito al objetivo. Esta duplicidad dirige entonces un complejo de endonucleasas, RISC al ARN objetivo, que se desdobla ("cortes") en una ubicación 57 simple, produciendo extremos de ARN no protegidos que se degradan prontamente mediante el mecanismo celular (Figura 4) . Como se mencionó anteriormente, se conocen también los mecanismos adicionales mediados por las especies de ARN cortas (microARN) · (ver, por ejemplo, Ruvkin, G., Science, 294, 797-799, 2001; Zeng, Y., et al., Molecular Cell, 9, 1-20, 2002) . Se observa que la discusión de los mecanismos y las figuras descritas en ellos no pretenden sugerir cualquiera de las limitaciones en el mecanismo de acción de la presente invención. Los homólogos de la enzima DICER se encuentran en diversos rangos de especies a partir de C. elegans de humano (Sharp, Genes Dev. 15/ 485, 2001; Zamora, Nat. Struct.- Biol. 8:746, 2001), planteando la posibilidad de que el mecanismo tipo AR i podría ser capaz de silenciar la expresión del gen en una variedad de distintos tipos celulares que incluyen células de mamíferos o incluso humanas. Sin embargo, se conoce que los ARNds largos (por ejemplo, los ARNds que tienen una región de hebra doble más larga que tiene aproximadamente de 30 a 50 nucleótidos) activan la respuesta de la interferona en las células de mamíferos. Así, en lugar de obtener el silenciamiento del gen específico observado en el mecanismo del ARNi de la Drosophila, se esperaría la presencia de ARNds largos dentro de células de mamíferos para conducir una supresión de traducción no específica mediada 58 por la interferona, resultando potencialmente en la muerte celular. Por lo tanto, no se piensa que los ARNds largos sean útiles para inhibir la expresión de los genes particulares en células de mamíferos . Sin embargo, los inventores y otros han encontrado que los ARNsi, cuando son introducidos en células de mamíferos, pueden reducir efectivamente la expresión de los genes objetivo que incluyen genes virales. Los inventores han demostrado que los ARNsi dirigidos a una variedad de ARN del virus de la influenza, incluyendo ARNs que codifican a la transcriptasa de ARN dependiente del ARN y nucleoproteínas NP, redujo dramáticamente el nivel del virus producido en las células de mamíferos infectadas (Ejemplos 2, 4, 5, 6) . Los inventores han demostrado también que los ARNsi dirigidos a los transcritos del virus de la influenza pueden inhibir la replicación del virus de la influenza in vivo en organismos intactos, principalmente embriones de pollos infectados con el virus de la influenza (Ejemplo 3) . Además, los inventores han demostrado que los ARNsi dirigidos a los transcritos del virus de la influenza pueden inhibir la producción del virus en ratones cuando se administra ya sea antes o después de la infección viral (Ejemplos 12 y 14). Además, los inventores han demostrado que la administración de un vector de ADN a partir del cual los precursores ARNsi (ARNsh) pueden ser expresados, inhiben la producción del virus de la influenza 59 en ratones. Asi, la presente invención demuestra que el tratamiento con ARNsi, ARNsh, o con otros vectores cuya presencia dentro de una célula conducen a la expresión de ARNsi o ARNsh son estrategias efectivas para inhibir la infección del virus de la influenza y/o replicación. Aun cuando no se desea ligarse a alguna teoría, los inventores sugieren que este descubrimiento es especialmente significativo en vista de los profundos cambios en las actividades celulares, por ejemplo, actividades metabólicas y biosintéticas , que tienen lugar luego de la infección con el virus de la influenza descrito anteriormente. La infección con el virus de la influenza inhibe tales procesos celulares fundamentales como el empalme del ARNm celular, transporte, traducción y resultados en la inhibición de la síntesis: de la proteína celular. A pesar de estas alteraciones, el encontrar que el ARNsi dirigidos a los transcritos virales inhibe la replicación viral sugiere que los mecanismos celulares que fundamentan la inhibición mediada por el ARNi de la expresión del gen continua para operar en las células infectadas con el virus de la influenza en un nivel suficiente para inhibir la expresión del gen de la influenza. Los ARNsi y ARNsh preferidos para usarse de acuerdo con la presente invención incluyen una región de pares de: bases de aproximadamente 19 nt largas, y pueden tener opcionalmente uno o más extremos libres o rizados. Por ejemplo, la figura 5 60 presenta varias estructuras que podrían ser utilizadas como un ARNsi o ARNsh de acuerdo a la presente invención. La figura 5 A muestra la estructura encontrada para ser activa en el sistema Drosophila descrito anteriormente, y puede representar a las especies ARNsi que están activas en las células de los mamíferos. La presente invención abarca la administración de un ARNsi que tiene la estructura descrita en la figura 5 A en las células de mamíferos para tratar o prevenir la infección de la influenza. Sin embargo, no se requiere que el agente administrado tenga esta estructura. Por ejemplo, la composición administrada puede incluir cualquier estructura capaz de ser procesada in vivo a la estructura de la figura 5 A, con tal de que el agente administrado no provoque eventos nocivos o indeseados tal como inducción de la respuesta de la interferona. (Note que el término in vivo, como se usa en la presente con respecto a la síntesis, proceso o actividad de ARNsi o ARNsh, se refiere generalmente a eventos que se presentan dentro de una .célula opuesta a un sistema libre de células. En general, las células pueden mantenerse en el cultivo del tejido o pueden formar parte de un organismo intacto. La invención puede comprender también la administración de agentes que no procesen precisamente a la estructura descrita en la figura 5 A, siempre y cuando la administración de tales agentes reduzca suficientemente los niveles de transcripción viral 61 discutidos anteriormente. Las figuras 5B y 5C representan estructuras adicionales que pueden usarse para mediar la interferencia del ARN. Estas estructuras de horquilla (troncal-rizo) pueden funcionar directamente como ARNs inhibidores o pueden procesarse intracelularmente para producir una estructura ARNsi tal como se describe en la figura 5 A. La figura 5B muestra un agente que comprende una molécula de ARN que contienen dos regiones complementarias que se hibridlzan entre si para formar una región doble representada como troncal 400, un rizo 410 y una colgante 320. Se dirá que tales moléculas son autohibridizables y una estructura de esta clase se refiere como un ARNsh. Preferiblemente, la troncal tiene aproximadamente 19 bp de largo, el rizo tiene aproximadamente de 1 a 20, más preferiblemente de aproximadamente 4 a 10, y más preferiblemente de aproximadamente 6 a 8 nt de largo y/o la colgante es aproximadamente de 1 a 20, y más preferiblemente de aproximadamente 2 a 15 nt de largo. En ciertas modalidades de la invención, la troncal tiene como mínimo 19 nucleótidos en longitud y puede tener hasta aproximadamente 29 nucleótidos en longitud. Un experto en la técnica apreciará que los rizos de 4 nucleótidos están probablemente menos sujetos a restricciones estéricas que son rizos más cortos, y que por consiguiente, pueden preferirse. En algunas modalidades, la colgante incluye un fosfato 5' y 62 un hidroxilo 3' . Como se discutió anteriormente, un agente que tiene la estructura descrita en la figura 5B puede ser generado fácilmente mediante la transcripción in vivo o in vitro, en varias modalidades preferidas, el extremo del transcrito será incluida en la colgante, de manera que con frecuencia la colgante comprenderá una pluralidad de residuos U, por ejemplo, entre 1 y 5 residuos ü. Se nota que los ARNsi sintéticos que han sido estudiados en los sistemas de mamíferos tienen frecuentemente 2 residuos U que se proyectan. Ver también las figuras 20 y 21 para ejemplos de estructuras ARNsh. El rizo puede localizarse ya sea en el extremo 5' o 3' de la región que es complementaria al transcrito de direccionamiento cuya inhibición se desea (es decir, la porción antisentido del ARNsh) . La figura 5C muestra un agente que comprende un círculo de ARN que incluye elementos complementarios lo suficiente para formar una troncal 400 de aproximadamente 19 bp de largo. Tal agente puede mostrar estabilidad mejorada comparada con distintos ARNsi descritos en la presente. Al describir ARNsi será frecuentemente conveniente referirse a hebras sentido y antisentido del ARNsi. En general, la secuencia de la porción doble de la hebra sentido del ARNsi es sustancialmente idéntica a la porción dirigida del transcrito de direccionamiento, mientras que la hebra antisentido del ARNsi es sustancialmente complementaria al 63 transcrito de direccionamiento en esta región como se discutió anteriormente. ? pesar de que los ARNsh contienen una molécula de aRN imple que se autohibridiza, se apreciará que la estructura doble resultante puede ser considerada para comprender hebras o porciones sentido y antisentido. Por lo tanto, será conveniente referirse a hebras sentido y antisentido, o porciones sentido o antisentido de un ARNsh, cuando la hebra o porción sentido es el segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un duplo y que es substancialmente complementaria a la porción dirigida al transcrito de direccionamiento, y la hebra o porción sentido es el segmento de la molécula que forma o es capaz de formar un duplo y es sustancialmente idéntica en su secuencia a la porción dirigida del transcrito de direccionamiento. Para propósitos de la descripción, la discusión anterior se referirá frecuentemente como ARNsi, en lugar de ARNsi o ARNsh. Sin embargo, como será evidente por un experto: en la técnica, las enseñanzas relevantes para la hebra sentido o antisentido de un ARNsi se aplican generalmente a las porciones sentido y antisentido de la porción troncal de un ARNsh correspondiente. Asi, en general, las consideraciones anteriores aplican también al diseño, selección y suministro de los ARNsh inventivos . Se apreciará por aquellos expertos en la técnica, que los agentes que tienen cualquiera de las estructuras 64 descritas en la figura 5, o cualquier otra estructura efectiva descrita en la presente, puede comprender completamente nucleótidos de ARN natural, o puede en su lugar incluir uno o más análogos de nucleótidos . Una amplia variedad de tales análogos se conocen en la técnica, los más empleados comúnmente en los estudios de loa ácidos nucleicos terapéuticos son el fosforotioato (para alguna discusión de las consideraciones involucradas cuando se utilizan fosforotioatos, ver, por ejemplo, Agarwal, Biochim. Biophys. Acta 1489:53, 1999). En particular, en ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable estabilizar la estructura del ARNsi, por ejemplo, incluyendo análogos de nucleótidos en uno o más extremos de hebras libres para reducir la digestión, por ejemplo, mediante exonucleasas . La inclusión de desoxinucleótidos, por ejemplo, pirimidinas tales como las desoxitimidinas en uno o más extremos libres puede servir para este propósito. Alternativamente o adicionalmente, puede ser deseable incluir uno o más análogos de nucleótidos para incrementar o reducir la estabilidad de la troncal de 19 bp, en particular, comparada con cualquier híbrido que se formará mediante la interacción de una hebra del ARNsi (o una hebra de la porción de troncal del ARNsh) con un transcrito de direccionamiento . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, se usan selectivamente distintas modificaciones de nucleótidos 65 ya sea en la hebra sentido como antisentido de un ARNsi. Por ejemplo, puede ser preferible utilizar ribonucleótidos no modificados en la hebra antisentido empleando ribonucleótidos modificados y/o modificados o desoxiribonucleótidos no modificados en algunas o todas las posiciones en la hebra sentido. Ver el ejemplo 5, que describe el uso de los ARNsi que tienen modificaciones en la posición 2' de los nucleótidos en la hebra sentido para determinar si el ARNsi se dirige al ARNm, ARNv y/o ARNc virales . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención solo los ribonucleótidos no modificados se usan en la porción doble de la hebra sentido y/o antisentido del ARNsi, mientras que la colgante de la hebra antisentido y/o sentido puede incluir ribonucleótidos modificados y/o desoxirribonucleótidos . En ciertas modalidades de la invención, una o ambas hebras ARNsi comprenden uno o más ribonucleótidos 0 metilados . Numerosos análogos de nucleótidos y modificaciones de nucleótidos se conocen en la técnica, y su efecto en las propiedades tales como la hibridización y resistencia a la nucleasa ha sido explorado. Por ejemplo, se han introducido varias modificaciones en las bases, azúcares y enlaces' internucleósidos dentro de los oligonucleótidos en posiciones seleccionadas, y el efecto resultante en relación con los oligonucleótidos no modificados comparados. Una variedad de modificaciones ha demostrado alterar uno o más aspectos de 66 los oligonucleótidos tales como su capacidad para hibridizar a un ácido nucleico complementario, su estabilidad, etc. Por ejemplo, las modificaciones 2 ' útiles incluyen grupos halo, alcoxi y aliloxi. Las patentes de los E.U. Nos. 6,403,779, 6,399,754, 6,225,460, 6, 127,553, 6,031,086, 6,005,087, 5,977,089 y referencias describen allí una amplia variedad de análogos de nucleótidos y modificaciones que pueden usarse en la práctica de la presente invención. Ver también Crooke, S. (ed.) "Antisense Drug Technology: Principies, Strategies, and Applications" (lera edición), Marcel Dekker, ISBN: 0824705661, 1 edición (2001) y referencias allí dentro. Como se apreciará por un experto en la técnica, los análogos y modificaciones pueden probarse usando por ejemplo, los ensayos descritos en la presente u otros ensayos apropiados para seleccionar aquellos que reducen efectivamente la expresión de los; genes virales . Ver las referencias 137-139 para una discusión adicional de las modificaciones que se han encontrado .útiles en el contexto del ARNsi. La invención abarca el uso de tales modificaciones . En ciertas modalidades de la invención, los análogos o modificaciones resultan en un ARNsi con una capacidad de absorción incrementada (por ejemplo, capacidad de absorción incrementada a través de una capa mucosa, absorción oral incrementada, etc) , estabilidad incrementada en el torrente sanguíneo o dentro de las células, capacidad incrementada 67 para atravesar las membranas celulares, . etc. Como se apreciará por un experto en la técnica, los análogos o modificaciones pueden resultar en un Tm alterado, que puede ser resultado de una tolerancia incrementada de las no coincidencias entre la secuencia ARNsi y el objetivo aún cuando da como resultado una supresión efectiva o puede resultar en una especificidad disminuida o incrementada para los transcritos de direccionamiento deseados. Se apreciará además por aquellos expertos en la técnica que los agentes del ARNsi efectivo para usarse de acuerdo con la presente invención puede comprender una o más porciones que es/son nucleótidos o análogos de nucleótidos . En general, una hebra de los ARNsi inventivos incluirán preferiblemente una región (la "región inhibidora") que es sustancialmente complementaria a la que se encuentra en una porción del transcrito de direccionamiento, de manera que un híbrido preciso pueda formarse in vivo entre una hebra o porción del ARNsi (la hebra sentido) y el transcrito de direccionamiento. En aquellas modalidades de la invención en las que se emplea una estructura ARNsh, esta región sustancialmente complementaria incluye preferiblemente incluye la mayoría o todas las estructuras de troncal descritas en la figura 5B. En ciertas modalidades preferidas de la invención, la región inhibidora relevante del ARNsi o ARNsh se complementa perfectamente con los transcritos de 68 direccionamiento; en otras modalidades, uno o más residuos no complementarios se localizan dentro del duplo ARNsi/plantilla. Puede ser preferible evitar las no coincidencias en la porción central del duplo ARNsi/plantilla (ver, por ejemplo, Elbashir et al., EMBO J. 20:6877, 2001, incorporado en la presente por la referencia) . En general, los ARNsi preferidos hibridizan con un sitio objetivo que incluye secuencias exónicas en el transcrito de direccionamiento. La hibridización con las secuencias intrónicas no se excluyen, pero parecen generalmente no preferirse en las células de mamíferos. En ciertas modalidades preferidas de la invención, el ARNsi hibridiza exclusivamente con las secuencias exónicas. En algunas modalidades de la invención, la ARNsi hibridiza con un sitio objetivo que incluye solo secuencias dentro de un exón simple; en otras modalidades, el sitio objetivo se crea mediante el empalme u otra modificación de un transcrito primario. En general, cualquier sitio que está disponible para la hibridización con un ARNsi que resulta de la división y degradación del transcrito puede utilizarse de acuerdo con la presente invención. No obstante, aquellos expertos en la técnica, apreciarán que, en algunos ejemplos, puede ser deseable seleccionar regiones particulares de transcritos de direccionamiento como objetivos de hibridización ARNsi. Por ejemplo, puede ser deseable evitar secciones de transcritos 69 de direccionamiento que pueden ser divididos con otros transcritos cuya degradación no se desea. En general, se prefieren regiones que codifican y regiones cercanas al extremo 3' del transcrito más que a los extremos 5' . Los ARNsi pueden seleccionarse de acuerdo a una variedad de metodologías: En general, como se mencionó anteriormente, los ARNsi inventivos incluirán preferiblemente una región (la "región inhibidora" o "región doble") que es perfectamente complementaria o sustancialmente complementaria que se encuentra en una porción del transcrito de direccionamiento (la "porción objetivo"), de manera que un híbrido' pueda formarse in vivo entre la hebra antisentido del ARNsi y el transcrito de direccionamiento. Esta región doble o duplo también referida como "región núcleo" se entiende no incluye colgantes, a pesar de que si se presentan las colgantes, pueden también ser complementarias al transcrito de direccionamiento. Preferiblemente, esta región perfectamente o sustancialmente complementaria incluye la mayoría o toda la estructura de hebra doble descrita en las figuras 3, 4 y 5. Se prefiere que la región inhibidora relevante del ARNsi sea perfectamente complementaria con el transcrito de direccionamiento. Sin embargo, los ARNsi que incluyen uno o más residuos no complementarios han demostrado también mediar el silenciamiento, a pesar de la magnitud de la inhibición puede ser menor que la obtenible usando ARNsi con porciones 70 dobles que son perfectamente complementarias con el transcrito de direccionamiento . En general, las no coincidencias en la mitad 3' de la porción doble ARNsi parece resultar en una reducción menor del efecto inhibidor que en las no coincidencias de la mitad 5' de la porción doble del ARNsi . Para propósitos de descripción en la presente, se asumirá que la longitud de una región del núcleo del ARNsi es de 19 nucleótidos, y una secuencia de 19 nucleótidos será referida como N19. Sin embargo, la región del núcleo puede fluctuar en longitud, a partir de 15 hasta 20 nucleótidos. Además, se supone que la región inhibidora N19 del ARNsi se escogerá para que la región del núcleo de la hebra sentido del ARNsi (es decir, la porción que es complementaria al transcrito de direccionamiento) sea perfectamente complementaria al transcrito de direccionamiento, aun cuando como se mencionó anteriormente, pueden tolerarse una o más no coincidencias. En general, es deseable evitar las no coincidencias en la región duplo si se desea que un ARNsi tenga la capacidad máxima para reducir la expresión del transcrito de direccionamiento via la trayectoria clásica. Sin embargo, como se describió anteriormente, puede ser deseable seleccionar un ARNsi que exhibe menos que la capacidad máxima para reducir la expresión del transcrito de direccionamiento, o puede ser deseable para emplear un ARNsi 71 que actúa via la trayectoria alternativa. En tales situaciones, puede ser deseable incorporar una o más no coincidencias en la porción doble del ARNsi. En general, preferiblemente menos que cuatro residuos o alternativamente menos de aproximadamente 15% de los residuos en la región inhibidora no hacen coincidencia con el objetivo. En algunos casos, la secuencia de ARNsi se selecciona tal que la hebra antisentido entera (que incluye la colgante 3' si se presenta) es perfectamente complementaria al transcrito de direccionamiento . Sin embargo, no es necesario que las colgantes sean ya sea complementaria o idéntica al transcrito de direccionamiento. Cualquier secuencia deseada (por ejemplo, üü) puede simplemente ser anexada a los extremos 3' de las regiones núcleo de 19 bp sentido y/o antisentido de un ARNsi para generar colgantes 3' . En general, se emplean las colgantes que contienen una o más pirimidinas, usualmente ü, T o dT. Cuando los ARNsi se sintetizan puede ser más conveniente usar T en lugar de ü, aun cuando el uso de dT en lugar de T puede conferir una estabilidad aumentada. Como 'se indica anteriormente, la presencia de colgantes es opcional y, cuando están presentes, no tienen ninguna relación con la secuencia objetivo. Se observa que puesto que los ARNsi tienen solo un extremo 3' , solamente una colgante 3' simple es posible antes del proceso para formar ARNsi. En resumen, generalmente puede diseñarse un ARNsi para 72 seleccionar cualquier región del núcleo de longitud apropiada, por ejemplo, 19 nt en el transcrito de direccionamiento, y seleccionar un ARNsi que tiene una hebra antisentido cuya secuencia es sustancialmente o perfectamente complementaria a la región del núcleo y una hebra sentido cuya secuencia es complementaria a la hebra antisentido del ARNsi. Las colgantes 3' tales como las descritas anteriormente pueden entonces añadirse a estas secuencias para generar una estructura ARNsi. Asi, no es un requerimiento que la colgante en la hebra antisentido sea complementaria al transcrito de direccionamiento o que la colgante en la hebra sentido corresponda con la secuencia presente en el transcrito de direccionamiento. Se apreciará que, en general, cuando el transcrito de direccionamiento es un ARNm, las secuencias del ARNsi pueden seleccionarse con respecto a la secuencia que corresponde con el ADnc de hebra doble en lugar de la propia secuencia de ARNm, puesto que de acuerdo con la convención de la hebra sentido del ADNc es idéntica al ARNm excepto que el ADNc contiene T en lugar de U. (observe que en el contexto del ciclo de replicación del virus de la influenza, no se genera el ADNc de hebra doble, y el ADNc presente ¦ en la célula es de hebra sencilla y complementaria al ARNm viral) . No todos los ARNsi son igual de efectivos para reducir o inhibir la expresión de cualquier gen objetivo particular (Ver por ejemplo, Holen, T., et al., Nucleic ñcids Res., 73 30 (8) : 1757-1766, que reporta la variabilidad en la eficacia de diferentes ARNsi) y una variedad de consideraciones pueden emplearse para incrementar la probabilidad que un ARNsi seleccionado pueda ser efectivo. Por ejemplo, puede preferirse seleccionar porciones objetivo dentro de los exones en lugar de los intrones. En general, las porciones objetivo cerca del extremo 3' de un transcrito de direccionamiento pueden preferirse a las porciones objetivo cercano al extremo 5' o de en medio de un transcrito de direccionamiento. Los ARNsi pueden diseñarse generalmente de acuerdo con los principios descritos en el boletín técnico # 003 - revisión B, "Oligonucleótidos ARNsi para Aplicaciones ARNi", disponibles de Dharmacon Research, Inc., Lafayette, Co 80026, un proveedor comercial de los reactivos ARN. Los Boletines técnicos #003 (accesibles en la Red Amplia mundial en www. dharcon. com/tech/tech003B .html) y #004 disponible en www. dharmacon. com/tech/tech004.html de Dharmacon contiene una variedad de información relevante a los parámetros de diseño de los ARNsi, síntesis, etc., y se incorporan en la presente por las referencias. Las consideraciones de diseño adicionales que pueden también emplearse se describe en Semizarov, D., Proc. Nati Acad Sci . , Vol. 100, No. 11, pp. 6347-6352. Un aspecto de la presente invención es el reconocimiento que cuando existen cepas múltiples, subtipos, etc. (referidas 74 colectivamente como variantes) , de un agente infeccioso, cuyos genomas varian en secuencia, será frecuentemente deseable seleccionar y/o diseñar ARNsi y ARNsh que se dirijan a regiones que están altamente conservadas entre distintas variantes. En particular, al comparar un número suficiente de secuencias y seleccionar regiones altamente conservadas, será posible dirigir variantes múltiples con un ARNsi simple cuya porción doble incluye tal región altamente conservada. Generalmente, tales regiones deben tener una longitud suficiente para incluir la porción doble total del ARNsi (por ejemplo, 19 nucleótidos) y, opcionalmente, una o más colgantes 3' , a pesar de que pueden usarse también regiones más cortas que las longitud completa del duplo (por ejemplo, 15, 16 , 17 o 18 nucleótidos) . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, una región se conserva favorablemente ente variantes múltiples si ésta es idéntica entre las variantes. De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, una región (de cualquier longitud es para ser incluida en la porción doble del ARNsi, por ejemplo, 15, 16, 17, 18 ó preferiblemente, 19 nucleótidos) se conserva favorablemente si difiere de al menos un nucleótido (es decir, o ó 1 nucleótido) se conserva favorablemente si difiere por más de un nucleótido (es decir, 0 ó 1 nucleótido) entre las variantes. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, tal región se conserva favorablemente entre las múltiples 75 variantes si difiere por más de dos nucleótidos (es decir, 0, ó 2 nucleótidos) entre las variantes. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, una región se conserva favorablemente entre múltiples variantes si difiere por más de tres nucleótidos o (es decir, 0, 1, 2 ó 3 nucleótidos) entre las variantes. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, un ARNsi incluye una porción doble que dirige una región que se conserva favorablemente como mínimo entre 5 variantes, al menos 10 variantes, al menos 15 variantes, al menos 20 variantes, al menos 25 variantes, al menos 30 variantes, al menos 40 variantes, o al menos 50 o más variantes . Para determinar si una región se conserva favorablemente entre un conjunto de variantes múltiples, puede usarse el siguiente procedimiento. ün miembro del conjunto de secuencias se selecciona como la secuencia base, es decir, la secuencia en la cual otras secuencias se comparan. Típicamente, la longitud de la secuencia base será la longitud deseada para la porción doble del ARNsi, por ejemplo, 15, 16, 17, 18, ó, preferiblemente 19 nucleótidos. De acuerdo a diferentes modalidades de la invención, la secuencia base puede ser ya sea una de las secuencias en el conjunto que se compara, o puede ser una secuencia derivada por consenso, por ejemplo, al determinar para cada posición, el nucleótido que se encuentra con mayor frecuencia en la posición, entre las 76 secuencias en el conjunto. Al tener seleccionada una secuencia base, la secuencia de cada miembro del conjunto de variantes múltiples se compara con la secuencia base. El número de diferencias entre la secuencia base y cualquier número de conjuntos de variantes múltiples sobre una región de la secuencia se usa para determinar si la secuencia base y el miembro se conservan favorablemente sobre la región de interés particular. Como se observa arriba, en distintas modalidades de la invención, si el número de secuencias difiere entre las dos regiones es cualquiera 0; 0 ó 1, 0, 1, ó 2; ó 0, 1, 2, ó 3, las regiones se consideran altamente conservadas. En las posiciones en donde se presentan diferencias, la secuencia del ARNsi puede seleccionarse por ser idéntico para la secuencia base o a una de las otras secuencias. Generalmente, se seleccionará el nucleótido presente en la secuencia base. Sin embargo, en ciertas modalidades de la invención, particularmente si un nucleótido presente en una posición particular en una secuencia secundaria en el conjunto que se compara se encuentra en la mayoría de las secuencias que se comparan con el nucleótido en la secuencia base, después la secuencia ARNsi puede seleccionarse por ser idéntica a la secuencia secundaria. Además, de acuerdo con ciertas modalidades de la invención, si el nucleótido de consenso (nucleótido que se presenta comúnmente) en la posición en 77 donde la diferencia presente es diferente a la que se encuentra en la secuencia base, puede usarse el nucleótido de consenso. Observe que esto puede resultar en una secuencia que no es idéntica a cualquiera de las secuencias que se comparan (como puede ser el uso de una secuencia de consenso como la secuencia base) . El ejemplo 1 muestra la selección de las secuencias ARNsi basadas en la comparación de un conjunto de secuencias a partir de las cepas tipo A de la influenza que tienen una hospedera de humano de origen y la comparación de un conjunto de secuencias de siete cepas tipo A de la influenza que tienen hospederas de distinto origen animal (incluyendo el humano) . Se entiende que pueden usarse diferentes métodos para seleccionar las regiones altamente conservadas. Sin embargo, la invención abarca los ARNsi cuyas porciones dobles (y, opcionalmente, cualquiera de las colgantes incluidas en el ARNsi) se seleccionan en base a regiones altamente conservadas que encuentran el criterio proporcionado en la presente, con respecto de cómo se seleccionan las regiones altamente conservadas. También se entiende que la invención abarca los ARNsi dirigidos a las porciones de los transcritos del virus de la influenza que no encuentran el criterio para las regiones altamente conservadas descritas en la presente. A pesar de que tales ARNsi pueden ser menos preferidos que aquellos que son dirigidos a las regiones altamente 78 conservadas, son también inhibidores efectivos de la producción del virus de la influenza para aquellos virus a cuyos transcritos se dirigen. La tabla 1A enlista regiones de 21 nucleótidos que se conservan favorablemente entre un conjunto de las secuencias del virus de la influenza para cada uno de los segmentos del gen viral. Las secuencias en la Tabla 1A se listan en la dirección 5' a 3r de acuerdo a la secuencia presente en el ARNm viral excepto que T se usa en lugar de ü. Los números indican las ubicaciones de las secuencias en el genoma viral. Por ejemplo, PB2-117/137 denota una secuencia que se extiende desde la posición 117 hasta la posición 137 en el segmento PB2. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, para diseñar ARNsi en base a estas secuencias, se seleccionan los nucleótidos 3-21 como las regiones del núcleo de las secuencias de hebra sentido del ARNsi. Una colgante de dos nt 3' que consiste de dTdT se agrega a cada una. Una secuencia complementaria de nucleótidos 1-21 de cada secuencia se selecciona como la hebra antisentido correspondiente. Por ejemplo, para diseñar un ARNsi basado en la secuencia altamente conservada Pa-44/64, es decir, se selecciona AATGCTTCAATCCGATGATTG (SEC ID NO: 22) una región de núcleo de 19 nt que tiene la secuencia TGCTTCAATCCGATGATTG (SEC ID NO:109). Se agregan dos colgantes nt 3' que consisten de dTdT, que resultan (después del reemplazo de T por U) en la 79 secuencia 5' -UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT-3' (SEC ID NO: 79). Esta es la secuencia de la hebra sentido ARNsi. La secuencia de la secuencia de hebra ARNsi antisentido (en la dirección 5' a 3' ) es complementaria a la SEC ID NO: 22, es decir, CAAÜCAUCGGAUUGAAGCAdTdT (SEC ID NO: 80) en donde T ha sido reemplazada por U excepto para la colgante 2 nt 3' , en donde T se reemplaza por d . Las secuencias ARNsi antisentido pueden obtenerse similarmente para cada secuencia listada en la Tabla 1A. Veinte secuencias de ARNsi se listan en la Tabla 2. Cada secuencia listada en la Tabla 1A incluye una región de 19 nt (nt 3-21) y una secuencia 2 nt inicial que no está presente en la hebra sentido del ARNsi correspondiente pero que es complementaria para la colgante 3' de la hebra antisentido del ARNsi. Se apreciará que la región 19 nt puede usarse como la hebra sentido para diseñar una variedad de moléculas ARNsi que tienen diferentes colgantes 3' en cualquiera o ambas hebras sentido y antisentido. Los nucleótidos 3 a 21 en cada una de las secuencias listadas en la Tabla 1A corresponden a las secuencias sentido para las ARNsi, listadas de izquierda a derecha en la dirección 5' a 3' . La secuencia antisentido correspondiente es complementaria con los nucleótidos 1 a 21 de la secuencia listada. La hibridización de las hebras sentido y antisentido que tienen estas secuencias (con la adición de una colgante 80 3' OH para la secuencia de hebra sentido y el reemplazo de T con ü en ambas secuencias) resultando asi en un ARNsi que tiene una región doble de núcleo con 19 pares de bases, cada hebra tiene una colgante 3' OH con 2 nucleotidos. Sin embargo, de acuerdo con la descripción presentada anteriormente, las secuencias presentadas en la tabla 1? pueden usarse para diseñar una variedad de ARNsi que no tienen precisamente esta estructura. Por ejemplo, la secuencia de las colgantes pueden ser variadas, y la presencia de una o ambas colgantes puede no ser esencial para una inhibición efectiva mediada por ARNsi del gen -de expresión. Además, a pesar de que la longitud preferida de la porción doble de un ARNsi puede ser de 19 nucleotidos, pueden ser efectivas porciones dobles más cortas o más grandes. Asi, los ARNsi diseñados de acuerdo con las secuencias altamente conservadas presentadas en la. Tabla 1A pueden incluir solo algunos nucleotidos en la región entre las posiciones 3 y 21 en la hebra sentido del ARNsi. (Observe que cuando la palabra "entre" se sigue por un rango de valores, el rango se toma para incluir los puntos finales) . La tabla IB lista ARNsi adicionales diseñados en base a las regiones altamente conservadas del virus de la influenza. Ambas hebras sentido y antisentido se conocen en una dirección 5f a 3' . Una colgante dTdT 3' se anexa a cada hebra. Los nucleotidos 1 a 19 en cada una de las secuencias de hebra sentido listadas en la tabla IB tiene una secuencia idéntica 81 a una región altamente conservada de un transcrito del virus de la influenza. La secuencia antisentido correspondiente es complementaria a la hebra sentido. Para propósitos de la siguiente descripción, una "región altamente conservada" se refiere a los nucleótidos 3-21 en cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla 1? o los nucleótidos 1-19 de cualquiera de las hebras sentido listadas en la Tabla IB. Estas son las regiones que se presentan en forma de doble hebra en una ARNsi o ARNsh inventivo. Las secuencias de estas regiones son referidas como "secuencias altamente conservadas". La invención proporciona ARNsi que tienen hebras sentido con secuencias que incluyen toda o una porción de las secuencias altamente conservadas listadas en las Tablas 1A y IB. La invención proporciona además ARNsh que tienen porciones sentido con secuencias que incluyen todas o una porción de las secuencias altamente conservadas listadas en las Tablas 1A y IB. Por brevedad, la discusión de abajo describe ARNsi. Sin embargo, se entiende que la invención abarca los ARNsh correspondientes, en donde la porción sentido de los ARNsh incluyen toda o una porción de las secuencias altamente conservadas listadas en las Tablas 1A y IB. Generalmente, la secuencia de la hebra sentido de una ARNsi diseñada de acuerdo con una secuencia altamente 82 conservada presentada en la tabla 1A o la Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente, al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivos y aún más preferiblemente 19 nucleótidos consecutivos de la secuencia listada altamente conservada. Generalmente, la secuencia de la hebra antisentido de un ARNsi diseñado de acuerdo con una secuencia altamente conservada presentada en la Tabla 1A o la Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivo, . y aún más preferiblemente 19 nucleótidos consecutivos que son perfectamente complementarios a una porción de la secuencia de la secuencia listada altamente conservada. Asi, la invención abarca ARNsi que son "desplazados" por 1 o más nucleótidos, por ejemplo, hasta 9 nucleótidos, a partir de las secuencias altamente conservadas en la tabla 1A o la Tabla IB con respecto a la porción del transcrito de direccionamiento con el cual se complementan. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de la hebra sentido de un ARNsi diseñada de acuerdo con una secuencia altamente conservada presentada en la Tabla 1A o Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más 83 preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivos, aún más preferiblemente 19 nucleótidos consecutivos de la secuencia altamente conservada, con un nucleótido diferente de la secuencia listada. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de la hebra antisentido de un ARNsi diseñada de acuerdo con una secuencia altamente conservada presentada en la Tabla 1A o la Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 19 nucleótidos consecutivos que son perfectamente complementarios a una porción de secuencia altamente conservada excepto que puede diferir un nucleótido. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de la hebra sentido de un ARNsi diseñada de acuerdo con una secuencia altamente conservada presentada en la Tabla 1A o la Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivos,. más preferiblemente al menos 19 nucleótidos de la secuencia lista altamente conservada, con dos nucleótidos diferentes de la 84 secuencia litada. En ciertas modalidades de la invención, la secuencia de la hebra antisentido de un ARNsi diseñada de acuerdo con una secuencia altamente conservada presente en la Tabla 1A o Tabla IB incluirá al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 17 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 19 nucleótidos que son perfectamente complementarios con la secuencia altamente conservada, excepto que dos nucleótidos pueden diferir . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARNsi incluye una porción doble que está altamente conservada entre las variantes que infectan naturalmente organismos de al menos dos especies diferentes. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARNsi incluye una porción doble que está altamente conservada entre variantes que originan en organismos al menos dos especies diferentes. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARNsi incluye una porción doble que se conserva favorablemente entre variantes que originan en los organismos al menos tres diferentes especies, o al menos cinco especies diferentes. Las especies pueden incluir humana, equino (caballo) , aves (por ejemplo, pato, pollo), porcinos y otros. En ciertas modalidades preferidas de la invención, las especies incluyen 85 humanos. En el caso de muchos agentes infecciosos, por ejemplo, numerosos subtipos A de la influenza identificada previamente, se conoce la capacidad del subtipo para infectar una hospedera de una especie en particular. Además, se conocen las especies de origen de numerosos subtipos de influenza reflejados en los nombres de los subtipos. Un experto en la técnica será capaz de determinar si un agente infeccioso infecta naturalmente cualquiera de las especies hospederas particulares y/o para determinar las especies de origen del agente ya sea revisando la literatura o de acuerdo con los métodos que han sido usados por los subtipos del virus A de la influenza. Puede ser deseable también seleccionar variantes que son aisladas en diferentes años y/o variantes que expresan diferentes subtipos de NA y HA. Por ejemplo, las variantes usadas para seleccionar las secuencias altamente conservadas para las porciones doble de ARNsi/ARNsh descritas en el Ejemplo 1 incluyen variantes aisladas de humanos asi como una amplia variedad de una fuente -animal diferente. Las variantes incluyen virus aislados en diferentes años e incluyen virus que expresan casi todos los subtipos de HA y NA conocidos. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el agente infeccioso es un agente cuyo genoma comprende segmentos de ácidos nucleicos independientes múltiples, por ejemplo, segmentos de ARN independientes múltiples. 86 Generalmente, la porción doble incluye al menos 10 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 12 nucleótidos consecutivos, más preferiblemente al menos 15 nucleótidos consecutivos que están conservados favorablemente entre múltiples variantes. Preferiblemente la porción doble incluye al menos 17 nucleótidos consecutivos que están conservados favorablemente entre las variantes múltiples. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, la porción doble incluye 19 nucleótidos consecutivos que están conservados favorablemente entre las variantes múltiples. Además de la porción doble, el ARNsi puede incluir una colgante 3' en una o más hebras. Una colgante en la hebra sentido del ARNsi puede (pero de acuerdo a ciertas modalidades de la invención no ser) idénticas a las secuencias presentes en el transcrito 3' objetivo de la región objetivo. Una colgante en la hebra antisentido del ARNsi puede (pero de acuerdo a ciertas modalidades de la invención no necesariamente) ser complementaria a los nucleótidos inmediatamente en la 5' de la porción objetivo del transcrito de direccionamiento . Las colgantes pueden ser 1 nucleótido, 2 nucleótidos, o más en longitud como se describe en otra parte en la presente. Un experto en la técnica apreciará que el ARNsi puede exhibir un rango de temperaturas de fusión (Tm) y temperaturas de disociación (Td) de acuerdo con los 87 principios anteriores. La Tm se define como la temperatura a la cual el 50% de un ácido nucleico y su perfecto complemento forman un duplo en la solución, mientras que el Td se define como la temperatura a una concentración particular de la sal, y la concentración de la hebra total en la que el 50% de un oligonucleótido y su complemento de enlace de filtro perfecto forman un duplo, relacionadas en situaciones en las cuales una molécula se inmoviliza en un filtro. Ejemplos representativos de Tm aceptables pueden determinarse fácilmente usando métodos bien conocidos en la técnica, ya sea experimentalmente o usando ecuaciones apropiadas derivadas de la teoría o empíricamente, basadas en las secuencias ARNsi descritas en los ejemplos, aquí. Una forma común para determinar la Tm actual es para usar una célula en termostato en un espectrofotómetro de UV. Si la temperatura se gráfica contra la absorbancia, se observará una curva en forma de S con dos mesetas. La lectura de la absorbancia a la mitad de la meseta corresponde a la Tm. La ecuación más simple para Td es la regla de Wallace: Td = 2 (A+T) +4 (G+C) Wallance, R. B., Shaffer, J. , Murphy, R.F., Bonner, J.; Hirose, T.; Itakura, K. Nuciere Acids Res. 6, 3543 (1979) . La naturaleza de la hebra objetivo inmovilizada proporciona una disminución neta en la Tm observada en relación con el valor cuando ambos objetivos y sondas se encuentran libres en la solución. La magnitud de la 88 disminución es aproximadamente de 7-8 °C. Otra ecuación útil para el ADN que es válida para las secuencias más extensas que 50 nucleótidos de un pH 5 a 9 dentro de valores apropiados para la concentración de cationes monovalentes, es : Tm = 8.15 + 16.6 log M + 41 (XG+XC) -500/L - 0.62F, en donde M es la concentración molar de los cationes monovalentes, XG y XC son las fracciones molares de G y C en la secuencia, L es la longitud de la hebra más corta en el duplo, y F es la concentración molar de la formamida (Howley, P. M; Israel, M.F.; Law, -F. ; Martin, M.A., J. Biol. Chem. 254, 4876) . Ecuaciones similares para el ARN son: Tm= 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8 (XG+XC) 2-820/L-0.35 F y para los híbridos ADN-ARN: Tm = 79.8 + 18.5 log M + 58.4 (XG+XC) + 11.8 (XG+XC) 2-820/L-O .5 F. Estas ecuaciones se derivan de híbridos objetivo inmovilizados. Varios estudios han derivado en ecuaciones exactas para Tm usando un conjunto de bases termodinámicas para interacciones vecinas más cercanas. La ecuación para el ADN o el ARN es: Tm = (1000??)/? + AS + Rln(Ct/4)- 273.15 + 16.6 Ln [Na+] , en donde ?? (Kcal/mol) es la suma de los cambios de entalpia vecina más cercana para los híbridos, A (eu) es una constante que contiene correcciones para la iniciación de la hélice, AS (eu) es la suma de los cambios de entropía vecina más cercana, R es la constante del Gas (1.987 cal deg-1 mol-1) y Ct es la concentración molar total de hebras-. Si la hebra es 89 autocomplementaria, Ct/4 se reemplaza por Ct. Los valores para los parámetros termodinámicos están disponibles ¦ en la literatura. Para ADN ver Breslauer, et al., Proc. Nati Acad Sel. USA 83, 3746-3750, 1986. Para el ARN: ADN duplo ver Sugimoto, N . , et al, Biochemistry, 34(35): 11211-6, 1995. Para el ARN ver Freier, S.M., et al., Proc. Nati Acad Sci. 83, 9373-9377, 1986. Rychlik, W., et al., Nucí. Acids Res. 18(21), 6409-6412, 1990. Distintos programas de computadora para calcular Tm se encuentran ampliamente disponibles. Ver por ejemplo, el sitio de Red que tiene : URL www. asic . nwu . edu/biotools/oligocalc . html . Ciertos AR si hibridizan en un sitio objetivo que incluye o consiste completamente de secuencias ÜTR 3' . Tales ARNsi pueden tolerar un gran número de coincidencias en el duplo ARNsi/plantilla, y particularmente pueden tolerar no coincidencias dentro de un región central del duplo. Por ejemplo, una o ambas hebras pueden incluir uno o más nucleótidos "extra" que forman una protuberancia como se muestra en la figura. Típicamente, la extensión de perfecta complementariedad tiene al menos 5 nucleótidos en longitud, por ejemplo, 6, 7, o más nucleótidos en longitud, mientras las regiones de no coincidencias pueden ser por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4 nucleótidos en longitud. Cuando se produce una hibridización con el transcrito de direccionamiento tal como el ARNsi, se incluyen frecuentemente dos extensiones de 90 complementariedad perfecta separadas por una región de no coincidencia. Es posible una variedad de estructuras. Por ejemplo, el ARNsi puede incluir áreas múltiples de no identidad (no coincidencia) . Las áreas de no identidad (no coincidencia) no necesitan ser simétricas, es decir, no se requiere que tanto el objetivo como el ARNsi incluyan nucleótidos no apareados. Puede ser deseable que existan algunas no coincidencias, como la formación doble ARNsi/plantilla en la 3' , la UTR puede inhibir la expresión de una proteina codificada por la plantilla del transcrito mediante un mecanismo relacionado pero distinto al de la inhibición del ARN clásica. En particular, existe la evidencia que sugiere que el ARNsi que se enlaza a la 3' , la UTR de una plantilla del transcrito puede reducir la traducción del transcrito en lugar de disminuir su estabilidad. Específicamente, como se muestra en la figura 6, la enzima DICER que genera ARNsi en el sistema Drosophila discutido anteriormente y también en una variedad de organismos, se conoce por tener la capacidad para procesar un substrato de ARN temporal pequeño (ARNt) dentro de un agente inhibidor que, cuando se enlaza dentro del 3' UTR de un transcrito de direccionamiento, bloquea la traducción del transcrito (ver Grishok, A., et al., Cell 106, 23-24, 2001; Hutvagner, G., et al., Science, 293, 834-838, 2001; Ketting, R., et al., Genes Dev. , 15, 2654-2659). Para los propósitos 91 de la presente invención, cualquier ARN corto de doble hebra parcialmente o completamente como se describe en la presente, una hebra que se enlaza a un transcrito de direccionamiento que reduce su expresión (es decir, reduce el nivel del transcrito y/o reduce la síntesis del polipéptido codificado por el transcrito) se considera que es un ARNsi, sin tener en cuanta si el ARN se conduce activando la degradación, mediante la inhibición de la traducción o mediante otros medios. En ciertas modalidades preferidas de la invención, reducir la expresión de los transcritos involucra la degradación del transcrito. Además, cualquier estructura precursora (por ejemplo un ARN de horquilla corta, como se describe en la presente) que puede ser procesada in vivo (es decir, dentro de una célula u organismo) para generar tal ARNsi útil en la práctica de la presente invención. Los expertos en la técnica apreciarán simplemente que los agentes que inducen ARNi inventivo pueden prepararse de acuerdo a cualquier técnica disponible que incluye, pero no se limita a la síntesis química, enzimática o desdoblamiento químico in vivo o in vitro, o transcripción de las plantillas in vivo o in vitro. Como se nota anteriormente, los agentes que inducen ARN inventivo pueden suministrarse como una molécula de ARN simple que incluye porciones auto complementarias (es decir, un ARNsh que puede procesarse intracelularmente para producir un ARNsi) , o como dos hebras 92 hibridizadas entre si. Por ejemplo, pueden generarse dos hebras de ARN de 21 nt separadas, que contiene cada una una región 19 nt complementaria a la otra, y las hebras individuales pueden hibridizarse al mismo tiempo para generar una estructura tal como la que se describe en la figura 5A. Alternativamente, cada hebra puede generarse mediante la transcripción de un promotor, ya sea in vitro o in vivo. Por ejemplo, puede proporcionarse un constructo que contiene dos regiones transcribibles separadas, que contiene cada una un transcrito de 21 nt que contiene una región 19 nt complementaria con la otra. Alternativamente, puede utilizarse un constructo simple que contienen promotores opuestos Pl y P2 y terminaciones ti y t2 colocadas de manera que los dos transcritos diferentes, cada uno de los cuales es al menos parcialmente complementario al otro, sean generados como se indican en la figura 7. En otra modalidad, un agente que induce ARN inventivo se genera como un transcrito simple, por ejemplo, mediante la transcripción de una unidad de la transcripción simple que codifica regiones autocomplementarias . La figura 8 describe tal modalidad de la presente invención. Como se indicó, se emplea una plantilla que incluye una primera y segunda regiones complementarias, y que incluye opcionalmente una región de rizo. Tal plantilla puede ser utilizada para la transcripción in vitro o in vivo, con una selección apropiada 93 del promotor (y opcionalmente otros elementos reguladores, por ejemplo, terminador) . La presente invención abarca los constructor que codifican a una o más hebras ARNsi. La transcripción in vítro puede realizarse usando una variedad de sistemas disponibles que incluyen los sistemas promotor T7, SP6 y T3/polimerasa (por ejemplo, aquellos disponibles de Promega, Clontech, New England Biolabs, etc) . Como se apreciará por un experto en la técnica, el uso de los promotores T7 o T3 requieren típicamente una secuencia de ARNsi que tiene dos residuos G en el extremo 5' y aun cuando el uso del promotor SP6 requiere típicamente una secuencia ARNsi que tiene una secuencia GA en su extremo 5' . Los vectores que incluyen el promotor T7, SP6 o T3 son bien conocidos en la técnica y pueden modificarse fácilmente para dirigir la transcripción del ARNsi. Cuando el ARNsi se sintetiza in vitro pueden dejarse hibridizar antes 'de la transfección o suministro a un sujeto. Se entiende que las composiciones ARNsi inventivo no necesita consistir completamente de moléculas de hebra doble (hibridizadas) . por ejemplo, las composiciones del ARNsi pueden incluir una porción pequeña de ARN de hebra simple. Esto puede ocurrir, por ejemplo, como resultado del equilibrio entre las moléculas hibridizadas y no hibridizadas, debido a relaciones desiguales de hebras de ARN antisentido y sentido o, debido a la terminación transcripcional previo a la síntesis de ambas 94 porciones de un ARN autocomplementario, etc. Generalmente, las composiciones preferidas comprenden al . menos aproximadamente 80% de ARN de hebra doble, al menos aproximadamente 90% de ARN de hebra doble, al menos aproximadamente 95% de ARN de hebra doble, o incluso al menos aproximadamente 99-100% de ARN de hebra doble. Sin embargo, las composiciones de ARNsi pueden contener menos del 80% de ARN hibridizado siempre y cuando contengan suficiente ARN de hebra doble para ser efectivas. Los expertos en la técnica apreciarán que, cuando los agentes de ARNsi o ARNsh inventivos van a ser generados in vivo, es generalmente preferible que se produzcan via la transcripción de una o más unidades de transcripción. El transcrito principal puede ser procesado opcionalmenté (por ejemplo, mediante una o más enzimas celulares) para generar el agente final que realiza la inhibición del gen. Se apreciará además, que el promotor apropiado y/o elementos reguladores pueden seleccionarse fácilmente para permitir la expresión de las unidades de trascripción relevantes en las células de mamíferos. En algunas modalidades de la invención, puede ser deseable utilizar un promotor regulable; en- otras modalidades, puede desearse una expresión constitutiva. Se observa que el término "expresión" como se usa en la presente con respecto a la síntesis (transcripción) de los precursores ARNsi o ARNsh no implica la traducción del ARN transcrito. 95 En ciertas modalidades de la invención, el promotor utilizado para dirigir la expresión in vivo de una o más unidades de transcripción ARNsi o ARNsh es un promotor para la polimerasa III (pol III) del ARN. La pol III dirige la síntesis de transcritos pequeños que termina al encontrar un residuo de 4 a 5 T de extensión en la plantilla. Ciertos promotores Pol III tales como los promotores U6 o Hl no requieren elementos reguladores que actúan con cis (de otra manera a la del primer nucleótido transcrito) dentro de la región transcrita y que por lo tanto se prefiere de acuerdo a ciertas modalidades de la invención puesto que permite fácilmente la selección de las secuencias de ARNsi deseadas. En el caso de los promotores U6 que se presenta naturalmente el primer nucleótido transcrito es guanosina, mientras que en el caso de los promotores Hl que se presentan naturalmente el el primer nucleótido transcrito es adenina. (ver, por ejemplo, Yu, J., et al., Proc. Nati Acad Sci. , 99(9), 6047-6052 (2002); Sui, G . , et al., Proc. Nati Acad Sci. 99(8), 5515-5520 (2002) ; Paddison, P., et al., Genes and Dev., 16, 948-958 (-2002); Brummelkamp, . , et al., Science, 296, 550-553 (2002); Miyagashi, M. y Taira, K. , Nat. Biotech. , 20, 497-500 (2002); Paul, C, et al., Nat. Biotech., 20, 505-508 (2002); Tuschl, T . , et al., Nat. Biotech., 20, 446-448 (2002). Asi, en ciertas modalidades de la invención, por ejemplo, cuando la transcripción se conduce mediante un promotor U6, el 96 nucleótido 5 de las secuencias ARNsi preferidas es G. En ciertas modalidades de la invención, por ejemplo, cuando la transcripción se conduce mediante un promotor Hl, el nucleótido 5' puede ser A. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, los promotores para Pol III pueden usarse también como se describe por ejemplo, en Xia, H., et al., Wat. Bíotechnol. , 20, pp. 1006-1012, 2002. Como se describe en la presente, pueden emplearse constructos en los cuales una secuencia de horquilla se yuxtapone dentro de la proximidad cercana a un sitio de partida de transcripción seguido por un cásete poliA, resultando en colgantes mínimos o ningunos colgantes en la horquilla transcrita. En ciertas modalidades de la invención, pueden usarse promotores Pol II específicos de tejido, específicos de células o inducibles, siempre y cuando se reúnan los requerimientos anteriores. Además, en ciertas modalidades de la invención, pueden usarse los promotores Pol I como se describe por ejemplo, en (McCo n 2003) . Se apreciará que la expresión in vivo de los constructos que proporcionan plantillas para la síntesis de los ARNsi, ARNsh tales como los descritos en las figuras 7 y 8 pueden realizarse deseablemente mediante la introducción de los constructos dentro de un vector, tal como por ejemplo, un plásmido de ADN o vector viral, e introducir el vector dentro de células de mamíferos. Pueden seleccionarse cualquiera de 97 una variedad de vectores, aun cuando en ciertas modalidades puede ser deseable seleccionar un vector que puede suministrar el constructo (s) en una o más células que son susceptibles a la infección del virus de la influenza. La presente invención abarca los vectores que contienen unidades de transcripción ARNsi y/o ARNsh, asi como células que contienen tales vectores o por el contrario, diseñadas para contener unidades de transcripción que codifican una o más hebras ARNsi o ARNsh. En ciertas modalidades preferidas de la invención, los vectores inventivos son vectores de terapia de gen apropiados para el suministro de un constructo que expresa ARNsi o ARNsh en células de mamíferos (por ejemplo, células de un mamífero domesticado) , y más preferiblemente células de humano. Tales vectores pueden administrarse a un sujeto antes o después de exponerse a un · virus de la influenza, para proporcionar la profilaxis o el tratamiento para las enfermedades y condiciones provocadas por la infección con el virus. Los vectores que inducen ARNi de la invención pueden suministrarse en una composición que comprende cualquiera de una variedad de agentes de suministro como se describe adicionalmente abajo. Por consiguiente, la invención proporciona una variedad de vectores virales y no virales cuya presencia dentro de una célula resulta en la transcripción de uno o más ARNs que se autohibridizan o hibridizan entre sí para formar un ARNsi o 98 ARNsh que inhibe la expresión de al menos un transcrito del virus de la influenza en la célula. En ciertas modalidades de la invención, dos hebras ARNsi complementarias separadas se transcribieron usando un vector de señal que contienen dos promotores, cada uno de los cuales dirige la transcripción de un hebra de ARNsi simple, es decir, se enlaza operablemente a una plantilla del ARNsi de forma tal que se presente la transcripción. Los dos promotores pueden estar en la misma orientación, en cuyo caso, cada uno se enlaza operablemente a una plantilla de una hebra ARNsi. Alternativamente, los promotores pueden estar en orientación opuesta que flanquea a una plantilla simple de manera que la transcripción de los promotores resulte en la síntesis de dos hebras de ARN complementarias . En otras modalidades de la invención, se emplea un vector que contiene un promotor que dirige la transcripción de una molécula de ARN simple, que comprende dos regiones complementarias (por ejemplo, un ARNsh) . En ciertas modalidades de la invención, se usa un vector que contienen promotores múltiples, cada uno dirige la transcripción de una molécula de ARN simple, que comprende dos regiones complementarias. Alternativamente, pueden transcribirse múltiples ARNsh diferentes, ya sea a partir de un promotor simple o de promotores múltiples. Es posible una variedad de configuraciones. Por ejemplo, un promotor simple puede 99 dirigir la síntesis de un transcrito de ARN simple que contiene múltiples regiones autocomplementarias, cada una' de las cuales puede hibridizarse para generar una pluralidad de estructuras troncal-rizo . Estas estructuras pueden ser desdobladas in vivo, por ejemplo, mediante DICER, para generar múltiples ARNsh diferentes. Se apreciará que tales transcritos contienen preferiblemente una señal de terminación en el extremo 3' del transcrito, pero no entre las unidades ARNsh individuales. Se apreciará también que los ARNs simples a partir de los cuales los ARNsi múltiples pueden generarse no necesitan ser producidos in vivo, pero en su lugar pueden sintetizarse o producirse usando una transcripción in vitro siempre y cuando sea exógeno. En otra modalidad de la invención, el vector incluye promotores múltiples, cada uno de los cuales dirige la síntesis de una molécula de ARN autocomplementaria que se hibridiza para formar un ARNsh. Los ARNsh múltiples pueden todos dirigir al mismo transcrito, o pueden dirigir diferentes transcritos. Cualquier combinación de transcritos virales puede ser dirigida. El ejemplo 11 proporciona detalles del diseño y prueba de los ARNsh transcritos a partir de vectores de ADN para la inhibición de la infección del virus de la influenza en ciertas modalidades de la invención. Ver también la figura 21. En general, de acuerdo a ciertas modalidades de la invención, los ARNsi y/o ARNsh 100 expresados en la célula incluyen una región (duplo) de pares base de aproximadamente 19 nucleótidos de largo. Los expertos en la técnica apreciarán además que la expresión in vivo de los ARNsi y ARNsh de acuerdo a la presente invención, pueden permitir la producción de células que producen los ARNsi o ARNsh durante periodos amplios de tiempo (por ejemplo, mayores a unos pocos días, preferiblemente al menos varias semanas a meses, más preferiblemente al menos un año o más, posiblemente una vida) . Tales células pueden protegerse del virus de la influenza indefinidamente . Los vectores virales preferidos para usarse en las composiciones para proporcionar la expresión intracelular de ARNsi y ARNsh incluyen, por ejemplo, vectores retrovirales y vectores lentivirales . Ver por ejemplo, Kobinger, G.P., et al., Nat Biotechnol 19 (3) :225-30, 2001, que describe un vector basado en un Filovirus que incluye un vector de VIH de de una proteina seudotipo, que transduce eficientemente el epitelio de las vias aéreas de la superficie apical. Ver también Louis, C . , et al., Science, 295:868-872, Feb. 1, 2002, que describe el vector lentiviral FUGW; Somia, N., et al. J. Virol. 74 (9) : 4420-4424, 2000; Miyoshi, H., et al., Science 283:682-686, 1999; y la patente de los E.ü. 6,013,516. ; En ciertas modalidades de la invención, el vector es un vector lentiviral cuya presencia dentro de una célula -resulta 101 en la transcripción de uno o más ARNs que se autohibridizan o hibridizan entre si para formar un ARNsi o ARNsh que inhibe la expresión de al menos un transcrito en la célula. Para propósitos de la descripción, se asumirá que el vector es un vector lentiviral tal como el que se describe en Rubinson, D., et al, Nature Genetics, Vol. 33, pp. 401-406, 2003. Sin embargo, se entiende que pueden usarse también otros vectores retrovirales o lentivirales . De acuerdo a varias modalidades de la invención, el vector lentiviral puede ser ya sea un plásmido de transferencia lentiviral o una partícula lentiviral, por ejemplo, un lentivirus capaz de infectar células . En ciertas modalidades de la invención, el vector lentiviral incluye un segmento de ácidos nucleicos enlazado operablemente a un promotor, para que la transcripción del promotor (es decir, la transcripción dirigida por el promotor) resulta en la síntesis de un ARN que comprenden regiones complementarias que hibridizan para formar un ARNsh dirigido al transcrito de direccionamiento . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARNsh comprende una región de pares base de aproximadamente 19 nucleótidos de largo. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARN puede comprender más de 2 regiones complementarias, para que la autohibridización resulte en regiones de pares base múltiple, separada por rizos o regiones de hebra simple. Las regiones de pares base pueden tener secuencias diferentes o idénticas 102 y por consiguiente, ser dirigidas a una región igual o distinta de un transcrito simple o transcritos diferentes. En ciertas modalidades de la invención, el vector lentiviral incluye un segmento de ácidos nucleicos flanqueado por dos promotores en orientación opuesta, en donde los promotores se enlazan operablemente al segmento de ácidos nucleicos, de manera que la transcripción de los promotores resulte en la síntesis de dos ARNsi complementarios que hibridizan entre sí para formar un ARNsi dirigido al transcrito de direccionamiento . De acuerdo a cierta modalidades de la invención, el ARNsi incluye una región de pares base de aproximadamente 19 nucleótidos de largo. En ciertas modalidades de la invención, el vector lentiviral comprende al menos dos promotores y al menos dos segmentos de ácidos nucleicos, en donde cada promotor se enlaza operablemente a un segmento de ácidos nucleicos, de manera que la transcripción de los promotores resulte en la síntesis de dos ARNs complementarios que hibridizan entre sí para formar un ARNsi dirigido al transcrito de direccionamiento. Como se mencionó anteriormente, los vectores lentivirales pueden ser plásmidos de transferencia lentiviral o partículas lentivirales infecciosas (por ejemplo, un lentivirus o lentivirus de pseudotipo) . Ver por ejemplo, la patente de los E.U. número 6,013,516 y las referencias 113-117 para una discusión adicional de los plásmidos de 103 transferencia lentiviral, partículas lentivirales y sistemas de expresión lentiviral. Como se conoce en la técnica, los lentivirus tienen un genoma de ARN. Por lo tanto, cuando un vector lentiviral es una partícula lentiviral, por ejemplo, un lentivirus infeccioso, el genoma viral debe experimentar una transcripción inversa y una síntesis de hebra secundaria para producir ADN capaz de dirigir la transcripción del ARN. Además, cuando se hace referencia aquí en los elementos tales como promotores, elementos reguladores, etc., Será entendido que las secuencias de estos elementos que están presentes en el ARN forman partículas lentivirales de la invención' y que están presentes en el ADN forman plásmidos de transferencia lentiviral de la invención. Adicionalmente, cuando una plantilla para la síntesis de un ARN está "proporcionada por" ARN presente en una partícula lentiviral, se entiende que el ARN debe experimentar una transcripción inversa y una síntesis de hebra secundaria para producir ADN que puede servir como una plantilla para la síntesis del ARN (transcripción) . Los vectores que proporcionan plantillas para la síntesis de ARNsi o ARNsh son consideradas para proporcionar el ARNsi o ARNsh cuando se introducen dentro de las células en las cuales se presenta la síntesis. Los ARNsi o ARNsh inventivas pueden introducirse dentro de las células mediante cualquier método disponible. Por ejemplo, los ARNsi, ARNsh o vectores que los codifican pueden 104 introducirse dentro de células vía la transformación convencional o técnicas de transfección . Como se usa en la presente, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir el ácido nucleico (por ejemplo, el ADN o ARN) dentro de la célula, que incluye la co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE dextrano, lipofección, inyección o electroporación . Como se describió abajo, un aspecto de la invención incluye el uso de una variedad de agentes de suministro para introducir ARNsi, ARNsh y o vectores (ya sea vectores ADN o vectores virales) que proporcionan una plantilla para la síntesis de un ARNsi o ARNsh dentro de células que incluyen, pero no se limitan a, polímeros cationicos, varios transportadores moleculares de polipéptidos que incluyen péptidos ricos en arginina, péptidos ricos en histidina y lipidos neutrales y cationicos, varios polímeros no cationicos, liposomas, carbohidratos y materiales tensoactivos . La invención abarca también el uso de agentes de suministro que han sido modificados en cualquiera de una variedad de formas, por ejemplo, mediante la adición de una porción que mejora el suministro del agente de suministro, como se describe abajo. La presente invención abarca cualquier célula manipulada para contener un ARNsi, ARNsh inventivo, o vector que 105 proporciona una plantilla para la síntesis de un ARNsi o ARNsh inventivo. Preferiblemente, la célula es una célula de un mamífero, particularmente de humano. Preferiblemente, la célula es una célula epitelial respiratoria. Opcionalmente, tales células contienen también ARN de virus de influenza. En algunas de las modalidades de la invención, las células son células no humanas dentro de un organismo. Por ejemplo, la presente invención abarca animales transgénicos diseñados para contener o expresar los ARNsi o ARNsh inventivos. Tales animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de los ARNsi y ARNsh inventivos, y/o para estudiar el sistema de infección/replicación del virus de la influenza. Como se usa en la presente, un "animal transgénico" es un animal no humano en el cual uno o más de las células del animal incluyen un transgen. Un transgen es un ADN exógeno o un reordenamiento, por ejemplo, una eliminación del ADN cromosomal endógeno, que se integra preferiblemente en o se presenta en el genoma de las células de un animal transgénico Un transgen puede dirigir la expresión de un producto del ARNsi codificado en una o más tipos celulares o tejidos del animal transgénicos. Los animales transgénicos preferidos son mamíferos no humanos, preferiblemente roedores tales como ratas o ratones. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, ovejas, perros, vacas, cabra, aves tales como pollos, anfibios y similares. De acuerdo 106 ciertas modalidades de la invención, el animal transgénico es un variedad usada como un modelo animal (por ejemplo, murina, hurón o primate) para probar los terapéuticos de la influenza potencial . III. Inhibición Amplia de la Acumulación del ARN viral Una característica general de la inhibición mediada por ARNi de la expresión del gen es su especificidad. En otras palabras, el ARNsi dirigido a una secuencia del transcrito particular no resulta típicamente en la degradación de otros transcritos. Sin embargo, como se describe en el Ejemplo 6, los inventores han descubierto que el ARNsi dirigido a los transcritos NP, PA, o PBl resulta también en niveles reducidos de otros ARN virales, que incluyen ARNs que tienen secuencias no relacionadas para la secuencia NP o AP. Además, como se muestra en el Ejemplo 5, aun cuando parece probablemente que el objetivo directo del ARNsi es un ARNm viral, la administración de ARNsi dirigida a NP, PA inhibe la acumulación del ARNv correspondiente y al ARNc además de inhibir la acumulación del ARNm en NP o PA. Como se muestra en el Ejemplo 7, estos efectos no se deben a la respuesta del interferón o a la degradación mediada por el virus de los transcritos virales. Además, el efecto fue específico para los transcritos virales puesto que hubo poco o nulo efecto en una variedad de transcritos celulares. Los mecanismos potenciales que pueden mediar este efecto se discuten en el 107 Ejemplo 6. Sin tener en cuenta el mecanismo exacto, estos resultados demuestran que la administración de un ARNsi dirigida a un segundo transcrito puede, bajo ciertas condiciones, afectar también a un primer transcrito o transcritos al cual el ARNsi no se dirige, que incluye por ejemplo, un primer transcrito que carece de identidad u homología significativa para el transcrito secundario. En particular, esto puede presentarse cuando la proteína codificada por el transcrito secundario (o, potencialmente, el mismo transcrito) se involucra en la síntesis, proceso, o estabilidad del primer transcrito. Así, la invención proporciona un método para inhibir un primer transcrito que comprende administrar un ARNsi dirigido a un segundo transcrito, en donde la inhibición del segundo transcrito resulta en la inhibición del primer transcrito. En general, el primer y segundo transcritos no son idénticos y no homólogos al menos sobre la porción del segundo transcrito que se dirige. Sin embargo, en varias modalidades de la invención, el primer y segundo de los transcritos puede compartir una región de homología o identidad sobre la porción del segundo transcrito que se dirige (por ejemplo, una porción que corresponde a una porción doble de 19 nucleótidos del ARNsi) . Si el ARNsi no incluye una región de identidad para el primer transcrito de al menos 5 nucleótidos consecutivos, entonces el ARNsi no se dirige al primer 108 transcrito. En general, el ARNsi dirigido al segundo transcrito no se dirige al primer transcrito. Si existe una región compartida de homología de identidad, tal región puede, pero no necesariamente, incluir toda o parte de la secuencia objetivo. Los transcritos secundarios apropiados (transcritos de direccionamiento) incluyen aquellos que codifican proteínas tales como proteínas que enlazan ARN o cualquier proteína que juega un papel importante en la estabilización del ARN. En general, la palabra "inhibición" se refiere a una reducción en el nivel o cantidad del transcrito. Sin embargo, también se incluyen otros mecanismos de inhibición. El método de inhibición puede ser ya sea directo o indirecto. Como se discutió además en el ejemplo 6, mientras no se desee ligar cualquier teoría, los inventores sugieren que la capacidad de los transcritos dirigidos al NP provocan niveles reducidos de la acumulación de los genes ARNm, ARNv, y ARNc de los transcritos de los genes NS, M, NS, PB1, PB2 y PA es probablemente un resultado de la importancia de la proteína NP de enlazar y estabilizar estos transcritos, y no debido a la degradación no específica del ARN de los objetivos ARNsi NP-específicos . Además, aún cuando no se desea . ligar cualquier teoría, los inventores sugieren que la capacidad de los transcritos dirigidos al PA provocan niveles reducidos de acumulación de ARNm, ARNv, y ARNc de los transcritos de los genes NA, M, NS, PBl, PB2 y PA, es probablemente un resultado 109 de la importancia de la proteina pA en la síntesis de los transcritos virales, y no debido a la degradación no específica del ARN de los objetivos ARNsi PA-específicos . En presencia del ARNsi de PA-específicos, se degrada el ARNm del PA recientemente transcrito, que resulta de la inhibición de la síntesis de la proteína PA. A pesar de la presencia de aproximadamente 30 a 60 copias de la proteína PA (transcriptasa ARN) por virión de la influenza (1), sin la proteina PA sintetizada recientemente, se inhibe probablemente la replicación y transcripción viral adicional. Se cree que la capacidad de ciertos ARNsi para provocar una reducción en los niveles de los transcritos a los que no son específicamente dirigidos, no ha sido demostrada en otros sistemas . Los inventores han reconocido que los transcritos de direccionamiento que codifican proteínas que juegan un papel importante para estabilizar otras moléculas de ARN o para sintetizar ARN pueden preferirse como objetivos para inhibir el crecimiento, replicación, infectividad, etc., de un agente infeccioso. Así, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento, infectividad, o replicación de un agente infeccioso que comprende administrar un ARNsi dirigido a un transcrito de direccionamiento, en donde la inhibición del transcrito de direccionamiento da como resultado la inhibición de al menos otro transcrito, en donde el otro 110 transcrito tiene un agente especifico. El transcrito de direccionamiento puede, pero no necesariamente ser, un transcrito de agentes especificos. Al menos otro transcrito puede, pero no necesariamente, compartir una región de homología o identidad con el transcrito de direccionamiento. Si existe una región homologa o identidad compartida, tal región puede, pero no necesariamente, incluir parte o toda la secuencia objetivo. Los transcritos de direccionamiento apropiados incluyen aquellos que codifican proteínas tales como proteínas que enlazan ARN o cualquier otra proteína que juega un papel importante para estabilizar al ARN. Los transcritos de direccionamiento apropiados incluyen también aquellos que juegan un papel importante en la síntesis o proceso del ARN, por ejemplo, polimerasa, transcriptasas inversas, etc. Los resultados descritos en la presente sugieren que, en general, los ARNsi dirigidos a los transcritos que codifican proteínas que enlazan ARN o ADN que enlazan normalmente ácidos nucleicos de agentes específicos (ADN o ARN) tienen probablemente amplios efectos (por ejemplo, efectos en otros transcritos de agentes específicos) más bien que la simple reducción en el nivel del ARN dirigido. De igual manera, los resultados descritos en la presente sugieren que, en general, los ARNsi dirigidos a los genes de polimerasa (polimerasa de ARN, polimerasa de ADN, o transcriptasa inversa) de agentes 111 infecciosos tienen probablemente amplios efectos (por ejemplo, efectos en otros transcritos de agentes específicos) más bien que la simple reducción en el nivel del ARN de polimerasa. El direccionamiento de transcritos que codifiquen a las proteínas que estabilizan específicamente los ARNs del agente infeccioso más que aquellos de las células hospederas, ofrece la oportunidad para reducir selectivamente el nivel de los transcritos de agentes específicos no afectando el nivel de los transcritos de las células hospederas. Así, el suministro de tales ARNsi no esperaría afectar adversamente a las ' células del organismo hospedador. Esta metodología no se limita a transcritos que codifican proteínas que estabilizan específicamente ARNs del agente infeccioso en mas bien que aquellos de la célula hospedera, pero que aplica también a los transcritos que codifican a las proteínas que . están involucradas específicamente en cualquier aspecto del proceso, síntesis y/o traducción de los transcritos de agentes específicos (es decir, los transcritos cuya plantilla es parte del genoma de los agentes más bien que del genoma de las células hospederas) más que los transcritos de las células hospederas. Tales proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas que están involucradas en la síntesis, empalme o cierre de los transcritos de agentes específicos pero no transcritos de células hospederas. IV. Identificación y Prueba de los ARNsi y ARNsh que 112 inhiben el virus de la influenza Como se menciona arriba, la presente invención proporciona un sistema para identificar ARNsi que son útiles como inhibidores de la infección del virus de la influenza y/o replicación. También, como se menciona arriba, los ARNsi se procesan intracelularmente para producir ARNsi que tienen porciones dobles con la misma secuencia como la estructura de troncal del ARNsh, el sistema es igualmente útil para identificar los ARNsh que son útiles como inhibidores de la infección del virus de la influenza. Para los propósitos de descripción, esta sección se referirá a los ARNsi, pero el sistema abarca también los ARNsh correspondientes. Específicamente, la presente invención demuestra la preparación exitosa del ARNsi dirigida a los genes virales para bloquear o inhibir la infección viral y/o replicación. Las técnicas y reactivos descritos en la presente pueden aplicarse fácilmente para diseñar nuevos ARNsi potenciales, dirigir a otros genes o regiones del gen, y probar su actividad en la inhibición de la infección del virus de la influenza y/o replicación como se discutió en la presente. Se espera que los virus de la influenza continúen mutando y experimenten un reordenamiento que puede ser deseable para continuar con el desarrollo y probar nuevos ARNsi dirigidos de distinta forma. En varias modalidades de la invención, los inhihidores 113 del virus de la influenza potenciales pueden probarse mediante la introducción de ARNsi(s) candidatos en células (por ejemplo, mediante la administración exógena o mediante la introducción de un vector o constructo que dirige la síntesis endógena de ARNsi dentro de la célula) antes de, simultáneamente con, o después de la transfección con un genoma de la influenza o porción del mismo (por ejemplo, dentro de minutos, horas, o al menos unos pocos días) o antes de, simultáneamente con, o después de la infección con el virus de la influenza. Alternativamente, los inhibidores del virus de la influenza potencial pueden probarse introduciendo ARNsi (s) candidatos en células que se infectan productivamente con el virus de la influenza (es decir, células que producen la descendencia del virus) . Se evalúa entonces la capacidad de los ARNsi (s) candidatos para reducir los niveles del transcrito de direccionamiento y/o para inhibir o suprimir uno o más aspectos o características del ciclo de vid viral tal como replicación viral, patogenicidad, y/o infectividad. Por ejemplo, la producción de partículas virales y/o producción de proteínas virales, etc, pueden evaluarse ya sea directamente o indirectamente usando métodos bien conocidos en la técnica. Las células en las que las composiciones ARNsi inventivas han sido suministradas (células probadas) pueden compararse con células similares o comparables que no han 114 recibido la composición inventiva (células control, por ejemplo, células que han recibido ya sea no ARNsi o un ARNsi control tal como un ARNsi dirigida a un transcrito no viral tal como GFP) . La susceptibilidad de las células de prueba para la infección del virus de la influenza puede compararse con la susceptibilidad de las células de control para la infección. La producción de las proteínas virales y/o virus de la progenie puede compararse en las células de prueba en relación con las células de control. Otros indicios de la infectividad viral, replicación, patogenicidad, etc., pueden ser comparados de manera similar. Los ensayos antivirales in vitro estándar pueden utilizar la inhibición de placas virales, efecto citopático viral (CPE) , y hemaglutinina viral u otra proteína, inhibición de la producción viral, etc. El CPE puede ser determinado visualmente y mediante la fijación de un tinte. Ver por ejemplo, Sidwell, R. W. y Smee, D.F., "In vitro and in vivo assay systems for study of influenza virus inhibitors" Antiviral Res 2000 Oct; 48(1): 1-16, 2000. Generalmente, las células de prueba y las células control serían las mismas especies y de tipo celular idéntico o similar. Por ejemplo, podrían ser comparadas las células de la misma línea celular. Cuando la célula de prueba es una célula primaria, típicamente la célula control podría ser una célula primaria. Típicamente, la misma cepa del virus de la influenza podría usarse para comparar las células de prueba y 115 las células de control. Por ejemplo, como se describe en el ejemplo 2, la capacidad de un ARNsi candidato para inhibir la producción del virus de la influenza puede determinarse convenientemente mediante (1) el suministro de ARNsi candidato a las células (ya sea antes de, al mismo tiempo que, o después de la exposición al virus de la influenza) ; (ii) valorar la producción de la hemaglutinina viral usando un ensayo de hemaglutinina, y (iii) comparar la cantidad de hemaglutinina producida en presencia del ARNsi con la cantidad producida en la ausencia del ARNsi. (La prueba no necesita incluir un control en el cual el ARNsi está ausente, pero puede hacer uso de información previa con respecto a la cantidad de hemaglutinina producida en la ausencia de la inhibición) . Una reducción en la cantidad de hemaglutinina sugiere fuertemente una reducción en la producción del virus. Este ensayo puede usarse para probar ARNsi que dirige cualquier transcrito viral y no se limita a los ARNsi que dirigen al transcrito que codifica a la hemaglutinina viral. La capacidad de un ARNsi candidato para reducir el nivel del transcrito de direccionamiento puede valorarse también midiendo la cantidad del transcrito de direccionamiento usando por ejemplo, inmunotransferencia Northern, ensayos para la protección de la nucleasa, PCR de transcripción inversa (RT), PCR en tiempo real RT, análisis de 116 microarreglos, etc. La capacidad de un ARNsi candidato para inhibir la producción de un polipéptido codificado por el transcrito de direccionamiento (ya sea en el nivel trasncripcional o post-transcripcional) puede ser medida usando una variedad de metodologías basadas en anticuerpos que incluyen, pero no se limitan a, inmunotransferencias Western, inmunoensayos, ELISA, citometría de flujo, microarreglos de proteínas, etc. En general, puede usarse cualquier método para medir la cantidad tanto del transcrito de direccionamiento como del polipéptido codificado por el transcrito de direccionamiento. En general, ciertos inhibidores del virus de la influenza preferidos reducen el nivel del transcrito de direccionamiento al menos aproximadamente 2 veces, preferiblemente al menos aproximadamente 4 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces o incluso a un grado mayor relativo al nivel que podría estar presente en ausencia del inhibidor (por ejemplo, en una célula de control comparable que carece del inhibidor) . En general, ciertos inhibidores del virus de la influenza preferidos inhiben la replicación viral, de manera que el nivel de la replicación es inferior en una célula que contienen el inhibidor que en la célula control no contiene el inhibidor mediante la menos aproximadamente 2 veces, 117 preferiblemente al menos 64 veces, más preferiblemente al menos aproximadamente 8 veces, al menos aproximadamente 16 veces, al menos aproximadamente 64 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 200 veces, o incluso en un mayor grado. En particular, como se describe en el ejemplo 2, los inventores han demostrado que la concentración viral, medida por la producción de hemaglutinina, se redujo en más de 256 veces en células infectadas con la cepa del virus de la influenza A/PR/8/34 (H1N1) en la que una dosis simple de ARNsi (PB1-2257) se administró más de 120 veces en células infectadas con la cepa del virus de la influenza A/WSN/33 (H1N1) en la cual se administró una dosis simple de ARNsi (NP-1496 y otros) . Cuando se midió el ensayo de la placa en MOI ann de 0.001, la inhibición del pliegue fue aún mayor, es decir, al menos aproximadamente 30, 000 veces. Incluso a una MOI de 0.1, la producción del virus inhibido NP-1496 aproximadamente 200 veces . Ciertos inhibidores del virus de la influenza preferidos inhiben la replicación viral de manera que el desarrollo de la concentración viral detectable se impide al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o al menos 60: horas después de la administración del ARNsi y la infección de las células. Ciertos inhibidores del virus de la influenza preferidos previenen (es decir, reducen los niveles 118 indetectables) o reducen significativamente la replicación viral durante al menos 24 horas, al menos 36 horas, al menos 48 horas, o al menos 60 horas siguiendo la administración del ARNsi. De acuerdo a varias modalidades de la invención, una reducción significativa en la replicación viral es una reducción menor de aproximadamente el 90% del nivel que se presentaría en la ausencia del ARNsi, una reducción no menor de aproximadamente el 75% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNsi, una reducción menor de aproximadamente el 50% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNsi, una reducción menor de aproximadamente el 25% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNsi, o una reducción menor de aproximadamente el 10% del nivel que se presentaría en ausencia del ARNsi. La reducción en la replicación viral puede ser medida usando cualquier método adecuado que incluye, pero no se limita a, la medición de la concentración de HA. Los inhibidores potenciales del virus de la influenza pueden probarse también usando cualquiera de una variedad de modelos animales que han sido desarrollados.. Las composiciones que comprenden ARNsi (s) candidatos, constructos o vectores capaz de dirigir la síntesis de tal ARNsi dentro de una célula hospedera o células diseñadas o manipuladas que contienen ARNsi candidato puede administrarse a un animal previo a, simultáneamente con, o después de la infección con un virus de la influenza. Se evalúa la capacidad de la 119 composición para prevenir la infección viral y/o para retrasar o prevenir la aparición de los síntomas relacionados con la influenza y/o aminorar su severidad relativa a los animales infectados con el virus de la influenza, que no han recibido el inhibidor de la influenza potencial. Tales modelos incluyen, pero no se limitan a, murina, pollo, hurón, y modelos de primates no humanos para la infección de la influenza, todos conocidos en la técnica y usados para probar la eficacia de las vacunas y terapéuticos contra la influenza potencial. Ver, por ejemplo, R.W. y Smee, D.F, referenciados arriba. Tales modelos pueden involucrar el uso de cepas del virus de la influenza que se presentan naturalmente y/o cepas que han sido modificadas o adaptadas para vivir en hospederas particulares (por ejemplo, las cepas WSN o PR8, que se adaptan para la réplica en ratones) . Ver ejemplos 6, 7, 8, 9 y 10 para una discusión adicional de los métodos para probar las composiciones ARNsi in vitro e in vivo. V. Composiciones para el suministro mejorado de ARNsi, ARNsh y vectores que inducen ARNi Los inventores han reconocido en general la terapia de ARNi efectiva, que incluye la prevención y terapia de infección del virus de la influenza, se mejorará mediante el suministro eficiente de ARNsi, ARNsh y/o vectores que inducen ARNi en células de organismos intactos. En el caso del virus de la influenza, tales agentes pueden ser introducidos en las 120 células en el tracto respiratorio, en donde se presenta normalmente la infección de la influenza. Para uso en humanos, se prefiere emplear métodos no virales que facilitan la absorción intracelular de ARNsi o ARNsh. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden cualquiera de una variedad de agentes de suministro no virales para mejorar el suministro de ARNsi, ARNsh y/o vectores que inducen ARNI en células de organismos intactos, por ejemplo, mamíferos y aves. Como se usa en la presente, el concepto de "suministro" incluye el transporte de un ARNsi, ARNsh o vector que induce ARNi de su sitio de entrada en el cuerpo para ubicar las células en las que funciona, además de la absorción celular del ARNsi, ARNsh o vector y cualquiera de las etapas posteriores involucradas en. la elaboración de ARNsi o ARNsh disponibles en el mecanismo ARNi intracelular (por ejemplo, liberación de ARNsi o ARNsh de las endosomas) . Por lo tanto, la invención comprende composiciones que comprenden un agente que induce ARNi tal como un ARNsi, ARNsh o un vector que induce ARNi cuya presencia dentro de una célula resulta en la producción de un ARNsi o ARNsh, en donde el ARNsi o ARNsh se dirige a un transcrito del virus de la influenza, y cualquiera de una variedad de agentes de suministro, que incluyen, pero no se limitan a, polímeros catiónicos, polímeros catiónicos modificados, transportadores moleculares de péptido (que incluyen arginina o péptidos 121 ricos en histidina) , lipidos (que incluyen lipidos catiónicos, lipxdos neutrales y combinaciones de los mismos) , liposomas, lipopoliplexos, polímeros no catiónicos, tensoactivos adecuados para la introducción en los pulmones, etc. (se observa que la frase "en donde" en el lenguaje anterior y en otra parte pretende referirse a ARNsi o ARNsh en la composición, además de aquellos producidos como resultado de la presencia de un vector dentro de la célula. ) Ciertos agentes de suministro se modifican para incorporar una porción que incrementa el suministro o incrementa el suministro selectivo del ARNsi, ARNsh o vector que inducen ARNi en células que desean inhibir un transcrito del virus de la influenza. En ciertas modalidades de la invención, el agente de suministro es biodegradable . Ciertos agentes de suministro adecuados para usarse en la presente invención se describen abajo y en la solicitud de patente de los E.U. copendiente titulada "Composiciones y Métodos para el Suministro del ARN de Interferencia corta y ARN de Horquilla corta en mamíferos", presentada con una fecha acorde, que está incorporada en la presente por la referencia.

A. Polímeros catiónicos y polímeros catiónicos modificados . Se han investigado los sistemas basados en polímeros catiónicos como portadores para la transfeccion de ADN (35) . 122 Se piensa que la capacidad de los polímeros catiónicos para promover la absorción intracelular de ADN surge parcialmente de su capacidad para enlazar ADN y condensar moléculas de ADN de plásmidos grandes dentro de complejos de ADN/polímeros para una endocitosis más eficiente. Los complejos de polímeros de ADN/catiónico actúan también como bioadhesivos debido a su interacción electrostática con residuos de ácido siálico cargados negativamente de las glicoproteínas de la superficie celular (36) . Además, algunos polímeros catiónicos promueven aparentemente la interrupción de la membrana endosomal y en consecuencia, la liberación de ADN en el citosol (32) . Por consiguiente, la invención proporciona composiciones que comprenden (i) una entidad que induce ARNi dirigida a un transcrito del virus de la influenza y (ii) un polímero catiónico. La invención proporciona además, métodos para inhibir la expresión del gen objetivo que comprende administrar una composición que comprende una entidad que induce ARN dirigida a un transcrito del virus de la influenza en un sujeto mamífero. En particular, la invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir la infección del virus de la influenza que comprende administrar una composición que comprende una entidad que induce ARN que dirige un transcrito del virus de la influenza y un polímero catiónico en un sujeto mamífero. En varias modalidades de la invención, la entidad que induce ARNi es un ARNsi, ARNsh o 123 vector que induce ARNi . En general, un polímero catiónico es un polímero que se carga positivamente aproximadamente con un pH fisiológico, por ejemplo, un pH en el rango de aproximadamente 7.0 a 7.6, preferiblemente aproximadamente de 7.2 a 7.6, más preferiblemente de aproximadamente 7.4. Tales polímeros catiónicos incluyen, pero no se limitan a, polilisina (PLL) , poliarginina (PLA) , polihistidina, polietilenimina (PEI) (37), que incluyen PEI lineal y PEI peso molecular bajo como se describe por ejemplo, en (76), polivinilpirrolidona (PVP) (38), y quitosan (39,40) . Se apreciará que ciertos de estos polímeros comprenden grupos amina primarios, grupos imina, grupos guanidina, y/o grupos imidazol. Los polímeros catiónicos preferidos tienen relativamente una toxicidad baja y eficiencia de transfección de ADN alta. Los polímeros catiónicos adecuados incluyen también copolímeros que comprenden subunidades de cualquiera de los polímeros anteriores, por ejemplo, copolímeros de lisina-histidina, etc. El porcentaje de varias subunidades necesarias no son iguales en los copolímeros pero pueden seleccionarse, por ejemplo, para optimizar tales propiedades como la capacidad para formar complejo con los ácidos nucleicos mientras se minimiza su citotoxicidad. Además, las subunidades necesarias no se alternan en una forma regular. Los ensayos apropiados para evaluar varios polímeros con 124 respecto a las propiedades deseables se describen en los ejemplos. Los polímeros catiónicos preferidos incluyen también polímeros tales como los anteriores, que incorporan adicionalmente cualquiera de varias modificaciones. Las modificaciones apropiadas se discuten abajo e incluyen, pero no se limitan a, la modificación con grupos acetilo, succinilo, acilo o imidazol (32) . Aunque no se desee ligar cualquier teoría, se cree que los polímeros catiónicos tales como PEI compactan o condensan ADN dentro de partículas cargadas positivamente capaces de interactuar con los proteoglxcanos aniónicos en la superficie celular e introducir células mediante endocitosis. Tales polímeros pueden poseer la propiedad de actuar como una "esponja de protones" que amortigua el pH endosomal y protege al ADN de la degradación. El influjo continuo de protones también induce el aumento osmótico de la endosoma y su ruptura, proporcionando un mecanismo de escape para las partículas de ADN en el citoplasma. (Ver, por ejemplo, las referencias 85-87, U.S.S.N. 6,013,240; WO9602655- para información adicional en PEI y otros polímeros catiónicos útiles en la práctica de la invención) . De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el reactivo OEI comercialmente disponible conocido como jetPEI™ (Qbiogene, Carlsbad, CA) , se usa en una forma lineal de PEI (U.S.S.N. 6,013,240). Como se describe en el ejemplo 12, los inventores han 125 descubierto que las composiciones que comprenden PEI, PLL o PLA y un ARNsi que se dirigen a un ARN del virus de la influenza inhiben significativamente la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra intravenosamente ya sea antes o después de infectarse con el virus de la influenza. La inhibición depende de la dosis y exhibe efectos aditivos cuando se usan dos ARNsi dirigidos a diferentes ARN del virus de la influenza. Asi, el ARNsi, cuando se combina con un polimero catiónico tal como PEI, PLL o PLA, es capaz de alcanzar los pulmones, par entrar en las células e inhibir efectivamente el ciclo de réplica viral. Se cree que estos resultados representan el primer reporte de la eficacia en la inhibición de la producción del ¦ virus infeccioso en un mamífero usando ARNsi (opuesto, por ejemplo, para inhibir la producción de los transcritos virales o intermediarios en un ciclo de réplica viral) . Se observa que otros esfuerzos por suministrar. ARNsi intravenosamente a órganos sólidos y tejidos dentro del cuerpo (ver, por ejemplo, McCaffrey 2002? McCaffrey 2003; Le is, G.L., et al.,) han empleado la técnica conocida como transfección hidrodinámica, que involucra un suministro rápido de grandes volúmenes de fluidos dentro de la vena de la cola de ratones y se ha demostrado que da como resultado una acumulación de cantidades significativas de ADN de plásmido en órganos sólidos, particularmente el hígado (Liu 126 1999; Zhang 1999; Zhang 2000) . Esta técnica involucra el suministro de volúmenes de fluido que son casi equivalentes al volumen sanguíneo total del animal, por ejemplo, 1.6 mi para ratones con un peso corporal de 18 a 20 gramos, equivalente aproximadamente a 8-12% del peso corporal, contrario a las técnicas convencionales que involucra la inyección de aproximadamente 200 µ? de fluido (Liu 1999) . Además, la inyección que usa metodología de transfección hidrodinámica tiene lugar durante un intervalo de tiempo corto (por ejemplo, de 5 segundos) , que es necesario para una expresión eficiente de los transgenes inyectados (Liu 1999) .

Aunque el mecanismo mediante el cual la transfección hidrodinámica obtiene la transferencia y la expresión con un nivel superior de transgenes inyectados en el hígado no está completamente claro, se cree que se debe a un reflujo en la solución de ADN dentro del hígado vía la vena hepática debido a la congestión cardiaca transitoria (Zhang 2000) . Parece improbable que sea factible una metodología comparable para los propósitos terapéuticos en humanos. En contraste, los inventores han usado volúmenes convencionales de fluidos (por ejemplo, 200 µ?) y han demostrado un suministro efectivo de ARNsi en los pulmones bajo condiciones que se esperaría conduzcan a una expresión mínima de los transgenes inyectados aún en el hígado, sitio en el que la expresión se obtiene de manera más fácil usando una transfección hidrodinámica. 127 Por consiguiente, la invención proporciona un método para inhibir la expresión de un transcrito viral, por ejemplo, un transcrito del virus de la influenza, en una célula dentro de un sujeto mamífero, que comprende la etapa de introducir una composición que comprende una entidad que induce ARNi dirigida al transcrito de direccionamiento dentro del sistema vascular del sujeto usando técnicas de inyección convencionales, por ejemplo, una técnica que usa presiones convencionales y/o volúmenes convencionales del fluido. La entidad que induce ARNi puede ser un ARNsi, ARNsh, o un vector que induce ARNi. En ciertas modalidades preferidas de la invención, la composición comprende un polímero cati'ónico. En las modalidades preferidas de la invención, la composición se introduce en un volumen de fluido equivalente a menos de 10% del peso corporal del sujeto. En ciertas modalidades de la invención, el volumen del fluido es equivalente a meno del 5%, menos del 2%, menos del 1%, o menos del .1% del peso corporal del sujeto. En ciertas modalidades de la invención, el método obtiene el suministro de cantidades efectivas de ARNsi o ARNsh en una célula dentro de un tejido corporal u órgano distinto al del hígado. En ciertas modalidades preferidas de la invención, la composición se introduce dentro de la vena, por ejemplo, mediante inyección intravenosa. Sin embargo, la composición puede también administrarse en una arteria, usando un dispositivo tal como 128 un catéter, que se aloja en la línea intravenosa, etc. En ciertas modalidades preferidas de la invención, la entidad que induce ARNi inhibe la producción del virus. Como se describe en el ejemplo 15, los inventores han demostrado también que los polímeros catiónicos PLL y PLA son capaces de formar complejos con ARNsi y promover la absorción de ARNsi funcional en células cultivadas. La transfección con los complejos de PLL y NP-1496 o complejos de PLA y NP-1496 ARNsi inhiben la producción del virus de la influenza en las células. Estos resultados y los resultados en ratones discutidos anteriormente demuestran la factibilidad de usar mezclas o combinaciones de polímeros catiónicos y ARNsi para el suministro de ARNsi en células de mamíferos dentro del cuerpo de un sujeto. La metodología descrita en el ejemplo 15 puede emplearse para probar polímeros adicionales, particularmente, polímeros modificados mediante la adición de grupos (por ejemplo, grupos acilo, succinilo, acetilo o imidazol) para reducir la citotoxicidad y para optimizar aquellas que son inicialmente eficaces. En general, ciertas modificaciones preferidas dan como resultado una reducción en la carga positiva del polímero catiónico. Ciertas modificaciones preferidas convierten a la amina principal en una amina secundaria. Los métodos para modificar polímeros catiónicos para incorporar tales grupos adicionales se conocen bien en la técnica. (Ver, por ejemplo, la referencia 129 32) . Por ejemplo, el grupo e-amino de varios residuos puede ser sustituido, por ejemplo, mediante la conjugación con un grupo deseado que se modifica después de la síntesis del polímero. En general, es deseable seleccionar un % de sustitución suficiente para obtener una reducción apropiada en la citotoxicidad, en relación con el polímero no sustituido mientras no se provoque una reducción muy amplia de la capacidad del polímero para mejorar el suministro de la entidad que induce ARNi. Por consiguiente, en ciertas modalidades de la invención, se sustituye entre el 25% y el 75% de los residuos en el polímero. En ciertas modalidades de la invención, se sustituye aproximadamente el 50% de lo residuos en el polímero. Se observa que efectos similares pueden obtenerse en copolímeros que se forman inicialmente a partir de subunidades monoméricas seleccionadas apropiadamente, es decir, algunas subunidades que ya incorporan la modificación deseada. Una variedad de polímeros catiónicos adicionales pueden también usarse. Grandes colecciones de polímeros catiónicos nuevos y oligómeros de diacrilato y monómeros de amina han sido desarrolladas y probadas en la transfección del ADN. Estos polímeros se refieren en la presente como polímeros poli(p-amino éster) (PAE) . Por ejemplo, se ha descrito una colección de 140 polímeros de 7 monómeros de diacrilato y 20 monómeros de amina han sido (34) y pueden producirse 130 colecciones grandes usando una metodología idéntica o similar. De los 140 miembros de esta colección, 70 son completamente solubles en agua (2 mg/ml, 25 mM de solución amortiguadora de acetato, pH = 5.0). Cincuenta y seis de los 70 polímeros solubles en agua interactuaron con el ADN mostrando un desplazamiento de movilidad electroforética . Muy importante, dos de los 56 polímero mediaron la transfección de ADN en células COS-7. Las eficiencias de transfección de los polímeros nuevos fueron de 4 a 8 veces más altas que en PEI e iguales o mejores que en Lipofectamina 2000. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula ARNsi y un polímero catiónico, en donde el polímero catiónico es un poli^-éster amino) , y métodos para inhibir la expresión del gen objetivo mediante la administración de tales composiciones. El poli (beta-éster amino) se describe adicionalmente en la solicitud de patente publicada 20020131951, titulada "Biodegradable poly(beta-amino esters) and uses thereof" presentada el 19 de septiembre de 2002, por Langer et al, y Anderson (2003) . Se observa que los polímeros catiónicos que se usan para facilitar el suministro de entidades que inducen ARNi pueden modificarse de manera que puedan incorporar uno d más residuos distintos a la principal subunidad monomérica que comprende el polímero. Por ejemplo, uno o más residuos alternados pueden agregarse al final de un polímero, o los 131 polímeros pueden unirse por un residuo distinto al del monómero principal que comprende el polímero. Los polímeros catiónicos adicionales que pueden usarse también para mejorar el suministro de las entidades que inducen ARNi inventivo incluyen dendrímeros de poliamidoamina (PAMAM) , poli (2-dimetilamino) etil metacrilato (pDMAEMA) y su análogo de amina cuaternaria, poli (2-triemetilamino) etil metacrilato (???????) , ácido poli [a- (4-aminobutil) -L-glicólico (PAGA) , y poli (éster 4-hidroxi-l-prolina) . Ver Han (2000) para una descripción adicional de estos agentes.

B. Transportadores Moleculares de Péptido Los estudios han demostrado que una variedad de péptidos tiene la capacidad de actuar como agentes de suministro para los ácidos nucleicos. (Como se usa en la presente, un polipéptido se considera ser un "péptido" si es más corto que aproximadamente 50 aminoácidos de longitud) . Por ejemplo, factores de transcripción que incluyen la proteína Tat del VIH (42,43), la proteína VP22 del virus simples del herpes (44) , y una proteína Antennapedia de Drosophlla (45) , pueden penetrar a la membrana del plasma a partir de la superficie celular. Los segmentos de péptido responsables de la penetración de. la membrana consisten de 11-34 residuos de aminoácidos, que son enriquecidos altamente por la arginina, y son referidos frecuentemente como arginina rica en péptidos 132 (ARPs) o penetratinas . Cuando se enlazan covalentemente con polipéptidos mucho más grandes, los ARP son capaces de transportar los polipéptidos fusionados a través de la membrana del plasma (46-48) . De igual manera, cuando los oligonucleótidos se enlazan covalentemente a los ARP; son mucho más rápidos para absorber las células (49, 50) . Estudios recientes han demostrado que un polímero de ocho argininas es suficiente para este transporte de transmembrana (51) . Tal como los polímeros catiónicos, los ASP también se cargan positivamente y son probablemente capaces de enlazar ARNi, sugiriendo que es probablemente no necesario enlazar ARNsi covalentemente a los ARP. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una entidad que induce ARNi, en donde la entidad que induce ARNi se dirige a un transcrito del virus de la influenza y un transportador molecular de péptidos y métodos para inhibir la expresión del gen objetivo mediante la administración de tales composiciones. La invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir la infección del virus de la influenza que comprende administrar tales composiciones en sujetos que corre el riesgo de padecer de la influenza. Los transportadores moleculares de péptido incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las referencias 46-51, 120, y 134-136 y variaciones de las mismas evidentes para un experto en la técnica. Los péptidos ricos 133 en arginina incluyen un péptido que consiste únicamente de residuos de arginina. Generalmente, los transportadores moleculares de péptido preferidos son menos de aproximadamente 50 aminoácidos en longitud. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el transportador molecular de péptido es un péptido que tiene una longitud entre aproximadamente 7 y 34 aminoácidos. Muchos de los péptidos preferidos son ricos en arginina. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, un péptido es rico en arginina si incluye al menos 20%, al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 90% de arginina. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el transportador molecular de péptido es un péptido rico en arginina que incluye entre 6 y 20 residuos de arginina. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el péptido rico en arginina consiste de entre 6 y 20 residuos de arginina. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el ARNsi y el transportador molecular de péptido se enlaza covalentemente, mientras que en otras modalidades de la invención, el ARNsi y el transportador molecular de péptido se mezclan al mismo tiempo pero no se enlazan covalentemente entre si. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, se usa un péptido rico en histidina (88) . De acuerdo con la invención, los péptidos ricos en histidina pueden exhibir longitudes y porcentajes de 134 residuos de histidina como los descritos para los péptidos ricos en arginina. Por lo tanto, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una entidad que induce ARNi, en donde la entidad que induce ARNi se dirige a un transcrito del virus de la influenza y un péptido rico en histidina y métodos para inhibir la expresión del transcrito de direccionamiento administrando tales composiciones. La invención proporciona métodos para tratar y/o prevenir la infección del virus de la influenza que comprende administrar tales composiciones a un sujeto que corre el riesgo de sufrir influenza . Los péptidos adicionales o péptidos modificados que facilitan el suministro de entidades que inducen ARNi en las células de un sujeto, pueden usarse en las composiciones inventivas. Por ejemplo, se ha descrito una familia de péptidos ricos en lisina, que contiene generalmente entre 8 y aproximadamente 50 residuos de lisina (McKenzie 2000) . A pesar de que estos péptidos pueden mejorar la absorción de los ácidos nucleicos mediante las células en el cultivo del tejido, son menos eficientes para suministrar vehículos en los ácidos nucleicos en el cuerpo de un sujeto que en los polipéptidos más largos, por ejemplo, PLL comprende más de 50 residuos de lisina. Esto puede deberse en parte a la estabilidad insuficiente del complejo de ácidos nucleicos/péptidos dentro del cuerpo. La inserción de 135 cisteínas múltiples en varias posiciones dentro de los péptidos resulta en un ADN de peso molecular bajo que condensa péptidos que se oxidan espontáneamente después de enlazar ADN plásmido para formar enlaces de disulfuro de interpéptidos . Estos vehículos de suministro de ADN reticulados fueron los inductores más eficientes de la expresión del gen cuando se usaron para suministrar plásmidos a las células en relación a los condensados de ADN de péptido no reticulado (McKenzie 2002) . Además, los péptidos que comprenden residuos de sulfhidrilo para la formación de enlaces de disulfuro pueden incorporar polietilen glicol (PEG) , que se cree que reducen el enlace no específico en proteínas de suero (Park 2002) . Los glicopéptidos que incluyen porciones tales como residuos de ma osa o galactosa pueden usarse también para mejorar la absorción selectiva de entidades que inducen ARNi de acuerdo con la presente invención, como se discutió arriba Tales glicopéptidos pueden incluir también grupos sulfidrilo para la formación de enlaces de disulfuro (Park 2002) . La invención abarca la administración de varios agentes que mejoran la salida de los ácidos nucleicos de las vesículas endocíticas. Tales agentes incluyen cloroquina (Zhang 2003) y bupivacaina (Satishchandran 2000) . Los agentes que mejoran la salida pueden ser administrados sistémicamente, oralmente, y/o localmente (por ejemplo, a o en proximidad cercana al sitio deseado de acción) . Estos pueden administrarse junto con el ARNsi, ARNsh o vectores que inducen ARNi inventivo o por separado.

C. Agentes de suministro poliméricos adicionales La invención proporciona composiciones que comprenden entidades que inducen ARNi inventivo y cualquiera de una variedad de agentes de suministro poliméricos, que incluyen polímeros modificados, además de aquellos descritos arriba. La invención proporciona además métodos para inhibir la expresión de un transcrito del virus de la influenza en una célula y métodos para tratar o prevenir la infección del virus de la influenza mediante la administración de las composiciones. Los agentes de suministro adecuados incluyen varios agentes que han demostrado mejorar el suministro de ADN en las células. Estas incluyen versiones modificadas de polímeros catiónicos tales como aquellos mencionados arriba, por ejemplo, los polímeros poli (L-histidina) -inj erto-poli (L-lisina) (Benns 2000), polihistidina-PEG (Putnam 2003), folato-PEG-inj erto-polietilenoimina (Benns 2002) , polietilenimina-sulfato de dextrano (Tiyaboonchai 2003) , etc. Los polímeros pueden ser ramificados o lineales y pueden ser injertados o no injertados. De acuerdo a la invención, los polímeros forman complejos 137 con entidades que inducen ARNi inventivo, que se administra entonces a un sujeto. Los complejos pueden ser referidos como nanoparticulas o nanocompuestos . Cualquiera de los polímeros pueden modificarse para incorpórar PEG u otros polímeros hidrofilicos , que son útiles para reducir la activación complementaria y enlazar otras proteínas de plasma. Los polímeros catiónicos pueden ser modificados en forma múltiple. Por ejemplo, un polímero catiónico puede modificarse para incorporar una porción que reduce la carga negativa del polímero (por ejemplo, imidazol) y puede modificarse además con una porción secundaria tal como PEG. Además, puede usarse una variedad de polímeros y matrices de polímeros distintas de los polímeros catiónicos descritos arriba. Tales polímeros incluyen una variedad de polímeros no catiónicos, es decir, polímeros que no tienen carga positiva en el pH fisiológico. Tales . polímeros pueden tener ciertas ventajas, por ejemplo, citotoxicidad reducida y, en algunos casos aprobación de FDA. Un número de polímeros adecuados han demostrado mejorar el fármaco y suministro de genes en otros contextos. Tales polímeros incluyen por ejemplo, pío (lacturo). (PLA) , poli (glicólido) (PLG) , y poli (DL-lactido-co-glicólido) (PLGA) (Panyam 2002), que pueden formularse en nanoparticulas para el suministro de las entidades que inducen ARNi inventivo. 138 Pueden usarse también los copolimeros y combinaciones de los anteriores. En ciertas modalidades de la invención, un polímero catiónico se usa para condensar el ARNsi, ARNsh, o vector, y el complejo condensado se protege mediante PLGA u otro polímero no catiónico. Otros polímeros que pueden usarse incluyen polímeros no condensables tales como alcohol de polivinilo, o bromuro de poli (N-etil-4-vinilpiridino, que puede formarse con el complejo Pluronico 85. Otros polímeros de uso en la invención incluyen combinaciones entre polímeros catiónicos y no catiónicos. Por ejemplo, pueden usarse poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) -injertado poli (L-lisina) (Jeong 2002) y otras combinaciones que incluyen PLA, PLG o PLGA y cualquiera de los polímeros catiónicos o polímeros catiónicos modificados tales como aquellos discutidos arriba. D. Agentes de Suministro que incorporan porciones que mejoran el suministro La invención abarca la modificación de cualquiera de los agentes de suministro que incorporan una porción que mejora el suministro del agente en las células y/o mejora el suministro selectivo del agente a las células en las que es deseable inhibir un transcrito de direccionamiento . Puede usarse cualquiera de una variedad de porciones que incluyen, pero no se limitan a, (i) anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que enlazan específicamente a una molécula 139 expresada por una célula en la que se desea la inhibición (por ejemplo, una célula epitelial respiratoria); (ii) ligandos que enlazan específicamente a una molécula expresada por una célula en la cual se desea la inhibición. Preferiblemente, la molécula se expresa en la superficie de la célula. Se prefieren en general los anticuerpos monoclonales . En el caso de la células epiteliales respiratorias, las porciones adecuadas incluyen anticuerpos que se enlazan específicamente a receptores tales como el purinoceptor p2Y2, receptor de bradicinina, activador R de plasminógeno de urocinasa, o complejo de la enzima serpina pueden conjugarse en varios agentes de suministro mencionados arriba para incrementar el suministro y selectividad para las células epiteliales respiratorias. De igual manera, los ligandos para estas distintas moléculas pueden conjugarse a los agentes de suministro para incrementar el suministro y selectividad de las células epiteliales respiratorias. Ver por ejemplo, (Ferrari 2002). En ciertas modalidades preferidas de la invención, el enlace del anticuerpo o ligando induce la internalización del complejo enlazado. En ciertas modalidades de la invención, el suministro del agente mej orador (por ejemplo, anticuerpos, fragmentos del anticuerpo o ligando) , se conjuga a un vector que induce ARNi (por ejemplo, un vector de ADN) para incrementar el suministro o mejora de la selectividad. Los métodos para 140 conjugar anticuerpos o ligandos a los ácidos nucleicos o a distintos agentes de suministro descritos en la presente son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, "Cross-Linking", Pierce Chemical Technical Library, disponible en el sitio de la Red que tiene URL ww .piercenet . com y publicada originalmente en el catálogo Pierce 1994-95 y referencias citadas en la presente y Wongs SS, Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press Publishers, Boca Ratón, 1991.

E. Tensoactivos adecuados para la introducción en los pulmones El tensoactivo endógeno natural es un compuesto que incluye fosfolipidos, lipidos neutrales y proteínas (proteínas tensoactivos A, B, C y D) que forman una capa entre las superficies del alveolo en los pulmones y el gas alveolar, y reduce el colapso alveolar mediante la disminución de la tensión de la superficie dentro del alveolo (77-84) . Las moléculas tensoactivas se difunden dentro de la película líquida que baña la cubierta celular entera de las paredes alveolares, donde se produce una mono-molécula esencial, sobre toda la capa penetrante. La deficiencia de tensoactivos en infantes prematuros resulta frecuentemente en el síndrome de dolor respiratorio (RDS) . Por consiguiente, se han desarrollado una variedad de preparaciones de 141 tensoactivos para el tratamiento y/o prevención de esta condición. Los tensoactivos pueden ser extraídos a partir del lavado de pulmones de animales y del fluido amniótico de humanos o el producido a partir de materiales sintéticos (ver por ejemplo, U.S.S.N. 4,338,301, 4,397,839, 4,312,860, 4,826,821, 5,110,806). Distintas formulaciones de tensoactivos se encuentran comercialmente disponibles, que incluyen. Infasurf® (fabricada por ONY, Inc., Amherst, NY) , Survanta ® (Ross Labs, Abbott Park, IL) , y Exosurf Neonatal® (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC) . Como se usa en la presente, la frase "tensoactivo adecuado para introducirse en los pulmones" incluye formulaciones particulares usadas en los productos de tensoactivos disponibles comercialmente descritos y reivindicados en las solicitudes de patente arriba mencionadas y equivalentes de las mismas. En ciertas modalidades de la invención, la frase incluye preparaciones que comprenden de 10-20% de proteínas y 80-90% de lípidos ambos basados en el tensoactivo completo, en el que los lípidos consisten de aproximadamente 10% de lípidos neutrales (por ejemplo, triglicéridos, colesterol) y de aproximadamente 90% de fosfolipidos ambos basados en los mismos, mientras que el contenido de fosfatidilcolina basado en los fosfolipidos totales de 86%, en donde ambos "%" y "parte" se encuentran basados en la materia general (ver U.S.S.N. 4,388,301 y 142 4,397,839) . En ciertas modalidades de la invención, la frase incluye composiciones sintéticas, que pueden estar completamente o sustancialmente libres de proteínas, por ejemplo, composiciones que comprenden o consisten esencialmente de fosfatidilcolina dipalmitoilo y alcoholes grasos, en donde la fosfatidilcolina de dipalmitoilo (DPPC) constituye el principal componente de la composición de tensoactivos mientras que el alcohol graso comprende un menor componente del mismo, que incluye opcionalmente un agente activo de superficie no iónica tal como tiloxapol (ver U.S.S.N. 4, 312,860, 4,826,821 y 5,110,806). Un experto en la técnica será capaz de determinar mediante la referencia de las pruebas descritas en la literatura y patentes mencionadas anteriormente, si cualquiera de las composiciones de los tensoactivos particulares es adecuada para introducirse en los pulmones. Aunque no se desea ligar a cualquier teoría, es posible que la capacidad del tensoactivo para esparcirse y cubrir el alveolo facilita la composición del mismo tensoactivo, facilitando la absorción de ARNsi y/o vectores mediante las células dentro de los pulmones. Infasurf es un tensoactivo para pulmones no pirogénico estéril preparado solo para la instilación intrataqueal . Este es un extracto de tensoactivo natural de pulmones de ternero que incluye fosfolípidos, lípidos neutrales y proteínas B y C 143 asociadas con los tensoactivos hidrofóbicos . El infasurf está aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los E.U. para el tratamiento del síndrome de dolor respiratorio y es por lo tanto, un vehículo seguro y tolerado para la administración en el tracto respiratorio y los pulmones. Survante es también un extracto derivado de pulmones bovinos, mientras que el Exosurf neonatal es un tensoactivo de pulmones sintético libre de proteínas que contiene dipalmitoilfosfatidilcolina, alcohol cetílico y tiloxapol. Ambas de estas formulaciones de tensoactivos han sido aprobadas también por la ü.S.F.D.A. para el tratamiento del síndrome de distensión respiratoria. Como se describe en el ejemplo 14, los inventores han demostrado que los vectores de ADN que sirven como plantillas para la síntesis de ARNsh dirigida a los ARN de la influenza pueden inhibir la producción del virus de la influenza cuando se mezcla con Infasurf y se administra a ratones mediante la instilación intranasal. Además, como se describe en el ejemplo 13, los inventores demostraron que la infección con lentivirus que expresan los mismos ARNsh inhiben la producción del virus de la influenza en células en el cultivo del tejido. Estos resultados demuestran que los ARNsh dirigidos a los ARN del virus de la influenza pueden suministrarse a células y procesarse dentro de los ARNsi que son efectivos en el tratamiento y/o prevención de la 144 infección del virus de la influenza. Los resultados también demuestran que los materiales tensoactivos tales como Infasurf, por ejemplo, materiales que tienen una composición y/o propiedades similares a aquellos tensoactivos de pulmones naturales, son vehículos apropiados para el suministro de ARNsh a los pulmones. Además, los resultados sugieren fuertemente que los ARNsi dirigidos al virus de la influenza inhibirán efectivamente también la producción del virus de la influenza cuando se suministra a los pulmones y/o conductos respiratorios. Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende (i) al menos una entidad que induce ARNi, en donde la entidad que induce ARNi se dirige a un transcrito del virus de la influenza (ii) un material tensoactivo adecuado para la introducción en los pulmones. Las composiciones inventivas que comprenden tensoactivos y una entidad que induce ARNi pueden introducirse en los pulmones en cualquiera de una variedad de formas que incluyen la instilación, mediante la inhalación por rocío en aerosol, etc. Se observa que la composición puede contener menos de 100% de tensoactivos. Por ejemplo, la composición puede contener entre aproximadamente 10 y 25% de tensoactivos por peso,' entre aproximadamente 25 y 50% de tensoactivos por peso, entre aproximadamente 50 y 75% de tensoactivos por peso, entre aproximadamente 75 y 100% de tensoactivos por peso. La invención proporciona métodos para tratar o prevenir la 145 influenza que comprende la administración de las composiciones anteriores para un sujeto que corre el riesgo de sufrir de influenza.

F. Agentes adicionales para el suministro de entidades que inducen ARNi en los pulmones La invención abarca el uso de una variedad de agentes adicionales y métodos para mejorar el suministro de entidades que inducen ARNi inventivo en las células epiteliales pulmonares. Los métodos incluyen la precipitación de CaP04 de vectores previo al suministro o administración junto con EGTA para provocar la quelación de calcio. Puede usarse también la administración con detergentes y soluciones tixotrópicas . Los líquidos perfluoroquímicos pueden usarse también como vehículos de suministro. Ver (Weiss 2002) para una discusión adicional de estos métodos y su aplicabilidad en la transferencia de genes. Además, la invención abarca el uso de complejos de proteínas/polietilenimina que incorporan entidades que inducen el ARNi inventivo para el suministro a los pulmones. Tales complejos comprenden polietilenimina en combinación con albúmina (u otras proteínas solubles) . Se ha demostrado que los complejos similares que contienen plásmidos para la transferencia de genes resultan en un suministro a los tejidos de pulmones después de la administración intravascular (Orson 2002). Los complejos de 146 proteína/PEI que comprenden una entidad que induce ARNi inventivo pueden usarse también para mejorar el suministro a las células que no están dentro de los pulmones.

Lipidos G Como se describe en el ejemplo 3, los inventores han demostrado que la administración de ARNsi dirigido a un transcrito del virus de la influenza mediante la inyección en embriones de pollo intactos en presencia del agente lipido conocido como Oligofectamina™ inhibe efectivamente la producción del virus de la influenza aun cuando la administración del mismo ARNsi en ausencia de la Oligofectamina no resulte en una inhibición efectiva. Estos resultados demuestran la utilidad de los agentes de suministro lipidos para mejorar la eficacia de ARNsi en organismos intactos Por lo tanto, la invención proporciona una composición que comprende (i) al menos una entidad que induce ARNi, en donde la entidad que induce ARNi se dirige a un transcrito del virus de la influenza y (ii) un lipido. Además, la invención proporciona métodos para inhibir la producción del virus de la influenza y métodos para tratar la infección del virus de la influenza que comprenden administrar la composición inventiva a un sujeto. 147 VI. Análisis de la infección/'replicación del virus- de la influenza Como se observa anteriormente, un uso de las entidades que inducen ARNi de la presente invención se encuentra en el análisis y caracterización del ciclo de infección / réplica del virus de la influenza y del efecto de varias proteínas virales en las células hospederas . Los ARNsi y ARNsh pueden diseñarse para que sean dirigidos en cualquiera de una variedad de genes virales involucrados en una o más etapas de la infección viral y/o ciclo de réplica y/o genes virales que afectan las funciones o actividades de las células hospederas tales como el metabolismo, biosíntesis, liberación de citocinas, etc. Los ARNsi, ARNsh o vectores que inducen ARNi pueden introducirse en las células antes de, durante o después de la infección viral, y sus efectos en varias etapas del ciclo de infección/réplica y en la función y actividad celular pueden ser valuados como se desee.

VII. Aplicaciones terapéuticas Como se mencionó anteriormente, las composiciones que comprenden entidades que inducen ARNi de la presente invención pueden usarse para inhibir o reducir la infección del virus de la influenza o réplica. En tales aplicaciones, una cantidad efectiva de una composición inventiva se suministra a una célula u organismo antes de, simultáneamente 148 con, o después de exponerse al virus de la influenza. Preferiblemente, la cantidad de entidades que inducen ARNi es suficiente para reducir o retrasar uno o más síntomas de la infección del virus de la influenza. Para propósitos de descripción, esta sección se referirá a los ARNsi inventivos, pero como será evidente, la invención abarca aplicaciones similares a otras entidades que inducen ARNi dirigidas a los transcritos del virus de la influenza. Las composiciones que contienen ARNsi inventivas pueden comprender una especie de ARNsi simple, dirigida al sitio simple en un transcrito de direccionamiento simple, o puede comprender una pluralidad de distintas especies de ARNsi, dirigidas a uno o más sitios en uno o más transcritos de direccionamiento. El ejemplo 8 describe una metodología general para la identificación sistemática de ARNsi con capacidad superior para inhibir la producción del virus de la influenza ya sea sola o en combinación. En algunas modalidades de la invención, será deseable utilizar composiciones que contienen colecciones de distintas especies de ARNsi dirigidas a diferentes genes. Por ejemplo, puede ser deseable atacar al virus desde puntos múltiples en el ciclo de vida viral usando una variedad de ARNsi dirigidos contra los distintos transcritos virales. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, la composición de ARNsi contiene un ARNsi dirigido en cada segmento del genoma viral. 149 De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, las composiciones ARNsi inventivas pueden contener más de una especie ARNsi dirigida a un transcrito viral simple. Para dar un ejemplo, puede ser deseable incluir al menos un ARNsi dirigido a las regiones de codificación de un transcrito de direccionamiento y al menos un ARNsi dirigido en la 3' UTR. Esta estrategia puede proporcionar una seguridad extra en la que los productos codificados por el transcrito principal no se generarán debido al menos porque un ARNsi en la composición dirigirá el transcrito para su degradación, mientras que al menos otro, inhibirá la traducción de cualquier transcrito evitando su degradación. Como se describe arriba, la invención abarca "cócteles terapéuticos", que incluyen, pero que no se limitan a, metodologías en las cuales los oligonucleótidos ARNsi múltiples se administran y metodologías en las que un vector simple dirige la síntesis de los ARNsi inhibiendo a los objetivos múltiples de ARN que pueden procesarse para producir una pluralidad de ARNsi. Ver el ejemplo 11 para más detalles. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, la composición incluye ARNsi dirigidos a al menos un transcrito A del virus de la influenza y al menos un transcrito B del virus de la influenza. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, la composición comprende ARNsi múltiples que tienen secuencias distintas que dirigen a la 150 misma porción de un segmento particular. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, la composición comprende ARNsi múltiples que inhiben diferentes cepas o subtipos del virus de la influenza. Es importante que los inventores hayan demostrado la inhibición efectiva mediada por ARNsi de la réplica del virus de la influenza, como evidencia mediante la producción ampliamente reducida de HA, usando todo el virus infeccioso, al contrario de por ejemplo, los genes transfectados, transgenes integrados, genomas virales integrados, clones moleculares infecciosos, etc. Se apreciará que los virus de la influenza experimentan tanto desplazamiento antigénico como tendencia antigénica, como se mencionó anteriormente. Por lo tanto, puede presentarse una emergencia de defensa a los agentes terapéuticos. En consecuencia, puede esperarse que, después de que una composición inventiva ha sido usada algunas veces, puede presentarse una mutación o reordenamiento de manera que puede surgir una variante que no se inhiba mediante los ARNsi particulares proporcionados. Por lo tanto, la presente invención contempla involucrar regímenes terapéuticos . Por ejemplo, uno o más ARNsi nuevos, pueden seleccionarse; en un caso particular en respuesta a una mutación particular o reordenamiento. Por ejemplo, seria a menudo posible diseñar un ARNsi nuevo idéntico al original excepto que se 151 incorporaría cualquier mutación ocurrida o dirigida en un segmento de ARN adquirido recientemente; en otros casos, sería deseable dirigir una secuencia nueva dentro del mismo transcrito, aún en otros casos, sería deseable dirigir completamente a un transcrito nuevo. Será a menudo deseable combinar la administración de ARNsi inventivos con uno o más agentes antivirales para inhibir, reducir, o prevenir uno o más síntomas o características de la infección. En ciertas modalidades preferidas de la invención, los ARNsi inventivos se combinan con uno o más de otros agentes antivirales tales como amantadita o rimantadina (ambos de los cuales inhiben la proteína M2 del canal de iones involucrada en la ausencia de revestimiento viral), y/o zanamivir, oseltamivir, peramivir (BCX-1812, RWJ-270201) Ro64-0796 (GS4104) o RWJ-270201 (todos son inhibidores NA y evitan la liberación propia de partículas virales de la membrana del plasma) . Sin embargo, la administración de las composiciones de ARNsi inventivas pueden combinarse con una o más de cualquiera de una variedad de agentes que incluyen por ejemplo, vacunas de la influenza (por ejemplo, vacunas convencionales que emplean virus de la influenza o antígenos virales así como vacunas de ADN) de una variedad que se conoce. Ver Palese, P. y García-sastre, 2002; Cheung y Lieberman, 2002, Leuscher-Mattli, 2000; y Stiver, 2003, para información adicional con respecto a varios 152 agentes en uso o bajo estudio para el tratamiento o prevención de la influenza. En diferentes modalidades de la invención, los términos "combinado con" o "en combinación con" pueden significar que los ARNsi están presentes en la misma mezcla como otros agente (s) o que el régimen de tratamiento para un individuo incluye ambos ARNsi y otros agente (s), no necesariamente suministrados en la misma mezcla o al mismo tiempo. De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, el agente antiviral es un agente aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los E.ü. tales como amantadina, rimantadina, Relenza o Tamiflu. Los ARNsi inventivos ofrecen una estrategia complementaria para la vacunación y pueden administrarse a individuos que tienen o han sido vacunados con cualquiera de varias vacunas disponibles generalmente o en evolución (revisar en Palese, P. u García-Sastre, A., J. Clint. Invest., 110(1): 9-13, 2002). Las formulaciones de vacunas actuales en los Estados Unidos contienen virus inactivados y deben administrarse mediante inyecciones intramusculares. La vacuna es tripartita y contiene cepas representativas de ambos subtipos de la influenza A que circulan actualmente (H3N2 y HlNl) , además de un tipo B de la influenza. Las recomendaciones especificas de cada periodo identifican cepas particulares para usarse en las vacunas de cada periodo. Otras metodologías de vacuna incluyen al virus de la 153 influenza vivo adaptándose al frió, que puede administrase mediante rocío nasal, vacunas del virus de la influenza vivo diseñado genéticamente que contiene supresiones u otras mutaciones en el genoma viral, virus de la influenza de réplica defectiva y vacunas de ADN en las que el ADN del plásmido codifica una o más proteínas virales se administra ya sea intramuscularmente o tópicamente (ver por ejemplo, Macklin, .D., et al., J. Virol, 72 (2 ): 1491-6, 1998; Illum, L . , et al, Adv Drug Deliv Se , 51 (l-3):81-96, 2001; Ulmer, J. , Vaccine, 20:S74-S76, 2002). Se observa que los pacientes inmunocomprometidos y los ancianos pueden obtener beneficios a partir de terapéuticos basados en ARNi puesto que la eficacia de tales terapéuticos no requiere de una respuesta inmune efectiva. En algunas modalidades de la invención, puede ser deseable dirigir la administración de las composiciones ARNsi inventivas en células infectadas con el virus de la influenza, o al menos células susceptibles de infectarse con el virus de la influenza (por ejemplo, células que expresan receptores que contienen ácido siálico) . En otras modalidades, será deseable tener disponible una variedad muy amplia de opciones de suministro. Como se observa arriba, los protocolos terapéuticos inventivos incluyen la administración de un cantidad efectiva de un ARNsi previo a, simultáneamente con, o después de 154 exponer el virus de la influenza. Por ejemplo, los individuos infectados pueden ser "inmunizados" con una composición inventiva antes de exponerse a la influenza, en individuos expuestos (por ejemplo, los ancianos, individuos inmunocomprometidos, personas que han estado recientemente en contacto con alguien que es sospechoso, probablemente, o se sabe estar infectado con el virus de la influenza,, etc.) puede tratarse sustancialmente al mismo tiempo con (por ejemplo, dentro de 48 horas, preferiblemente dentro de 24 horas, y más preferiblemente dentro de 12 horas de) una exposición conocida. Por supuesto, los individuos que se sabe están infectados, pueden recibir el tratamiento inventivo en cualquier tiempo Los protocolos de terapia de genes pueden involucrar administrar una cantidad efectiva de un vector de terapia de gen capaz de dirigir la expresión de un ARNsi inhibidor a un sujeto ya sea antes, sustancialmente al mismo tiempo con, o después de la infección con el virus de la influenza. Otra metodología que puede usarse alternativamente o en combinación con la anterior, es aislar una población de células, por ejemplo, células troncal o células del sistema inmune de un sujeto, expandir opcionalmente las células en el cultivo del tejido y administrar un vector de terapia de gen capaz de dirigir la expresión de un ARNsi inhibidor en las células in vitro . Las células pueden ser entonces regresadas 155 al sujeto. Opcionalmente, las células que expresan el ARNsi (que pueden volverse así, resistentes a la infección del virus de la influenza) pueden seleccionarse in vitro antes de introducirse en el sujeto. En algunas modalidades de la invención, puede usarse una población de células, que pueden ser células provenientes de una línea de células o de un individuo que no es el sujeto. Los métodos para aislar células troncales, células del sistema inmune, etc, de un sujeto y regresarse al sujeto son bien conocidos en la técnica. Tales métodos se usan por ejemplo, para transplantes de médula ósea, transplante de células troncales sanguíneas periféricas, etc., en pacientes que están sometidos a quimioterapias . En otra metodología, puede usarse terapia de genes. Por ejemplo, la US 6,248,720 describe métodos y composiciones por medio de los cuales los genes bajo el control de promotores están contenidos protectivamente en micropartículas y suministrados a las células en forma operativa, obteniendo asi un suministro de gen no invasivo. Después de la administración oral de las micropartículas, los genes se trasladan en células epiteliales, que incluyen células epiteliales intestinales de absorción, tomadas en el intestino asociado con el tejido linfoide e incluso transportados a las células remotas del epitelio mucosal. Como se describe en la presente, las micropartículas pueden 156 suministrar los genes en sitios remotos del epitelio mucosal, es decir, pueden atravesar la barrera epitelial e ingresar a la circulación general, transfiriendo asi células en otros sitios . Como se mencionó arriba, los virus de la influenza infectan una variedad amplia de especies en humanos. La presente invención incluye el uso de composiciones de, ARNsi inventivo para el tratamiento de especies no humanas, particularmente especies tales como pollos, cerdos y caballos VIII. Formulaciones farmacéuticas Las composiciones inventivas pueden formularse para el suministro mediante cualquier ruta disponible que incluye, pero no se limita a parenteral (por ejemplo, intravenosa) , intradermal, subcutánea, oral, nasal, bronquial, oftálmica, transdermal (tópica), transmucosal, rectal y ruta vaginal. Las rutas preferidas de suministro incluyen parenteral, transmucosal, nasal, bronquial y oral. Las composiciones farmacéuticas inventivas incluyen típicamente un ARNsi u otros agentes tales como vectores que resultarán en la producción posterior de un suministro de ARNsi, en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, el lenguaje "portador farmacéuticamente aceptable" incluye solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y 157 antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los compuestos suplementarios activos pueden incorporarse dentro de las composiciones. Una composición farmacéutica se formula para ser compatible con su ruta proyectada de administración. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral (por ejemplo, intravenosa) , intramuscular, intradermal, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes; un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos, agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metil parabenos, antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfuro de sodio, agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético, soluciones amortiguadores tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácido o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede ser incluida en ampolletas, jeringas disponibles o frascos de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico. Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen típicamente soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos 158 estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL ™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe fluir a tal grado que sea fácilmente inyectable. Las formulaciones farmacéuticas preferidas son estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y deben preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. En general, el portador principal puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La propia fluidez puede mantenerse por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensoactivos . La prevención de la acción de microorganismos puede obtenerse mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio 159 en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser producida incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes mencionados arriba, como se requiere, seguido por una esterilización filtrada. Preferiblemente, las soluciones para la inyección se encuentran libres de endotoxinas . Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de aquellos mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el de secado al vacío y secado por congelación los cuales producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada estéril previamente de la misma. Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un portador comestible. Para el propósito de una administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, pastillas o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de 160 gelatina. Las composiciones orales pueden prepararse usando un portador fluido que se usa como enjuague. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, pildoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de uno de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina, un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido alginico Primogel o almidón de maíz, un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes, un agente mejorador de flujo tal como dióxido de silicón coloidal, un agente edulcorante tal como sucrosa o sacarina, o un agente saborizante tal como menta, metil salicilato o saborizante de naranja. Las formulaciones del suministro oral pueden incorporar ventajosamente para mejorar la estabilidad dentro del tracto intestinal y/o para mejorar la absorción. Para la administración por inhalación, el ARNsi inventivo, ARNsh o vectores se suministran preferiblemente en la forma de un roció en aerosol de un recipiente o surtidor presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador. la presente invención contempla particularmente el suministro de composiciones ARNsi usando un roció nasal. La administración intranasal de vacunas de ADN dirigidas contra los virus de la 161 influenza ha demostrado inducir respuestas de células CD8 T indicando que al menos algunas células en el tracto respiratorio pueden absorber ADN cuando se suministra en esta forma. (Ver por ejemplo, K. Okuda, A. Ihata, S. Watabe, E. Okada, T. Yamakawa, K. Hamajima, J. Yang, N. Ishii, M. Nakazawa, K. Okuda, K. Ohnari, K. Nakajima, K.-Q.Xin, vProtective immunity against influenza A virus induced by immunization with DNA plasmad containing influenza M gene", Vaccine 19:3681-3691, 2001). Los ARNsi son mucho más pequeños que el ADN de plásmido tal como los usados en las vacunas, sugiriendo que ocurrirá incluso una absorción mayor de ARNsi. Además, de acuerdo a ciertas modalidades de la invención, se incluyen agentes de suministro que facilitan la absorción de ácidos nucleicos mediante las células en las vías aéreas de la composición farmacéutica. (Ver por ejemplo, S.-0- Han, R.I. Mahato, Y.K. SPNG, S. W. Kim, "Development of biomaterials for gene therapy", Molecular Therapy 2.302317, 2000). De acuerdo a ciertas modalidades de la invención, las composiciones ARNsi se formulan como grandes partículas porosas para la administración de aerosol como se describe con mayor detalle en el ejemplo 10. La administración sistémica puede ser también mediante medios transmucosales o transdermales . Para la administración transdermal o transmucosal, en la formulación se usan penetradores apropiados para la barrera que va a "ser permeada. 162 Tales penetradores se conocen generalmente en la técnica, e incluyen por ejemplo, la administración transmucosal, detergentes, sales de bilis y derivados de ácido fusidico. La administración transmucosal puede realizarse a través del uso de roclos nasales o supositorios. Para la administración transdermal, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como generalmente se conocen en la técnica . Los compuestos pueden prepararse en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal. Además de los agentes de suministro descritos arriba, en ciertas modalidades de la invención, los compuestos activos (ARNsi, ARNsh o vectores) se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como la formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles biodegradables tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán aparentes por aquellos expertos en la técnica. Los materiales pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals , Inc. Las suspensiones liposomales (que 163 incluyen liposomas dirigidas a las células infectadas con anticuerpos monoclonales para antigenos virales) pueden también usarse como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo a los métodos conocidos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, como los descritos en la patente de los E.U. No. 4,522,811. Es ventajoso formular composiciones parenterales u orales en formas unitarias de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La unidad de dosificación como se usa en la presente se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto que va a ser tratado, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuestos activos calculados para producir el efecto terapéutico deseado asociado con el portador farmacéutico requerido. La toxicidad y la eficacia terapéutica de · tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD5o (la dosis total letal en 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La relación de la dosis entre los efectos terapéuticos y tóxicos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de LD50/ED5o. Se prefieren los compuestos que exhiben índices terapéuticos altos. Aun cuando pueden usarse compuestos que 164 exhiben efectos secundarios tóxicos, debe tenerse cuidado para diseñar un sistema de suministro que dirija tales compuestos en el sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial de células no infectadas y, asi, reducir los efectos secundarios. Los datos obtenidos a partir de los ensayos del cultivo celular y los estudios animales pueden usarse en la formulación de un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos yace preferiblemente dentro de un rango de concentraciones de circulación que incluyen el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva puede estimarse inicialmente a partir de los ensayos del cultivo celular. Una dosis puede formularse en modelos animales para obtener un rango de concentración de plasma que circula, que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que obtiene una inhibición máxima media de los síntomas) determinadas en el cultivo celular. Tal información puede usarse para determinar de forma más segura las dosis útiles en humanos. Los niveles en el plasma pueden medirse por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución. Una cantidad terapéuticamente efectiva de una 165 composición farmacéutica se encuentra típicamente en los rangos de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferiblemente de aproximadamente 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente de aproximadamente 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal e incluso más preferiblemente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg, de 2 a 9 mg/kg, de 3 a 8 mg/kg, de 4 a 7 mg/kg, o de 5 a 6 mg/kg de peso corporal. La composición farmacéutica puede administrarse en varios intervalos y en periodos diferentes de tiempo como se requiera, por ejemplo, muchas veces por día, diariamente, cada dos días, una vez por semana durante aproximadamente 1 a 10 semanas, entre 2 a 8 semanas, entre 3 a 7 semanas, aproximadamente 4, 5 ó 6 semanas, etc. El experto en la técnica apreciará que ciertos factores^ pueden influenciar la dosis' y el tiempo requerido para tratar de manera efectiva al sujeto, que incluye pero no se limita a la severidad de la enfermedad o desorden, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto y otras enfermedades presentes. Generalmente, el tratamiento de un sujeto con un ARNsi, ARNsh, o vector descrito en la presente, puede incluir un tratamiento sencillo, o en muchos casos, puede incluir una serie de tratamientos. Ejemplos de dosificaciones incluyen cantidades de miligramos o microgramos del ARNsi inventivo por kilogramo del peso de muestra del sujeto (por ejemplo, aproximadamente 166 1 microgramo por kilogramo hasta aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente 100 microgramos por kilogramo, de aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o de aproximadamente 1 microgramo por kilogramo hasta aproximadamente 50 microgramos por kilogramo) . Para la administración local (por ejemplo, intranasal) , pueden usarse dosis mucho más pequeñas que estas. Se entiende además que la dosis apropiada de un ARNsi depende de la potencia del ARNsi, y puede diseñarse opcionalmente para el recipiente particular, por ejemplo, a través de la administración de dosis incrementadas hasta que se obtiene una respuesta deseada preseleccionada . Se comprende que el nivel de la · dosis especifica para cualquier sujeto animal particular puede depender de la variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto especifico empleado, la edad, peso corporal, salud general, género y dieta del sujeto, el tiempo de administración, la ruta de administración, la relación de excreción, cualquier combinación de fármacos, y el grado de expresión o actividad que va a ser modulada. Como se mencionó arriba, la presente invención incluye el uso de composiciones de ARNsi inventivas para el tratamiento de animales no humanos que incluyen, pero no se limitan a, caballos, cerdos y aves. Por consiguiente, la dosis y métodos de administración pueden seleccionarse de acuerdo con los principios conocidos de la farmacología 167 veterinaria y la medicina. La guia puede encontrarse por ejemplo, en Adams, R. (ed.), Veterinary Pharmacology and Therapeutics, 8th edición, Iowa State üniversity Press; ISBN: 0813817439:2001. Como se describe arriba, las moléculas de ácidos nucleicos que sirven como plantillas para la transcripción de ARNsi o ARNsh pueden insertarse dentro de vectores que pueden usarse como vectores para la terapia de genes. En general, los vectores de terapia de genes puede suministrarse a un sujeto mediante por ejemplo, inyección intravenosa, administración local o mediante inyección intravenosa (ver por ejemplo, Chen et al., (1994) Proc. Nati Acad Sel. USA 91:3054-3057). En ciertas modalidades de la invención, las composiciones que comprenden vectores de terapia de genes y un agente de suministro pueden ser suministrados oralmente o inhalatoriamente y pueden ser encapsulados o por el contrario, manipularse para protegerlos de la degradación, etc. Las composiciones farmacéuticas que comprenden vectores de terapia de genes pueden incluir un diluyente aceptable, o pueden comprender una matriz de liberación lenta en la que se absorbe el vehículo de suministro de genes. Alternativamente, cuando el vector de suministro de genes puede producirse intacto a partir de las células recombinantes, por ejemplo, vectores lentivirales o retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir uno o más células que produce el 168 sistema de suministro de genes. Las composiciones farmacéuticas inventivas pueden introducirse en un recipiente, paquete o surtidor junto con las instrucciones para la administración.

Modalidades Adicionales Se apreciará que muchas enseñanzas proporcionadas en la presente pueden aplicarse fácilmente a infecciones con agentes infecciosos distintos al del virus de la influenza. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos y composiciones para inhibir la infección y/o replicación mediante cualquier agente infeccioso a través de la administración de una entidad que induce ARNi (por ejemplo, un ARNsi, ARNsh o un vector que induce ARNi) que inhibe la expresión o actividad de uno o más genes de agentes especifico involucrado en el ciclo de vida del .agente infeccioso. En particular, la presente invención proporciona métodos y composiciones para inhibir la infección y/o replicación mediante los agentes infecciosos que infectan células que son fácilmente accesibles desde el exterior del cuerpo. Tales células incluyen células de la piel y células mucosales, por ejemplo, células del tracto respiratorio, tracto urogenital, y ojos. Estas condiciones incluyen infecciones debido a agentes virales, protozoarios y/o fúngicos . Las infecciones del 169 tracto respiratorio adecuadas para el tratamiento usan composiciones de ARNsi inventivo como se describe en la presente, que incluyen pero no se limitan a, hantavirus, adenovirus, virus del herpes simple y coccidiomicosis, y la infección por histoplasmosis . El tracto urogenital y las infecciones de la piel adecuadas para el tratamiento que usan composiciones que inducen ARNi incluyen, pero no se limitan a, virus del papiloma (que provoca carcinomas cervicales entre otras condiciones) y virus del herpes. En particular, se observa que la terapia basada en ARNi puede ser particularmente apropiada para infecciones en las que ya sea (i) existan vacunas no efectivas, y/o (ii) no existe otra medicación efectiva y/o existen regímenes terapéuticos que son muy extensos o pesados, y/o (iii) el agente experimenta cambios genéticos que pueden suministrar terapias antiguas o vacunas ineficaces. Estos agentes incluyen muchos candidatos para usarse en armas biológicas, y por lo tanto, son de mucho interés en el desarrollo de métodos efectivos para la profilaxis y las terapias. Los tripanosomas cambian la superficie de los antígenos frecuentemente vía un evento de recombinación genética, la flexibilidad proporcionada por la capacidad para diseñar rápidamente ARNsi y ARNsh dirigidos a los transcritos que codifican a los antígenos de superficie nuevos sugieren que las terapias basadas en ARNi pueden ser apropiadas para las 170 enfermedades provocadas por los organismos que pueden cambiar rápidamente la superficie de los antigenos y de esta manera, evadir las metodologías basadas en el sistema inmune. En cada caso, el experto en la técnica seleccionará uno o más transcritos de agentes específicos necesarios o importantes para la infección efectiva, supervivencia, réplica, maduración, etc., del agente. Por transcrito de agentes específico se entiende un transcrito que tiene una secuencia que difiere de la secuencia de los transcritos encontrados normalmente en una célula hospedera no infectada en una región suficientemente grande que sirve como un objetivo para el ARNi . En general, tal región tiene al menos 15 nucleótidos en longitud. Observar que los ARNm del virus de la influen2a, que incluyen secuencias derivadas de los ARNm de células hospederas se consideran transcritos de agentes específicos. El transcrito de agentes específicos puede estar presente en el genoma del agente infeccioso o producido posteriormente durante el proceso infeccioso.- Uno o más ARNsi se diseñaran entonces de acuerdo al criterio presentado aquí. La capacidad de los ARNsi candidatos para suprimir la expresión de los transcritos de direccionamiento y/o la eficacia potencial de los ARNsi como agentes terapéuticos puede probarse usando modelos apropiados in vitro y/o ín vivo (por ejemplo, un animal) para seleccionar aquellos ARNsi 171 capaces de inhibir la expresión de los transcritos de direccionamiento y/o reducir o prevenir la infectividad, patogenicidad, réplica, etc., del agente infeccioso. Los modelos apropiados variarán dependiendo del agente infeccioso y pueden seleccionarse fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, para ciertos agentes infecciosos y para ciertos propósitos será necesario proporcionar células hospederas mientras que en otros casos, el efecto del ARNsi en el agente puede evaluarse en ausencia de células hospederas. Como se describió arriba con respecto a la infección del virus de la influenza, los ARNsi pueden diseñarse de manera que se dirijan a cualquiera de una variedad de genes de agentes específicos involucrados en una o más etapas del ciclo de infección y/o réplica. Tales ARNsi pueden introducirse en células antes de, durante, o después de la infección, y sus efectos en varias etapas del ciclo de infección/réplica pueden evaluarse como se desee. Es importante que los inventores hayan demostrado la inhibición efectiva mediada por ARNi de la expresión del transcrito de direccionamiento y de la entrada y réplica de un agente infeccioso usando virus infecciosos completos, opuesto a, por ejemplo, genes transfectados, transgenes integrados, genomas virales integrados, clones moleculares infecciosos, etc. La invención abraca una entidad que induce ARNi dirigida a un transcrito de agentes específicos que está 172 involucrado en la réplica, patogenicidad o infección mediante un agente infeccioso. Los transcritos de agentes específicos preferidos que pueden ser dirigidos de acuerdo con la invención incluyen el genoma de los agentes y/o cualquiera de otros transcritos producidos durante el ciclo de vida del agente. Los objetivos preferidos incluyen transcritos que son específicos para el agente infeccioso y que no se encuentra en la célula hospedera. Por ejemplo, objetivos preferidos pueden incluir polimerasas de agentes específicos, factores sigma, factores de transcripción, etc. Tales moléculas son bien conocidas en la técnica, y el practicante experto será capaz de seleccionar apropiadamente objetivos basándose en su conocimiento del ciclo de vida del agente. A este respecto, puede encontrase información útil en por ejemplo, Field's Virology, th edición, Knipe, D. et al. (eds.) Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2001; Marr, J., et al., Molecular Medical Parasitology; and Georgi 's Parasitology for Veterinarians, Bowman, D., et al., W.B. Saunders, 2003. En algunas modalidades de la invención, un transcrito preferido es uno que se asocia con la virulencia del agente infeccioso, por ejemplo, un producto de expresión de un gen virulento. Varios métodos para identificar los genes virulentos se conocen en la técnica, y se han identificado una variedad de tales genes. La disponibilidad de las secuencias genómicas para grandes números de virus 173 patogénicos y no patogénicos, bacterias, etc., facilitan la identificación de los genes de virulencia. De igual manera, los métodos para determinar y comparar los perfiles de expresión de las proteínas para las cepas patogénicas y no patogénicas y/o para una cepa simple en diferentes etapas en estos agentes de ciclo de vida permite la identificación de genes cuya expresión se asocia con la virulencia. Ver por ejemplo, Winstanley, "Spot the difference: applications of subtractive hibridisation to the study of bacterial pathogens", J Med Microbiol 2002 Jun; 51 ( 6) : 459-67; Schoolnik, G, "Functional and' comparative genomics of pathogenic bacteria", Curr Opin Microbiol 2002 Feb; 5(l):20-6. Por ejemplo, los genes de agentes que codifican proteínas que son tóxicas para las células hospederas serían considerados genes virulentos y pueden ser objetivos preferidos para los ARNi. Los transcritos asociados con la resistencia del agente para terapias convencionales son también objetivos preferidos en ciertas modalidades de la invención. A este respecto, se observa que en algunas modalidades de la invención, el transcrito de direccionamiento necesita no ser codificado por el genoma del agente pero puede en su lugar, ser codificado por un plásmido u otro elemento extracromosomal dentro del agente . En algunas modalidades de la invención, el virus es un virus distinto al virus sincitial respiratorio. En algunas 174 modalidades de la invención, el virus es un virus distinto al virus de la polio. Las entidades que inducen ARNi pueden tener cualquiera de una variedad de estructuras como las descritas arriba (por ejemplo, dos hebras de ARN, horquilla, estructuras, etc.). Estos pueden sintetizarse químicamente, producirse mediante transcripción in vitro o producidos dentro de una célula hospedera .

Ejemplificación Ejemplo 1: Diseño de ARNsi para inhibir el virus A de la influenza Se compararon las secuencias genómicas de un conjunto de cepas del virus de la influenza y se identificaron las regiones de cada segmento que estaban mejor conservadas. Este grupo de virus incluyeron virus derivados de aves, cerdos, caballos y humano. Para realizar la comparación de las secuencias, se alinearon los segmentos individuales de 12 a 15 cepas del virus A de la influenza de diferentes especies animales (no humanos) aisladas en distintos años y de 12 a 15 cepas de humanos aisladas en distintos años. Las cepas se seleccionaron para abarcar una amplia variedad de HA y subtipo NA. Se seleccionaron las regiones que se diferencian ya sea de 0, 1, ó 2 nucleótidos entre las distintas cepas. Por ejemplo, las siguientes cepas se usaron para la selección 175 de ARNsi que dirigen el transcrito NP, se indica el número de acceso antes de cada nombre de la cepa se refiere al número de acceso de la secuencia NP y las porciones de la secuencia que son comparadas mediante el número de nucleótido. El orden de las entradas en la siguiente lista es: número de acceso, nombre de la cepa, porción de la secuencia comparada, año, subtipo. Los números de acceso para los otros segmentos del genoma difieren pero no puede encontrase fácilmente en la base de datos mencionada arriba. Las cepas comparadas son: NC_002019 A/Puerto Rico/8/34 1565 1934 HlNl M30746 A/Wilson-Smith/33 1565 1933 HlNl 81583 A/Leningrad/134/47/57 1566 1957 H2N2 AF348180 A/Hong Kong/1/68 1520 1968 H3N2 L07345 A/Memphis/101/72 1565 1972 H3N2 D00051 A/Udorn/307/72 1565 1972 H3N2 L07359 A/Guangdong/38/77 1565 1977 H3N2 M59333 A/Ohio/201/83 1565 1985 H3N2 L07364 A/ emphis/14/85 1565 1985 H3N2 M76610 A/Wisconsin/3623/88 1565 1988 HlNl U71144 A/Akita/1/94 1497 1994 H3N2 AF084277 A/Hong Kong/483/97 1497 1997 H5N1 AF036359 A/Hong Kong/156/97 1565 1977 H5N1 AF250472 A/ave acuática/Hong Kong/M603/98 1497 1998 H11N1 176 ISDN13443 A/Sydney/27 /2000 1503 2000 H3N2 M63773 A/Pato/Manitoba/1/53 1565 1953 H10N7 63775 A/Pato/Pennsylvania/1/69 1565 1969 H6N1 M30750 A/Equino/Londres/1416/73 1565 1973 H7N79 63777 A/Gaviota/ aryland/5/77 1565 1977 H11N9 M30756 A/Gaviota/Maryland/1815/79 1565 1979 H13N6 M63785 A/Pato silvestre/Astrakhan (Gurj ev) /263/82 1565 1984 H14N5 M27520 A/Ballena/Maine/328/84 1565 1984 H13N2 M63768 A/Puerco/Iowa/17672/88 1565 1988 HlNl Z26857 A/Pavo/Io a/3/91 1554 1991 H1N1 U49094 A/Pato/Nanchang/1749/92 1407 1992 H11N2 AF156402 A/Pollo/Hong Kong/G9/97 1536 1997 H9N2 AF285888 A/Porcino/Ontario/0911-1/99 1532 1999 H4N6. La figura 9 muestra un ejemplo de la selección de ciertas regiones del transcrito ?? que se conservan altamente entre seis variantes A de la influenza (todas tienen una hospedera humana de origen) , en cuyas regiones se consideran altamente conservadas si difieren de ya sea 0, 1, ó 2 nucleótidos. (Observe que las secuencias se listan como ADN en lugar del ARN y por lo tanto, contienen T en lugar de U.) La secuencia de la cepa A/Puerto Rico/8/34 (HlNl) se seleccionó como la secuencia base, es decir, la secuencia se comparó con las otras secuencias. Los otros miembros del conjunto fueron A/WSN/33 (HlNl), A/Leningrado/134/17/57 177 (H2N2), A/Hong Kong/1/68 (H3N2), A/Hong Kong/481/97 (H5N1) , y A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). La figura presenta una alineación de secuencia múltiple producida por el programa de computadora CLUSTAL W (14) . Los nucleótidos que difieren de la secuencia base están protegidos. La figura 10 muestra un ejemplo de la selección de ciertas regiones del transcrito PA que están altamente conservadas entre cinco variantes de influenza A (todas las cuales tienen diferentes ospedadores animales de origen) y también entre dos cepas que tienen un hospedador humano de origen, en el cual las regiones se consideran altamente conservadas si difieren por ya sea 0, 1, ó 2 nucleótidos. (Notar que la secuencia se enlista como ADN en vez de ARN y por lo tanto contienen T en vez de ü) . La secuencia de la cepa A/Puerto Rico/8/34 (HlNl) se selecciona como la secuencia base, esto es, la secuencia con la cual las otras secuencias se comparan. Los otros miembros del conjunto son A/WSN/33 (HlNl), A/pollo/FVP/Rostock/34 (H7N1), A/pavo/California/189/66 (H9M2) , A/Equino/Londres/1416/73 (H7N7), A/gaviota/Mavilan/704/77 (H13N6) , y A/marrano/Hong Kong/9/98 (H9N2) . Los nucleótidos que difieren de la secuencia base están sombreados. Notar que en las comparaciones de secuencias en las figura 9 y 10 muchas regiones altamente conservadas diferentes pueden seleccionarse ya que grandes porciones 178 de la secuencia cumplen los criterios para ser altamente conservadas. Sin embargo, las secuencias que tienen AA en el extremo 5' proporcionan una secuencia de 19 nucleótidos en el núcleo y un nucleótido 2 en 3' üü colgante en la hebra ARNsi antisentido (complementaria) . Por lo tanto, las regiones que están altamente conservadas se revisan para identificar 21 porciones de nucleótido que tienen AA en su extremo 5' de manera que los nucleótidos complementarios, que se presentan en la hebra antisentido del ARNsi, son ÜU . Por ejemplo, cada una de las secuencias sombreadas tiene AA en su extremo 5' . Notar que el colgante UU3' en la hebra antisentido de la molécula de ARNsi resultante puede reemplazarse por TT ó dTdT como se muestra en la tabla 2. Por lo tanto, no es necesario que el colgante de 2 nt en 3' de la hebra antisentido sea UU . Para ilustrar además del método, la figura 12 muestra una comparación de secuencia entre una porción de la región 3' de las secuencias NP entre doce subtipos de virus de influenza A o aislados que tienen un hospedador de origen ya sea humano o animal. La secuencia subrayada y las porciones correspondientes de las secuencias debajo de las secuencias subrayadas se usan para designar el ARNsi NP-1496 (ver abajo) . Estas secuencias se indican en la figura 12. La secuencia base es la secuencia de la 179 cepa A/Puerto Rico/8/34. Las letras sombreadas indican los nucleótidos que difieren de la secuencia base. La tabla 1 enlista 21 regiones de nucleótido que son altamente conservadas entre el conjunto de secuencias de virus de influenza comparados para el segmento PA además de los otros siete segmentos del gen viral. Muchas de estas secuencias cumplen los criterios adicionales de que tienen ?? en su extremo 5' de manera que resultan en un colgante 3'UÜ en la hebra complementaria. Para el segmento PA, en casos donde una o dos diferencias de nucleótidos se presentan, las secuencias de los ARNsi se basan en la cepa A/PR8/34 (HlNl) excepto para la secuencia PA-2087/2107 AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA (SEQ ID NO: 30), que se basa en la cepa A/WSN/33 (HlNl ) . Notar que en la posición 20, cinco de las seis secuencias contienen una G mientras que en la secuencia base contiene un A. De esta manera en este caso, la secuencia de la secuencia base no se usa para diseñar el ARNsi. Para diseñar los ARNsi base en las secuencias enlistadas en la tabla 1 A, se seleccionan los nucleótidos 3-21 como las regiones núcleo de las secuencias de hebras sentido ARNsi, y un colgante de dos nt en 3' que consiste de dTdT se agrega a cada secuencia resultante. La secuencia complementaria a los nucleótidos 1-21 de cada secuencia se selecciona como la 180 correspondiente hebra antisentido. Por ejemplo, para diseñar un A Nsi con base en la secuencia altamente conservada PA-44/64, esto es, AATGCTTCAATCCGATGATTG (SEQ ID NO: 22) una región de núcleo de 19 nt que tiene la secuencia TGCTTCAATCCGATGATTG (SEQ ID NO: 109) se selecciona, ün colgante de dos nt 3' que consiste de dTdT se agrega, resultando (después de reemplazar T por U) en la secuencia 5' - UGCUUCAAUCCGAUGAüUGdTdT-3' 8SEQ ID NO: 79), que fue la secuencia de la hebra sentido de ARNsi. La secuencia de la correspondiente secuencia de hebra de ARNsi antisentido es complementaria a SEQ ID NO: 22, esto es, CAAUCAÜCAUCGGAÜÜGAAGCAdTdT (SEQ ID NO: 80) donde T se ha reemplazado por U excepto para el colgante 2 nt 3' en el cual T se reemplaza por dt . La tabla IB enlista los ARNsi diseñados con base en las regiones altamente conservadas adicionales de transcritos de virus de influenza. Las primeras secuencias de 19 nt de la secuencia que se indican como "hebra sentido" en la tabla IB son secuencias de regiones altamente conservadas. La secuencias de ARNsi de hebras sentido se muestran con un colgante dTdT en el extremo 3' , que no corresponde a la secuencias de virus de influenza y es una característica opcional del ARNsi. Las hebras antisentido correspondientes también se muestran, también incorporan un colgante dTdT en el extremo 3' como una 181 característica opcional. La nomenclatura es como en la tabla IB. Por ejemplo, el sentido PB2-4/22 indica un ARNsi cuya hebra sentido tiene la secuencia de nucleótidos 4-22 de transcrito PB2. El antisentido PB2-4/22 indica la hebra complementariamente antisentido que corresponde al sentido PB2-4/22. Para el ARNsi que dirige sitios en el transcrito que empalma un sitio de empalme, las posiciones dentro del transcrito no empalmados se indican. Por ejemplo, M-44-52/741-750 que los nucleótidos corresponden a 44-52 y 741-750 de las secuencias genómicas se dirigen en el ARNm. Las áreas sombreadas en la figuras 9 y 10 indican algunas de las regiones de 21 nucleótido que cumplen los criterios para ser altamente conservadas. Se diseñan los ARNsi con base en estas secuencias como se describe arriba, la secuencia de ARNsi actual que se prueban se enlistan en la tabla 2. 182 Tabla 1 Regiones conservadas para diseño de ARNsi para interferir con la infección del virus de influenza A Segmento1:PB2 PB2-117/137 AATCAAGAAGTACACATCAGG {SEQ ID NO: 1) PB2-124/144 AAGTACACATCAGGAAGACAG {SEQ ID NO: 2) PB2-170/190 A&TGGATGATGGCAATGAAAT (SEQ ID NO: 3> PB2-195/215 AATTACAGCAGACAAGAGGAT (SEQ ID NO: 4) PB2-1614/1634 AACTTACTCATCGTCAATGAT (SEQ ID HO: 5) PB2-1942/19S2 AATGTGAGGGGATCAGGAATG (SEQ ID NO: 6) PB2-2151/2171 AAGCATCAATGAACXGAGCAA (SEQ ID NO: 7) PB2-2210/2230 AAGGAGACGTGGTGTTGGTAA (SEQ ID NO: 8) PB2-2240/2260 AACGGGACTCTAGCATACTTA {SEQ ID NO: 9) PB2-2283/2303 ARGAATTCGGATGGCCATCAA (SEQ ID NO: 10) Segmento2: PB1 PB1-6/26 AAGCAGGCAAACCATTTGAAT {SEO. ID NO: 11) PBi-15/35 AACCATTTGAATGGATGTCAA {SEQ ID NO: 12) PB1-34/54 AATCCGACCTTACTTTTCTTA (SEQ ID NO: 13) PB1-56/76 A&GTGCCAGCACAAAATGCTA (SEQ ID NO: 14) PB1-129/149 AACAGGATACACCATGGATAC (SEQ ID NO: 15) EB1-1050/1070 AATGTTCTCAAACAAAATGGC (SEQ ID NO: 16) PB1-1242/1262 AATGATGATGGGCATGTTCAA {SEQ ID NO: 17) PB1-2257/2277 AAGATCTGTTCCACCATTGAA (SEQ ID NO: 18) Segmento3: PA PA-6/26 AAGCAGGTACTGATCCAAAAT (SEQ ID NO: 19) PA-24/44 AATGGAAGATTTTGTGCGACA (SEQ ID NO: 20) PA-35/55 TTGTGCGACAATGCTTCAATC (SEQ ID NO: 21) PA-44/64 AATGCTTCAATCCGATGATTG (SEQ ID NO: 22) PA-52/72 AATCCGATGATTGTCGAGCTT (SEQ ID NO: 23) PA-121/141 C&AATTTGCAGCAATATGC (SEQ ID NO: 24) PA-617/637 AAGAGACAATTGAAGAAAGGT (SEQ ID NO: 25) PA-711/731 TAGAGCCTATGTGGATGGATT (SEQ ID NO: 26) PA-739/759 AACGGCTACATTGAGGGCAAG (SEQ ID NO: 27) PA-995/1015 AACCACACGAAAAGGGAATAA (SEQ ID NO: 28) PA-2054/2074 AACCTGGGACCTTTGATCTTG (SEQ ID NO: 29) PA-2087/2107 AAGCAATTGAGGAGTGCCTGA (SEQ ID NO: 30) PA-2110/2130 AATGATCCCTGGGTTTTGCTT (SEQ ID NO: 31) PA-2131/2151 AATGCTTCTTGGTTCAACTCC (SEQ ID NO: 32) Segmento4: HA HA-1119/1139 TTGGAGCCATTGCCGGTTTTA (SEQ ID NO: 33) HA-1121/1141 GGAGCCATTGCCGGTTTTATT (SEQ ID NO: 34) HA-1571/1591 AATGGGACTTATGATTATCCC (SEQ ID NO: 35) Segmento5; Np NP-19/39 AATCACTCACTGAGTGACATC (SEQ ID NO: 36) NP-42/62 AATCATGGCGTCCCAAGGCAC (SEQ ID NO: •37) NP-231/251 AATAGAGAGAATGGTGCTCTC (SEQ ID NO: 38) 2ÍP-390/410 AATAAGGCGAATCTGGCGCCA (SEQ ID NO: 39) NP-393/413 AAGGCGAATCTGGCGCCAAGC (SEQ ID NO: 40) NP-708/728 AATGTGCAACATTCTCAAAGG (SEQ ID NO: 41) NP-1492/1512 AATGAAGGATCTTATTTCTTC (SEQ ID NO: 42) 183 NP-1496/1516 AAGGATCTTATTTCTTCGGAG (SEQ ID NO: 43) NP-1519/1539 AATGCAGAGGAGTACGACAAT (SEQ ID NO: 44) Seq mentó 6: NA NA-20/40 AATGAATCCAAATCAGAAAAT (SEQ ID NO: 45) NA704/724 GAGGACACAAGAGTCTGAATG (SEQ ID NO: 46) NA-861/881 GAGGAATGTTCCTGTTACCCT (SEQ ID NO: 47) NA-9G1/921 GTGTGTGCaGAGACAATTGGC {SEQ ID NO : 48) Seqmento 7: -156/176 AATGGCTAAAGACAAGACCAA (SEQ ID NO: 49) M-175/195 AATCCTGXCACCTCTGACTAA (SEQ X D NO: 50) M-218/238 ACGCTCACCGTGCCCAGTGAG (SEQ ID NO: 51) M-244/264 ACTGCAGCGTAGACGCTTTGT (SEQ ID NO: 52) M-373/393 ACTCAGTTATTCTGCTGGTGC (SEQ ID NO: 53) -377/397 AGTTATTCTGCTGGTGCACTT (SEQ ID NO : 54) M-480/500 AACA6ATIGCTGACTCCCAGC (SEQ ID NO: 55) M-584/604 AAGGCTATGGAGCAAATGGCT ISBQ ID NO: 56) M-598/618 AATGGCTGGATCGAGTGAGCA (SEQ ID NO : 57) M-686/706 ACTCATCCTAGCTCCAGTGCT (SEQ ID NO: 58) M-731/751 AATTTGC&GGCCTATCAGAAA (SEQ ID NO: 59) -816/836 ATTGTGGATTCTTGATCGTCT (SEQ ID NO: 60) M-934/954 AAGAATATCGAAA6GAACAGC (SEQ ID NO: 61) M-982/1002 ATTTTGTCAGCATAGAGCTGG (SEQ ID NO: 62) Seqmento S: NS NS-101/121 AAGAACTAGGTGATGCCCCAT (SEQ ID NO: 63) HS-104/124 AACTAGGTGATGCCCCATTCC (SEQ ID NO: 64) NS-128/1 8 ATCGGCTTCGCCGAGATCAGA (SEQ ID NO: 65) HS-137/157 GCCGAGATCAGAAATCCCTAA (SEQ ID NO: 66) NS-562/582 GGAGTCCTCATCGGAGGACTT (SEQ ID NO: 67) NS-589/609 AATGATAACACAGTTCGAGTC (SEQ ID NO: 68) Tabla IB . Regione s de cons ervación para designar el ' ARNsi para interferir con la infección de l virus A de influenza SegjTiento 1; PB2 PB2-4 /22 sentido GAAAGCAGGÜCAAUÜAUAÜdTdT (SEQ ID NO: 190) PB2-4/22 antisentido AUAOAAUDGACCUGCDüüCdTdT (SEQ ID NO : 191) PB2-12/30 sentido GÜCAAUUAÜAüüCAAÜAUGdTdT (SEQ ID NO : 192) PB2-12/30 antisentido CAUADDGAAUAUAAOüGACdTdT (SEQ ID NO : 193 ) PB2-68/86 sentido CUCGCACCCGCGAGAüACUdTdT (SEQ ID NO: 194 ) PB2-68/86 antisentido AGUAüCUCGCGGGüGCGAGdTdT (SEQ ID NO: 195) PB2-115/133 sentido AUAAüCAAGAAGnACACAÜdTdT (SEQ ID NO: 196) PB2-115/133 antisentido ADGÜGÜACÜÜCDüGAÜDADdTdT (SEQ ID NO: 197 ) PB2-167 /185 sentido üGAAAÜGGAUGAUGGCAAÜdTdT (SEQ ID NO: 198 ) PB2 -167/185 antisentido AÜÜGCCAÜCAUCCAÜOüCAdTdT (SEQ ID NO: 199) PB2-473/491 sent¡do CÜGGUCAÜGCAGAOCüCAGdTdT (SEQ ID NO: 200) PB2-473/491 antisentido CÜGAGAUCUGCAüGACCAGdTdT (SEQ ID NO: 201) PB2-956/974 sentido OAOGCAAGGCOGCAAÜGGGdTdT ( SEQ ID NO: 202) PB2-956/974 antisentido CCCAüüGCAGCCÜÜGCAüAdTdT (SEQ ID NO: 203) PB2-1622/1640 sentido CAUCGÜCAADGAÜGUGGGAdTdT (SEQ ID NO: 204) PB2-1622/1640 antisentido OCCCACAUCAüUGACGADGdTdT (SEQ ID NO: 205) 184 Segmento 2: PB1 PB1-1124/1142 sentido AAAOACCÜGCAGAAAUGCUdTdT SEQ ID NO: 206) PB1-U24/1142 antisentido AGCAÜÜOCOGCAGGÜAÜÜÜdTdT SEQ ID NO: 207) PB1-1618/1636 sentido AACAADAÜGAOAAACAAOGdrdT SEQ ID NO: 208) PB1-1618/1636 antisentído CAOOGDWAOCADADDGODdTdT SEQ ID NO: 209) Segmento 3: PA PA-3/21 sentido CGAAAGCAGGUACDGAüCCdTdT SEQ ID NO: 210) PA-3/21 antisentído GGAOCAGOACCUGCOOUCGdTdT SEQ ID NO: 211) PA-544/5S2 sentido AGGCUAOÜCACCAOAAGACdTdT SEQ ID NO: 212) PA-544/562 antisentido GÜCOTAUGGUGAAÜAGCCÜdTdT SEQ ID NO: 213) PA-587/605 sentido GGGAÜDCCüDÜCGOCAGOCdTdT SEQ ID NO: 214) ' PA-587/605 antisentído GACOGACGAAAGGAAUCCCd!TdT SEQ ID NO: 215) PA-1438/1466 sentido GCAOCÜDGDGCAGCAAUGGdXdT SEQ ID NO: 216) PA-1438/1466 antisentido CCADüGCüGCACAAGAUGCdTdT SEQ ID NO: 217) PA-2175/2193 sentido GDUGIGGCAGDGCDACUAUdTdT SEQ 'ID NO: 218) PA-2175/2193 antisentído ADAGÜAGCACUGCCACAACdTdT SEQ ID NO: 219) PA-2188/2206 sentido OACUAOOUGCOAUCCAUACdTdT SEQ ID NO: 220) PA-2188/2206 antisentido GUAOGGAUAGCAAAUAGUAdTdT SEQ ID NO: 221) Segmento 5: NP NP-14/32 sentido ÜAGAtWAÜCACDCACUGAGdTdT SEQ ID NO: 222) NP-14/32 antisense CÜCAGDGAGÜGAUÜAÜCOAdTdT SEQ ID NO: 223) NP-50/68 sentido CGOCCCAAGGCACCAAACGdTdT SEQ ID NO: 224) HP-50/68 antisentido CGüOÜGGUGCCDUGGGACGdTdT SEQ ID NO: 225) NP-1505/1523 sentido AÜUOCOOCGGAGACAADGCdTdT SEQ ID NO: 226) NP-1505/1523 antisentido GCAOOGDCOCCGAAGAAADdTdT SEQ ID NO: 227) NP-1521/1539 sentido OGCAGAGGAGüACGACAAUdTdT SEQ ID NO: 228) NP-1521/1539 antisentido AUüGUCGÜACÜCCUCUGCAdTdT SEQ ID NO: 229) NP-14881506 sentido GAGTAATGAAGGATCTTATdTdT SEQ ID NO: 230) NP-1488/1506 antisentído ATAAGATCCTTCATTACTCdTdT SEQ ID NO: 231) Sepnent7: M M-3/21 sentido CGAAAGCAGGDAGAüADOGdTdT SEQ ID NO 232) M-3/21 antisentido CAAOAÜCOACCOGCDUÜCGdTdT SEQ ID NO 233) -13/31 sentido DAGAOAOOGAAAGATTGAGOdTdT SEQ ID NO234) M-13/31 antisentído ACOCAUCOüDCAAOAÜCOAdTdT SEQ ID NO 235) M-150/158 sentido UCAÜGGAAUGGCUAAAGACdTdT SEQ ID NO 236) M-150/158 antisentído GOCÜDOAGCCADDCCAÜGAdTdT SEQ ID NO . 237) M-172/190 sentido ACCAAUCCüGÜCACCUCDGdTdT SEQ ID NO : 238) M-172/190 antisentido CAGAGGüGACAGGAOÜGGüdTdT SEQ ID NO 239) M-211/229 sentido UGUGUtíCACGCUCACCGüGdTdT SEQ ID NO 240) M-211/229 antisentido CACGGDGAGCGOGAACACAdTdT SEQ ID NO 241) M-232/250 sentido CAGOGAGCGAGGACüGCAGdTdT SEQ ID NO 242) M-232/250 antisentído COGCAGaCCÜCecUCACOGdTdT SEQ ID NO 243) M-255/273 sentido GACGCOUOGDCCAAAAÜGCdTdT SEQ ID NO 244) M-255/273 antisentido GCAOOOOGGACAAAGCGOCdTdT SEQ ID NO 245) M-645/663 sentido GÜCAGGCÜAGGCAAAUGGÜdTdT SEQ ID NO 246) M-645/663 antisentido ACCAOTOGCCÜAGCCOGACdTdT SEQ ID NO : 247) -723/741 sentido OacODGAAAAOÜOGCAGGCdTdT SEQ ID NO . 248) M-723/ 41 antisentído GCCOGCAAADDüDCAAGAAdTdT SEQ ID NO : 249) M-808/826 sentido UCAOÜGGGAOCODGCACDDdTdr SEQ ID NO 250) M-808/826 antisentido AAGüGCAAGAUCCCAAÜGAdTdT SEQ ID NO 251) M-832/850 sentido DGOGGAODCDüGADCGÜCDdTdT SEQ ID NO 252) M-832/850 antisentido AGACGAOCAAGAAaCCACAdTdT SEQ ID NO 253) 185 M-986yi004 sentido ?GOCAGCAÜAGAGCüGGAGdTdT (SEQ ID NO: 254) M-986/1004 antisentido COCCAGCDCOAOGCDGACAdTdT (SEQ ID NO: 255) M-44-52/741-75Q sentido GTCGAAACGCCTATCAGAAdTdT (SEQ ID NO: 256) M-44-52/741-750 antisentido UUCUGAÜAGGCGÜUUCGACdTdT (SEQ ID NO: 257) Segmento 8; NS NS-5/23 sentido AAAAGCAGGGOGACAAAGAdTdT (SEQ ID NO: 258) NS-5/23 antlsentldo ÜCüDOGDCACCCDGCüDUÜdTdT (SEQ ID NO: 259) KS-9/27 sentido GCAGGGÜGACAAAGACAUAdTdT (SEQ ID NO: 260) NS-9/27 antisentido UAOGOCOOOGDCACCCDGCdTdT (SEQ ID NO: 261) NS-543/561 sentido GGAUGDCAAAAAOGCAGÜUdTdT (SEQ ID NO: 262) NS-543/561 antisentido AACÜGCAÜUÜUÜGACAUCCdTdT (SEQ ID NO: 263) NS-623/641 sentido AGAGADOCGCDÜGGAGAAGdTdT (SEQ ID NO: 264) NS-623/641 antlsentldo CUDCÜCCAAGCGAAOCUCDdTdT (SEQ ID NO: 265) NS-642/660 sentido CAGOAAÜGAGAAÜGGGAGAdTdT (SEQ ID NO: 266) NS-642/660 antisentido ÜCÜCCCAOUCOCAÜDACüGdTdT (SEQ ID NO: 267) NS-831/849 sentido ÜÜGOGGADüCDDGAUCGÜCdTdT (SEQ ID NO: 268) NS-831/839 antisentido GACGAüCAAGAAÜCCACAAdTdT (SEQ ID NO: 269) Ejemplo 2: ARNsi que dirigen la polimerasa del ARN viral o nucleoproteina que inhibe la producción de virus- A de influenza Materiales y Métodos Cultivo celular. Se hacen crecer células de riñon canino Madin-Darby (MDCK) , una donación dada del Dr. Peter Hálese, Mount Sinai School of Medicine, New York, Y, de un medio de DMEM que contienen FCS, inactivado por calor al 10%, L-glutamina 2mM, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µg/ml estreptomicina. Las células se hacen crecer a 37 °C, 5% C02. Para electroporación, las células se mantienen en un medio RPMI 1640 libre de suero. Se dan las infecciones por virus en un medio de infección (DMEM, albúmina de suero de bovino al 0.3% (BSA, Sigma, St. Louis, MO) , Hepes lOmM, 100 unidades/ml 186 de penicilina, y 100% µ?/ta? de estreptomicina) . Virus. Se hacen crecer virus de influenza A7PR/8/34 (PR8) y A/WSN/33 ( SN) , subtipos H1N1, una donación del Dr. Peter Palese, Mount Sinai School of Medicine, durante 48 hrs . en huevos de pollo embrionados de 10 días (laboratorios Charles Ri er, MA) a 37° C. se cosecha el fluido alantoico 48 hrs después de la inoculación del virus y se almacena a -80° C. ARNsi. Se diseñan los ARNsi como se describe arriba, además, para conformar el criterio de selección descrito en el ejemplo 1, los ARNsi se diseñan generalmente de conformidad con los principios descritos en el boletín técnico # 003- Revisión B, "ARNsi Oligonucleotides por ARNi applications", disponible de Dharmacon Research, Inc., Lafayette, CO 80026, un distribuidor comercial de rectivos de ARN. Los boletines técnicos # 003 (accesible en en la www. En www. dharmacon . com/tech/tech003B .html) y # 004 (disponible en www. dharmacon . com/tech/tech004.html de Dharmacon contienen una variedad de información relevante a los parámetros de diseño de ARNsi, síntesis, etc., y se incorporan en la presente para referencia, la secuencia sentido y antisentido que se prueban se enlistan en la tabla 2. 187 Tabla 2. Secuencias ARNsi Nombre Secuencia ARNsi (¡p _ 3 ') PB2-2210/2230 (sentido) GGAGACGUGGUGUUGGUAAdTdT (SEO ID NO: 69) PB2-2210/2230 (antisentido) UUACCAACACCACGUCUCCdTdT (SEO ID NO: 70) PB2-2240/2260 (sentido) CGGGACUCUAGCAUACUUAdTdT (SEO ID NO: 71) PB2-2240/2260 (antisentido) UAAGUAUGCUAGAGUCCCGdTdT (SEO ID NO: 72) PB 1-6/26 (sentido) " GCAGGCAAACCAUUUGAAUdTdT (SEO ©NO: 73) PB1-6/26 (antisentido) AUUCAAAÜGGÜÜUGCCUGCdTdT (SEO ID NO: 74) PB 1-129/149 (sentido) CAGGAUACACCAUGGAUACdTdT (SEQ ID NO: 75) PB1-129/149 (antisentido) GUAÜCCAUGGUGUAUCCUGdTdT (SEO ID NO: 76) PB1-2257/2277 (sentido) GAUCUGUUCCACCAUUGAAdTdT (SEO ÍD NO: 77) PB1-2257/2277 (antisentido) UUCAAUGGUGGAACAGAUCdTdT (SEO ID NO: 78) PA-44/64 (sentido) UGCUUCAAUCCGAUGAUUGdTdT (SEO ID NO: 79 PA-44/64 (antisentido) CAAUCAUCGGAUUGAAGCAdTdT (SEO ID NO: 80 PA-739/759 (sentido) CGGCUACAUUGAGGGCAAGdTdT (SEQ IDNO: 81) PA-739/759 (antisentido) CüUGCCCUCAAUGUAGCCGdTdT (SEQ IDNO: 82) PA-2087/2107 (G) (sentido) GCAAÜUGAGGAGUGCCUGAdTdT (SEQ IDNO: 83) PA-2087/2107 (G) (antisentido) UCAGGCACUCCUCAAUUGCdTdT (SEQ IDNO: 84) PA-2110/2130 (sentido) UGAUCCCUGGGUUUUGCUUdTdT (SEQ ID NO: 85) PA-2110/2130 (antisentido) AAGCAAAACCCAGGGAUCAdTdT (SEQ IDNO: 86) PA-2131/2151 (sentido) UGCÜUCUUGGUUCAACUCCdTdT (SEQ ID NO: 87) PA-2131/2151 (antisentido) GGAGUUGAACCAAGAAGCAdTdT (SEQ IDNO: 88) NP-231/251 (sentido) UAGAGAGAAUGGUGCUCUCdTdT (SEQ ID O: 89) NP-231/251 (antisentido) GAGAGCACCAUUCUCUCUAdTdT (SEQ IDNO: 0 NP-390/410 (sentido) UAAGGCGAAUCÜGGCGCCAdTdT (SEQ IDNO: 91) M>-390/410 (antisentido) UGGCGCCAGAUUCGCCUÜAdTdT (SEO ID NO: 92) NP-1496/1516 (sentido) GGAUCUUAUUUCUUGGGAGdTdT (SEQ EDNO: 93) NP-1496/1516 (antisentido) CUCCGAAGAAAUAAGAUCCdTdT (SEQ IDNO: 94) NP-1496/1516a (sentido) GGAUCUUAUUUCUUCGGAGAdTdT (SEQ ID O: 188) NP-1496/1516a (antisentido) UCUCCGAAGAAAÚAAGAUCCdrdT (SEQ ID NO: 189) M-37/57 (sentido) CCGAGGUCGAAACGUACGUdTdT (SEQ ID O: 95) M-37/57 (antisentido) ACGUACGUUUCGACCUCGGdTdT (SEQ IDNO: 96) M-480/500 (sentido) CAGAUUGCUGACUCCCAGCdTdT (SEQ ID O: 7) M-480/5Ó0 (antisentido) GCUGGGAGUCAGCAAUCÜGdTdT (SEQ ID NO: 98) -598/618 (sentido) UGGCUGGAUCGAGUGAGCAdTdT (SEO JD NO: 99) -598/618 (antisentido) UGCUCACUCGAUCCAGCCAdTdT (SEQ IDNO: 100) M-934/954 (sentido) GAAUAUCGAAAGGAACAGCdTdT (SEQ ID O: 101) M-934/954 (antisentido) GCUGUUCCUUUCGAUAUUCdTdT (SEQID O: 102) NS-128 148 (sentido) CGGCUÜCGCCGAGAUCAGAdAdT (SEQ IDNO: 103) NS- 128/148 (antisentido). UCUGAUCUCGGCGAAGCCGdAdT (SEQ IDNO: 104 NS-562/582 (R) (sentido) GUCCUCCGAUGAGGACUCCdTdT (SEQ ID NO: 105) NS-552/582 (R) (antisentido) GGAGUCCUCAUCGGAGGACdTdT (SEQ IDNO: 106) NS-589/609 (sentido) UGAUAACACAGUUCGAGUCdTdT (SEQ IDNO: 107) NS-589/609 (antisentido) GACUCGAACUGUGUUAUCAdTdT (SEQ ID NO: 108) , 188 Todos los ARNsi se sintetizan por Dharmacon Research (Lafayette, CO) usando la química de protección 2'ACE. Las hebras de ARNsi se desprotegen de conformidad con las instrucciones del fabricante, se mezclan en relaciones equimolares y combinar los pares base por calentamiento hasta 95° C y reducir lentamente la temperatura por un 1° C cada 30 seg hasta 35° C y 1° C cada minuto hasta 5° C. Electroporación de ARNsi. Los cultivos de fase Log de células MDCK se tripsinan, se lavan y se vuelven a suspender en RPMI 1640 libre de suero a 2xl07 células por mi. Se colocan 0.5 mi de células en una cubeta de 0.4 cm y se electroforan usando un aparato Gene Pulser (Bio-Rad) a 400 V, 975 µ? con 2.5 nmol de ARNsi. Las eficiencias de electroporación son aproximadamente 30-40% de células viables. Las células electroporadas se dividen en 3 pozos de una placa de 6. pozos en medio de D EM lúe contiene FCS al 10% y se incuban a 37° C, 5% C02- Infección viral. Seis a ocho horas después de la electroporación, el medio que contiene suero se lava y se inoculan 100 µ? de virus PR8 o WSN a una multiplicidad apropiada de infección en los pozos, cada uno de los cuales contiene aproximadamente 106 células. Las células se infectan ya sea con 1,000 PFU (un virus por 1000 células; MOI = 0.001) ó 10,000 PFU (un virus por 100 células; MOI = 0.01) de virus. 189 Después de 1 hr. de incubación a temperatura ambiente, se agregan 2 mi de medio de infección con 4 g/ml de tripsina a cada pozo y las células se incuban a 37° C, 5%C02. En los tiempos indicados, se cosechan los sobrenadantes de los cultivos infectados y la titulación del virus se determina por hemaglutinación de eritrocitos de pollo (50 µ?, 0.5%, Charles River laboratories, MA) . Medición de la titulación viral. Se cosechan los sobrenadantes a 24, 36, 48 y 60 horas después de la infección. La titulación viral se mide usando un ensayo de hemaglutinina estándar como se describe en Knipe DM, Howley, PM, Fundamental Virology, 4a. edición, p34-35. El ensayo de hemaglutinación se da en placas de 96 pozos de fondo en "V". Se incuban diluciones de 2 veces en serie de cada muestra durante 1 hr en hielo con un volumen igual de una suspensión al 0.5% de eritrocitos de pollo (Charles River Laboratories) . Los pozos que contienen una capa homogénea, adherente, de eritrocitos se registran como positivos. Para ensayos de placa, se titulan diluciones de 10 veces en serie de cada muestra para el virus como se describe en Fundamental Virology, 4a' edición, p.32 (referenciado en otra parte en la presente) y bien conocido en el arte.

Resultados Para investigar la posibilidad de usar ARNsi para 190 suprimir la replicación del virus de influenza, se dirigen varios ARNs A de virus de influenza. Específicamente, se utilizó la línea de célula MDCK, que se infecta fácilmente y se usa ampliamente para estudiar el virus de la influenza. Cada ARNsi se introduce individualmente en poblaciones de célula MDCK por electroporaciones . El ARNsi dirigido a GFP (sentido: 5'- GGCUACGÜCCAGGAGCGCAUU -3' (SEQ ID NO: 110); antisentido: 5'- UGCGCUCCUGGACGUAGCCU - 3' (SEQ ID NO: 111)) se usó como control. Este ARNsi se refiere como GFP-949. En experimentos posteriores (descritos en los ejemplos de abajo) el colgante UU en el extremo 3f de ambas hebras se reemplaza por dTdT sin efecto en los resultados. También se realiza una electroporacion de imitación como un control. Ocho horas después de la electroporacion, la células se infectan ya sea con el virus de influenza a PR8 o WSN a un MOI de ya sea 0.2 ó 0.01 y se analizan para producción de virus en varios puntos de tiempo (24, 36, 48, 60 hrs . ) posteriormente usando un ensayo de hemaglutinación estándar. La expresión GFP se evalúa por citometría de flujo usando métodos estándar. Las figuras 11A y 11B comparan resultados de experimentos en los cuales la capacidad de los ARNsi individuales para inhibir la replicación de la cepa de virus A de influenza A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (figura 11 A) o la cepa del virus A de influenza A/ SN/33 (H1N1) (figura 11 B) se determina al medir la titulación HA. De esta manera, una 191 titulación HA alta indica una carencia de inhibición, mientras que una titulación HA baja indica una inhibición efectiva. Las células DCK se infectan a un MOI de 0.01. Para estos experimentos, un ARNsi que dirige el segmento PBl (PB1-2257/2277), un ARNsi que dirige el segmento PB2 (PB2-2240/2260), un ARNsi que dirige el segmento PA (PA-2087/2107(G)), y tres diferentes ARNsi que dirigen el genoma NP y el transcrito (NP-231/251, NP-390/410, y NP-1496/1516) se probaron. Notar que las leyendas en las figuras 11 A y 11 B enlistan solo el nucleótidos 5' de los ARNsi. Los símbolos en las figuras 11 A y 11B son como sigue: los cuadros rellenos representan las células de control que no reciben ARNsi. Los cuadros abiertos representan células que reciben el ARNsi de control GFP. Los círculos rellenos representan células que reciben ARNsi PB1-2257/2277. Los círculos abiertos representan células que - reciben ARNsi NA-PB2-2240/2260. Los triángulos abiertos representan células que reciben ARNsi PA-2087/2107 (G) . El símbolo X representa células que reciben el ARNsi NP-231/251. El símbolo + representa células que reciben ARNsi NP-390/410. Los triángulos cerrados representan células que reciben ARNsi NP-1496/1516. Notar que en las gráficas ciertos símbolos algunas veces se sobreponen. Por ejemplo, en la figura 11 B los triángulos abiertos y cerrados están súper puestos. Las tablas 3 y 4, que enlistan los valores numéricos para cada 192 punto, pueden consultarse para clarificación. Como se muestra en las figuras 11A y 11B (tablas 3 y 4) , en ausencia de ARNsi (TF de imitación) o presencia de ARNsi de control (GFP) , la titulación del virus se incrementa durante el tiempo, alcanzando un pico a aproximadamente 48-60 horas después de la infección. En contraste, a 60 horas la titulación viral se reduce importantemente en presencia de cualesquiera de los ARNsi. Por ejemplo, en la cepa WSN, la titulación HA (que refleja el nivel del virus) fue aproximadamente tanto como la mitad en presencia de los ARNsi PB2-2240 ó NP-231 que en los controles. En particular, el nivel de virus estuvo debajo del límite de detección (10,000 PFU/ml) en presencia de ARNsi NP-1496 en ambas cepas. Esto representa una reducción por un factor de más de 60 veces en la cepa PR8 y más de 120 veces en la cepa WSN. El nivel de virus también estuvo debajo del límite de detección (10,000 PFU/ml) en presencia de ARNsi PA-2087 (G) en la cepa WSN y fue extremadamente bajo en la cepa PR8. La supresión de producción de virus por ARNsi fue evidente aún desde el punto de tiempo más temprano medido. La supresión efectiva, incluyendo la supresión de producción de virus hasta niveles indetectables (como se determina por titulación HA) se ha observado en puntos de tiempo tan grandes como 72 horas después de la infección. La tabla 5 resume los resultados de los ensayos de 193 inhibición de ARNsi a 60 horas en células MDCK expresadas en términos de inhibición de pliegues. De esta manera, un valor bajo indica la carencia de inhibición, mientras que un valor alto indica una inhibición efectiva. La ubicación de los ARNsi dentro del gen viral se indica por el número que sigue al nombre del gen. Como en cualquier lugar en la presente, el número representa el nucleótido de partida del ARNsi en el gen. Por ejemplo, NP-1496 indica un ARNsi especifico para NP, el primer nucleótido de partida en el nucleótido 1496 de la secuencia NP. Los valores mostrados (veces de inhibición) se calculan al dividir las unidades de hemaglutinina de la transfección imitada por unidades de hemaglutinina de la transfección con el ARNsi indicado; un valor de 1 significa sin inhibición. Un total de veinte ARNsi, dirigidos a 6 segmentos del genoma del virus de la influenza (PB2, PB1, PA NP, M y NS) , se han probado en el sistema de linea celular MDCK (tabla 5) . Alrededor del 15% del ARNsi (PB1-2257, PA-2087G y NP-1496) probado exhibe un fuerte efecto, que inhibe la producción viral por más de 100 veces en la mayoría de los casos a MOI=0.001, y por 16 hasta 64 veces a MOI=0.01, sin tener en cuenta si se usa el virus PR8 ó WSN. En particular, cuando se usa ARNsi NP-1496 ó PA-2087, la inhibición no es tan pronunciada como con los sobrenadantes de cultivo que carecen de una actividad de hemaglutinina detectable. Estos ARNsi 194 potentes se dirigen a 3 diferentes segmentos de gen viral: PB 1 y PA, que están involucrados en el complejo de transcriptasa de ARN, y NP que es una nucleoproteina de enlace a la ARN de Hebras sencilla. Consistente con los hallazgos en otros sistemas, las secuencias dirigidas por estos ARNsi todas se colocan relativamente cerca del extremo cebador 3 de la región codificada (figura 13) . Aproximadamente el 40% de los ARNsi inhiben importantemente la producción de virus, pero la extensión de inhibición varia dependiendo de ciertos parámetros. Aproximadamente el 15% los ARNsi inhiben potentemente la producción de virus sin tener en cuenta si se usa un virus PR8 ó WSN. Sin embargo, en el caso de ciertos ARNsi la extensión de inhibición varia algunas veces dependiendo de si se usa PR8 ó WSN. Algunos ARNsi inhiben significativamente la producción de virus solo en puntos de tiempo más tempranos (24 hasta 36 Horas después de la infección) o solo a una dosis más baja de infección (MOI=0.001), tal como PB2-2240, PB1-129, NP-231 y M37. Estos ARNsi dirigen segmentos de gen viral diferentes, y las correspondientes secuencias se colocan ya sea cerca del extremo cebador 3 ó el extremo cebador 5 de la región de codificación (figura 13 y tabla 5) .

Aproximadamente 45% de los ARNsi no tienen un efecto discernible en la titulación del virus, lo que indica que no son efectivos para interferir con la producción de virus de 195 influenza en células DCK. En particular, ninguno de los cuatro ARNsi que dirigen el segmento del gen NS muestran ningún efecto inhibidor. Para estimar titulación de virus más precisamente, se realizan ensayos de placa con sobrenadantes de cultivo (a 60 hrs) de los sobrenadantes de cultivo obtenidos de las células infectadas con virus que experimentan una transfección de imitación o una transfección con NP-1496. Aproximadamente 6 x 105 pfu/ml se detectaron en el sobrenadante de imitación, mientras que no se detectaron placas en el sobrenadante NP-1496 sin diluir (figura 11 C) . Como el limite de detección del ensayo de placa es de alrededor de 20 pfu (unidades que forman placa) /mi, la inhibición de la producción de virus por NP-1496 es al menos alrededor de 30,000 veces. A un MOI de 0.1, NP-1496 inhibe la producción de virus alrededor de 200 veces. Para determinar la potencia del ARNsi, se transfiere una cantidad graduada de NP-1496 en células MDCK seguido por la infección con virus PR8. las Litulaciones de virus en los sobrenadantes cultivados se miden por ensayo de hemaglutininas . Cuando la cantidad de ARNsi disminuye, la titulación de virus se incrementa en los sobrenadantes de cultivo como se muestra en la figura 11 D. Sin embargo, aún cuando tan poco como 25 pmol de ARNsi se usan para la transfección, se detecta aproximadamente una inhibición 196 de 4 veces la producción de virus comparado con la transfección de imitación, lo que indica la potencia del ARNsi NP-1496 para inhibir la producción de virus de influenza . Para terapia, es deseable para el ARNsi sea capaz de inhibir efectivamente una infección de virus existente. En una infección de virus de influenza tipica, se liberan nuevos viriones iniciando alrededor de cuatro horas después de la infección. Para determinar si el .ARNsi reducirá o eliminará la infección por los virus recientemente liberados al enfrentarse a una infección existente, las células MDCK se infectan con virus PR8 durante 2 horas y luego se transfieren con ARNsi NP-1496. Como se muestra en la figura 11E, la titulación de virus se incrementa establemente durante el tiempo después de la transfección de imitación, mientras que la titulación de virus solo se incrementa ligeramente en células transfectadas con NP-1496. De esta manera, la administración de ARNsi después de la infección de virus es efectiva. Es conjunto, estos resultados muestran que.- (i) ciertos ARNsi pueden inhibir potencialmente la producción de virus de influenza; (ii) la producción de virus de influenza puede inhibirse por los ARNsi específicos para diferentes genes virales, incluyendo aquellos que 197 codifican proteínas NP, ??, y PB1; y(iii) la inhibición del ARNsi se presenta en células que se infectan previamente además de células infectadas simultáneamente con o después de la administración de los ARNsi.

Tabla 3. Inhibición de la cepa de virus ?/Puerto Rico/8/34 (H1N1) Producción por ARNsi Tabla 4. Inhibición de la producción de cepa de virus A/WSN/33 (H1N1) producidos por ARNsi ARNsi Hilera GFP PS1-2257 FB2-2040 PA-2087(G) NP-231 NP-390 NP-1496 24 hr 32 32 1 8 1 8 16 1 36 hr 64 128 16 32 1 64 64 1 48 hr 128 128 16 64 1 64 64 1 60 hr 128 128 32 64 1 64 128 1 198 Tabla 5: efectos de 20 ARNsi en la producción de virus de influenza en células MDCK Infección de virus (MOI) ARNsi pR8 PR8 PR8 WSN WSN (0.001) (0.01) (o.i) (o.oon (o.oi) Bxp. l GFP-949 2 1 PB2-2210 16 8 PB2-2240 128 16 PBÍ-6 4 4 PB1-129 128 16 PBJ-2257 256 64 Exp. 2 GEP-9 9 2 1 PA-44 2 1 PA-739 4 2 PA-2087 12S 16 PA-21I0 8 4 PA-2131 4 2 Exp.3 NP-231 16 4 4 NP-390 4 2 2 NP-1496 16 64 128 M-37 2 2 128 Exp.4 M-37 2 128 M-480 2 4 M-59S 2 128 M-934 1 4 S-128 2 2 NS-562 1 1 NS-589 1 1 NP-1496 64 128 Exp.5 GFP-949 1 1 PB2-2240 8 2 PB1-2257 8 4 PA-2087 16 128 NP-1496 64 128 NP-231 8 2 Ejemplo 3: ARNsi que dirigen la polimerasa o núcleo proteina de ARN viral que inhibe la producción de virus de 199 influenza A en embriones de pollo.

Materiales y Métodos Formación de un complejo ARNsi-oligofectamina en inoculación de embriones de pollo. Se preparan ARNsi como se describe arriba. Se mantienen huevos de pollo bajo condiciones estándar. Se mezclan 30µ1 de oligofectamina (número de producto 12252011: Life Techonologies , ahora Invitrogen) con 30µ1 de Opti-MEM I (Gibco) y se incuba a temperatura ambiente durante 5 minutos. Se mezclan 2.5 mmol (10 µ?) de ARNsi con 30 µ? de Opti-MEM I y se agrega en la oligofectamina diluida. Se incuban el ARNsi y la oligofectamina a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se inoculan huevos de pollo de 10 días de edad con el complejo ARNsi-oligifectamina junto con 100 µ? de virus PR8 /5000 pfu/ml) . Los huevos se incuban a 37° C durante el tiempo indicado y se cosecha el fluido alantoico. La titulación viral en el fluido alantoico se prueba por ensayo HA como se describe arriba.

Resultados Para confirmar los resultados en células MDCK, la capacidad del ARNsi para inhibir la producción de virus de influenza en huevos de pollo fertilizados también se evalúa. Debido a que la electroporación no puede usarse en huevos, la 200 oligofectamina, un agente con base en lípido que se ha mostrado que facilita la absorción intracelular de oligonucleótido de ARN asi como los ARNsi in vitro, se usó (25) . Brevemente, el virus PR8 solo (500 pfu) ó virus más complejo de ARNsi-oligofectamina se inyectó en la cavidad alantoica de huevos de pollo de 10 días de edad como se muestra esquemáticamente en la figura 14 A. Se conectan los fluidos alantoicos 17 horas más tarde para medir las titulaciones de virus por ensayo de hemaglutinina . Como se muestra en la figura 14 B, cuando el virus se inyecta solo (en presencia de oligofectamina) , se detectan rápidamente altas titulaciones de virus. La co-inyección de GFP-949 no afecta importantemente la titulación de virus (no se observa reducción importante en la titulación de virus cuando se omite la oligofectamina) . La inyección de los ARNsi específicos para virus de influenza muestra resultados consistentes con aquellos observados en células MDCK: los mismos ARNsi (NP-1496, PA2087 y PBl-2257) que inhiben la producción de virus de influenza en células MDCK también inhiben la producción de virus en huevos de pollo, mientras que los ARNsi (NP-231, M-37 y PB1-129) que son menos efectivos en células MDCK, no fueron efectivos en huevos de pollo fertilizado. De esta manera, los ARNsi' también son efectivos para interferir con la producción de virus de influenza en huevos de pollo fertilizado. 201 Ejemplo 4: ARNsi inhibe la producción del virus de la influenza al nivel del ARNm.

Materiales y Métodos Se efectúo la preparación de ARNsi como se describe arriba . Extracción de ARN, transcripción inversa y PCR en tiempo real. Las células 1 x 107 MDCK se electroporaron en 2.5 nmol de NP-1496 de electroporado de imitación (sin ARNsi) . Ocho horas después se inoculó un virus de influenza A PR8 en las células a MOI=0.1. En momentos 1,2, y 3 horas después de la infección, se retiró el sobrenadante y las células se Usaron con reactivo de Trizol (Gibco) . Se purificó el ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa (RT) se efectuó a 37°C durante 1 hora usando 200 ng de ARN total, cebadores específicos (ver a continuación) y un kit de transcriptasa inversa Omniscript (Qiagen) en una mezcla de reacción de 20 µ? de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cebadores específicos para ARNm, NP ARNv, NP ARNc, NS ARNv, o NS ARNc fueron como siguen: ARNm, dTis= 5' TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 112) NP ARNv, NP-367: 5r -CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 113) . NP ARNc, np-1565R: 5' ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT-3' (SEQ ID NO: 202 114) . NS ARNv, NS-527: 5 ' -CAGGACATACTGATGAGGATG-3' (SEQ ID NO: 115) . NS ARNc, NS-890R: 5' -ATATCGTCTCGATATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT-3' (SEQ ID NO: 116) . Un µ? de la mezcla de reacción RT (esto es la muestra obtenida al efectuar una transcripción inversa) y los cebadores específicos de secuencia se usaron para una PCR en tiempo real usando un mezcla maestra de PCR SYBR Green (AB Applied Biosystems) incluyendo un colorante de enlace de ADN de hebra doble SYBR Green I. Formaron ciclos las PCR en un sistema de detección de secuencia ABI PRISM 7000 (AB Applied Biosystems) y se analizaron con el software ABI PRISM 7000 SDS (AB Applied Biosystems) . La reacción por PCR se efectúo a 50°C, 2 min 95°C, 10 min, luego 95°C, 15 sec y 60°C, 1 minutos por 50 ciclos. Se analizaron los tiempos del ciclo a una lectura de 0.2 unidades de fluorescencia. Todas las reacciones se hicieron por duplicado. Los tiempos del ciclo que varían por más de 1.0 entre los duplicados se descartaron. Los tiempos de ciclo duplicados luego se promediaron y el tiempo del ciclo de ß-actina se resto de ellos para un valor normalizado. Los cebadores PCR fueron como sigue: Para los ARN de NP 203 NP-367: 5' -CTCGTCGCTTATGACAAAGAAG-3' (SEQ ID NO: 117). NP-460R: 5' AGATCATCATGTGAGTCAGAC-3' (SEQ ID NO: 118) . Para ARN NS: NS-527: 5' -CAGGACATACTGATGAGGATG-3' (SEQ ID NO: 119). NS-617R: 5 ' -GTTTCAGAGACTCGAACTGTG-3' (SEQ ID NO: 120).

Resultados Como se describe arriba durante la replicacion del virus de la influenza, se transcribe el ARNv para producir ARNc que sirve como un plantilla para más síntesis de ARNv y ARNm, que sirve como una plantilla para la síntesis de proteína (1) . Aunque se conoce que ARNi dirige la degradación del ARNm en una forma específica de secuencia (16-18), existe una posibilidad de que el ARNv y ARNc se han también objetivos para ARNsi ya que el ARNv de la virus A de la influenza es sensible a la nucleasa 1. Para investigar el efecto de ARNsi en la degradación de diversas especies de ARN, la transcripción inversa usando cebadores específicos de secuencia seguido por PCR de tiempo real se usó para cuantificar los niveles de ARNv, ARNc y ARNm. La figura 16 muestra la relación del virus de la influenza ARNv, ARNm y ARNc. Como se muestra en las figuras 16A y 16B, el ARNc es el complemento exacto de ARNv, pero el ARNm contiene una estructura de cierre en la terminación 5r en los 10 a 13 nucleótidos adicionales derivados del ARNm de célula 204 hospedera y ARNm contiene una secuencia polyA en la terminación 3' comenzando en el sitio complementario a un sitio de 15 - 22 nucleótidos en la dirección descendente desde el extremo 5' del segmento ARNv. Asi comparado a ARNv y ARNc, el ARNm carece de 15 a 22 nucleótidos en la terminación 3' . Para diferenciar entre las tres especies virales de ARN se usaron cebadores específicos para ARNv, ARNc, y ARNm en la primera reacción de transcripción inversa (Figura 16B) . Para ARNm se usó el poly dT18 como cebador. Para ARNc un cebador complementario a la terminación 3' del ARNm que falta del ARNm se usó. Para el ARNv, el cebador puede estar siempre en cualquier lugar a lo largo del ARN con tal que sea complementario a ARNv y no esté demasiado cercano a la terminación 5' . El ADNc resultante transcrito de solamente de uno de los ARNs se amplifica por PCR en tiempo real. Después de la infección por el virus de la influenza, están empezando a empacarse nuevos viriones y liberarse por alrededor de 4 horas. Para determinar el efecto de ARNsi en la primera onda de transcripción de ARNm y ARNc se aisló el ARN temprano después de la infección. Brevemente, NP-1-496 se electroporo en las células MDCK. También se efectuó una electroporación por imitación (sin ARNsi) de seis a ocho horas después se infectaron las células con el virus PR8 a MOI=0.1. Las células luego se Usaron 1, 2 y 3 horas después de la infección y se aisló la ARN. Los niveles de ARNm ARNv y 205 ARNc se ensayaron por transcripción inversa usando cebadores para cada especie de ARN seguido por PCR de tiempo real. La figura 17 muestra cantidades de NP viral y otras especies de ARN NS en diversos momentos después de la infección con el virus, en células que se transfecta por imitación o que se transfectan ARNsi NP-1496 aproximadamente de 6 a 8 horas previo a la infección. Como se muestra en la figura 17 1 hora después de la infección no hubo una diferencia importante en la cantidad de NP ARNm entre muestras con o sin una transfección de NP ARNsi. Tan pronto como dos horas después de la infección, el NP ARNm se incrementoó 38 veces grupos de transfección por imitación mientras que los niveles de NP ARNm no se incrementaron (o aun disminuyeron ligeramente) en células transfectadas con ARNsi. Tres horas después de la infección los niveles de transcrito de ARNm continuaron incrementándose én la transfección por imitación mientras que una disminución continua en la cantidad de NP ARNm se observó en las células que recibieron tratamiento por ARNsi. NP ARNv y ARNc desplegó un patrón similar excepto que el incremento de una cantidad de ARNv y ARNc en la transfección por imitación fue importante solamente tres horas después de la infección. Aunque no se desea apegarse por ninguna teoría, es probable debido al ciclo de vida del virus de la influenza en el cual una ronda inicial de la transcripción de ARNm, sucede antes 206 de ARNc y después en la síntesis de ARNv. Estos resultados indican que consistente con los resultados de medición intacta del virus vivo por ensayo de hemaglutinina o ensayo de placas las cantidades de todas las especies de NP ARN también se redujeron significativamente por el tratamiento por NP ARNsi. Aunque se sabe que ARNsi media principalmente la degradación de ARNm los datos de este experimento no excluyen la posibilidad de una degradación mediada de ARNsi de NP ARNc y ARNv aunque los resultados descritos a continuación sugieren la reducción en niveles de proteina de NP como un resultado de una reducción en los resultados de NP ARNm en la estabilidad disminuida de NP ARNc y/o ARNv.

Ejemplo 5: Identificación del objetivo de la interferencia del ARN. Materiales y Métodos. La preparación de ARNsi de los ARNsi sin modificar se efectuó como se describe arriba. Los oligonucleótidos de ARN modificados en el cual el grupo 2'-hidroxilo se substituye con un grupo 2'-0-metilo en cada residuo de nucleótido de la hebra de sentido o antisentido o ambos, se sintetizaron también por Dharmacon. Se desprotegieron los oligonucleótidos modificados y se combinaron a sus pares base a la hebra complementaria como se describe para los oligonucleótidos no 207 modificados. Los dúplex de ARNsi se analizaron para terminación de la formación dúplex por electroforesis de gel.

Cultivo de células, transfección con ARNsi, e infección con virus. Estas se efectuaron esencialmente como se describen en arriba. Brevemente, para el experimento que involucra NP-1496 ARNsi, modificado se transfectaron primero las células con MDCK con NP-1496 ARNsi (2.5 nmol) formado a partir de hebras de tipo silvestre y modificadas y se infectaron 8 horas después con un virus de PR8 a un OI de 0.1. Las concentraciones de virus en los sobrenadantes de cultivo se ensayaron 24 horas después de la infección. Para el experimento que involucra M-37 ARNsi, se transfectaron las células MDCK con M-37 ARNsi (2.5 nmol), infectadas con un virus PR8 a un MOI de 0.01 y se cosecharon para el aislamiento de ARN 1, 2 y 3 horas después de la infección. Ver la tabla 2 para las secuencias de sentido y antisentido M37. Extracción con ARN, transcripción inversa y PCR en tiempo real se efectuaron esencialmente como se describen arriba. Los cebadores específicos para ARNm, ARNv específicos de M y ARNc de M usados para transcripción inversa fueron como sigue: ARNm, dTi8= 5' TTTTTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO: 112) M ARNv: 5 ' -CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG- 3' (SEQ ID NO: 161) M ARNc 5'- ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT-3 ' (SEQ 208 ID NO: 162) . Los cebadores PCR para los ARNs M fueron como sigue: M delantero 5' -CGCTCAGACATGAGAACAGAATGG -3' (SEQ ID NO: 163) .M inverso: 5' -TAACTAGCCTGACTAGAAACCTC -3' (SEQ ID NO: 164) Resultados Para investigar la posibilidad de que el ARNsi pudiera interferir con ARNv y/o ARNc además de ARNm, los NP-1496 ARNsi en los cuales la hebra de sentido (S O +) o antisentido (AS o -) se modificó se sintetizaron. La modificación que substituye a un grupo 2'-0-metilo o para el grupo 2'hidroxilo en cada residuo de nucleótido no afecta el apareamiento de bases para la formación del dúplex pero la hebra de ARN modificada ya no soporta la interferencia de ARN. En otras palabras, un ARNsi en el cual la hebra en sentido se modifican pero la hebra antisentido es de tipo silvestre (mS:wtAS) soportará la degradación de los ARNs que tiene una secuencia complementaria a la hebra en sentido pero no una secuencia complementaria a la hebra en sentido. Inversamente un ARNsi la hebra de sentido es de tipo silvestre pero la hebra antisentido es modificada (wtS:mAS) soportara la degradación de los ARNs que tiene una secuencia complementaria a la hebra de sentido pero no soportaran la 209 degradación de los ARN que tiene una secuencia complementaria a la hebra de sentido. Este fenómeno se describe en mayor detalle en la solicitud de patente provisional copendiente Ser. No. 60/446,387 y titulada "Reducción del respaldo de ARNi" . Las células MDCK fueron transfectadas con imitación o transíectadas con NP-1496 ARNsi en las cuales la hebra de sentido (mS:wtAS) o la hebra antisentido (wtS:mAS) se modifica mientras que la hebra fue de tipo silvestre. Las células también se transfectaron con NP-1496 ARNsi en la cual ambas hebras se modificaron (mS:mAS). Luego se infectaron las células con el virus PR8 y se midieron la concentración de virus en el sobrenadantes. Como se muestra en la figura 18A, se detectaron altas concentraciones de virus en los cultivos sometidos a una transfección por imitación. Como se esperaba se detectaron concentraciones muy bajas de virus en los cultivos transfectados con el ARNsi (wtSrwtAS) de tipo silvestre pero se detectaron altas concentraciones de virus en cultivos transfectados con ARNsi en los cuales se modificaron ambas hebras (mS:mAS). Las concentraciones de virus fueron altas en los cultivos transfectados con ARNsi en los cuales se modificó la hebra antisentido (wtAS:mAS), mientras que las concentraciones de virus fueron bajas en cultivos transfectados con ARNsi en los cuales la hebra de sentido solamente se modificó (mS:wtAS). Aunque no se desea 210 apegarse por ninguna teoría, los inventores sugieren que el requerimiento para una hebra antisentido de tipo silvestre (-) del dúplex ARNsi para inhibir el virus de la influenza, sugiere que el objetivo de la interferencia del ARN sea ARNm (+) o ARNc (+) o ambos. Para diferenciar además estas posibilidades, el efecto de ARNsi en la acumulación de los ARNm, ARNv y ARNc correspondientes se examinó. Para seguir la transcripción en un ensayo de células simultáneamente infectadas, se cosecharon células MDCK transfectadas con ARNsi para un aislamiento de ARN 1, 2, o 3 horas después de la infección (antes de la liberación y re infección de nuevos viriones) . Los ARNm, ARNv y ARNc virales se convirtiero primero independientemente a ADNc por transcripción inversa usando cebadores específicos. Luego se cuantifico el nivel de cada ADNc por PCR de tiempo real. Como se muestra en la figura 18B, cuando un ARNsi específico de en M-37 se usa, se detecta poco ARNm específico de M detectado uno o dos horas después de la infección. Tres horas después de la infección, ARNm específica M se detecta en ausencia de M-37. Las células transfectadas con M-37, el nivel de ARNm específico de M se reduce por aproximadamente 50%. En contraste los niveles de ARNv y ARNc específicos de M no se inhibieron por la presencia de M-37. Aunque no se desea apegarse por ninguna teoría, estos resultados indican que el ARNm viral es 211 probablemente el objetivo de la interferencia mediada por ARNsi.

Ejemplo 6: Efectos amplios de ciertos ARNsi en la acumulación del ARN viral . Resultados Se efectuó la preparación de ARNsi como se describe arriba . Extracción de ARN transcripción inversa y la PCR en tiempo real se efectuaron como se describen en el ejemplo 3. Los cebadores específicos para ARNm, NP ARNv, NP ARNc, NS ARNv, NS ARNc, M ARNv, o ARNc fueron como se describen en los ejemplos 4 y 5. Los cebadores específicos para PBl ARNv, PBl ARNc, PB2 ARNv, PB2 ARNc, PA ARNv, o PA ARNc, usados para la transcripción inversa fueron como sigue: PBl ARNv: 5 ' GTGCAGAAATCAGCCCGAATGGTTC-3' (SEQ ID NO: 165) PBl ARNc: 5' ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3' (SEQ ID NO: 166) PB2 ARNv: 5' GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3' (SEQ ID NO: 167) PB2 ARNc: 5' -ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT-3' (SEQ ID NO: 168) PA ARNv: 5' -GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3' (SEQ ID NO: 169) PA ARNc. 5 ' -ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT-3' (SEQ ID NO: 170) Los cebadores PCR para los ARN de PBl, PB2 y PA .fueron 212 como siguen: PB1 delantero: 5' -CGGATTGATGCACGGATTGATTTC-3' (SEQ ID NO: 171) PB1 inverso: 5' -GACGTCTGAGCTCTTCAATGGTGGAAC-3' (SEQ ID NO: 172) ' PB2 delantero: 5' -GCGAAAGGAGAGAAGGCTAATGTG-3' (SEQ ID NO: 173) PB2 inverso: 5' -AATCGCTGTCTGGCTGTCAGTAAG-3' (SEQ ID NO: 174) PA delantero: 5' -GCTTCTTATCGTTCAGGCTCTTAGG-3' (SEQ ID NO: 175) PA inverso: 5' -CCGAGAAGCATTAAGCAAAACCCAG-3' (SEQ -ID NO: 176) Resultados Para determinar si NP-1496 dirige la degradación del segmento de genes NP específicamente o si los niveles de loa ARN virales diferentes a NP también se afectan, se usaron cebadores específicos para NS para RT y PCR en tiempo real para medir la cantidad de especies de ARN MS diferentes (ARNm, ARNv, ARNc) como se describen arriba (ejemplo 4) . Cómo se muestra en la figura 19 los cambios en NS ARNm, ARNv, y ARNc mostraron el mismo patrón de que el que se observa para los NP AR s . Tres horas después de la infección, un incremento importante en todas las especies de NS ARN se pudo observar 213 en las células transfectadas por imitación mientras que no se observaron cambios importantes en los niveles de NS ARN en las células que recibieron NP-1496 ARNsi. Este resultado indica que la transcripción y replicación de ARN virales diferentes se regula coordinadamente al menos con respecto a NP AR s. Al regular coordinadamente significa que los niveles de un transcrito afectan los niveles de otro transcrito directa o indirectamente. No está implicado ningún mecanismo en particular. Cuando los transcritos de NP se degradan por tratamiento por ARNsi también se reducen los niveles de otros ARNs virales . Para explorar además el efecto de NP ARNsi sobre, otros ARN virales, se midió la acumulación de ARNm, ARNv, y ARNc de todos los genes virales en células que habían sido tratadas con NP-1496. Como se muestran en la figura 19A (Panel superior), el ARNm específico de NP fue bajo una o dos horas después de la infección. Tres horas después de la infección, se detectó fácilmente el NP ARNm en ausencia de NP-1496 mientras que en presencia de NP-1496 el nivel de NP ARNm permaneció al nivel de respaldo, indicando que ARNsi inhibió la acumulación del ARNm específico. Como se muestra en la figura 19A (paneles de la mitad y del fondo) , los niveles de ARNv específicos de NS y específicos de NP y ARNc de inhibieron ampliamente por la presencia de NP-1496. Estos resultados confirman los resultados descritos en el ejemplo 4. 214 Además, en las células tratadas con NP-1496 la acumulación de ARNm, ARNv, y ARNc de los genes M, NS, PB1, PB2 y PA también se inhibe (figura 19B, 19C y 19H) . Adicionalmente, el efecto inhibidor amplio también se observó para PA-2087. Los paneles de la parte superior de la mitad y del fondo al lado izquierdo en las figuras 19E, 19F y 19G, despliegan los mismo resultados como se presentan en las figuras 19?, 19B y 19C, lo que muestra que la inhibición de la transcripción de la ARNm viral y de la replicación viral de ARNv y ARNc por NP-1496 ARNsi. Los paneles de la parte superior de la mitad del fondo a lado derecho en las figuras 19E, 19F y 19G presentan resultados del mismo experimento efectuado con PA-2087 ARNsi a la misma concentración. Como se muestra en la figura 19E, los paneles superior derecho, medio inferior respectivamente tres horas después de la infección, los ARNm de PA, M, y NS se detectaron fácilmente en ausencia de PA-2087 mientras que la presencia de PA-2087 inhibió la transcripción de PA, , y NS ARNm. Como se muestra en la figura 19F, los paneles superior derecho, medio inferior respectivamente tres horas después de la infección, los ARNv de PA, , y NS se detectaron fácilmente en ausencia de PA-2087 mientras que la presencia de PA-2087 inhibió la transcripción de PA, M, y NS ARNv. Como se muestra en la figura 19G, los paneles superior derecho, medio inferior respectivamente tres horas después de la infección, los ARNc de PA, M, y NS se detectaron 215 fácilmente en ausencia de PA-2087 mientras que la presencia de PA-2087 inhibió la acumulación de ARNc de PA, M, y NS. Además, la figura 19H muestra que los ARNsi específicos de NP inhiben la acumulación de PB1 (panel superior) , PB2 (panel medio) y PA- (panel inferior) del ARNm específico. Aunque no se desea apegarse por ninguna teoría, los inventores sugieren que el efecto amplio de NP ARNsi es probablemente un resultado de la importancia de NP en el enlace y estabilización de ARNv y AR c y no debido a que el ARNsi específico de NP dirige la degradación del ARN no específicamente. El segmento del gen NP en el virus de la influenza codifica una nucleoproteína de enlace de ARN de hebra sencilla que se puede enlazar a ARNv y ARNc (ver figura 15) . Durante el ciclo de vida viral, el ARNm de NP se transcribe y traduce primero. La función primaria de la proteína NP es formar la cápsida del genoma del virus para el propósito de la transcripción del ARN, replicación y empaque. En ausencia de la proteína NP, la síntesis de longitud completa de ARNv y ARNc se debilita fuertemente. Cuando NP ARNsi induce la degradación de NPARN la síntesis de la proteína NP se debilita y la falta de proteína suficiente NP resultante afecta posteriormente la replicación de otros segmentos del gen viral. De esta manera, NP ARNsi se puede inhibir potentemente la producción del virus en una etapa muy temprana. 216 El número de moléculas de proteína NP en las células infectadas se ha hipotetizado por regular los niveles de la síntesis de ARNm contra la replicación del genoma del ARN (ARNv y ARNc) (1) . Al usar una mutación sensible a la temperatura en la proteína NP, los estudios previos han demostrado que la síntesis del ARNc pero no la del ARNm es sensible a la temperatura tanto in vitro como in vivo (70, 71) . La proteína NP se muestra que se requiere para la prolongación y antiterminación de los transcritos nacientes de ARNc y ARNv (71, 72) . Los resultados arriba presentados muestran que el ARNsi específico de NP inhibe acumulación de todos los ARNs virales en las células infectadas. Aunque no se desea apegarse a ninguna teoría, parece probable que en presencia de ARNsi específico de NP se degrade el ARNm NP transcrito recientemente, resultado en la inhibición de la síntesis de proteínas NP después de la infección por virus. Sin el NP recientemente sintetizado, una transcripción y replicación viral adicional y por lo tanto una nueva producción de virión se inhibe. Similarmente, en presencia de un específico de ??,. el ?? ARNm recientemente transcrito se degrada lo que resulta en la inhibición de la síntesis de proteína PA. A pesar de la presencia de 30-60 copias de la transcriptasa de ARN por virión de influenza (1) , sin la transcriptasa de ARN recientemente sintetizada se inhibe probablemente una 217 transcripción y replicación viral adicional. Se obtuvieron resultados similares un ARNsi específico para PB1. En contraste la proteína de matriz (M) no se requiere hasta la fase tardía de la infección por virus (1) . Así, el ARNsi específico de M inhibe la acumulación del ARNm específico de M pero no de ARNv ARNc o de otros ARN virales. Al tomarse juntos estos hallazgos demuestran un requerimiento crítico para la nucleoproteína recientemente sintetizada y las proteínas de polimerasa en una transcripción y replicación del ARN viral de la influenza. Tanto los mecanismos específicos del virus como los del ARN por los cual los NP-, PA-, y PB1 específicos de ARNsi interfieren con la acumulación de ARNm y de otra transcripción viral de ARN sugiere que estos ARNsi pueden ser inhibidores especialmente potentes de la infección por el virus de la influenza. En particular, los resultados aquí descritos sugieren que en general, los ARNsi dirigidos a los transcritos que codifican las proteínas de enlace de ADN o ARN que se enlazan normalmente ácidos nucleicos específicos de agentes (ADN o ARN) , es probable que tengan efectos amplios (por ejemplo, efectos sobre otros transcritos específicos del agente) más que reducir simplemente el nivel del ARN dirigido. Similarmente, los resultados descritos en la presente sugieren que en general, los ARNsi dirigidos a los genes de polimerasa (polimerasa de ARN, polimerasa de ADN o 218 transcriptasa inversa) , de agentes infecciosos posiblemente tengan amplios efectos (por ejemplo, efectos en otros transcritos de agente especifico) en vez de reducir simplemente los niveles de ARN de polimerasa. Ejemplo 7: Inhibición amplia de la acumulación de ARN viral por ciertos ARNsi no se debe a la respuesta del interferón o a la degradación de ARN inducida por el virus .

Materiales y Métodos . Medición de niveles de ARN. Se miden los niveles de ARN usando PCR bajo condiciones estándar. Se usaron los siguientes cebadores PCR para medir el ARN de ?-actina. ?-actina delantero: 5' -TCTGTCAGGGTTGGAAAGTC-3' (SEQ ID NO: 177) ?-actina inverso: 5' -AAATGCAAACCGCTTCCCAAC-3' (SEQ ID NO: 178) Cultivo de células Vero y mediciones de PKR fosforilada se realizaron de conformidad con técnicas estándar en las referencias citadas a continuación.

Resultados Una posible causa para la amplia inhibición de acumulación ARN viral es una respuesta al interferón de las células infectadas en presencia de ARNsi (23, 65, 66) . De esta manera los experimentos anteriores se repiten en células 219 Vero en las cuales la indicación IFN completa, incluyendo todos los genes a, ß y ?, se eliminan (67, 68) (Q.G.and J.C. datas no publicados) . Igual como en las células MDCK, la acumulación de ARNm especifico de NP-, M-, y NS- se inhiben todas por NP-1496 (figuras 19D) . Además el efecto del ARNsi en los niveles de transcritos de genes celulares, incluyendo ß-actina, ?-actina y GAPDH, se evalúa usando PCR. No hay una diferencia importante en los niveles de transcrito detectada en ausencia o presencia de ARN (figura 18C panel del fondo, que muestran la carencia del efecto de ARNsi -37 en el ARNm de ?-actina, y los datos no se muestran) , lo que indica que el efecto inhibidor del ARNsi es especifico para los ARN virales. Estos resultados sugieren que la amplia inhibición de la acumulación de ARN viral por ciertos de ARNsi no es resultado de la respuesta del interferón celular. Después de la infección por el virus de la influenza, la presencia de ARNds también activa una trayectoria celular que dirige al ARN a la degradación (23) . Para examinar el efecto del ARNsi en la activación de esta trayectoria se evalúan los niveles de proteina cinasa R fosforilada (PKR) , el componente más critico de la trayectoria (23) . La transfección de células MDCK con NP-1496 en ausencia de infección por virus no afecta los niveles de PKR activado (datos no mostrados) . La infección por el virus de influenza resulta en un; nivel incrementado de PKR, fosforilado consistente con los estudios 220 previos (65, 66, 69) . Sin embargo, el incremento fue el mismo en presencia o ausencia de NP-1496 (datos no mostrados) . De ( esta manera la amplia inhibición de acumulación de ARN viral no es resultado de la degradación inducida por el virus aumentada en presencia de ARNsi. Ejemplo 8: Identificación sistemática de los ARNsi con capacidad superior para inhibir la producción de virus de influenza ya sea solo o en combinación. Este ejemplo describe un enfoque sistemático para la identi icación de ARNsi con capacidad superiores para inhibir la producción de virus de influenza. No obstante que el ejemplo se refiere a los ARNsi, se entenderá que la misma metodología pueden emplearse por los ARNsh cuya porción doble es idéntica a la porción doble de los ARNsi descritos abajo y que contienen un circuito cuya secuencia puede variar como se describe arriba. Razón fundamental: Para propósitos tanto profilácticos como terapéuticos, es deseable identificar los ARNsi que exhiben potencia superior para inhibir la protección por virus de influenza. Como se describe arriba 20 ARNsi, 19 de los cuales se basa en secuencias altamente concentradas que incluyen los di-nucleótidos AA en el extremo 5' se han designado y probado. No obstante que la presencia de los nucleótidos AA en esta posición se considera iniciálmente importante para función del ARNsi los más recientes indican 221 que no se requieren que los ARNsi basados en secuencias que contienen otros nucleótidos en esta posición son efectivos (22, 28). No obstante, los ARNsi adicionales designados basados en secuencias que no inician con ??, se designaran y probaran para identificar ARNsi adicionales que inhiben efectivamente la producción de virus de influenza. La disponibilidad de algunos ARNsi inhibidores potentes permitirá su uso en combinación. Un estudio reciente en la inhibición de ARNsi de virus de polio muestra que el uso de un ARNsi sencillo resultan en la producción de una variante de virus de polio preexistente que no dirige por el ARNsi (24) . Debido a que el virus de la influenza se conoce que muta en una alta relación (4), el uso de ARNsi sencillo posiblemente promoverían la excreción de virus resistentes y de esta manera vuelven potencialmente al ARNsi ineficaz después de un periodo de tiempo. Por otro lado, la probabilidad de que un virus resistente emerga se reduce por ordenes de magnitud si dos o más ARNsi diferentes se usan simultáneamente especialmente aquellos de ARNsi específicos para diferentes ARN virales. De esta manera, los ARNsi se probaran en combinaciones de dos o más de manera que se encuentre las combinaciones más efectivas. Este ejemplo describe un enfoque sistemático para alcanzar los siguientes puntos: 1. Diseñar y probar ARNsi adicionales de manera que la 222 región conservada completa del genoma del virus de influenza se cubra una vez por los ARNsi no traslapantes. 2. Para identificar los ARNsi inhibidores más potentes al separarlos por exclusión con multiplicidad incrementadamente alta de infección (MOI) . 3. Identificar las combinaciones más potentes de ARNsi efectivos para prevenir la emergencia de virus resistentes. Diseño y prueba de ARNsi adicionales. Los ARNsi adicionales específicos para las regiones conservadas del genoma viral gue no se cubren por los ARNsi descritos en el ejemplo 1 se diseñarán. El objeto es cubrir las regiones conservadas del genoma viral una vez con los ARNsi no traslapantes. Los ARNsi no traslapantes se eligen por dos razones. Primero, la aplicación simultánea de los ARNsi traslapados probablemente no proporcionará las combinaciones más efectivas debido a que algunas de las secuencias objetivos tal como protegidas. La mutación en la región traslapada posiblemente volverá a los ARNsi inefectivos. Segundo para una separación por exclusión extensiva, el número de ARNsi traslapados puede ser muy grande para probarse dentro de un periodo de tiempo razonable. El propósito es obtener al menos un ARN potente para cada uno de PA, PBl, PB2, NP, M, y NS . (por empalme de ARN, los genes M y NS cada uno codifican dos proteínas. Si es posible los ARNsi específicos para ambos transcritos del mismo gen se diseñan) . 223 Los ARNsi potentes específicos para NP, PA, y PB1 ya se han identificado (Tabla 5) , por lo tanto el enfoque estará en probar más candidatos a ARNsi específicos para PB2, M y US. Si los ARNsi no traslapados probados no revelan a ARNsi potentes para estos genes, se probaran candidatos a ARNsi traslapados. La disponibilidad de inhibidor de ARNsi inhibidor potente específico para cada uno de los seis genes, facilitará la identificación de las combinaciones más potentes . Para diseñar los ARNsi adicionales que no se traslapan se usarán los mismo criterios como se describen en el ejemplo 1 y en la descripción detallada, excepto que los AA di-nucleótidos iniciales no se requerirán. Con base en estos criterios se estima que puede ser deseable probar alrededor de 40 ARNsi. Los oligonucleótidos de ARN de hebra sencilla se sintetizarán comercialmente y combinarán en sus pares base a sus hebras complementarias . Los dúplex resultantes de ARNsi se probaran por capacidad por interferir con la producción del virus de la influenza (PR8, WSN o ambos), en células MDK como se mide por un ensayo de hemaglutinina . Aquellos ARNsi que son efectivos en la línea celular se evaluarán además en embriones de pollo. ARNsi que muestran efectos inhibidores consistentes con ambos subtipos del virus y en células y embriones se prefieren para investigación adicional. Comparación de las potencias de ARNsi. Una vez que los 224 ARNsi que inhiben importantemente la producción del virus de la influenza se identifican sus potencias se compararán con el mismo ensayo con objeto de identificar los potentes. En la mayoría de los ensayos descritos al usar células MDCK, se usó el virus a una MOI de 0.001 o 0.01. Se encontró que la concentración de virus en dos muestras (NP-1496 y PA-2087) fue indectectable por el ensayo de hemaglutinina y en una muestra (NP-1496) indectetable por ensayo de placas. Para diferenciar las potencias de estos ARNsi, especialmente aquellas específicas para el mismo gen, el MOI usado para infectar las células MDCK se incrementará por 0.1 o .mayor. ARNsi se probará en embriones de pollo. Se usarán ensayos de placas para medir más precisamente las concentraciones de virus . Además, las potencias de ARNsi se compararán al concentrar la cantidad de ARNsi usado para la transfección. Brevemente cantidades diferentes de ARNsi (tales como 0.025, 0.05, 0.1, y 0.25 nmol) se tratarán por electroporesis por células MDCK (1 x 107) . Se infectarán las células con el virus PR8 o WSN a un MOI fijo (tal como 0.01) y se cosecharán los sobrenadantes de cultivo 60 horas después para medir las concentraciones de virus por hemaglutinación . Los resultados de estos experimentos ayudarán a determinar no solamente las potencias de cada ARNsi sino también la cantidad mínima necesaria para la inhibición máxima. El último será útil para 225 determinar cuanto de cada ARNsi se debe usar en combinaciones como se describen abajo. Identificación de las combinaciones más potentes de ARNsi. El uso de dos o más ARNsi diferentes simultáneamente puede ser considerable con objeto de evitar la aparición de virus variantes que pueden escapar a la interferencia por un ARNsi sencillo. Una vez que los ARNsi potentes para varios de los ocho genes de virus se identifican, sus eficacias en combinaciones se examinarán. Preferiblemente, los ARNsi potentes dirigidos a al menos 2 genes se identifican. Más preferiblemente, los ARNsi potentes dirigidos a al menos 3, 4, 5, 6, 7, o aun a todos ocho genes se identifican. Sin embargo, puede ser deseable limitar la prueba inicialmente al menos de todos los ocho genes por ejemplo, 5 o 6 genes. Para estos estudios son importantes las siguientes consideraciones: i) los números de diferentes ARNsi usados en la misma mezcla, ii) la cantidad mínima de cada ARNsi usado en el "cóctel" iii) las formas más eficientes de identificar las combinaciones más potentes. La velocidad de mutación de virus de la influenza se estima que es de 1.5 x 1CT5 por nucleótido por ciclo de infección (4) . Si se usan simultáneamente dos ARNsi específicos para genes diferentes, la probabilidad de aparición del virus resistente es de 2.25 x · 10~10. Considerando que el ARNsi puede algunas veces tolerar una no 226 coincidencia de nucleótido (26), especialmente en las terminaciones (28) y el mitad 3' de la hebra antisentido, el uso simultáneo de dos ARNsi debe ser bastante efectivo para evitar la aparición del virus resistente. Para ser conservadores tres ARNsi usados en combinación deben ser suficientes. Este cálculo asume que cada ARNsi en una mezcla actúa independientemente. Inicialmente la cantidad mínima de ARNsi que se requiere para la inhibición máxima de la producción del virus de la influenza como se determina arriba usando ese ARNsi solo se usará en las combinaciones. Algunos estudios han demostrado que la maquinaria de ARNsi en las células de mamíferos y Drosophila puede ser limitante (-27, 29, 30) . Si esto parece ser el caso para la interferencia de ARN con la producción del virus de la influenza, se probarán cantidades reducidas de cada ARNsi en las combinaciones tales como las dosis máxima media de cada ARNsi en combinación de dos se probará. Primero, la composiciones de prueba de dos ARNsi se probarán sistémicamente . La ventaja de esta estrategia es que producirán no solamente las combinaciones más potentes de dos ARNsi sino probablemente también los componentes potentes en combinaciones de tres ARNsi. Aunque las combinaciones de dos ARNsi específicos para genes diferentes o etapas diferentes del ciclo de vida del virus pueden ser más deseables debido a los efectos sinérgicos potenciales, vale la pena probar 227 combinaciones de ARNsi especificas para diferentes componentes de la transcriptasa debido a que no son proteínas abundantes y críticas para la producción del virus. Suponiendo que un ARNsi potente para cada gen (??, PB1, PB2, NP, M y NS), será necesario probar 15 combinaciones para cubrir todas las combinaciones posibles de dos ARNsi. ARNsi, se introducirá en las células MDCK por electroporación individualmente o en combinación de dos. Ocho horas después, se infectarán las células con el virus PR8 o WSN a un MOI predeterminado y se cosecharán sobrenadantes de cultivo 60 horas después para ensayar la concentración del virus por hemaglutinación. Las concentraciones precisas en las muestras que tiene unidades substancialmente inferiores de hemaglutinina se determinarán por un ensayo de placas . Las combinaciones de ARNsi se ensayarán en embriones de pollo para confirmar los resultados de la línea celular. Los resultados de esta serie de experimentos revelarán las potencias relativas de combinaciones de dos ARNsi y si una combinación de dos ARNsi tiene efectos sinérgicos. Por ejemplo, si la combinación de NP-1496 y PA-2087 es más que el efecto aditivo de NP-1496 más PA-2087 individualmente, la combinación tendría un efecto sinérgico. Estos resultados proporcionarán una indicación sobre cuales combinaciones de tres ARNsi es probable que sean óptimamente efectivas. Por ejemplo suponiendo que la combinación de NP-1496 y PA-2087 es 228 más efectiva que el NP-1496 o PA-2087 solamente y la combinación de PA-2087 y PB1-2257 sea más efectiva que PA-2087 o PB1-2257 solamente, los tres ARNsi en un cóctel que contiene NP-1496, PA-2087 y PB1-2257 serán especialmente efectivos. Las potencias de al menos tres cócteles de ARNsi que es probable que sea efectivos en células MDCK y en embriones de pollo se medirán. Si los resultados de la combinación de dos ARNsi no son útiles, las potencias de tres cócteles de ARNsi se probarán sistemáticamente como se describe para probar dos cócteles de ARNsi. Para cubrir todas las posibilidades, se necesitarán probar 10 combinaciones diferentes . En resumen los resultados obtenidos de los experimentos propuestos probablemente identificarán los ARNsi más potentes de las regiones conservadas de un número de ocho genes del virus de la influenza y sus combinaciones más efectivas para inhibir la producción del virus de la influenza. Ejemplo 9: Evaluación de los agentes de administración no viral que facilitan la absorción celular de ARNsi. Este ejemplo describe la prueba de una diversidad de agentes de suministro no virales por su capacidad de mejorar la absorción celular de ARNsi. Los ejemplos posteriores proporcionan datos que muestran resultados positivos con diversos polímeros que se probaron como se describe a continuación y en los ejemplos mismos. Se pueden probar 229 similarmente otros ejemplos de suministro. Polímeros catiónicos-. La capacidad de los polímeros catiónicos para promover la absorción intracelular de ADN se cree que resulta parcialmente de su capacidad para enlazarse a ADN y condensar moléculas de ADN de plásmidos grandes en complejos más pequeños de polímero/ADN para una endocitosis más eficiente. Los dúplex de ARNsi son cortos (por ejemplo, solamente 21 nucleótidos de longitud) lo que sugiere que probablemente no se pueden condensar mucho más. Los precursores de ARNsi tales como ARNsi también son relativamente cortos . Sin embargo la capacidad de los polímeros catiónicos para enlazar a ARNsi cargados negativamente e interactuar con la superficie celular cargada negativamente puede facilitar la absorción intracelular de ARNsi y ARNsh. Así, los polímeros catiónicos conocidos que incluyen pero no se limitan a PLL, PLL modificado (por ejemplo, modificado con grupo acilo, succinilo, acetilo, o imidazol (32)), polietilenimina (PEI) (37), polivinilpirrolidona (PVP) (38), y quitosán (39, 40) son candidatos prometedores como agentes de suministro para ARNsi y ARNsh. Además los polímeros catiónicos novedosos y oligómeros desarrollados por el laboratorio de Roberts Langer son candidatos prometedores como agentes de suministro. Las estrategias eficientes para sintetizar y probar grandes 230 colecciones de polímeros catiónicos novedosos y oligómeros de monomeros de diacrilato y de amina por su uso en la transfección de ADN se han desarrollado. Estos polímeros se refieren en la presente como polímero de poly(P~amino éster) (PAE) . En un primer estudio una colección de 140 polímeros de 7 onómeros - de diacrilato y 20 de amina se sintetizó y probó 34. De los 140 miembros, 70 se encontraron suficientemente solubles en agua (2 mg/ml, 25mM solución amortiguadora de acetato de pH= 5.0) . Cincuenta seis de los 70 polímeros en agua interactuaron con el ADN como se muestra por un giro de movilidad electroforética . De manera más importante se encuentran dos de los 56 polímeros que median la transfección de ADN en las células COS-7. La eficiencias de transfección de los polímeros novedosos fueron de 4 a 8 veces superiores que PEI e iguales o mejores que Lipofectamine 2000. Desde el estudio inicial se ha construido una colección de 2,400 polímeros catiónicos y separado por exclusión y otra aproximadamente 40 polímeros que promueven una transfección eficiente del ADN se ha obtenido (118) . Debido a que las variaciones estructurales pueden tener un impacto importante en el enlace del ADN y las eficacias de transfección (33), es preferible probar muchos polímeros por su capacidad de promover la absorción intracelular de ARNsi. Además, es posible que en la transición a un sistema in vivo, esto es, 231 en sujetos mamíferos se excluirán probablemente ciertos polímeros como resultados de los estudios de su desempeño in vivo, absorción, distribución, metabolismo, y excreción (ADME) . Así es importante la prueba en organismo intactos. En conjunto al menos aproximadamente 50 polímeros catiónicos se probarán en experimentos de transfección de ARNsi. La mayoría de ellos será PAE y PPL modificado por un grupo imidazol como se describe arriba. PEI, PVP y el quitosan se adquirirán de fuentes comerciales. Para separar por exclusión estos polímero's rápida y eficientemente, ya se ha movido la colección de polímeros PAE que transfecta exitosamente las células en una solución en una placa, de 96 pozos. El almacenamiento de estos polímeros de este efecto estándar de 96 pozos permite un desarrollo directo de una separación por exclusión semi-automatizada usando un robot de micropipeta EDR 384S/96S estéril Labcite. Se concentrará la cantidad de polímero (usando una cantidad predeterminada de ARNsi) para definir relaciones adecuadas de ARNsi de polímero y condiciones de suministro más eficientes. Dependiendo del ensayo específico, la separación por exclusión semi-automatizada será ligeramente diferente como se describe a continuación . Caracterización de los complejos de polímeros/ARNsi . Para que diversos polímeros catiónicos faciliten la absorción intracelular de ARNsi deben poder formar complejos con ARNsi. 232 Esta cuestión se examinará por el ensayo de giro de movilidad electoforético (EMSA) que sigue un protocolo similar a aquel descrito (34) . Brevemente, se mezclará el ARNsi NP-1496 con cada uno de los 50 o más polímeros a relaciones de 1:0.1, 1:0.3, 1:0.9, 1:2.7, 1:8.1, y 1:24.3 (ARNsi/polímero/peso/peso) en placas de 96 pozos usando un robot de micro pipetas. Las mezclas se cargarán en una plancha de gel de agarosa al 4% capaz de ensayar hasta 500 muestras usando un pipeteador multi canal. Se visualizarán los patrones de migración ARNsi con una tinción con bromuro de etidio. Si la movilidad de un ARNsi se reduce en presencia de un polímero ARNsi, el ARNsi forma complejos con ese polímero. Con base a relaciones del ARNsi al polímero puede ser posible identificar la relación de neutralización. Aquellos polímeros que no se enlazan a ARNsi serán menos preferidos y se focalizará un examen adicional en aquellos polímeros que se enlazan a ARNsi. La citotoxicidad de PLL, PEI, PVP modificados por el grupo imidazol, quitosan y algunos polímeros PAE se han medido sola o en complejos con ADN en líneas celulares. Debido a que la citotoxicidad cambia dependiendo de las moléculas enlazadas, la citotoxicidad de diversos polímeros y polímeros modificados en complejos con ARNsi se medirán en células MDCK. Brevemente, se mezclará NP-1496 con cantidades diferentes de polímeros como arriba usando el robot 233 micropipeteador Labcyte estéril. Se aplicarán los complejos a las células MDCK en placas de 96 pozos por 4 horas. Luego se reemplazará el medio que contiene polímero con medio de crecimiento normal. Se medirán 24 horas después la actividad metabólica de las células en el formato de 96 pozos usando el ensayo MTT (41) . Aquellos polímeros que exterminan 90% o más células en la cantidad más baja usada serán menos preferidos, y el foco de una investigación adicional serán los polímeros que no exterminen más del 90% de las células en la cantidad más baja usada. Aunque en algunos casos se han efectuado estudios similares usando composiciones de polímeros de ADN será importante determinar si los resultados similares (por ejemplo, citotoxicidad, promoción de la absorción celular) se obtienen con composiciones de ARN/polímero . Absorción de ARNsi por células cultivadas. Una vez que se han caracterizado los complejos de ARNsi/polímero, se probará su capacidad para promover la absorción celular de ARNsi partiendo de células cultivadas usando dos sistemas de ensayos diferentes . En el primer método se probará un ARNsi específico de GFP (GFP-949) en células MDCK que expresan GFP debido a que una disminución en la expresión de GFP se cuantifica fácilmente al medir la intensidad fluorescente. Brevemente, el polímero GFP-949 en las mismas relaciones como arriba se aplicará en las células MDCK en placas de 96 pozos. 234 Como controles negativos se usará NP-1496 o ningún ARNsi. Como un control positivo, se introducirá GFP-949 en las células por electroporacion. Se Usarán células 36 horas después en placas de 96 pozos y la intensidad fluorescente de los Usados medida por un lector de placas fluorescente. La capacidad de diversos polímeros para promover la absorción celular de ARNsi se indicará por una disminución global de la intensidad GFP. Alternativamente se analizarán células para la expresión GFP usando un citómetro de flujo que se quita para manejar muestras en un formato de 96 pozos. Las capacidades para diversos polímeros para promover la absorción celular de ARNsi se indicará por un porcentaje de células con intensidad reducida GFP y el grado de la disminución en la intensidad GFP. Los resultados de estos ensayos bloquearán también la luz en la relación óptima del polímero ARNsi para una transfeccion más eficiente. En la segunda metodología, se medirá directamente la inhibición de la producción del virus de la influenza en las células MDCK. Como se describe anteriormente, se aplicará ARNsi ??-1496/polímero en varias relaciones a las células MDCK en placas de 96 pozos. Como un control positivo, el ARNsi se introducirá en células MDCK mediante electroporacion. Como controles negativos, no se usarán GFP-949 o ARNsi. Ocho horas después, las células se infectarán con el virus WSN o WSN en un MOI predeterminado. Los sobrenadantes del cultivo 235 se cosecharán 60 horas más tarde y se ensayarán para el virus sin dilución mediante la hemaglutinación en placas de 96 pozos. Los sobrenadantes de los pozos que tienen concentraciones de virus baja en el ensayo inicial se diluirán (indicando asi que la composición de ARNsi/polimeros inhibió la producción del virus) y se ensayó mediante la hemaglutinación. Alternativamente, los cultivos infectados durante 60 horas se ensayarán para la actividad metabólica mediante el ensayo MT . Debido a que las células infectadas se lisaron eventualmente, el nivel relativo de la actividad metabólica también proporcionar una indicación de la inhibición de infección del virus. Si la concentración del título del virus o la actividad metabólica es sustancialmente inferior en los cultivos que son tratados con ARNsi/polimeros que aquellos que no son tratados, se concluirá que el polímero promueve la transfección del ARNsi. Mediante la comparación de las concentraciones del virus en cultivos en los que se introducen ARNsi mediante la electroporacion, se estimará la eficiencia de la transfección relativa de ARNsi y las composiciones de ARNsi/polimeros. Una variedad de polímeros catiónicos más efectivos de las dos separaciones por exclusión iniciales se verificarán en el ensayo de infección del virus en placas de 96 pozos mediante la titulación tanto del ARNsi como de los polímeros. 236 En base a los resultados obtenidos, la capacidad de los seis polímeros en las relaciones más efectivas ARNsi :polímeros se analizarán además en células MDCK, en placas de 24 pozos y placas de 6 pozos. Una variedad de polímeros más efectivos se seleccionarán para estudios adicionales en ratones como se describió en el Ejemplo 10. Metodologías alternativas. Como una alternativa para los polímeros catiónicos para la promoción eficiente de absorción intracelular de ARNsi en células cultivadas, péptidos ricos en arginina se investigarán en los experimentos de transfección de ARNsi. Debido a que se piensa que los ARP penetran directamente a la membrana del plasma interactuando con los fosfolípidos cargados negativamente (48) , mientras se piensa que los polímeros catiónicos usados actualmente promueven la absorción celular del ADN mediante la endocitosis, se investigará la eficacia de ARP al promover la absorción intracelular de ARNsi. Tal como los polímeros catiónicos, los ARP y la poliarginina (PLA) también se cargan positivamente y probablemente son capaces de enlazar ARNsi, sugiriendo también que es probablemente no necesario enlazar covalentemente ARNsi a los ARP o PLA. Por lo tanto, los ARP o PLA se tratarán de manera similar a otros polímeros catiónicos. La capacidad del ARP a partir de Tat y longitud diferente de PLA (disponible por Sigma) para promover la absorción celular de ARNsi se determinará como se describe 237 arriba . Ejemplo 10. Prueba de ARNsi y composiciones de agentes ARNsi/'suministro en ratones. Razonamiento: Se evaluará la capacidad de los polímeros identificados para promover la absorción de ARNsi mediante células en el tracto respiratorio en ratones, y se examinará la eficacia de los ARNsi en la prevención y tratamiento de la infección del virus de la influenza en ratones. La demostración de la inhibición de ARNsi en la infección del virus de la influenza en ratones proporcionará evidencia para su uso potencial en humanos, para prevenir o tratar la infección del virus de la influenza, por ejemplo, mediante la administración intranasal o pulmonar de ARNsi. La metodología para identificar composiciones que contienen ARNsi que suministran efectivamente ARNsi a células y tratan efectivamente o previenen la infección del virus de la influenza se describe en este ejemplo. Por simplicidad, el ejemplo describe probar composiciones ARNsi/polímeros . Métodos análogos pueden usarse para probar otras composiciones de agentes ARNsi/suministro tal como las composiciones de polímeros ARNsi/catiónicas, composiciones de péptido ARNsi/ricos en arginina, etc. Rutas de administración. Debido a que las células epiteliales infectan al virus de la influenza en las vías aéreas superiores y a los pulmones, el enfoque estará sobre 238 los métodos que suministran ARNsi dentro de las células epiteliales en el tracto respiratorio. Se han usado diversos métodos para suministrar fármacos de moléculas pequeñas, proteínas, y complejos de ADN/polímeros dentro de las vías aéreas superiores y/o pulmones de ratones que incluyen instilación, inhalación mediante aerosol (tanto líquida como en polvo seco) , administración intratraqueal e inyección intravenosa. Mediante la instilación, usualmente los ratones se anestesian ligeramente y se sostienen erguidos en forma vertical. Se aplican terapéuticos (es decir, complejos de ARNsi/polímeros ) en un volumen pequeño (usualmente de 30 a 50 µ?) lentamente a un orificio nasal en donde el fluido se inhala (52) . Los animales se mantienen en la posición erguida durante un periodo corto de tiempo para permitir al fluido instilado alcanzar los pulmones (53) . La instilación es efectiva para suministrar terapéuticos a ambas vías aéreas superiores y a los pulmones, y puede repetirse muchas veces en el mismo ratón. Con respecto al aerosol, el líquido y el polvo seco se aplican usualmente en forma distinta. Los aerosoles líquidos se producen por un nebulizador dentro de una jaula plástica sellada, donde se colocan los ratones (52) . Debido a que los aerosoles se inhalan al igual que como lo hacen los animales, el método puede ser ineficiente e impreciso. Los aerosoles de polvo seco se administran usualmente mediante la ventilación 239 forzada en ratones anestesiados. Este método puede ser muy efectivo asi debido a que las partículas en aerosol son grandes y porosas (ver abajo) (31) . Para la administración intratraqueal, una solución que contienen terapéuticos se inyecta vía un tubo dentro de los pulmones de los ratones anestesiados (54) . A pesar de que es bastante eficiente para suministrarse en los pulmones, se evita en las vías aéreas superiores . La inyección intravenosa de una cantidad pequeña de ADN (aproximadamente 1 µg) en complejos con proteínas y polietileneimina ha demostrado transferir células endoteliales y células en tejidos intersticiales de los pulmones (55) . Basada en esta consideración, los complejos de ARNsi/polímeros se administrarán primero a ratones mediante la instilación. También se explorará el suministro intravenoso y suministro en aerosol usando partículas porosas grandes. Además, también se probarán otros métodos de suministro que incluyen inyección intravenosa e intraperitoneal . Absorción de ARNsi mediante células en el tracto respiratorio . Una variedad de los polímeros más efectivos identificados como se describe en el ejemplo 9 se probará por su capacidad para promover la absorción xntracelular de ARNsi en el tracto respiratorio en ratones. Para facilitar las investigaciones, se usará la inhibición de la expresión de GFP mediante ARNsi de GFP específicos (GFP-949) en ratones 240 transgénicos que expresan GFP. La ventaja de usar inicialmente ARNsi de GFP específicos es que la simplicidad y precisión de los ensayos puede acelerar la identificación de los polímeros efectivos en ratones. Además, los resultados obtenidos pueden verter luz en las áreas o tipos de células que toman ARNsi in vivo. La información posterior será útil para modificar los agentes de suministro y los métodos de administración para el suministro óptimo de ARNsi dentro de células epiteliales en el tracto respiratorio. De manera breve, las dosis clasificadas de complejos de GFP-949/polímeros (en la relación más efectiva determinada en el Ejemplo 9) se administrará a los ratones transgénicos GFP mediante la instilación. Con respecto a los controles, los ratones darán solo ARNsi o únicamente polímeros o nada, o complejos de ARNsi/polímeros no específicos. Los tejidos de las vías aéreas superiores y los pulmones se cosecharán 36 a 48 horas después de la administración de ARNsi, incrustados en OCT y congelados. Las secciones se visualizarán bajo un microscopio de fluorescencia para la intensidad de GFP y las secciones adyacentes se teñirán con hematoxilina/eosina (H/E) . Alternativamente, los tejidos se fijarán en paraformaldehído y se incrustarán en OCT. Algunas secciones se teñirán con H&E y secciones adyacentes se teñirán con anticuerpos anti-GFP conjugados con HRP. El recubrimiento de la histología y las imágenes GFP (o teñido anti-GFP) pueden permitir identificar 241 las áreas o tipos de células en las que se inhibe la expresión de GFP. Para una sensibilidad incrementada, los tejidos pueden examinarse mediante microscopía confocal para identificar áreas en donde la intensidad de GFP disminuye. Basándose en los resultados de la transfección de ADN mediante la instilación (52,56) se espera que el ARNsi sea probablemente el que tome células epiteliales en la superficie luminar del tracto respiratorio. Si se observa una disminución significativa en la intensidad de GFP en ratones tratados con GFP-949/polímeros en comparación con los ratones de control, esto indicaría que el polímero específico promueve la absorción celular de ARNsi in vivo. Inhibición de ARNsi de la infección del virus de la influenza en ratones. Además del estudio GFP-949 anterior en ratones transgénicos GFP, una variedad de los polímeros más efectivos para promover la absorción de ARNsi en ratones, se examinará usando ARNsi específico para el virus de la influenza, tal como NP-1496 o probablemente dos o tres "cócteles" de ARNsi. Para el estudio inicial, los complejos de ARNsi/polímeros y el virus de la influenza se introducirán en los ratones al mismo tiempo mezclando complejos de ARNsi/polímeros y virus antes de la instilación. Se usarán las dosis graduadas de los complejos ARNsi/polímero y el virus PR8 (en una dosis predeterminada) . Como controles, los ratones producirán solo ARNsi, o únicamente polímeros, o 242 ninguno, o GFP-949/??limero . En distintos tiempos después de la infección (por ejemplo, 2 a 3 días, o más, por ejemplo, varios días o una semana o más) después de la infección, se preparará un lavado nasal y los pulmones se homogenizarán para eluir el virus mediante congelación y deshielo. La concentración del virus en el lavado y en los pulmones se medirá mediante hemaglutinación. Si la concentración resulta ser demasiada baja para detectarse mediante el ensayo de hemaglutinina, el virus se amplificará en células MDC antes del ensayo de hemaglutinina. Para una determinación más exacta de la concentración del virus, los ensayos de placa se realizarán en muestras seleccionadas. Si una dosis simple de ARNsi/polímero no es efectiva para inhibir la infección de la influenza, se investigarán múltiples administraciones de ARNsi (en una dosificación relativamente alta) para determinar si las administraciones múltiples son más efectivas. Por ejemplo, siguiendo el ARNsi inicial/polímero y la administración del virus, los ratones proporcionarán ARNsi/polímero cada 12 horas durante 2 días (4 dosis) . La concentración del virus en los pulmones y el lavado nasal se medirán varias veces después de la infección inicial. Los resultados de estos experimentos deben demostrar si los ARNsi son efectivos para inhibir la infección del virus de la influenza en las vías aéreas superiores y en los 243 pulmones, y el punto para la dosis más sencilla. Se espera que las administraciones múltiples de A Nsi/polímero sean probablemente más efectivas que una administración simple en el tratamiento de la infección del virus de la influenza. Otros polímeros o agentes de suministro pueden ser explorados así como las diferentes metodologías para el suministro de ARNsi/polímeros, por ejemplo, los descritos abajo. Suministro de ARNsi/polímeros usando partículas porosas grandes. Otro método de suministro eficiente para las vías aéreas y los pulmones es usar partículas porosas grandes desarrolladas originalmente por el grupo Robert Langer. En contraste a la instilación, que es de base líquida, el último método depende de la inhalación de partículas porosas grandes (polvo seco) que transporta terapéuticos. En sus estudios iniciales, demostró que la evaporación de solventes de dos emulsiones de terapéuticos y poli (ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) o poli (ácido láctico-co-lisina-in erto-lisina) (PLAL-Lys) conduce a la generación de grandes partículas porosas (31) . Estas partículas tienen densidades de masa menores a 0.4 gramos/cm3 y diámetros medios que exceden los 5 um. Estas pueden ser inhaladas eficientemente en los pulmones debido a sus bajas densidades. -También, son menos eficientes para limpiar por parte de los macrófagos en los pulmones (57) . La inhalación de grandes partículas porosas que contienen insulina mediante ratas, da como 244 resultado niveles sistémicos elevados de insulina y supresión de niveles de glucosa sistémicos durante 96 horas, en comparación con partículas no porosas pequeñas durante 4 horas . Se ha desarrollado un procedimiento (58) para producir grandes partículas porosas usando excipientes que son tanto aprobados por la FDA para la inhalación o son endógenos para los pulmones (o ambos) . En este procedimiento, los excipientes solubles en agua (es decir, lactosa, albúmina, etc.) y terapéuticos se disolvieron en agua destilada. La solución se alimentó para un Secador Portátil por Rocío de Niro Atomizer (Niro, Inc., Columbus, MD) para producir los polvos secos, que tienen diámetros medios geométricos que se encuentran el rango de entre 3 y 15 um y densidad de toma entre 0.04 y 0.6 g/cm3. El método de rocío en seco se usará para producir partículas grandes porosas de baja densidad que transportan ARNsi/polímeros descritos por Langer excepto que los terapéuticos se reemplazan con ARNsi/polímeros Las partículas resultantes se caracterizarán por su porosidad, densidad y tamaño como se describe en (31,58). Aquellas que reaccionan con el criterio mencionado anteriormente se administrarán para anestesiar a los ratones mediante ventilación forzada usando un ventilador Harvard. Dependiendo de si se usa ARNsi específico tanto para el GFP o el virus de 245 la influenza, se realizarán distintos ensayos como se describe arriba. Si la expresión de GFP o la concentración del virus en ratones que proporcionan ARNsi específico/polímeros en partículas grandes porosas es significativamente inferior a la de los ratones de control, la inhalación del aerosol vía las partículas grandes porosas parecería ser un método efectivo para el suministro de ARNsi.

Aplicación terapéutica y profiláctica de complejos de ARNsi/polímeros . Se examinará la eficacia de los complejos de ARNsi/polímeros como la profilaxis o terapia para la infección del virus de la influenza en ratones. Asumiendo que una dosis simple de complejos ARNsi/polímeros es efectiva, se evaluará la duración de tiempo después de su administración sobre la cual los ARNsi permanecen efectivos al interferir con la infección de la influenza. Los complejos de ARNsi/polímeros se administrarán a los ratones mediante la instilación o mediante aerosoles porosos (dependiendo de cuál es más eficaz, como se determinó arriba) . Los ratones se infectarán con el virus de la influenza inmediatamente, o 1, 2 ó 3 días después, y la concentración del virus en el lavado nasal y los pulmones se medirá en 24 ó 48 horas después de la infección del virus. Si se encuentra que el ARNsi es más efectivo después de 3 días, los ratones se infectarán 4, 5, 6 y 7 días después de la administración de ARNsi/polímeros, y los tejidos se cosecharán para realizar un ensayo de la 246 concentración del virus 24 horas después de la infección. Los resultados de estos experimentos revelarán probablemente cómo después de una administración prolongada, los ARNsi permanecen vigentes al interferir en la producción del virus en ratones y guiarán su uso en los humanos . Para evaluar la eficacia terapéutica de ARNsi, los ratones se infectarán con el virus de la influenza y entonces producirán complejos de ARNsi/polimeros en distintos tiempos después de la infección. Específicamente, los ratones se infectarán iatranasalmente y entonces producirán una dosis efectiva (como se determinó arriba) de ARNsi/polimeros inmediatamente, o 1, 2 ó 3 días después. En los controles, los ratones producirán GFP-949 o ningún ARNsi inmediatamente después de la infección. La concentración del virus en el lavado nasal y los pulmones se medirá 24 ó 48 horas después de la administración de ARNsi. Además, los ratones se infectarán con una dosis letal del virus de la influenza y dentro de cinco grupos (5 a 8 ratones por grupo) . El grupo 1 producirá inmediatamente una dosis efectiva de complejos ARNsi/polimeros. Los grupos 2 a 4 producirán una dosis efectiva de complejos de ARNsi/polimeros del día 1 al 3 después de la infección, respectivamente. Los grupos 5 producirán ARNsi de GFP especifico inmediatamente después de la infección y se usan como controles. Se seguirá la supervivencia de los ratones infectados. Los resultados de 247 estos experimentos revelarán probablemente cómo después de una administración prolongada a la infección de ARNsi se ejerce aún un efecto terapéutico en los ratones. Ejemplo 11: Inhibición de la infección del virus de la influenza mediante ARNsi transcritos a partir de plantillas proporcionadas por los lentivirus o vectores de ADN. Razonamiento: La terapia de ARNsi efectiva de la infección del virus de la influenza depende de la capacidad para suministrar una cantidad suficiente de ARNsi dentro de células apropiadas in vivo. Para prevenir la emergencia del virus resistente, puede usarse preferiblemente dos o tres ARNsi al mismo tiempo. El suministro simultáneo de dos o tres ARNsi en las mismas células requerirán de un sistema de suministro eficiente. Como una alternativa a las metodologías descritas anteriormente, se explorará el uso de vectores de ADN a partir de los precursores de ARNsi pueden transcribirse y procesarse en los ARNsi efectivos. Se ha demostrado previamente que los ARNsi transcritos a partir de un vector de ADN pueden inhibir la expresión CD8a en la misma extensión como el ARNsi sintético introducido en las mismas células. Específicamente, se encontró que uno de los cinco ARNsi diseñados al objetivo del gen CD8oc referido como CD8-61, inhibió al CD8 pero no a la expresión CD4 en una línea (27) de células T CD8+CD4+ de ratón. Al probar varios derivados de horquilla del ARNsi CD8-61, se encontró que el 248 CD8-61F tuvo una actividad inhibidora similar a CD8-61 (Figuras 20A y 20B) (59) . Debido a su estructura de horquilla, el CD8-61 F se construyó en pSLOOP III, un vector de ADN (figura 20C) en la que el CD8-61F fue dirigido por el promotor ARN Hl . El promotor ARN Hl es compacto (60) y se transcribió por la polimerasa III (poli III) . El promotor Pol III se usó debido a que transcribe normalmente a los ARNsi cortos y se ha usado para generar previamente (61) un silenciamiento tipo ARNsi. Para probar el vector de ADN, se usaron células HeLa que han sido transíectadas con un vector de expresión CD8a. Como se muestra en la figura 20D, la transfección transitoria del plásmido pSLOOP III-CD8-16F dentro de las células HeLa que expresan CD8a resultó en una reducción en la expresión de CD8oc para la misma magnitud de las células HeLa que se transfectaron con el ARNsi del CD8a sintético. En contraste, la transfección de un vector menos promotor no reduce significativamente la expresión de CD8a. Estos resultados demuestran que una horquilla de ARN puede transformarse a partir de un vector de ADN y después procesarse en el ARNsi para el silenciamiento de un ARN. Una metodología similar se usará para diseñar vectores de ADN que expresan precursores de ARNsi específicos para el virus de la influenza. Investigación de ARNsi transcrito a partir de plantilla de ADN en células cultivadas . Para expresar precursores de ARNsi a partir de un vector de ADN, se diseñarán derivados de 249 horquilla de ARNsi (específicos para el virus de la influenza) que pueden ser procesados en duplos de ARNsi. Además, se producirán vectores en los que dos o más precursores ARNsi puedan transcribirse. Para acelerar estas investigaciones, los ARNsi GFP-949 y NP-1496 se usarán en células DCK que expresan GFP. Siguiendo el diseño del CD8-61F, los derivados de horquilla de GFP-949 y NP-1496 referidos como GFP-949H y NP-1496H se sintetizarán respectivamente (Figura 21A) . Tanto los GFP-949 y GFP-949H se someterán a una electroporacion en células MDCK que expresan GFP. La NP-1496 o electroporacion simulada se usará como un control negativo 24 y 48 horas más tarde, las células se ensayarán para la expresión de GFP mediante citometría de flujo. -Si el porcentaje de células positivas GFP y la intensidad del nivel de GFP se reduce significativamente en cultivos que proporcionan GFP-949H, se habrá demostrado la efectividad de los derivados de horquilla. Su eficacia se indicará comparando la intensidad GFP en células que producen GFP-949 estándar. De igual manera, los NP-1496 y NP-1496H se someterán a una electroporacion dentro de células MDCK. La GFP-949 o simulación de electroporacion se usará como control negativo. 8 horas después de la transfección, las células se infectarán con PR8 o el virus WSN. Las concentraciones del virus en los sobrenadantes del cultivo se medirán mediante hemaglutinación 250 60 horas después de la infección. Si la concentración del virus se reduce significativamente en cultivos que proporcionan NP-1496H, el derivado de la horquilla inhibirá la producción del virus. Se espera que los derivados de horquilla sean funcionales basándose en los estudios con CD8-61F. Si no, se sintetizarán y probarán distintos diseños de derivados de horquilla similares a los escritos en (59, 61, 62) . Diseño de vectores de ADN y su prueba en células cultivadas. Una vez que el GFP-949H y NP-1496H demuestran ser funcionales, se construirán los vectores de expresión correspondientes. Los GFP-949H y NP-1496H se clonarán individualmente detrás del polímero Hl en el vector pSLOOP III (figura 21 C superior) . Los vectores resultantes se transfectarán transitoriamente en células MDCK que expresan GFP mediante electroporación . Las células transfectadas se analizarán mediante intensidad de GFP o infectarán con el virus y se ensayarán para la producción del virus. El promotor U6 Pol III que también ha demostrado dirigir niveles altos de expresión del precursor ARNsi se probará además a otros promotores para identificar uno potente para la transcripción del precursor de ARNsi. Una vez que los vectores que transcriben un precursor ARNsi simple demuestran ser efectivos, se construirán vectores que puedan transcribir dos precursores de ARNsi. 251 Para este propósito, tanto el GFP-949H como el NP-1496H se clonarán en el vector pSLOOP III en tándem, ya sea que el GFP-949H en la 5' y NP-1496H en la 3', o en otra forma alrededor (figura 21 C, en medio) . En los vectores resultantes, los dos precursores ARNsi se enlazarán mediante nucleótidos extra presentes en la estructura de horquilla (Figura 21 B) . Debido a que no se conoce si los dos ARNsi pueden procesarse a partir de un transcrito simple, se construirán vectores en los que ambos GFP-949H y NP-1496H se transcriban mediante promotores independientes (Figura 21 C, inferior) . Debido a que la eficiencia de transfección en células MDCK es aproximadamente de 50%, la transfección transitoria puede no ser ideal para evaluar vectores que codifican dos precursores ARNsi. Por lo tanto, los transfectores estables se establecerán mediante la electroporación de células MDCK que expresan GFP con vectores linealizados, más un vector neo-resistente. El ADN se aislará a partir de transfectores múltiples para confirmar la presencia de vectores que expresan ARNsi mediante inmunotransferencia Southern. Los transfectores positivos se ensayarán mediante expresión GFP para determinar si el ARNsi GFP especifico transcrito a partir del vector integrado estable, puede inhibir la expresión GFP. Aquellos transfectores en los que la expresión GFP se inhibe se infectarán con el virus PR8 o WSN y la 252 concentración del virus se medirá mediante hemaglutinación . El encontrar que tanto la expresión GFP como la producción del virus se inhiben en una fracción significativa o transfectores establecerían que dos precursores ARNsi pueden transcribirse y procesarse a partir de un vector de ADN simple . La construcción de vectores a partir de los cuales un precursor ARNsi simple se transcribirá debe ser directa debido a que una metodología similar ha sido usada exitosamente en estudios previos (59) . Puesto que muchos estudios han demostrado que dos genes pueden transcribirse independientemente del mismo vector usando promotores y secuencias de terminación idénticas, es probable que dos precursores ARNsi puedan transcribirse a partir del mismo vector. En la última metodología, los precursores ARNsi se transcriben independientemente. La longitud de los precursores ARNds resultantes es probablemente menor a 50 nucleótidos . En contraste, cuando dos precursores ARNsi se transcriben en tándem (figura 21B y C) , el precursor ARNds sería más largo que 50 nucleótidos. La presencia de ARNds más largos que 50 nucleótidos, activan una respuesta de interferona en células de mamíferos (22, 23) . Así, otra ventaja de la transcripción independiente de dos precursores ARNsi del mismo vector es que evitaría una respuesta de la interferona. La interferona inhibe la infección del virus y 253 por consiguiente, podría ser útil, pero la respuesta también cierra muchas trayectorias metabólicas y por lo tanto, interfiere con la función celular (63). Para determinar si una respuesta de interferón se induce en células MDCK transfectadas con distintos vectores de ADN, se ensayará el nivel de la proteína cinasa dependiente de ARNds fosforilada y total (PKR) puesto que la fosforilación de PKR se requiere para la respuesta de la interferón (23) . Los lisados celulares preparados a partir de células transfectadas simuladas y de vector se dividirán en SDS-PAGE. Las proteínas se transferirán a una membrana y la membrana se probará con anticuerpos específicos a PKR fosforilada o PKR total. Si el ensayo no es suficientemente sensible, se realizará una inmunoprecipitación seguida por una inmunotransferencia Western. Si no se detecta una diferencia en el nivel de la PKR, los precursores ARNds transcritos a partir de los vectores de ADN no activan la respuesta del interferón. Los vectores de ADN preferidos para la síntesis intracelular de ARNsi no activan la respuesta del interferón, por lo que la invención proporciona tales vectores. Investigación de vectores de ADN en ratones. Una vez que se demuestra que el ARNsi se transcribió a partir de los vectores de ADN puede inhibir la producción del virus de la influenza en células MDCK, se investigará su eficacia en ratones. Para minimizar la integración del ADN de plásmidos 254 introducidos en el genoma celular, el ADN superenrollado se usará para la expresión transitoria. La otra ventaja de la expresión transitoria es que el nivel de expresión tiende a ser probablemente alto, el número de copias de plásmidos por célula es alto antes de la integración. Para facilitar la transfección de ADN en ratones, se usarán polímeros catiónicos que han sido desarrollados para una terapia de gen que incluyen PLL, PEI, PVP y PAE modificados con un grupo imidazol, como se describe en el ejemplo 8. Específicamente, los vectores de ADN que expresan solo GFP-949H o NP-1496H o ambos NP-1496H y GFP-949H se mezclarán con los polímeros específicos en una relación predeterminada. Las cantidades graduadas de los complejos más el virus PR8 o WSN se introducirán en ratones transgénicos GFP anestesiados mediante instilación. Como controles, los ratones producirán solo ADN, o únicamente polímeros o ninguno. Entre dos y tres días después de la infección, el lavado nasal y los pulmones se cosecharán para realizar un ensayo de la concentración del virus como se describe en el ejemplo 10. Además, las vías aéreas superiores y las secciones de los pulmones se examinarán para una reducción en la expresión de GFP. También se administrarán muchas veces complejos de ADN/polímeros, por ejemplo, junto con el virus inicialmente y una vez por día durante los siguientes dos días. El efecto de múltiples administraciones se examinará el día 3 después de 255 la infección. Además, se construirán vectores de ADN que codifican dos o tres precursores de ARNsi específicos de la influenza y se probará su eficacia para inhibir la infección de la influenza en ratones. Lentivirus. Los constructos descritos arriba se insertarán en plásmidos de transferencia lentiviral y se usarán para la producción del lentivirus infeccioso. El lentivirus proporciona de esta manera, una plantilla para la síntesis de ARNsh dentro de células infectadas con el virus. La capacidad de vectores lentivirales para inhibir la producción del virus de la influenza se probará en cultivos del tejido y en ratones, como se describe arriba para los vectores del ADN. Los lentivirus pueden administrarse a ratones usando cualquiera de los agentes de suministro de la invención o agentes de suministro previamente usados para la administración de lentivirus u otros vectores de terapia de gen virales. Ejemplo 12. Inhibición de la producción del virus- de la influenza en ratones mediante ARNsi. Este ejemplo describe experimentos que demuestran que la administración de ARNsi dirigida a los transcritos NP o AP del virus de la influenza inhibe la producción del virus de la influenza en ratones, cuando se administra ya sea antes o después de la infección con el virus de la influenza. La inhibición depende de la dosis y muestra efectos aditivos 256 cuando dos ARNsi dirigidos a los transcritos expresados a partir de dos genes diferentes del virus del ARNsi se administran al mismo tiempo.

Materiales y Métodos Preparación de ARNsi. Esto se realizó como se describe arriba . Suministro de ARNsi. Los ARNsi (30 o 60 µg de GFP-949, NP-1496 o PA-2087) se incubaron con jetPEI™ para los oligonucleótidos del reactivo de transfección de los polímeros catiónicos, relación N/P = 5 (Qbiogene, Inc., Cralsbad, CA: ; Cat. No. GDSP20130, N/P se refiere al número de residuos de nitrógenos por fosfato de nucleótidos ¦ en el reactivo jetPEI) o con poli-L-lisina (PM (vis) 52,000, PM (LALLS) 41,800, Sigma Cat. No. P2636) durante 20 minutos a la temperatura ambiente en 5% de glucosa. La mezcla se inyectó en ratones intravenosamente en la vena retro-orbital, 200 µ? por ratón, 4 ratones por grupo. Se inyectaron 200 µ? de glucosa al 5% en los ratones de control (sin tratamiento) . Estos ratones se anestesiaron con 2.5% de Avertina antes de la inyección de ARNsi o la infección intranasal. Infección viral. Los ratones B6 (mantenidos bajo condiciones de laboratorio estándar) se infectaron intranasalmente con el virus PR8 mediante un goteo de la solución amortiguadora que contenía el virus en la nariz del 257 ratón con una pipeta, 30 ul (12,000 pfu) por ratón. Determinación de la concentración viral. Los ratones se sacrificaron varias veces después de la infección y los pulmones se cosecharon. Los pulmones se homogenizaron y el homogeneizado se congeló y se deshielo dos veces para liberar el virus. El virus PR8 presente en los pulmones infectados se tituló mediante la infección de células MDCK. Las placas de 96 pozos de fondo plano se sembraron con las células MDCK 3 x 104 por pozo, y 24 horas después, se removió el medio que contenia el suero. 25 µ? del homogeneizado de pulmones ya sea diluidos o no diluidos de lxlO-1 a lx 10~7 se inocularon en pozos por triplicado. Después de 1 hora de incubación, 175 µ? del medio de infección con 4 µg/ml de tripsina se añadieron a cada una de las células. Después de 48 horas de incubación a 37 °C, la presencia o ausencia del virus se determinó mediante hemaglutinación de RBC de pollo mediante el sobrenadante de las células infectadas. El ensayo de hemaglutinación se llevó a cabo en placas de 96 pozos con fondo en forma de V. Las diluciones en serie de 2 veces el sobrenadante, se mezclaron con un volumen igual de una suspensión al 0.5% (vol/vol) de' eritrocitos de pollo (Charles River Laboratories) . y se incubaron en hielo durante 1 hora. Los pozos que contenían una capa homogénea adherente de eritrocitos se registraron como positivos . Las concentraciones del virus se determinaron mediante la interpolación del punto final de dilución que se 258 infectó con 50% de los pozos mediante el método de Reed y Muench (TCID50) . Los datos de cualquiera de los dos grupos se compararon mediante la prueba t de Student, que se usó durante los experimentos descritos en la presente para evaluar su importancia.

Resultados La figura 22A muestra los resultados de un experimento que demuestran que el ARNsi dirigido a los transcritos NP virales inhiben la producción del virus de la influenza cuando se administran antes de la infección 30 o 60 µg de siARNs de GFP-949 o NP-1496 se incubaron con jetPEI y se inyectaron intravenosamente en ratones como se describe arriba en Materiales y Métodos. Tres horas después, los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 1200 pfu por ratón. Los pulmones se cosecharon 24 horas después de la infección. Como se muestra en la figura 22A, el promedio logioTCID50 del homogeneizado de los pulmones para ratones que no recibieron tratamiento de ARNsi (NT, cuadrados rellenos) o recibieron ARNsi dirigido al GFP (GFP 60 µg, cuadrados en blanco), fue de 4.2. En ratones que fueron pretratados con 3 µg de ARNsi dirigidos al NP (NP 30 µg, circuios en blanco) y jetPEI, el promedio logio CIDso del homogeneizado de los pulmones fue de 3.9. En los ratones que se pretrataron con 60 g de ARNsi dirigido al NP (NP 60 µg, circuios rellenos) y 259 jetPEi, el promedio logioTCID5o del homogeneizado de los pulmones fue de 3.2. La diferencia en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que no recibieron tratamiento y le grupo que recibió 60 µg de ARNsi NP fue significativo con p = 0.0002. Los datos para los ratones individuales se presentan en la Tabla 6A (NT = sin tratamiento) . La figura 22B muestra los resultados de otros experimentos que demuestran que el ARNsi dirigido a los transcritos NP virales inhiben la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administra intravenosamente antes de la infección en una composición que contiene el polímero catiónico PLL. 30 ó 60 µg de GFP-949 o NP-1496 de ARNsi se incubaron con PLL y se inyectaron intravenosamente dentro de ratones como se describe arriba en los Materiales y Métodos. Tres horas después, los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8 , 12000 pfu por ratón. Los pulmones se cosecharon 24 horas después de la infección. Como se muestra en la figura 22B, el logioTCIDso promedio del homogeneizado de los pulmones para los ratones que no recibieron tratamiento ARNsi (NT; cuadrados rellenos) o recibieron un ARNsi dirigido a GFP (GFP 60 µg, cuadrados en blanco) fue de 4.1. En ratones que se pretrataron con 60 µg de ARNsi dirigidos al NP (NP 60 µg, círculos rellenos) y PLL, el promedio de logicTCID50 del homogeneizado de los pulmones 260 fue de 3.0. La diferencia en la concentración del virus del omogeneizado de los pulmones entre el grupo que recibió 60 µg de GFP y el grupo que recibió 60 µg de NP de ARNsi fue significativo con P = .001. Los datos para los ratones individuales se presentan en la Tabla 6 A (NT ¦= sin tratamiento) . Estos datos indican que el ARNsi dirigido al transcrito NP de la influenza redujo la concentración del virus en los pulmones cuando se administra antes de la infección del virus. Estos indican también, que las mezclas de ARNsi con polímeros catiónicos son agentes efectivos para la inhibición del virus de la influenza en los pulmones cuando se administran mediante una inyección intravenosa, que no requieren de técnicas tales como la transfección hidrodinámica .

Tabla 6A. Inhibición de la producción del virus de la influenza en ratones mediante ARNsi con polímeros catiónicos Tratamiento logi0TCID50 NT (experimento jetPEI) 4.3 4.3 4.0 4.0 GFP(60µg) + jetPEI 4.3 4.3 4.3 4.0 NP (30 g) + jetPEI 4.0 4.0 3.7 3.7 NP (60 µg) + jetPEI 3.3 3.3 3.0 3.0 NT (experimento PLL) 4.0 4.3 4.0 4.0 GFP (60µ?) + PLL 4.3 4.0 4.0 sin hacer NP (60 µg) + PLL 3.3 3.0 3.0 2.7 261 La figura 22C muestra resultados de un tercer experimento que demuestra que el ARNsi dirigido a los transcritos NP virales inhiben la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administran antes de la infección y demuestran que la presencia de un polímero catiónico incrementa significativamente la eficacia inhibidora del ARNsi. 60 µg de GFP-949 o NP-1496 de ARNsi se incubaron con la solución salina amortiguada con fosfato (PBS) o jetPEI y se inyectaron intravenosamente en ratones como se describe arriba en Materiales y Métodos. Tres horas después, los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 1200 pfu por ratón. Los pulmones se cosecharon 24 horas después de la infección. Como se muestra en la figura 22C, el promedio logioTCID5o del homogénea zado de los pulmones para ratones que no recibieron tratamiento ARNsi (NT, cuadrados en blanco) fue de 4.1, mientras que el promedio logioTCIDso del homogeneizado de los pulmones para los ratones que recibieron un ARNsi dirigido a GFP en PBS (GFP PBS, triángulos en blanco) fue de 4.4. En ratones que se pretrataron con 60 µg de ARNsi dirigidos a NP en PBS (NP PBS, circuios en blanco) el promedio logi0TCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 4.2, mostrando solo un modesto incremento en eficacia en relación con ningún 262 tratamiento o tratamiento con un ARNsi dirigido al GFP . En ratones que se pretrataron con 60 µg de ARNsi dirigidos a GFP en jetPEI (GFP PEI, circuios abiertos), el promedio log10TCID5o del homogeneizado de los pulmones fue de 4.2. Sin embargo, en ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigidos a NP en jetPEI (NP PEI, circuios cerrados), y jetPEI, el promedio logioTCIDso del homogeneizado de los pulmones fue de 3.9. En ratones que se pretrataron con 60 µg de ARNsi dirigido a NP y jetPEI (NP PEI, circuios rellenos), el promedio de logi0TCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 3.2. La diferencia en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que recibió GFP de ARNsi en PBS y el grupo que recibió NP de ARNsi en PBS fue importante con P= 0.04, mientras que la diferencia en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que recibió GFP de ARNsi con jetPEI y el grupo que recibió NP de ARNsi con jetPEI fue altamente significativo con P = 0.003. Los datos para los ratones individuales se presentan en la Tabla 6B (NT = sin tratamiento) . 263 Tabla 6B. Inhibición de la producción del virus de la influenza en ratones mediante ARNsi que muestran una eficacia aumentada con polímeros catiónicos. Tratamiento logi0TCID50 NT 4.3 4.3 4.0 3.7 GFP (60 g) + PBS 4.3 4.3 4.7 4.3 NP (60 g) + PBS 3.7 4.3 4.0 4.0 GPP (60 µg) + jetPEI 4.3 4.3 4.0 3.0 NT (60 µg) + jetPEI 3.3 3.0 3.7 3.0 La figura 23 muestra los resultados de un experimento que demuestra que los ARNsi dirigidos a los distintos transcritos del virus de la influenza exhiben un efecto adictivo. Sesenta µg de ARNsi NP-1496, 60 µg de ARNsi pA-2087 ó 60 µg de ARNsi NP-1496 + 60 µg de ARNsi PA-2087 se incubaron con jetPEI y se inyectaron intravenosamente en ratones como se describe arriba en Materiales y métodos. Tres horas más tarde, los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 12000 pfu por ratón. Los pulmones se cosecharon 24 horas después de la infección. Como se muestra en la figura 23, el promedio logioTCID50 del homogeneizado de los pulmnones para los ratones que no recibieron tratamiento de ARNsi (NT, cuadrados rellenos) fue de 4.2. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigido NP (NP 60 µg, círculos en 264 blanco) , el promedio logioTCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 3.2. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigido al PA (PA 60 µg, triángulos en blanco) , el promedio logioTCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 3.4. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigido a NP + 60 g de ARNsi dirigido a PA (NP + PA, circuios rellenos), el promedio log10TCID5o del homogeneizado de los pulmones fue de 2.4. La diferencia en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que no recibió tratamiento y los grupos que recibieron 60 µg de ARNsi NP, 60 µg de ARNsi PA ó 60 µg de ARNsi NP + 60 µg de ARNsi PA fueron significativos con p = 0.003, 0.01 y 0.0001, respectivamente. Las diferencias en el homogeneizado de los pulmones entre los grupos que recibieron 60 µg de ARNsi NP ó 60 µg de ARNsi NP y el grupo que recibió 60 µg de ARNsi NP + 60 µg de ARNsi PA fue significativo con P = 0.01. Los datos para los ratones individuales se presentan en la tabla 7 (NT = sin tratamiento) . Estos datos indican que el pretratamiento con ARNsi dirigido a los transcritos NP o PA de la influenza reducen la concentración del virus en los pulmones de los ratones infectados posteriormente con el virus de la influenza. Los datos indican además que una combinación de ARNsi dirigida a distintos transcritos virales exhibe un efecto aditivo, sugiriendo que la terapia con una combinación 265 de ARNsi dirigida a los distintos transcritos puede permitir una reducción en la dosis de cada ARNsi, relativo a la cantidad de un ARNsi simple que se necesitaría para obtener una eficacia igual. Es posible que ciertos ARNsi dirigidos a los distintos transcritos puedan exhibir efectos sinérgicos (es decir, efectos que son mayores que el aditivo) . La metodología sistemática para identificar potentes ARNsi y combinaciones de ARNsi pueden usarse para identificar composiciones ARNsi en las que los ARNsi exhiben efectos sinérgicos.

Tabla 7. Efecto aditivo de ARNsi contra el virus- de la influenza en ratones. Tratamiento logi0TCID50 NT 4.3 4.3 4.0 4.0 NP (60 µg) 3.7 3.3 3.0 3.0 PA (60 µg) 3.7 3.7 3.0 3.0 NP + PA (cada 60 g) 2.7 2.7 2.3 2.0 La figura 24 muestra los resultados de un experimento que demuestra que los ARNsi dirigidos a los transcritos NP virales inhiben la producción del virus de la influenza en ratones cuando se administran después de la infección. Los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 500 pfu. Sesenta µg de ARNsi GFP-949, 60 µg de ARNsi ??-2087, 60 266 µg de ARNsi NP-1496 ó 60 de ARNsi NP + 60 µg de ARNsi PA se incubaron con jetPEI y se inyectaron intravenosamente en ratones 5 horas después como se describe arriba en Materiales y Métodos. Los pulmones se cosecharon 28 horas después de la administración de ARNsi. Como se muestra en la figura 24, el promedio logioTCIDso del homogeneizado de los pulmones que no recibió tratamiento ARNsi (NT, cuadrados rellenos) o recibieron el GFP-949 ARNsi de GFP específicos (GFP, cuadrados en blanco) fue de 3.0. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigido al PA (PA 60 µg, triángulos en blanco), el promedio logi0TCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 2.2. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi dirigido al NP (NP 60 µ?, circuios en blanco), el promedio logioTCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 2.2. En ratones que recibieron 60 µg de ARNsi NP + 60 µg de ARNsi PA (PA + NP, circuios rellenos), el promedio logioTCIDso del homogeneizado de los pulmones fue de 1.8. Las diferencias en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que no recibió tratamiento y los grupos que recibieron 60 µg de PA, el ARNsi NP ó 60 µg de ARNsi NP + 60 µg de ARNsi PA fueron significativos con P = 0.09, 0.02 y 0.003, respectivamente. La diferencia en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que recibió ARNsi NP y ARNsi PA + NP tuvo un valor P de 0.2. Los 267 datos para los ratones individuales se presentan en la Tabla 8 (NT = sin tratamiento) . Estos datos indican que los ARNsi dirigidos a los transcritos NP y/o PA de la influenza reducen la concentración del virus en los pulmones cuando se administra después de la infección del virus.

Tabla 8. Inhibición de la producción del virus de la influenza en ratones infectados por ARNsi. Tratamiento logi0TCID50 NT 3. .0 3.0 3 .0 3.0 GFP (60 µg) 3. .0 3.0 3 .0 2.7 PA (60 µg) 2. .7 2.7 2 .3 1.3 NP (60 µg) 2 .7 2.3 2 .3 1.7 NP + PA (cada 60 µg) 2. .3 2.0 1 .7 1.3 Ejemplo 13: Inhibición de la producción del virus de la influenza en células mediante la administración de un lentivirus que proporciona una plantilla para la producción de ARNsh. Materiales y Métodos Cultivo celular. Las células Vero se sembraron en placas de 24 pozos en células de 4 x 105 por pozo en 1 mi de DMEM-10% de FCS y se incubaron a 37 °C bajo C02 al 5%. Producción del lentivirus que proporciona una plantilla para la producción de ARNsh. ün oligonucleótido que sirve 268 como una plantilla para la síntesis de un ARNsh NP-1496 (ver la figura 25 ?) se clonó entre el promotor U6 y la secuencia de terminación del vector lentiviral pLL3.7 (Rubinson, D., et al, Nature Genetics, Vol . 33, pp. 401-406, 2003), descrito esquemáticamente en la figura 25 A. Los oligonucleótidos se insertaron entre los sitios de restricción Hpal y Xhol dentro del sitio de clonación múltiple de pLL3.7. El vector lentiviral también expresa EGFP para facilitar el monitoreo de las células transfectadas/infectadas . El lentivirus se produjo mediante la co-transfección del vector de ADN que comprende una plantilla para la producción del ARNsi NP-1496A y vectores que empaquetan en las células 293T. Cuarenta y ocho horas después, se recogió el sobrenadante del cultivo que contenia el lentivirus, se hizo girar a 2000 r.p.m. durante 7 minutos a 4°C y después se filtró a través de un filtro de 0.45 um. Las células Vero se sembraron a 1 x 105 por pozo en placas de 24 pozos. Después del cultivo durante toda la noche, los sobrenadantes del cultivo que contenían los insertos (ya sea de 0.25 mi ó 1.0 mi) se agregaron, a los pozos en presencia de 8 µg/ mi de polibreno. Las placas se centrifugaron entonces a 2500 r.p.m. a la temperatura ambiente durante 1 hora y se regresaron al cultivo. Veinticuatro horas después de la infección, las líneas celulares Vero (Vero-NP-0.25 y Vero-Np-1.0) se analizaron para la expresión GFP mediante citometría de flujo junto con 269 las células Vero parenterales (no infectadas) . Se observa que NP-1496a difiere de NP-1496 debido a que la inclusión inadvertida de un nucleótido adicional (A) en el extremo 3' de la porción antisentido y un nucleótido complementario (ü) en el extremo 5' de la porción antisentido que resulta en una porción doble que es de 20 nt en longitud en lugar de 19 como en NP-1496. (ver la tabla 2). De acuerdo a otras modalidades de la invención, se usan las secuencias NP-1496 en lugar de NP-1496a. Además, la porción de rizo de ARNsi NP-1496a difiere de la del ARNsi NP-1496 que se muestra en la figura 21. Infección del virus de la influenza y determinación de la concentración viral. Las células Vero control y las células Vero infectadas con el lentivirus que contienen insertos (Vero-NP-0.25 y Vero-NP-1.0) se infectaron con el virus PR8 en OI de 0.4, 0.2 y 1. Las concentraciones del virus de la influenza en los sobrenadantes se determinaron mediante un ensayo de hemaglutinación (HA) 48 horas después de la infección como se describe en el ejemplo 12.

Resultados Las plantillas que contienen lentivirus para la producción del ARNsh NP-1496a se probaron por su capacidad para inhibir la producción del virus de la influenza en células Vero. El ARNsi NP-1496a incluye dos regiones 270 complementarias capaces de formar una estructura madre que contiene una porción de doble hebra que tiene la misma secuencia como la del ARNsi NP-1496a descrita anteriormente. Como se muestra en la figura 25B, la incubación de los sobrenadantes que contienen el lentivirus con las células Vero durante toda la noche resultaron en la expresión de EGFP indicando la infección de las células Vero mediante el lentivirus. La curva sombreada representa la intensidad de fluorescencia media en células de control (no infectadas) . Cuando se usó 1 mi del sobrenadante, casi todas las células se volvieron EGFP positivas y la intensidad de la fluorescencia media fue alta' (1818) (Vero-NP-1.0 ) . Cuando se usó 0.25 mi del sobrenadante, la mayoría de las células (~ 95%) fueron EGFP positivas y la intensidad de la fluorescencia media fue inferior (503) (Vero-NP-0.25 ) . Las células Vero parenterales y las células Vero infectadas con lentivirus se infectaron después con el virus de la influenza en MOI de 0.04, 0.2 y 0.1, y las concentraciones del virus se ensayaron 48 horas después de la infección del virus de la influenza. Con el incremento de MOI, las concentraciones del virus incrementaron en los sobrenadantes de los cultivos de las células Vero parenterales (figura 25 C) . En contraste, las concentraciones del virus permanecieron muy bajas en los 271 sobrenadantes de los cultivos celulares Vero-NP-1.0, indicando que la producción del virus de la influenza si •inhibió en estas células. De igual manera, la producción del virus de la influenza en cultivos de células Vero-NP-0.25 se inhibió también parcialmente. Las concentraciones virales se presentan en la tabla 9. Estos resultados sugieren que el ARNsh NP-1496 expresado de los vectores de lentiv rus puede procesarse en el ARNsi para inhibir la producción del virus de la influenza en células Vero. La magnitud de inhibición parece ser proporcional a la magnitud de la infección del virus por célula (indicada por el nivel EGFP) .

Tabla 9. Inhibición de la producción del virus de la influenza mediante ARNsi expresado en células en el cultivo del tejido. Linea celular Concentración viral Vero 16 64 128 Vero-NP-0.25 8 32 64 Vero-NP-1.0 1 4 8 Ejemplo 14. Inhibición de la producción de la influenza en ratones mediante la administración intranasal de un vector de ADN a partir del cual los precursores ARNsi pueden transcribirse 272 Materiales y Métodos Construcción de plásmidos que sirven como una plantilla para el ARNsi. La construcción de un plásmido a partir del cual el ARNsi NP-1496a se expresa como se describe en el ejemplo 13. Los oligonucleótidos que sirven como plantillas para la síntesis de ARNsh PB1-2257 o ARNsh de RSV específico se clonaron entre el promotor U6 y la secuencia de terminación del vector lentiviral pLL3.7 como se describe en el ejemplo 13 y se describe esquemáticamente en la figura 25A para el ARNsh NP-1496a. La secuencia de los oligonucleótidos fue como sigue : Sentido NP-1496a: 5' -TGGATCTTATTTCTTCGGAGATTCAAGAGATCTCCGAAGAAATAAGATCCTTTTTTC-3' (SEC ID NO:179) Sentido NP-1496a: 5'- TCGAGAAAAAAGGATCTTATTTCTTCGGAGATCTCTTGAATCTCCGAAGAAATAAGATCCA -3' (SEC ID NO:180) Sentido PB1-2257: 5' -TGATCTGTTCCACCATTGAATTCAAGAGATTCAATGGTGGAACAGATCTTTTTTC-3' (SEC ID NO:181) Sentido PBl-2257: 5'-TCGAGAAAAAAGATCTGTTCCACCATTG???CTCTTGAATTCAATGGTGGAACAGATCA- 273 3' (SEC ID NO:182) Sentido RSV: 5' -TGCGATAATATAACTGCAAGATTCAAGAGATCT GCAGT?? A ATCGTTTTTTC-3' (SEC ID NO:183) Sentido RSV: 5'- TCGAGAAAAAACGATAATATAACTGCAAGATCTCTTGAATCTTGCAGTTATATTATCGCA-3' (SEC ID NO:184) El ARNsh RSV expresado a partir del vector que comprende los oligonucleótidos de arriba se procesan in vivo para generar un ARNsi que tiene hebras sentido y antisentido con las siguientes secuencias: Sentido: 5' -CGATAATATAACTGCAAGA-3' (SEC ID NO:185) Antisentido: 5' CTTGCAGTTATATTATCG-3 ' (SEC ID NO: 186) Una horquilla de PA específico puede construirse similarmente usando los siguientes nucleótidos : Sentido PA-2087: 5' -TGCAATTGAGGAGTGCCTGATTCAAGAGATCAGGCACTCCTCAATTGCTTTTTTC-3' (SEC ID NO:187) Sentido PA-2087: 5'- TCGAGAAAAAAGCAATTGAGGAGTGCCTGATCTCTTGAATCAGGCACTCCTCAATTGCA-3' (SEC ID NO:270) 274 Infección viral y determinación de la concentración viral. Estos fueron realizados como se describe en el ejemplo 12. Suministro de ADN. Los ADN de plásmido que sirven como plantillas para la expresión de ARNsh NP-1496a, ARNsh PB1-2257 o ARNsh de RSV específicos (60 µg cada uno) se mezclaron individualmente con 40 µ? de Infasurf ® (ONY, Inc., Amherst NY) y 20 µ? de glucosa al 5% se administraron intranasalmente a grupos de ratones, 4 ratones por cada grupo, como se describe arriba. Una mezcla de 40 µ? de Infasurf y 20 µ? de glucosa al 5% se administraron a ratones en el grupo sin tratamiento (NT) . Los ratones se infectaron intranasalmente con el virus PR8, 12000 pfu por ratón, 13 horas más tarde como se describe arriba. Los pulmones se cosecharon y la concentración viral se determinó 24 horas después de la infección .

Resultados Se probó la capacidad de ARNsh expresada a partir de los vectores de ADN para inhibir la infección del virus de la influenza en ratones. Para estos experimentos, el ADN del plásmido se mezcló con Infasurf, un extracto tensoactivo natural de pulmones de ternero similar a los vehículos mostraron previamente promover la transferencia del gen en los pulmones (74) . Las mezclas de ADN/Infasurf se instilaron 275 en ratones mediante el goteo de la mezcla dentro de la nariz usando una pipeta. Los ratones se infectaron con el virus PR8, 12000 pfu por ratón, 13 horas más tarde. Veinticuatro horas después de la infección del virus de la influenza, los pulmones se cosecharon y las concentraciones del virus se midieron mediante un ensayo de MDCK/hemaglutinina . Como se muestra en la figura 26, las concentraciones del virus fueron altas en ratones que no produjeron cualquier ADN de plásmido o produjeron un vector de ADN que expresa un ARNsh de (RSV) -especifico del virus sincitial respiratorio. Se observaron concentraciones del virus inferiores cuando los ratones produjeron ADN de plásmido que expresa ya sea ARNsh NP-1496a o ARNsh PBl-225 . Las concentraciones del virus disminuyeron de forma significativa cuando los ratones produjeron ambos ADN de plásmido de influenza específicos al mismo tiempo, uno que expresa ARNsh NP-1496a y el otro que expresa ARNsh PBl-2257. El promedio logi0TCID5o del homogeneizado de los pulmones para los ratones que no recibieron tratamiento (NT, cuadrados en blanco) o recibieron un plásmido que codifica un ARNsh de RSV específico (RSV, cuadrados rellenos) fue de 4.0 ó 4.1, respectivamente. En ratones que recibieron plásmidos capaces de servir como una plantilla para el ARNshNP-1496a (NP, círculos en blanco) , el promedio logi0TCID50 del homogeneizado de los pulmones fue de 3.4. En ratones que recibieron plásmidos capaces de servir como una plantilla para el ARNsi PBl-2257 (PB, triángulos en blanco) , el promedio logioTCIDso del homogeneizado de los pulmones fue de 3.8. En ratones que recibieron plásmidos capaces de servir como plantillas para ARNsh NP y PB (NP + PBl, circuios rellenos), el promedio logio CIDso del homogeneizado de los pulmones fue de 3.2. Las diferencias en la concentración del virus en el homogeneizado de los pulmones entre el grupo que no recibió tratamiento o plásmido de ARNsh de RVS específicos y los grupos que recibieron plásmido ARNsh NP, plásmido ARNsh PBl o plásmidos ARNsh NP y PBl tuvieron valores P de 0.049, 0.124 y 0.004 respectivamente. Los datos para los ratones individuales se presentan en la Tabla 10 (NT = sin tratamiento) . Los experimentos preliminares que involucran la administración intranasal de ARNsi NP-1496 en lugar de ARNsh NP en presencia de PBS o jetPEI en la ausencia de Infasurf no resultan en una inhibición efectiva del virus de la influenza. Estos resultados demuestran que el ARNsh expresados a partir de los vectores de ADN pueden procesarse en el ARNsi para inhibir la producción del virus de la influenza en ratones y demuestra que el Infasurf es un vehículo adecuado para el suministro de plásmidos a partir de los que el ARNsh puede expresarse. En particular, estos datos indican que el ARNsh dirigido 277 al NP de la influenza y/o transcritos PB1 reducen la concentración del virus en los pulmones cuando se administran después de la infección del virus.

Tabla 10. Inhibición de la producción del virus de la influenza mediante ARNsh expresada en ratones Tratamiento logioTCID50 NT 4.3 4.0 4.0 4.3 RSV (60 pg) 4.3 4.0 4.0 4.0 NP (60 g) 4.0 3.7 3.0 3.0 PBl (60 g) 4.0 4.0 3.7 3.3 NP + PB1 (cada 60 µg) 3.7 3.3 3.0 3.0 Ejemplo 15: Polímeros catiónicos que promueven la absorción celular de ARNsi Materiales y Métodos Reactivos . Las poli-L-lisinas de dos diferentes promedios de pesos moleculares [poli-L~lisina (PM (vis) 52,000, PM (LALLS) 41,800, Cat. No. P2636) y poli-L-lisina (PM (vis) 9,400, PM (LALLS) 8,400, Cat. No. P2636) , poli-L-arginina (PM 15,000-70,000 Cat. No. P7762) y bromuro de tetrazolio de 3- (4, 5-dimetilazol-2-il) -2, 5-difenilo (MTT) se adquirió de Sigma. Se asumirá para propósitos de descripción, los pesos moleculares obtenidos usando el método LALLS, pero se entenderá que los pesos moleculares son aproximados puesto 278 que los polímeros muestran alguna heterogenicidad en tamaño.

Ensayo de retardación por gel. Los complejos del polímero ARNsi se formaron mediante el mezclado de 10 µ? de ARNsi (10 pmol en 10 mM de la solución amortiguadora Hepes, pH 7.2) con 10 µ? de la solución del polímero que contienen cantidades variables del polímero. Los complejos se dejaron formar durante 30 minutos a la temperatura ambiente después de que 20 µ? se ejecutaron en un gel de agarosa al 4%. Las bandas se visualizaron con un teñido de bromuro de etidio. Ensayo de citotoxicidad. Los complejos de polímeros ARNsi se formaron mezclando cantidades iguales (50 p mol) de ARNsi en una solución amortiguadora Hepes 10 mM, pH 7.2 con una solución de polímeros que contenían cantidades variables del polímero durante 30 minutos a la temperatura ambiente. La citotoxicidad se evaluó mediante un ensayo de MTT . Las células se sembraron en placas de 96 pozos en 30,000 células por pozo en 0.2 mi de DMEM que contenían suero de feto de ternero al 10% (FCS) . Después de la incubación durante toda la noche a 37°C, el medio se removió y se reemplazó con 0.18 mi de OPTI-MEM (GIBCO/BRL) . Los complejos del polímero ARNsi en 20 µ? de la solución amortiguadora Hepes se agregaron a las células. Después de 6 horas de incubación a 31°C, el medio que contenía polímeros se removió y se reemplazó con DMEM-10% de FCS. La actividad metabólica de las células se midió 24 horas después de usar el ensayo MTT de acuerdo a las 279 instrucciones de fabricación. Los experimentos se realizaron por triplicado, y se hizo un promedio de los datos. Cultivo celular, transfección, formación de complejos de polímeros de ARNsi y determinación de la concentración viral. Las células Vero se hicieron crecer en DMEM que contenía FCS inactivado o calor al 10%, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/mi de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina a 37°C bajo una atmósfera de aire 95%/C02 al 5%. Para los experimentos de transfección, las células Vero de fase logarítmica se sembraron en placas de 24 pozos en células 4 x 105 por pozo en 1 mi de D EM-10% de FCS. Después de la incubación durante toda la noche a 37 °C, los complejos de polímeros de ARNsi se formaron añadiendo 50 µ? de ARNsi (400 pmol) (aproximadamente 700 ng) en una solución amortiguadora Hepes 10 mM, pH 7.2) a 50 µ? del polímero sometido a un vórtice . Se usaron distintas concentraciones del polímero para obtener la formación completa del complejo entre el ARNsi y el polímero. La mezcla se incubó a la temperatura ambiente durante 30 minutos para completar la formación del complejo. El medio de crecimiento celular se removió y se reemplazó con OPTI-MEM I (Tecnologies Life) justo antes de que se añadieran los complejos. Después de incubar las células con los complejos durante 6 horas a 37°C bajo CO2 al 5%, el medio que contenía el 280 complejo se removió y 200 µ? del virus PR8 en el medio de la infección MOI = 0.04, que consistió de DMEM, BSA al 3% (Sigma) , Hepes 10 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina se añadieron a cada pozo. Después de la incubación durante 1 hora a la temperatura ambiente con una oscilación constante, se añadieron 0.8 mi del medio de infección que contenia 4 µ9/½1 de tripsina a cada uno de los pozos y las células se cultivaron a 37°C bajo C02 al 5%. En distintos momentos después de la infección, los sobrenadantes se cosecharon a partir de los cultivos infectados y la concentración del virus se determinó mediante un ensayo de hemaglutinación (HA) como se describe arriba. La transfección de ARNsi mediante lipofectamina 2000 (Life Technology) se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante para las lineas celulares adherentes. De manera breve, las células Vero de fase logarítmica se sembraron en una placa de 24 pozos a 4 x 105 células por pozo en 1 mi de DMEM-FCS al 10% y se incubaron a 37 °C bajo C02 al 5%. Al siguiente día, 50 µ? de Lipofectamina diluida 2,000 en OPTI-MEM I se añadieron a 50 µ? de ARNsi (400 pmol en ????-MEM I) para formar complejos. Las células se cosecharon y se incubaron con el medio libre de suero. Los complejos se aplicaron a las células y las células se incubaron a 37 °C durante 6 horas antes de que se lavaran y se infectaran con el virus de la influenza, como se describió anteriormente. En 281 distintos tiempos después de la infección, los sobrenadantes se cosecharon a partir de cultivos celulares y la concentración del virus se determinó mediante ensayos de hemaglutinación (HA) como se describió anteriormente.

Resultados Se probó la capacidad de la poli-L-lisina (PLL) y poli-L-arginina (PLA) para formar complejos con ARNsi y promover la absorción de ARNsi mediante células cultivadas. Para determinar si PLL y/o PLA forman complejos con ARNsi, una cantidad fija de ARNsi NP-1496 se mezcló con cantidades mayores del polímero. La formación de los complejos de polimeros/ARNsi se visualizó después mediante electroforesis en gel de agarosa al 4%. Con las cantidades aumentadas del polímero, la movilidad electroforética de ARNsi se retardo (Figura 27? y 27B) , indicando la formación del complejo. Las figuras 27A y 27B representan la formación del complejo entre los ARNsi y PLL (41.8 K) o PLA, respectivamente. La cantidad del polímero usado en cada panel aumenta de izquierda a derecha. En las figuras 27A y 27B en cada panel, puede sembrarse una banda en la senda de la izquierda, indicando la carencia de una formación del complejo y por lo tanto, la entrada del ARNsi en el gel y su subsecuente migración. Conforme uno se mueve a la derecha, la banda desaparece indicando la formación del complejo y la insuficiencia del 282 complejo para ingresar al gel y emigrar. Para investigar la citotoxicidad de los complejos de ARNsi/polímeros, se añadieron -las mezclas de ARNsi y PLL o PLA en diferentes relaciones a los cultivos de células Vero en placas de 96 pozos. La actividad metabólica de las células se midió mediante un ensayo MTT (74) . Los experimentos se realizaron por triplicado y los datos se promediaron. La viabilidad celular se redujo significativamente con las cantidades aumentadas de PLL (PM ~ 42 k) mientras que PLL (~ 8 K) mostró una toxicidad significativamente inferior, exhibiendo una mínima o nula toxicidad en las relaciones de PLL/AR si tan altas como 4:1 (figura 28 A; círculos = PLL (PM ~ 8 K) , cuadrados = PLL (PM ~ 42 K) ) . La viabilidad celular se redujo con relaciones de PLA/ARNsi incrementadas como se muestra en la figura 28 B, pero la viabilidad permaneció por arriba del 80% en las relaciones de PLA/ARNsi tan altas como 4.5:1. La relación del polímero/ARNsi se indica en el eje x en las figuras 28A y 28B. Los datos graficados en las figuras 28 A y 28 B se presentan en las Tablas 11 y 12. En la tabla 11 los números indican el % de viabilidad de las células que siguen el tratamiento con los complejos del polímero/ARNsi, relativos al % de viabilidad de las células no tratadas. ND = no realizado. En la tabla 12, los números indican la relación de PLA/ARNsi, % de supervivencia y desviación estándar como se muestra. 283 Tabla 11. Citotoxicidad de los complejos PLL/ARNsi (¾ de supervivencia) Tratamiento logi0TCID50 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 16.0 PLL ~8.4K 92.26 83.57 84.39 41.42 32.51 ND PLL~41.8K ND 100 100 100 82.55 69.63 Tabla 12. Citotoxicidad de los complejos PLA/ARNsi (¾ de supervivencia) Relación Polímero/AENsi 0.17 0.5 1.5 4.5 13.5 % de sobrevivencia 94.61 100 92.33 83 39.19 desviación estándar .74 1.91 2.92 1.51 4.12 Para determinar si el PLL o PLA promueven la absorción celular de ARNsi, distintas cantidades de polímeros y ÑP-1496 se mezclaron en relaciones en las que todos los ARNsi formaron complejos con el polímero. Cantidades iguales de ARNsi se usaron en cada caso. Se usó una relación de polímeros /ARNsi inferior para ~42 K de PLL que para ~8 K de PLL puesto que la anterior proporcionó una mayor toxicidad a las células. Los complejos se añadieron a las células Vero y 6 horas más tarde, los cultivos se infectaron con el virus PR8. En distintos momentos después de la infección, los 284 sobrenadantes del cultivo se cosecharon y se ensayaron para el virus mediante el ensayo HA. La figura 29A es una gráfica de concentraciones del virus con respecto al tiempo en células que recibieron varios tratamientos de la transfección (circuios = sin tratamiento, cuadrados =Lipofectamina, triángulos rellenos = PLL (~42 K en la relación PLL/ARNsi = 2), triángulos en blanco = PLL (~8 K en la relación PLL/ARNsi = 8) . Como se muestra en la figura 29 A, las concentraciones del virus incrementaron con el tiempo en los cultivos no transfectados. Las concentraciones del virus fueron significativamente inferiores en los cultivos que se transfectaron con NP-1496/Lipofectamina e incluso aún más bajos en los cultivos tratados con los complejos PLL/NP-1496. Los datos graficados en la figura 29 A se presentan en la Tabla 13 (NT = sin tratamiento, LF2K = Lipofectamina . La relación de PLL : RNsi se indica en paréntesis. El PLA se probó de manera similar en un rango de relaciones polímero/ARNsi . La figura 29B es una gráfica de las concentraciones del virus con respecto al tiempo en células que reciben varios tratamientos de transfección (cuadrados rellenos = simulación de la transfección, circuios rellenos - Lipofectamina, cuadrados en blanco = PLA en una relación de PLA/ARNsi = 1, circuios en blanco = PLA en una relación de PLA/ARNsi 285 = 2, triángulos en blanco = PLA en una relación PLA/ARNsi, triángulos rellenos = PLA en una relación de PLA/ARNsi = 8). Como se muestra en la figura 29 B, las concentraciones del virus con respecto al tiempo en el cultivo de control (simulación de la transfeccion) y en el cultivo tratado con PLA/ARNsi en una relación de 1:1. Las concentraciones del virus fueron significativamente inferiores en cultivos que se transfectaron con NP-1496/lipofectamina e incluso inferiores en cultivos tratados con complejos PLA/ARNsi que contenían complejos en una relación PLA/ARNsi de 4:1 o superior. Las cantidades aumentadas del polímero resultaron en una reducción mayor en la concentración viral . Los datos graficados en la figura 29 B se presentan en la Tabla 14.

Tabla 13. Inhibición de la producción del virus de la influenza mediante los complejos de polimero/ARNsi Tratamiento Tiempo (horas) 24 36 48 60 Transfeccion de imitación 16 64 64 64 LF2K 4 8 16 16 PLL ~42 K (2:1) 1 4 8 8 PLL ~8K (8:1) 1 2 4 8 286 Tabla 14. Inhibición de la producción del virus de la influenza mediante complejos de polimeros/ARNsi Tratamiento Tiempo (horas) 24 36 48 60 Transfeccion de imitación 8 64 128 256 LF2K 2 6 16 32 PLA (1:1) 4 16 128 256 PLA (2:1) 4 16 32 64 PLA (4:1) 1 4 8 16 PLA (8:1) 1 1 1 2 Asi, los polímeros catiónicos promueven la absorción celular de ARNsi e inhiben la producción del virus de la influenza en una línea celular y son más efectivos que el reactivo de transfeccion lipofectamina ampliamente usado. Estos resultados también sugieren que los polímeros catiónicos pueden identificarse fácilmente para estimular la absorción celular de ARNsi y describe un método para su identificación. El PLL y PLA pueden servir como controles positivos para tales esfuerzos.

Equivalentes Aquellos expertos en el arte reconocerán, o podrán determinar usando únicamente la experimentación de rutina, muchos equivalentes para las modalidades específicas de la 287 invención descritas en la presente. El alcance de la presente invención no pretende limitarse a la descripción anterior, sino más bien, como se establece en las reivindicaciones anexadas .

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Claims

307 Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición, caracterizada porque comprende: un ARNsi o ARNsh dirigido a un transcrito de direccionamiento, en donde el transcrito de direccionamiento es un transcrito de agente especifico, cuyo transcrito está involucrado en la infección por o replicación de un agente infeccioso. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso es un agente cuyo genoma comprende múltiples moléculas de ácido nucleico independientes . 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque: las moléculas de ácido nucleico son ARN. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque: las moléculas de ARN son de hebra sencilla . 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: las variantes múltiples del agente infeccioso existen y en donde el agente es capaz de experimentar reconfiguración genética. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: las variantes múltiples del agente 308 infeccioso existen y en donde el ARNsi o ARNsh comprenden una región dúplex cuya hebra antisentido o porción antisentido es perfectamente complementaria a una porción de un ARNm de direccionamiento, cuya porción es de al menos 10 nucleótidos de longitud y es altamente conservada entre una pluralidad de variantes . 7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque: las variantes múltiples del agente infeccioso existen y en donde el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex cuya hebra antisentido o porción antisentido es perfectamente complementaria a una porción de un ARNm de direccionamiento, cuya porción es al menos de 12 nucleótidos en longitud y es altamente conservada entre una pluralidad de variantes . 8. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque: las variantes múltiples del agente infeccioso existen y en donde el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex cuya hebra antisentido o porción antisentido es perfectamente complementaria a una porción de un ARNm de direccionamiento, cuya porción es al menos de 15 nucleótidos en longitud y es altamente conservada entre una pluralidad de variantes . 9. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque: las variantes múltiples del agente infeccioso existen y en donde el ARNsi o ARNsh comprende una 309 región dúplex cuya hebra antisentido o porción antisentido es perfectamente complementaria a una porción de un ARNm de direccionamiento, cuya porción es al menos 17 nucleótidos en longitud y es altamente conservada entre una pluralidad de variantes. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque: variantes múltiples del agente infeccioso existen y en donde el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex cuya hebra antisentido o porción antisentido es perfectamente complementaria a una porción de un ARNm de direccionamiento, cuya porción es al menos 19 nucleótidos en longitud y es altamente conservada entre una pluralidad de variantes . 11. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: un porción es altamente conservada entre las variantes si es idéntica entre las diferentes variantes . 12. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque un porción es altamente conservada entre las variantes si varia como máximo un nucleótido entre diferentes variantes. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: un porción es altamente conservada entre las variantes si varia como máximo dos nucleótidos entre diferentes variantes. 310 14. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: la porción es altamente conservada como mínimo entre 5 variantes . 15. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: la porción es altamente conservada como mínimo entre 10 variantes. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: la porción es altamente conservada como mínimo entre 15 variantes. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque: la porción es altamente conservada como mínimo entre 20 variantes. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta células epiteliales respiratorias. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso es un virus de influenza. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque: el virus de influenza es un virus A de influenza. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque: el virus de influenza es un virus B de influenza. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 311 1, caracterizada porque: el agente infeccioso inhibe la traducción del ARNm de célula hospedera. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la producción del agente por la célula hospedera por al menos alrededor de 2 veces. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la producción del agente por una célula hospedera por al menos alrededor de 5 veces. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la producción del agente por una célula hospedera por al menos alrededor de 10 veces. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la producción del agente por una célula hospedera por al menos alrededor de 50 veces. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel 312 suficiente para inhibir la producción del agente por una célula hospedera por al menos alrededor de 100 veces. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso infecta una célula hospedera y el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la producción del agente por una célula hospedera por al menos alrededor de 200 veces. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el transcrito de direccionamiento codifica una subunidad de una polimerasa de ARN viral. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el transcrito de direccionamiento codifica una hemaglutinina o una neuraminidasa . 31. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el agente infeccioso es un virus de influenza y el transcrito de direccionamiento codifica una proteina seleccionada del grupo que consiste de hemaglutinina, neuraminidasa, proteina de membrana 1, proteina de membrana 2, proteina no estructural 1, proteina no estructural 2, proteina de polimerasa PB1, proteina de polimerasa PB2, proteina de polimerasa PA, proteina de polimerasa NP. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh está presente a un nivel suficiente para inhibir la replicación del agente infeccioso. 313 33. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región de pares de bases de al menos 15 nucleótidos en longitud. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región de pares de bases de aproximadamente 19 nucleótidos en longitud. 35. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región de pares de bases de al menos 15 nucleótidos en longitud y al menos un colgante cebador de 3 hebras sencillas. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una porción que es perfectamente complementaria a una región del transcrito de direccionamiento, en donde la porción es al menos 15 nucleótidos en longitud. 37. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una porción que es perfectamente complementaria a un porción del transcrito de direccionamiento, con la excepción de como máximo un nucleótido, en donde la porción es al menos 15 nucleótidos en longitud. 38. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una 314 porción que es perfectamente complementaria con una porción del transcrito de direccionamiento con la excepción de como máximo nucleótidos, en donde la porción es de al menos 15 nucleótidos en longitud. 39. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 1 hasta 68. 40. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 1 hasta 68. 41. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 1 hasta 68. 315 42. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada por que: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS : 1 hasta 68. 43. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS : 1 hasta 68. 44. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la. hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS : 1 hasta 68, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 10 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 45. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una 316 región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS : 1 hasta 68, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 12 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 46. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS : 1 hasta 68, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 15 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 47. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 1 hasta 68 , con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 17 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 317 48. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 3 hasta 21 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 1 hasta 68, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 19 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 49. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268. 50. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 12 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en 318 cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268. 51. La composición, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268. '52. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la. hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268. 53. La composición de conformidad con la reivindicación 319 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268. 54. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 10 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 10 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 55. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la- hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al 320 menos 12 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 12 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 56. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 15 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 57. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 17 nucleótidos consecutivos como se establece en los 321 nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 17 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 58. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque: el ARNsi o ARNsh comprende una región dúplex del núcleo, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción de la región dúplex del núcleo comprende al menos 19 nucleótidos consecutivos como se establece en los nucleótidos 1 hasta 19 de la secuencia presente en cualesquiera de las SEQ ID NOS: 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, ó 268, con la condición de que ya sea uno o dos nucleótidos entre los 19 nucleótidos consecutivos pueda diferir de la secuencia. 59. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende hebras sentido o antisentido o porciones cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 77 y 78 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3f en una o ambas secuencias. 322 60. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 71 y 72 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3f en una o ambas secuencias. 61. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 83 y 84 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3' en una o ambas secuencias. 62. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 89 y 90 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3' en una o ambas secuencias. 63. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 91 y 92 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3' en una o ambas secuencias. 64. La composición de conformidad con la reivindicación 323 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-19 de SEQ ID NOS: 93 y 94 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3' en una o ambas secuencias. 65. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue el ARNsi o ARNsh comprende porciones sentido y antisentido cuyas secuencias comprenden secuencias dadas por nucleótidos 1-20 de SEQ ID NOS: 188 y 189 respectivamente, con, opcionalmente, un colgante 3r en una o ambas secuencias. 66. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ARNsi o ARNsh comprende una porción dúplex seleccionada del grupo que consiste de porciones dúplex de: NP-1496, NP- 1496a, PA-2087, PBL-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, o M-598 o una variante de cualesquiera de los anteriores, cuya variante difiere de por como máximo un nucleótido del correspondiente ARNsi. 67. La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh es idéntica a la porción dúplex de NP-1496. 68. La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh es idéntica a la porción dúplex de NP-1496A. 69. La composición de conformidad con la reivindicación 324 1, caracterizada porque la hebra sentido o porción del ARNsi o ARNsh tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste de : los primeros 19 nucleótidos de SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 99, y SEQ ID NO: 188, leído en una dirección 5' hasta 3'. 70. ün análogo del ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el análogo difiere de los ARNsi o ARNsh en que contiene al menos una modificación. 71. El análogo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque: la modificación resulta en una estabilidad creciente de los ARNsi, mejora la absorción de los ARNsi, mejora la entrada celular de los ARNsi, o cualquier combinación de los anteriores. 72. El análogo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque: la modificación modifica una base, un azúcar, o una ligadura internucleósido . 73. El análogo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque: la modificación no es una modificación del nucleótido 2' . 74. El análogo de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque: la modificación es una modificación del nucleótido 2 ' . 75. ün análogo del ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: el análogo difiere de 325 los ARNsi en que al menos un ribonucleótido se reemplaza por un desoxiribonucleótido . 76. Una composición caracterizada porque comprende una pluralidad de ARNs de hebra sencilla que cuando se hibridizan uno con el otro, forman la composición de conformidad con la reivindicación 1. 77. La composición de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque: el intervalo de los ARN de hebra sencilla en longitud es entre aproximadamente 21 y 23 nucleótidos, inclusive. 78. Una composición caracterizada porque comprende una pluralidad de los AR si o AR sh de conformidad con la reivindicación 1. 79. La composición de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque al menos algunos de los ARNsi o ARNsh se dirigen a transcritos diferentes del virus de la influenza . 80. La composición de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque al menos algunos de los ARNsi o ARNsh se dirigen a regiones diferentes del mismo transcrito del virus de la influenza. 81. El ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: la presencia del ARNsi o ARNsh dentro de una célula susceptible a infección por el virus de la influenza, reduce la susceptibilidad de la 326 célula a la infección por al menos dos cepas de influenza. 82. El ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la presencia del ARNsi o ARNsh dentro de un sujeto susceptible a la infección con virus de influenza reduce la susceptibilidad del sujeto a la infección por al menos dos cepas de influenza. 83. Una célula, caracterizada porque comprende el ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1. 84. Un vector, caracterizado porque proporciona una plantilla para la síntesis del ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1. 85. El vector de conformidad con la reivindicación 84, caracterizado porque el vector comprende un ácido nucleico enlazado operablemente a señales de expresión activas en una célula hospedera de manera que, cuando el constructo se introduce en la célula hospedera, el ARNsi o ARNsh de conformidad con la reivindicación 1 se produce dentro de la célula hospedera. 86. Un vector, caracterizado porque comprende un ácido nucleico enlazado operablemente a señales de expresión activas en una célula hospedera de manera que, cuando el constructo se introduce en la célula hospedera, un ARNsi o ARNsh se produce dentro de la célula hospedera la cual está dirigida a un transcrito especifico para un agente infeccioso, cuyo transcrito está involucrado en infección por o 327 replicación del agente. 87. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el agente infeccioso es un virus y en donde las variantes múltiples del virus existen y en donde el virus es capaz de experimentar reconfiguración o mezclado genético . 88. Una célula, caracterizada porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 87. 89. ün animal transgénico, caracterizado porque comprende el vector de conformidad con la reivindicación 87. 90. El vector de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el virus es uno cuyo genoma comprende múltiples moléculas de ácido nucleico independientes. 91. El vector de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el agente infeccioso es un virus de influenza . 92. El vector de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque el vector proporciona una plantilla para la transcripción de una o más hebras de un ARNsi o un ARNsh que reduce la susceptibilidad de la célula a la infección por virus de influenza o inhibe la producción de virus de influenza. 93. El vector de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque la degradación del transcrito de direccionamiento retarda, previene, o inhibe uno o más 328 aspectos de infección o replicación del virus de influenza. 94. El vector de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh se selecciona del grupo que consiste de porciones dúplex de: NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, y M-598, o una variante de cualesquiera de los anteriores, en donde la variante difiere por como máximo un nucleótido del correspondiente ARNsi en cualquiera de su porción sentido, porción antisentido, o ambos. 95. El vector de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh es idéntica a la porción dúplex de NP-1496. 96. El vector de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la porción dúplex de ARNsi es idéntica a la porción dúplex de NP-1496a. 97. El vector de conformidad con la reivindicación 94, caracterizado porque la hebra sentido o porción del ARNsi o ARNsh tiene la secuencia seleccionada del grupo que consiste de: los primeros 19 nucleótidos de cualesquiera de las SEQ ID NOs: 71, 75, 77, 83, 93, 95, 99, y 188, que se leen en una dirección 5' a 3' . 98. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque: el ácido nucleico se enlaza operablemente a un promotor para la polimerasa III de ARN. 99. El vector de conformidad con la reivindicación 98, 329 caracterizado porque: el promotor es un promotor Ü6 o Hl. 100. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque: el vector se selecciona del grupo que consiste de vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, y vectores de virus asociados con adeno. 101. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el vector es un vector lentiviral. 102. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el vector es un vector de ADN. 103. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el vector es un virus. 104. El vector de conformidad con la reivindicación 86, caracterizado porque el vector es un lentivirus. 105. Un método para el tratamiento o prevención de infección por un agente infeccioso, el método caracterizado porque comprende las etapas de: administrar a un sujeto antes de, simultáneamente con, o después de la exposición del sujeto al agente infeccioso, una composición que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 86 o la célula de conformidad con la reivindicación 88. 106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el agente infeccioso es un virus. 107. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el agente infeccioso infecta células 330 epiteliales respiratorias. 108. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el agente infeccioso es un virus de in luenza . 109. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la composición se administra intravenosamente . 110. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la composición se administra intranasalmente . 111. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque la' composición se administra por inhalación . 112. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: la composición de conformidad con la reivindicación 1; y un portador farmacéuticamente aceptable. 113. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque: la composición se formula como' un aerosol . 114. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque: la composición se formula como un roció nasal. 115. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque: la composición se formula para administración intravenosa. 331 116. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 112, caracterizada porque: el agente infeccioso es un virus de influenza y en donde la composición comprende además un segundo agente anti-influenza . 11 . La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 116, caracterizada porque el segundo agente anti-influenza está aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos. 118. Un método para identificar inhibidores virales, el método caracterizado porque comprende las etapas de: proporcionar una célula que incluye un ARNsi o ARNsh candidato cuya secuencia incluye una región de complementariedad con al menos un transcrito producido durante la infección con un virus, cuyo transcrito se caracteriza en que su degradación retarda, previene, o inhibe uno o más aspectos de la infección o replicación viral; detecta la infección por o replicación del virus en la célula; e identifica un ARNsi o ARNsh que inhibe la infectabilidad o replicación viral, cuyo ARNsi o ARNsh es un inhibidor viral. 119. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque: el virus es un virus de influenza. 120. El método de conformidad con la reivindicación 118, en donde la célula está caracterizada porque en ausencia del ARNsi o ARNsh, la célula produce al menos un transcrito viral. 121. El método de conformidad con la reivindicación 118, 332 caracterizado porque comprende además la etapa de: transfectar la célula con un genoma viral o infectar la célula con el virus. 122. ün método para el tratamiento o prevención de infección por un virus, el método comprende las etapas de: administrar a un sujeto antes de, simultáneamente con, o después de la exposición del sujeto al virus, una composición que comprende una cantidad efectiva de una entidad que induce el ARNi, en donde la entidad que induce el ARNi está dirigida a un transcrito producido durante la infección por el virus, cuyo transcrito está caracterizado porque la reducción en los niveles del transcrito retarda, previene, o inhibe uno^ o más aspectos de la infección por o replicación del virus. 123. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque: el virus infecta células epiteliales respiratorias . 124. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque: el virus es un virus de influenza. 125. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la composición se administra en el tracto respiratorio. 126. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la composición se administra por un método de administración intravenosa convencional. 127. El método de conformidad con la reivindicación 122, 333 caracterizado porque en ausencia de la entidad que induce el ARNi, el virus es capaz de experimentar un ciclo de vida completo que lleva a la producción del virus infeccioso, y en donde la presencia del ARNsi o ARNsh inhibe la producción del virus . 128. El método de conformidad con la reivindicación 122, caracterizado porque la entidad que induce el ARNi comprende una porción dúplex seleccionada del grupo que consiste de porciones dúplex de: NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PBl-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, y -598, o una variante de cualesquiera de los anteriores, en donde la variante difiere por como máximo un nucleótido del correspondiente ARNsi en cualquiera de su porción sentido, porción antisentido, o ambos . 129. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque la porción dúplex es idéntica a la porción dúplex de NP-1496. 130. El vector de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque la porción dúplex es idéntica a la porción dúplex de ??-1496?. 131. ün método para diseñar un ARNsi o ARNsh que tiene una porción dúplex, el método caracterizado porque comprende las etapas de: identificar una porción de un transcrito de direccionamiento, cuya porción es altamente conservada entre una pluralidad de variantes de un agente infeccioso y 334 comprende al menos 15 nucleótidos consecutivos; y selecionar la secuencia de la porción como la secuencia para la porción dúplex de la porción o hebra sentido ARNsi o ARNsh. 132. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque comprende además: seleccionar una secuencia complementaria a la porción como la secuencia para la porción dúplex de la porción o hebra antisentido ARNsi o ARNsh . 133. El método de conformidad con la reivindicación 132, caracterizado porque comprende además: agregar un colgante 3' a cualquiera o ambas de las hebras sentido o antisentido del dúplex ARNsi. 134. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: la pluralidad de variantes comprende al menos 10 variantes. 135. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: la pluralidad de variantes comprende al menos 15 variantes. 136. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: la pluralidad de variantes comprende al menos 20 variantes. 137. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: la porción comprende aproximadamente 19 nucleótidos . 138. El método de conformidad con la reivindicación 131, 335 caracterizado porque: un porción se considera altamente conservada entre una pluralidad de variantes si difiere por como máximo de un nucleótido entre las variantes. 139. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: el agente infeccioso es un virus de influenza . 140. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: el agente infeccioso es capaz de experimentar reconfiguración. 141. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: las variantes incluyen al menos dos variantes, cada una de las cuales infecta naturalmente un hospedador de una especie diferente. 142. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque: la especie incluye al menos dos especies seleccionadas del grupo que consiste de humanos, porcinos, caballos, y especies de pájaros. 143. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque: las variantes incluyen al menos dos variantes, cada una de las cuales surgen en un hospedador de una especie diferente. 144. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque: la especie incluye al menos dos especies seleccionadas del grupo que consiste de humanos, porcinos, caballos, y especies de pájaros. 336 145. Una composición que comprende un ARNsi o ARNsh caracterizado porque se diseña de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 131. 146. Un método para reducir o disminuir los niveles de un transcrito, cuyo transcrito es un ARNv o ARNc, caracterizado porque comprende administrar una entidad que induce ARNi dirigida a un transcrito de ARNm que tiene una secuencia, al menos una porción de la cual es complementaria a o idéntica al tracripto de ARNv o ARNc. 147. Un método para inhibir un primer transcrito, caracterizado porque comprende administrar una entidad que induce el ARNi dirigido a un segundo transcrito, en donde la inhibición del segundo transcrito resulta en la inhibición del primer transcrito. 148. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el nivel del primer transcrito se reduce con relación a su nivel en ausencia de la entidad que induce el ARNi. 149. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el nivel del segundo transcrito se reduce con relación a su nivel en ausencia de la entidad que induce el ARNi . 150. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque los niveles del primer y segundo transcrito se reducen con relación a sus niveles en ausencia 337 de la entidad que induce el ARNi. 151. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque la entidad que induce el ARNi no se dirige específicamente al primer transcrito. 152. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el segundo transcrito codifica una proteína que funciona para mantener la estabilidad del ARN. 153. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque la proteina es una proteina que enlaza al ácido nucleico. 154. El método de conformidad con la reivindicación 153, caracterizado porque la proteína que enlaza al ácido nucleico es una proteína que enlaza el ARN. 155. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el segundo transcrito codifica una polimerasa . 156. El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque la polimerasa es una polimerasa de ARN. 157. El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque la polimerasa es una polimerasa de ADN. 158. El método de conformidad con la reivindicación 155, caracterizado porque la polimerasa es una transcriptasa inversa . 159. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque cualquiera o ambos del primero y segundo 338 transcritos son transcritos especificos de agente, en donde el agente es un agente infeccioso. 160. El método de conformidad con la reivindicación 147, caracterizado porque el primero y segundo transcritos son transcritos especificos de agente, en donde el agente es un agente infeccioso. 161. El método de conformidad con la reivindicación 160, caracterizado porque el agente infeccioso es un virus. 162. El método de conformidad con la reivindicación 161, caracterizado porque el virus es un virus de influenza. 163. El método de conformidad con la reivindicación 162, caracterizado porque el segundo transcrito codifica ya sea una proteina NP viral o una proteina PA viral. 164. El método de conformidad con la reivindicación 163, caracterizado porque el primer transcrito codifica una proteina seleccionada del grupo que consiste de: proteina M, proteina HA, proteina PB1, proteina PB2, o proteina NS . 165. Una composición, caracterizada porque comprende: una entidad que induce el ARNi, en donde la entidad que induce el ARNi se dirige a un transcrito de virus de influenza; y un agente de administración seleccionado del grupo que consiste de: polímeros catiónicos, polímeros catiónicos modificados, transportadores moleculares de péptido, tensoactivos apropiados para la introducción en el pulmón, lípidos neutrales o catiónicos, liposomas, polímeros 339 no catiónicos, polímeros no catiónicos modificados, bupivacaina, y cloroquina. 166. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque el agente de administración comprende una porción que aumenta la administración para aumentar la administración a una célula de interés. 167. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la porción que aumenta la administración comprende un anticuerpo, fragmento de anticuerpo, o ligando que se enlaza específicamente a la molécula expresada por la célula de interés. 168. La composición de conformidad con la reivindicación 167, caracterizada porque la célula de interés es una célula epitelial respiratoria. 169. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la porción que aumenta la administración comprende una porción seleccionada para degradación reducida, liberación, o enlace no específico del agente de administración. 170. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un vector viral . 171. La composición de conformidad con la reivindicación 170, caracterizada porque el vector viral comprende aun vector lentiviral . 340 172. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un vector de ADN. 173. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un virus. 174. La composición de conformidad con la reivindicación 173, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un lentivirus . 175. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un ARNsi. 176. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un ARNsh. 177. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque la entidad que induce el ARNi comprende un vector que induce el ARNi cuya presencia dentro de la célula resulta en la producción de un ARNsi o ARNsh dirigido a un transcrito de virus de influenza. 178. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque: la entidad que induce el ARNi comprende un ARNsi o ARNsh o un vector que induce el ARNi cuya presencia dentro de la célula resulta en la producción de un ARNsi o ARNsh, en donde el ARNsi o ARNsh comprende una 341 porción que es perfectamente complementaria a una región del transcrito de direccionamiento, en donde la porción es al menos de 15 nucleótidos en longitud. 179. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque: la entidad que induce el ARNi comprende un ARNsi o ARNsh o un vector que induce el ARNi cuya presencia dentro de la célula resulta en la producción de un ARNsi o ARNsh, en donde el ARNsi o ARNsh comprende una porción dúplex seleccionada del grupo que consiste de porciones dúplex de: NP-1496, NP-1496a, PA-2087, PB1-2257, PB1-129, PB2-2240, M-37, y M-598, o una variante de cualesquiera de las anteriores, en donde la variante difiere por como máximo de un nucleótido del correspondiente ARNsi o ARNsh en cualquiera de su porción sentido, porción antisentido, o ambas. 180. La composición de conformidad con la reivindicación 179, caracterizada porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh comprende la porción dúplex de NP-1496. 181. La composición de conformidad con la reivindicación 179, caracterizada porque la porción dúplex de ARNsi o ARNsh comprende la porción dúplex de NP-1496a. 182. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque: la entidad que induce el ARNi comprende un ARNsi o ARNsh o un vector que induce el ARNi cuya presencia dentro de la célula resulta en la producción 342 de un ARNsi o ARNsh, en donde el ARNsi o ARNsh, en donde la secuencia de la hebra sentido o porción del ARNsi o ARNsh comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de los primeros 19 nucleótidos de, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO : 93; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 99, y SEQ ID NO: 188 leídos en una dirección 5' a 3' . 183. La composición de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque la secuencia de la hebra sentido o porción del ARNsi o ARNsh comprende la secuencia de SEQ ID NO 93. 184. La composición de conformidad con la reivindicación 182, caracterizada porque la secuencia de la hebra sentido o porción del ARNsi o ARNsh comprende la secuencia de SEQ ID NO 188. 185. La composición de conformidad con la reivindicación 165, caracterizada porque el agente de administración se selecciona del grupo que consiste de polímeros catiónicos, polímeros catiónicos modificados, y tensoactivos apropiados para la introducción en el pulmón. 186. La composición de conformidad con la reivindicación 185, caracterizada porque el polímero catiónico se selecciona del grupo que consiste de polilisina, poliarginina, polietilenimina, poli inilpirrolidona, chitosan, y polímeros de poli (ß-amino éster) . 343 187. La composición de conformidad con la reivindicación 186, caracterizada porque el polímero catiónico es polietilenimina . 188. La composición de conformidad con la reivindicación 185, caracterizado porque el polímero catiónico modificado incorpora una modificación seleccionada para reducir la naturaleza catiónica del polímero. 189. La composición de conformidad con la reivindicación 188, caracterizada porque la modificación comprende una substitución con un grupo seleccionado de la lista que consiste de: acetilo, imidazol, succinilo, y acilo. 190. La composición de conformidad con la reivindicación 185, caracterizada porque se modifican entre 25% y 75% de los residuos del polímero catiónico modificado. 191. La composición de conformidad con la reivindicación 190, caracterizada porque se modifica aproximadamente 50% de los residuos del polímero catiónico modificado. 192. La composición de conformidad con la reivindicación 185, caracterizada porque el agente de administración comprende un tensoactivo apropiado para la introducción en el pulmón . 193. La composición de conformidad con la reivindicación 192, caracterizada porque el tensoactivo es Infasurt®, Survanta®, o Exosurf®. 19 . Un método para el tratamiento o prevención de la 344 replicación, patogenicidad o infectividad del virus ed la influenza, caracterizado porque comprende administrar la composición de conformidad con la reivindicación 165 a un sujeto en riesgo o que padece de la infección por el virus de la influenza. 195. El método de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque la composición se administra por una ruta seleccionada del grupo que consiste de: inyección intravenosa, inhalación, intranasalmente y como un aerosol. 196. El método de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque la composición se administra intravenosamente . 197. El método de conformidad con la reivindicación 196, caracterizado porque la composición se administra usando una técnica de administración intravenosa convencional. 198. El método de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque la composición se administra por inhalación. 199. El método de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque la composición se administra intranasalmente . 200. El método de conformidad con la reivindicación 194, caracterizado porque la composición se administra como un aerosol .