CN101367750B - (1s,2s,3s,4r)-3-[(1s)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物及其医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸类化合物，其制备方法，含有这些化合物的药物组合物及其制备方法，以及上述化合物作为神经氨酸酶抑制剂在抗流行感冒中的临床应用。

Description

(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物及其医药用途
技术领域
本发明涉及水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸类化合物，其制备方法，含有这些化合物的药物组合物及它们的抗流感作用。
背景技术
突发性新型病毒性传染性疾病是一类由于病毒自身进化或变异而产生的具有高度传染性及危害性的疾病，由于其病原体为全新的生物结构，爆发时往往缺乏有效的防治手段，因此造成的危害极为严重。流感病毒由于其高度的易变性及对人体的易感性而成为突发性新型病毒性传染性疾病的重要源头，每隔一段时间，新型流感就会在人类形成大流行，近100年来已至少爆发了四次，其中1918年的流感大流行夺去了全球近两千万人的生命。目前，H5N1型高致病性禽流感正在禽类中流行蔓延，随着其自身的不断变异，必将形成可感染人类的新型流感，流感大爆发的威胁正日益临近，及时地发展特效防治药物是应对以新型流感为首的突发性新型病毒性传染性疾病流行的重要手段。
神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)是促进新形成的流感病毒粒子从感染细胞中分离与扩散的关键蛋白，在流感病毒表面最易变异的三类蛋白中(血凝素HA、神经氨酸酶NA和非结构蛋白NS1)，神经氨酸酶相对稳定，尤其是构成活性位点的基酸序列在所有甲、乙型流感病毒中高度保守。这就决定了发展神经氨酸酶抑制剂是应对未知流感病毒的最佳选择。在新型流感的防治药物方面，以奥司他韦和扎那米韦为代表的神经氨酸酶抑制剂被认为是可能的有效防治药物。但二者都存在一定的局限性。均为口服制剂，不利于对高危病人进行救治，老年及儿童等易感人群服用也不方便，预防作用和治疗作用受到很大的限制。对于其它重大病毒性传染疾病，也同样缺乏有效的防治药物，而且治疗费用高。而且单一品种的大量广泛使用极易造成病毒耐药株的出现，从而使药物防治体系失去保护能力，因此需要不断寻找新的治疗途径以发展疗效好毒副作用低的防治药物。
(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸[RWJ270201，BCX1812，JNJ2，peramivir]是一种与奥司他韦和扎那米韦结构完全不同的环戊烷化合物，可选择性地抑制A和B型流感病毒的神经氨酸酶。体外活性研究表明RWJ270201在体外选择性抑制7株A型流感病毒的神经氨酸酶活性(IC50＝0.1-1.4nM)，以及4株B型流感病毒的神经氨酸酶活性(IC50＝0.6-11nM)(Bania S，ParkerC.D.，Ananth S.L.，et al，Comparison of the Anti-influenza VirusActivity of RWJ270201 against Cilnical Isolates of Influenza Virusand Neuraminidase Inhibitor-Resistant Variants，AntimicrobAgnents Chemother，2001，45(12)，3403-3408)。RWJ 270201的活性与扎那米韦和奥司他韦相当或更强。体内活性研究表明RWJ270201可以显著预防感染A型流感病毒A/HongKong/156/97毒株(H5N1)小鼠的死亡率，0.1mg/kg/day组存活率达70％，10mg/kg/day组存活率达100％，并能显著降低肺组织病毒滴度，阻止病毒向脑组织扩散(GovorkovaE.A.，Leneva I.A.，Goloubeva O.G.，et al.，Comparison ofEfficiencies of RWJ270201，Zanamivir，and Oseltamivir againstH5N1，H9N2，and Other Avian Influenza Viruses，Antimicrob AgentsChemother，2001，45(10)，2723-2732)。RWJ270201在第6天时还可抑制肺实变和肺病毒滴度，比奥司他韦作用时间更长。该化合物在剂量低至1mg/kg/day时，仍能防止动脉氧饱和度的降低。RWJ270201(1mg/kg/day)可以降低感染致命性流感B/Hong Kong/5/72毒株的实验动物的死亡率，抑制肺实变以及防止动脉氧饱和度降低，比奥司他韦更有效。此外，RWJ270201 10mg/kg/day还可有效地对抗致死性流感A/Bayern/07/95(H1N1)毒株的感染，降低感染流感A/NWS/33(H1N1)病毒的实验动物的死亡率(Bantia S.，Amold C.S.，Parker C.D.，Anti-influenza Virus Activity of Peramivir in Mice with SingleIntramuscular Injection，Antiviral Research，2006，69(1)，39-45)。RWJ270201毒性低，剂量达到328μg/ml对细胞无毒性；大鼠给药RWJ270201，剂量为1000mg/kg/day，给药5天，没有发现毒副作用。小鼠和大鼠给药剂量达到3000mg/kg/day时，没有观察到急性毒性反应(Sidwell R.W.，Smee D.F.，Huffman J.H.，et al.，In the fluenzaof Virus Strain，Challenge Dose，and Time of Therapy Initiationon the in vivo Influenza Inhibitory Effect of RWJ270201，AntiviralRes.，2001，51(3)，179-187)。是新一种高效低毒的神经氨酸酶抑制剂。
但是研究表明RWJ270201易吸潮，吸潮后水分难以除尽，因此其无水物难以通过工业化获得，质量难以有效控制。在水溶液中不稳定，受环境因素影响易发生自降解，难以直接制成注射剂型以用于危重病人的救治。本发明的目的就是为了寻找具有不易吸潮、质量可控的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸衍生物及其制备方法，同时发展相应的可用于危重病人救治的注射剂型。
发明概述
本发明人通过研究发现，(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)与RWJ270201及其它衍生物相比，具有良好的稳定性，不易吸潮，质量易于控制，适于大规模工业化生产。
药效研究结果表明(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)与RWJ270201在体内外的多种流感毒株上表现出了相同的活性。药物代谢结果表明(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)与RWJ270201具有相同的代谢途径和药物动力学性质。毒理学研究结果表明(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)与RWJ270201在各种毒性指标上表现出相同的作用。因此(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)与RWJ270201具有等效的作用。
本发明人通过研究进一步发现，(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)在水溶液的的稳定性可由溶液的PH值控制，在适当的PH值下具有极好的稳定性，并由此发展了适于危重病人救治的注射剂型。
因此，一方面，本发明提供通式(I)的化合物，以及其制备方法。
另一方面，本发明提供包含本发明化合物的药用组合物及其制备方法。本发明的药用组合物包含至少一种通式(I)的化合物，和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在又一方面，本发明提供治疗或预防流感病毒所致疾病、危险因子或病症的方法，包括给予主体治疗或预防有效量的本发明化合物。
发明详述
本发明提供通式(I)所示的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物：
其中X为2.0或3.0.
本发明化合物可抑制流感病毒的神经氨酸酶活性。
按照一个优选的实施方案，本发明优选的化合物为(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物。
根据本发明，术语“流感病毒”包括但不限于人流感病毒及衍生于各种动物的流感病毒如禽流感病毒。
本领域技术人员应该意识到，本发明化合物也可以以其药学上可接受的盐的形式使用。式(I)化合物的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机酸或有机酸或者无机碱或有机碱形成的常规的盐以及季铵的酸加成盐。合适的与酸形成的盐的例子包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、扑酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、steroic、鞣酸等的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其药学上可接受的盐。合适的与碱形成的盐的例子包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N’-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因的盐。下文提及本发明的化合物时，包括式(I)化合物及其药学上可接受的盐。
本发明还包括本发明化合物的前药，该前药一经给药，即通过代谢过程进行化学转化，之后变成具有活性的药物。通常，这类前药是本发明化合物的功能性衍生物，其在体内容易转化成所需的式(I)的化合物。例如，在“Design Of Prodrugs”，H Bund Saard，Elsevier编辑，1985中描述了选择和制备适宜的前药衍生物的常规方法。
本发明也包括本发明化合物的活性代谢物。
本发明的另一个方面涉及药物组合物，其含有本发明的化合物和至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其可用于体内治疗并具有生物相容性。所述药物组合物可以根据不同给药途径而制备成各种形式。
本发明的药物组合物包括有效剂量的本发明式(I)化合物或其可药用盐，和一种或多种适宜的可药用载体、稀释剂或赋形剂。所述药用载体、稀释剂或赋形剂包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。
本发明的药物组合物可以以下面的任意方式施用：口服，喷雾吸入，直肠用药，鼻腔用药，颊部用药，局部用药，非肠道用药如皮下、静脉、肌内、腹膜内、鞘内、心室内、胸骨内和颅内注射或输入，或借助一种外植储器用药。其中优选非肠道如静脉内给药方式。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。如果需要，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当局部用药时，特别是治疗局部外敷容易达到的患面或器官，如眼睛、皮肤时，可根据不同的患面或器官将本发明化合物制成不同的局部用药制剂形式，具体说明如下：
当眼部局部施用时，本发明化合物可配制成一种微粉化悬浮液或溶液的制剂形式，所使用载体为等渗的一定pH的无菌盐水，其中可加入也可不加防腐剂如氯化苄基烷醇盐。对于眼用，也可将化合物制成膏剂形式如凡士林膏。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚环氧乙烷，聚环氧丙烷，乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯，吐温60，十六烷酯蜡，十六碳烯芳醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。
本发明化合物还可以无菌注射制剂形式用药，包括但不限于无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液或无菌粉针如冻干粉针。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。另外还可包含pH调节剂、0.9％的氯化钠水溶液、缓冲剂、抗氧剂、金属离子络合剂、或其任意组合。
另外需要指出，本发明化合物的使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、使用的化合物的活性、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01～100mg/kg体重/天，最优选的剂量在1～40mg/kg体重/天。
本发明还提供通式(I)化合物的制备方法。
专利CN1282316A(2001)、CN1367776A(2002)披露了(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品的制备方法，但原料、催化剂价格昂贵，制备过程中使用了剧毒的异氰酸苯酯，不适于工业化生产。
Figure G071E3607520070817D000081
本发明以Boc保护的左旋2-氮杂双环并[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(4)和2-乙基丁醛(13)为起始原料，经羟肟化、氯代制得中间体(15)。接着中间体(4)与(15)经合环水解成叔丁胺盐、NaBH4/NiCl2还原、醋酐乙酰化、浓盐酸脱Boc保护、氢氧化钠水解、与1，2，4-三氮唑甲脒反应上胍基，共7步反应制备RWJ270201。此合成路线共经13步反应，我们在原合成方法上进行相应的改进，适应工业化生产的要求，形成制备(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品的改进方法。
Figure G071E3607520070817D000091
本发明将(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品溶于以不同比例的水与互溶的有机溶剂组成的溶液之中，有机溶剂包括但不限于甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、丁酮、叔丁酮等，比例一般在水∶有机溶剂＝100∶1-500或纯水的条件下，优选为20∶1至1∶2；在适当温度，一般在20-100℃下，优选在80-100℃溶解；采用适当的降温速度进行结晶，如0.1℃/分钟至5℃/分钟得到了含不同结晶水的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物(I)。本发明式I化合物也可在上述条件下，通过加入式I化合物晶种得到。
Figure G071E3607520070817D000101
其中X为2.0或3.0。
本发明的优选化合物是三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸。
根据本发明，本发明化合物的溶解度可用标准溶解度测定方法测定。例如在室温水溶液中和中性缓冲溶液中，式(I)化合物中(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物的溶解度≈0.17g/ml，(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品的溶解度≈0.08g/ml，因此式(1)化合物较其非水合物在水溶液和中性生理缓冲溶液中的溶解度明显提高。
本发明化合物的吸湿性可用标准吸湿性测定方法测定。例如在92.5％、80％或75％的相对湿度下，在密闭的容器内常温存放，间隔一定时间取样测定化合物水分含量的改变。式(I)化合物中三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物在十天的观察实验中重量增加约为2.24％，而(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品十天的观察实验中重量增加约为13.53％，因此式(1)化合物较其非水合物在高湿条件下吸水性明显下降。
本发明的稳定性可用标准的稳定性测定方法测定，如中国药典2005版附录XIX C中指定的《药物稳定性试验指导原则》中指定的方法。例如式(I)化合物稳定性可以用加速稳定性实验来测定，如在40摄氏度，75％相对湿度；40摄氏度，92.5％相对湿度；及80摄氏度下测定式(I)化合物在0、1、2、3、6个月的稳定性。分析可以用薄层色谱、高效液相等技术分析主药成份及相关物质的变化情况。式(I)化合物中三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸在1、2、3、6个月的稳定性考察中主成份含量稳定、相关物质没有显著增加，具有良好的稳定性。
本发明得到的水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸具有良好的稳定性，不易吸潮，质量易于控制，适于大规模工业化生产。
本发明还涉及用于预防和治疗流行性感冒的药物组合物，包括式(I)化合物及其药用载体。
根据本发明，本发明式(I)化合物可单独使用或以药物组合物的形式使用。本发明药物组合物可通过口服、非肠道或局部给药途径给药。给药剂型举例但不限于：片剂、胶囊、溶液、注射液、栓剂、贴剂、软膏等。其中优选剂型为非肠道给药组合物及粉针。
为使本发明中式(I)化合物适于流感危重病人的紧急救治，本发明人通过研究，开发出了具有众多优点的非肠道给药药物组合物及其粉针制剂。并且其制备工艺简单易行，成本低廉。
根据本发明，本发明式I化合物的量或药物组合物中式I化合物的量是以(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸的量计。
具体来说，该非肠道给药组合物的特征为包含药学可接受的溶剂和约50％到约4000％w/v的式I化合物，其中式I化合物量以(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸的量计，w/v是指单位剂型中式I化合物重量与溶剂体积之间的比。其中式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物占组合物的量优选为300％至2000％w/v。所述组合物进一步可选择性包含至少一种选自下列的组分：pH调节剂、缓冲剂、抗氧剂、金属离子络合剂、或其任意组合。其中所述的pH调节剂选自无机酸，且以调节所述组合物pH值到约3～7的量存在。pH调节剂优选为稀盐酸，且以调节所述组合物pH值最佳到约4～6的量存在。其中所述药学可接受的溶剂选自水、0.9％的氯化钠水溶液、PEG400、丙二醇、乙醇、甘油及其任意组合，优选为水。所述的式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物占水为溶剂的组合物量最佳为300mg/100ml至100mg/5ml。
粉针制剂的特征为含有式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物，或另含有以下至少一种药学可接受载体、pH调节剂、缓冲剂、抗氧剂、金属离子络合剂、或其任意组合。载体可为但不限于右旋糖酐、甘露醇、氯化钠、山梨醇、枸橼酸等，常用的pH值调节剂包括但不限于盐酸、磷酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、羟基马来酸、谷氨酸、水杨酸、富马酸、枸橼酸等；优选为盐酸。其中(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物与药用载体在单位剂量下按重量百分比的比例为1∶0～1∶100，pH值调节剂的量为确保本制剂在单位剂量下使用时，溶液的pH的范围为2.5～6.5，优选pH的范围为3.5～5.5。
上述制剂的临床应用方式优选为静脉或肌肉注射，或静脉输液滴注。
本发明另一方面还提供了(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物非肠道给药组合物的制备方法，所述方法包括式I化合物的溶解，活性碳吸附与过滤，酸度调节，精滤，灌注及高压高温灭菌等过程，或采用本领域已知方法将式I化合物制成粉针剂如冻干粉针剂。
根据本发明的一个实施方案，每毫升非肠道给药组合物中含有0.5毫克至4克式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物，以及至少一种下述药用载体：pH调节剂、0.9％的氯化钠水溶液、缓冲剂、抗氧剂、金属离子络合剂、或其任意组合。
本发明的式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物的非肠道给药组合物可按以下方法制备：
1)将式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物溶于药学上可接受的溶剂，所述溶剂选自水、0.9％的氯化钠水溶液、PEG400、丙二醇、乙醇、甘油或其任意组合，可采用常温搅拌、超声溶解、加热40至100摄氏度溶解；
2)在40至100摄氏度下加入0.01％至5％的活性碳吸附处理10至30分钟，过滤；
3)加入pH调节剂调节pH值到约4～6的量存在；
4)过精滤膜后灌装，灌装单位为1至150毫升；
5)封口，于105至125摄氏度下灭菌10至50分钟。
根据本发明的另一个实施方案，式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物的非肠道给药组合物包含：
1)300％和2000％w/v的式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物；
2)药学可接受的溶剂，其选自水、PEG400、丙二醇、乙醇、甘油或其任意组合，优选为水；
3)pH调节剂，优选为稀盐酸，且以调节所述组合物pH值最佳到约4～6的量存在。
根据本发明的又一个实施方案，式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物的非肠道给药组合物包含：
1)300％和2000％w/v的式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物；
2)药学可接受的溶剂，其选自水、0.9％的氯化钠水溶液、PEG400、丙二醇、乙醇、甘油或其任意组合，优选自0.9％的氯化钠水溶液；
3)pH调节剂，优选自稀盐酸，且以调节所述组合物pH值最佳到约4～6的量存在。
本发明更优选的配方示于实施例。
本发明另一方面还提供了(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物粉针制剂的制备方法，以(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物为主药制成的粉针制剂。该粉针制剂用注射用水、乙醇、乙醚中的至少一种溶剂进行溶解制取含有(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物的溶液，再进行脱水或脱溶剂后制成的粉针剂。
根据本发明的一个实施方案，每克粉针制剂中含有0.1毫克至1克(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物，或包含以下至少一种填充剂、pH调节剂、缓冲剂、抗氧剂、金属离子络合剂、或其任意组合。
本发明的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物的粉针制剂可按以下方法制备：
用药学上可接受的溶剂，包括但不限于注射用水、乙醇、乙醚中的至少一种溶剂进行溶解并制取含有(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物的溶液，浓度范围为1～6g/100ml，优选范围为2.3～3.5g/100ml；加有机酸和或无机酸调节pH，pH的范围为2.5～6.5，优选pH的范围为3.5～5.5；常用的有机酸和无机酸包括盐酸、磷酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、羟基马来酸、谷氨酸、水杨酸、富马酸、枸橼酸等优选自盐酸，所述溶液经过药用活性炭脱色、0.22μm微孔滤膜过滤后，采用干燥法制备无菌(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物粉针剂；干燥的方法包括减压干燥法、冷冻干燥法、喷雾干燥法和冷冻分装法。
所述非肠道给药组合物具有耐高温，耐贮存，稳定性高，能有效克服在水溶液中的自降解；所述粉针制剂具有制作工艺先进，产品的稳定性好，有效期长，运输方便，便于储藏保管。上述产品使用安全、方便，质量可靠，易于危重病人的紧急救治等优点。
本发明式(I)化合的神经氨酸酶抑制活性可按Barnett JM等人的方法测得(Barnett JM，et al.Antimicrob Agents Chem.2000；41，7887.)。具体如下：
以4-MUNANA为底物，荧光法测定流感病毒神经氨酸酶的活性及受试化合物对神经氨酸酶的抑制活性。在MDCK细胞培养一代的病毒储备液，用神经氨酸酶测定缓冲液(NA assay buffer：32.5MES，4mM CaCl2，PH6.5)对倍稀释，50μl病毒稀释液和等体积4-MUNANA(200mM in NA assaybuffer)混合于黑色96孔板(Costar)，37℃温育1小时，加2倍体积的终止液(25％乙醇，0.1M甘氨酸，pH10.7)终止反应。测定λExcitation：360nM和λEmission：460nM处的荧光密度(PolarSTAROptima，BMG Labtech，德国)。以荧光单位净值对病毒浓度做散点图，选取不同活性位于散点图线性部分中部的病毒浓度用于化合物抑制活性测定，一般不少于两个。用无菌去离子水配制不同浓度的待测化合物，各取25μl与等量与2×NA assay buffer稀释的病毒(两倍于在活性测定中选取的浓度)混合，室温作用30分钟，加50μl 4-MUNANA(200mM inNA assay buffer)，37℃温育1小时，如前测定荧光密度。每个药物浓度设2个复孔，空白对照设4个复孔，其中只含4-MUNANA和终止液，病毒对照设4个复孔，其中待测化合物浓度为0。按公式：
IR(％)＝[1-(FU-FUB)÷(FUC-FUB)]×100
FU：测试孔荧光单位均值；
FUB：空白对照荧光单位均值；
FUC：病毒对照荧光单位均值。
计算抑制率IR(％)。以IR(％)对化合物浓度做散点图，对数回归分析计算IC50，由不同病毒浓度试验结果得到的回归曲线应较好的重叠，IC50值接近。
本发明式(I)化合的抗流感病毒活性可按以下方法测得。
制备病毒滴液，通常使其在50μl磷酸盐缓冲液(含有0.42％牛血清清蛋白)含有500pfu(蚀斑形成单位)小鼠顺应的流感病毒株，然后通过小鼠鼻内滴入使小鼠(BALB/C，雌性，5-6周龄，体重20克)感染。将本发明的化合物悬浮于生理盐水中制备不同的剂量，通常为2.5mg/kg至40mg/kg并在病毒感染前后不同时间给药，通常为感染感染后1小时和感染后2、3、4、5天共腹腔注射5次向动物给药。实验组用8或12只动物进行，通常用10只动物。结果用感染后14天生存小鼠数目与受试小鼠数目之比表示。同时用无水(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸作为对照化合物。结果表明本发明化合物与对照化合物在多种流感毒株上均表现出相同或相近的活性。
具体实施方式
                   实施例
实施例1  2-乙基-N-羟基丁亚氨酰氯(中间体15)的合成
将盐酸羟胺1150g、水1000g、甲苯3500g混合，搅拌下加入2-乙基丁醛1580g。在8～12℃下，用1小时加入氢氧化钠溶液(ca.30％，4630g)。加毕，继续搅拌60分钟。静置分层，取上层含化合物14的甲苯层，直接用于下一步。将N-氯琥珀酰亚胺(NCS)4212g悬浮在二甲基甲酰胺5000mL中，冷却至8℃。用2.5小时将NCS的二甲基甲酰胺悬浮液加入上述化合物14的甲苯溶液，滴加时使反应温度不超过23℃。加完后，继续搅拌1小时。加入水10000mL，搅拌30分钟。丢弃水层，有机层水洗3次，每次10000mL。分出含化合物15(氯肟)的甲苯层，直接用于下一步。
实施例2  (3aR，4R，6S，6aS)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-(1’-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸叔丁基铵(中间体16)的合成
Figure G071E3607520070817D000171
将(1S，4R)-(-)-甲基-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]环戊-2-烯-1-羧酸甲酯(4)(2533.2g)、甲苯(6000ml)、三乙胺(4427mL)混合加热至50℃。用2.5小时向该溶液中滴加入2-乙基-N-羟基丁亚氨酰氯(化合物15，4690g)的甲苯(6000ml)溶液。加完后，反应混合物在62-66℃继续搅拌约8小时。反应液加5000ml水溶解固体。分出甲苯层，并用5000mL水洗，浓缩除去约一半甲苯。往浓缩液加入氢氧化钠(640g，16.0mol)的水(4180g)溶液，室温搅拌7小时。弃除甲苯层，水层用甲苯5000mL×2洗。往水相加入甲苯8000ml，往1747ml盐酸加水3710ml，然后加入上述甲苯层中和至pH～4，加入甲苯使固体溶解(约12000ml)，分出甲苯层。在20-40℃，往甲苯层滴加叔丁胺(894.0g)，析出白色固体产物，95～100℃加热3h，冷却到20～25℃。抽滤，固体用丙酮8000mL洗两次，60℃干燥6小时。得白色固体2694g，收率62.0％
实施例3  (3aR，4R，6S，6aS)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-(1’-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸甲酯(5)的合成
Figure G071E3607520070817D000181
将(3aR，4R，6S，6aS)-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-3-(1’-乙基丙基)-3a，5，6，6a-四氢-4H-环戊烷并[d]异噁唑-6-羧酸1，1-二甲基乙基铵(16)(3210g，7.8mol)悬浮于丙酮(4000g)。加入碳酸钾(53.8g)、含312g氢氧化钠的30％氢氧化钠水溶液。蒸除3000mL溶剂，加入丙酮3000ml，再蒸除3000ml溶剂，再加入3000ml丙酮，蒸除4000ml丙酮，反应液基本无叔丁胺气味。将该溶液冷却至30～35℃，滴加入硫酸二甲酯1060mL，滴加速度保持温度不超过45℃。滴毕，40-45℃搅拌1.5小时。冷却至15-20℃，加入25％氨水1500mL。搅拌30分钟，加入甲醇1500mL，将该反应混合物冷却至0～5℃。用45分钟再加入加入25％氨水2240mL。过滤收集产物，用水3000mL洗涤，45-50℃真空干燥。得率：2686.2g(97.13％)。
实施例4  (1S，2S，3S，4R，1’S)-3-[(1-氨基-2’-乙基)丁基]-4-[[(1，1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]-2-羟基环戊烷-1-羧酸甲酯(6)的合成
Figure G071E3607520070817D000182
将中间体5(1000g)和六水合氯化镍(700g)溶于甲醇(2500mL)，冷却至-10～5℃。将氢氧化钠(5g)和硼氢化钠(300g)溶于甲醇(2300mL)，用约4～6小时加入反应液中，保持反应液温度在-10～4℃。加完后，反应液在0～5℃搅拌60分钟。加入亚硝酸钠(200g)、氯化铵(560g)和25％氨水(650g)与水(6000mL)中形成的溶液。室温搅拌16小时。抽滤，滤饼用25％氨水(340g)与水(2500g)配制的溶液洗涤2次。将滤饼悬浮于甲苯(15000mL)和25％氨水(1250g)中，75～80℃搅拌60分钟。分出有机相，再加入25％氨水(1500g)。加入二水合乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)(150g)与水(2000g)的混合液。70～80℃加热60分钟，分出有机层。将有机层冷却至0～5℃，搅拌2～3小时后，抽滤，滤饼用甲苯(2000g)洗，40～50℃真空干燥，得白色固体化合物6，740g(73.2％)。
实施例5  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品(9)的合成
Figure G071E3607520070817D000191
操作步骤
将中间体62000g悬浮于甲苯10000mL中，冷却至2-5℃，滴加乙酸酐680g。滴毕，室温搅拌1.5小时。慢慢加入10％碳酸钠水溶液4800mL，搅拌15分钟。弃掉水层，有机层即为含中间体7的甲苯溶液，直接进行下一步反应。
冰浴下，往上述甲苯溶液中，滴加浓盐酸1900mL。滴毕，搅拌1.5小时。分层，用水(1000mL)洗有机层一次。合并水层，得含中间体8的水溶液。直接进行下一步反应。
于0-6℃，往上述水溶液中，加入30％氢氧化钠水溶液2920mL。加毕，再搅拌60分钟。得含中间体21的水溶液，直接进行下一步反应。
往上述含中间体21的水溶液中，加入盐酸1，2，4-三唑-1-甲脒1020g，搅拌60分钟。加入30％氢氧化钠水溶液，使溶液pH为8.4。反应液室温搅拌过夜，然后再于0-4℃搅拌4小时。抽滤，烘干得白色固体1150g，(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸粗品，收率30％。
实施例6  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸一水合物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸1200克悬浮于20000毫升水中，加热至90℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入50克活性碳，加热90℃下回流10分钟，趁热过滤。静置降温至75℃，向体系内加入6000毫升丙酮。在冰浴的条件下边搅拌边迅速降温，有大量白色粉未状固体析出。待体系温度降至-4℃时，将混和体系移至冰箱中冷藏，12小时后，过滤收集固体，用丙酮与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得一水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，白色固体，产量1100克，纯度99.57％，水分含量5.31％。
实施例7  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸二水合物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸1000克悬浮于30000毫升水中，加热至90℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入50克活性碳，加热90℃下回流10分钟，趁热过滤。静置降温至75℃，向体系内加入6000毫升甲醇。将混和液置于干燥器中密闭，放置于温控反应槽内，控制温度在六小时内由75℃降至-10℃，有大量白色粉未状固体不断析出。恒温静置12小时后，过滤收集固体，用甲醇与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得二水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，白色固体，产量880克，纯度99.67％，水分含量9.95％。
实施例8  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸1200克悬浮于30000毫升水中，加热至90℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入50克活性碳，加热90℃下回流10分钟，趁热过滤。静置降温至75℃，向体系内加入5000毫升甲醇。将混和液置于干燥器中密闭存放静置，数小时后有大量白色粉未状固体析出。12小时后，过滤收集固体，用甲醇与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，白色固体，产量1080克，纯度99.86％，水分含量14.21％。
实施例9  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸0.5水合物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸100克悬浮于1000毫升甲醇中，加热至70℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入5克活性碳，加热70℃下回流10分钟，趁热过滤。向滤液内加入1000毫升水。在冰浴的条件下边搅拌边迅速降温，有大量白色粉未状固体析出。待体系温度降至-4℃时，将混和体系移至冰箱中冷藏，12小时后，过滤收集固体，用甲醇与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸倍半水合(0.5水合)物，白色固体，产量84克，纯度99.71％，水分含量2.73％。
实施例10  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸一倍半水合(1.5水合)物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸100克悬浮于1000毫升丙酮中，加热至70℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入5克活性碳，加热70℃下回流10分钟，趁热过滤。向滤液内加入1200毫升水。控制温度在五小时内由75℃降至4℃，有大量白色粉未状固体析出。待体系温度降至-4℃时，将混和体系移至冰箱中冷藏，12小时后，过滤收集固体，用丙酮与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得一倍半水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，白色固体，产量80克，纯度99.61％，水分含量7.64％。
实施例11  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸六水合物
将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸100克悬浮于1300毫升水中，加热至100℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入5克活性碳，加热100℃下回流10分钟，趁热过滤。控制温度在一小时内由75℃降至5℃，有大量白色粉未状固体析出。待体系温度降至-4℃时，将混和体系移至冰箱中冷藏，12小时后，过滤收集固体，用甲醇与水的混和液洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得六水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，白色固体，产量78克，纯度99.59％，水分含量24.92％。
实施例12  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物溶解度测定
按《中华人民共和国药典》2005年版二部凡例五(2)，称取研成细粉的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物适量，置于25±2℃不同容量的溶剂中，每隔5分钟强力振摇30秒，观察30分钟内的溶解情况，以看不到(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物粉粒为完全溶解。结果见下表。
(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊
         基-1-羧酸及其水合物溶解度测定结果
Figure G071E3607520070817D000231
实施例13  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物吸湿性的测定
按中国药典2005版附录XIX C中指定的《药物稳定性试验指导原则》中指定的高湿影响因素考察方法，将(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物开口置恒湿密闭容器中，在25℃分别于相对湿度90％±5％条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目要求检测，同时准确称量试验前后(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸及其水合物的重量，以考察供试品的吸湿潮解性能。若吸湿增重5％以上，则在相对湿度75％±5％条件下，同法进行试验；若吸湿增重5％以下，且其他考察项目符合要求，则不再进行此项试验。恒湿条件可通过在密闭容器如干燥器下部放置饱和盐溶液实现，根据不同相对湿度的要求，选择NaCl饱和溶液(15.5～60℃，相对湿度75％±1％)或KNO3饱和溶液(25℃，相对湿度92.5％)。结果见表。
(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊
               基-1-羧酸及其水合物吸湿性测定结果
Figure G071E3607520070817D000241
实施例14  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物稳定性的考察
按中国药典2005版附录XIX C中指定的《药物稳定性试验指导原则》中指定的加速试验方法，取(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物3各批，按市售包装，在温度40℃±2℃、相对湿度75％±5％的条件下放置6个月。所用设备应能控制温度±2℃，相对湿度±5％，并能对真实温度与湿度进行监测。在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末取样一次，按稳定性重点考察项目检测。在上述条件下，如6个月内供试品经检测不符合制订的质量标准，则应在中间条件下即在温度30℃±2℃，相对湿度60％±5％的情况下(可用NaNO2饱和溶液，25～4O℃相对湿度64％～61.5％)进行加速试验，时间仍为6个月。
(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊
                基-1-羧酸水合物稳定性的考察结果
Figure G071E3607520070817D000251
实施例15  规格为100毫克的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物注射液的制备
  成分   重量(克)
  三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸 116.4
  注射用水   4868.6
  活性碳   5
  稀盐酸(0.1M)   10
  总量   5000
将116.4克三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸在80摄氏度下溶于4000毫升注射用水中，充分溶解。趁热加入5克活性碳，80摄氏度下吸附20分钟。过滤，补加注射用水至总体积5000毫升，待滤液冷却至室温，加入10毫升0.1M的稀盐酸调节PH值至3至5之间，用0.2μm的滤膜过滤。滤液按5毫升每瓶灌装安瓿，灌装完毕封口，于115摄氏度下灭菌2O分钟。共计1000支。
实施例16  规格为50毫克的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物注射液的制备
  成分   重量(克)
  三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸 58.2
  注射用水   4926.8
  活性碳   5
  稀盐酸(0.1M)   10
  总量   5000
将58.2克三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸在80摄氏度下溶于4000毫升注射用水中，充分溶解。趁热加入5克活性碳，80摄氏度下吸附20分钟。过滤，补加注射用水至总体积5000毫升，待滤液冷却至室温，加入10毫升0.1M的稀盐酸调节PH值至3至5之间，用0.2μm的滤膜过滤。滤液按5毫升每瓶灌装安瓿，灌装完毕封口，于115摄氏度下灭菌20分钟。共计1000支。
实施例17  规格为300毫克的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物注射液的制备
  成分   重量(克)
  三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸 34.9
  注射用水   9850.1
  氯化钠   90
  活性碳   10
  亚硫酸氢钠   10
  依地酸钙钠   5
  总量   10000
将90克氯化钠，10克亚硫酸氢钠，5克依地酸钙钠在80摄氏度下溶于8000毫升注射用水中，充分溶解。再加入34.9克三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸充分溶解。趁热加入10克活性碳，80摄氏度下吸附20分钟。过滤，补加注射用水至总体积10000毫升，待滤液冷却至室温，用0.2μm的滤膜过滤。滤液按100毫升每瓶灌装安瓿，灌装完毕封口，于115摄氏度下灭菌20分钟。共计100支。
实施例18  规格为300毫克的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物注射液的制备
  成分   重量(克)
  三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸 349
  注射用水   98366
  氯化钠   900
  活性碳   100
  稀盐酸(1M)   285
  总量   100000
将900克氯化钠在80摄氏度下溶于80000毫升注射用水中，充分溶解。再加入349克三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸充分溶解。趁热加入100克活性碳，80摄氏度下吸附20分钟。过滤去除活性碳，加入285毫升1M稀盐酸调节PH值至4至6之间，补加注射用水至总体积100000毫升，待滤液冷却至室温，用0.2μm的滤膜过滤。滤液按100毫升每瓶灌装安瓿，灌装完毕封口，于115摄氏度下灭菌20分钟。共计1000支。
实施例19  规格为500毫克的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物注射液的制备
  成分   重量(克)
  三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸 582
  注射用水   98133
  氯化钠   900
  活性碳   100
  稀盐酸(1M)   285
  总量   100000
将900克氯化钠在80摄氏度下溶于80000毫升注射用水中，充分溶解。再加入582克三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸充分溶解。趁热加入100克活性碳，80摄氏度下吸附20分钟。过滤去除活性碳，加入285毫升1M稀盐酸调节PH值至4至6之间，补加注射用水至总体积100000毫升，待滤液冷却至室温，用0.2μm的滤膜过滤。滤液按100毫升每瓶灌装安瓿，灌装完毕封口，于115摄氏度下灭菌20分钟。共计1000支。
实施例20  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物粉针制剂的制备
处方1
Figure G071E3607520070817D000281
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸23.3g，氯化钠9g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀盐酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的20ml的西林瓶中，每瓶5ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
处方2
处方和制备方法同处方1，干燥方法为将配制好的溶液放置在大盘内无菌干燥，粉碎，按照规定重量分装于西林瓶中，轧盖封口，包装即得。
处方3
Figure G071E3607520070817D000291
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸23.3g，甘露醇33.6g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀盐酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的20ml的西林瓶中，每瓶5ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
处方4
处方和制备方法同处方3，干燥方法为将配制好的溶液放置在大盘内无菌干燥，粉碎，按照规定重量分装于西林瓶中，轧盖封口，包装即得。
处方5
Figure G071E3607520070817D000301
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸23.3g，氯化钠9g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀乙酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的20ml的西林瓶中，每瓶5ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
处方6
处方和制备方法同处方5，干燥方法为将配制好的溶液放置在大盘内无菌干燥，粉碎，按照规定重量分装于西林瓶中，轧盖封口，包装即得。
处方7
Figure G071E3607520070817D000302
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸23.3g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀盐酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的20ml的西林瓶中，每瓶5ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
处方8
处方和制备方法同处方7，干燥方法为将配制好的溶液放置在大盘内无菌干燥，粉碎，按照规定重量分装于西林瓶中，轧盖封口，包装即得。
处方9
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸34.95g，氯化钠9g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀盐酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的20ml的西林瓶中，每瓶5ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
处方10
处方和制备方法同处方9，干燥方法为将配制好的溶液放置在大盘内无菌干燥，粉碎，按照规定重量分装于西林瓶中，轧盖封口，包装即得。
处方11
Figure G071E3607520070817D000321
在洁净室称取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸34.95g，氯化钠9g置于已经灭菌得容器中，加灭菌注射用水500ml，用0.1N稀盐酸溶液调节pH3.5～5，然后加灭菌注射用水定容至1000ml，加入活性炭1g，过滤，滤液再用装有0.22μm微孔滤膜灭菌器过滤后，罐装于已经灭菌的50ml的西林瓶中，每瓶10ml。在-30℃～-40℃预冻2～3h，-36℃～-20℃9h升华干燥，30℃再干燥10～24h，加盖、轧口，包装制得粉针剂。
实施例20  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物在水中溶解特征的考察
按100ml:300mg的规格预试，原料为三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸，溶解条件设计为：
①注射用水(室温)
②注射用水(80℃)
③注射用水(室温，用盐酸调节为酸性)
④注射用水(用磷酸氢二钠溶液调节为碱性)
结果：
在条件①下化合物溶解缓慢，注射用水加至全量，搅拌或超声较长时间；在条件②下，化合物溶解迅速，较少体积的注射用水即可溶解，考虑规模化生产过程中，注射用水温度一般在80℃循环，为便于生产，此条件为优选条件。在条件③下比较容易溶解，相对于条件④，本品更易在酸性条件下溶解，可作为调节pH的依据。
实施例21  不同酸性条件对(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物稳定性的影响
取三水合(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸349mg及900mg氯化钠，根据溶解特性预试，用注射用水80℃溶解，用盐酸调节不同pH值，制成溶液后于115℃下热压灭菌30min。取样观测体系PH值的变化及有关物质含量的变化。结果如下：
                 pHm确定表
Figure G071E3607520070817D000331
注：括号里的为有关物质，归一化法计算。括号外为含量
结果：当pH超过6.5时，灭菌后pH下降，幅度随pH的增大也相应增大，说明在高pH值时高温会改变体系pH值。在含量变化方面，当pH超过7.0时，灭菌后含量下降明显，60℃10天含量继续下降；pH4.5时，60℃10天后含量也有下降趋势。说明在pH值过高或过低对体系的稳定性均有不利影响。在有关物质分析方面：有关物质采用归一化法，各变化未见明显变化，但从杂峰的个数分析，pH偏碱性是有关物质的个数有增加趋势。因此，本品在酸性条件下趋于稳定。最佳的pH范围在4.5～6.5之间。
实施例22  活性碳吸附灭菌的条件研究
分别设计0.05％和0.1％、0.2％的活性炭用量，考察吸附前后含量的变化，结果随活性炭用量的增加吸附量也增加，0.1％大约吸附2％左右，为保证产品质量，选用0.1％的活性炭。灭菌分别进行了115℃30min和121℃20min两种常规的灭菌条件，结果表明，121℃20min含量有所下降，选用常规灭菌方法115℃30min，即可使F0＞8。
实施例23  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物非肠道给药组合物处方的优化研究
按如下基本处方：
三水合物         349mg
氯化钠           0.9g
注射用水         100ml
用稀盐酸调节pH值，将pH＝5.0的标记为SY1、pH＝6.0的标记为SY2、pH＝6.5标记为SY3；制备样品后，考察高温、光照试验及40℃加速试验。
按如下基本处方：
三水合物         116.4mg
注射用水         5ml
并用如下方法制备三种处方：用盐酸调节pH值至5.04，标记为XZ1；加0.05％硫脲，用氨水调节pH值6.98，标记为XZ2；：溶解后，不加任何辅料和pH调节剂，标记为XZ3。制备样品后，考察高温、光照试验及40℃加速试验。
研究结果如下表所示：
Figure G071E3607520070817D000351
实施例24  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物对甲型流感病毒神经氨酸酶抑制作用的测定
以4-MUNANA为底物，荧光法测定流感病毒神经氨酸酶的活性及受试化合物对神经氨酸酶的抑制活性。在MDCK细胞培养一代的病毒储备液，用神经氨酸酶测定缓冲液(NA assay buffer：32.5MES，4mM CaCl2，PH6.5)对倍稀释，50μl病毒稀释液和等体积4-MUNANA(200mM in NA assaybuffer)混合于黑色96孔板(Costar)，37℃温育1小时，加2倍体积的终止液(25％乙醇，0.1M甘氨酸，pH10.7)终止反应。测定λExcitation：360nM和λEmission：460nM处的荧光密度(PolarSTAROptima，BMG Labtech，德国)。以荧光单位净值对病毒浓度做散点图，选取两个活性位于散点图线性部分中部的病毒浓度用于化合物抑制活性测定。用无菌去离子水配制0.01、0.1、1、10、100pMol浓度的(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物，各取25μl与等量与2×NA assay buffer稀释的病毒(两倍于在活性测定中选取的浓度)混合，室温作用30分钟，加50μl 4-MUNANA(200mM in NA assay buffer)，37℃温育1小时，如前测定荧光密度。每个药物浓度设2个复孔，空白对照设4个复孔，其中只含4-MUNANA和终止液，病毒对照设4个复孔，其中待测化合物浓度为0。按公式：
IR(％)＝[1-(FU-FUB)÷(FUC-FUB)]×100
FU：测试孔荧光单位均值；
FUB：空白对照荧光单位均值；
FUC：病毒对照荧光单位均值。
计算抑制率IR(％)。以IR(％)对化合物浓度做散点图，对数回归分析计算IC50，由不同病毒浓度试验结果得到的回归曲线应较好的重叠，IC50值接近。结果如下所示：
     对甲型流感病毒(H3N2)神经氨酸酶的抑制活性
Figure G071E3607520070817D000371
*NA 1/40，NA 1/80指实验所用的两个病毒浓度
实施例25  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物对乙型流感病毒神经氨酸酶抑制作用的测定
按实施例24的方法对(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸三水合物对乙型流感病毒神经氨酸酶抑制作用进行了测定，选用乙型流感病毒(B/京防/76/98)神经氨酸酶替代原方法中的甲型流感病毒神经氨酸酶，结果如下：
    对乙型流感病毒(B/京防/76/98)神经氨酸酶的抑制活性
Figure G071E3607520070817D000372
*NA 1/20，NA 1/40指实验所用的两个病毒浓度
实施例26  (1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物抗流感活性试验
制备溶液，使其在50μl磷酸盐缓冲液(含有0.42％牛血清清蛋白)含有500pfu(蚀斑形成单位)小鼠顺应的流感病毒FM1(H1N1)株，然后通过小鼠鼻内滴入使小鼠(BALB/C，雌性，5-6周龄，体重20克)感染。病毒感染量为23.7LD50，将本发明的化合物悬浮于生理盐水中，按2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的剂量，在病毒感染后1小时和感染后2、3、4、5天共腹腔注射5次向动物给药。实验组用10只动物进行。结果用感染后14天生存小鼠数目与受试小鼠数目之比表示。同时用无水(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸作为对照化合物。

Claims (1)

1.式I(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸水合物：
Figure FSB00000620790100011
其中X为2.0或3.0
的制备方法，其特征是将粗品1000克(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸悬浮于30000毫升水中，加热至90℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入50克活性碳，加热90℃下回流10分钟，趁热过滤，静置降温至75℃，向体系内加入6000毫升甲醇；将混和液置于干燥器中密闭，放置于温控反应槽内，控制温度在六小时内由75℃至-10℃，有大量的白色粉末状固体析出，恒温静置12小时后，过滤收集固体，用甲醇和水的混合物洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得式I化合物的二水合物；或将粗品(1S，2S，3S，4R)-3-[(1S)-1-乙酰氨-2-乙基-丁基]-4-胍基-2-羟基-环戊基-1-羧酸1200克悬浮于30000毫升水中，加热至90℃溶解，稍静置片刻，向体系内加入50克活性碳，加热90℃下回流10分钟，趁热过滤，静置降温至75℃，向体系内加入5000毫升甲醇；将混和液置于干燥器中密闭存放静置，数小时后有大量的白色粉末状固体析出，12小时后，过滤收集固体，用甲醇和水的混合物洗涤滤饼，所得固体自然干燥，得式I的化合物的三水合物。
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