KR101422744B1 - （１ｓ，２ｓ，３ｓ，４ｒ）－３－［（１ｓ）－１－아세틸아미노－２－에틸－부틸］－４－구아니디노－２－하이드록시－사이클로펜틸―１－카복실산 하이드레이트 및 이의 약제학적 용도 - Google Patents

（１ｓ，２ｓ，３ｓ，４ｒ）－３－［（１ｓ）－１－아세틸아미노－２－에틸－부틸］－４－구아니디노－２－하이드록시－사이클로펜틸―１－카복실산 하이드레이트 및 이의 약제학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 화합물, 이의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법, 및 항-인플루엔자에 대한 뉴라미디나아제 저해제로서 상기 화합물의 임상적 용도에 관한 것이다.

Description

（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）－３－［（１Ｓ）－１－아세틸아미노－２－에틸－부틸］－４－구아니디노－２－하이드록시－사이클로펜틸―１－카복실산 하이드레이트 및 이의 약제학적 용도{(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-ACETYLAMINO-2-ETHYL-BUTYL]-4-GUANIDINO-2-HYDROXY-CYCLOPENTYL-1-CARBOXYLIC ACID HYDRATES AND PHARMACEUTICAL USES THEREOF}
본 발명은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 화합물, 이의 제조 방법, 상기 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 항-인플루엔자에 대한 이들의 용도에 관한 것이다.
갑자기 발생하는 새로운 형태의 바이러스 감염 질환은 자가-진화 또는 자가-변이로 인해 감염성 및 해로운 질환의 형태이다. 이의 병원체는 완전히 새로운 생물 구조를 가지고 있어, 일반적으로 그의 발생에서 예방 및 치료가 어려우므로, 매우 심각한 위험을 초래한다. 인플루엔자 바이러스는 인체에 대한 높은 변이성 및 민감성 때문에 갑자기 발생하는 새로운 형태의 바이러스 감염 질환의 중요한 원천이 되고 있다. 일정한 간격으로, 새로운 형태의 인플루엔자가 인류에서 세계적인 유행병이 될 것이다. 최근 100년간, 적어도 4회의 인플루엔자 발생이 있었고, 이들 중 1918년의 인플루엔자 유행병으로 전 세계적으로 거의 2천만명의 사람이 사망하였다. 현재, H5N1 형 고병원성 조류 인플루엔자가 가금류에서 만연하고, 이 인플루엔자는 그 자체의 불연속적인 변이에 따라 필연적으로 인류에서 영향을 미칠수 있는 인플루엔자의 새로운 형태가 될 것이다. 인플루엔자의 발생의 위협이 다가올수록, 새로운 형태의 인플루엔자로 인해 갑자기 발생하는 새로운 형태의 바이러스 감염성 질환의 유행병을 다루기 위한 고효율의 약물을 시간에 맞춰 개발하는 것은 매우 중요한 의미가 있다.
뉴라미니다아제 (NA)는 감염된 세포로부터 새롭게 형성되는 인플루엔자 바이러스 입자의 분리 및 확산을 촉진하는 주요 단백질이다. 인플루엔자 바이러스의 표면 상에서 가장 쉽게 변이될 수 있는 3개의 단백질(헤마글루티닌, HA, 뉴라미니다아제, NA 및 비구조 단백질 NS1) 중, NA가 비교적 안정하고, 특히, 활성 부위를 구성하고 있는 이의 아미노산 서열은 모든 인플루엔자 A 및 B 바이러스에서 매우 보존적이다. 그러므로, NA 저해제의 개발은 알려지지 않은 인플루엔자 바이러스를 처리하기 위한 최상의 선택이다. 인플루엔자의 새로운 형태의 예방 및 치료를 위한 약물에 관한 한, 오셀타미비르 (oseltamivir) 및 자나미비르 (zanamivir)로 대표되는 NA 저해제가 유효한 효능 약물로서 간주된다. 그러나, 두개의 약물은 모두 어느 정도 한계가 있다. 이들 둘은 모두 경구 제제이고, 고위험 환자를 치료하는데 적합하지 않으며, 또한 민감성 집단 예컨대, 노인 및 어린이가 섭취하기에 불편하여, 예방 및 치료에서 이들의 효과는 매우 제한적이다. 다른 심각한 바이러스 감염성 질환에 있어서, 이들을 예방하고 치료하는데 효과적인 약물은 없으며 이들을 치료하기 위한 비용은 높다. 또한 단일 형태의 약물의 광범위한 사용은 약물-내성 바이러스 균주의 발생을 유도하여, 약물 예방 및 치료 시스템이 그의 방어 능력을 잃게 될 것이다. 그러므로, 새로운 치료 경로로 우수한 치료 효과와 낮은 독성 부작용을 갖는 약물을 개발하기 위한 지속적인 연구가 요망된다.
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 [RWJ270201, BCX1812, JNJ2, 페라미비르 (peramivir)]은 오셀타미비르 및 자나미비르와는 전혀 다른 사이클로펜탄 화합물의 형태이고, 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 NA를 선택적으로 저해할 수 있다. 시험관내 활성 연구는 RWJ270201가 7개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 (IC50=0.1-1.4nM)의 NA의 시험관내 활성 및 4개의 인플루엔자 B 바이러스 균주 (IC50=0.6-11nM) (Bania S., Parker C.D., Ananth S.L., et al, Comparison of the Anti-influenza Virus Activity of RWJ270201 against Clinical Isolates of Influenza Virus and Neuraminidase Inhibitor-Resistant Variants, Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(12), 3403-3408)의 NA의 활성을 선택적으로 저해할 수 있는 것으로 나타났다. RWJ270201의 활성은 오셀타미비르 및 자나미비르의 활성과 동일하거나 더 높았다. 생체내 활성 연구는 RWJ270201가 0.1 mg/kg/일의 그룹에서 70%에 이르는 생존률 및 10 mg/kg/일의 그룹에서는 100%에 이르는 생존률을 나타내어 인플루엔자 바이러스 균주 A/홍콩/156/97 (H5N1)로 감염된 마우스의 사망률을 현저하게 감소시켰고, 폐조직에서의 바이러스 역가를 현저하게 감소시켰으며, 뇌조직에 대한 바이러스 확산을 예방(Govorkova E.A., Leneva I.A., Goloubeva O.G., et al., Comparison of Efficiencies of RWJ270201, Zanamivir, and Oseltamivir against H5N1, H9N2, and Other Avian Influenza Viruses, Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45(10), 2723-2732)하는 것으로 나타났다. RWJ270201는 또한 6일째에 폐 경화 및 폐조직에서의 바이러스 역가를 저해하고, 오셀타미비르보다 장기간 작용할 수 있다. 이 화합물은 또한 동맥 산소 포화의 감소를 예방할 수 있다. RWJ270201 (1 mg/kg/일)은 또한 오셀타미비르보다 효과적이다. 또한, 10 mg/kg/일의 용량으로 RWJ270201은 치명적인 인플루엔자 바이러스 균주 A /Bayern/07/95 (H1N1)의 감염에 효과적으로 대항할 수 있고, 인플루엔자 바이러스 균주 A/NWS/33 (H1N1) (Bantia S., Amold C.S., Parker C.D., Anti-influenza Virus Activity of Peramivir in Mice with Single Intramuscular Injection, Antiviral Research, 2006, 69(1), 39-45)로 감염된 실험실 동물의 사망률을 감소시킬 수 있다. RWJ270201은 낮은 독성을 가졌고, 328 μg/ml의 높은 용량에서 세포에 비독성이었으며; RWJ270201을 5일 동안 1000 mg/kg/일의 용량으로 투여했을 경우, 독성 부작용이 발견되지 않았다. 마우스 및 랫트에 투여된 용량이 3000 mg/kg/일 이하일 경우 급성 독성 반응이 관찰되지 않았다(Sidwell R.W., Smee D.F., Huffman J.H., et al., In the fluenza of Virus Strain, Challenge Dose, and Time of Therapy Initiation on the in vivo Influenza Inhibitory Effect of RWJ270201, Antiviral Res., 2001, 51(3), 179-187). RWJ270201은 새로운 형태의 저독성 고효율 NA 저해제이다.
그러나 연구에서 나타난 바, RWJ270201은 쉽게 습기를 흡수하고, 수분을 흡수한 뒤 물을 완전하게 제거하는 것이 어려워, 산업에서 RWJ270201의 무수물 형태를 얻는 것은 어려우며, 이의 질을 효과적으로 제어하는 것이 어렵다. RWJ270201은 수용액에서 불안정하고, 환경 요소의 영향 하에 자가-분해되기 쉬우며, 중증 환자를 치료하기 위한 주사용으로 직접 제조하는 것이 어렵다.
본 발명의 목적은 쉽게 수분을 흡수하지 않고 질의 제어가 가능한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 유도체의 탐색 및 이의 제조 방법과 동시에 중증 환자를 치료하기 위해 상응하는 주입용을 개발하는 것이다.
발명의 요약
본 발명자들은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)이 RWJ270201 및 다른 유도체에 비해 우수한 안정성을 보이고, 쉽게 습기를 흡수하지 않고, 질적으로 쉽게 조절가능하며, 대량 산업적 생산에 적절하다는 것을 연구하여 밝혀냈다.
약력학 연구의 결과는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)가 생체내 및 시험관내에서 많은 형태의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 RWJ270201과 동일한 활성을 나타내는 것을 증명하였다. 약물 대사의 결과로 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)가 RWJ270201과 동일한 대사 경로 및 약동학 성질을 나타내는 것으로 증명되었다. 독물학 연구의 결과는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)가 다양한 독성 계수에서 RWJ270201과 동일한 효과를 나타내는 것을 증명하였다. 따라서, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)는 RWJ270201과 효능이 동등하다.
본 발명자들은 또한 수용액 중 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)의 안정성이 용액의 pH값을 조정함으로써 조절될 수 있고, 매우 우수한 안정성이 절적한 pH값에서 얻어질 수 있어, 중증 환자를 치료하기에 적절한 주사로 개발될 수 있음을 연구로 밝혔다.
그러므로, 한편으로, 본 발명은 일반식 (I)의 화합물 및 이의 제조 방법을 제공한다.
다른 한편으로, 본 발명은 본 발명의 화합물을 포함하는 약제학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적어도 하나의 일반식 (I)의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 인플루엔자 바이러스로 인한 질환, 위험 인자 또는 증후군을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공하고, 이는 대상에 본 발명의 화합물의 치료적 또는 예방적 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 하기 일반식 (I)로 나타내어지는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 제공한다:
Figure 112012079230491-pat00001
(I)
상기 식에서,
X는 2.0 또는 3.0이다.
본 발명의 화합물은 인플루엔자 바이러스의 NA 활성을 저해할 수 있다.
바람직한 일 구체예에 따라, 본 발명의 바람직한 화합물은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트이다.
본 발명에 따른 용어 "인플루엔자 바이러스"는 한정하는 것은 아니나, 인간 인플루엔자 바이러스 및 다양한 동물 유래의 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 조류 인플루엔자 바이러스를 포함한다.
당업자들은 본 발명의 화합물이 이의 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 일반식 (I)의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 무기산 또는 유기산 또는 무기 염기 또는 유기 염기로 형성된 통상적인 염 및 4차 암모늄의 산부가염을 포함한다. 산으로 형성된 적절한 염의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 하이드록시아세트산, 포름산, 젖산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 파모인산, 말론산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 톨루엔술폰산, 메탄술폰산, 나프탈렌-2-술폰산, 벤젠술폰산, 하이드록실 나프탈렌포름산, 요오드화수소산, 말산, 스테아린산 및 타닌산 등으로 형성된 염을 포함한다. 다른 산, 예컨대, 옥살산과 같이 산 자체는 약제학적으로 허용되지 않지만, 염을 제조하는데 중간체로서 사용할 수 있어, 본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 얻을 수 있다. 염기로 형성되는 적절한 염의 예는 나트륨, 리튬, 칼륨, 마그네슘, 알루미늄, 칼슘, 아연, N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루코사민 및 프로카인으로 형성된 염을 포함한다. 하기 언급된 바와 같이 본 발명의 화합물은 일반식 (I)의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 프로드럭을 포함하고, 이는 투여되면, 대사 과정을 통하여 화학 변환을 통해 활성 약물로 변환된다. 일반적으로 이러한 약물의 종류는 본 발명의 화합물의 기능적 유도체이고, 생체내에서 원하는 일반식 (I)의 화합물로 쉽게 변환된다. 예를 들어, 적절한 프로드럭 유도체를 선별하고 제조하는 통상의 방법은 문헌["Design Of Prodrugs", H Bund Saard, Elsevier, 1985]에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 활성 대사체를 포함한다.
다른 한편으로, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이고, 이는 생체내 치료에 사용될 수 있으며, 생체적합성을 갖는다. 약제학적 조성물은 상이한 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 유효량의 일반식 (I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 및 하나 이상의 적절한 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제는 한정하는 것은 아니나, 이온 교환체, 알루미늄 옥사이드, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 알부민과 같은 혈청 단백질, 버퍼 물질, 예컨대, 포스페이트, 글리세린, 소르빈산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분 글리세리드의 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 프로타민 설페이트, 디소듐 하이드로겐 포스페이트, 칼륨 하이드로겐 포스페이트, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐카복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 밀랍, 라놀린을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 분무 흡입, 직장, 코, 입, 국부, 비경구, 예컨대, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 수강내, 뇌실내, 흉골내 또는 뇌수 주사 또는 주입, 또는 이식된 저장소의 도움에 의한 투여 중 임의의 경로로 투여될 수 있고, 여기에서 비경구 경로에 의한 투여 경로, 예컨대, 정맥내 주사가 바람직하다.
경구 투여를 위하여, 본 발명의 화합물은, 한정하는 것은 아니나, 정제, 캡슐, 수용액제 또는 수성 현탁제를 포함하는 임의의 경구적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다. 여기에서 정제에 사용되는 담체는 일반적으로 락토오스 및 콘 스타치를 포함하고, 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제가 첨가될 수 있다. 캡슐 제제에 사용되는 희석제는 일반적으로 락토오스 및 건조된 콘 스타치를 포함한다. 수성 현탁 제제는 일반적으로 활성 성분을 적절한 유화제 및 현탁화제와 혼합시킴으로써 사용된다. 경우에 따라, 감미제, 향미제 또는 착색제가 첨가될 수 있다.
국부 적용, 특히, 국부적 외부 적용에 의해 도달하기 쉬운, 얼굴 또는 기관에 영향을 주는 치료, 예를 들어 눈, 피부를 위하여, 본 발명의 화합물은 상이하게 영향을 받는 얼굴 또는 기관에 따라 국부 적용을 위하여 상이한 제형으로 제조될 수 있다.
눈에 대한 국부 적용을 위하여, 본 발명의 화합물은 미세화 현탁제 또는 용액제의 제형으로 제조될 수 있고, 여기에서 사용되는 담체는 특정 pH값을 갖는 등장성 멸균 브라인이며, 여기에서 염소화된 벤질 알콕사이드와 같은 방부제가 첨가되거나 첨가되지 않을 수 있다. 눈의 사용을 위하여, 화합물은 바셀린 페이스트와 같은 페이스트의 제형으로 제조될 수도 있다.
피부에 대한 국부 적용을 위하여, 본 발명의 화합물은 연고, 로션 또는 크림의 적절한 형태로 제조될 수 있고, 여기에서 활성 성분은 하나 이상의 담체(들) 중에 현탁되거나 용해된다. 연고를 위하여 사용되는 담체는, 한정하는 것은 아니나, 광유, 액체 바셀린, 백색 바셀린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드, 유화된 왁스 및 물을 포함하고; 로션 및 크림을 위한 담체는, 한정하는 것은 아니나, 광유, 소르비탄 모노스테아릭 에스테르, 트윈 60, 세틸 에스테르 왁스, 헥사데실렌 방향성 알코올, 2-옥틸 도데칸올, 벤자놀 및 물을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한, 한정하는 것은 아니나, 멸균 주사 수성 또는 오일 현탁제 또는 멸균 주사 용액제 또는 멸균 분말 주사, 예컨대, 동결건조 분말 주사를 포함하는 멸균 주사 제제의 형태로 투여될 수 있다. 여기에서, 사용가능한 담체 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액을 포함한다. 또한, 멸균 비휘발성 오일, 예컨대, 모노글리세리드 또는 디글리세리드도 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 또한, 제제는 pH 조절제, 0.9% 염화나트륨 수용액, 버퍼, 산화방지제, 금속 이온 착화제 또는 이의 임의의 배합물을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 투여 용량 및 방식은 다양한 인자, 예컨대, 체중, 성별, 자연 건강 상태 및 환자의 영양 상태, 화합물의 활성, 투여 시간, 대사율, 질환의 중증도 및 진단/치료에 대한 의사의 주관적 판단에 좌우된다. 투여 용량은 바람직하게 1일 체중 1kg 당 0.01 내지 100 mg의 범위이고, 가장 바람직하게는 1일 체중 1kg 당 1 내지 40 mg의 범위이다.
본 발명은 또한 일반식 (I)의 화합물의 제조 방법을 제공한다.
특허 출원 CN1282316A(2001), CN1367776A(2002)는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물의 제조 방법을 기술하고 있으나, 여기에 사용된 원료 및 결정은 너무 비싸고, 강독성 벤질 이소시아네이트가 사용되고 있어, 이 방법은 산업적 생산에 적절하지 않다.
Figure 112012079230491-pat00002
본 발명에서, Boc (4)으로 보호된 레보-2-아자바이사이클로[2.2.1]헵트-5-엔-3-온이 출발 물질이고, 중간체 (15)는 출발 물질 2-에틸-부틸알데히드 (13)으로부터 하이드록시화 및 염소화를 통해서 제조하였다. 그 후, RWJ270201을 하기 7-단계 반응으로 제조하였다: 중간체 (4) 및 중간체 (15)를 고리 닫힘 및 가수분해에 적용하여 테트라-부틸아민 염을 얻은 후, NaBH4/NiCl2로 환원, 아세틸 무수물로 아세틸화, 농축 염산으로 Boc의 제거, 나트륨 하이드록사이드로 가수분해 및 1,2,4-트리아졸 포름아미딘과의 반응에 적용하여 구아니딘 치환체를 얻었다. 이 합성 경로는 총 13-단계 반응을 포함한다. 원래의 합성 방법에 대해 상응하는 개선책으로 본 발명자들은 산업적 생산의 요구를 충족시키도록 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물의 개선된 제조 방법을 획득하였다.
Figure 112012079230491-pat00003
본 발명의 방법에서, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물은 적절한 온도, 전형적으로 20 내지 100℃, 바람직하게 80 내지 100℃의 범위 하에서 상이한 비율로 물 및 수혼합성 유기 용매(여기에서 유기 용매는, 한정하는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, n-부탄올, 아세톤, 부탄온 및 tert-부탄온 등을 포함하고, 물:유기 용매의 비는 100:1-500, 또는 순수한 물의 조건 하, 바람직하게는 20:1 내지 1:2의 범위임)로 구성된 용액에 용해된 후, 생성된 용액은 적절한 냉각률, 예를 들어, 0.1℃/분 내지 5℃/분에서 결정화에 적용되어 상이한 결정수를 포함하는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)를 수득하였다. 본 발명의 일반식 (I)의 화합물은 또한 상술한 조건 하에서 일반식 (I)의 화합물의 결정종 (crystal seed)을 첨가하여 수득할 수 있다.
Figure 112012079230491-pat00004
(I)
상기 식에서,
X는 2.0 또는 3.0이다.
바람직한 본 발명의 화합물은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 화합물의 용해도는 표준 용해도 검사 방법을 사용하여 검사될 수 있다. 예를 들어, 상온의 수용액 및 자연 버퍼 용액에서, 일반식 (I)의 화합물의 하나인 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트는 용해도
Figure 112012079230491-pat00005
0.17 g/ml을 갖고, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물은 용해도
Figure 112012079230491-pat00006
0.08 g/ml을 갖는다. 그러므로, 일반식 (I)의 화합물은 상응하는 비-하이드레이트와 비교하여 수용액 및 자연 생리 버퍼 용액에서 명백하게 증가된 용해도를 나타낸다.
본 발명의 화합물의 흡습성은 표준 흡습성 검사 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 화합물을 상온에서 92.5%, 80% 또는 75%의 상대적 습도로 밀봉 용기에 저장하고, 화합물의 수분 함량의 변화를 일정 간격으로 샘플링함으로써 검사한다. 10일의 관찰 검사에서, 일반식 (I)의 화합물 중의 하나인 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트는 중량이 약 2.24% 증가되었고, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물은 중량이 약 13.53% 증가되는 것을 발견하였다. 그러므로, 일반식 (I)의 화합물은 상응하는 비-하이드레이트에 비하여 높은 습도 조건 하에서 명백하게 감소된 흡습성을 나타내었다.
본 발명의 화합물의 안정성은 표준 안정성 검사 방법, 예컨대, 중국 부록 약전 (Chinese Pharmacopoeia) XIX C (2005년 판)에 포함된 약물 안정성 검사 지침 (Guidelines for Stability Testing of Drug Substances)에 기술된 방법으로 검사될 수 있다. 예를 들어, 일반식 (I)의 화합물의 안정성은 가속 안정성 검사 방법, 예를 들어, 0, 1, 2, 3, 6 개월에서 40℃, 75% 상대 습도; 40℃, 92.5% 상대 습도; 및 80℃ 조건 하에서 각각 검사하는 방법으로 검사될 수 있다. 기본 시약 및 관련 물질의 변화는 박막 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피로 분석할 수 있다. 1, 2, 3, 6개월의 안정성 검사에서, 일반식 (I)의 화합물의 하나인 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트는 안정한 기본 시약의 함량을 가졌고, 관련 물질의 함량에서는 주목할만한 증가가 없었으며, 우수한 안정성을 나타내었다.
본 발명에서 수득된 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트는 우수한 안정성을 나타내었고, 흡습이 용이하지 않으며, 대량 산업적 생산에 대해 적절하고 질적으로 쉽게 조절가능하다.
본 발명은 또한 일반식 (I)의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 인플루엔자를 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다.
여기에서 일반식 (I)의 화합물은 단독으로 또는 약제학적 조성물의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 비경구 또는 국부 투여 경로로 투여될 수 있다. 투여 용량 제형의 예는, 한정하는 것은 아니나, 정제, 캡슐, 용액제, 주사, 좌약, 패치 및 연고 등을 포함한다. 바람직한 제형은 비경구 투여 및 분말 주사 제제를 위한 약제학적 조성물이다.
일반식 (I)의 화합물이 긴급 구호 및 인플루엔자로 인한 중증 환자의 치료에 적합하도록 하기 위하여, 본 발명자들은 복합적인 이점을 갖는 분말 주사 제제 및 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물을 연구하여 개발하였다. 또한, 이들의 제조 방법은 간단하고, 작동이 용이하며, 비용이 싸다.
본 발명에서, 일반식 (I)의 화합물의 양 또는 약제학적 조성물 중의 일반식 (I)의 화합물의 양은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산으로 계산된다.
구체적으로, 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 용매 및 약 50% 내지 약 4000%w/v의 일반식 (I)의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하고, 여기에서 약제학적 조성물 중의 일반식 (I)의 화합물의 양은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산의 양으로 계산되며, w/v는 단위 제형 중의 일반식 (I)의 화합물의 중량:용매의 부피 비를 의미한다. 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트는 조성물에 대해 바람직하게 300% 내지 2000%w/v의 양으로 존재한다. 조성물은 또한 pH 조절제, 버퍼, 산화방지제, 금속 이온 착화제 또는 이의 임의의 배합물로부터 선택된 적어도 하나의 성분을 임의로 포함할 수 있다. 여기에서 pH 조절제는 무기산으로부터 선택되고, 조성물의 pH값을 약 3 내지 7로 조정하기에 충분한 양으로 존재한다. pH 조절제는 바람직하게 희석 염산이고, 바람직하게 조성물의 pH값을 약 4 내지 6으로 조정하기에 충분한 양으로 존재한다. 약제학적으로 허용되는 용매는 물, 0.9% 염화나트륨 수용액, PEG400, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 글리세린 및 이의 임의의 배합물로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 물이다. 용매로서 물을 포함하는 조성물에서, 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트는 조성물에 대해 바람직하게 300 mg/100 ml 내지 100 mg/5 ml의 양으로 존재한다.
분말 주사 제제는 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하거나, pH 조절제, 버퍼, 산화방지제, 금속 이온 착화제 또는 이의 임의의 배합물 중의 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 담체는, 한정하는 것은 아니나, 덱스트로-글루코사이드, 만니톨, 염화나트륨, 솔비톨 및 시트르산 등을 포함한다. 일반적으로 사용되는 pH 조절제는, 한정하는 것은 아니나, 염산, 인산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 하이드록시말레산, 글루탐산 및 살리실산 등을 포함하고, 바람직하게는 염산이다. 제제가 단위 용량으로 사용될 경우, 단위 용량 중 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트:약제학적으로 허용되는 담체의 중량비는 1:0 내지 1:100이고, pH 조절제는, 용액이 2.5 내지 6.5, 바람직하게 3.5 내지 5.5 범위의 pH가 되도록 하는데 충분한 양으로 사용된다.
상기 제제는 정맥내 또는 근육내 주사 또는 정맥내 드립 주입의 형태로 임상 적용을 위하여 바람직하게 사용된다.
다른 한편으로, 본 발명은 또한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하는 비경구 투여용 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하고, 이는 일반식 (I)의 화합물의 용해, 활성 탄소로 흡수 및 여과, 산성도 조정, 정밀 여과, 충진 및 고압 고온 멸균 등 또는 당업계에 공지된 방법에 따라 일반식 (I)의 화합물을 분말 주사제, 예컨대, 동결건조 분말 주사제로 제조하는 것을 포함한다.
본 발명의 일구체예에 따라, 비경구 투여용 약제학적 조성물은 ml 당 0.5 mg 내지 4 g의 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 및 pH 조절제, 0.9% 염화나트륨 수용액, 버퍼, 산화방지제, 금속 이온 착화제 또는 이의 임의의 배합물 중의 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
여기에서 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하는 비경구 투여용 약제학적 조성물은 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
(1) 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 물, 0.9% 염화나트륨 수용액, PEG400, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 글리세린 또는 이의 임의의 배합물로부터 선택된 약제학적으로 허용되는 용매 중에 상온에서 교반, 초음파 용해 또는 40 내지 100℃로 가열하여 용해시키는 단계;
(2) 40 내지 100℃에서 0.01% 내지 5%의 활성 탄소를 첨가하여 10 내지 30분 동안 흡수 처리를 수행하고, 여과하는 단계;
(3) pH 조절제를 용액의 pH값이 약 4 내지 6으로 조정되기에 충분한 양으로 첨가하는 단계;
(4) 정밀 여과 막으로 여과하고 단위 당 1 내지 150 ml의 부피로 충진하는 단계; 및
(5) 밀봉하고 10 내지 50분 동안 105 내지 125℃에서 멸균하는 단계.
본 발명의 다른 구체예에 따라, 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하는 비경구 투여용 약제학적 조성물은 하기를 포함한다:
(1) 300% 내지 2000% w/v의 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트;
(2) 물, PEG400, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 글리세린 또는 이의 임의의 배합물로부터 선택되는 약제학적으로 허용되는 용매, 바람직하게는 물; 및
(3) 바람직하게는 조성물의 pH값이 약 4 내지 6으로 조정되기에 충분한 양으로 존재하는, pH 조절제, 바람직하게는 희석 염산.
본 발명의 또다른 구체예에 따라, 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하는 비경구 투여용 약제학적 조성물은 하기를 포함한다:
(1) 300% 내지 2000% w/v의 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트;
(2) 물, 0.9% 염화나트륨 수용액, PEG400, 프로필렌 글리콜, 에탄올, 글리세린 또는 이의 임의의 배합물로부터 선택되는 약제학적으로 허용되는 용매, 바람직하게는 0.9% 염화나트륨 수용액; 및
(3) 바람직하게는 조성물의 pH값이 약 4 내지 6으로 조정되기에 충분한 양으로 존재하는, pH 조절제, 바람직하게는 희석 염산.
가장 바람직한 비경구 투여용 약제학적 조성물의 제제는 실시예에 나타내었다.
또다른 한편으로, 본 발명은 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 분말 주사 제제, 예를 들어, 활성 성분으로서 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 포함하는 분말 주사 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 이 분말 주사 제제는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 주사용수, 에탄올 및 에틸 에스테르로부터 선택된 적어도 하나의 용매 중에 용해시킨 다음 생성된 용액을 탈수 또는 용매 제거에 적용함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 구체예에 따라, 분말 주사 제제는 그램 당, 0.1 mg 내지 1 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 포함하거나, pH 조절제, 버퍼, 산화방지제, 금속 이온 착화제 또는 이의 임의의 배합물 중의 적어도 하나의 충진제를 추가로 포함한다.
여기에서 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 분말 주사 제제는 하기의 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다:
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 한정하는 것은 아니나, 주사용수, 에탄올 및 에틸 에테르를 포함하는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 용매로 용해시켜 1 내지 6 g/100 ml, 바람직하게는 2.3 내지 3.5 g/100 ml의 농도 범위를 갖는 용액을 얻는 단계;
용액을 유기산 또는 무기산으로 pH 2.5 내지 6.5, 바람직하게 pH 3.5 내지 5.5의 범위로 조정하는 단계(여기에서, 흔히 사용되는 무기산 및 유기산은 염산, 인산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 하이드록시말레산, 글루탐산 및 살리실산을 포함하고, 바람직하게는 염산이다);
용액을 약제학적으로 허용되는 활성 탄소로 탈색하는 단계;
0.22 μm 미소공성 여과막으로 여과하는 단계; 및
건조하여 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 멸균 분말 주사 제제를 얻는 단계(여기에서 건조는 진공 건조 방법, 동결건조 방법, 분무 건조 방법 또는 냉동 및 충진 방법으로 수행될 수 있다).
비경구 투여용 약제학적 조성물은 고온 내성, 저장성, 높은 안정성 및 수용액에서 자가-분해를 효과적으로 극복하는 능력을 갖는 것을 특징으로 한다. 분말 주사 제제는 개선된 제조 방법, 우수한 안정성, 장기간의 유효성, 이동의 편리함 및 저장 및 보존의 용이함을 특징으로 한다. 이들 생성물은 안성정 및 사용의 편리함, 믿을만한 질, 긴급 구호 및 중증 환자의 치료용으로 용이함을 포함하는 이점을 갖는다.
뉴라미니다아제에 대한 일반식 (I)의 화합물의 저해 활성은 Barnett JM 등 (Barnett JM, et al. Antimicrob Agents Chem., 2000; 41, 78-87)에 의해 제공된 방법에 따라 평가될 수 있다. 상기 방법은 하기와 같이 기술되어 있다:
기질로서 4-MUNANA를 사용하여, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제의 활성 및 뉴라미니다아제에 대한 후보 화합물의 저해 활성을 형광분석법 (fluorimetry)으로 검정하였다. 제 1 세대 바이러스의 스톡 용액을 MDCK 세포 중에 배양하고, 1:2의 비로 뉴라미니다아제 어세이 버퍼 (NA 어세이 버퍼: 32.5 MES, 4mM CaCl2, Ph 6.5)로 희석하였다. 생성된 50 μl의 바이러스 희석 용액을 블랙 96-웰 플레이트 (Costar)에 동일한 부피의 4-MUNANA (NA 어세이 버퍼 중 200mM)와 혼합하고, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 반응을 정지시키기 위하여, 2배의 정지 버퍼 (25% 에탄올, 0.1M 글리신, pH 10.7)를 첨가하였다. λ 여기: 360nM 및 λ 배기: 460nM에서 형광 밀도를 평가하였다(PolarSTAR Optima, BMG Labtech, Germany). 형광 단위:바이러스 농도 (일반적으로 적어도 2개의 상이한 바이러스 농도)의 순수값의 산포도를 플롯하고, 산포도의 직선 부분의 중앙의 활성 상태를 선택하고 화합물의 저해 활성을 검정하는데 사용하였다. 상이한 농도를 갖는 후보 화합물의 용액을 멸균 탈이온수를 사용하여 제조하였다. 25 μl의 용액 각각을 2×NA 어세이 버퍼로 희석시킨 동량의 바이러스 (활성 어세이에서 선택된 농도의 두배로)와 혼합한 후, 30분 동안 상온에서 활성화시킨 다음, 50 μl의 4-MUNANA (NA 어세이 버퍼 중 200mM)를 첨가한 후, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 마지막으로 상술한 바와 같이 형광 농도를 검정하였다. 각 농도의 후보 화합물을 두개의 평행 구멍에 제공하였고, 블랭크 대조군 (단지 4-MUNANA 및 정지 버퍼만을 포함함)은 4개의 평행 구멍에 제공하였으며, 바이러스 대조군 (제로 농도의 후보 화합물을 포함함)은 4개의 평행 구멍에 제공하였다. 저해률 IR (%)을 하기의 식으로 계산하였다:
IR (%) = [1 - (FU - FUB) ÷ (FUC - FUB)] x 100
FU: 후보 화합물 그룹에서 형광 단위의 평균값;
FUB: 블랭크 대조군 그룹에서 형광 단위의 평균값;
FUC: 바이러스 대조군 그룹에서 형광 단위의 평균값.
IR(%):화합물의 농도의 산포도를 플롯하고, IC50을 대수 회귀 분석으로 계산하였다. 상이한 바이러스 농도의 어세이 결과로부터 얻은 회귀 곡선은 유사한 IC50 값으로 바람직하게 오버랩될 것이다.
일반식 (I)의 화합물의 항-인플루엔자 바이러스 활성을 하기 방법에 따라 검정할 수 있다.
50 μl 인산 버퍼 (0.42% 우혈청 알부민 포함) 중 500 pfu (플라크 형성 단위) 마우스-순응 인플루엔자 바이러스 균주를 포함시켜 전형적으로 바이러스 드립을 제조한 다음, 마우스 (BALB/C, 암컷, 5 내지 6 주령, 20 g)의 비강으로 떨어뜨려 이들을 감염시킨다. 본 발명의 화합물을 생리 식염수 중에 현탁시켜 상이한 농도, 전형적으로 2.5 mg/kg 내지 40 mg/kg을, 감염 전 및 후의 상이한 시간에 마우스에, 전형적으로 5회, 즉 바이러스 감염 1 시간 및 2, 3, 4, 5일 후에 복강내 주사로 투여한다. 어세이는 8 또는 12, 전형적으로 10마리의 마우스를 사용하여 수행한다. 결과는 바이러스 감염 14일 후 생존 마우스의 수:어세이 마우스의 수의 비로 나타낸다. 한편, 무수물 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산을 대조 화합물로서 사용한다. 결과는 본 발명의 화합물과 대조 화합물이 다양한 종류의 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 동일하거나 유사한 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
본 발명의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 (I)는 수분을 쉽게 흡수하지 않고 질적으로 쉽게 조절가능하며, 대량 산업적 생산에 적절하다는 것을 연구하여 밝혀냈다.
본 발명의 수행 방식
실시예
실시예 1
2-에틸-N-하이드록시부티르이미도일 클로라이드 (중간체 15)의 합성
Figure 112012079230491-pat00007
1150 g의 하이드록실아민 하이드로클로라이드, 1000 g의 물 및 3500 g의 톨루엔을 혼합하여 1580 g의 2-에틸-부틸알데히드에 교반하면서 첨가하였다. 8-12℃에서, 나트륨 하이드록사이드의 용액 (ca. 30%, 4630 g)을 1 시간 내에 첨가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 추가로 60분 동안 교반하였다. 이어서 반응 혼합물을 정치시켜 층을 이루게 하고 화합물 14를 포함하는 상부 톨루엔층을 취해 즉시 다음 단계에 사용하였다. 4212 g의 N-클로로숙신이미드 (NCS)를 5000 ml의 디메틸포름아미드 중에 현탁시키고, 8℃로 냉각시켰다. 디메틸포름아미드 중의 NCS의 현탁액을, 반응 온도가 23℃를 초과하지 않도록 하면서 화합물 14를 포함하는 상기 톨루엔 용액에 2.5 시간 내에 적가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 추가로 1 시간 동안 교반하였다. 이어서, 10000 ml의 물을 첨가한 후, 30분 동안 교반하였다. 수성층을 버리고, 유기층을 10000 ml x 3의 물로 세정하였다. 화합물 15 (클로로-옥심)를 포함하는 톨루엔층을 분리하고, 즉시 다음 단계에 사용하였다.
실시예 2
tert-부틸 암모늄 (3aR,4R,6S,6aS)-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노]-3-(1'-에틸프로필)-3a,5,6,6a-테트라하이드로-4H-사이클로펜타[d]이속사졸-6-카복실레이트 (중간체 화합물 16)의 합성
Figure 112012079230491-pat00008
메틸 (1S,4R)-(-)-메틸-[[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노]사이클로펜트-2- 엔-1-카복실레이트 (4) (2533.2 g), 톨루엔 (6000 ml) 및 트리에틸아민 (4427 ml)을 혼합하고 50℃로 가열하였다. 톨루엔 (6000 ml) 중 2-에틸-N-하이드록시부티르이미도일 클로라이드 (화합물 15, 4690 g)의 용액을 생성된 용액에 2.5 시간 내에 적가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 약 8 시간 동안 62-66℃에서 추가로 교반하였다. 5000 ml의 물을 반응 용액에 첨가하여 고체를 용해시켰다. 톨루엔층을 분리하고, 5000 ml의 물로 세정한 다음, 농축시켜 약 반의 톨루엔을 제거하였다. 물 (4180 g) 중 나트륨 하이드록사이드 (640 g, 16.0 mol)의 용액을 (4180 g) 생성된 농축 용액에 첨가한 후, 7 시간 동안 상온에서 교반하였다. 톨루엔층을 제거하고, 수성층을 5000 ml x 2의 톨루엔으로 세정하였다. 8000 ml의 톨루엔을 수성상에 첨가하였다. 3710 ml의 물을 1747 ml의 염산에 첨가하고, 희석 염산을 상기 톨루엔층에 첨가하여 약 4의 pH로 중화시켰다. 이어서 톨루엔 (약 12000 ml)을 첨가하여 고체를 용해시키고, 톨루엔층을 분리하였다. 20 내지 40℃에서, tert-부틸아민 (894.0 g)을 톨루엔층에 적가하여, 백색 고체 생성물을 침전시킨 후, 3 시간 동안 95 내지 100℃로 가열하고, 20 내지 25℃로 냉각시켰다. 흡입 여과 후, 생성된 고체 생성물을 8000 ml x 2의 아세톤으로 세정하고, 6 시간 동안 60℃에서 건조시켰다. 마지막으로, 62.0%의 수득율로 2694 g의 고체 생성물을 얻었다.
실시예 3
메틸 (3aR,4R,6S,6aS)-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노]- 3-(1'-에틸프로필)-3a,5,6,6a-테트라하이드로-4H-사이클로펜타[d]이속사졸-6-카복실레이트 (5)의 합성
Figure 112012079230491-pat00009
1,1-디메틸에틸 암모늄 (3aR,4R,6S,6aS)-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노]-3-(1'-에틸프로필)-3a,5,6,6a-테트라하이드로-4H-사이클로펜타[d]이속사졸-6-카복실레이트 (16) (3210 g, 7.8 mol)를 아세톤 (4000 g) 중에 현탁시켰다. 칼륨 카보네이트 (53.8 g) 및 312 g의 나트륨 하이드록사이드를 포함하는 30% 나트륨 하이드록사이드의 수용액을 생성된 현탁액에 첨가하였다. 3000 ml의 용매를 증발시켜 제거하고, 3000 ml의 아세톤을 첨가한 다음, 3000 ml의 용매를 증발시켜 제거하고, 3000 ml의 아세톤을 첨가한 후, 4000 ml의 아세톤을 증발시켜 제거하고 실질적으로 냄새가 없는 tert-부틸아민의 반응 용액을 얻었다. 반응 용액을 30 내지 35℃로 냉각시키고, 45℃를 초과하지 않는 온도를 유지시키는 속도로 1060 ml의 디메틸 설페이트에 적가하였다. 첨가 완료 후, 생성된 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 40 내지 45℃에서 교반하였다. 반응 혼합물을 15 내지 20℃로 냉각시키고, 1500 ml의 25% 암모니아에 첨가하였다. 30분의 교반 후, 1500 ml의 메탄올을 첨가한 다음, 반응 혼합물을 0 내지 5℃로 냉각시켰다. 이 후, 2240 ml의 25% 암모니아를 45분 내에 반응 혼합물에 첨가하였다. 생성된 생성물을 여과로 수집하고, 3000 ml의 물로 세정하고, 45 내지 50℃의 진공에서 건조하였다. 마지막으로, 97.13%의 수득률로 2686.2 g의 생성물을 얻었다.
실시예 4
메틸 (1S,2S,3S,4R,1'S)-3-[(1-아미노-2'-에틸)부틸]-4-[[(1,1-디메틸에톡시)카보닐]아미노]-2-하이드록시사이클로펜탄-1-카복실레이트 (6)의 합성
Figure 112012079230491-pat00010
중간체 5 (1000 g) 및 니켈 클로라이드 헥사하이드레이트 (700 g)를 메탄올 (2500 ml) 중에 용해시키고, -10 ~ 5℃로 냉각시켰다. 나트륨 하이드록사이드 (5 g) 및 나트륨 보로하이드라이드 (300 g)를 메탄올 (2300 ml) 중에 용해시키고, 약 4 내지 6 시간 내에 -10 ~ 4℃ 범위로 반응 용액의 온도를 유지하면서 상기 반응 용액에 첨가하였다. 첨가 완료 후, 반응 용액을 60분 동안 0 ~ 5℃에서 교반하였다. 물과 함께 나트륨 니트리트 (200 g), 암모늄 클로라이드 (560 g) 및 25% 암모니아 (650 g)로 형성된 용액을 반응 용액에 첨가하였다. 이어서 반응 용액을 상온에서 16 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액 흡입 여과에 적용하고, 얻은 필터 케이크를 25% 암모니아 (340 g) 및 물 (2500 g)로 제조된 용액으로 2회 세정하였다. 필터 케이크를 톨루엔 (15000 ml) 및 25% 암모니아 (1250 g) 중에 현탁시키고, 60분 동안 75 ~ 80℃에서 교반하였다. 유기상을 분리하고, 25% 암모니아 (1500 g)에 첨가하였다. 이어서 물 (2000 g) 중 디소듐 에틸렌디아민테트라아세테이트 디하이드레이트 (EDTA) (150 g)의 용액을 첨가하였다. 60분 동안 70 ~ 80℃로 가열 후, 유기층을 분리하였다. 유기층을 0 ~ 5℃로 냉각시키고, 2 내지 3 시간 동안 교반하고, 진공여과하였다. 얻은 필터 케이크를 톨루엔 (2000 g)으로 세정하고, 40 ~ 50℃에서 진공 하에 건조시키고, 백색 고체 화합물 6,740 g (73.2%)을 얻었다.
실시예 5
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물 (9)의 합성
Figure 112012079230491-pat00011
절차
2000 g의 중간체 6을 10000 ml의 톨루엔 중에 현탁시키고, 2 ~ 5℃로 냉각시키고, 680 g의 아세틱 무수물에 적가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 상온에서 교반하였다. 이어서, 4800 ml의 나트륨 카보네이트 10% 수용액을 서서히 첨가한 후, 15분 동안 교반하였다. 수성층을 제거하고, 유기층, 즉, 중간체 7을 포함하는 톨루엔 용액을 다음 단계에 즉시 사용하였다.
아이스 배스에서, 1900 ml의 농축 염산을 상기 톨루엔 용액에 적가하였다. 첨가 완료 후, 반응 혼합물을 1.5 시간 동안 교반하였다. 계층화 후, 유기층을 1 시간 동안 물 (1000 ml)로 세정하였다. 수성층을 결합시키고, 중간체 8을 포함하는 수용액을 얻어 다음 단계에 즉시 사용하였다.
0 ~ 6℃에서, 2920 ml의 30% 나트륨 하이드록사이드 수용액을 상기 수용액에 첨가하였다. 첨가 완료 후, 용액을 60분 동안 추가로 교반하고, 중간체 21을 포함하는 수용액을 얻어, 다음 단계에 즉시 사용하였다.
1020 g의 1,2,4-트리아졸-1-포름아미딘 하이드로클로라이드를 중간체 21을 포함하는 상기 수용액에 첨가한 후, 60분 동안 교반하였다. 이어서 30% 나트륨 하이드록사이드 수용액을, 반응 용액의 pH를 8.4로 조정하기 위하여 첨가하였다. 반응 용액을 밤새 상온에서 교반한 다음, 4 시간 동안 0 ~ 4℃에서 교반하였다. 마지막으로, 반응 용액을 흡입 여과에 적용한 다음 건조시키고, 30%의 수득률로1150 g의 백색 고체, (1S,2S,3S,4R)-3- [(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 얻었다.
실시예 6
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 모노하이드레이트의 제조
1200 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 20000 ml의 물에 현탁시키고, 90℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 50 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 90℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 정치시켜 75℃로 냉각시킨 후, 6000 ml의 아세톤을 여과물에 첨가하였다. 아이스 배스에서 혼합된 용액을 교반하고 신속하게 냉각시켜, 다량의 백색 분말 고체를 침전시켰다. 약 4℃로 냉각시킨 후, 혼합된 시스템을 냉동 저장을 위하여 냉동고로 옮겼다. 12 시간 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 아세톤 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.57%이고 수분 함량이 5.31%인 1100 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 모노하이드레이트를 얻었다.
실시예 7
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 디하이드레이트의 제조
1000 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 30000 ml의 물 중에 현탁시키고, 90℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 50 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 90℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 정치시켜 75℃로 냉각시킨 후, 6000 ml의 메탄올을 여과물에 첨가하였다. 이어서, 혼합된 용액을 데시케이터에 두고 밀봉한 다음, 온도가 6 시간 내에 75℃에서 -10℃로 감소하도록 조절된 온도-조절 반응 탱크에 두어, 다량의 백색 분말 고체를 지속적으로 침전시켰다. 12 시간 동안 등온상에 정치시킨 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 메탄올 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.67%이고 수분 함량이 9.95%인 880 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 디하이드레이트를 얻었다.
실시예 8
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 제조
1200 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 30000 ml의 물 중에 현탁시키고, 90℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 50 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 90℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 정치시켜 75℃로 냉각시킨 후, 5000 ml의 메탄올을 여과물에 첨가하였다. 이어서, 혼합된 용액을 데시케이터에 두고 밀봉하였다. 몇 시간 동안 정치시킨 후, 다량의 백색 분말 고체를 침전시켰다. 12 시간 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 메탄올 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.86%이고 수분 함량이 14.21%인 1080 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 얻었다.
실시예 9
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 세미하이드레이트의 제조
100 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 1000 ml의 메탄올 중에 현탁시키고, 70℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 5 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 70℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 1000 ml의 물을 여과물에 첨가하였다. 아이스 배스에서 혼합된 용액을 교반하여 신속하게 냉각시켜, 다량의 백색 분말 고체를 침전시켰다. 약 4℃로 냉각시킨 후, 혼합된 시스템을 냉동 저장을 위하여 냉동고로 옮겼다. 12 시간 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 메탄올 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.71%이고 수분 함량이 2.73%인 84 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 세미하이드레이트를 얻었다.
실시예 10
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 세스퀴하이드레이트의 제조
100 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 1000 ml의 아세톤 중에 현탁시키고, 70℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 5 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 70℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 1200 ml의 물을 여과물에 첨가하였다. 이어서, 혼합된 용액의 온도를 5 시간 내에 75℃에서 4℃로 감소하도록 조절하여, 다량의 백색 분말 고체를 침전시켰다. 약 4℃로 냉각시킨 후, 혼합된 시스템을 냉동 저장을 위하여 냉동고로 옮겼다. 12 시간 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 아세톤 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.61%이고 수분 함량이 7.64%인 80 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 세스퀴하이드레이트를 얻었다.
실시예 11
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 헥사하이드레이트의 제조
100 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 1300 ml의 물 중에 현탁시키고, 100℃로 가열하여 용해시켰다. 잠시 동안 정치시킨 후, 5 g의 활성 탄소를 시스템에 첨가한 다음, 10분 동안 100℃로 환류시키고, 시스템을 가열하면서 여과하였다. 여과물의 온도를 1 시간 내에 75℃에서 5℃로 감소하도록 조절하여, 다량의 백색 분말 고체를 침전시켰다. 약 4℃로 냉각시킨 후, 혼합된 시스템을 냉동 저장을 위하여 냉동고로 옮겼다. 12 시간 후, 혼합된 시스템을 여과하고, 얻은 필터 케이크를 메탄올 및 물의 혼합물로 세정하였다. 얻은 고체를 자연적으로 건조시키고, 순도가 99.59%이고 수분 함량이 24.92%인 78 g의 백색 고체 생성물, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 헥사하이드레이트를 얻었다.
실시예 12
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 용해도 결정
중국 약전 [Chinese Pharmacopoeia (2005 판), Vol. II, General Notice 5(2)]에 따라, 미세 분말로 그라운딩한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트를 적정량으로 중량을 측정하여 25±2℃에서 상이한 부피의 용매에 부었다. 5분 동안 30초마다 강하게 교반하여, 분말의 용해를 30분 내에 관찰하였다. (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 분말 입자가 관찰되지 않을 경우, 분말이 완전하게 용해되었다고 간주하였다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 용해도의 결정 결과
용매 샘플 용해도 (g/ml)
물




 무수물 0.08
모노하이드레이트 0.15
세스퀴하이드레이트 0.03
디하이드레이트 0.05
트리하이드레이트 0.17
헥사하이드레이트 0.11
실시예 13
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 흡습성의 결정
중국 부록 약전 (Chinese Pharmacopoeia) XIX C (2005년 판)에 포함된 약물 안정성 검사 지침 (Guidelines for Stability Testing of Drug Substances)에 기술된 바와 같이 고습도의 관찰 영향 인자를 위한 방법에 따라, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트를 10일 동안 25℃, 상대 습도 90%±5%의 조건 하에, 항습 밀봉 용기에 두었다. 5일째 및 10일째에, 생성물을 샘플링하고 안정성 관찰에 있어서 중요한 항목에 대하여 결정하였다. 한편, (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 실험 전 및 후의 중량을 정확하게 측정하여, 생성물의 흡습성 및 조해성을 관찰하였다. 수분 흡수에 인한 생성물의 중량 증가가 5% 이상이라면, 이 생성물은 상대 습도 75%±5% 하에서 동일한 방법으로 추가의 실험을 하였다. 수분 흡수에 인한 생성물의 중량 증가가 5% 미만이고, 관찰시 이의 다른 항목이 관련있는 필요조건을 충족시킨다면, 더 이상의 실험은 필요하지 않았다. 항습 조건은 밀봉 용기, 예를 들어, 데시케이터의 하부에 포화 생리 식염수를 둠으로써 달성할 수 있고, NaCl 포화 용액 (15.5 내지 60℃, 상대 습도 75±1%) 또는 KNO3 포화 용액 (25℃, 상대 습도 92.5%)을 상이한 상대 습도의 요구에 따라 선택할 수 있다. 결과를 하기 표에 나타내었다.
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 및 이의 하이드레이트의 흡습성의 결정 결과
상대습도 샘플 5일째의 흡습성
(%)		 10일째의 흡습성
(%)		 개요
92.5%




 무수물 8.38 13.53 필요조건 확인 필요 없음
모노하이드레이트 2.83 3.35 필요조건 확인 필요 없음
세스퀴하이드레이트 4.48 7.33 필요조건 확인 필요 없음
탈수 2.54 2.98 필요조건 확인
트리하이드레이트 2.11 2.24 필요조건 확인
헥사하이드레이트 4.37 9.96 필요조건 확인 필요 없음
75%




 무수물 7.23 12.88 필요조건 확인 필요 없음
모노하이드레이트 2.41 2.77 필요조건 확인
세스퀴하이드레이트 4.01 6.89 필요조건 확인 필요 없음
탈수 2.21 2.54 필요조건 확인
트리하이드레이트 1.68 1.83 필요조건 확인
헥사하이드레이트 3.86 6.33 필요조건 확인 필요 없음
실시예 14
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 안정성의 관찰
중국 부록 약전 (Chinese Pharmacopoeia) XIX C (2005년 판)에 포함된 약물 안정성 검사 지침 (Guidelines for Stability Testing of Drug Substances)에 기술된 가속 검사 방법에 따라, 상업용 패키지에 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 3개의 배치를, 6개월 동안 40℃±2℃의 온도, 상대 습도 75%±5%의 조건 하에 두었다. 사용된 기구는 ±2℃의 정확도로 온도를 조절하고, ±5%의 정확도로 상대 습도를 조절하는 것이 가능하여야 하며, 실제 온도 및 습도를 모니터할 수 있어야 한다. 검사 하는 동안 생성물을 1, 2, 3 및 6 개월 말에 각각 샘플링하고, 안정성 관찰에 있어서 중요한 항목에 대하여 결정하였다. 샘플이 상기 조건 하에서 6개월 내에 결정된 바와 같이 기술된 질 표준을 만족시키지 못하면, 이를 중간체 조건 하에서 가속 실험, 즉, 6개월 동안 30℃±2℃의 온도, 상대 습도 60%±5% (NaNO2 포화 용액 (25 내지 40℃, 상대 습도 64 내지 61.5%)이 사용되어야 함)에 적용시켰다.
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 안정성의 관찰 결과
화합물 시간
(개월)		 관찰 항목
특성 중량 변화(%) 함량
(%)		 관련 물질 (%)
트리하이드레이트 0 백섹 고체 분말 ----- 99.90 필요조건 확인
1 백섹 고체 분말 +0.01 99.95 필요조건 확인
2 백섹 고체 분말 -0.02 99.97 필요조건 확인
3 백섹 고체 분말 +0.01 99.96 필요조건 확인
6 백섹 고체 분말 +0.01 99.91 필요조건 확인
실시예 15
100 mg의 규정량을 갖는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 주사제의 제조
성분 중량 (g)
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 116.4
주사용수 4868.6
활성 탄소 5
희석 염산 (0.1M) 10
총량 5000
116.4 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 80℃에서 완전히 용해될 때까지 4000 ml의 주사용수 중에 용해시켰다. 이 후, 가열하면서 5 g의 활성 탄소를 생성된 용액에 첨가하여, 20분 동안 80℃에서 흡착에 영향을 미치도록 하였다. 용액을 여과하고, 생성된 여과물을 총 부피 5000 ml이 되도록 주사용수로 보충하였다. 여과물을 상온으로 냉각시킨 후, 이의 pH가 3 내지 5가 되도록 10 ml의 0.1 M 희석 염산을 첨가한 후, 0.2 μm의 여과막을 사용하여 여과하였다. 생성된 여과물을 앰플 당 5 ml의 양으로 앰플(총 10000)에 충진하였다. 충진 완료 후, 앰플을 밀봉하고, 20분 동안 115℃에서 멸균하였다.
실시예 16
50 mg의 규정량을 갖는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 주사제의 제조
성분 중량 (g)
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 58.2
주사용수 4926.8
활성 탄소 5
희석 염산 (0.1M) 10
총량 5000
58.2 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 80℃에서 완전히 용해될 때까지 4000 ml의 주사용수 중에 용해시켰다. 이 후, 가열하면서 5 g의 활성 탄소를 생성된 용액에 첨가하여, 20분 동안 80℃에서 흡착에 영향을 미치도록 하였다. 용액을 여과하고, 생성된 여과물을 총 부피 5000 ml이 되도록 주사용수로 보충하였다. 여과물을 상온으로 냉각시킨 후, 이의 pH가 3 내지 5가 되도록 10 ml의 0.1 M 희석 염산을 첨가한 후, 0.2 μm의 여과막을 사용하여 여과하였다. 생성된 여과물을 앰플 당 5 ml의 양으로 앰플(총 10000)에 충진하였다. 충진 완료 후, 앰플을 밀봉하고, 20분 동안 115℃에서 멸균하였다.
실시예 17
300 mg의 규정량을 갖는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 주사제의 제조
성분 중량 (g)
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 34.9
주사용수 9850.1
염화나트륨 90
활성 탄소 10
소듐 비설파이트 10
소듐 칼슘에데테이트 5
총량 10000
90 g의 염화나트륨, 10 g의 나트륨 비설파이트 및 5 g의 나트륨 칼슘에데테이트를 80℃에서 완전히 용해될 때까지 8000 ml의 주사용수 중에 용해시켰다. 이어서 여기에 34.9 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 완전히 용해될 때까지 추가로 첨가하였다. 이 후, 가열하면서 10 g의 활성 탄소를 생성된 용액에 첨가하여, 20분 동안 80℃에서 흡착에 영향을 미치도록 하였다. 용액을 여과하고, 생성된 여과물을 총 부피 10000 ml이 되도록 주사용수로 보충하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 여과물을 0.2 μm의 여과막을 사용하여 추가로 여과하였다. 생성된 여과물을 앰플 당 100 ml의 양으로 앰플(총 100)에 충진하였다. 충진 완료 후, 앰플을 밀봉하고, 20분 동안 115℃에서 멸균하였다.
실시예 18
300 mg의 규정량을 갖는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 주사제의 제조
성분 중량 (g)
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 349
주사용수 98366
염화나트륨 900
활성 탄소 100
희석 염산 (1M) 285
총량 100000
900 g의 염화나트륨을 80℃에서 완전히 용해될 때까지 8000 ml의 주사용수 중에 용해시켰다. 이어서 여기에 349 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 완전히 용해될 때까지 추가로 첨가하였다. 이 후, 가열하면서 10 g의 활성 탄소를 생성된 용액에 첨가하여, 20분 동안 80℃에서 흡착에 영향을 미치도록 하였다. 용액을 여과하여 활성 탄소를 제거하고, 285 ml의 1M 희석 염산을 생성된 여과물에 첨가하여 이의 pH를 4 내지 6으로 조정하였다. 이어서, 여과물을 총 부피 100000 ml이 되도록 주사용수로 보충하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 여과물을 0.2 μm의 여과막을 사용하여 추가로 여과하였다. 생성된 여과물을 앰플 당 100 ml의 양으로 앰플(총 1000)에 충진하였다. 충진 완료 후, 앰플을 밀봉하고, 20분 동안 115℃에서 멸균하였다.
실시예 19
500 mg의 규정량을 갖는(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트 주사제의 제조
성분 중량 (g)
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 582
주사용수 98133
염화나트륨 900
활성 탄소 100
희석 염산 (1M) 285
총량 100000
900 g의 염화나트륨을 80℃에서 완전히 용해될 때까지 80000 ml의 주사용수 중에 용해시켰다. 이어서 여기에 582 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 완전히 용해될 때까지 추가로 첨가하였다. 이 후, 가열하면서 100 g의 활성 탄소를 생성된 용액에 첨가하여, 20분 동안 80℃에서 흡착에 영향을 미치도록 하였다. 용액을 여과하여 활성 탄소를 제거하고, 285 ml의 1M 희석 염산을 생성된 여과물에 첨가하여 이의 pH를 4 내지 6으로 조정하였다. 이어서, 여과물을 총 부피 100000 ml이 되도록 주사용수로 보충하였다. 상온으로 냉각시킨 후, 여과물을 0.2 μm의 여과막을 사용하여 추가로 여과하였다. 생성된 여과물을 앰플 당 100 ml의 양으로 앰플(총 1000)에 충진하였다. 충진 완료 후, 앰플을 밀봉하고, 20분 동안 115℃에서 멸균하였다.
실시예 20
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 분말 주사 제제의 제조
식 1
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-
2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트		 23.3 g
(페라미비어 등가물) 20.0 g
염화나트륨 9.0 g
0.1 N 희석 염산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 100 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
23.3 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 9 g의 염화나트륨을 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 20 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 5 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링 (rolling-installing)하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
식 2
제제화될 용액을 큰 디쉬에서 멸균 건조시킨 후, 부수고, 특정 중량으로 페니실린 보틀에 분할 충전하고, 캡핑하고, 밀봉하고, 포장한 것 외에 식과 제조 방법은 일반식 1의 것과 동일하였다.
식 3
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 23.3 g
(페라미비어 등가물) 20.0 g
만니톨 33.6 g
0.1 N 희석 염산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 100 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
23.3 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 33.6 g의 만니톨을 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 20 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 5 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
식 4
제제화될 용액을 큰 디쉬에서 멸균 건조시킨 후, 부수고, 특정 중량으로 페니실린 보틀에 분할 충전하고, 캡핑하고, 밀봉하고, 포장한 것 외에 식과 제조 방법은 일반식 3의 것과 동일하였다.
식 5
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 23.3 g
(페라미비어 등가물) 20.0 g
염화나트륨 9.0 g
0.1 N 희석된 아세트산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 100 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
23.3 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 9 g의 염화나트륨을 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 20 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 5 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
식 6
제제화될 용액을 큰 디쉬에서 멸균 건조시킨 후, 부수고, 특정 중량으로 페니실린 보틀에 분할 충전하고, 캡핑하고, 밀봉하고, 포장한 것 외에 식과 제조 방법은 일반식 5의 것과 동일하였다.
식 7
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 23.3 g
(페라미비어 등가물)
 20.0 g
0.1 N 희석된 아세트산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 100 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
23.3 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트를 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 20 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 5 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
식 8
제제화될 용액을 큰 디쉬에서 멸균 건조시킨 후, 부수고, 특정 중량으로 페니실린 보틀에 분할 충전하고, 캡핑하고, 밀봉하고, 포장한 것 외에 식과 제조 방법은 일반식 7의 것과 동일하였다.
식 9
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노- 2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 34.95g
(페라미비어 등가물) 30.0g
염화나트륨 9.0g
0.1 N 희석 염산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 150 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
34.95 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 9 g의 염화나트륨을 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 20 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 5 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
식 10
제제화될 용액을 큰 디쉬에서 멸균 건조시킨 후, 부수고, 특정 중량으로 페니실린 보틀에 분할 충전하고, 캡핑하고, 밀봉하고, 포장한 것 외에 식과 제조 방법은 일반식 9의 것과 동일하였다.
식 11
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노- 2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 34.95g
(페라미비어 등가물) 30.0g
염화나트륨 9.0g
0.1 N 희석 염산 용액 pH 3.5 내지 5로 조정하기 위한 적정량
물 1000 ml이 되도록 첨가
200 보틀을 보틀 당 300 mg의 기본 시약의 사양으로 준비
34.95 g의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 9 g의 염화나트륨을 무균실에서 무게를 측정하여, 멸균 용기에 두고, 500 ml의 멸균된 주사용수를 첨가하였다. 이어서, 생성된 용액을 0.1 N 희석 염산 용액으로 3.5 내지 5의 pH로 조정하고, 1000 ml이 되도록 멸균된 주사용수로 보충한 다음, 1 g의 활성 탄소로 흡착시켰다. 여과 후, 생성된 여과물을 0.22 μm의 미세여과막이 장착된 살균장치로 추가로 여과하였다. 마지막으로 얻은 용액을 50 ml의 멸균된 페니실린 보틀에 보틀 당 10 ml의 양으로 채웠다. 보틀을 2 내지 3 시간 동안 -30℃ ~ -40℃에서 예비냉동시키고, 9 시간 동안 -36℃ ~ -20℃에서 승화 건조시키고, 10 내지 24 시간 동안 30℃에서 건조시키고, 캡핑하고, 롤링-인스톨링하고, 포장함으로써 분말 주사 제제를 제조하였다.
실시예 20
물 중 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 용해 양식의 관찰
100 ml : 300 mg의 규정량으로 예비-검사를 수행하였고, 여기에서 원료는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트이고 용해 조건은 하기와 같다:
(1) 주사용수 (상온)
(2) 주사용수 (80℃)
(3) 주사용수 (상온, 염산으로 산성으로 조정)
(4) 주사용수 (디소듐 하이드로겐 포스페이트염기성으로 조정)
결과:
(1)의 조건 하에, 화합물은 상대적으로 장시간 동안 그의 총량으로 주사용수를 사용하고, 교반 또는 초음파 용해를 함께 사용했지만 천천히 용해되었다.
(2)의 조건 하에, 화합물은 상대적으로 적은 부피로 주사용수를 사용하여 신속하게 용해되었다; 대량 생산 동안 주사용수는 일반적으로 80℃에서 순환하는 것을 고려하면 이 조건은 생산의 용이함에 있어서 바람직한 조건이다.
(3)의 조건 하에, 화합물은 (4)의 조건 하의 경우와 비교하여 상대적으로 쉽게 용해되었고, 화합물은 산성 조건 하에 더욱 쉽게 용해되었으며, 이는 pH값의 조정을 위하여 염기성으로 제공할 수 있다.
실시예 21
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 안성성에 상이한 산성 조건의 영향
349 mg의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트 및 900 mg의 염화나트륨을 트리하이드레이트의 용해 양식에 따라 80℃에서 주사용수로 용해시키고, 염산으로 상이한 pH값으로 조정하였다. 생성된 용액을 30분 동안 115℃에서 고압 스팀 멸균하였다. 이어서, 용액을 pH값의 변화 및 관련 물질 양의 변화의 결정을 위하여 샘플링하였다. 결과를 하기에 열거하였다:
pH 결정의 표
용액 번호 외양 pH 값 양 (관련 물질)
멸균전 면균후 멸균전 멸균후 60℃에서 10일 후
1 무색 투명 액체 4.00 4.08 98.58(0.11) 97.8(0.17)
(2 불순물 피크)		 101.20(0.10)
2 무색 투명 액체 4.53 4.50 102.90(0.11) 99.3(0.10) 96.1(0.09)
3 무색 투명 액체 5.02 5.02 101.1(0.10) 101.7(0.10) 100.4(0.10)
4 무색 투명 액체 5.40 5.40 104.3(0.29)
(2 불순물 피크)		 101.7(0.10) 102.8(0.09)
5 무색 투명 액체 6.08 6.04 103.8(0.11) 102.5(0.10) 104.0(0.10)
6 무색 투명 액체 6.56 6.30 104.2(0.10) - (0.10) 104.4(0.39)
(5 불순물 피크)
7 무색 투명 액체 6.95 6.40 102.90(0.10) 95.7(0.10) 93.43(0.11)
8 무색 투명 액체 7.53 6.72 104.1(0.10) 98.8(0.09) 103.9(0.16)
(3 불순물 피크)
9 무색 투명 액체 7.93 7.09 104.1(0.20)
(3 불순물 피크)		 94.3(0.10) 102.73(0.27)
주의: 괄호 안의 데이터는 관련 물질의 양이고, 정규화 방법으로 계산하였다. 괄호 밖의 데이터는 트리하이드레이트의 양이다.
결과는 다음과 같다:
pH값이 6.5를 초과할 경우, 이는 멸균 후 감소하였고, 감소의 정도는 pH값이 증가할수록 증가하였으며, 이는 시스템의 pH값이 상기 pH값이 높을 경우 높은 온도로 변할 수 있다는 것을 가르킨다. 양이 변한다는 관점에서, pH값이 7.0을 초과할 경우, 멸균 후 양은 명백하게 감소하고, 60℃에서 10일 후 지속적으로 감소한다; pH값이 4.5일 경우, 양은 또한 60℃에서 10일 후 감소하려는 경향이 있다. 이는 너무 높거나 너무 낮은 pH값은 시스템의 안정성에 부정적인 영향을 미친다는 것을 가르킨다. 정규화 방법으로 계산된 바, 관련 물질에서의 분석은 관련 물질의 양이 명백하게 변하지 않았지만, 많은 불순물 피크는 pH값이 염기성이 될수록 많은 관련 물질이 증가하는 경향이 있다는 것을 가르킨다. 그러므로, 화합물은 산성 조건 하에서 안정하려는 경향이 있다. 최적 pH값은 4.5 내지 6.5의 범위 내였다.
실시예 22
활성 탄소를 이용한 흡착 및 멸균의 조건 연구
0.05%의 양의 활성 탄소로 흡착 전 및 후의 양의 변화는 각각 0.1% 및 0.2%로 관찰되었다. 결과는, 흡착 양은 활성 탄소의 양이 증가할수록 증가하고, 흡착 양은 활성 탄소의 양이 0.1%일 경우 약 2%인 것으로 나타났다. 생성물의 질을 확인하기 위하여, 활성 탄소를 0.1%의 양으로 사용하였다. 멸균은 두개의 통상의 조건, 즉, 115℃에서 30분 및 121℃에서 20분의 조건 하에 각각 수행하였다. 결과는 121℃, 20분의 조건 하에서는 다소 양이 감소하였고 115℃, 30분의 조건 하의 통상의 멸균 방법만이 F0 > 8인 것으로 나타났다.
실시예 23
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트를 포함하는 비경구 투여용 약제학적 조성물의 식의 최적화 연구
염기성 식에 따라:
트리하이드레이트 349 mg
염화나트륨 0.9 g
주사용수 100 ml
3개의 샘플을 다음과 같이 제조하였다:
희석 염산으로 pH값을 조정하여, pH = 5.0을 갖도록 제조한 샘플을 SY1로 표시하였고, pH = 6.0을 갖도록 제조한 샘플을 SY2로 표시하였으며, pH = 6.5를 갖도록 제조한 샘플을 SY3으로 표시하였다. 제조한 샘플을 고온, 조명 실험 및 40℃ 가속 실험에 적용하였다.
염기성 식에 따라:
트리하이드레이트 116.4 mg
주사용수 5 ml
3개의 샘플을 다음과 같이 제조하였다:
염산으로 pH값을 조정하여 5.04가 되도록 제조한 샘플을 XZ1로 표시하였다; 0.05% 티오우레아를 첨가하고 암모니아로 pH값을 6.98로 조정한 샘플을 XZ2로 표시하였다; 트리하이드레이트를 임의의 애쥬번트 및 pH 조절제의 첨가 없이 주사용수 중에 직접 용해시켜 제조한 샘플을 XZ3으로 표시하였다. 제조한 샘플을 고온, 조명 실험 및 40℃ 가속 실험에 적용하였다.
결과를 하기 표에 나타내었다:
샘플 pH 값
멸균전 0일 조명 5일 조명
10일		 60℃
5일		 60℃
10일		 40℃
10일
SY1 5.07 5.06 5.08 5.10 5.08 5.10 5.06
SY2 5.95 5.99 6.03 6.01 6.04 6.07 6.03
SY3 6.20 6.39 6.21 6.22 6.29 6.31 6.29
XZ1 5.04 5.03 5.05 5.03 5.06 5.05 5.05
XZ2 6.98 6.88 6.88 6.90 6.91 6.86 6.89
XZ3 7.22 6.98 6.99 6.97 6.96 6.95 6.93
양 (%)
SY1 101.2 100.5 99.5 100.2 99.3 100.9 100.2
SY2 100.8 99.6 99.0 99.5 100.1 99.2 99.1
SY3 102.5 99.8 99.1 98.2 99.1 98.2 99.6
XZ1 98.5 97.8 98.0 98.2 99.6 100.9 100.2
XZ2 100.0 98.6 99.7 98.5 97.1 98.0 99.8
XZ3 101.1 97.5 98.1 97.8 98.1 98.3 99.9
관련 물질 (%)
SY1 0.10 0.11 0.09 0.11 0.12 0.09 0.10
SY2 0.09 0.13 0.12 0.18 0.13 0.10 0.12
SY3 0.13 0.15 0.17 0.20 0.15 0.18 0.11
XZ1 0.13 0.12 0.11 0.10 0.12 0.16 0.11
XZ2 0.12 0.14 0.15 0.18 0.09 0.14 0.10
XZ3 0.11 0.18 0.20 0.11 0.19 0.27 0.18
실시예 24
인플루엔자 A 바이러스 뉴라미니다아제에 대한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 저해 활성 결정
기질로서 4-MUNANA를 사용하여, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제의 활성 및 뉴라미니다아제에 대한 후보 화합물의 저해 활성을 형광분석법으로 검정하였다. 제 1 세대 바이러스의 스톡 용액을 MDCK 세포 중에 배양하고, 1:2의 비로 뉴라미니다아제 어세이 버퍼 (NA 어세이 버퍼: 32.5 MES, 4mM CaCl2, Ph 6.5)로 희석하였다. 생성된 50 μl의 바이러스 희석 용액을 블랙 96-웰 플레이트 (Costar)에 동일한 부피의 4-MUNANA (NA 어세이 버퍼 중 200mM)와 혼합하고, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 다음, 반응을 정지시키기 위하여, 2배의 정지 버퍼 (25% 에탄올, 0.1M 글리신, pH 10.7)를 첨가하였다. λ 여기: 360nM 및 λ 배기: 460nM에서 형광 밀도를 평가하였다(PolarSTAR Optima, BMG Labtech, Germany). 형광 단위:바이러스 농도 (일반적으로 적어도 2개의 상이한 바이러스 농도)의 순수값의 산포도를 플롯하고, 산포도의 직선 부분의 중앙의 활성 상태를 선택하고 화합물의 저해 활성을 검정하는데 사용하였다. 0.01, 0.1, 1, 10, 100 pMol의 농도를 갖는 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 용액을 멸균 탈이온수를 사용하여 각각 제조하였다. 25 μl의 용액 각각을 2×NA 어세이 버퍼로 희석시킨 동량의 바이러스 (활성 어세이에서 선택된 농도의 두배로)와 혼합한 후, 30분 동안 상온에서 활성화시킨 다음, 50 μl의 4-MUNANA (NA 어세이 버퍼 중 200mM)를 첨가한 후, 1 시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 마지막으로 상술한 바와 같이 형광 농도를 검정하였다. 각 농도의 후보 화합물을 두개의 평행 구멍에 제공하였고, 블랭크 대조군 (단지 4-MUNANA 및 정지 버퍼만은 포함함)은 4개의 평행 구멍에 제공하였으며, 바이러스 대조군 (제로 농도의 후보 화합물을 포함함)은 4개의 평행 구멍에 제공하였다. 저해률 IR (%)을 하기의 식으로 계산하였다:
IR (%) = [1 - (FU - FUB) ÷ (FUC - FUB)] x 100
FU: 후보 화합물 그룹에서 형광 단위의 평균값;
FUB: 블랭크 대조군 그룹에서 형광 단위의 평균값;
FUC: 바이러스 대조군 그룹에서 형광 단위의 평균값.
IR(%):화합물의 농도의 산포도를 플롯하고, IC50을 대수 회귀 분석으로 계산하였다. 상이한 바이러스 농도의 어세이 결과로부터 얻은 회귀 곡선은 유사한 IC50 값으로 바람직하게 오버랩될 것이다. 결과를 하기에 열거하였다:
인플루엔자 A 바이러스 (H3N2) 뉴라미니다아제에 대한 저해 활성
농도(nM) 100 10 1 0.1 0.01 Ln(IC50) IC50 평균 IC50
NA 1/40 100.43 99.25 60.99 13.23 0.63 -0.39549 0.673353 0.542104
NA 1/80 99.89 98.80 63.20 24.04 12.33 -0.88951 0.410856
*NA 1/40, NA 1/80은 실험에 사용한 두개의 바이러스 농도를 의미한다.
실시예 25
인플루엔자 B 바이러스 뉴라미니다아제에 대한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 저해 활성의 결정
인플루엔자 B 바이러스 뉴라미니다아제에 대한 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 트리하이드레이트의 저해 활성을 실시예 24에서 기술한 방법에 따라 결정하였고, 여기에서, 인플루엔자 B 바이러스 (B/Jing Fang/76/98) 뉴라미니다아제를 인플루엔자 A 바이러스 뉴라미니다아제 대신 사용하였다. 결과를 하기에 열거하였다:
인플루엔자 B 바이러스 (B/Jing Fang/76/98) 뉴라미니다아제에 대한 저해 활성
농도(nM) 100 10 1 0.1 0.01 Ln(IC50) IC50 평균 IC50
NA 1/20 97.78 82.01 39.11 15.31 8.81 0.131306 1.140317 1.0691996
NA 1/40 96.71 81.45 44.84 19.17 7.92 -0.00192 0.998082
*NA 1/20, NA 1/40은 실험에 사용한 두개의 바이러스 농도를 의미한다.
실시예 26
(1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 항-인플루엔자 활성 실험
50 μl 인산 버퍼 (0.42% 우혈청 알부민 포함) 중 500 pfu (플라크 형성 단위) 마우스-순응 인플루엔자 바이러스 균주를 포함시켜 전형적으로 바이러스 드립을 제조한 다음, 마우스 (BALB/C, 암컷, 5 내지 6 주령, 20 g)의 비강으로 떨어뜨려 감염량 23.7LD50으로 이들을 감염시켰다. 본 발명의 화합물을 생리 식염수 중에 현탁시켜 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg의 용량으로 5회, 즉 바이러스 감염 1 시간 및 2, 3, 4, 5일 후에 복강내 주사로 각각 투여하였다. 검정을 10마리의 마우스를 사용하여 수행하였다. 결과는 바이러스 감염 14일 후 생존 마우스의 수:어세이 마우스의 수의 비로 나타내었다. 한편, 무수물 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산을 대조 화합물로서 사용하였다.
용량 시약 생존수 생존률
블랭크 대조군 생리 식염수 10/10 100%
바이러스 대조군 생리 식염수 0/10 0%
2.5 mg/kg
 트리하이드레이트 6/10 60%
무수물 5/10 50%
5.0 mg/kg
 트리하이드레이트 7/10 70%
무수물 7/10 70%
10 mg/kg
 트리하이드레이트 8/10 80%
무수물 7/10 70%
20 mg/kg
 트리하이드레이트 9/10 90%
무수물 9/10 90%

Claims (21)

  1. 하기 일반식 (I)의 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 하이드레이트의 제조 방법으로서,
    Figure 112013113274196-pat00012

    (I)
    (상기 식에서, X는 2.0 이다)
    물 중에 (1S,2S,3S,4R)-3-[(1S)-1-아세틸아미노-2-에틸-부틸]-4-구아니디노-2-하이드록시-사이클로펜틸-1-카복실산 조 생성물을 현탁시키고, 50 내지 90℃로 가열하여 용해시키고;
    정치시킨 다음 시스템에 활성 탄소를 첨가하고;
    10분 동안 가열하여 환류시킨 후 여과하고;
    정치시켜 35 내지 75℃로 냉각시킨 후 시스템에 유기 용매를 첨가하거나; 유기 용매의 첨가 후 일반식 (I)의 화합물의 결정종 (crystal seed)을 첨가하고;
    밀봉 용기에 혼합 용액을 넣고, 정치시키고, 냉각률을 조절하여 결정 생성물을 제공한 다음 고체 생성물을 여과하고 수집하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 유기 용매가 메탄올, 에탄올, n-부탄올, 아세톤 및 아세토니트릴 또는 이의 혼합물로 구성된 그룹 중에서 선택된 것인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 유기 용매가 메탄올 및 아세톤으로 구성된 그룹 중에서 선택된 것인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 물:유기 용매의 부피비가 1:5 내지 100:1이거나, 순수한 물인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 냉각률이 0.1℃/분 내지 5℃/분인 방법.
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