CN108042535A - 用于治疗流感的化合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及通过使用式I的化合物抑制流感病毒HA的成熟过程来治疗和预防流感感染的方法。本发明还涉及用于治疗和预防流感感染的含有式I的化合物和其他药剂的组合。

Description

用于治疗流感的化合物和方法

本申请是申请号为201080037082.7、2012年02月20日进入中国国家阶段、申请日为2010年06月23日、发明名称为“用于治疗流感的化合物和方法”的发明专利申请的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年6月26日提交的美国临时申请第61/220,891号的优先权，该美国临时申请的全部内容在此通过引用并入本文。

背景技术

本发明涉及利用噻唑化物(thiazolide)治疗和预防流感感染的方法和产品。

流感是影响所有年龄组的高度传染性急性呼吸道疾病，仅仅在美国，流感每年导致约36,000人死亡和超过226,000人入院治疗。根据流感病毒的核蛋白质和基质蛋白质中的抗原差异对流感病毒进行分类(A型、B型和C型)，流感病毒是被包裹的负链RNA病毒；A型病毒在临床上是最常见的。A型流感病毒的许多亚型在它们的两种表面糖蛋白(红血球凝集素(“HA”)和神经氨糖酸苷酶(“NA”))上有差异，所述两种表面糖蛋白是保护性免疫应答的主要靶标，并且根据红血球凝集素(用编号H来表示)和神经氨糖酸苷酶(用编号N来表示)的类型对这两种表面糖蛋白进行标记。HA和NA由于抗原漂移和抗原转换而连续变化。已知16个H亚型(或“血清型”)和9个N亚型。

高度致病性A型流感病毒毒株(例如，新的H1N1猪流感)的出现代表了对全球人类健康特别严重的威胁。除了监测和早期诊断之外，对控制新出现的流感毒株所做的努力还在于着力研制有效的疫苗和新型抗病毒药物。

A型流感病毒红血球凝集素是三聚体糖蛋白，基于毒株的类型，所述三聚体糖蛋白在每个亚单元中含有3至9个N连接的糖基化序列肽段(sequon)。HA起初在内质网中合成并将HA核心糖基化为75kDa至79kDa的前体(HA0)，所述前体聚集成非共价连接的同型三聚体。所述三聚体被快速地运输至高尔基(Golgi)复合体并到达质膜，在所述质膜中，HA的插入使新形成的病毒颗粒开始进行组装并成熟。仅仅在插入质膜之前或同时，每个三聚体的亚单元通过蛋白水解作用裂解为两个糖蛋白，HA1和HA2，这两个糖蛋白仍然通过二硫键连接。

发明内容

本发明提供在抗糖类内切酶的消化之前的阶段通过阻断病毒红血球凝集素的成熟来治疗和预防病毒感染的方法。治疗和预防是通过给药式I的化合物或其药学上可接受的盐(单独或与其他药剂联合)进行的。式I的化合物通过新的机理表现出抗病毒活性，所述新的机理为选择性阻断病毒表面蛋白HA成熟，从而减弱细胞内运输以及插入宿主细胞的质膜。初步的结果表明式I的化合物构成了一类新的有效对抗A型流感感染的抗病毒药物。本发明还提供在抗病毒治疗中单独、同时或顺序使用的、作为组合制剂的产品，所述产品含有式I的化合物或其药学上可接受的盐和有效量的其他抗病毒药剂或有效量的免疫刺激剂或有效量的疫苗。

简要说明

本发明涉及通过抑制流感病毒HA成熟，利用式I的噻唑化物治疗和预防流感感染的方法、药物组合物和组合制剂。在根据本发明的组合制剂、药物组合物和治疗方法中，抗病毒药剂可包含1至4种化合物或制剂并且还可包含疫苗和/或免疫刺激剂。

在一种实施方式中，本发明提供或设计了含有治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐或酯和药学上可接受的载体的药物组合物。

在另一实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和另一抗病毒药剂。

在更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和神经氨糖酸苷酶抑制剂。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和免疫刺激剂。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和PEG化的干扰素。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和重组唾液酸酶融合蛋白。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和疫苗。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和反义寡核苷酸。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和另一抗病毒药剂，其中，两种药剂基本上同时给药。

在另一更加具体的实施方式中，本发明提供或设计了用于治疗流感的组合，所述组合包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和另一抗病毒药剂，其中，两种药剂顺序给药。

在另一实施方式中，本发明提供通过给药式I的化合物或其药学上可接受的盐治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供通过式I的化合物或其药学上可接受的盐与免疫刺激剂的联合给药治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供通过式I的化合物或其药学上可接受的盐与神经氨糖酸苷酶抑制剂的联合给药治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供通过式I的化合物或其药学上可接受的盐与疫苗的联合给药治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供通过式I的化合物或其药学上可接受的盐与反义寡核苷酸的联合给药治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供通过式I的化合物或其药学上可接受的盐与金刚烷类似物的联合给药治疗和预防病毒感染的方法。

在另一实施方式中，本发明提供用于治疗流感的组合包装或试剂盒，所述组合包装或试剂盒包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和神经氨糖酸苷酶抑制剂。

在另一实施方式中，本发明提供用于治疗流感的组合包装或试剂盒，所述组合包装或试剂盒包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和免疫刺激剂。

在另一实施方式中，本发明提供用于治疗流感的组合包装或试剂盒，所述组合包装或试剂盒包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和金刚烷类似物。

在另一实施方式中，本发明提供用于治疗流感的组合包装或试剂盒，所述组合包装或试剂盒包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和重组唾液酸酶融合蛋白。

在另一实施方式中，本发明提供用于治疗流感的组合包装或试剂盒，所述组合包装或试剂盒包含式I的化合物或其药学上可接受的盐和反义寡核苷酸。

具体实施方式

本文使用的下列术语具有所说明的含义。

除非另有说明，不指明具体数目(“a”)是指一个(一种)或一个(一种)以上。

除非另有说明，本文使用的术语“一个或一个以上取代基”是指基于可利用的键合位点的数目，从一个取代基至可能的最大数目的取代基。

本文使用的术语“治疗”是指逆转、缓解、抑制对其应用术语“治疗”的失调或病症的发展或所述病症或失调的一种或一种以上症状的发展或者预防对其应用该术语“治疗”的失调或病症或所述病症或失调的一种或一种以上症状。本文使用的术语“治疗(treatment)”是指起治疗(treating)作用，“治疗(treating)”的定义接近上述内容。

术语“联合”，“联合治疗(combination therapy和co-therapy)”包含给药式I的化合物和作为意在提供有益效果的具体治疗方案的一部分的另一药剂，所述有益效果来自这些治疗剂的共同作用。联合的有益效果包括但不限于：治疗剂的联合引起的药代动力学或药效学的共同作用。这些治疗剂的联合给药通常在限定的时间段内(基于所选择的组合通常为数分钟、数小时、数天或数周)进行。

“联合治疗”通常无意包含给药作为独立的单治疗方案的一部分的这些治疗剂中的两种或两种以上，所述独立的单治疗方案的一部分偶然地且任意地产生本发明的组合。“联合治疗”意在包括以基本上同时的方式或顺序的方式给药治疗剂。基本上同时给药可通过例如给药含有固定比例的治疗剂的单个胶囊来完成或通过给药每个治疗剂的单个胶囊来完成。治疗剂的顺序给药和基本上同时给药均可通过任何合适的途径实现，所述合适的途径包括但不限于：口服途径、静脉途径、肌肉内途径和通过粘膜组织直接吸收。所述治疗剂可通过相同的途径或通过不同的途径给药。例如，所选择的组合的第一治疗剂可通过静脉注射给药，而所述组合的另一治疗剂可口服给药。可选地，例如，所有治疗剂可口服给药或所有治疗剂可通过静脉注射给药。治疗剂的给药顺序可以是关键的或不关键的。“联合治疗”还可包括给药进一步结合了其他生物活性成分(例如，但不限于：不同的抗病毒剂、疫苗或免疫刺激剂)和非药物治疗剂(包括营养补充物)的如上所述的治疗剂。

术语“盐”以其最广的含义使用。例如，术语盐包括带有本发明的化合物的离子的酸式盐和碱式盐。在一些实施方式中，术语盐可以是亚类，其被称为药学上可接受的盐，所述亚类为具有药理学活性的本发明的化合物的盐并且所述亚类既不是生物学上不理想的也不是在其他方面不理想的。在所有实施方式中，所述盐可通过酸形成，例如但不限于：氢、卤化物、醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。在所有实施方式中，所述盐可通过碱形成，例如，但不限于：氢氧化物、铵盐、碱金属盐(例如锂盐、钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐、镁盐、铝盐)、有机碱(例如，氨、甲胺、二乙胺、乙醇胺、二环己胺、N-甲基吗啉、N-甲基-D-葡糖胺)的盐和氨基酸(例如，精氨酸和赖氨酸)的盐。碱性含氮基团可用包括低级烷基卤化物、二烷基硫酸盐、长链卤化物和芳烷基卤化物在内的试剂进行季铵化，所述低级烷基卤化物例如甲基氯化物、甲基溴化物、甲基碘化物、乙基氯化物、乙基溴化物、乙基碘化物、丙基氯化物、丙基溴化物、丙基碘化物、丁基氯化物、丁基溴化物、丁基碘化物；所述二烷基硫酸盐例如二甲基硫酸盐、二乙基硫酸盐、二丁基硫酸盐和二戊基硫酸盐；所述长链卤化物例如癸基氯化物、癸基溴化物、癸基碘化物、月桂基氯化物、月桂基溴化物、月桂基碘化物、十四烷基氯化物、十四烷基溴化物、十四烷基碘化物、十八烷酰基氯化物、十八烷酰基溴化物、十八烷酰基碘化物；所述芳烷基卤化物例如苄基溴化物和苯乙基溴化物。

本文使用的术语“治疗上可接受的盐”和“药学上可接受的盐”代表水可溶的或油可溶的或可分散的本发明的化合物的盐和两性离子形式；所述本发明的化合物的盐和两性离子形式适于治疗疾病而不产生过度毒性、刺激和过敏反应；所述本发明的化合物的盐和两性离子形式与合理的收益/风险比例相适应；并且，所述本发明的化合物的盐和两性离子形式对于它们预期的用途而言是有效的。所述盐可在化合物的最终分离和纯化过程中制备或者通过合适的化合物的游离碱的形式与合适的酸反应来单独地制备。代表性的酸加成盐包括：醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、L-抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(besylate)、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、龙胆酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、乙醇酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、DL-扁桃酸盐、1,3,5-三甲基苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐(pectinate)、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、膦酸盐、苦味酸盐、三甲基乙酸盐、丙酸盐、焦谷氨酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、L-酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐(p-tosylate)和十一烷酸盐。同样，本发明的化合物的碱性基团可被下列基团季铵化，所述基团为：甲基氯化物、甲基溴化物、甲基碘化物、乙基氯化物、乙基溴化物、乙基碘化物、丙基氯化物、丙基溴化物、丙基碘化物、丁基氯化物、丁基溴化物和丁基碘化物、二甲基硫酸盐、二乙基硫酸盐、二丁基硫酸盐和二戊基硫酸盐、癸基氯化物、癸基溴化物、癸基碘化物、月桂基氯化物、月桂基溴化物、月桂基碘化物、十四烷基氯化物、十四烷基溴化物、十四烷基碘化物、十八烷酰基氯化物、十八烷酰基溴化物、十八烷酰基碘化物以及苄基溴化物和苯乙基溴化物。可用于形成治疗上可接受的加成盐的酸的例子包括无机酸和有机酸，所述无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；所述有机酸例如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。盐还可通过化合物与碱金属离子或碱土金属离子相结合来形成。因此，本发明设计了本发明的化合物的钠盐、钾盐、镁盐和钙盐，等等。

碱加成盐可在化合物的最终分离和纯化过程中，通过羧基、苯酚或类似基团与合适的碱或氨或有机初级胺、二级胺或三级胺反应来制备，所述合适的碱例如金属氢氧化物、金属碳酸盐或金属碳酸氢盐。治疗上可接受的盐的阳离子包括：锂、钠、钾、钙、镁和铝以及无毒季铵阳离子，所述无毒季铵阳离子包括：铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁基胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄基胺、N,N-二苄基苯乙基胺，1-二苯羟甲胺和N,N’-二苄基乙烯二胺。其他代表性的用于形成碱加成盐的有机胺包括：乙烯二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。

术语“溶剂化物”以其最广的含义使用。例如，术语溶剂化物包括当本发明的化合物含有一个或一个以上结合水分子时形成的水合物。

本文使用的术语“烷基羰基”和“烷酰基”是指通过羰基基团连接至母体分子部分的烷基基团。这些基团的例子包括甲基羰基(也称为乙酰基)、乙基羰基(也称为丙酰基)和2-甲基-环戊基羰基，等等。

本文使用的术语“酰基”是指连接至烷基、烯基、芳基、杂芳基、杂环烷基或任何其他基团的羰基，其中，连接至羰基的原子为碳原子。“乙酰基”基团是指-C(O)CH3基团。酰基基团的例子包括烷酰基、芳酰基和混合的烷基-芳基基团，所述烷酰基基团例如甲酰基、乙酰基和丙酰基，所述芳酰基基团例如苯甲酰基，所述混合的烷基-芳基基团例如肉桂酰基。

术语“酰基氨基”是指被酰基基团取代的氨基基团。“酰基氨基”基团的一个例子为乙酰基氨基(CH3C(O)NH-)；另一例子为苯甲酰基氨基。

本文使用的术语“烯基”是指具有一个或一个以上双键且含有2至20个碳原子的(或在环状基团的情况下具有3至20个环成员的)直链、支链或环状不饱和烃基基团或者具有一个或一个以上双键且含有2至20个碳原子的(或在环状基团的情况下具有3至20个环成员的)、含有直链或支链和环状基团的任何组合的基团。在许多实施方式中，烯基基团包含2至6个碳原子。术语“烯基基团”以其最广的含义使用。例如，术语“(C2-C8)烯基基团”包括具有至少一个双键的、含有2至8个碳原子的直链、支链和环状烃基团。合适的烯基基团的例子包括乙烯基(也称为vinyl)、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯基、仲丁烯基、叔丁烯基、1,3-丁二烯、n-戊烯、n-己烯、环烯基基团(例如环己烯和1,3-环戊二烯)、环烯基烷基基团(例如环己烯甲基)、烯基环烷基基团(例如亚甲基环己基)，等等。

亚烯基是指在两个或两个以上的位置连接的碳碳双键系统，例如，亚乙烯基[(-CH＝CH-),(-C::C-)]。

本文使用的术语“烷氧基”是指烷基醚基团，其中，术语烷基是如本文所定义的。合适的烷基醚基团的例子包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、异丙氧基、n-丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、环戊氧基，等等。

本文使用的术语“烷氧基烷氧基”是指通过另一烷氧基基团连接至母体分子部分的一个或一个以上烷氧基基团。例子包括乙氧基乙氧基、甲氧基丙氧基乙氧基、乙氧基戊氧基乙氧基乙氧基，等等。

本文使用的术语“烷氧基烷基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的烷氧基基团。术语“烷氧基烷基”还包括具有一个或一个以上连接至烷基基团的烷氧基基团的烷氧基烷基基团，也就是说，形成单烷氧基烷基和双烷氧基烷基基团。

本文使用的术语“烷氧基羰基”是指通过羰基基团连接至母体分子部分的烷氧基基团。这些“烷氧基羰基”基团的例子包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基和己氧基羰基。

术语“烷氧基羰基烷基”是指具有如上定义的取代烷基基团的“烷氧基羰基”的基团。更加优选的烷氧基羰基烷基基团为具有连接至1至6个碳原子的、如上定义的低级烷氧基羰基基团的“低级烷氧基羰基烷基”。这些低级烷氧基羰基烷基基团的例子包括甲氧基羰基甲基。

本文使用的术语“烷基”是指直链、支链或环状烷基基团或由直链、支链和/或环状基团的任何组合构成的基团，所述烷基为含有1至20个碳原子的饱和脂肪族烃基。在许多实施方式中，烷基基团含有1至10个碳原子。在许多其他实施方式中，烷基基团含有1至6个碳原子。术语“烷基基团”以其最广的含义使用。如本文所定义的，烷基基团可被任选地取代。烷基基团的例子包括甲基、乙基、n-丙基、异丙基、环丙基、环丙基甲基、n-丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、环丁基、戊基、新戊基、异戊基、己基、环己基、反式-1,2-二乙基环己基、辛基、壬基，等等。例如，缩写“(C1-C6)-烷基基团”包括(C3-C6)-环烷基基团以及直链和支链烷基基团，并且“O(C1-C8)-烷基基团”包括直链O(C1-C8)烷基基团、支链O(C1-C6)烷基基团和环状O(C1-C6)-烷基基团。

本文使用的术语“烯基”是指从在两个或两个以上位置连接的直链或支链饱和烃得到的饱和脂肪族基团，例如，亚甲基(-CH2-)、乙烯和1,3-环丁烯。

本文使用的术语“烷基氨基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的氨基基团。

本文使用的术语“烷基氨基羰基”是指通过羰基基团连接至母体分子部分的烷基氨基基团。这些基团的例子包括N-甲基氨基羰基和N,N-二甲基羰基。

本文使用的术语“亚烷基”是指烯基基团，其中，碳碳双键的一个碳原子属于与烯基基团连接的基团。

本文使用的术语“烷基亚磺酰基”是指通过亚磺酰基基团连接至母体分子部分的烷基基团。烷基亚磺酰基基团的例子包括甲基亚磺酰基、乙基亚磺酰基、丁基亚磺酰基和己基亚磺酰基。

本文使用的术语“烷基磺酰基”是指通过磺酰基基团连接至母体分子部分的烷基基团。烷基磺酰基的例子包括甲磺酰基、乙磺酰基、叔丁烷磺酰基，等等。

本文使用的术语“烷硫基”是指烷基硫醚(R-S-)基团，其中，术语烷基是如上所定义的。合适的烷基硫醚基团的例子包括甲硫基、乙硫基、n-丙硫基、异丙硫基、n-丁硫基、异丁硫基、仲丁硫基、叔丁硫基、乙氧基乙硫基、甲氧基丙氧基乙硫基、乙氧基戊氧基乙氧基乙硫基，等等。

术语“烷硫基烷基”包括连接至烷基基团的烷硫基基团。烷硫基烷基基团包括具有1至6个碳原子的烷基基团和如上定义的烷硫基基团的“低级烷硫基烷基”基团。这些基团的例子包括甲硫基甲基。

本文中以其最广的含义使用的术语“炔基”是指具有一个或一个以上碳碳三键且含有2至20个碳原子的直链、支链或环状不饱和烃基基团以及具有一个或一个以上碳碳三键且含有2至20个碳原子的、含有直链、支链和/或环状基团的任何组合的基团。在许多实施方式中，炔基基团含有2至6个碳原子。在许多其他实施方式中，炔基基团含有2至4个碳原子。“亚炔基”是指在两个位置连接的碳-碳三键，例如，亚乙炔基(-C:::C-，-C≡C-)。除非另有说明，例如，(C2-C8)炔基基团包括含有2至8个碳原子的、具有至少一个三键的直链、支链和环状烃链，并且术语包括但不限于取代基，所述取代基例如，乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、4-甲氧基戊-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、3,3-二甲基丁-1-炔基，等等。

本文使用的术语“酰胺基”是指通过羰基或磺酰基基团连接至母体分子部分的如下所述的氨基基团。本文使用的术语“C-酰胺基”是指具有本文定义的R的-C(＝O)-NR2基团。本文使用的术语“N-酰胺基”是指具有本文定义的R的RC(＝O)NH-基团。

本文使用的术语“氨基”是指-NRR’，其中，R和R’独立地选自下列基团：氢、烯基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基、烷基羰基、芳基、芳基烯基、芳基烷基、环烷基、卤代烷基羰基、杂芳基、杂芳基烯基、杂芳基烷基、杂环、杂环烯基或杂环烷基，其中，所述芳基、所述芳基烯基和芳基烷基中的芳基部分、所述杂芳基、所述杂芳基烯基和所述杂芳基烷基中的杂芳基部分、所述杂环以及所述杂环烯基和杂环烷基中的杂环部分可被一个、两个、三个、四个或五个取代基任选地取代，所述取代基独立地选自下列基团：烯基、烷氧基、烷氧基烷基、烷基、氰基、卤素、卤代烷氧基、卤代烷基、羟基、羟基烷基、硝基或氧。

本文使用的术语“氨基烷基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的氨基基团。例子包括氨基甲基、氨基乙基和氨基丁基。术语“烷基氨基”是指已被一个或两个烷基基团取代的氨基基团。合适的“烷基氨基”基团可为单烷基化形成的基团或双烷基化形成的基团，例如，N-甲基氨基、N-乙基氨基、N,N-二甲基氨基、N,N-二乙基氨基，等等。

本文使用的术语“氨基羰基”和“氨基甲酰基”是指氨基取代的羰基基团，其中，氨基基团可为含有取代基的初级或二级氨基基团，所述取代基选自下列基团：烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基，等等。

本文使用的术语“氨基羰基烷基”是指如上所述的连接至烷基基团的氨基羰基基团。这些基团的例子为氨基羰基甲基。术语“脒基”是指-C(NH)NH2基团。术语“氰基脒基”是指-C(N-CN)NH2基团。

本文使用的术语“芳烯基”或“芳基烯基”是指通过烯基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳烷氧基”或“芳基烷氧基”是指通过烷氧基连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳烷基氨基”或“芳基烷基氨基”是指通过氮原子连接至母体分子部分的芳基烷基基团，其中，所述氮原子被氢取代。

本文使用的术语“芳亚烷基”或“芳基亚烷基”是指通过亚烷基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳烷硫基”或“芳基烷硫基”是指通过硫原子连接至母体分子部分的芳基烷基基团。

本文使用的术语“芳炔基”或“芳基炔基”是指通过炔基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳烷氧基羰基”是指通式芳烷基-O-C(O)-的基团，其中，术语“芳烷基”具有上述含义。芳烷氧基羰基基团的例子为苄氧基羰基(“Z”或“Cbz”)和4-甲氧基苯基甲氧基羰基(“MOS”)。

本文使用的术语“芳烷酰基”是指从芳基取代的烷烃羧酸得到的酰基基团，例如，苯甲酰基、苯基乙酰基、3-苯基丙酰基(苯丙酰基)、4-苯基丁酰基、(2-萘基)乙酰基、4-氯代苯丙酰基、4-氨基苯丙酰基、4-甲氧基苯丙酰基，等等。术语“芳酰基”是指从芳基羧酸得到的酰基基团，“芳基”具有下面给出的含义。这些芳酰基基团的例子包括取代的或未取代的苯甲酰基或萘甲酰基，例如，苯甲酰基、4-氯代苯甲酰基、4-羧基苯甲酰基、4-(苄氧基羰基)苯甲酰基、1-萘甲酰基、2-萘甲酰基、6-羧基-2-萘甲酰基、6-(苄氧基羰基)-2-萘甲酰基、3-苄氧基-2-萘甲酰基、3-羟基-2-萘甲酰基、3-(苄氧基甲酰胺基)-2-萘甲酰基，等等。

本文使用的术语“芳基”是指含有一个、两个或三个环的碳环芳香族体系，其中，这些环可以悬挂的方式连接在一起或可被稠合。术语“芳基”包括诸如苯基、萘基、蒽基、菲基和联苯基之类的芳香族基团。本发明的芳基基团可被一个、两个、三个、四个或五个取代基任选地取代，所述取代基独立地选自本文所定义的基团。

本文使用的术语“芳基氨基”是指通过氨基基团连接至母体部分的芳基基团，例如，N-苯基氨基，等等。

本文使用的术语“芳基羰基”和“芳酰基”是指通过羰基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳基磺酰基”是指通过磺酰基基团连接至母体分子部分的芳基基团。

本文使用的术语“芳硫基”是指通过硫原子连接至母体分子部分的芳基基团。

术语“羧基(carboxy或carboxyl)”无论单独使用或与其他术语(例如，“羧基烷基”)一同使用是指-CO2H。

本文使用的术语“苯并”和“苯”是指从苯得到的二价基团C6H4＝。例子包括苯并噻吩和苯并咪唑。

本文使用的术语“氨基甲酰氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的氨基取代的羰基基团(例如，RR’NC(＝O)O-)，其中，所述氨基基团可以为含有取代基的初级氨基或二级氨基基团，所述取代基选自下列基团：烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基，等等。

本文使用的术语“O-氨基甲酰基”是指具有本文所定义的R的-OC(O)NR基团。

本文使用的术语“C-连接的”是指通过碳碳键连接至母体分子部分的任何取代基。

本文使用的术语“N-氨基甲酰基”是指具有本文所定义的R的ROC(O)NH-基团。

本文使用的术语“碳酸酯”是指具有本文所定义的R的-O-C(＝O)OR基团。

本文使用的术语“羰基”当单独使用时包括甲酰基[-C(O)H]，并且当结合使用时为-C(O)-基团。

本文使用的术语“羧基”是指-C(O)OH或相应的“羧酸酯”，例如羧酸盐衍生物或羧酸酯衍生物。“O-羧基”基团是指RC(O)O-基团，其中，R是如本文所定义的。“C-羧基”基团是指-C(O)OR基团，其中，R是如本文所定义的。

本文使用的术语“氰基”是指-CN基团。

本文使用的术语“环烷基”是指饱和或部分饱和的单环、双环或三环烷基基团，其中，每个环状基团含有3至12个，优选地含有3至7个碳原子环成员，并且所述饱和或部分饱和的单环、双环或三环烷基基团可任选地为苯并稠环体系，如本文所定义的，该苯并稠环体系被任选地取代。这些环烷基基团的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、八氢萘基、2,3-二氢-1H-茚基、金刚烷基，等等。本文使用的术语“双环”和“三环”意在包括诸如十氢萘、八氢萘之类的稠环体系以及饱和类型或部分不饱和类型的多环(多中心)。后一类型的异构体一般通过双环[2.2.2]辛烷，双环[2.2.2]辛烷、双环[1.1.1]戊烷、樟脑和双环[3.2.1]辛烷来举例说明。

本文使用的术语“环烯基”是指部分不饱和的单环、双环或三环基团，其中，每个环状基团含有3至12个，优选地含有5至8个碳原子环成员并且所述部分不饱和的单环、双环或三环基团可任选地为苯并稠环体系，如本文所定义的，所述苯并稠环体系被任选地取代。这些环烯基基团的例子包括环戊烯基、环己烯基、环己二烯基、环庚烯基、环辛二烯基、-1H-茚基，等等。

本文使用的术语“环烷基烷基”是指被如上所定义的环烷基基团取代的如上所定义的烷基基团。这些环烷基烷基基团的例子包括环丙基甲基、环丁基甲基、环戊基甲基、环己基甲基、1-环戊基乙基、1-环己基乙基、2-环戊基乙基、2-环己基乙基、环丁基丙基、环戊基丙基、环己基丁基，等等。

本文使用的术语“环烯基烷基”是指被如上所定义的环烯基基团取代的如上所定义的烷基基团。这些环烯基烷基基团的例子包括1-甲基环己-1-烯基-、4-乙基环己-1-烯基-、1-丁基环戊-1-烯基-、3-甲基环戊-1-烯基-，等等。

本文使用的术语“酯”是指在碳原子处桥接两个基团的羰基氧-(C＝O)O-基团。例子包括乙基苯甲酸酯、n-丁基肉桂酸酯、苯基乙酸酯，等等。

本文使用的术语“醚”是指在碳原子处桥接两个基团的氧。

本文使用的术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

本文使用的术语“卤代烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的卤代烷基基团。

本文使用的术语“卤代烷基”是指其中一个或一个以上氢被卤素取代的具有如上所定义的含义的烷基基团。具体包括单卤代烷基、双卤代烷基、全卤代烷基和多卤代烷基基团。例如，单卤代烷基基团中可具有碘、溴、氯或氟原子中的任一个。双卤代和多卤代烷基基团可具有两个或两个以上相同的卤素原子或不同的卤素原子的组合。卤代烷基基团的例子包括：氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯代甲基、二氯甲基、三氯甲基、三氯乙基、五氟乙基、七氟丙基、二氟氯甲基、二氯氟甲基、二氟乙基、二氟丙基、二氯乙基和二氯丙基。“卤代烯基”是指在两个或两个以上位置连接的卤代烃基基团。例子包括氟代亚甲基(-CHF-)、二氟亚甲基(-CF2-)、氯代亚甲基(-CHCl-)，等等。这些卤代烷基基团的例子包括氯代甲基、1-溴乙基、氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、1,1,1-三氟乙基、全氟代癸基，等等。

本文使用的术语“杂烷基”是指完全饱和的或含有1至3个不饱和度的、由所声明的数目的碳原子和1至3个选自O、N和S的杂原子构成的、稳定的直链或支链或环状烃基团或其组合，并且，其中，氮原子和硫原子可被任选地氧化并且氮杂原子可被任选地季铵化。杂原子O、N和S可被置于杂烷基基团的任何内部位置。多达两个杂原子可以是连续的，例如，-CH2-NH-OCH3。

本文使用的术语“杂芳基”是指芳香族五元或六元环，在该芳香族五元或六元环中，至少一个原子选自N、O或S，并且剩余的环原子为碳。五元环具有两个双键，六元环具有三个双键。杂芳基基团通过环内可取代的碳原子或氮原子连接至母体分子基团。术语“杂芳基”还包括其中杂芳环稠合至本文所定义的芳基基团、本文所定义的杂环基或其他杂芳基基团的体系。杂芳基通过下列基团来举例说明，所述基团为：苯并噻吩基、苯并恶唑基、苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、噌啉基、呋喃基、咪唑基、三唑基[例如，4H-1,2,4-三唑基、1H-1,2,3-三唑基、2H-1,2,3-三唑基，等等]、四唑基[例如，1H-四唑基、2H-四唑基，等等]、吲唑基、吲哚基、异恶唑基、异喹啉基、异噻唑基、萘啶基、恶二唑基[例如，1,2,4-恶二唑基，1,3,4-恶二唑基、1,2,5-恶二唑基，等等]、恶唑基、异恶唑基、嘌呤基、噻唑基、异噻唑基、噻吩并吡啶基、噻吩基、噻二唑基[例如，1,2,4-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基，等等]、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、吡唑基、吡咯基、吡啶并[2,3-d]嘧啶基、吡咯并[2,3-b]吡啶基、间二氮杂萘基、喹啉基、噻吩并[2,3-c]吡啶基、四唑基、三嗪基，等等。本发明的杂芳基基团可被一个、两个、三个、四个或五个取代基任选地取代，所述取代基独立地选自本文所定义的基团。

杂芳基基团的例子包括但不限于：噻吩基、苯并噻吩基、呋喃基、苯并呋喃基、二苯并呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、喹喔啉基、四唑基、恶唑基、噻唑基、三唑基和异恶唑基。

本文使用的术语“杂芳烷基”或“杂芳基烷基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文使用的术语“杂芳烯基”或“杂芳基烯基”是指通过烯基基团连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文使用的术语“杂芳烷氧基”或“杂芳基烷氧基”是指通过烷氧基基团连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文使用的术语“杂芳亚烷基”或“杂芳基亚烷基”是指通过亚烷基基团连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文使用的术语“杂芳氧基”是指通过氧原子连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文使用的术语“杂芳基磺酰基”是指通过磺酰基基团连接至母体分子部分的杂芳基基团。

本文中可互换使用的术语“杂环烷基”和“杂环基”是指含有一个或一个以上作为环成员的杂原子的饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的单环、双环或三环杂环基团，其中，每个杂原子可独立地选自氮、氧或硫，并且其中，每个环中通常具有3至8个环成员。大多数常见的杂环含有5至6个环成员。在本发明的一些实施方式中，杂环含有1至4个杂原子；在其他实施方式中，杂环含有1至2个杂原子。“杂环烷基”和“杂环”意在包括砜、亚砜、叔氮环成员的N-氧化物以及碳环稠合的和苯并稠合的环体系；此外，这两个术语还包括其中杂环与本文所定义的芳基基团或其他杂环基团稠合的体系。本发明的杂环基团通过下列基团来举例说明，所述基团为：氮杂环丙烯基、氮杂环丁烷基、1,3-苯并二氧代基(1,3-benzodioxolyl)、二氢异吲哚基、二氢异喹啉基、二氢噌啉基、二氢苯并二氧芑基(dihydrobenzodioxinyl)、二氢[1,3]恶唑并[4,5-b]吡啶基、苯并噻唑基、二氢吲哚基、二氢吡啶基、1,3-二氧六环基、1,4-二氧六环基、1,3-二氧杂环己基、异二氢吲哚基、吗啉基、哌嗪基、吡咯烷基、四氢吡啶基、哌啶基、硫代吗啉基，等等。除非明确禁止，杂环基团可被任选地取代。

本文使用的术语“杂环烯基”是指通过烯基基团连接至母体分子部分的杂环基团。

本文使用的术语“杂环烷氧基”是指通过氧原子连接至母体分子基团的杂环基团。

本文使用的术语“杂环烷基烷基”是指其中至少一个氢原子被如上定义的杂环烷基基团取代的如上所定义的烷基基团，例如，吡咯烷基甲基、四氢噻吩甲基、吡啶甲基，等等。

本文使用的术语“杂环亚烷基”是指通过亚烷基基团连接至母体分子部分的杂环基团。

本文使用的术语“肼”是指通过单键连接的两个氨基基团，即，-N-N-。

本文使用的术语“羟基(hydroxy和hydroxyl)”是指-OH基团。

本文使用的术语“羟基烷基”是指具有1至约10个碳原子且其中任一个碳原子可被一个或一个以上羟基基团取代的直链或支链烷基基团。这些基团的例子包括羟甲基、羟乙基、羟丙基、羟丁基和羟己基。

本文使用的术语“羟基烷基”是指通过烷基基团连接至母体分子部分的羟基基团。

本文使用的术语“亚氨基”是指＝N-。

本文使用的术语“亚氨基羟基”是指＝N(OH)和＝N-O-。

短语“在主链中”是指从基团与本发明的化合物连接点开始的最长连续的碳原子链或者相邻的碳原子链。

术语“异氰酸基”是指-NCO基团。

术语“异硫氰酸基”是指-NCS基团。

短语“原子的线性链”是指独立地选自碳、氮、氧和硫的原子的最长直链。

本文使用的术语“低级”(例如在术语“低级烷基”中)是指含有1个、2个、3个、4个、5个或6个碳原子。

本文使用的术语“巯基烷基”是指R'SR-基团，其中R和R'是本文所定义的。

本文使用的术语“巯基烷基硫自由基(mercaptomercaptyl)”是指RSR’S-基团，其中R是本文所定义的。

本文使用的术语“烷基硫自由基(mercaptyl)”是指RS-基团，其中R是本文所定义的。

术语“零价(null)”是指孤电子对。

本文使用的术语“硝基”是指-NO₂。

术语“任选地取代”是指在先基团可以是取代的或未取代的。“取代的”是指与碳连接的一个或一个以上氢原子被“取代基”取代。术语“任选地取代”中所包括的或涵盖的取代基为：C1-3烷基、C3-6环烷基、C1-3烷氧基、羟基、C1-3烷酰基、C1-3烷氧基羰基、卤素、苯基、苄基、苯氧基、苯甲酰基、吡啶基、氨基、C1-3烷基氨基、酰胺基、C1-3烷基酰胺基、氰基、C1-3卤代烷基和C1-3全卤代烷基。两个取代基可连接在一起形成稠合的四元、五元、六元或七元碳环或杂环，所述碳环或杂环由0至3个杂原子构成，所述取代基例如亚甲基二氧基或亚乙基二氧基。任选地取代的基团可为未取代的(例如，-CH2CH3)、完全取代的(例如，-CF2CF3)、单取代的(例如，-CH2CH2F)或以完全取代和单取代之间的任何水平取代的(例如，-CH2CF3)。当记载了取代基但未对取代进行限定时，包括了取代的和未取代的这两种形式。当取代基被限定为“取代的”时，取代的形式为特别意指的。所有悬垂的芳基、杂芳基和杂环基团可进一步由一个、两个、三个、四个或五个取代基任选地取代，所述取代基独立地选自上文列出的基团。

本文使用的术语“氧”或“氧杂”是指-O-。

本文使用的术语“氧代”是指双键连接的氧＝O。

术语“全卤代烷氧基”是指所有氢原子被卤素原子取代的烷氧基基团。

本文使用的术语“全卤代烷基”是指所有氢原子被卤素原子取代的烷基基团。

本文使用的术语“膦酸酯”是指-P(＝O)(OG)(OG1)基团，其中，G和G1选自下列基团：H、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基，等等。

本文使用的术语“亚膦酸酯”是指-P(＝O)(G)(OG1)基团，其中，G和G1选自下列基团：H、烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基，等等。

本文使用的术语“磺酸酯”“磺酸”和“磺酸基”是指-SO3H基团，并且在形成盐的过程中，-SO3H基团的阴离子作为磺酸使用。

本文使用的术语“硫烷基(sulfanyl)”是指-S和-S-。

本文使用的术语“亚磺酰基(sulfinyl)”是指-S(O)-。

本文使用的术语“磺酰基(sulfonyl)”是指-SO2-。

术语“N-磺酰胺基”是指具有本文所定义的R的RS(＝O)2NH-基团。

术语“S-磺酰胺基”是指具有本文所定义的R的-S(＝O)2NR2基团。

本文使用的术语“硫杂(thia)”和“硫代(thio)”是指-S-基团或其中氧被硫取代的醚。硫代基团的氧化衍生物(即亚磺酰基和磺酰基)被包括在硫杂和硫代的定义之中。

本文使用的术语“硫醚”是指在碳原子处桥接两个部分的硫代基团。

本文使用的术语“硫醇”是指-SH基团。

本文使用的术语“硫羰基”，当单独使用时包括硫醛基-C(S)H，当组合使用时是-C(S)-基团。

术语“N-硫代氨基甲酰基”是指具有本文所定义的R的ROC(S)NH-基团。

术语“O-硫代氨基甲酰基”是指具有本文所定义的R的-OC(S)NR基团。

术语“硫氰酸基”是指-CNS基团。

术语“三卤代甲磺酰胺基”是指X3CS(O)2NR-基团，X是卤素，R是本文所定义的。

术语“三卤代甲磺酰基”是指X3CS(O)2-基团，其中X是卤素。

术语“三卤代甲氧基”是指X3CO-基团，其中X是卤素。

本文使用的术语“三取代甲硅烷基”是指根据取代氨基的定义，在硅基团的三个游离原子价上用本文列出的基团取代的硅基团。实例包括三甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、三苯基甲硅烷基，等等。

本文使用的术语“脲”是指具有本文所定义的R的-N(R)C(＝O)N(R)(R)。

术语“载体”以其最广的含义来使用。例如，术语载体是指任何载体、稀释剂、赋形剂、润湿剂、缓冲剂、悬浮剂、润滑剂、佐剂、介质、递送系统、乳化剂、崩解剂、吸收剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、香料和甜味剂。在一些实施方式中，载体可以为药学上可接受的载体，该术语比载体的范围更窄，因为术语“药学上可接受的载体”是指可适于在药物组合物中使用的无毒的载体。

本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体、有效量的至少一种本发明的化合物。

术语有效量以其最广的含义使用。例如，该术语是指产生期望的效果所需的量。

具体实施方式

在一种实施方式中，本发明靶定病毒红血球凝集素的成熟并且提供在与目前可使用的抗流感药物所提供的阶段不同的阶段扰乱感染性病毒颗粒的生成的机会。在另一实施方式中，本发明提供或设计了通过给药有效量的式I的化合物治疗和预防人体和其他哺乳动物体内的病毒感染的方法。一种这样的化合物是硝唑尼特(1)，在美国它是一种用于治疗感染性肠胃炎的授权生产产品，目前在美国和国外，硝唑尼特正处于治疗慢性丙型肝炎的临床实验II期。该药物已表现出是安全的和有效的，甚至当给药持续一年时也是安全的和有效的，并且临床研究II期可在未来任何时间在流感的治疗方面启动。临床实验目前已证明了商售的硝唑尼特药物制剂在治疗轮状病毒肠胃炎和慢性乙型肝炎以及慢性丙型肝炎方面的活性。

实验步骤

材料和方法

材料

将硝唑尼特(NTZ,1)、替唑尼特(TIZ,2)和噻唑化物的类似物以及参比化合物苦马豆素(SW)(Sigma-Aldrich)溶于二甲亚砜(DMSO)。将衣霉素(TM)和1-脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ)(Sigma-Aldrich)溶于水溶液中。

流感研究方法

细胞培养、处理和转染。Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞和人A549II型肺泡样上皮细胞、Jurkat T淋巴母细胞和U397单核细胞性白血病细胞在RPMI 1640(Invitrogen)中，在37℃、5％CO2大气条件下生长，RPMI 1640补充了10％胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺和抗生素。在1小时的吸附期之后立即加入测试化合物，并且保持在培养基中持续整个实验时间，除非有不同地说明。对照接收了等量的介质，所述介质不影响细胞的生存能力或病毒复制。细胞的生存能力通过先前所述的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物(MTT)至MTT甲臜的转化实验(Sigma-Aldrich)来测定。假感染的或病毒感染的细胞的显微镜检测使用Leica DM-IL显微镜进行并使用Leica Image-Manager 500软件在Leica DC 300相机上捕捉图像。

对于转染实验而言，根据生产商的说明，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)，由绿色荧光蛋白(GFP)-标记的内在化-缺陷的人低密度脂蛋白受体(hLDLR)突变体(LDLR-A18-GFP质粒，由E.Rodriguez-Boulan,Cornell University New York,NY友情提供)瞬时转染接种在LabTekII盖玻片腔室(Nunch-Thermo Fisher Scientific Inc.)中的MDCK细胞。

病毒的制备、感染和滴定。在该研究中使用四种不同的A型流感病毒(哺乳动物H1N1A/PR/8/34(PR8)和A/WSN/33(WSN))以及H3N2A/Firenze/7/03(A/FI)、H5N9低致病性禽类毒株A/Ck/It/9097/97(A/Ck))和B型流感病毒(B/Parma/3/04临床分离株)。A/Firenze/7/03、A/Ck/It/9097/97和B/Parma/3/04流感病毒由Dr.Isabella Donatelli,IstitutoSuperiore di Sanita’,Rome,Italy友情提供。在初步将鸡的器官匀浆递送至10日龄的无特定病原体(SPF)的含胚胎的鸡蛋中之后分离禽类毒株A/Ck/It/9097/97。A型流感病毒在8日龄的含胚胎的鸡蛋的尿囊腔中生长。在37℃下，48小时之后，根据标准步骤，收获尿囊液并以5000rpm的速度离心30分钟，从而除去细胞碎片，并且通过红血球凝集素滴定和噬菌斑法确定病毒滴度。除非有不同地说明，在37℃条件下，流感病毒以5HAU/105个细胞的感染复数(m.o.i.)感染汇合的细胞单层1小时。在吸附期(时间0)之后，除去病毒接种体，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞单层三次。在37℃下，将细胞保持在含有2％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。对于多步病毒生长曲线而言，在含有1μg/ml胰蛋白酶IX(Sigma-Aldrich)的相同培养基中培养感染的细胞。在感染后(p.i.)24小时或48小时通过红血球凝集素滴定测定病毒产量。对于PR8病毒感染性分析而言，在37℃，在1μg/ml胰蛋白酶存在持续48小时的条件下，将在96孔平板上生长的MDCK细胞接种于连续稀释的病毒悬浮液，并且如所描述的测定TCID50(50％组织培养物感染剂量)。可选地，通过在感染和用抗流感A/PR/8/34抗体(抗-PR8,E.Rodriguez-Boulan,Cornell University New York,NY友情提供)间接免疫荧光染色之后进行荧光细胞计数来测定MDCK细胞上的病毒滴度。滴度相应地表示为ffu(荧光形成单位)/ml。

代谢标记、蛋白合成分析和蛋白质印迹分析。在无蛋氨酸/半胱氨酸的培养基中饥饿30分钟后，用10μCi/ml的[35S]-蛋氨酸-半胱氨酸([35S]-Met/Cys，Redivue Pro-Mix35S体外细胞标记混合物；GE Healthcare)对假感染的或流感病毒感染的细胞进行标记持续指明的时间段。对于脉冲/追踪实验而言，在无蛋氨酸/半胱氨酸的培养基中饥饿30分钟后，用[35S]-Met/Cys(100μCi/ml)对细胞进行标记持续15分钟。在脉冲结束时，在存在或不存在TIZ的条件下，在含有10mM冷的蛋氨酸和1mM环己酰亚胺的完全培养基中追踪细胞持续不同的时间。脉冲/追踪通过将细胞置于冰上而结束。如所描述的，在RIPA缓冲液(150mMNaCl,10mM Tris-HCl pH 7.5,4mM EDTA,1％Triton X-100,600mM KCl)中裂解细胞之后，通过SDS/PAGE(3％浓缩胶，10％分离胶)分离含有相同量的放射性的样品并进行自动放射线照相术分析，所述RIPA缓冲液含有1mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物(PIC；Roche Diagnostics GmbH)。自动放射线照相术分析的图像在Typhoon-8600成像器(Molecular Dynamics,Amersham Pharmacia Biotech)中被可视化和定量，并且使用ImageQuant软件(Amersham Pharmacia Biotech)来获取图像(MDP分析)。

对于掺入病毒颗粒中的蛋白质的分析而言，在感染后3小时，在存在药物的条件下，用[35S]-Met/Cys对在病毒吸附之后用TIZ，TM或介质处理的PR-8感染的或假感染的MDCK细胞进行标记(25μCi/ml，21小时脉冲)。在感染后24小时，收获细胞培养物上清液并以13,000rpm的速度离心10分钟，从而除去细胞碎片，然后以45,000rpm的速度超速离心(Beckman XL-100K Ultracentrifuge,转子70.1Ti；Beckman Coulter Inc.)持续2小时。将含有病毒颗粒的小粒悬浮在Laemmli样品缓冲液中，放射性标记的病毒蛋白质通过10％SDS-PAGE分离且在暴露于Amplify^TM荧光照相试剂(Amplify^TM Fluorographic Reagent,GEHealthcare)之后通过自动放射线照相术检测。如上所述，使自动放射线图像可视化。

对于蛋白质印迹分析而言，用冷的高盐提取(HSB)缓冲液或RIPA缓冲液裂解细胞，所述高盐萃取(HSB)缓冲液含有2mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM PMSF、1mM原钒酸盐、20mMβ-甘油磷酸酯、1mM p-硝基苯基磷酸酯(pNPP)和PIC，所述RIPA缓冲液含有1mM PMSF和PIC。全细胞提取物(30μg)通过SDS-PAGE分离，使之在硝酸纤维素上形成印迹，并且使过滤器与多克隆抗-二氧磷基Ser51-eIF2α(p-eIF2α,Calbiochem)抗体、抗-eIF2α(FL-315,Santa CruzBiotechnology)抗体和抗流感A/PR/8/34抗体或单克隆抗-HA(IVC102；Biodesign Inc.)抗体和抗-Grp78/BiP(Stressgene)抗体一同孵育，接着用过氧化物酶标记的抗兔IgG或抗小鼠IgG(超级信号检测试剂盒；Pierce)修饰。蛋白质的定量评价使用Quantity One软件程序，通过Versadoc-1000分析来测定，所述Quantity One软件程序由BIO-RAD实验室提供。

HA0的免疫沉淀。在无蛋氨酸/半胱氨酸培养基中饥饿30分钟之后，在感染后5小时或6小时，用[35S]-Met/Cys对病毒吸附后用10μg/ml TIZ或对照稀释液处理的PR8-感染的或假感染的MDCK细胞进行标记(70μCi/ml，4小时脉冲)。在存在PIC和1mM PMSF的条件下，在RIPA缓冲液中裂解之后，细胞碎片通过以13,000rpm的速度冷离心10分钟除去。在4℃下，放射性标记的裂解液(50μl)与抗-HA单克隆抗体(IVC102；Biodesign Inc.)在RIPA缓冲液中一同孵育16小时，所述RIPA缓冲液含有1mM PMSF、PIC和蛋白质-A-琼脂糖(Sigma-Aldrich)。离心之后，用RIPA缓冲液洗涤小粒3次，并在95℃下，在Laemmli样品缓冲液(20)中洗提小粒5分钟。免疫沉淀的样品进行Endo-H酶切(如下所述)和/或进行SDS/PAGE(3％浓缩胶，10％分离胶)并在暴露于Amplify^TM荧光照相试剂之后进行自动放射线照相术分析。如上所述，使自动放射线图像在Typhoon-8600成像器中可视化并且获取图像。

红血球凝集素糖基化的分析、三聚化和加工分析。在感染后6小时，用20μCi/ml的[3H]甘露糖或[3H]葡萄糖胺盐酸盐(GE Healthcare)对假感染的或流感病毒感染的细胞进行标记持续4小时，然后如上所述，进行SDS/PAGE(3％浓缩胶，10％分离胶)和自动放射线照相术分析。对于糖类内切酶消化实验而言，用PR8流感病毒感染MDCK细胞，洗去游离的未结合的病毒，并在存在或不存在10μg/ml TIZ的条件下培养MDCK细胞。感染后5小时，在无蛋氨酸/半胱氨酸培养基中饥饿30分钟之后，用[35S]-Met/Cys对细胞进行标记(50μCi/ml，4小时脉冲)。在脉冲结束时，除去放射性培养基并将细胞置于冰上。在存在PIC和1mM PMSF的条件下，在L缓冲液(100mM NaCl、10mM Tris-HCl pH 7.5、5mM EDTA、1％Triton X-100、0.1％SDS)中进行裂解并以13,000rpm的速度离心10分钟之后，对样品进行糖类内切酶H(Endo-H)消化或肽N-糖苷酶F(PNGase-F)消化，所述样品含有相同量的放射性。对于Endo-H消化而言，在0.1％SDS和140mMβ-巯基乙醇的100mM柠檬酸钠(pH 5.5)的100μl溶液中孵育用抗-HA单克隆抗体免疫沉淀的(如上所述的)样品或非免疫沉淀的样品并在95℃下加热5分钟。在加入1mM PMSF和PIC之后，将样品分为两等份，一份在37℃下用5mU Endo-H(RocheDiagnostics GmbH)孵育16小时。根据生产商的规程(New England BioLabs Inc.)，用500U的PNGase-F进行肽N-糖苷酶消化。通过加入Laemmli样品缓冲液终止消化。将样品在95℃下加热5分钟，接着上样至10％SDS-PAGE凝胶。对于三聚体形成的分析而言，HA的交联通过将体积比为1:10的含有0.2mM EGS[乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)；Pierce]的DMSO加至假感染的和PR8感染的MDCK细胞的全细胞提取物中来进行。在22℃条件下，15分钟后，通过加入最终浓度为75mM的甘氨酸来淬灭反应，并且对样品进行SDS-PAGE(6％分离胶)。HA交联的产物通过用单克隆抗HA抗体或多克隆抗PR8标记而可视化。

免疫荧光显微镜检查。在感染后16小时或24小时，在室温下，用4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水分别将在盖玻片上生长的PR8-感染的MDCK细胞和WSN-感染的A549细胞固定20分钟。对假感染的细胞进行类似的操作。37℃下，将固定的细胞与抗HA-单克隆抗体(IVC102；Biodesign Inc.)一同孵育1小时用于质膜染色或者在室温下用0.1％TritonX100-PBS渗透固定的细胞10分钟，然后在37℃下，与单克隆抗-HA和抗-p230反式高尔基体(克隆15；BD Biosciences)或多克隆抗α-微管蛋白(11H10；Cell Signaling，Technology Inc.)抗体一同孵育1小时，接着用Alexa Fluor488-结合的(MolecularProbes-Invitrogen)或罗丹明结合的(Pierce)山羊抗小鼠IgG和罗丹明-结合的山羊抗兔IgG(Pierce)修饰。细胞核用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或Hoechst 33342(MolecularProbes,Invitrogen)染色。使用SoftWoRx-2.50软件(Applied-Precision)，由DeltaVision显微镜(Applied-Precision)捕捉图像并对图像进行去卷积处理。对照培养物未表现出抗免疫球蛋白结合物之间的交叉反应性或抗免疫球蛋白结合物和非相关一抗之间的交叉反应性。显示了具有类似结果的三个实验中的代表性实验的图像。

对于检测人低密度脂蛋白受体(hLDLR)的质膜靶定而言，用GFP标记的内在化缺陷hLDLR突变体(LDLR-A18-GFP质粒)瞬时转染接种在盖玻片腔室中的MDCK细胞，8小时后，用TIZ(10μg/ml)或介质处理16小时。在用100μg/ml环己酰亚胺(Sigma-Aldrich)阻断蛋白合成1小时之后，使用CellMaskTM橙色质膜染料(Molecular Probes,Invitrogen)对质膜进行染色。染色之后，使用装配有UV激发滤光片的Leica DM-IL荧光显微镜检查细胞。使用LeicaImage-Manager 500软件，由Leica DC-300照相机捕捉图像。

血细胞吸附分析。在病毒吸附之后，用TIZ、TM或介质处理假感染的或PR8感染的MDCK细胞单层。感染后5小时，用PBS洗涤细胞三次，并在4℃下，用0.1％人红细胞(RBC)的PBS溶液孵育20分钟，从而抑制神经氨糖酸苷酶的活性。通过用PBS洗涤三次除去未结合的红血球之后，吸附于MDCK细胞表面的RBC通过相差显微镜检测。使用Leica Image-Manager500软件，由装配有Leica DC300照相机的Leica DMLB显微镜来捕捉图像。室温下，粘附的红血球在150mM NH4Cl缓冲液中裂解2小时，并且通过测量在λ＝540nm处的血红蛋白的吸光率进行定量。

统计学分析。未成对的数据的统计学分析使用Student t检测进行。数据表示为重复样品的平均值+S.D.。P值小于0.05被认为是显著性的。

结果

噻唑化物针对A型流感病毒的不同毒株的抗病毒活性。在用下列A型流感病毒的四种不同的毒株感染之后，测试了人类细胞和犬细胞中噻唑化物的治疗效果，所述四种不同的毒株为：哺乳动物H1N1A/PR/8/34(PR8)和A/WSN/33(WSN)、H3N2A/Firenze/7/03(A/FI)病毒以及H5N9低致病性禽类毒株A/Ck/It/9097/97(A/Ck)。在病毒吸附期之后，立即用不同浓度的NTZ、TIZ或介质处理PR8、WSN或A/Ck流感病毒感染的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞，在感染后(p.i.)24小时测定病毒产量。NTZ处理导致以剂量依赖的方式抑制病毒复制，NTZ对PR8、WSN和A/Ck病毒的EC50分别为1μg/ml、0.5μg/ml和1μg/ml(图1B)。同样地，TIZ对所有A型流感病毒具有活性，TIZ对PR8的EC50为1μg/ml并且对WSN和A/Ck的EC50为0.5μg/ml(图1B)。TIZ在抑制H3N2 A/FI A型流感病毒和B/Parma/3/04B型流感病毒的复制方面也非常有效(图10和图11)。NTZ和TIZ在有效抗病毒浓度条件下对未感染的细胞均无毒性(CC50>50μg/ml)。除了通常用于流感病毒研究的犬MDCK细胞之外，TIZ在亚微摩尔非毒性浓度条件下抑制不同类型的人类细胞中的A型流感病毒的复制方面有效(EC50＝0.3μg/ml)，所述不同类型的人类细胞包括单核细胞U937、T淋巴细胞Jurkat和II型肺泡样A549细胞(图1C)。TIZ的抗病毒活性不依赖于感染的m.o.i.并且在多步病毒生长和单步骤病毒生长条件下同样检测到显著阻断H1N1PR8病毒复制(图10C，D)。若干个噻唑化物针对PR8A型流感病毒的抗病毒活性在表1中总结。发现在所测试的噻唑化物中NTZ(1)、TIZ(1)、替唑尼特钠盐(3)、化合物14-16、27、28、36和37是有效的且是选择性的。化合物27和28是高选择性的并且效力比NTZ和TIZ大10倍，化合物27和28的EC50＝0.1μg/ml且CC50>50μg/ml。

表1表示A型流感细胞分析中的噻唑化物的数据。

表1.A型流感细胞分析结果(PR8、MDCK细胞)。

噻唑化物在进入后水平(post-entry level)条件下起作用。为了检测在病毒吸附之前噻唑化物处理是否可保护宿主细胞不受病毒感染，用10μg/ml的TIZ处理MDCK细胞12小时、6小时或3小时。在所标明的时间除去药物，洗涤细胞单层三次，接着用PR8病毒感染。如图1D(pre)所示，病毒感染之前替唑尼特(2)预处理细胞长达12小时对流感病毒的复制没有影响。而且，仅仅在吸附期处理病毒接种体(数据未显示)或处理细胞并不抑制病毒复制(图1D)，这说明药物不直接影响病毒感染性，也不影响病毒结合靶细胞或进入靶细胞。在感染后0小时至3小时开始的TIZ处理在抑制病毒复制方面最有效(图1D，post)。在感染后6小时开始的处理有效性较低，但是仍然能够抑制病毒复制，然而当感染后12小时给药时，药物无效。病毒吸附之后的单独给药在感染后至少48小时抑制病毒复制方面有效(图1E)。

噻唑化物选择性改变病毒红血球凝集素的成熟。为了检测噻唑化物的抗流感活性是否由蛋白合成的改变引起，在感染后不同的时间，用[35S]-蛋氨酸-半胱氨酸([35S]-Met/Cys)对病毒吸附后不久由TIZ处理的假感染的或PR8感染的细胞进行标记，并且通过SDS/PAGE和自动放射线照相术分析或蛋白印迹分析对蛋白质进行分析。如图2A所示，TIZ不抑制宿主蛋白合成(下部)，也没有引起合成的多肽的电泳图像发生可检测的改变(上部)；此外，TIZ不影响未感染的或PR8-感染的细胞中的真核起始因子2α(eIF2-α)的磷酸化作用(中部)。发现主要的流感病毒蛋白在感染后4小时在未处理的细胞中开始大量合成；除了大约79kDa摩尔重量(mol.wt.)的条带消失之外，在处理的细胞中没有检测到流感病毒蛋白合成的重大变化，随后鉴定出所述条带为红血球凝集素前体的成熟同等型并且与出现较快迁移的74kDa条带同时出现(图2A)。

为了测定TIZ处理是否选择性改变HA合成，在感染后5小时，通过代谢对由TIZ(10μg/ml)处理的假感染的或PR8感染的MDCK细胞进行标记(4小时脉冲)并且放射性标记的蛋白用抗红血球凝集素单克隆抗体进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE和自动放射线照相术分析。图2B中显示的数据识别出由TIZ改变电泳迁移性的蛋白为病毒HA0前体。为了测定TIZ诱导的HA0修饰是否为暂时的，在感染后3小时，通过代谢方法对由TIZ(10μg/ml)处理的或N-糖基化抑制剂衣霉素(TM，5μg/ml)处理的假感染的或PR8感染的MDCK细胞进行标记持续接下来的15小时，通过SDS/PAGE和自动放射线照相术对蛋白质进行分析。可选地，在感染后5小时对PR8-感染的细胞进行标记，然后在存在10mM冷蛋氨酸和1mM环己酰亚胺的条件下追踪感染后接下来的3小时。如图2C所示，如两种形式的HA0的不同电泳迁移图所显示的，TIZ诱导的HA0翻译后修饰在感染后18小时仍然是明显的并且看起来不同于TM诱导的改变，此外，TM导致HA0累积的降低，如前所述，延长TIZ处理没有降低感染的细胞中的细胞内HA0水平。与TM不同，TIZ没有诱导MDCK细胞中的葡萄糖调节的应激蛋白Grp78/BiP(未折叠的蛋白反应的标记)的表达(图2C)。追踪实验的结果表明在未处理的细胞中，在合成后10分钟至20分钟HA0达到成熟的79kDa形式，然而，在存在TIZ的条件下，较慢迁移的74kDa形式在合成后较晚的时间(30分钟)开始出现(图2D)，并且在接下来的2.5小时中，电泳迁移性没有可检测的进一步变化(数据未显示)。

为了检测TIZ是否正在抑制HA0糖基化，在病毒吸附后，由TIZ或衣霉素处理PR8-感染的细胞，并且在感染后6小时，用[35S]-Met/Cys、[3H]-葡糖胺或[3H]-甘露糖进行标记。如图3A所示，TM完全阻止HA0糖基化，用TIZ处理没有降低葡糖胺并且实际上增强了将甘露糖掺入未成熟的HA0形式中。然而，与在用两种抑制剂处理的细胞中存在的HA0形式相比较，如由TIZ诱导的未成熟的HA0的不同的电泳迁移性所表示的，噻唑化物看起来起到不同于α-甘露糖苷酶I的抑制剂(1-脱氧甘露糖野尻霉素)和α-甘露糖苷酶II的抑制剂(苦马豆素)的作用(图3B)。

已知HA的成熟受到宿主细胞糖基化作用机理和病毒毒株这两者的影响。为了测定所述的HA0的改变对PR8病毒是否是特异性的或者是否是依赖细胞的，用A型流感人类WSN毒株感染人类肺上皮A549细胞，而用禽类A/Ck毒株感染MDCK细胞。在这两种情况下，检测到从HA0的成熟类似物至PR8毒株的所描述的HA0成熟类似物的改变(图3C和图3D)，这说明TIZ能够抑制HA0成熟，不依赖于宿主细胞的类型和A型流感毒株的类型。最后，如图3E和图3F所示，硝唑尼特导致人类流感病毒红血球凝集素(E)和禽类流感病毒红血球凝集素(F)中的类似改变。

替唑尼特抑制将HA运输至细胞膜并且阻止病毒离开宿主细胞。与其他细胞表面糖蛋白类似，添加“高甘露糖”低聚糖的HA的糖基化作用在ER中开始。在输送至细胞表面的过程中，富含甘露糖的糖成分在高尔基体结构中加工并且末端糖基化作用发生在高尔基体结构的反面潴泡内。为了检测TIZ是否可影响HA0穿过高尔基体，用内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶H(Endo-H)或肽N-糖苷酶F(PNGase-F)对等份的放射性标记的蛋白和HA0免疫沉淀的样品进行消化，所述内切-β-N-乙酰基氨基葡糖苷酶H(Endo-H)是除去了末端未糖基化的N-连接的糖链的酶，所述N-糖苷酶F(PNGase-F)除去了所有N-聚糖。如所预期的，两种形式的蛋白均对PNGase-F的消化敏感，然而，对照细胞中的HA0进行了末端糖基化，变成了Endo-H抗性的，合成之后，TIZ处理的细胞中的HA0对蛋白酶消化保持敏感长达四小时(图4A和图4B)。如图4C所示，TIZ诱导的改变没有阻止HA0形成三聚体的能力。

因为Endo-H抗性的获得是运输到顺面和中间高尔基体膜囊中的标记，这些结果表明TIZ诱导的改变可阻断ER和高尔基复合体之间的HA0运输，这阻止了将HA0运输至质膜。对运输至反面高尔基体膜囊的抑制实际上通过免疫荧光，使用特异性反面高尔基体抗体来检测(图4D)。为了确定TIZ处理抑制将HA运输至阻止成熟病毒颗粒离开的宿主细胞质膜，在病毒吸附之后，用TIZ(10μg/ml)或衣霉素(5μg/ml)处理假感染的和PR8感染的MDCK细胞，并且在感染后16小时，通过免疫荧光检测细胞质的病毒红血球凝集素水平(图5A)和质膜的病毒红血球凝集素水平(图5B)。这些研究确定了TIZ处理的细胞中的HA0细胞质水平与对照类似(图5A)，病毒蛋白的质膜水平在TIZ处理的细胞中显著下降(图5B，上部)。在TIZ处理之后，HA质膜水平的大幅度下降通过由受体结合(红细胞的血细胞吸附)分析测定的质膜合并的HA的生物功能来进一步确认(图5B，下部)。在平行研究中，在用GFP-标记的内在化缺陷人类低密度脂蛋白受体突变体(LDLR-A18-GFP质粒)瞬时转染MDCK细胞之后，发现TIZ不抑制LDLR的质膜靶定，这说明了噻唑化物的选择作用(图11)。在用不同的质膜细胞糖蛋白(人类Toll样受体-4)瞬时转染MDCK细胞和HEK-293细胞之后获得类似的结果。

在平行样品中，在感染后3小时，通过代谢的方式用[35S]-Met/Cys对假感染的和PR8感染的细胞进行标记持续接下来的21小时，纯化感染的细胞的上清液中的放射性标记的病毒粒子。通过SDS-PAGE和自动放射线照相术分析掺入病毒颗粒中的蛋白质。如图5C所示，TIZ处理的细胞的上清液中的病毒蛋白不能被检测出来。病毒颗粒的显著降低通过感染后24小时由TCID50感染性分析(图5D，上部)或HAU分析(图5D，下部)测定的平行的、未标记的样品中的病毒产量来确认。

硝唑尼特与神经氨糖酸苷酶抑制剂(扎那米韦和奥塞米韦)对PR8A型流感病毒的联合研究表现出协同活性。为了测定与临床流感抑制剂联合的NTZ的抗病毒活性，检测了不同浓度条件下NTZ与扎那米韦的联合以及NTZ与奥塞米韦的联合。扎那米韦和奥塞米韦是神经氨糖酸苷酶(NA)抑制剂，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂减弱了受感染的宿主细胞中病毒的高效释放并且所述神经氨糖酸苷酶抑制剂通过与噻唑化物明显不同的机理起作用。

用哺乳动物H1N1A/PR/8/34(PR8)病毒感染之后，在犬细胞中测试NTZ和扎那米韦联合处理的效果。在病毒吸附期之后，立即用不同浓度的NTZ、扎那米韦或介质处理用PR8流感病毒感染的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞，并且在感染后(p.i.)24小时测定病毒产量。

在各自的研究中，NTZ处理导致以剂量依赖的方式抑制病毒复制，NTZ对PR8病毒的EC50为1μg/ml(3.3M)(图1B)。下表2总结了联合实验的抗病毒数据。活性表示为相对于未处理的对照的HAU/ml的降低。在具有扎那米韦的实验中，NTZ看起来比先前的研究略微更加有效并且EC50为约0.66μg/ml(约2.2μM)。仅仅在1μM的最高测试浓度条件下，单独的扎那米韦使病毒产量降低(抑制)50％，因此，可以确定在这些实验条件下扎那米韦的EC50为1μM(图6和图7左侧)。1μM的扎那米韦与0.1μg/ml(0.33μM)的NTZ的联合导致病毒复制相对于未处理的对照降低了83％，并且对应于效力提高大约3倍(相对于用扎那米韦单独处理)(图6右侧)。

表2.NTZ和扎那米韦的联合的抗流感活性

PR8产量：HAU/ml

在0.1μM条件下，用扎那米韦单独处理对病毒复制没有影响(图7，左侧)。然而，0.1μM的扎那米韦与1.0μg/ml(3.3μM)的NTZ的联合使病毒的复制相对于用NTZ单独处理进一步降低50％(图7，右侧)。这些结果对应于效力相对于用扎那米韦单独处理提高约6倍以及效力相对于用NTZ单独处理提高2倍。1.0μM的扎那米韦和1.0g/ml(3.3μM)的NTZ的联合导致病毒复制相对于用NTZ单独处理降低了94％(图7，右侧)。这些结果对应于效力相对于用扎那米韦单独处理提高了约24倍和效力相对于用NTZ单独处理提高了16倍。总而言之，这些结果表明扎那米韦和NTZ联合的抗病毒活性对PR8A型流感病毒起协同作用。

以类似的方式，用哺乳动物H1N1A/PR/8/34(PR8)病毒感染之后，在犬细胞中测试NTZ和奥塞米韦联合的处理效果。在病毒吸附期之后，立即用不同浓度的NTZ、奥塞米韦或介质处理PR8流感病毒感染的Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞，并且在感染后(p.i.)24小时测定病毒产量。

在这些实验中，NTZ表现出EC50为1μg/ml(3.3μM)。在测试浓度高达1μM的条件下，没有观察到单独使用奥塞米韦使病毒产量下降(抑制)，因此，没有测定奥塞米韦的EC50(图8和图9，左侧)。1μM的奥塞米韦和0.1μg/ml(0.33μM)的NTZ的联合导致病毒复制下降33％，对应于效力相对于用奥塞米韦单独处理或用NTZ单独处理增加了1.5倍(图8，右侧)。注意到NTZ的剂量为其确立的EC50的十分之一。

1.0μM的奥塞米韦和1.0μg/ml(3.3μM)的NTZ的联合使得病毒复制相对于用奥塞米韦单独处理降低了67％并且使病毒复制相对于用NTZ单独处理降低了33％(图9，右侧)。这些结果对应于效力相对于用奥塞米韦单独处理提高了大约3倍，以及效力相对于用NTZ单独处理提高了1.5倍。总而言之，这些结果说明奥塞米韦和NTZ的联合对PR8A型流感病毒的抗病毒活性是介于加和和协同之间的。

若干生物化学方法的结果显示在抗糖类内切酶-H消化之前的阶段TIZ阻断HA末端糖基化，HA末端糖基化是运输至正面和中间高尔基体膜囊的标记。对由感染的细胞产生的病毒颗粒的免疫显微研究和分析确定了TIZ诱导的改变减弱了ER和高尔基复合体之间的HA0运输，阻止HA0运输和插入宿主细胞质膜，并且阻断成熟的病毒粒子离开宿主细胞。HA成熟的改变是由TIZ与病毒糖蛋白直接结合引起的还是由细胞介导的作用引起的，这还有待确认。

先前已表明噻唑化物具有针对两种不同的RNA病毒(丙型肝炎病毒(HCV，正链RNA病毒)和轮状病毒(双链RNA病毒)以及DNA病毒(乙型肝炎病毒(HBV))的抗病毒活性。广谱抗病毒活性表明细胞介导的作用而非特异性病毒靶标。目前正在研究病毒糖蛋白的成熟与针对HBV和HCV的抗病毒活性有关的可能性。目前已揭示了轮状病毒中，TIZ诱导的结构性病毒糖蛋白VP7的修饰(Santoro MG和Rossignol JF，结果未发表)，巩固了如下假设：关键病毒糖蛋白的成熟和运输可为这类新型药物的抗病毒活性的普遍机理。如下发现进一步支持了该假设：噻唑化物没有显著影响人类鼻病毒(小核糖核酸病毒)的复制，所述人类鼻病毒(小核糖核酸病毒)的成熟不需要将病毒糖蛋白运输至细胞膜。

使用了如下缩写：NTZ，硝唑尼特；TIZ，替唑尼特；EC50，50％有效浓度；CC50，50％细胞毒素浓度；HA，红血球凝集素；TM，衣霉素；Endo-H，内切-β-N乙酰氨基葡萄糖苷酶H；PNG-ase F，肽N-糖苷酶F；TCID50，50％组织培养物感染剂量；SW，苦马豆素；DMJ，1-脱氧甘露糖野尻霉素；HAU/ml，血凝单位/ml；EGS，乙二醇双(琥珀酰亚胺琥珀酸酯)。

低剂量给药诸如NTZ之类的噻唑化物治疗病毒感染。NTZ可以300mg或600mg的剂量每天两次口服给药持续5天作为对流感的治疗。临床试验显示该剂量方案能够治疗流感。优选地，硝唑尼特的剂量为300mg每天两次持续5天，该剂量小于治疗肠感染所需的NTZ的剂量，从而能够减小与较高剂量有关的副作用。噻唑化物还可作为改良的释放双层片剂给药。这样，噻唑化物可以100mg、200mg、300mg、400mg、500mg或600mg的剂量每天两次给药持续5天来治疗病毒感染。

还发现诸如硝唑尼特之类的噻唑化物针对其他呼吸道病毒具有活性。体内数据如表3所示。

表3：针对其他呼吸道病毒的活性

病毒	EC50(μg/mL)	CC50(μg/mL)
			副流感病毒	0.5	>50
冠状病毒	1.0	>50
			腺病毒	0.2	>50
呼吸道合胞病毒	0.5	>50
			鼻病毒	>10	>50

有趣地是，诸如NTZ之类的噻唑化物还能治疗患有流感样疾病(ILI)的患者。流感样疾病表现出流感症状，所述症状可能由另一病毒或病原体引起。

在患有流感样疾病的儿科患者和成人中，在症状的持续期内对硝唑尼特每天给药两次持续五天的效果进行评价。进行两组双盲安慰剂对照试验。将NTZ悬浮液给于12个月至11岁的儿童(n＝100，每组50)并且向大于等于12岁的患者给于500mg NTZ片剂(n＝86，每组43)。进行单中心试验。研究基于试验。该试验遵守特定的纳入/排除标准。需要纳入年龄为1-11岁的儿童和年龄≥12岁的、发热>100oF且具有≥1的呼吸道症状(包括咳嗽、流鼻涕、打喷嚏、喉咙痛，等等)和/或具有≥1的身体症状(肌痛、不适、疲劳、头痛、寒战/出汗，等等)的患者。主要排除的是症状持续期>72小时、怀孕或哺乳、同时使用了抗生素/抗病毒药物或有哮喘病史或其他肺部疾病病史。

患者随机地一天两次接受NTZ或安慰剂持续5天。在基线处收集鼻咽拭子用于对7种病毒(RSV，A型和B型流感病毒、1-3型副流感病毒以及腺病毒)快速直接地进行免疫荧光分析(SimulFluor呼吸道筛查)。具有每种症状的患者(或家属)在每日日记中记录的症状分为0至3级：不存在、轻度、中度、重度。将组织存放于自封塑料袋中并由研究人员每日收集组织用于称重。在第七天进行跟踪体检。第一终点是在基线至每种症状恢复为不存在或轻度(<2)的时间点。第二终点包括抗生素的使用、第七天呼吸道症状、每天组织/粘液重量。

其他生物化学方法中的结果显示硝唑尼特对其他呼吸道病毒有效。参见由患者构成的表4和病毒检测的表5。表5显示大多数患者未检测出腺病毒、RSV、A型流感病毒、1型副流感病毒阳性。然而，图12至图15显示出NTZ能够治疗患有流感样疾病的患者。这些数据出人意料地说明了表现出流感症状但未检测出腺病毒、RSV、A型流感病毒、1型副流感病毒阳性的患者可用诸如NTZ之类的噻唑化物治疗。

表4：患者

表5：由快速分析检测的病毒

附图说明

图1，噻唑化物在进入后水平条件下起作用抑制A型流感病毒复制。A，硝唑尼特(NTZ)和替唑尼特(TIZ)的结构。B，NTZ(蓝色圆圈)和TIZ(红色圆圈)抑制人类A型流感病毒毒株(PR8，WSN)和禽类A型流感病毒毒株(A/Ck)在MDCK细胞中复制。在感染后24小时测定病毒产量。C，TIZ对人类单核细胞U937(●)和T-淋巴母细胞Jurkat(▲)中的A型流感病毒PR8和人类肺上皮细胞A549(■)中的WSN病毒的抗病毒活性。D，在感染之前(Pre)，紧接着在吸附期之后(Post)或仅在吸附过程中(Ad，虚线柱)，在所标明的时间，用10μg/ml TIZ(实心柱)处理MDCK细胞。空心柱代表未处理的感染对照(C)。E，病毒吸附之后，用10μg/ml TIZ(实心圆圈)或介质(空心圆圈)处理的PR8-感染的MDCK细胞中TIZ的长期抗病毒活性。B至E，病毒产量表示为HAU/ml(B和E)或表示为未处理的对照的百分比(C和D)，病毒产量代表具有类似结果的三个实验中的代表性实验的重复样品的平均值±SD。*＝P<0.01；**＝P<0.05。

图2，替唑尼特选择性改变流感红血球凝集素成熟。A，TIZ对PR8病毒蛋白合成的动力学的影响。病毒吸附之后用10μg/ml TIZ处理的假感染的(U)或PR8-感染的细胞中的[35S]-Met/Cys-标记的蛋白(1.5小时脉冲)在感染后的不同时间的自动放射线照相术分析(上部)。标明了病毒蛋白。在相同的实验中，通过将[35S]-Met/Cys-掺入TIZ(●)或介质(○)处理的细胞的蛋白中来测定蛋白合成(下部)，并且通过免疫印迹分析，使用抗二氧磷基Ser-51-eIF2α(p-eIF2α)或eIF2α泛抗(panspecific antibody)(中部)测定二氧磷基-eIF-2α蛋白水平。B，在感染后5小时进行[35S]-Met/Cys-标记(4小时脉冲)之后，用抗HA抗体通过免疫沉淀识别红血球凝集素。显示了加入抗体(-αHA)之前的相同样品中的免疫沉淀的蛋白(+αHA，IP)和放射性标记的蛋白。显示了HA未裂解的前体(HA0)的位置。C，病毒吸附之后用10μg/ml TIZ、5μg/ml衣霉素(TM)或介质(C)处理的假感染的(U)或PR8感染的细胞中[35S]-Met/Cys-标记的蛋白(15小时脉冲)的自动照相术分析。白色三角和黑色箭头分别表示TM诱导的GRP78/BiP和未糖基化的HA0[通过免疫印迹识别(未显示)]。D，如在A中一样处理的PR8感染的细胞中的[35S]-Met/Cys-标记的蛋白(感染后5小时15分钟脉冲，接着追踪持续标明的时间)的自动照相术分析。A至D，未处理的或TIZ处理的细胞中较慢迁移的HA0形式和较快迁移的HA0形式分别通过星号和黑色三角标识。

图3，噻唑化物干扰病毒红血球凝集素N-糖基化作用。A，在病毒吸附之后用10μg/ml TIZ、5μg/ml TM或介质处理假感染的(U)或PR8-感染的(PR8)MDCK细胞。在感染后6小时，用[35S]-Met/Cys(上部)、[3H]-葡糖胺(中部)或[3H]-甘露糖(下部)对细胞进行标记持续4小时。对放射性标记的样品进行SDS-PAGE和自动照相术分析。显示了SDS/PAGE凝胶中部分荧光图。白色箭头表示TM诱导的Grp78/BiP。B，病毒吸附之后，用10μg/ml TIZ、10μg/ml苦马豆素(SW)、15μg/ml脱氧甘露糖野尻霉素(DMJ)或介质(C)处理假感染的(U)或PR8-感染的MDCK细胞。在感染后6小时，用[35S]-Met/Cys对细胞进行标记(4小时脉冲)，并且对放射性标记的样品进行SDS-PAGE和自动放射性照相术分析。C至D，在病毒吸附之后，用5μg/mlTIZ,5μg/ml衣霉素(TM)或介质(C)处理的假感染的(U)或WSN感染的(WSN)A549细胞(C)和假感染的或禽类A型流感病毒感染的(A/Ck)MDCK细胞(D)中放射性标记的蛋白的自动放射性照相术分析。在感染后3小时(WSN)或6小时(A/Ck)，用[35S]-Met/Cys对细胞进行标记持续15小时(WSN)或4小时(A/Ck)。E至F，病毒吸附之后，用10μg/ml TIZ、10μg/ml硝唑尼特(NTZ)或介质(C)处理的假感染的(U)、PR8感染的(PR8)(E)或禽类A型流感病毒感染的(A/Ck)(F)MDCK细胞中的放射性标记的蛋白的自动放射线照相分析。在感染后6小时，用[35S]-Met/Cys对细胞进行标记持续4小时。A至F显示了病毒蛋白HA0、NP、M1和NS1。未处理的或噻唑化物处理的细胞中较慢迁移的HA0形式和较快迁移的HA0形式分别通过星号和三角来标识。

图4，在EndoH-敏感阶段，替唑尼特阻断HA成熟。A，在感染后5小时，用[35S]-Met/Cys对在病毒吸附之后用10μg/ml TIZ(+)或介质(-)处理的假感染的(U)或PR8感染的(PR8)MDCK细胞进行标记(脉冲4小时)。放射性标记的蛋白被PNGase-F或Endo-H消化(+)或者不被消化(-)，并且进行SDS-PAGE和自动放射线照相术分析。显示了未裂解的糖基化(HA0)的红血球凝集素前体形式和未糖基化(HAp)的红血球凝集素前体形式。B，在感染后6小时用[35S]-Met/Cys对如同A一样处理的MDCK细胞进行标记(4小时脉冲)。放射性标记的蛋白用抗HA抗体(α-HA)进行免疫沉淀，用Endo-H进行消化(+)或者不进行消化(-)，并且进行SDS-PAGE。显示了部分荧光图。C，由TIZ(+)或介质(-)处理的假感染的(U)和PR8-感染的(PR8)MDCK细胞中的全细胞提取物用交联剂EGS(0.2mM)孵育(+)或者不用交联剂EGS(0.2mM)孵育(-)并且使用抗HA抗体进行蛋白质印迹分析。显示出HA单体(1)、二聚体(2)和三聚体(3)。A至C，未处理的或TIZ处理的细胞中较慢迁移的HA0形式和较快迁移的HA0形式分别通过星号和三角来标识。D，用抗-p230反面高尔基体(红色)抗体和抗-HA(绿色)抗体标记的由TIZ(5μg/ml)或介质处理24小时的假感染的(U)和WSN感染的A549细胞的免疫荧光。用DAPI(蓝色)对细胞核进行染色。显示了三种荧光物质的重叠(合并)。放大的区域(插图)突出了未处理的和TIZ处理的细胞中的HA的位置。使用Sof tWoRx-2.50软件，通过DeltaVision显微镜捕捉图像并对图像进行去卷积。标尺为5μm。

图5，替唑尼特抑制流感红血球凝集素运输至细胞表面。A，感染后16小时假感染的(U)和未处理的或TIZ处理的(10μg/ml)PR8感染的MDCK细胞中的总红血球凝集素(绿色)和α-微管蛋白(红色)的水平通过间接免疫荧光来检测(标尺为10μm)。用DAPI(蓝色)对细胞核进行染色。显示了三种荧光物质的重叠(合并)。使用SoftWoRx-2.50软件，通过DeltaVision显微镜捕捉图像并对图像进行去卷积。B，在感染后16小时，通过间接免疫荧光检测由10μg/ml TIZ或 5μg/ml TM处理的假感染的或PR8感染的细胞中的质膜红血球凝集素的水平(绿色)(上部)。用Hoechst33342(蓝色)对细胞核进行染色。如同A中一样处理图像(标尺为10μm)。显示了两种荧光物质的重叠。显示出感染后5小时平行样品中质膜上的红细胞血细胞吸附(下部)(标尺为35μm)。结合的红细胞的血红蛋白水平通过分光光度法来定量(λ＝540nm)。以光密度(O.D.)表示的数据代表来自具有类似结果的两个实验中的代表性实验的重复样品的平均值±SD。相对于感染的对照*＝P<0.05。C，[35S]-Met/Cys-标记的蛋白的自动放射线照相术分析，所述[35S]-Met/Cys-标记的蛋白被掺入在感染后24小时从如同B一样处理的假感染的或PR8感染的细胞的上清液中的纯化的病毒颗粒中。显示了病毒蛋白(HA、NP、M1)。D，在平行试验中，感染后24小时，在未处理的(空心柱)或TIZ处理的(实心柱)PR8感染的细胞中病毒产量通过感染性分析(上部)和红血球凝集素分析(下部)来测定。分别以TCID50/ml和HAU/ml表示的数据代表来自具有相同结果的两个实验中的代表性实验的重复样品的平均值±SD。相对于感染的对照，*＝P<0.05。

图6，在三种浓度条件下的扎那米韦针对A型流感的抗病毒活性和与0.1ug/mL硝唑尼特联合的扎那米韦针对A型流感的抗病毒活性。测试了以0.01μM,0.1μM和1.0μM的剂量单独对抗A型流感(MDCK/PR8)的扎那米韦并且测试了在存在0.1μg/ml NTZ的条件下对抗A型流感(MDCK/PR8)的扎那米韦。

图7，在三种浓度条件下的扎那米韦针对A型流感的抗病毒活性和与1.0ug/mL硝唑尼特联合的扎那米韦针对A型流感的抗病毒活性。测试了以0.01μM,0.1μM和1.0μM的剂量单独对抗A型流感(MDCK/PR8)的扎那米韦并且测试了在存在1.0μg/ml NTZ的条件下对抗A型流感(MDCK/PR8)的扎那米韦。

图8，在三种浓度条件下的奥塞米韦针对A型流感的抗病毒活性和与0.1ug/mL硝唑尼特联合的奥塞米韦针对A型流感的抗病毒活性。测试了以0.01μM,0.1μM和1.0μM的剂量单独对抗A型流感(MDCK/PR8)的奥塞米韦并且测试了在存在0.1μg/ml NTZ的条件下对抗A型流感(MDCK/PR8)的奥塞米韦。

图9，在三种浓度条件下的奥塞米韦针对A型流感的抗病毒活性和与1.0ug/mL硝唑尼特联合的奥塞米韦针对A型流感的抗病毒活性。测试了以0.01μM,0.1μM和1.0μM的剂量单独对抗A型流感(MDCK/PR8)的奥塞米韦并且测试了在存在1.0μg/ml NTZ的条件下对抗A型流感(MDCK/PR8)的奥塞米韦。

图10，替唑尼特针对A型流感病毒和B型流感病毒的抗病毒活性。A，用四种不同的A型流感病毒毒株(哺乳动物H1N1PR8和WSN、H3N2A/FI、H5N9禽类毒株A/Ck)以HAU/105个细胞的m.o.i.感染MDCK细胞，并在吸附期之后立即用10μg/ml TIZ(实心柱)或介质(空心柱)处理。测定感染后24小时的病毒产量。B，在病毒吸附之后，用B型流感病毒(B/Parma/3/04)感染并用10μg/ml TIZ(●)或介质处理的MDCK细胞中TIZ的长期抗病毒活性。C至D，单步(C)和多步(D)PR8病毒生长曲线，如同A中一样，所述单步(C)和多步(D)PR8病毒生长曲线在以10ffu/细胞m.o.i.(C)或0.001(D)ffu/细胞m.o.i.感染的并用10μg/ml TIZ(●)或介质处理的MDCK细胞中体现。在标明的感染后时间点测定病毒产量。(A至D)表示为未处理的对照的百分数(A)或HAU/ml(B至D)的病毒产量代表来自具有类似结果的三个实验中的代表性实验的重复样品的平均值±SD。*＝P<0.01；**＝P<0.05。

图11，替唑尼特不影响人低密度脂蛋白受体(LDLR)的质膜靶定。用绿色荧光蛋白(GFP)标记的内在化缺陷的人低密度脂蛋白受体突变体(LDLR-A18-GFP质粒)瞬时转染(40)MDCK细胞并在8小时后，用TIZ(10μg/ml)或介质处理持续接下来的16小时。用环己酰亚胺阻断蛋白合成持续1小时之后，使用CellMask^TM橙色质膜(PM)染色剂对质膜进行染色，并使用装配有UV激发滤光片的Leica DM-IL荧光显微镜成像。使用Leica Image-Manager500软件，由Leica DC-300照相机捕捉图像。测定未处理的(上图)或TIZ处理的(下图)、转染的MDCK细胞中的LDLR-GFP(绿色)和PM(红色)的水平。显示出两种荧光物质的重叠(合并)。显示出代表性实验的部分相同图像(标尺为10μm)。

图12。硝唑尼特可使与流感样疾病有关的症状消退。

图13。第七天身体检查数据。第7天硝唑尼特降低了与流感样疾病有关的呼吸道症状。

图14。后续研究的抗生素的使用。

图15。每日收集的组织重量。

本发明的化合物(I)可根据下面的通用方案，通过本文所定义的芳酰基衍生物与氨基噻唑衍生物在合适的反应条件下反应合成，其中R6和R9可选自硝基(NO2)或SO2R12，所述芳酰基衍生物中，G1为羟基、氯、氟、溴、烷氧基，等等。在一些实施方式中，反应通常可表示如下：

本发明的化合物(I)也可根据US3950351,US6020353,PCT WO2006042195A1和US2009/0036467A中公开的来合成。

本发明的化合物的实例可包括但不限于下表6中所列举的化合物。这一系列实例无意限定本发明。

表6

虽然上述内容涉及具体优选的实施方式，但是应当理解的是本发明不限于此。本领域普通技术人员可对公开的实施方式作出各种修改并且这些修改意在本发明的范围内。

本说明书中引用的所有公开出版物、专利申请和专利的全部内容通过引用并入本文。

Claims (85)

1.治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者病毒感染的口服药物中的用途，

其中，R₁、R₂、R₃中的一个为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅以及R₁、R₂和R₃中的剩余基团为H；并且R₆为NO₂且R₉为H；

其中，所述病毒感染为流感病毒引起，以及

其中，所述治疗有效量是在患者抗糖类内切酶-H消化之前的阶段阻断病毒红血球凝集素成熟的治疗有效量。

2.如权利要求1所述的用途，其中，R₁为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅以及R₃为H；并且R₆为NO₂且R₉为H。

3.如权利要求1所述的用途，其中，所述病毒感染由下列病毒引起，所述病毒选自：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。

4.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与神经氨糖酸苷酶抑制剂联合使用。

5.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与疫苗联合使用。

6.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与免疫刺激剂联合使用。

7.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与金刚烷类似物联合使用。

8.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与重组唾液酸酶融合蛋白联合使用。

9.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物与反义寡核苷酸联合使用。

10.如权利要求4所述的用途，其中，所述联合使用以基本上同时的方式进行。

11.如权利要求4所述的用途，其中，所述联合使用以顺序的方式进行。

12.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)神经氨糖酸苷酶抑制剂。

13.如权利要求12所述的组合，其中，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂选自：奥塞米韦、扎那米韦、帕拉米韦或拉尼米韦。

14.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)疫苗。

15.如权利要求14所述的组合，所述组合还含有免疫刺激剂。

16.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)金刚烷类似物。

17.如权利要求16所述的组合，其中，所述金刚烷类似物选自三环癸烷胺或金刚烷乙胺。

18.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)免疫刺激剂。

19.如权利要求18所述的组合，其中，所述免疫刺激剂为Polyoxidonium。

20.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)PEG化的干扰素。

21.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)重组唾液酸酶融合蛋白。

22.如权利要求21所述的组合，其中，所述重组唾液酸酶融合蛋白为

23.一种用于治疗流感病毒引起的病毒感染或用于治疗流感样疾病的组合，所述组合含有(a)权利要求1所述的式I的化合物和(b)反义寡核苷酸。

24.如权利要求23所述的组合，其中，所述反义寡核苷酸包括反义磷二酰胺吗啉代寡聚体。

25.如权利要求12所述的组合，其中，所述组合以顺序的方式进行使用。

26.如权利要求12所述的组合，其中，所述组合以基本上同时的方式进行使用。

27.权利要求1所述的治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐或酯在制备干扰或阻止人体内或其他哺乳动物体内感染性病毒颗粒产生的药物中的用途，其中，所述病毒颗粒为流感病毒颗粒。

28.如权利要求1所述的用途，其中所述式I的化合物选自：

HCL盐。

29.一种用于治疗或预防流感感染的药物组合物，所述组合物包括：

(i)有效治疗或预防流感感染的一定量的权利要求1所述的式I的化合物或其盐或酯，和

(ii)药学上可接受的载体。

30.如权利要求29所述的药物组合物，所述药物组合物还包括足以提供与所述式I的化合物起协同作用的一定量的另一抗病毒药剂。

31.如权利要求29所述的药物组合物，所述药物组合物还包括足以提供与所述式I的化合物起协同抗病毒保护性作用的一定量的疫苗。

32.治疗有效量的权利要求1所述的式I的化合物或其药学上可接受的盐或酯在制备治疗流感样疾病药物中的用途。

33.如权利要求32所述的用途，其中，R₁为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅以及R₃为H；并且R₆为NO₂且R₉为H。

34.一种用于治疗或预防流感样疾病的药物组合物，所述组合物包括：

(i)有效治疗或预防流感样疾病的一定量的权利要求1所述式I的化合物或其盐或酯，和

(ii)药学上可接受的载体。

35.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物的使用剂量为100mg至600mg。

36.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物的使用剂量为300mg或600mg。

37.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物以300mg或600mg的剂量一天两次给药。

38.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物以300mg的剂量一天两次给药。

39.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物作为单药物治疗使用。

40.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特，其中所述硝唑尼特一天两次给药。

41.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特或其药学上可接受的盐。

42.如权利要求1所述的用途，其中，所述患者为人类。

43.如权利要求39所述的用途，其中，所述化合物的使用不超过5天。

44.如权利要求39所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特或其药学上可接受的盐。

45.如权利要求41所述的用途，其中，所述硝唑尼特作为改良的释放双层片剂使用。

46.如权利要求1所述的用途，其中，所述式I的化合物以600mg的剂量一天两次给药。

47.治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗患者由流感病毒引起的病毒感染的药物中的用途，

其中，R₁、R₂、R₃中的至少一个为OH或其酯；R₄、R₅以及R₁、R₂和R₃中的剩余基团为H；并且R₆为NO₂且R₉为H。

48.如权利要求47所述的用途，其中，R₁为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅、R₂以及R₃为H或其药学上可接受的盐。

49.如权利要求47所述的用途，其中，所述式I的化合物选自：硝唑尼特，替唑尼特，硝唑尼特和替唑尼特的混合物或其药学上可接受的盐。

50.如权利要求47所述的用途，其中，所述病毒感染由下列病毒引起，所述病毒选自：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。

51.如权利要求48所述的用途，其中，所述病毒感染由下列病毒引起，所述病毒选自：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。

52.如权利要求49所述的用途，其中，所述病毒感染由下列病毒引起，所述病毒选自：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。

53.治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗患有流感样疾病的患者的药物中的用途，

其中，所述患者未检测出腺病毒、RSV、A型流感病毒、1型副流感病毒阳性，其中，R₁、R₂、R₃中的至少一个为OH或其酯；R₄、R₅以及R₁、R₂和R₃中的剩余基团为H；并且R₆为NO₂且R₉为H；

其中，所述流感样疾病包括如下一个或多个症状：鼻分泌物、鼻塞、打喷嚏、喉咙痛、发热、咳嗽、不适、头痛、寒战。

54.如权利要求53所述的用途，其中，R₁为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅、R₂以及R₃为H或其药学上可接受的盐。

55.如权利要求53所述的用途，其中，所述式I的化合物选自：硝唑尼特，替唑尼特，硝唑尼特和替唑尼特的混合物或其药学上可接受的盐。

56.如权利要求53所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特或其药学上可接受的盐。

57.如权利要求53所述的用途，其中，所述流感样疾病包括如下两个或两个以上症状：鼻分泌物、鼻塞、打喷嚏、喉咙痛、发热、咳嗽、不适、头痛、寒战。

58.如权利要求53所述的用途，其中，所述流感样疾病包括如下三个或三个以上症状：鼻分泌物、鼻塞、打喷嚏、喉咙痛、发热、咳嗽、不适、头痛、寒战。

59.如权利要求47所述的用途，其中，所述式I的化合物与神经氨糖酸苷酶抑制剂联合使用。

60.如权利要求48所述的用途，其中，所述式I的化合物与神经氨糖酸苷酶抑制剂联合使用。

61.如权利要求49所述的用途，其中，所述式I的化合物与神经氨糖酸苷酶抑制剂联合使用。

62.如权利要求59所述的用途，其中，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂选自：奥塞米韦、扎那米韦、帕拉米韦或拉尼米韦。

63.如权利要求60所述的用途，其中，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂选自：奥塞米韦、扎那米韦、帕拉米韦或拉尼米韦。

64.如权利要求61所述的用途，其中，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂选自：奥塞米韦、扎那米韦、帕拉米韦或拉尼米韦。

65.如权利要求64所述的用途，其中，所述神经氨糖酸苷酶抑制剂为奥塞米韦。

66.如权利要求65所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特或其药学上可接受的盐。

67.有效量的硝唑尼特或其药学上可接受的盐在制备治疗患者病毒感染的药物中的用途，所述病毒选自：副型流感病毒、冠状病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒。

68.如权利要求67所述的用途，所述病毒感染由副型流感病毒引起。

69.如权利要求67所述的用途，所述病毒感染由冠状病毒引起。

70.如权利要求67所述的用途，所述病毒感染由腺病毒引起。

71.如权利要求67所述的用途，所述病毒感染由呼吸道合胞病毒引起。

72.如权利要求67所述的用途，其中，所述患者患有流感样症状。

73.如权利要求67所述的用途，其中，硝唑尼特或其药学上可接受的盐口服给药。

74.如权利要求73所述的用途，其中，硝唑尼特或其药学上可接受的盐以300mg或600mg的剂量一天两次给药。

75.如权利要求74所述的用途，其中，所述给药持续5天。

76.如权利要求75所述的用途，其中，所述硝唑尼特或其药学上可接受的盐作为改良的释放双层片剂使用。

77.如权利要求67所述的用途，其中，所述硝唑尼特或其药学上可接受的盐以100mg，200mg，300mg，400mg、500mg或600mg的剂量一天两次给药。

78.如权利要求77所述的用途，其中，所述硝唑尼特或其药学上可接受的盐给药5天。

79.治疗有效量的式I的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗患有流感样疾病的患者的药物中的用途，

其中，R₁、R₂、R₃中的至少一个为OH或其酯；R₄、R₅以及R₁、R₂和R₃中的剩余基团为H；并且R₆为NO₂且R₉为H；

其中，所述流感样疾病包括如下一个或多个呼吸道症状：红斑状口咽、扁桃腺肥大、鼻充血、罗音、腺肿大。

80.如权利要求79所述的用途，其中，所述患者未检测出腺病毒、RSV、A型流感病毒、1型副流感病毒阳性。

81.如权利要求79所述的用途，其中，R₁为OH或OC(＝O)Q，其中，Q为R₇、OR₇或NHR₇；R₇为低级烷基、芳基或杂芳基并且被任选地取代；R₄、R₅、R₂以及R₃为H或其药学上可接受的盐。

82.如权利要求79所述的用途，其中，所述式I的化合物选自：硝唑尼特，替唑尼特，硝唑尼特和替唑尼特的混合物或其药学上可接受的盐。

83.如权利要求79所述的用途，其中，所述式I的化合物为硝唑尼特或其药学上可接受的盐。

84.如权利要求79所述的用途，其中，所述流感样疾病包括如下两个或两个以上症状：红斑状口咽、扁桃腺肥大、鼻充血、罗音、腺肿大。

85.如权利要求79所述的用途，其中，所述流感样疾病包括如下三个或三个以上症状：红斑状口咽、扁桃腺肥大、鼻充血、罗音、腺肿大。