WO2022214855A1 - Uso de nitazoxanida para la preparación de medicamento para prevenir o tratar infección causada por coronavirus sars-cov-2 - Google Patents
Uso de nitazoxanida para la preparación de medicamento para prevenir o tratar infección causada por coronavirus sars-cov-2 Download PDFInfo
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Classifications
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
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- A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
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- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
Definitions
- the present invention relates to obtaining an effective medicine to prevent or treat coronavirus disease 2019, also known as Covid-19, caused by infection with the new coronavirus, known as severe acute respiratory syndrome 2 (SARS-CoV-2). ) or 2019-nCov.
- coronavirus disease 2019, also known as Covid-19 caused by infection with the new coronavirus, known as severe acute respiratory syndrome 2 (SARS-CoV-2).
- SARS-CoV-2 severe acute respiratory syndrome 2
- 2019-nCov 2019-nCov.
- Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 is a betacoronavirus, in particular an enveloped, positive single-stranded ribonucleic acid (RNA) virus.
- SARS-CoV-2 encodes the receptor-binding domain (RBD)-containing spike protein that binds to human angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), and promotes membrane fusion. and virus uptake into human lung cells by endocytosis.
- RBD receptor-binding domain
- ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
- virus uptake into human lung cells by endocytosis.
- SARS-CoV-2 Upon entering human cells, SARS-CoV-2 takes over the system responsible for protein synthesis to synthesize viral proteins and assemble the proteins and then carry out viral replication (Wu et al. An Update on Current Therapeutic Drugs Treating COVID-19. Curr Pharmacol Rep. 11.05.2020: 1-15).
- Clinical symptoms of SARS-CoV-2 coronavirus infection include fever, cough, myalgia or fatigue, sputum production, shortness of breath, sore throat, and a portion of patients experience symptoms.
- gastrointestinal such as diarrhea and vomiting.
- Serafin, M. B. et al. Drug repositioning is an alternative for the treatment of coronavirus COVID-19.
- International Journal of Antimicrobial Agents 55 (2020) 105969 report other alternatives with trials with in vitro effects against the new coronavirus with amodiaquine, cyclosporine A, chlorpromazine hydrochloride, clomipramine, disulfiram, gemcitabine hydrochloride, hydroxychloroquine, dasatinib, imatinib mesylate, loperamide , mefloquine, promethazine hydrochloride, tamoxifen, terconazole, toremifene, and teicoplanin.
- Cytokine and Growth Factor Reviews 53 (2020) 66-70 report the possibility of therapy with a combination of active agents, such as thalidomide and glucocorticoids; remdesivir and interferon alfa2 (IFNa2); chloroquine and hydroxychloroquine; lopinavir and ritonavir; lopinavir, oseltamivir, and ritonavir; lopinavir, ritonavir, and interferon beta convalescent plasma; hydroxychloroquine and azithromycin; camostat mesylate and hydroxychloroquine; darunavir and umifenovir; ribavirin and interferon alfa; hydroxychloroquine and nitazoxanide.
- active agents such as thalidomide and glucocorticoids; remdesivir and interferon alfa2 (IFNa2); chloroquine and hydroxychloro
- nitazoxanide (2-acetyloxy-N-(5-nitro-2-thiazolyl)benzamide), a broad-spectrum antiparasitic and antiviral agent, for a drug , which is effective in antiviral action on the replication of SARS-CoV-2, being able to significantly reduce the number of copies of viral RNA.
- This invention managed to solve the problem present in the state of the art, using nitazoxanide for the preparation of a medicine to prevent or treat the infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, in which the medicine contains 600 mg of nitazoxanide.
- Figure 1 shows a schematic representation of the experimental design for the evaluation of the in vitro antiviral effect of Nitazoxanide in cell cultures infected with SARS-CoV-2.
- Figure 2 shows the in vitro antiviral effect of nitazoxanide on SARS-CoV-2 replication.
- VERO E6 cells were preincubated for 1 hour with MEM medium containing different concentrations of NTZ (x-axis) or kept untreated (Mock and Untreated).
- the SARS-CoV-2 isolate (EPI_ISL_413016) was added at an MOI of 0.05 to allow infection for 2 hours and, as a control, a pool of untreated cells was left uninfected (Mock).
- the supernatants and cells were washed twice with PBS and cultured in culture medium in the presence of NTZ at the mentioned concentrations for 48 hours at 37°C with a 5% C02 atmosphere.
- Viral quantification in culture supernatants was assessed by qRT-PCR and expressed as the number of viral RNA copies/mL (y-axis). Results represent the mean and standard error performed in triplicate on the qPCR reaction.
- Figure 3 shows the percentage inhibition of SARS-CoV-2 replication through in vitro treatment with nitazoxanide.
- Figure 4 shows the cytotoxic effect of nitazoxanide on VERO E6 cells.
- VERO E6 cells were cultured for 48 hours in MEM medium in the presence or absence of different concentrations of NTZ or, as a positive control for cell death, 1% Triton X-100. After this period, the supernatant was collected and cytotoxicity was assessed by quantifying the release of the enzyme LDH. Results represent the mean and standard error of 3 different biological samples, each with a technical triplicate in the LDH assay reaction.
- Figure 5 shows screening and randomization. Patients admitted for hospitalization with mild/moderate COVID-19 hypothesis were screened (73 patients), and 50 patients were randomized once RT-PCR for SARS-COV-2 was positive on nasal and swabs. throat (RT-PCR results available within the first 12 hours of hospital admission). Patients were assigned to receive Nitazoxanide (25) or placebo (25). Five patients did not receive 7 days of treatment with the assigned study interventions. Of the Nitazoxanide group, one patient died on study day 2, one patient received 4 doses of study drug and withdrew informed consent, and another patient was discharged in good health on study day 5 and missed study day. tracing. In the placebo group, one patient died on day 2 and another on day 4.
- Figures 6A to 6F show the activation status of T cells over time between the NTZ and Placebo groups.
- Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from patients in all groups were obtained by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation. PBMCs were thawed and used for immunophenotyping on Day 1, Day 10 and Day 21.
- IMF of CD38 + CD4 + T cells ( Figure 6A) HLA-DR + CD4 + T cells is shown.
- the present invention provides a medicament for preventing or treating infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, resulting in the effective prevention or treatment of Covid-19.
- nitazoxanide (2-acetyloxy-N-(5-nitro-2-thiazolyl) benzamide), a broad-spectrum antiparasitic and antiviral agent, for a drug, which is effective in antiviral action on the replication of SARS-CoV-2.
- the present invention consists of the use of nitazoxanide or a pharmaceutically acceptable salt thereof to prepare a medicine for the prevention or treatment of infection caused by the SARS-CoV-2 coronavirus, in which the medicine contains 600 mg of nitazoxanide .
- nitazoxanide is used to prepare a medicament in oral dosage form, in particular in solid oral dosage form.
- the solid oral dosage form is a tablet or capsule, preferably a tablet, and more preferably a coated tablet.
- nitazoxanide is used to prepare a sustained-release or immediate-release medicament, preferably an immediate-release medicament.
- sustained release refers to the gradual release of nitazoxanide over a prolonged period of time, for example, 08 hours or more.
- nitazoxanide is used to prepare a medicament indicated for administration two or three times a day, and is indicated for administration up to a maximum of seven or fourteen days after the onset of symptoms caused by the infection of the SARS-CoV-2.
- nitazoxanide is used to prepare a medicament having one or more pharmaceutically acceptable excipients, particularly diluents, disintegrants, binders, suspending agents, gliding agents, lubricants or fillers.
- the pharmaceutically acceptable excipients are starch, isopropyl alcohol, sodium starch glycolate, sorbitol, talc, magnesium stearate, hypromellose, titanium dioxide, methacrylic acid copolymer and methyl methacrylate, purified water, macrogol , yellow iron oxide, triethyl citrate and acetone.
- nitazoxanide is used to prepare a medicament having an additional active ingredient, particularly an additional active ingredient selected by way of example and not limitation from the group that includes ribavirin, penciclovir, nafamostat, chloroquine, remdesivir, favipiravir, umifenovir, lopinavir, ritonavir, oseltamivir, camostat mesylate, tocilizumab, amodiaquine, cyclosporin A, chlorpromazine hydrochloride, clomipramine, disulfiram, gemcitabine hydrochloride, hydroxychloroquine, dasatinib, imatinib mesylate, loperamide, mefloquine, promethazine hydrochloride, tamoxifen, terconazole, toremifene , teicoplanin, tenofovir, and interferon alfa, or combinations thereof.
- Another embodiment of the invention refers to a medicine to treat the infection caused by SARS-CoV-2, comprising 600 mg of nitazoxanide or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which may have one or plus pharmaceutically acceptable excipients as already described in this descriptive report.
- kits that contains the medication to treat the infection caused by SARS-CoV-2 that includes 600 mg of nitazoxanide and instructions for use of the medication.
- the instructions may provide the appropriate dosage and dosage regimens for administering the medicament including nitazoxanide, as already described in this descriptive report.
- step 4 Add to the mixture from step 3, the granulating solution obtained in step 1, and continue kneading until completing 25 minutes at 25 Hz speed.
- step 4 5- Calibrate the granulate obtained in step 4, using a rotary granulator mill at 200 rpm, equipped with a 9525 mesh
- step 9 Add to the mixture of step 8, the Talc and the Magnesium Stearate, previously calibrated with a 1905 screen rotary granulator mill, at a speed of 98 rpm. Mix for 5 min at 30 Hz
- VERO E6 lineage ATCC 1586, 31 passage
- MEM minimum essential media
- streptomycin/penicillin 10% serum and 1% streptomycin/penicillin, as recommended by ATC.
- SARS-CoV-2 isolate was used, and viral stock amplification and production were performed on the VERO E6 cell line as described by Hoffman et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by clinical proven protease inhibitor. Cell 271-280 (2020). Viral titer was determined by the amount of infective viral particles capable of forming plaque (PFU/mL). In parallel, molecular detection was performed using the recommended RT-qPCR test to detect SARS-CoV-2 (Pasteur Institute Protocol, Paris). In vitro evaluation of the antiviral effect of nitazoxanide
- VERO E6 cells have been plated in 48 wells at a quantity of 1x10 5 cells per well containing 0.5 mL of MEM medium (Gibco) plus 10% serum and 1% streptomycin/penicillin and cultured overnight at 37°C with 5% CO2 atmosphere. After this period, the culture medium was changed to fresh medium, adding nitazoxanide at concentrations of 0.1, 0.5, 1.0 and 10 mM and after one hour the cells were infected with SARS-CoV-2 in an MOI (multiplicity of infection) of 0.05. After the 2 hour period, culture medium was removed and cells were washed twice with PBS and fresh medium with nitazoxanide at concentrations of 0. 1, 0.5, 1.0 and 10mM. The cultures were maintained for 48 hours at 37°C in a 5% CO2 atmosphere, and after that period the supernatants were collected for the evaluation and quantification of the presence of SARS-CoV-2.
- Figure 1 schematically represents the experimental design described.
- RNA quantification in culture supernatants was determined by quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR). Briefly, total RNA was isolated with the QlAamp ® Viral RNA kit (Qiagen) and the q-RT-PCR reaction was performed using specific primers/probes for the viral genome (CDC, Pasteur Institute protocol) REF and Hot Start Go Taq reagents. ® mix (Promega) in a 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems). A standard curve was generated using synthetic RNA, and after determining the number of viral RNA copies in each sample, graphs were generated with the help of GraphPad Prism 7 software.
- VERO E6 cells have been plated in 48-well plates in an amount of 1x10 5 cells per well, containing 0.5 mL of MEM medium (Gibco) plus 10% serum and 1% streptomycin / penicillin and cultured overnight at 37°C with 5% CO2 atmosphere. After this period, the culture medium was changed to fresh medium, with nitazoxanide at concentrations of 0.1, 0.5, 1.0 and 10 mM or with 1% Triton X-100 as a positive control. Cultures were maintained for 48 hours at 37°C in a 5% CO2 atmosphere. After this period, 100 pL of supernatant was collected and transferred to a 96-well plate.
- LDH lactate dehydrogenase
- 100 pL per well of the reagent from the "Cytotoxic detection kit (LDH)" kit (Roche) were added and incubated for 30 minutes at room temperature in the dark. After this period, the reaction was stopped by adding 50 pL of 1N HCl and the absorbance at 492 nm was read on an EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer). Graphs were generated with the help of GraphPad Prism 7 software.
- Figure 2 shows the viral load analysis performed in number of copies/mL obtained by qRT-PCR using as target the Rdrp gene (RNA-dependent RNA polymerase, RNA-dependent RNA polymerase) present in the genome of the SARS-CoV-2. It is possible to observe the highly significant reduction of viral RNA copy number after treatment in a dose-dependent manner, which denotes the antiviral action of nitazoxanide in experiments performed in vitro.
- Figure 3 shows the percentage inhibition of SARS-CoV-2 replication by in vitro treatment with nitazoxanide, which is calculated as a function of absolute values of copy numbers by qRT-PCR using the control group (untreated). ) as a normalizer (0% inhibition). It is possible to see in Figure 3 that the treatment with nitazoxanide at the concentrations evaluated led to the inhibition of SARS-CoV-2 replication, with an inhibition of approximately 100% at concentrations of 0.5, 1.0 and 10 pM of nitazoxanide.
- Figure 4 shows the percentage of cytotoxicity observed in cell cultures treated with different concentrations of nitazoxanide, being able to It should be noted that the different concentrations tested induced a value of less than 10% of cytotoxic effect. Therefore, nitazoxanide at the concentrations tested has no relevant toxic effects on VERO E6 cells.
- the study population consisted of 50 participants diagnosed with COVID-19 with positive qPCR and compatible symptoms, aged 18 years or older, of both genders, who were hospitalized in a non-critical condition with mild respiratory failure with a maximum of 36 hours of symptoms. (Figure 5).
- the sample size followed the definitions of the WHO protocols for trials with COVID-19 (US Department of Health and Human Services Jun. 2020) (Organisa WH. Principles for clinical studies of COVID-19. Introduction 2020. Available at: https://www.fpm.org.uk/wp-content/uploads/2020/2017Principles-for-Clinical-Studies-into-COVID-19-PDF, Chung S, Wei C.
- nitazoxanide 600 mg BID, administered with food, for 7 consecutive days (25 patients), or placebo comparator BID, administered with food, for 7 consecutive days (25 patients).
- NTZ nitazoxanide
- Clinical evaluations were performed daily during the hospitalization period and, in cases of discharge before 21 days of hospitalization, through follow-up in outpatient clinics or by telemedicine.
- Viral evaluation was performed by qualitative RT-PCR and qPCR of viral load for SARS-COV-2 collected in nasal and throat swabs on day 1 (baseline, inclusion criteria) and days 4, 7, 14, 21. Assessments of clinical status, length of hospitalization, in-hospital mortality, need for mechanical ventilation, and need for rehospitalization were performed. Laboratory parameters accessed at baseline, day 10, and day 21 included high-sensitivity CRP (US-PCR), d-dimer, CPK, CK-MB, serum interleukins, and markers of lymphocyte activation.
- Plasma cytokine levels of IL-6, TNF, IL-8, IL-10, IFN-y, IL- 1b, IL-4, IL-5, IL-17A, IL-12p70, IL-13 were evaluated by the Luminex assay. Lymphocyte activation markers were accessed by flow cytometry and included HLA-DR and CD38 on CD4 + and CD8 + T cells, as described in Vergara TRC, Samer S, Santos-Oliveira JR, Girón LB, Arif MS, Silva-Freitas ML, et al.
- Thalidomide is Associated With Increased T Cell Activation and Inflammation in Antiretroviral-naive HlV-infected Individuals in a Randomized Clinical Trial of Efficacy and Safety. EBioMedicine. 2017;23:59-67.
- the groups were well balanced, with higher body weight and BMI in the NTZ group.
- the clinical evolution of the participant was evaluated using an ordinal scale, which measures the severity of the disease over time, according to the WHO recommendation. The scale was performed daily and the worst score was recorded.
- the levels of nonspecific inflammatory markers such as d-dimer and US-RCP decreased more significantly in the NTZ group compared to the placebo group.
- the decrease in plasma levels of interleukins such as TNF, IL-6 and IL-8 was more profound in the NTZ arm, although no significant differences were observed for IL-10, IFN- and, IL-1b, IL-4, IL-5, IL-17A, IL-12p70, and IL-13.
- the present invention teaches that, in the absence of a specific antiviral drug that can interrupt the replication cycle of SARS-COV-2 and based on a placebo-controlled pilot trial to investigate the safety and efficacy of NTZ in patients with moderate COVID-19, there is unequivocal antiviral activity against SARS-COV-2, also demonstrating the absence of in vitro cytotoxicity of this drug.
- IL-6 is released into the circulation by a variety of different cell types, acting as an important proinflammatory mediator for the induction of the acute phase response, leading to a wide range of local and systemic changes, including fever, recruitment of leukocytes and activation and hemodynamic effects, it is also a marker of increased risk of disease deterioration (Han H, Ma Q, Li C, Liu R, Zhao L, Wang W, et al.
- TNF is one of the cytokines that changes the most in COVID-19 (Akbari H, Tabrizi R, Lankarani KB, Aria H, Vakili S, Asadian F, et al.
- Inflammatory cytokine signature predicts COVID-19 severity and survival Nat Med. 2020;26(10):1636-43) and there are proposals to control the hyperinflammatory phase of the disease with the use of anti-TNF drugs. It is conceivable that anti-TNF therapy could mitigate inflammation-driven capillary leak in COVID-19, thereby reducing respiratory failure and mortality (Feldmann M, Maini RN, Woody JN, Holgate ST, Winter G, Rowland M, et al.Trials of anti-tumor necrosis factor therapy for COVID-19 are urgently needed. Lancet. 2020;395(10234):1407-9.).
- IL-8 is a potent proinflammatory cytokine that plays a key role in neutrophil recruitment and activation during inflammation (Baggiolini M, Walz A, Kunkel SL. Neutrophil- activating peptide-1/interleukin 8, a novel cytokine that activates neutrophils. J Clin Invest. 1989;84(4):1045-9) and, given the frequent neutrophilia observed in patients infected with SARS-CoV2, IL-8 may contribute to the pathophysiology of COVID-19 .
- One of the main objectives of the study was to assess the safety of NTZ among COVID-19 patients, and interestingly, the incidence of adverse events was significantly higher among placebo-treated individuals. It could be said that, in fact, the adverse events were symptoms related to COVID-19 that could have been mitigated in the NTZ-treated arm. Given the small sample size nature of the present study, the superiority of the treatment arm compared to placebo when clinical endpoints were analyzed. Surprisingly, however, the NTZ arm was superior when outcomes such as symptoms of illness, weaning from oxygen, and hospital discharge were assessed.
- NTZ may have antiviral activity in more than one step of the SARS-COV-2 replication cycle, since, in the case of other viruses, this drug acts simultaneously on the inhibition of viral RNA and DNA replication and direct inhibition of viral protein expression.
- this drug acts simultaneously on the inhibition of viral RNA and DNA replication and direct inhibition of viral protein expression.
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Abstract
La presente invención se refiere al uso de nitazoxanida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la infección causada por coronavirus SARS-CoV-2, en la que el medicamento contiene 600 mg de nitazoxanida.
Description
USO DE NITAZOXANIDA PARA LA PREPARACIÓN DE MEDICAMENTO PARA PREVENIR O TRATAR INFECCIÓN CAUSADA POR
CORONAVIRUS SARS-COV-2.
CAMPO TÉCNICO
A presente invención se refiere a la obtención de un medicamento eficaz para prevenir o tratar la enfermedad por coronavirus 2019, también conocida como Covid-19, causada por la infección del nuevo coronavirus, conocido como síndrome respiratorio aguda grave 2 (SARS-CoV-2) o 2019-nCov.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Ante el surgimiento de un nuevo coronavirus, conocido como SARS- CoV-2 o 2019-nCov, se observó una rápida propagación a nivel global de la enfermedad infecciosa causada por este patógeno, que volvió conocida como Covid-19, dando como resultado una pandemia.
El coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave 2 (SARS-CoV-2) es un betacoronavirus, en particular un virus del ácido ribonucleico (ARN o RNA) de cadena sencilla positiva y encapsulado. El SARS-CoV-2 codifica la proteína spike que contiene el dominio receptor-obligatorio (RBD) que se une a la enzima convertidora de angiotensina 2 humana ( angiotensin-converting enzyme 2; “ACE2”), y promueve la fusión de la membrana y la absorción del virus en células humanas pulmonares por endocitosis. Al ingresar a las células humanas, el SARS-CoV-2 asume el sistema responsable de la síntesis de proteína para sintetizar proteínas virales y reunir las proteínas y, luego, realizar la replicación viral (Wu et al. An Update on Current Therapeutic Drugs Treating COVID-19. Curr Pharmacol Rep. 11.05.2020: 1-15).
Los síntomas clínicos de la infección por coronavirus SARS-CoV-2 incluyen fiebre, tos, mialgia o fatiga, producción de esputo, falta de aire, dolor de garganta, y una parte de los pacientes experimental síntomas
gastrointestinales como diarrea y vómitos. Se observó que los pacientes de edad avanzada y también aquellos con disfunciones subyacentes, como por ejemplo, hipertensión, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, diabetes, enfermedad cardiovascular, desarrollaran rápidamente el síndrome respiratorio agudo grave, shock séptico, acidosis metabólica difícil de corregir y disfunción de coagulación, incluso llevando a la muerte (Guo, Y.-R., et ai. The origin, transmission and el i ni cal therapies on co ron avirus disease 2019 (COVID-19) outbreak-an update on the status. Military Medical Research (2020) 7:11).
Para afrontar urgentemente el nuevo coronavirus y la enfermedad asociada, se están llevando a cabo investigaciones intensas de diversos agentes y una amplia gama de enfoques terapéuticos, por ejemplo, inhibición de la entrada / fusión del virus SARS-CoV-2 en la célula humana, ruptura de la replicación viral, supresión de la respuesta inflamatoria excesiva para desarrollar un medicamento que sea eficaz.
Wang, M. et al. Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro. Cell Research (2020) 30:269- 271 evaluaron la eficacia antiviral in vitro de medicamentos aprobados por la FDA ( Food Drug Administratiorí), como ribavirina, penciclovir, nitazoxanida, nafamostat, cloroquina, remdesivir (GS-5734) y favipiravir (T-705) contra un SARS-CoV-2. Wang et al. (2020) informaron que el remdesivir y la cloroquina bloquearon potencialmente la infección del virus en baja concentración micromolar y alto índice de selectividad, y se sugirieron para el tratamiento de Covid-19 en humanos, además de mostrar una buena actividad inhibidora de favipiravir, nitazoxanida y nafamostat.
Wu, R. et al. An Update on Current Therapeutic Drugs Treating COVID- 19. Curr Pharmacol Rep. 11.05.2020: 1-15 reporta otras alternativas potenciales para el tratamiento de Covid-19, como umifenovir, lopinavir-ritonavir y oseltamivir, indicando que los ensayos clínicos con favipiravir contra Covid-19 em varios países, como China y Japón, que mostraron una tasa de recuperación más alta para los pacientes tratados con favipiravir en comparación con los pacientes tratados con umifenovir.
Además de remdesivir, cloroquina, nitazoxanida y lopinavir-ritonavir, Valencia, D. N. Brief Review on COVID-19: The 2020 Pandemic Causeó by SARS-CoV-2. Cureus (2020). 12(3):e7386, en un artículo de revisión, también informa estudios sobre la actividad inhibidora del SARS-CoV-2 para el mesilato de camostat y tocilizumab.
Serafín, M. B. et al. Drug repositioning is an alternative for the treatment of coronavirus COVID-19. International Journal of Antimicrobial Agents 55 (2020) 105969 reportan otras alternativas con ensayos con efectos in vitro contra e nuevo coronavirus con amodiaquina, ciclosporina A, clorhidrato de clorpromazina, clomipramina, disulfiram, clorhidrato de gemcitabina, hidroxicloroquina, dasatinib, mesilato de imatinib, loperamida, mefloquina, clorhidrato de prometazina, tamoxifeno, terconazol, toremifeno y teicoplanina.
A su vez, Li, H. et al. Updated Approaches against SARS-CoV-2. Antimicrob Agents Chemother (2020) 64:e00483-20 reportan que una nueva directriz publicada por la Comisión Nacional de Salud de China recomienda el interferón alfa, lopinavir-ritonavir, ribavirina, fosfato de cloroquina y umifenovir (arbidol) para la terapia antiviral.
Nile, S. H. et al. COVID-19: Pathogenesis, cytokine storm and therapeutic potential of interferons. Cytokine and Growth Factor Reviews 53 (2020) 66-70 reportan la posibilidad de terapia con combinación de agentes activos, como talidomida y glucocorticoides; remdesivir e interferón alfa2 (IFNa2); cloroquina e hidroxicloroquina; lopinavir y ritonavir; lopinavir, oseltamivir y ritonavir; lopinavir, ritonavir y plasma convaleciente de interferón beta; hidroxicloroquina y azitromicina; mesilato de camostat e hidroxicloroquina; darunavir y umifenovir; ribavirina e interferón alfa; hidroxicloroquina e nitazoxanida. Kathri, M. y Mago, P. Nitazoxanide/Camostat combination for COVID-19: An unexplored potential therapy. Chem. Biol. Lett. , 2020, 7(3), 192- 196, en un artículo teórico evaluaron una posible combinación también de nitazoxanida y camostat como terapia para el tratamiento de Covid-19 para prevenir la entrada y diseminación del virus, así como reprimir los daños al sistema inmunológico que causa el virus en el cuerpo humano.
Aunque ya se han realizados ensayos para una amplia gama de agentes activos potenciales, como informado por Wang et al. (2020) y Serafín et ai. (2020), todavía no existe una prevención o un tratamiento eficaz disponible contra la infección causada por el SARS-CoV-2, y es necesario desarrollarlo para prevenir o tratar la Covid-19 en los pacientes.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los inventores de la presente invención, después de una extensa investigación, alcanzaron una dosis óptima de nitazoxanida (2-acetiloxi-N-(5- nitro-2-tiazolil) benzamida), un agente antiparasitario y antiviral de amplio espectro, para un medicamento, el cual es eficaz en la acción antiviral sobre la replicación del SARS-CoV-2, pudiendo reducir significativamente el número de copias de ARN viral.
Esta invención logró solucionar el problema presente en el estado de la técnica, utilizando nitazoxanida para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la infección causada por el coronavirus SARS-CoV-2, en la que el medicamento contiene 600 mg de nitazoxanida.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra una representación esquemática del diseño experimental de la evaluación del efecto antiviral in vitro de Nitazoxanida en cultivos celulares infectados con SARS-CoV-2.
La Figura 2 muestra el efecto antiviral de nitazoxanida in vitro sobre la replicación del SARS-CoV-2. Las células VERO E6 se preincubaron durante 1 hora con medio MEM que contenía diferentes concentraciones de NTZ (eje x) o se mantuvieron sin tratamientos (Simulacro y Sin Tratar). Tras este periodo, se añadió el aislado de SARS-CoV-2 (EPI_ISL_413016) en una MOI de 0,05 para permitir la infección durante 2 horas y, como control, se dejó sin infectar un grupo de células sin tratar (Simulacro). A continuación, se eliminaron los
sobrenadantes y las células se lavaron dos veces con PBS y se cultivaron en medio de cultivo en presencia de NTZ a las concentraciones mencionadas durante 48 horas a 37°C con una atmósfera de C02 del 5%. La cuantificación viral en los sobrenadantes de cultivo se evaluó mediante qRT-PCR y se expresó como el número de copias de ARN viral / mL (eje y). Los resultados representan la media y el error estándar realizados por triplicado en la reacción de qPCR.
La Figura 3 muestra el porcentaje de inhibición de la replicación del SARS-CoV-2 a través del tratamiento in vitro con nitazoxanida.
La Figura 4 muestra el efecto citotóxico de nitazoxanida sobre células VERO E6. Las células VERO E6 se cultivaron durante 48 horas en medio MEM en presencia o ausencia de diferentes concentraciones de NTZ o, como control positivo de la muerte celular, de Tritón X-100 al 1%. Después de este periodo, se recogió el sobrenadante y se evaluó la citotoxicidad cuantificando la liberación de la enzima LDH. Los resultados representan la media y el error estándar de 3 muestras biológicas diferentes, cada una con un triplicado técnico en la reacción de dosificación de LDH.
La Figura 5 muestra el cribado y aleatorización. Los pacientes ingresados para su hospitalización con una hipótesis leve/moderada de COVID- 19 fueron cribados (73 pacientes), y 50 pacientes fueron aleatorizados una vez que la RT-PCR para el SARS-COV-2 fue positiva en los hisopos nasales y de garganta (resultados de la RT-PCR disponibles en las primeras 12 horas de ingreso en el hospital). Los pacientes fueron asignados a recibir Nitazoxanida (25) o placebo (25). Cinco pacientes no recibieron el tratamiento de 7 días con las intervenciones del estudio asignadas. Del grupo de Nitazoxanida, un paciente falleció el día 2 del estudio, un paciente recibió 4 dosis del fármaco del estudio y retiró el consentimiento informado, y otro paciente fue dado de alta en buenas condiciones de salud el día 5 del estudio y se perdió el seguimiento. Del grupo de placebo, un paciente falleció el día 2 y otro el día 4. Los datos disponibles de todos los pacientes se han analizado al final del periodo del estudio.
Las Figuras 6A a 6F muestran el estado de activación de las células T a lo largo del tiempo entre los grupos NTZ y Placebo. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de los pacientes de todos los grupos se obtuvieron por centrifugación en gradiente Ficoll-Hypaque. Las PBMC se descongelaron y se utilizaron para la inmunofenotipificación el Día 1, el Día 10 y el Día 21. Particularmente, se muestra la IMF de los linfocitos T CD38+ CD4+ (Figura 6A), los linfocitos T HLA-DR+ CD4+ (Figura 6B), los linfocitos T CD38+ CD8+ (Figura 6C), los linfocitos T HLA-DR+ CD8+ (Figura 6D), los linfocitos T CD38+ HLA-DR+ CD4+ (Figura 6E) y los linfocitos T CD38+ HLA-DR+ CD8+ (Figura 6F) se expresan como mediana ± desviación estándar. El placebo se representa con puntos negros, mientras que la nitazoxanida se representa con puntos verdes.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un medicamento para prevenir o tratar la infección causada por el coronavirus SARS-CoV-2, que da como resultado la prevención o el tratamiento eficaz de Covid-19.
Para eso, los inventores identificaron una dosis óptima de nitazoxanida (2-acetiloxi-N-(5-nitro-2-tiazolil) benzamida), un agente antiparasitario e antiviral de amplio espectro, para un medicamento, que es eficaz en la acción antiviral sobre la replicación del SARS-CoV-2.
La presente invención consiste en el uso de nitazoxanida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma para preparar un medicamento para la prevención o el tratamiento de la infección causada por el coronavirus SARS- CoV-2, en el que el medicamento contiene 600 mg de nitazoxanida.
De acuerdo con la invención, se utiliza la nitazoxanida para preparar un medicamento en forma de dosificación oral, en particular en forma de dosificación oral sólida. En una modalidad de la invención, la forma de dosificación oral sólida es una tableta o cápsula, preferiblemente una tableta, y más aun preferiblemente una tableta recubierta.
De acuerdo con la invención, se utiliza nitazoxanida para preparar un medicamento de liberación sostenida o liberación inmediata, preferiblemente un medicamento de liberación inmediata. El término “liberación sostenida” se refiere a la liberación gradual de nitazoxanida durante un período prolongado de tiempo, por ejemplo, de 08 horas o más.
De acuerdo con la invención, se utiliza nitazoxanida para preparar un medicamento indicado para su administración dos o tres veces al día, y está indicado para su administración hasta, como máximo, siete o catorce días después del inicio de los síntomas causados por la infección del SARS-CoV-2.
De acuerdo con la invención, se utiliza nitazoxanida para preparar un medicamento que tiene uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, particularmente diluentes, desintegrantes, aglutinantes, agentes de suspensión, agentes deslizantes, lubricantes o cargas. En una modalidad particular de la invención, los excipientes farmacéuticamente aceptables son almidón, alcohol isopropílico, almidón glicolato de sodio, sorbitol, talco, estearato de magnesio, hipromelosa, dióxido de titanio, copolímero de ácido metacrílico y metacrilato de metilo, agua purificada, macrogol, óxido de hierro amarillo, trietil citrato y acetona.
De acuerdo con la invención, se utiliza nitazoxanida para preparar un medicamento que tiene un ingrediente activo adicional, particularmente un ingrediente activo adicional seleccionado de manera enunciativa y no limitativa del grupo que incluye ribavirina, penciclovir, nafamostat, cloroquina, remdesivir, favipiravir, umifenovir, lopinavir, ritonavir, oseltamivir, mesilato de camostat, tocilizumab, amodiaquina, ciclosporina A, clorhidrato de clorpromazina, clomipramina, disulfiram, clorhidrato de gemcitabina, hidroxicloroquina, dasatinib, mesilato de imatinib, loperamida, mefloquina, clorhidrato de prometazina, tamoxifeno, terconazol, toremifeno, teicoplanina, tenofovir e interferón alfa, o combinaciones de los mismos.
Otra realización de la invención se refiere a un medicamento para tratar la infección causada por SARS-CoV-2, que comprende 600 mg de nitazoxanida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, que puede tener uno o
más excipientes farmacéuticamente aceptables como ya descritos en este informe descriptivo.
Otra realización de la invención se refiere a un kit que contiene el medicamento para tratar la infección causada por SARS-CoV-2 que incluye 600 mg de nitazoxanida e instrucciones de uso del medicamento. Las instrucciones pueden proporcionar la dosis y los regímenes de dosificación apropiados para administrar el medicamento que incluye nitazoxanida, como ya descritos en el presente informe descriptivo.
Los ejemplos a continuación ilustran la invención antes descrita, pero sin restringir su alcance de protección.
Método de elaboración
1- Adicionar la Hipromelosa al agua purificada, utilizando un tanque de 10 litros, agitar hasta obtener una solución.
2- Calibrar la Nitazoxanida y el sorbitol, mediante un Molino granulador rotativo, equipado con pantalla 1016 y espaciador, a 550 rpm de velocidad
3- Mezclar el almidón de maíz y el almidón pregelatinizado, en una amasadora para 200 kg, durante 15 minutos a 50 Hz.
4- Adicionar a la mezcla del paso 3, la solución granulante obtenida en el paso 1, y continuar amasando hasta completar 25 minutos a 25 Hz de velocidad.
5- Calibrar el granulado obtenido en el paso 4, mediante Molino granulador rotativo a 200 rpm, equipado con malla 9525
6- Secar en horno Fabbe-Primar, a 50°C, hasta obtener una humedad de 1,8 a 2,5 %
7- Calibrar el granulado seco mediante Molino granulador rotativo, equipado con pantalla 1905, a 98 rpm de velocidad
8- Mezclar, en un mezclador doble cono, durante 10 minutos a 10,8 rpm, el granulado calibrado obtenido en el paso 7, con el almidón glicolato previamente calibrado con Molino granulador rotativo por pantalla 1905, a 98 rpm de velocidad
9- Adicionar a la mezcla del paso 8, el Talco y el Estearato de magnesio, previamente calibrados con Molino granulador rotativo por pantalla 1905, a 98 rpm de velocidad. Mezclar durante 5 minutos a 30 Hz
10- Comprimir a 725 ± 5 % mg de peso promedio por comprimido.
11-Preparar lo suspensión de recubrimiento, adicionando el Copolímero de ácido metacrílico y metacrilato de metilo, en una mezcla del agua, alcohol isopropílico y trietilcitrato, agitar 15 minutos
12-Adicionar a la preparación del paso 11, Dióxido de titanio, macrogol y óxido de hierro amarillo, agitar durante 60 minutos a 30 HZ, o hasta homogeneizar.
13-Recubrir los núcleos con la suspensión obtenida en el paso anterior, utilizando una grageadora.
EJEMPLOS DE PRUEBA
Prueba in vitro de infección viral y citotoxicidad.
Cultivo de células
Para las pruebas de infección viral y citotoxicidad in vitro, se utilizaron las concentraciones de 0,1, 0,5, 1,0 y 10 mM de nitazoxanida, y los experimentos in vitro utilizaron las células del linaje VERO E6 (ATCC 1586, 31a pasada), que se cultivaron en medio MEM (mínimum essential media) (Gibco) más suero al 10% y estreptomicina / penicilina al 1%, como recomienda ATC. El día antes de las pruebas, las células se soltaron con solución de Tripsina- EDTA (0,25%/0,025%) y plaqueadas en placas de 48 pocilios en la cantidad de 1x105 células por pocilio, que contenían 0,5 mL del medio antes descrito.
Aislamiento viral
Se utilizó un aislamiento de SARS-CoV-2, y la amplificación y producción de reservas virales se realizaron en el linaje celular VERO E6 como fue descrito por Hoffman et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by clinical proven protease inhibitor. Cell 271-280 (2020). El título viral se determinó por la cantidad de partículas virales infectantes capaces de formar placa (PFU/mL). Paralelamente, se realizó la detección molecular utilizando la prueba RT-qPCR recomendada para detectar SARS-CoV-2 (Protocolo Instituto Pasteur, París).
Evaluación in vitro del efecto antiviral de nitazoxanida
Las células VERO E6 han sido plaqueadas en 48 pocilios en una cantidad de 1x105 células por pocilio que contenían 0,5 mL del medio MEM (Gibco) más suero al 10% y estreptomicina / penicilina al 1% y se cultivaron durante la noche a 37°C con el 5% de atmosfera de CO2. Después de este período, se cambió el medio de cultivo a medio fresco, añadiendo nitazoxanida en concentraciones de 0,1, 0,5, 1,0 y 10 mM y después de una hora las células se infectaron con SARS-CoV-2 en una MOI (multiplicity of infection) de 0,05. Después del período de 2 horas, se retiró medio de cultivo y las células se lavaron dos veces con PBS (por sus siglas en inglés phosphate buffered saline, tampón de fosfato alcalino) y se añadió de nuevo medio fresco con nitazoxanida en concentraciones de 0,1, 0,5, 1,0 y 10 mM. Los cultivos se mantuvieron durante 48 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%, y después de ese período se recogieron los sobrenadantes para la evaluación y cuantificación de la presencia de SARS-CoV-2. La Figura 1 representa esquemáticamente el diseño experimental descrito.
Cuantificación del SARS-CoV-2 en el sobrenadante de cultivos celulares infectados in vitro
La cuantificación viral en los sobrenadantes de cultivo se determinó mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Resumidamente, el ARN total fue aislado con el kit QlAamp® Viral RNA (Qiagen) y la reacción q- RT-PCR se realizó utilizando primers / sondas específicas para el genoma viral (CDC, protocolo Instituto Pasteur) REF y reactivos Hot Start Go Taq® mix (Promega) en un sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems). Se generó una curva estándar utilizando ARN sintético y, después de determinar el número de copias de ARN viral en cada muestra, se generaron los gráficos con la ayuda del software GraphPad Prism 7.
Evaluación del efecto citotóxico oosorueba in vitro
Las células VERO E6 han sido plaqueadas en placas de 48 pocilios en una cantidad de 1x105 células por pocilio, que contenían 0,5 mL del medio MEM (Gibco) más suero al 10% y estreptomicina / penicilina al 1% y se
cultivaron durante la noche a 37°C con atmósfera de CO2 al 5%. Después de este período, se cambió el medio de cultivo a medio fresco, con nitazoxanida en concentraciones de 0,1, 0,5, 1,0 y 10 mM o con Tritón X-100 al 1% como control positivo. Los cultivos se mantuvieron durante 48 horas a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%. Después de este período, se recogieron 100 pL del sobrenadante y se transfirieron a una placa de 96 pocilios. Luego, para cuantificar la actividad de lactato deshidrogenasa (LDH), se añadieron 100 pL por pocilio del reactivo proveniente del kit “Cytotoxic detection kit (LDH)” (Roche) y se incubaron durante 30 minutos, a temperatura ambiente, en la oscuridad. Después de este período, se interrumpió la reacción, añadiendo 50 pL de 1N de HCI y se leyó la absorbancia a 492 nm en un lector de placas EnSpire Multimode Píate Reader (PerkinElmer). Los gráficos se generaron con la ayuda del software GraphPad Prism 7.
Resultados
La Figura 2 muestra el análisis de carga viral realizado en número de copias/mL obtenido por qRT-PCR utilizando como objetivo el gen Rdrp (por sus siglas en inglés RNA-dependent RNA polymerase, ARN polimerasa dependiente de ARN) presente en el genoma del SARS-CoV-2. Es posible observar la reducción altamente significativa del número de copias de ARN viral después del tratamiento de manera dosis-dependiente, lo que denota la acción antiviral de nitazoxanida en experimentos realizados in vitro.
La Figura 3 muestra el porcentaje de inhibición de la replicación del SARS-CoV-2 mediante tratamiento in vitro con nitazoxanida, que se calcula con una función de los valores absolutos de los números de copias por qRT-PCR utilizando el grupo de control ( untreated) como normalizador (0% de inhibición). Es posible ver en la Figura 3 que el tratamiento con nitazoxanida a las concentraciones evaluadas condujo a la inhibición de la replicación de SARS- CoV-2, con una inhibición de aproximadamente el 100% en concentraciones de 0,5, 1,0 y 10 pM de nitazoxanida.
La Figura 4 muestra el porcentaje de citotoxicidad observado en cultivos de células tratados con diferentes concentraciones de nitazoxanida, pudiendo
notarse que las diferentes concentraciones probadas indujeron a un valor menor al 10% de efecto citotóxico. Por lo tanto, la nitazoxanida en las concentraciones probadas no tiene efectos tóxicos relevantes sobre las células VERO E6.
Los resultados in vitro muestran el potente efecto dosis-dependiente de la nitazoxanida sobre la replicación viral del SARS-CoV-2 y que no hubo un efecto citotóxico significativo de nitazoxanida a las concentraciones probadas en las células VERO E6.
Pruebas in vivo de la eficacia de nitazoxanida a 600 mg
La población del estudio consistió en 50 participantes diagnosticados con COVID-19 con qPCR positiva y síntomas compatibles, de 18 años o más, de ambos sexos, que fueron hospitalizados en una condición no crítica con insuficiencia respiratoria leve con un máximo de 36 horas de síntomas (Figura 5). El tamaño de la muestra siguió las definiciones de los protocolos de la OMS para los ensayos con COVID-19 (Departamento de Salud y Servicios Humanos de EE. Jun. 2020) (Organisa WH. Principios para los estudios clínicos de COVID-19. Introducción. 2020. Disponible en: https://www.fpm.org.uk/wp- content/uploads/2020/05/Principles-for-Clinical-Studies-into-COVID-19-PDF; Chung S, Wei C. Statistical Evaluation of Clinical Triáis Under COVID - 19 Pandemic. Ther Innov Regul Sci. 2020;54(6):1551-6; Eichler HG, Cavaleri M, Enzmann H, Scotti F, Sepodes B, Sweeney F, et al. Clinical Triáis for COVID- 19: Can we Better Use the Short Window of Opportunity? Clin Pharmacol Ther. 2020;108(4):730-3). Se trató de un estudio multicéntrico en el que participaron un total de 6 hospitales del Estado de Sao Paulo, Brasil, incluyendo el Instituto do Coragáo - Incor (ciudad de Sao Paulo), Beneficiencia Portuguesa (ciudad de Sao Paulo), Hospital Vera Cruz (Campiñas), SPDM / Hospital Geral de Guarulhos (Guarulhos), Hospital Municipal Dr. Francisco Moran (Barueri) y el Hospital Prevent Sénior (ciudad de Sao Paulo). El estudio se realizó desde el 20 de mayo de 2020 hasta el 21 de septiembre de 2020. Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Retrovirologia de la Universidad Federal de Sao Paulo, Sao Paulo, Brasil, y en el Laboratorio Interdisciplinar de Pesquisa Médicas (Instituto Oswaldo Cruz/FIOCRUZ).
Se excluyeron los pacientes infectados por el VIH, HTLV I o II, los participantes en tratamiento antineoplásico, los pacientes con enfermedades autoinmunes graves en inmunosupresión, los receptores de trasplantes, las mujeres embarazadas o en período de lactancia, o cualquier otra condición clínica que el investigador considerase un riesgo inminente para la salud y la vida del participante. Se excluyeron los pacientes que recibieron terapias previas de cualquier tipo para el COVID-19, al igual que medicamentos que estarían dirigidos contra las manifestaciones específicas del COVID-19, como los anticuerpos monoclonales o las anti-interleucinas. Después de la aleatorización, los pacientes recibieron nitazoxanida (NTZ) 600 mg BID, administrado con alimentos, durante 7 días consecutivos (25 pacientes), o el comparador de placebo BID, administrado con alimentos, durante 7 días consecutivos (25 pacientes). Las evaluaciones clínicas se realizaron diariamente durante el periodo de hospitalización y, en los casos de alta antes de los 21 días de hospitalización, mediante seguimiento en consultas externas o por telemedicina.
La evaluación viral se realizó mediante RT-PCR cualitativa y qPCR de carga viral para SARS- COV-2 recogida en hisopos nasales y de garganta el día 1 (línea de base, criterio de inclusión) y los días 4, 7, 14, 21. Se realizaron evaluaciones del estado clínico, la duración de la hospitalización, la mortalidad intrahospitalaria, la necesidad de ventilación mecánica y la necesidad de nuevas hospitalizaciones. Los parámetros de laboratorio a los que se accedió al inicio, al día 10 y al día 21, incluían la PCR ultrasensible (PCR-US), el d- dímero, la CPK, la CK-MB, las interleucinas séricas y los marcadores de activación linfocítica.
Con el Ensayo AllplexTM 2019- nCoV, se realizaron los análisis cualitativos de la RT-PCR del SARS-COV-2 se, versión 2.1, del 30 de octubre de 2020, según las instrucciones del fabricante. La carga viral del SARS-COV-2 se realizó por RT-PCR (Corman VM, Landt O, Kaiser M, Molenkamp R, Meijer A, Chu DKW, et al. Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real- time RT-PCR. Eurosurveillance. 2020;25(3):1-8).
Los niveles plasmáticos de citoquinas de IL-6, TNF, IL-8, IL-10, IFN-y, IL-
1b, IL-4, IL-5, IL-17A, IL-12p70, IL-13 se evaluaron mediante el ensayo Luminex. Se accedió a los marcadores de activación de linfocitos mediante citometría de flujo e incluyeron HLA-DR y CD38 en células T CD4+ y CD8+, como se describe en Vergara TRC, Samer S, Santos-Oliveira JR, Girón LB, Arif MS, Silva-Freitas ML, et al. Thalidomide is Associated With Increased T Cell Activation and Inflammation in Antiretroviral-naive HlV-infected Individuáis in a Randomised Clinical Trial of Efficacy and Safety. EBioMedicine. 2017;23:59-67.
Los análisis estadísticos incluyeron análisis de varianza de una vía utilizando la prueba de rangos no paramétrica de Kruskal-Wallis. Las cuestiones estadísticas adicionales se abordaron con la Prueba de Suma de Rangos de Wilcoxon para las variables numéricas y las pruebas de Chi- Cuadrado para las variables categóricas. Todos los análisis se llevaron a cabo utilizando el sistema y lenguaje estadístico R y sus paquetes apropiados (R: un lenguaje y entorno para la computación estadística. Disponible en: https://www.gbif.org/pt/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical- computing).
Resultados
Tabla 1. Características de los pacientes y resultados clínicos, inflamatorios y virológicos. Ratio: números superiores a 1 ,0 peso hacia el brazo de Placebo p- valor: no paramétrico, test de Wilcoxon. Sd = desviación estándar. € = Valor p de evolución. MFI = Fluorescencia de intensidad media.
Los grupos estuvieron bien equilibrados, con mayor peso corporal e IMC en el grupo de NTZ. La evolución clínica del participante se evaluó mediante una escala ordinal, que mide la gravedad de la enfermedad con el transcurso del tiempo, según la recomendación de la OMS. La escala se realizó diariamente y se registró la peor puntuación. Se adaptó la escala ordinal utilizada según el Comité Especial de la OMS, utilizando menos anclas (cinco) para facilitar la evaluación del reducido tamaño de la muestra de este estudio, de la siguiente manera 1= Ambulatorio; 2 = Hospitalizado sin uso de oxígeno; 3
= Hospitalizado con uso no invasivo de oxígeno, 4 = Terapia intensiva con oxígeno invasivo; 5 = Muerte. El análisis longitudinal de las puntuaciones de la evolución clínica mostró una diferencia significativa entre los tratamientos (Tabla 1, p = 0,001). Ambos brazos mostraron una disminución de la puntuación de la escala a lo largo del tiempo.
No obstante, hay una diferencia significativa en la disminución en el brazo de tratamiento con NTZ (p < 0,001). En el día 4, el 31,8% de los participantes del grupo de NTZ estaba en tratamiento ambulatorio y el 9% estaba hospitalizado con oxígeno o en la UCI, mientras que sólo el 8,3% de los participantes del grupo de placebo estaba en tratamiento ambulatorio, el 29,2% permanecía hospitalizado con oxígeno o en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI). En el día 7, el 68,4% de los participantes del grupo NTZ estaban en tratamiento ambulatorio, en comparación con el 31,8% de los participantes del placebo, mientras que en el día 14, el 84,2% de los participantes del grupo NTZ estaban en tratamiento ambulatorio, en comparación con el 55% de los participantes del placebo.
Considerando el número/proporción/frecuencia de muertes, observamos un total de 8 muertes, 2 para el grupo de NTZ, y 6 para el grupo de placebo; todas las muertes debidas al SDRA. Aunque no hay diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos (p = 0,564), se observa que la diferencia esperada entre las proporciones de muertes entre los tratamientos (16%) se considera clínicamente relevante, y una tendencia a ser considerada en estudios con mayor tamaño de muestra. Cuando se evaluó el número de participantes que requirieron ventilación mecánica invasiva, se observó una diferencia similar, con 8 pacientes en total, 2 con NTZ y 6 con placebo (p = 0,08), y de nuevo, tamaños muéstrales mayores pueden revelar algunas diferencias. En la evaluación del tiempo hasta la retirada del suplemento de oxígeno, observamos que la mediana del tiempo de destete en el grupo de NTZ fue de 3 días, mientras que en el grupo de placebo fue de 8 días. Esta diferencia no fue estadísticamente significativa (p = 0,08). El tiempo medio hasta el alta hospitalaria en el grupo NTZ fue de 6,2 días en comparación con 14 días en el grupo de placebo (p = 0,021).
Los resultados de la RT-PCR cualitativa del SARS-COV-2 fueron significativamente diferentes entre los grupos a lo largo del tiempo, favoreciendo al brazo de la NTZ (p = 0,045). Hubo una diferencia significativa entre los tratamientos en el día 21 (Tabla 1, p = 0,035), en el que el porcentaje de RT-PCR negativa fue del 100% en la NTZ frente al 78,9% en el brazo de placebo (15 de 19 pacientes, ya que 6 pacientes habían fallecido en el día 21). Las cargas virales de SARS-COV-2 no fueron diferentes entre los grupos de tratamiento, con una reducción significativa de las cargas virales en ambos grupos en el transcurso del tiempo (p<0,0001).
Como se observa en la Tabla 1, los niveles de los marcadores inflamatorios inespecíficos como el d-dímero y el US-RCP disminuyeron más significativamente en el grupo de NTZ en comparación con el grupo de placebo. Del mismo modo, la disminución de los niveles plasmáticos de interleucinas como el TNF, la IL-6 y la IL-8 fue más profunda en el brazo de la NTZ, aunque no se observaron diferencias significativas para la IL-10, el IFN-y, la I L- 1 b , la IL-4, la IL-5, la IL- 17A, la IL-12p70 y la IL-13.
El marcador de activación de los linfocitos T, observado por el CD38 y el HLA-DR en las células T CD4+ y en las células T CD8+, siempre presentó una tendencia a disminuir con el tiempo tanto en el brazo de NTZ como en el del placebo (Figuras 6A a 6B). El HLA-DR en las células T CD4+ fue significativamente menor en el grupo NTZ en comparación con el placebo en el día 21 (p = 0,005; Figura 6B). Del mismo modo, los niveles de CD38 en los linfocitos T CD4+ y CD8+ son menores en el brazo de la NTZ en el día 21 (p = 0,029 y 0,05 respectivamente; Figuras 6A y 6C). Además, cuando se evalúa la coexpresión de ambos marcadores (CD38 y HLA DR) también hay una diferencia significativa en el día 21 entre los dos brazos del estudio en los linfocitos T CD4+, favoreciendo a la NTZ (Figura 6E).
Se observaron un total de 36 acontecimientos adversos (EA), 14 en el grupo de NTZ y 22 con placebo (p=0,24). De los 5 posiblemente relacionados con el fármaco, 4 ocurrieron en el grupo de NTZ y 1 en el de placebo (p=0,99). Entre los 30 EA que no es probable que estén relacionados con el fármaco de tratamiento, 21 ocurrieron en el grupo placebo (p=0,04).
Entre los EA con posible relación causal con el fármaco en el grupo NTZ, 1 evento fue leve y 3 fueron moderados, y en el grupo placebo, el único EA fue leve. Uno de los EA en el grupo NTZ fue grave (muerte), que ocurrió después de la primera dosis del fármaco. Considerando los que se asumieron como eventos adversos, como tradicionalmente se acepta, como la elevación de las enzimas hepáticas, la insuficiencia renal, las manifestaciones digestivas, dolor de cabeza, entre otros, la mayor incidencia en el grupo placebo podría atribuirse posiblemente al daño del virus en diferentes órganos y tejidos de los huéspedes humanos.
De acuerdo con los ejemplos anteriores, la presente invención enseña que, en ausencia de un fármaco antiviral específico que pueda interrumpir el ciclo de replicación del SARS-COV-2 y con base en un ensayo piloto, controlado con placebo, para investigar la seguridad y eficacia de la NTZ en pacientes con COVID-19 moderado, existe una actividad antiviral inequívoca contra el SARS-COV-2, demostrando también la ausencia de citotoxicidad in vitro de este fármaco.
En el caso de una nueva enfermedad como lo es el COVID-19, inclusive los fármacos considerados previamente seguros deben probarse inicialmente sin grandes incrementos en las dosis y en pacientes que no tengan una elevada gravedad de la enfermedad, debido a que existe como precedente un estudio con hidroxicloroquina que condujo a un aumento inaceptable de la mortalidad cuando se utilizaron dosis más altas para la COVID-19 en pacientes con mayor gravedad.
El resultado primario del estudio que se describe en la presente solicitud fue la respuesta virológica al tratamiento con NTZ, y se observó una diferencia estadísticamente significativa en el número de pacientes que completaron el estudio con una PCR negativa para el SARS-COV-2. Del mismo modo, el proceso inflamatorio agudo disminuyó de forma más significativa en el brazo de la NTZ, como se observa en la disminución de la PCR-US. Se reconoce que la PCR-US está relacionada con un peor pronóstico y una peor evolución en el COVID-19 (Chen W, Zheng K, Liu S, et al. Plasma CRP level is positively associated with the severity of COVID-19. Ann Clin Microbiol Antimicrob.
2020; 15; 19(1): 18; Rúan Q, Yang K, Wang W, Jiang L, Song J. Clinical predictors of mortality due to COVID-19 based on an analysis of data of 150 patients from Wuhan, China Intensive Care Medicine.2020;46(6): 1294-7.) y podemos afirmar que la disminución de este marcador inespecífico de inflamación está relacionada con un mejor control de la infección viral. No es de extrañar que la IL-6 estuviera elevada entre los pacientes, evolucionando a un mayor decaimiento en el grupo NTZ. La IL-6 es liberada en la circulación por una variedad de tipos celulares diferentes, actuando como un mediador proinflamatorio importante para la inducción de la respuesta de fase aguda, lo que lleva a una amplia gama de cambios locales y sistémicos, incluyendo fiebre, reclutamiento de leucocitos y activación y efectos hemodinámicos, también es un marcador de mayor riesgo de deterioro de la enfermedad (Han H, Ma Q, Li C, Liu R, Zhao L, Wang W, et al. Profiling serum cytokines in COVID-19 patients reveáis IL-6 and IL-10 are disease severity predictors. Emerging Microbes & Infections. 2020;9(1): 1123-30.).
Además, se encontró una disminución estadísticamente significativa de los niveles de TNF, que eran más bajos en el día 21 en el brazo de NTZ en comparación con el placebo. El TNF es una de las citocinas que más cambia en la COVID-19 (Akbari H, Tabrizi R, Lankarani KB, Aria H, Vakili S, Asadian F, et al. The role of cytokine profile and lymphocyte subsets in the severity of coronavirus disease 2019 (COVID-19): Una revisión sistemática y meta- análisis. Life Sci.2020;258:118167; Del Valle DM, Kim-Schulze S, Huang HH, Beckmann ND, Nirenberg S, Wang B, et al. Una firma de citoquinas inflamatorias predice la gravedad y la supervivencia de COVID-19. Nat Med. 2020;26(10):1636-43) y existen propuestas para controlar la fase hiperinflamatoria de la enfermedad con el uso de fármacos anti-TNF. Es concebible que la terapia anti-TNF pueda mitigar la fuga capilar impulsada por la inflamación en el COVID-19, reduciendo de esta manera la insuficiencia respiratoria y la mortalidad (Feldmann M, Maini RN, Woody JN, Holgate ST, Winter G, Rowland M, et al. Triáis of anti-tumour necrosis factor therapy for COVID-19 are urgently needed. Lancet. 2020;395(10234):1407-9.). Por lo tanto, también es concebible que la disminución significativa del TNF asociada al uso de NTZ corresponda a otra ventaja en el proceso de recuperación de la
COVID-19. Además, la IL-8 disminuyó significativamente en el brazo de la NTZ cuando se comparó con el período de referencia hasta el día 21 de la enfermedad, y esto no ocurrió en el brazo de placebo del estudio. Se ha demostrado que los niveles séricos elevados de IL-6, IL- 8 y TNF-a en el momento de la hospitalización fueron predictores fuertes e independientes de la supervivencia de los pacientes (Del Valle DM, Kim-Schulze S, Huang HH, Beckmann ND, Nirenberg S, Wang B, et al. Una firma de citoquinas inflamatorias predice la gravedad y la supervivencia de COVID-19. Nat Med. 2020;26(10):1636-43). Además, la IL-8 es una potente citoquina proinflamatoria que desempeña un papel clave en el reclutamiento y la activación de los neutrófilos durante la inflamación (Baggiolini M, Walz A, Kunkel SL. Neutrophil- activating peptide-1/interleukin 8, a novel cytokine that activates neutrophils. J Clin Invest. 1989;84(4): 1045-9) y, dada la frecuente neutrofilia observada en los pacientes infectados por el SARS-CoV2, la IL-8 puede contribuir a la fisiopatología del COVID-19.
Además, se exploró si la infección moderada por el SARS-CoV-2 conducía a una activación de las células T de los linfocitos, tal como se deduce de los niveles de CD38 y HLA-DR en los linfocitos de las células T CD4+ y CD8+, y si el fármaco del estudio era capaz de mitigar esta activación celular. Curiosamente, pudimos documentar que todos estos marcadores estaban elevados en la línea de base en ambos grupos de pacientes, y disminuyeron gradualmente con el tiempo. Además, la disminución de los linfocitos T CD4+ HLA-DR+ en el día 21 fue significativamente mayor en el grupo tratado con NTZ en comparación con el grupo de placebo; una prueba más relacionada con la disminución de la inflamación asociada al fármaco COVID-19 entre los pacientes tratados.
Uno de los principales objetivos del estudio fue evaluar la seguridad de la NTZ entre los pacientes con COVID-19, y curiosamente, la incidencia de acontecimientos adversos fue significativamente mayor entre los individuos tratados con placebo. Se podría decir que, de hecho, los eventos adversos eran síntomas relacionados con la COVID-19 que podrían haber sido mitigados en el brazo tratado con NTZ. De acuerdo con la naturaleza del pequeño tamaño de la muestra del presente estudio, no se esperaba la superioridad del
brazo de tratamiento en comparación con el placebo cuando se analizaran los puntos finales clínicos. No obstante, sorprendentemente el brazo de la NTZ fue superior cuando se evaluaron resultados como los síntomas de la enfermedad, el destete de oxígeno y el alta hospitalaria.
Es concebible que para el tratamiento eficaz de una infección vírica como la COVID- 19 sea necesario asociar fármacos antivirales que actúen en diferentes etapas del ciclo de replicación del virus, como se hace normalmente para algunas otras infecciones víricas. Incluso con un mecanismo de corrección de la polimerización del ácido nucleico viral llevado a cabo por una exonucleasa con actividad correctora 3'-5' (Robson F, Khan KS, Le TK, París C, Demirbag S, Barfuss P, Rocchi P, Ng WL. Coronavirus RNA Proofreading: Molecular Basis and Therapeutic Targeting. Mol Cell. 2020 Sep 3;79(5):710- 727. doi: 10.1016/j.molcel.2020.07.027. Epub 2020 Aug 4. Erratum en: Mol Cell. 2020 Dec 17;80(6):1136-1138. PMID: 32853546; PMCID: PMC7402271), que disminuiría la diversidad genética de este virus y mitigaría la posibilidad de una rápida selección de mutantes resistentes, es concebible que la combinación de más de un fármaco sea necesaria al menos para aumentar la potencia del tratamiento antiviral. En este contexto y como se ha visto para otros virus, el NTZ puede tener actividad antiviral en más de un paso del ciclo de replicación del SARS-COV-2, ya que, en el caso de otros virus, este fármaco actúa simultáneamente en la inhibición de la replicación del ARN y el ADN virales y en la inhibición directa de la expresión de las proteínas virales. Además, como mecanismo asociado a la interferencia en el metabolismo celular del huésped, existe una modulación con el incremento del interferón proporcionado por el NTZ, que per se estaría asociado a un mecanismo antiviral adicional.
Los resultados presentados en la presente solicitud contrastan con los de un ensayo clínico aleatorio controlado con placebo más amplio para la COVID-19 leve, que a pesar de documentar una reducción significativa de la carga viral en el brazo de NTZ, no se detectaron beneficios clínicos. Este estudio utilizó 500 mg de NTZ TID durante 5 días, mientras que nuestro estudio administró 600 mg BID durante 7 días. Entre 475 pacientes aleatorizados con COVID-19 leve, no se informó de ninguna muerte y sólo 2 pacientes fueron
ingresados en la UCI, ambos del grupo NTZ (Rocco PRM, Silva PL, Cruz FF, Júnior MACM, Tierno PFGMM, Moura MA, et al. Early use of nitazoxanide in mild Covid-19 disease: randomised, placebo-controlled trial. Eur Respir J. 2020).
Claims
1. Uso de nitazoxanida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una infección causada por el coronavirus SARS-CoV-2, en donde el medicamento contiene 600 mg de nitazoxanida.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medicamento se encuentra en forma de dosificación oral.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el medicamento se encuentra en la forma de dosificación oral sólida.
4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la forma de dosificación oral sólida es una tableta o una cápsula.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la forma de dosificación oral sólida es una tableta recubierta.
6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el medicamento es de liberación sostenida o de liberación inmediata.
7. El uso de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el medicamento está indicado para ser administrable dos o tres veces al día.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el medicamento está indicado para ser administrable dos veces al día.
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el medicamento está indicado para ser administrable tres veces al día.
10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el medicamento está indicado para ser administrable hasta, como máximo, siete o catorce días después del inicio de los síntomas causados por la infección de SARS-CoV-2.
11. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el medicamento
es administrable hasta, como máximo, siete días después del inicio de los síntomas causados por la infección de SARS-CoV-2.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el medicamento es administrable hasta, como máximo, catorce días después del inicio de los síntomas causados por la infección de SARS-CoV-2.
13. El uso de acuerdo con cualquier de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el medicamento tiene uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde los excipientes farmacéuticamente aceptables se seleccionan del grupo que comprende diluentes, desintegrantes, aglutinantes, agentes de suspensión, agentes deslizantes, lubricantes y/o cargas.
15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde el medicamento contiene un ingrediente activo adicional.
16. El uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el ingrediente activo adicional es seleccionado del grupo que consiste en ribavirina, penciclovir, nafamostat, cloroquina, remdesivir, favipiravir, umifenovir, lopinavir, ritonavir, oseltamivir, mesilato de camostat, tocilizumab, amodiaquina, ciclosporina A, clorhidrato de clorpromazina, clomipramina, disulfiram, clorhidrato de gemcitabina, hidroxicloroquina, dasatinib, mesilato de imatinib, loperamida, mefloquina, clorhidrato de prometazina, tamoxifeno, terconazol, toremifeno, teicoplanina, tenofovir, e interferón alfa, o combinaciones de los mismos.
17. Medicamento para tratar la infección causada por SARS-CoV-2, caracterizado porque comprende 600 mg de nitazoxanida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.
18. Kit, caracterizado porque contiene el medicamento según se define en la reivindicación 17 e instrucciones de uso del medicamento.
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