CN116635022A

CN116635022A - 用于治疗或预防冠状病毒感染和/或covid-19细胞因子风暴的mek抑制剂

Info

Publication number: CN116635022A
Application number: CN202180059642.7A
Authority: CN
Inventors: S·路德维希; O·普朗兹; H·E·霍夫曼; J·科赫海尔; M·辛德勒
Original assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Current assignee: Westfaelische Wilhelms Universitaet Muenster
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2023-08-22
Also published as: AU2021277517A1; KR20230013077A; WO2021234097A1; CA3178137A1; US20230241014A1; JP2023526836A; MX2022014561A; EP4153159A1; BR112022023013A2; EP3912623A1

Abstract

本发明涉及用于治疗冠状病毒感染和/或治疗或预防COVID‑19细胞因子风暴的方法中MEK抑制剂。本发明还提供用于治疗冠状病毒感染，诸如COVID‑19的包含此类抑制剂的组合物。

Description

用于治疗或预防冠状病毒感染和/或COVID-19细胞因子风暴的MEK抑制剂

技术领域

本发明涉及MEK抑制剂用于治疗或预防冠状病毒感染和/或治疗或预防COVID-19细胞因子风暴中的用途。

背景技术

冠状病毒组由属于冠状病毒科的包膜正链RNA病毒组成，包括称为α-、β-、γ-和δ冠状病毒的亚型。α和β会影响哺乳动物，而γ会影响鸟类，δ能够影响二者。冠状病毒家族包括几个众所周知的致病成员。β冠状病毒家族迄今为止对人类构成最大危险，并且现在包括最著名的病毒靶标，包括2003年造成774人死亡的严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)、2012年造成858人死亡的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)以及出现的最新形式的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)，其在2020年5月初已经在全世界造成超过250,000例死亡。总之，冠状病毒对人类生命造成了持续且不断发展的威胁。

尽管冠状病毒的不同亚型能够感染不同的宿主类型，但病毒的总体生化结构是相似的。冠状病毒经历频繁重组。如上所述，SARS-CoV-2是沙贝病毒亚属(β-CoV谱系B)的成员。它的RNA序列的长度大约30,000个碱基，对于冠状病毒来说相对较长。它的基因组几乎完全由蛋白质编码序列组成，这是与其它冠状病毒共有的特征。SARS-CoV-2在已知的β冠状病毒中是独特的，因为它结合了弗林蛋白酶切割的多元位点，这是已知的会增加其它病毒的致病性和传播性的特征。截止2020年1月12日，中国疾病预防控制中心(CCDC)和其它机构报道，已经从武汉分离出SARS-CoV-2的五个基因组；截止2020年1月30日，基因组数目增加到42。对这些样品的系统进化分析显示它们“与相对于共同祖先最多七个突变高度相关”，这意味着第一次人类感染发生在2019年11月或12月。截止2020年5月7日，在六大洲采集的4,690个SARS-CoV-2基因组已经公开。从分离株Wuhan-Hu-1测序的第一个SARS-CoV-2基因组NCBI登录号为86693，被认为代表野生型SARS-CoV-2。在2020年7月，科学家报道，具有刺突蛋白变体G614的更具感染性的SARS-CoV-2变体已经替代D614，成为该流行病的主要形式。SARS-CoV-2有数千种变体，其中几种被认为在不同区域越来越占优势，例如英国变体B.1.1.7，南非变体B.1.351，巴西变体P.1和P.2或印度变体B.1.617。

尽管目前正在尝试开发抗人致病性冠状病毒感染且特别是抗SARS-CoV-2的疫苗，但仍需要提供替代的或改进的组合物和方法，用于治疗和/或预防由人致病性冠状病毒引起的疾病，尤其是鉴于新出现的病毒变体的情况下。

2019/2021年由SARS-CoV-2引起的COVID-19大流行清楚地表明，冠状病毒对全球健康系统具有强烈的影响。没有预防性接种可用，仅有一种抗病毒药物瑞德西韦(Remdesivir)被临时批准用于COVID-19，但现在被认为仅有中等效果。到2021年5月，开发了几种疫苗，并且2020年底开始可用。预计到2021年底，全世界将有一定比例的人口接种疫苗，然而，目前尚不清楚2021年批准的接种疫苗在多大程度上对目前和新出现的SARS-CoV-2变体，如英国变体B.1.1.7、南非变体B.1.351、巴西变体P.1和P.2或印度变体B.1.617有效。因此，SARS-CoV-2变异体可能继续出现并导致COVID-19。尽管已经进行了各种尝试以用可利用的药物治疗COVID-19，但迄今为止没有一种非常成功。这突出迫切需要其它的有效的抗病毒药物，以在总体上更好地控制一般冠状病毒，特别是SARS-CoV-2的感染。值得注意的是，在大流行的早期，当没有疫苗可用时，抗病毒药物是独立的治疗方法。这同样适用于疫苗无效的病毒变体。

在COVID-19的病例中，SARS-CoV-2感染的临床谱似乎很广，包括无症状感染、轻度上呼吸道疾病和严重的病毒性肺炎伴呼吸衰竭甚至死亡，许多患者住院治疗。使用3阶段分类系统被广泛接受，认识到COVID-19疾病表现出严重性增加的三个级别，其对应于不同的临床发现、治疗反应和临床结果。尽管感染原始SARS-CoV-2病毒的数量很高，但是所有阳性检测患者中80％仅经历轻微症状，20％的患者显示低氧血症症状，导致住院治疗，并且仅有5％的患者需要在重症监护病房(ICU)接受治疗。然而，这些统计数据不一定适用于新出现的病毒变体，特别是印度变体似乎导致更高数量的具有严重低氧血症症状的患者，需要住院治疗和重症监护。为了治疗COVID-19，了解感染阶段很重要。Hasan等人在题目为“自然和免疫抑制状态下的COVID-19疾病：临床-治疗分期方案”中总结了这些阶段，总结如下。

初期，称为第I阶段，是轻度感染，发生在接种和疾病早期建立时。对于大多数人来说，这涉及一段潜伏期，伴随有一些天的轻微且通常非特异性的症状，例如不适、发烧和干咳。在能够将病毒限制在COVID-19这一阶段的患者中，预后和恢复是极好的。在这个阶段的治疗主要针对症状缓解。如果抗病毒治疗被证明是有益的，则在该阶段期间针对选定的患者可能会缩短症状的持续时间，使传染性最小化，并且防止病情恶化。此外，早期作用的抗病毒药物将有助于预防无症状或第I阶段COVID-19患者的疾病进展。由于常规检测的增加，鉴定出更多无症状的患者，其可以从预防性治疗中受益，以避免疾病进展。目前，没有对无症状或第I阶段COVID-19患者的治疗方法。另外，已知没有预防性或预防性治疗可用于已经与SARS-CoV-2阳性的人有紧密接触的情况。

在第二阶段中，称为第II阶段，确定肺部疾病，病毒增殖和肺部局部炎症是常态。第II阶段包括肺受累，无缺氧称为第IIa阶段，缺氧称为第IIb阶段。在此阶段，患者发展为病毒性肺炎，伴随咳嗽、发热和可能的缺氧。在整个疾病过程中，呼吸困难在症状首次发作后13天的中值(9-16.5天的范围)之后发生。呼吸困难是气道、肺或心脏的严重疾病的症状，并且以呼吸困难或费力和呼吸短促为特征。在COVID-19的病例中，胸部X射线或计算机断层扫描显示双侧浸润或毛玻璃状斑块。在这个阶段，大多数患有COVID-19的患者需要住院以便密切观察和管理。一旦可用，治疗主要由支持性措施和抗病毒疗法组成。尽管如此，患者可能仍然会进展到第III阶段，需要在重症监护病房(ICU)中进行机械通气。

在COVID-19的第II阶段中，全身性炎症的标记物可能升高，但并不显著。在对第一批患者进行的早期研究中，发现进入医院后，血浆IL1β、IL1Rα、IL7、IL8、IL9、IL10、碱性FGF、GCSF、GMCSF、IFNγ、IP10、MCP1、MIP1α、MIP1β、PDGF、TNFα和VEGF的浓度高于健康成人。此外，发现ICU患者的IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1α和TNFα血浆浓度高于住院患者(Huang等人；The Lancet(《柳叶刀》)；第395卷；第497-506页；2020年2月15日)，表明这些细胞因子的增加标志着从COVID-19第II阶段转变为第III阶段。

少数COVID-19患者会转变为疾病的第三且最严重的阶段，称为第III阶段，其表现为肺外系统性高炎症综合征。在这个阶段，全身性炎症标志物升高。总的来说，该疾病的关键阶段的预后和恢复情况是差的。

因此，需要能够阻止COVID-19从第II阶段进展到第III阶段并降低COVID-19感染的严重性和死亡率的化合物。正在进行的几项多国研究集中于针对不同疾病的已经批准或经过临床研究的组合物。大多数被考虑用于治疗COVID-19的化合物属于以下两组之一：

1、最初针对HIV、埃博拉、丙型肝炎或流感开发的抗病毒药物。这种想法是阻断病毒的繁殖或阻止病毒进入肺细胞。其中，包括已知对病毒有效的旧疟疾药物。这些抗病毒药物在Covid-19的第I阶段和第II阶段早期中可能有效，因为它们在病毒生命周期的早期起作用。

2、开发用于治疗类风湿性关节炎或炎性肠病的抑制性免疫调节剂。这种想法是这些将限制免疫系统，从而不会引起比病毒本身更多的损伤。这些化合物在Covid-19感染的第II和第III阶段晚期有效，因为它们抑制细胞因子的产生。

2020年开始了几项多国研究，以测试瑞德西韦(RNA聚合酶抑制剂)、利托那韦或洛匹那韦(HIV药物)、β干扰素和/或氯喹或羟基氯喹(疟疾药物)的疗效。然而，迄今为止，这些中没有一个被发现是特别有效的，因此迫切需要一种有效的COVID-19患者的替代治疗方法。

在2020年5月初，美国FDA紧急批准使用抗病毒药物瑞德西韦治疗住院的Covid-19患者。瑞德西韦是一种RNA聚合酶抑制剂，最初是为治疗埃博拉病毒而开发的，但是在那儿发现瑞德西韦无效。瑞德西韦仅被批准用于治疗出现严重症状的医院环境中的患者，我们可以将这些患者归类为COVID-19的第III阶段。然而，尽管在试验中发现瑞德西韦减少了患者的住院时间，但是对死亡率没有显著影响。

鉴于现有技术和大量正在进行的研究，很明显需要能有效治疗和预防冠状病毒感染引起的疾病，特别是呼吸道疾病，如COVID-19的新的化合物和组合物。特别是，需要药物预防冠状病毒，特别是SARS-CoV-2的早期感染，并治疗第II阶段和第III阶段COVID-19患者，以防止疾病进展和降低死亡率。

发明概述

本文提供的上述问题的解决方案是提供用于治疗冠状病毒感染的MEK抑制剂。具体而言，发现MEK抑制剂可用于治疗第II阶段COVID-19，因为它们既通过阻断MEK激酶来阻止病毒传播并从宿主细胞中离去，同时又降低最终导致第III阶段COVID-19的免疫应答。由于这种双重机制，MEK抑制剂，特别是ATR-002，也称为PD 0184264，对于第II阶段COVID-19的治疗特别有希望。此外，MEK抑制剂可能在预防疾病从第II阶段发展到第III阶段，以及治疗第III阶段新冠肺炎。

MEK抑制剂最初被称为化疗药物，并且发明人正在开发用于治疗或预防病毒感染，特别是流感病毒和汉坦病毒感染。ATR-002，也称为PD 0184264，是在2004年化学疗法背景下首次描述的CI-1040的代谢物(Wabnitz等人)，其由发明人开发用于治疗或预防病毒性疾病，例如冠状病毒感染。ATR-002的化学结构如下所示：

PD-0184264是CI-1040的几种代谢产物之一(Wabnitz等人，2004，LoRusso等人，2005)。然而，在PD-0184264上研究的关于MEK在冠状病毒感染中的作用机制同样适用于其它MEK抑制剂。

因此，本发明涉及用于治疗人受试者中由冠状病毒引起的疾病的方法中的MEK抑制剂，其中所述人受试者是住院的。在一些方面，所述疾病是急性呼吸道疾病，例如由SARS-CoV-1、SARS-CoV-2或MERS引起的那些疾病。在本发明的上下文中，所述冠状病毒可以是SARS-CoV-2，相应的待治疗患者患有COVID-19。当COVID-19是第II阶段COVID-19时，使用本发明的MEK抑制剂特别有用。

如上所述，MEK抑制剂能够选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD98059和PD184352或其药学可接受的盐或代谢物。优选地，所述MEK抑制剂为PD-0184264或其药学上可接受的盐。

在优选的剂型中，PD-0184264或其药学上可接受的盐以100至1000mg，优选300至900mg，最优选300、600或900mg的剂量每天给予人受试者一次。

具体地，PD-0184264用于治疗患有由SARS-CoV-2引起的COVID-19的住院患者。优选地，所述COVID-19是第II阶段COVID-19。所述PD-0184264可以在住院后连续1至21天，优选连续5至18或连续7至14天给予人受试者。优选地，PD-0184264以口服剂型给予人受试者。

在另一方面，本发明的MEK抑制剂用于治疗住院的人患者，其中所述冠状病毒对以前的抗病毒治疗如瑞德西韦具有抗性。此外，所述MEK抑制剂能够用于治疗60岁以上或属于冠状病毒感染的高风险组的住院人受试者。

本发明还涉及MEK抑制剂在治疗或预防人冠状病毒感染受试者中COVID-19细胞因子风暴中的用途。所述MEK抑制剂优选选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD98059和PD184352或其药学可接受的盐或代谢物。

MEK抑制剂在治疗或预防受试者中COVID-19细胞因子风暴中的用途可以包括降低所述受试者中IL-1β和/或TNF-α的水平，优选降低受试者中TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、IL-6、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β中的一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或所有六种的水平。

与上述一致，本发明还涉及治疗或预防患有SARS-CoV-2感染的受试者中COVID-19细胞因子风暴的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用MEK抑制剂。该方法可包括降低所述受试者(血液或血浆)中IL-1β和/或TNF-α的水平，优选降低所述受试者(血液或血浆)中一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或所有六种或TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β的水平。

待治疗的SARS-CoV-2可以是原始野生型菌株和/或一种或多种变体。可以治疗的SARS-CoV-2变体的例子包括但不限于D614G、B.1.351、B.1.1.7、P1、P2、B.1.617、B.1.427、B.1.429、B.1.525和B.1.526变体。

另一方面，本发明涉及用于预防在感染人冠状病毒的无症状受试者中由人冠状病毒感染引起的症状的发展或者用于预防在已经与感染人冠状病毒的人紧密接触的受试者中的人冠状病毒感染的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂优选选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐或代谢物。同样，人冠状病毒可以是SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS或SARS-CoV-2变体，优选地选自D614G、B.1.351、B.1.1.7、P1、P2、B.1.617、B.1.427、B.1.429、B.1.525或B.1.526。

最后，包含用于所述用途的所述MEK抑制剂的药物组合物以及本文所述的药物治疗是本发明的一部分。

附图说明

图1：图1(A)显示感染SARS-CoV-2和ATR-002处理的CaCo-2细胞的蛋白质印迹分析泳道图；

在用ATR-002处理的SARS-CoV-2感染的Caco2细胞中检测到pERK1/2、ERK1/2和核衣壳蛋白。未感染的细胞(mock)用作对照。

图1(B)-(D)显示用ATR-002处理感染SARS-CoV-2的Caco-2细胞的ERK磷酸化和核衣壳蛋白相关性的比较。

图1(B)显示ERK-磷酸化。峰下面积用于将pERK1/2标准化为ERK1/2，并计算％ERK磷酸化的值。

图1(C)显示与DMSO对照相比，用不同浓度的ATR-002处理的Caco-2细胞的核苷蛋白浓度。

图1(D)显示与DMSO对照相比，用不同浓度的ATR-002处理的Caco-2细胞的病毒滴度(PFU/mL)。

图2：(A)显示MEK抑制后Vero细胞感染SARS-CoV-2的情况。

(B)显示MEK抑制后SARS-CoV-2感染期间检测的病毒基因RdRP。

图3：SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制能力以及在SARS-CoV-2期间可能的ERK激活。

图4：ERK敲低导致子代病毒滴度降低。

图5：ATR-002治疗在不同宿主细胞系统中对SARS-CoV-2有效。

图6：通过ATR-002对MEK抑制导致病毒滴度降低。

图7：ATR-002治疗对SARS-CoV-2的南非变体有效。

图8：ATR-002降低急性肺损伤(ALI)小鼠模型中的细胞因子和趋化因子基因的表达。

图9：ATR-002降低SARS-CoV-2感染CaCo2细胞后的促炎细胞因子/趋化因子应答。

图10：通过ATR-002对MEK抑制导致促炎细胞因子的表达降低。

图11：通过ATR-002对MEK抑制不会影响IFN的应答，但会减少聚肌胞苷酸poly(I：C)刺激后促炎性IL-8的表达。

图12：ATR-002降低PMBC细胞中促炎细胞因子/趋化因子的应答。

图13：ATR-002处理后压倒性细胞因子应答的调节示意图。

图14：发现ATR-002显示对抗CD3刺激、ConA刺激和PHA刺激的细胞因子/趋化因子刺激的明显剂量依赖性抑制。

图15：根据Hasan等人的COVID-19的阶段。

图16：ATR-002在仓鼠感染模型中抗SARS-CoV-2的效力。(A-E)显示了个别数据和中位值。(F)与感染时的体重相比，以百分比表示的感染后(p.i.)第4天的体重下降。用单向ANOVA多重比较测试分析数据。给出P值。

图17：ATR-002阻断了气-液界面培养物中子代病毒颗粒的产生。

图18：SARS-CoV-2感染期间的ERK激活依赖于hACE2的表达。

图19：ATR-002处理后在Calu-3细胞中ACE2的减少。

图20：ATR-002能够阻断SARS-CoV-2在ACE2过表达细胞中的复制。

图21和图22：MEK抑制剂能够预防预孵育后携带SARS-CoV-2刺突蛋白的假型VSV的感染。

发明详述

以下描述包括可用于理解本发明的信息。不承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前要求保护的发明相关，或者任何具体或隐含引用的出版物是现有技术。

如上所述，本发明涉及用在治疗由冠状病毒引起的住院人患者的病毒性疾病的方法中的抑制剂。如实施例中所示，本发明人惊奇地发现MEK抑制剂在治疗冠状病毒引起的疾病如COVID-19中具有双重作用。本发明还涉及治疗或预防SARS-CoV-2感染患者的COVID-19细胞因子风暴。此外，发现MEK抑制剂能有效阻断ACE-2受体的表达，因此可用于在感染人冠状病毒的无症状受试者中预防由人冠状病毒感染引起的症状的发展，或用于在与人冠状病毒感染者密切接触的受试者中预防人冠状病毒感染。在本文中，“紧密接触”通常被定义为在小于1.5米的距离内，在室外或在封闭房间内，与已经测试为阳性的人花费10分钟或更长时间。截止2021年5月9日，德国罗博特·科赫研究所(RKI)将与已知感染人冠状病毒的人密切接触的人定义为，如果他们具有以下情况，则感染风险会增加：

1、在没有适当防护措施，如FFP2面罩的情况下，紧密接触(小于1.5米)超过10分钟，

2、在没有适当防护措施，如FFP2面罩的情况下，不依赖于会话长度的面对面谈话(小于1.5米)，或直接接触呼吸道分泌物(咳嗽、打喷嚏)，和/或

3、即使佩戴了适当防护措施，接触者和感染者同时存在于同一具有高浓度传染性气溶胶的房间中，不论距离如何，持续时间超过10分钟。

紧密接触的人群的例子是

·来自同一家庭的人员，

·直接接触感染者的分泌物或体液的人，特别是通过亲吻、咳嗽、打喷嚏等直接接触呼吸道分泌物的人，

·在没有足够空气循环的具有传染性气溶胶的房间(例如通过歌唱、运动、聚会、会议、学校课程、宗教仪式)内的人，

·与飞机上的感染者接触的人，不论是否佩戴FFP-2面罩，和坐在飞机上的感染者同一排或位于感染者前两排或后两排，如果有紧密接触的乘务员或其他乘客，参见上面的第2点。

当然，“紧密接触”的定义可能可以根据病毒变体而改变。已经表明，某些病毒变体具有较高的传播速率，这可能会影响感染所需的距离和时间。由于这个原因，对病毒传播既具有预防作用又有效的抗病毒药物在SARS-CoV-2新出现的变体中特别有用。

具体而言，如所附实施例所证明的，ATR-002显示对SARS-CoV-2的病毒传播具有直接作用以及导致细胞因子释放减少的免疫调节作用。这种双重作用是令人惊讶的，使得MEK抑制剂特别适合于治疗COVID-19第II阶段患者。如上文背景技术部分所述和进一步定义的，这些患者住院，尚未处于重症监护。在这些患者中，MEK抑制具有双重作用，即预防随后导致第III阶段COVID-19的细胞因子风暴，同时抑制病毒传播以阻止疾病进展并降低死亡率。

在SARS-CoV-2感染后的第一天，观察到巨噬细胞、嗜中性粒细胞和NK细胞外渗到感染的肺组织中。然后，感染SARS-CoV-2病毒后，感染的肺上皮、单核细胞、树突细胞和肺泡巨噬细胞释放炎性介质，从而引起COVID-19。细胞因子和趋化因子(例如TNF-α、IL-1β、IP-10、IL6、IL-8、MCP-1、MIP-1β)的产生和分泌导致局部和全身急性炎症和适应性免疫应答的改变，其被称为“COVID-19细胞因子风暴”(其在本文中也可互换地称为“细胞因子风暴”)，标志着从第II阶段转变为第III阶段COVID-19。本文中术语“COVID-19细胞因子风暴”在如本领域所用的常规含义内使用(在这方面，参见Jamilloux等人，2020)，意指可能在已经感染了人致病性冠状病毒，特别是SARS-CoV-2的受试者中发生的细胞因子风暴。从实施例中提供的初步研究，似乎MEK抑制剂一般和ATR-002特别能够通过抑制细胞因子释放而同时降低病毒传播和预防细胞因子风暴(在这方面，参见图13)。这种双重作用是出乎意料的，不同于目前正在研究的用于治疗COVID-19的其它抗病毒药物，例如瑞德西韦。

考虑到COVID-19大流行，本发明人对确定SARS-CoV-2是否使用MEK途径进行病毒传播感兴趣。为此，必须首先获得SARS-CoV-2分离株(分离株“FI”)，然后确定哪些可用的细胞可以被该病毒感染。MEK抑制剂一般和ATR-002特别针对宿主细胞因子MEK，ATR-002的剂量-反应关系不取决于病毒，而取决于激酶的抑制。在体外实验中，ATR-002的抗病毒效力强烈依赖于用于实验的细胞系中MEK的活化状态。用于以下SARS-CoV-2研究的CaCo2细胞系显示高组成性MEK活性。作为比较，也在Vero细胞中进行了实验。所用的具体方法可以在实施例1中找到，结果示于图1和2。具体地，图1显示当感染SARS-CoV-2(MOI 0.1)的CaCo-2细胞用不同浓度的ATR-002处理时，在50和100μM ATR-002的浓度下观察到会抑制ERK以及SARS-CoV-2和核衣壳蛋白(病毒标记物)的磷酸化。抑制所需的高含量的ATR-002与病毒滴度无关，而是由于选择了具有组成性活性MEK的CaCo2细胞，因此高含量是MEK抑制剂所需的。这些实验表明SARS-CoV-2使用MEK途径进行病毒输出。另外，图2A显示在整个观察期间，感染SARS-CoV-2并用50μM ATR-002处理的Vero细胞的病毒载量比对照细胞低，图2B所示的SARS-CoV-2病毒基因RdRP的测量证实了这一发现。这表明抑制剂不仅引起复制延迟，而且可持续地抑制病毒传播。从实验1，本发明人得出结论，SARS-CoV-2使用MEK途径进行病毒传播。

为了验证在CaCo2和Vero细胞中观察到的效果，在人支气管上皮细胞系Calu-3上进行进一步的测试。首先测试SARS-CoV-2是否可以感染Calu-3细胞。此后，测试在Calu-3细胞中ERK是否被SARS-CoV-2激活以及何时被SARS-CoV-2激活。此外，测试在Calu-3细胞中ATR-002是否能够抑制SARS-CoV-2的复制。

实施例2中描述的实验显示Calu-3细胞也可以被SARS-CoV-2病毒感染。Calu-3是一种人肺癌细胞系，常用于肺癌研究和呼吸系统疾病的药物开发。Calu-3细胞是上皮细胞，可以在临床前应用中充当呼吸模型。Calu-3细胞通常用作体外和体内模型，用于针对肺癌的药物开发。该细胞已经用于肺部药物递送的研究，证明具有摄取低分子量物质的能力。由于Calu-3细胞对外来物质的反应性，其已经用作空气吸入和肺损伤的呼吸模型。在实施例2中，可以显示Calu-3细胞可以感染SARS-CoV-2。为了研究ATR-002是否能够抑制Calu-3细胞中的SARS-CoV-2，重复先前在CaCo2和Vero细胞上进行的实验，ATR-002能够以剂量依赖的方式抑制Calu-3细胞中的SARS-CoV-2。SARS-CoV-2在Calu-3细胞中复制和在SARS-CoV-2生命周期中ERK激活以及ATR-002的抑制作用。从图3可以看出，SARS-CoV-2能够在Calu-3细胞中复制。另外，可以看出感染SARS-CoV-2在病毒生命周期的非常早期阶段会导致ERK激活。感染后1小时观察ERK激活。在病毒生命周期的后期没有观察到额外的ERK激活，表明在病毒感染期间通路激活对早期过程的可能作用。

为了证实ATR-002在SARS-CoV-2生命周期期间的抗病毒作用不是脱靶效应，我们通过遗传手段阻断了Raf/MEK/ERK途径。因此，如实施例2B所述，在Calu-3细胞中通过特异性siRNA敲低激酶ERK的表达，所述激酶ERK是MEK的直接下游靶标。如图4所示，发现ERK敲除导致子代病毒滴度产生降低，因此显示ERK敲除导致刺突蛋白表达和子代病毒颗粒产生降低，证实MEK/ERK在病毒生命周期中发挥作用。

然后测试MEK抑制剂是否可以以与实施例1中CaCo2和Vero细胞中所显示的降低相当的方式降低Calu-3细胞中的SARS-CoV-2滴度。具体地，对于病毒产量降低分析，制备具有95％融合的Caco-2、Vero E6和Calu-3细胞的24孔板。在用SARS-CoV-2(MOI 0.01)感染前，用感染培养基洗涤一次洗涤1小时，每孔200μL感染培养基。然后，完全除去病毒接种物，用感染培养基洗涤孔一次，然后，在37℃、5％CO₂条件下，在含有1％DMSO的感染培养基中，每孔用1mL不同浓度的ATR-002(100μM、75μM、50μM、0μM)处理24小时。感染后24小时收获上清液，在5分钟、4℃下以最大速度离心以除去细胞碎片。从上清液制备140μL等份试样并在-80℃下储存。通过RT-qPCR(实时定量聚合酶链反应)测定样品的病毒滴度。用于检测病毒RNA拷贝的探针针对SARS-CoV-2N基因，显示结果。从图5可以看出，在所有细胞类型上显示的效果是相当的。

在下一步骤中，将Calu-3细胞与增加量的ATR-002孵育24、48或72小时。如图6所示，在无毒浓度范围内观察到子代病毒颗粒产量的浓度依赖性降低。这种作用在72小时的总感染时间内保持，表明ATR-002的途径抑制对病毒生命周期具有长时间的作用。另外，图6D是令人感兴趣的，因为它显示用ATR-002处理的细胞没有显示感染SARS-CoV-2的细胞的特征性细胞损伤，这表明ATR-002会预防肺损伤。

为了证实MEK抑制是不依赖于物种或变体的人冠状病毒的有效治疗，在实施例3中测试了ATR-002针对SARS-CoV-2SA变体B.1351的体外效力。使用与实施例1和2中相同的实验设置来观察ATR-002是否针对南非SARS-CoV-2变体B.1351有效。从图7可以看出，以ATR-002处理以0.1、1和10的MOI感染SARS-CoV-2SA的Vero细胞和Calu-3细胞，这些实验显示MEK抑制剂，特别是ATR-002能够抑制冠状病毒，特别是SARS-CoV-2变体。

在进一步的步骤中，本发明人回顾了先前在如实施例4所示的急性肺损伤(ALI)小鼠模型中获得的数据。具体地，在小鼠ALI模型中，LPS诱导的细胞因子和趋化因子表达允许在不存在病毒感染的情况下研究ATR-002的免疫调节功效。图9显示，用ATR-002处理ALI小鼠导致细胞因子TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、MCP-1和MIP-1β减少。如上文背景技术部分所述，根据Huang等人，与第II阶段COVID-19住院治疗的水平相比，所有这些细胞因子在COVID-19患者中均增加，并且TNF-α、IP-10和MIP-1β在第III阶段COVID-19患者中增加。这表明，与感染SARS-CoV-2无关，ATR-002能够降低哺乳动物中的细胞因子和趋化因子基因的表达。

为了证实ATR-002降低SARS-CoV-2感染后的促炎细胞因子/趋化因子应答，如实施例5所述，在CaCo2细胞中进行进一步的体外实验。用SARS-CoV-2感染CaCo2细胞，并用ATR-002处理。测量MCP-1的量，结果如图9所示。具体地，发现ATR-002能够降低SARS-CoV-2感染的细胞中MCP-1的表达。然而，如实施例1所述，为此需要大量的ATR-002，这是由于CaCo2细胞中MEK路径的组成性激活。由于体细胞驱动因子突变，需要大量的ATR-002以抑制SARS-CoV-2感染的CaCo-2细胞中MCP-1的表达。我们进一步提出了ATR-002是否可以降低Calu-3细胞中促炎细胞因子表达的问题。因此，我们用SARS-CoV-2感染Calu-3细胞，并如实施例2所述用增加量的ATR-002处理它们。通过定量实时PCR分析IL-6、IL-8、MCP-1、IP-10和CCL5mRNA的表达。结果在图10中描述为模拟感染细胞的n-倍mRNA表达。结果证实，ATR-002不仅可以降低子代病毒颗粒的产生，如前面实施例中所示，而且可以降低促炎细胞因子的表达。这是ATR-002治疗的额外益处，其降低了病毒感染期间细胞因子风暴的可能性。在第二步中，为了研究ATR-002处理对抗病毒干扰素和促炎细胞因子表达的一般作用，用通常用于模拟病毒RNA作用的合成类似物poly I：C转染A549细胞24小时。同时，用增加量的ATR-002处理细胞。发现ATR-002抑制MEK不影响I型IFN应答，但在poly(I：C)刺激后会降低促炎性IL-8表达。这些实验的结果如图11所示。发现ATR-002处理不影响抗病毒I型干扰素系统的刺激，如严格的I型IFN依赖性基因MxA mRNA的恒定表达所示例的。相反，即使使用低浓度的ATR-002，也发现促炎性IL8表达强烈降低。

为了观察这种作用是否在其它细胞类型中也能观察到，如实施例6所述，在LPS诱导的原代人外周血单核细胞(PMBC)中研究MEK抑制的作用。再次发现，ATR-002降低PMBC中的促炎细胞因子/趋化因子应答。具体地，研究了IP10、TNF-α和MCP-1表达的量，并且从图12可以看出，所有三种在用ATR-002处理后都降低了，表明10μg/ml ATR-002足以抑制人PBMC中>90％的LPS诱导的MCP-1。对PMBC的进一步研究证实，ATR-002显示了抗CD3刺激、ConA刺激和PHA刺激的细胞因子/趋化因子刺激的明显剂量依赖性抑制，如图14所示。

最后，由于迫切需要为COVID-19大流行病提供治疗，并且考虑到来自本文所述实施例的有希望的数据以及来自ATR-002的I期安全性研究的阳性数据，II期研究正在进行中。该II期研究在实施例7中描述。该研究被称为RESPIRE，是一项随机、双盲、安慰剂对照的临床研究，以评价ATR-002在患有中度冠状病毒疾病(COVID-19)的成人住院患者中的安全性和有效性。本研究的主要目的是通过第15天临床严重程度状态评估来证明ATR-002与安慰剂相比在治疗患有COVID-19患者中的功效，每种药物都是标准护理。如实施例1-6所测定的，ATR-002具有治疗COVID-19的潜力，因为其作用模式具有双重益处(效果)：(1)是抗病毒剂，和(2)会免疫调节(以干扰细胞因子风暴)。该临床研究将招募总共200名患有中度冠状病毒病第II阶段的成年住院患者。在随机分组前立即采集鼻咽拭子，以在此之后确认SARS-CoV-2的存在。

所有随机选择的患者将按照当地标准接受标准护理。随机选择100名患者将口服接受ATR-002 900mg，每天一次，100名患者将接受匹配的安慰剂。ATR-002或安慰剂将以对照双盲方式提供5天。

本研究的主要目的是以七点秩序测量等级通过临床严重程度状态评价ATR-002相对于安慰剂的功效：[1]未住院，无限制，[2]未住院，有限制，[3]住院，不需要补充氧气，[4]住院，需要补充氧气，[5]住院，使用无创通气或高流量氧气装置，[6]住院，使用有创机械通气或ECMO上，[7]死亡。

次要结果将通过临床体征和症状、患者报告的结果、治疗突发不良事件、严重不良事件、衍生的临床参数、评分和研究事件、实验室值和ATR-002血浆水平的变化以及定量SARS-CoV-2样品的变化来测量。

在研究药物治疗结束之后，为了安全原因，将跟踪所有患者直到第90天，以确定存活状态。

本研究选择的患者是筛查时年龄为18岁或以上且需要住院的成人，其显示感染COVID-19的临床症状，确定为发烧，发烧确定为体温≥37.3℃(腋下)，≥38.0℃(口腔)或≥38.6℃(直肠或鼓膜)，并且在室内空气中SpO₂<＝94％或需要补充氧气以维持SpO₂>94％。基于实施例中所示的抗病毒和细胞因子/趋化因子研究以及I期临床研究的进一步数据，需要抑制＞50％-90％的MEK活性以使病毒载量和细胞因子/趋化因子表达降低超过50％。在上述预期的RESPIRE研究和实施例5中，将治疗患有第II阶段COVID-19的患者。

在实施例7中描述的RESPIRE临床试验开始之前，在叙利亚仓鼠模型上进行实验，该模型是如实施例8中描述的用于研究SARS-CoV-2感染的优选模型生物体。SARS-CoV-2攻击后，在仓鼠模型中测试了人等效剂量的ATR-002的抗病毒效力。在感染当天或感染后24小时处理动物，并在攻击后第3-4天分析参数，如肺部损伤百分比和咽喉拭子和鼻甲组织中病毒载量。ATR-002治疗导致SARS-CoV-2叙利亚仓鼠感染模型中病毒滴度和肺部损伤显著降低，如图16所示。第一次治疗选择的剂量为100mg/kg，随后75mg/kg，每天一次，这代表900mg接着600mg人剂量的仓鼠等效剂量，用于ATR-002 2期临床试验。因此，本发明的结果完全支持ATR-002临床试验的剂量合理性，并支持ATR-002在SARS-CoV-2治疗中的体内效果。

此外，为了研究ATR-002对呼吸道真人细胞中病毒复制的影响，使用从四个健康成年人的咽喉拭子获得的原代人气液干扰(ALI)培养物。四种ALI培养物中的三种可以感染SARS-CoV-2，并用实施例9中描述的两种不同浓度的ATR-002处理。所用的两种浓度(50μM和100μM)完全阻断了这三种培养物中子代病毒颗粒的产生，表明ATR-002在原代人ALI培养物中对SARS-COV-2感染非常有效。这是ATR-002将证明在治疗人冠状病毒感染，特别是SARS-CoV-2第II阶段中有效的良好指示。

从图15(其是来自于Hasan等人的一篇论文，题目为“COVID-19Illness in Nativeand Immunosuppressed States:A Clinical-Therapeutic Staging Proposal”)可以看出，并总结如下，在第II阶段COVID-19中，病毒应答期和宿主应答期都在进行，因此这将是使用MEK抑制剂最有用的阶段。下面再次总结Hasan等人确定的COVID-19的阶段。

初期，称为第I阶段，是轻度感染，发生在接种和疾病早期建立时。对于大多数人来说，这涉及一段潜伏期，伴随有一些天的轻微且通常非特异性的症状，例如不适、发烧和干咳。在能够将病毒限制在COVID-19这一阶段的患者中，预后和恢复是极好的。在这个阶段的治疗主要针对症状缓解。如果抗病毒治疗被证明是有益的，则在该阶段期间针对选定的患者可能会缩短症状的持续时间，使传染性最小化，并且防止病情恶化。

在COVID-19的第II阶段中，全身性炎症的标记物可能升高，但并不显著。在对第一批患者进行的早期研究中，发现进入医院后，血浆IL1β、IL1RA、IL7、IL8、IL9、IL10、碱性FGF、GCSF、GMCSF、IFNγ、IP10、MCP1、MIP1α、MIP1β、PDGF、TNFα和VEGF的浓度高于健康成人。此外，发现ICU患者的IL2、IL7、IL10、GCSF、IP10、MCP1、MIP1α和TNFα血浆浓度高于住院患者(Huang等人；The Lancet(《柳叶刀》)；第395卷；第497-506页；2020年2月15日)，表明这些细胞因子的增加标志着从COVID-19第II阶段转变为第III阶段。这种转变的特征是临床恶化的突然和快速进展，称为“COVID-19细胞因子风暴”(本文也称为“细胞因子风暴”)。如Jamilloux等人(Autoimmunity Reviews 2020)中详细描述的，这里全身性炎症的标志物升高，例如IL-1β、IL-Rα、IL-6、TNF-α和sIL2Rα。这对应于上述Huang等人所显示的结果。

少数COVID-19患者将经历COVID-19细胞因子风暴，并转变为疾病的第三且最严重的阶段，称为第III阶段，其表现为肺外系统性高炎症综合征。在这个阶段，全身性炎症标志物升高。总的来说，该疾病的关键阶段的预后和恢复情况是差的。

为此，MEK抑制提供的双重机制对于防止进展到第III阶段并因此降低死亡率是至关重要的。

为了更好地理解SARS-CoV2感染的机制，如实施例10所述，对MEK抑制剂在预防SARS-CoV-2感染中的作用作了进一步研究。特别地，已知SARS-CoV-2可以通过ACE2/TMPRSS2进入细胞。因此，解决了ACE2和TMPRSS2表达对Raf/MEK/ERK信号传导通路激活的可能影响。用SARS-CoV-2感染过表达ACE2和TMRPSS2的A549细胞，并在感染后1h分析磷酸化状态。图18显示了三个独立实验中的一个的结果。发现在SARS-CoV-2感染期间，A549细胞中ACE2的过表达会导致ERK激活。

此后，测试在通过ATR-002处理MEK抑制后，细胞中ACE2表达是否降低。用ATR-002处理Calu-3细胞24小时，并通过免疫荧光显微镜和WES技术分析结果。结果可以在图19中看出，其中清楚的是ATR-002导致Calu-3细胞上的ACE2减少。

在下一步中，测试ATR-002是否能阻断SARS-CoV-2在过表达ACE2的A549细胞中的复制。因此，用SARS-CoV-2感染A549-ACE2、A549-ACE2/TMPRSS2或Calu-3细胞，并如上所述用ATR-002处理。

如果细胞以0.001的MOI感染，ATR-002降低了Calu-3和A549-ACE2/TMPRSS2细胞中子代病毒颗粒的产生。令人惊讶的是，当病毒接种物的浓度高十倍(MOI：0.01)时，ATR-002处理不影响A549-ACE2/TMPRSS2细胞中子代病毒颗粒的产生。SARS-CoV-2可以通过两种不同的途径进入细胞。通过TMPRSS2直接激活刺突蛋白，导致病毒和细胞膜融合，或者通过组织蛋白酶L内体内化和激活刺突蛋白。

最后，为了分析用MEK-抑制剂处理是否能降低ACE2的表达，将Vero细胞与MEK抑制剂CI-1040或ATR-002预孵育，并用VSV假型病毒感染，该病毒在其表面上携带SARS-CoV-2刺突蛋白，并在成功感染和内化后表达报道基因GFP。通过光学显微镜分析阳性细胞。图21和22中所示的数据代表三个独立实验的平均值±SD，并显示用CI-1040或ATR-002预孵育会导致VSV-S假型病毒内化的减少。这种效果是时间依赖性的。用CI-1040或ATR-002预孵育越久，GFP阳性细胞的量越低，这是感染的读数。这些结果表明MEK抑制剂，例如CI-1040和ATR-002降低ACE2的细胞表达，因此可用于防止病毒进入细胞。

上述实验表明，MEK抑制可能通过阻断ACE2受体而在预防SARS-CoV-2感染中起作用，并在无症状但测试为人冠状病毒阳性的患者中预防SARS-CoV-2的进展。这是重要的，因为它可以在早期人冠状病毒感染的情况下提供MEK抑制的预防或预防效果。

本发明的MEK抑制剂可用于治疗和/或预防的方法中。因此，术语“治疗”(treating)或“治疗”(treatment)包括向患有冠状病毒感染的受试者施用MEK抑制剂，优选以药物组合物的形式，以改善或改善症状。同样包括向患有COVID-19细胞因子风暴的受试者施用MEK抑制剂，优选以药物的形式，以改善或改善症状。

此外，如本文所使用的术语“预防”是指旨在预防疾病的医疗程序。如本文所使用的，术语“预防”(prevent)、“预防”(prevention)和“预防”(preventing)是指降低诊断为冠状病毒感染，如COVID-19细胞因子风暴的患者获得或发展给定病症的风险。“预防”还意味着减少或抑制诊断为冠状病毒感染，如SARS-CoV-2的受试者中全身性超炎症标记物，如TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、MCP-1和/或MIP-1β，以降低受试者中全身性超炎症，如COVID-19细胞因子风暴的风险。

“MEK抑制剂”通过抑制MEK(丝裂酶原激活蛋白激酶)来抑制细胞或受试者中的丝裂原信号级联Raf/MEK/ERK。这种信号级联被许多病毒，特别是流感病毒和冠状病毒劫持，以促进病毒复制。因此，在MEK瓶颈处特异性阻断Raf/MEK/ERK通路会损害病毒，尤其是冠状病毒的生长。另外，MEK抑制剂在人体中显示低的毒性和小的不良副作用。也不存在诱导病毒抗性的倾向(Ludwig，2009)。在本发明的上下文中，MEK抑制剂选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD98059和PD184352或其药学可接受的盐或代谢物。特别优选的抑制剂是PD0184264。

冠状病毒引起的“疾病”可以是由SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS引起的急性呼吸道疾病。具体地，在一个优选的实施方案中，冠状病毒是SARS-CoV-2，患者患有COVID-19。在最优选的方案中，该疾病是II期COVID-19。

“冠状病毒”可以是SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS或相关的新的人畜共患病或突变的冠状病毒。在一个具体实施方案中，冠状病毒对以前的抗病毒治疗如瑞德西韦有抗性。

可用本发明的抑制剂，特别是MEK抑制剂治疗的“受试者”是已诊断为冠状病毒感染的人类受试者。在一个实施方案中，所述受试者是住院的。受试者可以是任何年龄，可以是0至10岁之间的儿童、10至18岁之间的青少年或18岁及以上的成人。受试者可以任选地在50至65岁之间、在18或50岁之间或大于65岁的年龄。在其它实施方案中，受试者选自至少60岁的受试者，居住在慢性护理机构的受试者，患有肺或心血管系统的慢性病症的受试者，由于慢性代谢疾病、肾功能障碍、血红蛋白病或免疫抑制而在前一年需要定期医学随访或住院的受试者。

在一个具体方面，受试者可用MEK抑制剂治疗，以预防或治疗“COVID-19细胞因子风暴”。如上所述，该术语在本领域使用的常规含义内使用(在这方面参见Jamilloux等人，2020)，意指在已感染人致病性冠状病毒，特别是SARS-CoV-2的受试者中可能发生的细胞因子风暴。这种细胞因子风暴的特征是快速的临床恶化，促炎细胞因子的增加标志着COVID-19从第II阶段向第III阶段的转变。具体地，Huang等人和Jamilloux等人都注意到，观察到IL-1β和/或TNF-α的突然增加，可能与TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、MCP-1和MIP-1β中的两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或全部六种一起增加。一方面，MEK抑制剂用于降低受试者中IL-1β和/或TNF-α的水平，优选降低受试者中TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β中的一种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或所有六种的水平。

上述炎性细胞因子和趋化因子是本领域公知的。具体地，术语TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、MCP-1和MIP-1β是指UNIPROT和GENEBANK中已知的人蛋白序列，其登录号如下：

将用于本发明用途并包含MEK抑制剂如PD-0184264的药物组合物施用于住院的并患有冠状病毒引起的疾病的人类患者。一方面，人类患者超过60岁或属于冠状病毒感染的高风险或极高风险群体。在COVID-19的病例中，非常高风险群体包括如下患者：

·70岁以上

·已经进行了器官移植

·正在进行主动化疗

·正在进行肺癌根治性放疗

·患有血液或骨髓癌，如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤，处于任何治

疗阶段

·正在对癌症进行免疫治疗或其他持续的抗体治疗

·正在进行其它可能影响免疫系统的靶向癌症治疗

·在过去6个月内已经进行了骨髓或干细胞移植，或仍然在服用

免疫抑制药物

·具有严重的呼吸系统疾病，包括囊性纤维化、严重的哮喘、肺纤维化、间质性肺病和严重的COPD

·患有感染风险非常高的状况(如SCID，纯合镰状细胞)

·正在服用使你更可能感染的药物(例如高剂量的类固醇或免疫抑制治疗)

·患有严重的心脏病且怀孕。

高风险人群包括以下人群：

·60岁以上

·有学习障碍

·肺部病症不严重(如哮喘、COPD、肺气肿或支气管炎)

·患有心脏病(如心力衰竭)

·高血压(高血压)

·患有糖尿病

·患有慢性肾病

·患有肝病(如肝炎)

·具有影响呼吸的医疗状况

·患有癌症

·免疫系统衰弱(免疫抑制)

·患有脑血管疾病

·患有影响脑或神经的疾病(如帕金森病、运动神经元病、多发性硬化症或脑瘫)

·脾脏出现问题或切除脾脏

·患有意味着感染风险高的状况(如HIV、狼疮或硬皮病)

·正在服用影响免疫系统的药物(如低剂量的类固醇)

·具有肥胖症。

在本发明的方法中，PD-0184264可通过口服、静脉内、胸膜内、肌内、局部或通过吸入给药。优选地，PD-0184264通过吸入或口服给药。在优选的实施方案中，PD-0184264以100mg-1000mg、优选300mg、600mg或900mg的口服剂量在住院后连续1-21天、优选连续5-18或7-14天给药，每天给予一次。

具体地，如前所述，在I期临床研究中，在单次递增剂量/多次递增剂量(SAD/MAD)方案后，PD-0184264以100mg的起始剂量，以及在七组(seven arms)中最多三个递增步骤。给药方案为一次剂量PD-0184264，逐渐从100mg增加至900mg(SAD)，随后七次剂量PD-0184264，在七天内逐渐从100mg增加至600mg，每日一次(QD)(MAD)。安全检查委员会(SRC)认为每个剂量组都是安全的，允许下一个更高剂量(分别高达SAD 900mg和MAD 600mg)的释放。观察到的药代动力学曲线支持用于进一步临床开发的预期的每日一次方案，并且预期900mg的剂量用于测试。

试验期间，总共仅观察到很少的不良事件，并且没有观察到严重的不良事件。PD-0184264因此被认为是安全的和良好耐受的。在I期研究中验证了药物动力学暴露和MEK抑制的测定，并确认维持了临床相关血液水平。

本发明还设想了不同的组合物，优选药物组合物。本发明涉及包含PD-0184264的组合物，其用于治疗由冠状病毒引起的疾病如SARS-CoV-2的方法中。

如上所述，包含MEK抑制剂的组合物可以是药物组合物。药物组合物的优选实施方案包括PD 0184264。优选地，这样的组合物进一步包含载体，优选药学上可接受的载体。该组合物可以是口服给药的悬浮液或片剂、鼻喷雾剂、吸入装置制剂、无菌注射制剂(静脉内、胸膜内、肌内)，例如，作为无菌注射水性或油性悬浮液或栓剂。

MEK抑制剂优选以治疗有效量施用。PD-0184264或各活性化合物/抑制剂的“治疗有效量”可随各种因素变化，这些因素包括但不限于所用化合物的活性、活性化合物在患者体内的稳定性、待减轻病症的严重性、所治疗患者的总重量、给药途径、化合物被身体吸收的容易度、分布和排泄、所治疗患者的年龄和敏感性、不良事件等，这对本领域技术人员是显而易见的。当各种因素随时间变化时，可以调节给药量。

本文所述的抑制剂、方法和用途适用于人类治疗。如本文所述，本文所述的化合物，特别是PD-0184264可在生理学上可接受的载体中给予受试者。根据引入方式，化合物可以以如下讨论的各种方式配制。制剂中治疗活性化合物的浓度可在约0.1-100重量％范围内变化。所述药剂可单独施用或与其它治疗组合施用。例如，对于第II阶段COVID-19的治疗，PD-0184264可在10-100mg/kg PD-0184264，优选25-75mg/kg PD-0184264的剂量范围内施用。优选的给药剂量为100至1000mg，每日一次，包括在以下之间的任何剂量，例如200、300、400、500、600、700、800和900mg。在优选的实施方案中，每天给药一次，剂量为600mg或900mg，口服给药。PD-0184264可以在住院后连续1至21天或更长时间，优选5至18天，最优选7至14天给予。

本发明方法中的药物化合物可以以任何合适的单位剂型给药。合适的口服制剂可以是片剂、胶囊、悬浮液、糖浆、口香糖、薄片、酏剂等形式。药学上可接受的载体，例如粘合剂、赋形剂、润滑剂和甜味剂或调味剂，可以包括在口服药物组合物中。如果需要，也可以包括用于改变特殊形式的味道、颜色和形状的常规试剂。

对于可注射制剂，药物组合物可以是在合适的小瓶或管中与合适的赋形剂混合的冻干粉末。在临床使用前，可通过将冻干粉末溶解在合适的溶剂系统中而重构药物，以形成适于静脉内或肌内注射的组合物。

在一个实施方案中，病毒感染的减少是噬斑形成单位(PFU)/ml的减少。“噬斑形成单位”是单位体积能够形成噬斑的颗粒，例如病毒颗粒的数量的量度。它是功能测量而不是颗粒绝对量的测量：有缺陷或未能感染其靶细胞的病毒颗粒将不会产生噬斑，因此将不会被计数。例如，浓度为1,000PFU/μl的冠状病毒溶液表明，1μl溶液携带足够的病毒颗粒以在细胞单层中产生1000个感染斑块。在本发明的情况下，当与用MEK抑制剂如PD-0184264处理前的培养物相比时，用抑制剂处理的细胞培养物在处理后的培养物中噬斑形成单位数目减少。

为了本发明的目的，如上定义的活性化合物还包括其药学上可接受的盐。本文所用的短语“药学上可接受的盐”是指对于所需给药形式安全且有效的本发明化合物的盐。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐，例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，以及与阳离子形成的盐，例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些。

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须注意，如本文所用的单数形式“一种”、“一个”和“所述/该”包括复数指代，除非文中另有明确声明。因此，例如，提及“一种试剂”包括一种或多种这样的不同试剂，而提及“该方法”包括指代本领域普通技术人员已知的可以被修改或替代本文所述方法的等同步骤和方法。

本文所引用的所有出版物和专利都将通过整体引用并入本文。当通过引用并入的材料与本说明书存在矛盾或不一致时，本说明书将优先于任何此类材料

除非另有声明，否则一系列元素之前的术语“至少”理解为指代该系列中的每个元素。本领域技术人员仅仅使用常规实验就将得知或能够确定本文所述本发明的具体实施方式的许多等同物。这样的等同物意在被本发明涵盖。

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具体实施方式

以下实施例说明本发明。这些实施例不应被解释为限制本发明的范围。这些实施例是为了说明的目的，本发明仅由权利要求书限定。

材料：

1.细胞系

2.病毒

3.药物

ATR-002(PD0184264)[2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-N-3，4-二氟苯甲酸](M＝409，55g/mol)在ChemCon GmbH(德国，弗莱堡)合成。对于所有细胞培养实验，在DMSO(Merck-Millipore，Darmstadt，Germany)中制备10mM ATR-002储备溶液，并在各自的培养基中进一步稀释。

实施例1：SARS-CoV-2利用MEK通路

在这个初始实验中，本发明人对发现抑制MEK通路是否会抑制病毒繁殖感兴趣。ATR-002靶向宿主细胞因子MEK，然而ATR-002的剂量-反应关系与病毒无关，而是与激酶的抑制有关。在体外实验中，ATR-002的抗病毒效力强烈依赖于MEK在用于实验的细胞系中的活化状态。用于SARS-CoV-2研究的CaCo2细胞系显示了高组成性MEK活性。作为比较，还在Vero细胞中进行了实验。

方法：

A.病毒产量减少实验(VYR)

为了进行病毒产量减少实验，制备了含有95％融合Caco-2细胞的24孔板(GreinerBio-one，目录号662-160)。用补充有5％FCS(Capricorn，目录号FBS-12A)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，目录号P4333)和1％非必需氨基酸(NEAA)(Merck，目录号K 0293)的Caco-2感染培养基DMEM(Gibco，目录号41965-039)洗涤孔一次。在每孔200μL Caco-2感染培养基中将细胞用SARS-CoV-2(MOI 0.1)感染1小时。然后，完全除去病毒接种物，细胞用每孔1mL不同浓度的ATR-002(100μM，50μM，25μM，12.5μM，6.25μM，3.125μM，1.56μM，0.78μM，0.39μM，0.195μM，0.098μM，0μM)在含1％DMSO的Caco-2感染培养基中，在37℃，5％CO₂下处理24小时。感染后24小时收获上清液，并以最大速度，在5分钟、4℃下离心以除去细胞碎片。制备200μL的等份试样并在-80℃下储存。通过加入50μL补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物的改良RIPA缓冲液，在4℃孵育15分钟，裂解每孔的细胞层。在4℃下以最大速度离心5分钟，以除去细胞碎片。将裂解物储存在-80℃。

B.MEK抑制下SARS-CoV-2感染Vero细胞的噬斑实验

为了确定病毒滴度，进行标准噬斑测定。用SARS-CoV-2菌株FI(MOI0.01)感染Vero细胞。感染后1小时，用50μM ATR-002或相应量的DMSO作为对照处理细胞。在完全感染期间将化合物存在于培养基中。在感染后24、36和48小时后，收集上清液，并通过下面的噬斑测定法定量病毒滴度。图2A示出具有三个生物学重复的单个实验的数据。

将Vero E6细胞以100％融合在6孔板(Greiner Bio-One，目录号657-160)中接种。在补充有5％FCS(Capricorn，目录号FBS-12A)和1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，目录号P4333)的Vero E6感染培养基(IMDM，Gibco，目录号12440-053)中制备病毒样品的6倍稀释液。用Vero E6感染培养基洗涤细胞一次，然后在37℃，5％，CO₂条件下用每孔1mL病毒稀释物感染1小时。然后，完全除去病毒接种物，并用Avicel-培养基(1.25％Avicel(FMCBioPolymer，目录号RC581)、10％MEM(Gibco，目录号21430-20)、0.01％DEAE-葡聚糖(SigmaAldrich，目录号：D9885)、2.8％NaHCO₃(Merck，目录号：1.06329.1000)、1％青霉素/链霉素(Sigma Aldrich，目录号：P4333)、0.2％BSA(Carl Roth，目录号：9163.4)、1％L-谷氨酰胺(Sigma Aldrich，目录号：G7513)覆盖细胞。在37℃，5％，CO₂下孵育。72小时后，去除Avicel培养基。用PBS(Gibco，目录号：14190-094)冲洗细胞两次，用4％Roti-Histofix(CarlRoth，目录号：A146.1)在PBS(Lonza，目录号：17515Q)中于4℃下固定30分钟，并用结晶紫溶液(在dd H₂O中，1％结晶紫(Merck，目录号：1408)，10％乙醇(SAV-IP，目录号ETO-5000-99-1))染色。病毒滴度基于每孔的噬斑数目和各自的稀释因子计算。

C.在MEK抑制下，在SARS-CoV-2感染期间检测病毒基因RdRP。用FI(MOI 0.01)感染Vero细胞。感染后1小时，用50μM ATR-002或相应量的DMSO作为对照处理细胞。在完全感染期间将化合物存在于培养基中。在感染后24、36和48小时后，收集上清液并用于RNA提取。在感染后24，36和48小时后，根据标准曲线推断每ml RdRP基因的基因组拷贝数。图2B示出具有三个生物学重复的单个实验的数据。

D.Wes分析

使用的Wes^TM毛细管电泳鉴定和定量pERK1/2、ERK1/2和SARS-CoV-2核蛋白。用0.1X样品缓冲液(ProteinSimple，Abingdon，Oxford，UK)稀释细胞裂解物至每泳道约50ng总蛋白，并使用特异性抗体进行分析。一级抗体pERK1/2(磷酸-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(D13.14.4E)/>Rabit mAb，目录号43702)和ERK1/2(p44/42MAPK(Erk1/2)(137F5)Rabit mAb，目录号4695)购自Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州丹佛市Cell Signaling Technology)，并且以1:50(对于pERK1/2)和1:100(对于ERK1/2)在抗体稀释液(英国牛津阿宾顿ProteinSimple)中的稀释度使用。SARS-CoV-2核蛋白抗体，单克隆小鼠Ab购自ProSci(目录号35.580)，以1μg/ml在抗体稀释液(英国牛津阿宾顿ProteinSimple)中使用。用于WES分析的抗兔二抗(ProteinSimple，目录号DM-001)和抗小鼠二抗(ProteinSimple，目录号DM-002)以及所有其它试剂也购自ProteinSimple，备用。

结果：

上述方法的结果见图1和图2。图1显示当用不同浓度的ATR-002处理CaCo-2感染SARS-CoV-2(MOI 0.1)的细胞时，ERK以及SARS-CoV-2和核衣壳蛋白(病毒标记物)的抑制在ATR-002的浓度为50和100μM时观察到。抑制所需的高含量的ATR-002与病毒滴度无关，而是由于选择了具有组成型活性MEK的CaCo2细胞，因此高含量是MEK抑制剂所必需的。这些实验表明SARS-CoV-2使用MEK通路进行病毒输出。

此外，图2显示在24小时、36小时和48小时的整个观察期间内，感染SARS-CoV-2并用50μM ATR-002处理的Vero细胞具有比对照细胞更低的病毒载量，这表明该抑制剂不仅引起病毒复制的延迟，而且以持续方式抑制繁殖。这通过测定SARS-CoV-2病毒基因RdRP得到证实。

实施例2：SARS-CoV-2在Calu-3细胞中的复制和SARS-CoV-2生命周期中的ERK激活以及ATR-002的抑制作用

为了验证在CaCo2和Vero细胞中观察到的效果，在人支气管上皮细胞系Calu-3上进行进一步的测试。首先，测试SARS-CoV-2是否能够感染Calu-3细胞(A)，以及感染是否会导致Calu-3细胞中ERK的激活(磷酸化)(B)。此外，测试ATR-002是否能够在Calu-3细胞中抑制SARS-CoV-2(C)。

A.用SARS-CoV-2感染Calu-3细胞

在补充有10％标准化胎牛血清(FBS Advance；Capricone)、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的Dulbecco’s modified Eagle’smedium培养基(DMEM)中培养人支气管上皮细胞系Calu-3。所有细胞在37℃和5％CO₂的加湿培养箱中培养。用感染-PBS(含有0.2％BSA、1％CaCl2、1％MgCl2、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)中的SARS-CoV-2分离物hCoV-19/Germany/FI1103201/2020(EPI-ISL_463008)以MOI为2感染Calu-3细胞，或者模拟感染Calu-3细胞。从感染后4小时开始，分析新产生的SARS-CoV-2病毒颗粒和上清液的滴度。图3A显示了三个独立实验的结果。图3B显示了在指定时间点之后制备的蛋白质印迹裂解物。图3C和D显示了感染过程中SARS-CoV-2N和S蛋白表达和激酶磷酸化的定量。显示了三次独立实验的平均值±SD。数据通过单向ANOVA，随后通过Dunnett的多重比较检验(*p≤0.0332；***p≤0.0001)。虚线表示0h感染的水平。(C，D)对(B)中所示定量的示例性蛋白质印迹法。在图3(E)所示的进一步实验中，使用不同的MOI用SARS-CoV-2(FI)感染Calu-3细胞。感染后1小时分析ERK-激活。

从图3可以看出，SARS-CoV-2能够在Calu-3细胞中复制。此外，可以看出，SARS-CoV-2感染在病毒生命周期的非常早期阶段导致ERK激活。在感染后1小时观察到ERK激活。在病毒生命周期的后期没有观察到额外的ERK激活，这表明该通路激活在病毒感染的早期过程可能的作用。

B.在Calu-3细胞中通过SARS CoV-2激活ERK

为了分析ERK(在Raf/MEK/ERK通路中MEK的直接靶标)在SARS-CoV-2生命周期期间的重要性，将ERK1/2敲除引入Calu-3细胞中。靶向后72小时，用SARS-CoV-2感染细胞，并评价病毒刺突蛋白的表达和子代病毒颗粒的产生。发现ERK敲除导致子代病毒滴度产生降低，如图4(A-C：MOI：1.0；D：MOI：0.1)所示。图4A显示了感染后8小时分析的病毒S₀蛋白的表达。制备免疫印迹，并用抗S、抗ERK1/2和抗微管蛋白抗体探测。显示了三个独立实验中的一个的结果。图4B显示了S₀蛋白表达和敲除效果的定量。显示了三次独立实验的平均值±SD。数据通过了未配对的双尾t-检验(*p≤0.0332,****p≤0.0001)。图4C显示了(A)的滴度，显示了三次独立实验的平均值±SD，每次实验一式两份进行。PFU/ml：数据通过了带有Welch校正的非配对双尾t检验。百分比：数据通过了配对双尾t检验(*p≤0.0332；***p≤0.0002)。图4D显示感染后24小时的滴度分析。显示了三次独立实验的平均值±SD，每次实验一式两份进行。PFU/ml：数据通过了带有Welch校正的非配对双尾t检验。百分比：数据通过了配对双尾t检验(*p≤0.0332；****p≤0.0001)。

因此，显示ERK的敲低会导致刺突蛋白表达的降低和子代病毒颗粒的产生，不仅证实了ERK在病毒生命周期中的作用，而且通过遗传手段证实了MEK/ERK激酶模块在SARS-CoV-2增殖中的功能。

C.ATR-002能够抑制Calu-3细胞中的SARS-CoV-2

然后测试MEK抑制剂是否能以与实施例1中CaCo2和Vero细胞中观察到的降低相当的方式降低Calu-3细胞中的SARS-CoV-2滴度。用SARS-CoV-2感染Calu-3细胞，并使用与实施例1相同的病毒产生方案，用100μM、75μM或50μM ATR-002处理。具体地，对于病毒产量降低试验，制备具有95％融合的Vero E6、CaCo2和Calu-3细胞的24孔板。在用SARS-CoV-2SA(MOI 0.1、1和10)感染前，每用感染培养基洗涤各孔一次每孔200μL感染培养基，洗涤1小时。然后完全除去病毒接种物，用感染培养基洗涤孔一次，然后每孔用1mL的不同浓度的ATR-002(100μM，75μM，50μM，0μM)在含有1％DMSO的感染培养基中，在37℃，5％CO₂下处理24小时。每种条件制备的三个孔。在感染后24小时合并每种条件的三个孔的上清液，并以最大速度，在4℃下离心5分钟，以除去细胞碎片。从上清液制备140μL等份试样并在-80℃下储存，通过RT-qPCR(实时定量聚合酶链反应)以一式三份测定样品的病毒滴度。因此，分离出病毒RNA，用于检测病毒RNA拷贝的探针针对SARS-CoV-2N基因。

从图5可以看出，对所有细胞类型上所见的效果是相当的。

在下一步骤中，将Calu-3细胞与增加量的ATR-002孵育24、48或72小时。具体地，Calu-3细胞用SARS-CoV-2(FI)感染，MOI为0.01。感染后1小时，用ATR-002处理细胞，Mock、SARS-CoV-2和DMSO作为对照。图6A显示了ATR-002(10-150μM)处理后，Calu-3细胞中SARS-CoV-2的滴度降低。未处理的(SARS-CoV-2)和DMSO(0.1％)处理的细胞作为阴性对照。数据代表三次独立实验的平均值±SD，每次实验一式三份进行。通过单向ANOVA，随后Dunnett多重比较检验(**p≤0.0021；***p≤0,0002；****p≤0.0001)，对每个时间点的数据分别进行。DMSO用作参照。图6B示出了来自(A)的值的EC50计算值。与(C)的数据一起用于计算CC50值和选择性指数(SI)。图6C显示了72小时处理后，ATR 2在Calu-3细胞中的细胞毒性评价。数据代表三次独立实验的平均值±SD。图6D显示了(A)的三个独立实验中的一个的光学显微镜照片。我们可以观察到子代病毒颗粒产生浓度依赖性降低。在无毒浓度范围内，这种作用在72小时的总感染时间内保持，表明ATR-002的通路抑制对病毒生命周期具有长时间的影响。

实施例3：ATR-002对SARS-CoV-2SA变体B.1351的体外效力

使用与实施例1和2相同的实验设置来观察ATR-002是否对南非SARS-CoV-2变异体B.1351有效。以MOI为0.1、1和10的SARS-CoV-2SA感染Vero细胞和Calu-3细胞，并用20.48、30.72和40.96μg/ml(对应于50、75和100μM)的ATR-002处理，这可以从图7与图5相比中看出。

具体地，对于病毒产量降低的测定，制备具有95％融合的Vero E6和Calu-3细胞的24孔板。在用SARS-CoV-2SA(MOI 0.1、1和10)感染前，用感染培养基洗涤各孔一次，每孔200μL感染培养基，洗涤1小时。然后完全除去病毒接种物，用感染培养基洗涤孔一次，然后每孔用1mL不同浓度的ATR-002(100μM，75μM，50μM，0μM)在包含1％DMSO的感染培养基中，在37℃，5％CO₂下处理24小时。每种条件制备三个孔。在感染后24小时，合并每种条件的三个孔的上清液，并以最大速度、5分钟、4℃下离心，以除去细胞碎片。从上清液制备140μL等份试样，并在-80℃下储存，通过RT-qPCR(实时定量聚合酶链反应)以一式三份测定样品的病毒滴度。因此，分离出病毒RNA，用于检测病毒RNA拷贝的探针针对SARS-CoV-2N基因。

如图7所示，在SARS-CoV-2SA变体的Vero和Calu-3中都可以看到ATR-002降低病毒产量。

实施例4：ATR-002降低急性肺损伤(ALI)小鼠模型中细胞因子和趋化因子基因的表达

LPS诱导的ALI小鼠模型的细胞因子和趋化因子表达允许研究体内不存在病毒感染的情况下ATR-002的免疫调节功效。

方法：

用腹膜注射氯胺酮(10mg/kg)溶液麻醉小鼠。两个治疗组均经由腹腔注射以5mg/kg PBS中制备的LPS刺激。刺激后一小时，治疗组经由腹腔注射途径用25mg/kg ATR-002处理。处理后6小时对小鼠实施安乐死，然后将肺直接保存在RNA中。使用RNeasy PlusUniversal Midi试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)，根据制造商的说明书，从肺中分离RNA。用无RNase的水进行两轮RNA洗脱，并在-20℃保存，用于进一步分析。RNA质量使用NanoDrop分光光度计(ThermoFisher Scientific)测定，并用RT² First Strand Kit(Qiagen，Hilden，Germany)逆转录。之后，将该cDNA与RT² Green qPCR Mastermix一起用于实时RT² Profiler PCR Array。为了最佳性能，阵列被定制为包括：84个基因和5个用于数据标准化持家基因。为了进行质量控制，包括了小鼠基因组DNA污染测试、3次逆转录效率测试和3次PCR阵列重复性测试。提供了编码中度和重度COVID-19中涉及的细胞因子和趋化因子的基因表达的结果。

使用以下序列：

结果：

图8显示，用ATR-002处理ALI小鼠导致细胞因子TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-8、MCP-1和MIP-1β降低。如上文背景技术部分所述，根据Huang等人，与第II阶段COVID-19住院治疗的水平相比，所有这些细胞因子在COVID-19患者中均增加，并且TNF-α、IP-10和MIP-1β在第III阶段COVID-19患者中增加。这表明，与SARS-CoV-2感染无关，ATR-002能够降低哺乳动物中细胞因子和趋化因子基因的表达。

实施例5：ATR-002降低CaCo2细胞和Calu-3细胞中SARS-CoV-2感染后的促炎细胞因子/趋化因子应答

如实施例1所述，用SARS-CoV-2感染CaCo2细胞，并用ATR-002处理。测量MCP-1的量，结果如图9所示。具体地，ATR-002能够降低SARS-CoV-2感染的细胞中的MCP-1表达。然而，如实施例1所述，需要大量的ATR-002，这是由于CaCo2细胞中MEK通路的组成性激活。由于体细胞驱动器突变，需要大量的ATR-002以抑制SARS-CoV-2感染的CaCo2细胞中MCP-1的表达。我们进一步提出了这样的问题，即ATR-002是否能够降低Calu-3细胞中促炎细胞因子的表达。因此，我们用SARS-CoV-2感染Calu-3细胞，并如实施例2所述用增加量的ATR-002处理它们。用SARS-CoV-2(FI)感染Calu-3细胞，MOI为0.01。感染后1小时，用ATR-002处理细胞。Mock、SARS-CoV-2和DMSO作为对照。通过定量实时PCR对IL-6、IL-8、MCP-1、IP-10和CCL5mRNA的表达进行分析。结果如图10所示，为模拟感染细胞的n-倍mRNA表达。数据代表三次独立实验的平均值±SD，每次实验一式三份进行。数据通过单向ANOVA检验，随后通过Dunnett多重比较检验(*p≤0.0332；**p≤0.0021；***p≤0,0002；****p≤0.0001)，对于每个时间点分别进行。DMSO用作参照。结果证实，ATR-002不仅可以降低子代病毒颗粒的产生，如前面实施例所示，而且可以降低促炎细胞因子的表达。这是ATR-002治疗的额外益处，其降低了病毒感染期间细胞因子风暴的可能性。

在第二步中，为了研究ATR-002处理对抗病毒干扰素和促炎性细胞因子表达的一般作用，用polyI：C转染A549细胞24小时。同时，用增加量的ATR-002处理细胞。DMSO作为对照。发现ATR-002对MEK的抑制不影响IFN应答，但在poly(I：C)刺激后会降低促炎性IL-8的表达。

具体地，人肺上皮A549细胞(2x10⁵/ml)通过脂质体2000(Lipofectamine2000)用100ng/ml poly(I：C)转染，并用所示浓度的MEK抑制剂ATR-002处理24小时。转染后6小时更换转染培养基。未刺激的对照也暴露于含有与刺激细胞浓度相当的脂质体(Lipofectamine)的转染培养基。这些实验的结果如图11所示。图11A显示了抑制剂处理24小时后取出的用于蛋白质印迹的细胞裂解物，并使用针对pERK/ERK、pSTAT/STAT和微管蛋白的第一抗体通过免疫印迹进行分析。通过HRP连接的二抗和增强的化学发光检测蛋白质表达。在图11B中，根据补充方案，使用Qiagen Rneasy mini试剂盒分离抑制剂处理24小时后的RNA。在LightCycler 480(Roche)中使用合成的cDNA、SYBR Green和相应的引物对进行RT-qPCR以确定MxA和IL8 mRNA的表达水平。数据代表三次独立实验的平均值±SD，每次实验一式三份进行。数据通过单向ANOVA检验，随后是Dunnett多重比较检验(**p≤0.0021；***p≤0,0002)，对于每个时间点分别进行。Mock用作参照。

发现ATR-002处理不影响抗病毒干扰素系统的刺激，如MxA mRNA的恒定表达所示。相反，即使在低浓度ATR-002的情况下，发现促炎性IL8表达的强烈降低。

实施例6：ATR-002降低外周血单核细胞(PMBC)中的促炎细胞因子/趋化因子应答

为了检查细胞因子降低所需的ATR-002浓度，研究了ATR-002处理后LPS诱导的PMBC细胞中IP10、TNF-α和MCP-1表达的量。从图12可以看出，在10μg/ml ATR-002处理后，三者都减少，表明10μg/ml ATR-002足以抑制人PBMC中>90％的LPS诱导的MCP-1。

在进一步的研究中，研究了化合物ATR-002抑制人T细胞炎症的能力，如通过特定细胞因子的释放所测定的。使用来自三(3)名人供体的外周血单核细胞(PBMC)，在24小时的暴露时间内，在三(3)个浓度(100、50和25μM)下，以生物学一式三份测试化合物。抗CD3、ConA和PHA分别用作T细胞刺激剂。

方法：

T细胞炎症抑制试验方案(抗CD3刺激)

第1天

·使用PBS 1x用抗CD3(克隆UCHT-1，100ng/孔)和同种型IgG1包被高结合平板，并在4℃孵育过夜。第2天

·将冷冻保存的PBMC滴落解冻并稀释至适当的密度，并以每孔228μL培养基(RPMI1640，10％热灭活FBS，1％青霉素/链霉素，2mM L-谷氨酰胺)接种到U底96孔聚丙烯板(每孔1.2×10⁵个细胞)中。

·在加入测试化合物之前，将细胞在37℃、5％CO₂下孵育1小时。

·将测试化合物溶解在PBS中，并用细胞培养基进一步稀释至20X。将测试化合物以12μL(1X)的体积加入PBMC中，一式三份，并在37℃、5％CO₂下孵育1小时。

·对于参比化合物，根据平板图谱将12μL地塞米松(100nM)加入对照孔中，并在37℃，5％CO₂下孵育1小时。

·孵育1小时后，将200μL用测试化合物或对照处理的细胞(1×10⁵)转移至抗CD3包被板，并在37℃、5％CO₂下孵育24小时。

·对于阳性和阴性对照，将200μL(1×10⁵)细胞转移到具有抗CD3或同种型IgG1的包被平板。

·将平板以200×g离心10分钟。收集细胞培养上清液并在-80℃下储存直至需要用于分析。

T细胞炎症抑制分析方案(ConA和PHA刺激)

·将冷冻保存的PBMC滴落解冻并稀释至适当的密度，并接种到96孔聚苯乙烯板(2×10⁵细胞/孔)中，每孔150μL培养基(RPMI 1640，10％热灭活FBS，1％青霉素/链霉素，2mML-谷氨酰胺)。

·将测试化合物溶解在DMSO中，并用细胞培养基进一步稀释至20X。将化合物以10μL(1X)的体积加入到PBMC中，一式三份，并在37℃、5％CO₂下孵育1小时。

·对于参比化合物，根据平板图谱将10μL地塞米松(100nM)加入对照孔中，并在37℃，5％CO₂下孵育1小时。

·孵育1小时后，将40μL ConA(30μg/mL)和PHA(10μg/mL)加入到测试化合物或对照孔中，得到200μL的最终测定体积。将板在37℃，5％CO₂孵育24小时。

·以10μL稀释的工作原液的体积将对照加入到PBMC中，随后加入10μL适当稀释的溶媒，以模拟化合物的加入，得到200μL的最终测定体积。试验中DMSO载体的终浓度为0.1％。

·在24小时孵育后，将平板以200×g离心10分钟。收集细胞培养上清液并在-80℃下储存直至需要用于分析。

数据分析和分析物检出限

测量的细胞因子/趋化因子

抗CD3刺激

GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-17A、MIP-1α和TNFα

ConA刺激

GM-CSF、IFNγ、IL-1β、IL-1RA、IL-6、MIP-1α和TNFα

PHA刺激

IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13、MIP-1α和TNFα

按照制造商的方案，使用Millipore Sigma(目录号HCYTOMAG-60K)的人细胞因子/趋化因子磁珠板，标准范围为3.2、16、80、400、2000、10,000pg/mL，对细胞培养上清液中细胞因子水平进行Luminex评估，所有细胞因子都以1:20稀释在Luminex测定缓冲液中。

使用5点非线性回归分析，从标准曲线内插每种细胞因子的诱导水平，其中y＝(A+((B-A)/(1+(((B-E)/(E-A))*((X/C)^D))))。将中值荧光单位形式的原始数据插入测试浓度(pg/mL)中。

结果：

与刺激比较的P-值(总结)

总结：

如图14所示，发现ATR-002显示对抗CD3刺激、ConA刺激和PHA刺激的细胞因子/趋化因子刺激具有显著的剂量依赖性抑制。地塞米松抑制对照组会降低细胞因子/趋化因子的分泌，这证实了该测定的性能。

实施例7：

RESPIRE——一项随机、双盲、安慰剂对照临床研究，旨在评价ATR-002在患有中度冠状疾病(COVID-19)的成年住院患者中的安全性和功效。本研究的主要目的是通过第15天的临床严重程度状态评估来证明ATR-002与安慰剂相比在治疗患有COVID-19的患者中的功效，每种药物都是标准护理。ATR-002具有治疗COVID-19的潜力，因为其作用模式具有双重益处(效果)：(1)抗病毒剂，和(2)免疫调节(干扰细胞因子风暴)。该临床研究将招募200名患有中度冠状病毒病第II阶段的成年住院患者。在随机分组前立即采集鼻咽拭子以在此之后确认SARS-CoV-2的存在。

本研究选择的患者是筛查时年龄为18岁或以上且需要住院的成人，其显示感染COVID-19的临床症状，确定为发烧，发烧确定为体温≥37.3℃(腋下)，≥38.0℃(口腔)或≥38.6℃(直肠或鼓膜)，并且在室内空气中SpO₂<＝94％或需要补充氧气以维持SpO₂>94％。第一位患者于2021年4月14日接受治疗，然而治疗结果还不能获得。然而，本发明人确信ATR-002将证明在治疗第II阶段COVID-19患者和预防与从第II阶段至第III阶段COVID-19转变相关的细胞因子风暴中有效。

实施例8：

ATR-002在叙利亚仓鼠感染模型中抗SARS-COV-2的功效

本研究的目的是调查化合物ATR-002在仓鼠模型中SARS-CoV-2攻击后的治疗效果。用100mg/kg负荷剂量处理动物，随后用75mg/kg负荷剂量处理动物，每天一次。这是指在上述实施例7中使用人等效剂量为900mg负荷，随后600mg负荷，每天一次。

方法

在研究ATR-002在仓鼠模型中治疗SARS-COV-2的功效之前，通过口服途径测试三种不同的剂量，预期使用这些剂量，将达到在循环中抑制Raf/MEK/ERK信号传导通路＞80％的水平，并因此有效对抗SARS-COV-2的体内感染。本研究的结果用于确定功效研究中的剂量水平和方案。通过鼻内感染1×10 ³TCID ₅₀SARS-CoV-2(有复制能力的病毒的量)感染动物。治疗方案定义如下：

*由于一只动物死于吸入性肺炎，因此结果中仅显示5只动物。

感染SARS-CoV-2的仓鼠的治疗开始于感染后(p.i.)4小时或24小时，用100mg/kg负荷剂量的ATR-002开始，然后用75mg/kg ATR-002每日治疗，直到感染后第3天。在感染后第3天，取咽拭子以确定有复制能力病毒(TCID50)的数量。在感染后第4天，对动物实施安乐死，收集鼻甲以量化感染性病毒滴度，并检查肺叶的感染区域。

动物

动物处理

麻醉

对于所有动物程序，用异氟烷(3-4％/O₂)使动物镇静。

口服给药

通过使用灌胃针以500μL/150g的体积所述的剂量进行试验项目的口服给药。因此，对动物称重，并根据记录的体重调整所用的剂量体积。然后在恢复期间监测动物。

鼻内给药

对于鼻内给药，将动物仰卧，使用移液管将接种物(100μl)均匀地分配到两个鼻孔上。将动物仰卧，直到吸入完整的接种物，之后将它们放回笼中以恢复。

临床观察

由动物设施技术人员每天进行观察和记录，随后实验室技术人员每天质询(动物福利和临床观察)。观察时记录下包括起皱的皮毛、驼背姿势、呼吸加速和昏睡的症状。

在研究期间，使用电子天平在固定的时间点对动物称重(内部个体天平数量和性能将以适当的形式记录)。以适当的形式记录体重。

预防措施

需要采取的预防措施是处理动物、操作锐器和在BSL(DM)3条件下工作(外部临床前设备手册)。

接种后取样

研究期间，在固定的时间点对呼吸道取样。简而言之，将咽喉拭子收集在病毒转运培养基中，等分并储存。尸检时，收集组织样品并储存在10％福尔马林中用于组织病理学检查，并冷冻用于病毒学分析。对于病毒学分析，称重组织样品，在感染培养基中匀浆，并在滴定前短暂离心。

盲法/偏差减少方法

所有进行临床观察和实验室分析(需要解释数据)的人员在完成研究前的任何时间都不知道随机处理分配密钥(Random Treatment Allocation Key)，并且通过将唯一的样品编号分配给收集的每个样品而使其不知情。

有复制能力的病毒的检测

如上所述，使用一式四份10倍连续稀释液测定Vero E6细胞融合层中的病毒滴度(Vero E6细胞上的SARS-CoV-2滴定)。为此，制备样品(喉拭子和组织匀浆)的系列稀释液，并在Vero E6单层上于37度孵育1小时。洗涤Vero E6单层，并在37℃孵育4-6天，之后使用WST8(比色评估)对平板进行评分。使用微量平板读数器测量平板在450mn(OD450)下的光密度。使用Spearman-Karber方法计算病毒滴度(TCID ₅₀)。

病毒RNA的检测

使用喉拭子和匀浆组织样品检测病毒RNA。为此，分离RNA，并使用如Corman等人(Detection of 2019novel coronavirus(2019-nCoV)by real-time RT-PCR.EuroSurveill.2020；25(3))所述的特异性引物(E_Sarbeco_F：ACAGGTACGTTAATAG TTAATAGCGT和E_Sarbeco_R：ATATTGCAGCAGTACGCACACA)和探针(E_Sarbeco_P1：ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG)进行Taqman PCR。计算不同样本中的病毒拷贝数。

总体病理学

在对所有动物进行尸检时(发现感染后死亡，由于达到人道终点而实施安乐死，或在实验终点而实施安乐死)，对每只动物进行总体病理学分析，并描述所有异常情况。检查所有肺叶，描述了从背面观察的受影响肺组织的估计百分比，另外，还记录了在全身总体病理学期间其他器官中观察到的任何其他异常。

将左肺叶和鼻甲保存于10％中性缓冲福尔马林中以进行组织病理学分析，随后将这些组织的右侧匀浆，并进行Taqman PCR和病毒滴定。

结果：

在感染后第3天收集喉拭子，并在Vero E6细胞的TCID ₅₀试验中以及qPCR试验中分析病毒载量。ATR-002处理导致喉拭子中子代病毒减少。在感染后已经处理4小时(图16A)和感染后已经处理24小时(图16A)的组中，分别观察到1.1log10(P＝0.0134)和1.3log10(P＝0.0191)的减少。这些结果得到PCR的支持，其证实1.1log10(P＝0.0089)和1.2log10(P＝0.0090)的减少(图16B)。

在感染后第4天，鼻甲中的感染性病毒载量也观察到类似的模式，而在感染后4小时开始处理(图16C)，但不是在感染后24小时开始处理，感染病毒滴度显着降低(图16C)。感染后4小时开始处理，在仓鼠的鼻甲中感染性病毒滴度(TCID50/g组织)降低，为1.3log10(P＝0.0335)(图16C)。这些数据再次通过PCR证实。感染后4小时开始处理时，发现1.1log10(P＝0.0145)减少(图16D；红点)。

在感染后第4天，检查感染动物的肺损伤，并估计受影响肺面积的百分比。每种处理导致受影响肺组织显著减少(分别为P＝0.0282，P＝0.0314)(图16E)。

与接受载体的组相比，两组的治疗耐受性良好，没有显著的体重减轻(图16F)或任何明显的副作用。

总结

在SARS-CoV-2攻击后，在仓鼠模型中测试了人等效剂量ATR-002的抗病毒效果。在感染当天或感染后24小时处理动物，并在攻击后第3-4天分析参数，如肺损伤百分比和咽喉拭子和鼻甲组织中病毒载量。ATR-002处理导致SARS-CoV-2叙利亚仓鼠感染模型中病毒滴度和肺损伤的显著降低。第一次治疗选择的剂量为100mg/kg，然后75mg/kg，每天一次，代表用于实施例7中描述的ATR-002 2期临床试验的900mg，随后600mg人剂量的仓鼠等效剂量，因此，本发明的结果完全支持ATR-002临床试验的剂量论证。

实施例9：ATR-002对原代人气液干扰(ALI)培养物中病毒复制的影响

ALI细胞培养物取自四名健康成年人的喉拭子。扩增来自拭子的细胞，然后进一步在transwell小室嵌体的多孔膜的顶侧上培养。在浸没生长至接近融合后，从顶室中除去培养基，以允许暴露于空气时细胞分化。四种ALI培养物中的三种可以感染SARS-CoV-2，并用两种不同浓度的ATR-002处理。感染后1小时，用SARS-CoV-2(FI)感染ALI细胞，MOI为1.0.。用ATR-002(50μM，100μM)处理细胞。未处理的(SARS-CoV-2)和DMSO(0.1％)处理的细胞作为阴性对照。图17示出了一个实验的结果。两种浓度(50μM和100μM)都完全阻断了这三种培养物中子代病毒颗粒的产生，表明ATR-002在ALI培养物中对SARS-COV-2感染非常有效。

实施例10：MEK抑制剂在预防SARS-CoV-2感染中作用的进一步研究

已知SARS-CoV-2可以通过ACE2/TMPRSS2进入细胞。ACE2和TMPRSS2的表达对Raf/MEK/ERK信号传导通路激活的可能影响在下一组实验中阐明。用SARS-CoV-2感染过表达ACE2和TMRPSS2的A549细胞，在感染后1小时分析RK的磷酸化状态。A549细胞和Calu-3细胞分别作为阴性和阳性对照。

具体地，用MOI为2.0的SARS-CoV-2(FI)感染Calu-3细胞。感染后1小时，制备免疫印迹，并用抗-pERK1/2、抗-ERK1/2和抗微管蛋白抗体探测。图18中显示了三个独立实验中的一个的结果。模拟感染的细胞(mock infected cells)作为阴性对照。在SARS-CoV-2感染期间，A549细胞中ACE2的过表达导致ERK激活。

此后，测试ATR-002处理后细胞中ACE2表达是否降低。用ATR-002处理Calu-3细胞24小时，并通过免疫荧光显微镜和WES技术分析结果。具体地，将Calu-3细胞接种在24孔板中的玻璃盖玻片上，每孔1×10 ⁵个细胞，并在37℃、5％CO₂下孵育48小时，用培养基(含有10％FBS和1％P/S的IMDM)洗涤细胞后，将1mL 100μM ATR-002培养基或1mL 1％DMSO(溶剂对照)培养基加入到孔中，并在37℃、5％CO₂孵育24小时。

然后用PBS洗涤孔一次，并在室温下用300μL/孔的4％PFA的PBS固定10分钟。用PBS进行另一次洗涤步骤后，在室温下用1％BSA 的PBS封闭细胞1小时，然后用200μL/孔的一抗(山羊-抗-ACE2抗体(R&DSystems；目录号：AF933；批号：HOK0320061)(1:20)在1％BSA 的PBS中室温下在振荡器(100rpm)上孵育1小时。然后，用PBS洗涤细胞三次，然后用200μL/孔的二抗驴抗羊IgG(H+L)高交叉吸收的二抗(Donkey anti-Goat IgG(H+L)Highly Cross-Absorbed Secondary Antibody)，Alexa Fluor plus647(Invitrogen；参考号：A32 TR；批号：VE306231)(1:200)在1％BSA 的PBS中孵育45分钟。再用PBS洗涤三个步骤，将200μLRhodamine Phalloidin(Invitrogen；参考号：415；批号：LStoplus2)(1:40，PBS中1％BSA中)添加到每个孔中，并在室温摇床上孵育30分钟。用PBS进行两次最后的洗涤步骤后，将盖玻片从孔中取出，并用-Mount FluorCare DAPI(Roth；商品编号：HP20.1；批号：080293945)安装在显微镜载玻片上。将载玻片在4℃下在黑暗中干燥，然后使用共焦激光扫描显微镜(LSM800，Zeiss)进行分析。

结果如图19所示，其中清楚的是ATR-002导致Calu-3细胞上的ACE2减少。

使用MOI为0.001或0.01的SARS-CoV-2(FI)感染细胞系。感染后1小时，用ATR-002处理细胞。未处理的和DMSO处理的细胞作为对照。在感染后8、24、48和72小时后分析滴度。ATR-002(100μM)处理后不同细胞系中SARS-CoV-2的滴度降低。未处理的(SARS-CoV-2)和DMSO(0.1％)处理的细胞作为阴性对照。

如果细胞以MOI为0.001感染，ATR-002降低Calu-3和A549-ACE2/TMPRSS2细胞中子代病毒颗粒的产生。令人惊讶的是，当病毒接种物的浓度高十倍(MOI：0.01)时，ATR-002处理不影响A549-ACE2/TMPRSS2细胞中子代病毒颗粒的产生。SARS-CoV-2可以通过两种不同的途径进入细胞。通过TMPRSS2直接激活刺突蛋白，导致病毒和细胞膜融合，或者通过组织蛋白酶L内化和激活刺突蛋白。

最后，为了分析用MEK抑制剂处理是否可降低ACE2的表达，将Vero细胞与MEK抑制剂CI-1040或ATR-002预孵育，并用携带SARS-CoV-2刺突蛋白的VSV假型病毒系统感染。通过光学显微镜分析阳性细胞。具体地，在用VSVΔG/GFP-Luc+SΔ21(MOI 0.01)感染1小时之前，将Vero细胞与20μM CI-1040或100μM ATR-002孵育1小时、2小时、4小时和24小时。GFP阳性细胞在感染后24小时分析。DMSO作为阴性对照，设定为100％。图21和22中所示的数据分别代表CI-1040和ATR-002预孵育的三个独立实验的平均值±SD。数据通过双向ANOVA检验，随后通过Sidak检验(P≤0.05；**P≤0.001)。

发现以CI-1040或ATR-002预孵育会导致VSV假型病毒内化的减少。这种影响是时间依赖性的。用CI-1040或ATR-002预孵育越久，GFP阳性细胞的量越低，其为感染的读数。这些结果表明MEK抑制剂如CI-1040和ATR-002降低ACE2的细胞表达。

参考文献

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Claims

1.用于治疗人受试者中由冠状病毒引起的疾病的方法中的MEK抑制剂，其中所述人受试者是住院的。

2.根据权利要求1所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述疾病是急性呼吸系统疾病。

3.根据权利要求1或2所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述冠状病毒是SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS。

4.根据权利要求3所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2，并且所述患者患有COVID-19。

5.根据权利要求4所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述COVID-19是II期COVID-19。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐或代谢物。

7.根据权利要求6所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂是PD-0184264或其药学上可接受的盐，其中PD-0184264或其药学上可接受的盐优选以100至1000mg、优选300至900mg、最优选300、600或900mg的剂量每日一次施用于人受试者。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述患者罹患由SARS-CoV-2引起的COVID-19。

9.根据权利要求8所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中SARS-CoV-2是变体，优选选自D614G、B.1.1.7、B.1.351、P1、P2、B.1.617、B.1.427、B.1.429、B.1.525或B.1.526。

10.根据权利要求8或9所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述COVID-19是II期COVID-19。

11.根据权利要求10所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂PD-0184264在入院后连续1至21天、优选连续5至18天或连续7至14天施用于人受试者。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂PD-0184264以口服剂型施用于所述人受试者。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述冠状病毒对先前的抗病毒治疗有抗性，其中所述先前的抗病毒治疗优选施用瑞德西韦。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述住院的人受试者超过60岁或属于冠状病毒的极高风险或高风险组。

15.用于治疗或预防SARS-CoV-2感染的受试者中的COVID-19细胞因子风暴的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂优选选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS703026、PD05989和PD184352或其药学上可接受的盐或代谢物。

16.根据权利要求15所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述用途包括降低所述受试者中IL-1β和/或TNF-α的水平，优选降低所述受试者中TNF-α、IL-1β、IP-10、IL-6、IL-8、MCP-1、MIP-1α和MIP-1β中的一种或多种、两种或多种、三种或多种、四种或多种、五种或多种或所有六种的水平。

17.根据权利要求15或16所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述SARS-CoV-2是变体，优选选自D614G、B.1.351、B.1.1.7、P1、P2、B.1.617、B.1.427、B.1.429、B.1.525和B.1.526。

18.用于预防感染人冠状病毒的无症状受试者中由人冠状病毒感染引起的症状的发展，或者预防与感染人冠状病毒的人紧密接触的受试者中的人冠状病毒感染的MEK抑制剂，其中所述MEK抑制剂优选选自PD-0184264、CI-1040、GSK-1120212、GDC-0973、比美替尼(Binimetinib)、司美替尼(Selumetinib)、PLX-4032、AZD6244、AZD8330、AS-703026、RDEA-119、RO-5126766、RO-4987655、PD-0325901、TAK-733、AS302706、PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐或代谢物。

19.根据权利要求18所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述人冠状病毒是SARS-CoV、SARS-CoV-2或MERS。

20.根据权利要求19所述的用于所述用途的MEK抑制剂，其中所述SARS-CoV-2是变体，优选选自D614G、B.1.351、B.1.1.7、P1、P2、B.1.617、B.1.427、B.1.429、B.1.525或B.1.526。

21.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至20中任一项所述用途的MEK抑制剂。