KR20210125979A - 핵산 전달을 위한 혼성 희생 세포-침투 복합체 - Google Patents

핵산 전달을 위한 혼성 희생 세포-침투 복합체 Download PDF

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올레 오던 베르너 하베스
매튜 프랭크
아드리엔느 샐레츠
팀 알 블레이크
로버트 엠 웨이마우스
폴 웬더
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Abstract

본 명세서에는 특히 생체내에서 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 복합체, 조성물 및 방법이 제공된다. 상기 복합체, 조성물 및 방법은 시험관내 및 생체내에 둘 다에서 표적 세포, 조직 및 장기 내로의 올리고뉴클레오티드 및 다음이온성 카고의 전달 및 방출, 복합체화, 보호를 용이하게 할 수 있다.

Description

핵산 전달을 위한 혼성 희생 세포-침투 복합체
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2018년 11월 9일자로 출원된 미국 가출원 제62/758,487호의 이익을 주장하며, 이는 전문이 모든 목적을 위해서 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
연방정부의 후원 연구 및 개발 하에 수행된 발명에 대한 권리에 관한 기재
본 발명은 에너지부(Department of Energy)가 수여한 계약 DE-SC0005430, 국립 과학 재단(National Science Foundation)이 수여한 계약 1306730, 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 계약 CA031841 및 CA031845에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 정부가 본 발명의 특정 권한을 갖는다.
ASCII 텍스트 파일로 제출된 서열목록, 표 또는 컴퓨터 프로그램 목록 부록에 대한 참조
2019년 11월 11일자로 작성되고, 6,992 바이트, 기계 포맷 IBM-PC, MS 윈도우 운영 시스템의 파일명 041243-533001WO_SEQUENCE_LISTING_ST25.TXT에 기재된 서열 목록은 참조에 의해 포함된다.
광범위한 임상, 진단 및/또는 연구 응용에 필요한 바와 같이, 세포의 원형질막 및 기타 생물학적 장벽을 통해 치료제, 진단 프로브 및/또는 연구 도구의 전달을 가능하게 하거나 향상시키는 새로운 재료 및 전략에 대한 요구가 존재한다. 이러한 카고, 예를 들어, 핵산의 전달은 감염 질환, 암 면역요법, 단백질 요법 및 유전자 편집을 위한 백신접종 요법과 관련된 상당한 임상 가능성을 갖는다. 본 명세서에는 당업계에서 이러한 문제 및 다른 문제에 대한 해결책이 제공된다.
제1 양태에서, 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체(cell-penetrating complex)가 제공되며, 이러한 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는 나노입자 조성물이 제공된다.
또 다른 양태에서, 하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체가 제공된다: H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)(식 중, L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임). 실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 알킬렌이다. 실시형태에서, L1은 펩티드(예를 들어, 아미노산 서열)이다.
또 다른 양태에서, 하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체가 제공된다: H-L1-[(LP1)z1-(LP3)z1a-(IM)z2-(LP2)z3-(LP4)z3b]z4-L2-H(I)(식 중, L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1, LP2, LP3 및 LP4는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이고, LP1, LP2, LP3 및 LP4 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z1, z1a, z3 및 z3b는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1, z1a, z3 또는 z3a 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임). 실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 알킬렌이다. 실시형태에서, L1은 펩티드(예를 들어, 아미노산 서열)이다.
또 다른 양태에서, 핵산을 세포에 형질주입시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포를 본 명세서에 개시된 바와 같은 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체가 제공된다: R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5(식 중, R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R2A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고, LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이고, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 독립적으로 pH-감응성 희생 도메인이고, z5는 1 내지 10의 정수이고, z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 독립적으로 2 내지 100의 정수임). 실시형태에서, R1A는 수소이다. 식 중, R1A는 수소이고, z5는 1이다.
또 다른 양태에서, 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 개시된 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 갖는다.
도 1. CART 시스템을 사용한 안정한 형질주입 후 세포의 평균 휘도(radiance)(p/s/cm2/sr)를 나타낸 데이터를 도시한다.
도 2. CART의 항-종양 면역원성 및 CART와 아주반트의 조합물을 나타낸 데이터를 도시한다.
도 3a 내지 도 3c. 예방적 백신접종 전략의 효능을 나타낸 데이터를 도시한다. 도 3a: 종양 크기 차트, 도 3b: 생존 차트, 도 3c: TSA-발현 A20 림프종으로 재시험감염된 마우스의 종양 크기 차트(주석, 중첩선은 개별적으로 도시됨; 흑색선은 값은 모두 0임).
도 4a 및 도 4b. 사전-확립된 종양 크기 및 생존 데이터(제7일의 초기 백신접종 및 제10일 및 제13일의 부스트). 도 4a: 종양 크기 데이터. 도 4b: 생존 곡선 데이터.
도 5a 및 도 5b. 면역-자극성 단백질을 암호화하는 mRNA 및 CART를 사용한 인 시츄 백신접종을 도시한 데이터를 나타낸다.
도 6. mRNA 전달을 위한 전하-교차 방출 가능성 수송체(charge-alternating releasable transporter: CART)를 도시한 다이어그램을 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c. mRNA의 전달을 위해서 합성된 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르) CART을 도시한다. 도 7a) 아미드 형성을 위한 탠덤 5원, 이어서 6원 전이 상태를 통한 올리고(α-아미노 에스테르)에 대한 재배열 기전. 도 7b) 환식 카르보네이트 및 에스테르 단량체의 OROP를 통한 mRNA 전달을 위한 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르) CART의 합성. 도 7c) 이미 보고된 OROP 방법을 통해서 합성된 양친매성 올리고(카르보네이트).
도 8a 및 도 8b. 올리고(α-아미노 에스테르) CART 재배열 기전의 탐색을 도시한다. 도 8a) 블록 코-올리고머의 α-아미노 에스테르 부분의 자가-희생 재배열은 부착된 개시제 및 소분자 HEGD 2를 갖는 온전한 친유성 올리고카르보네이트 블록을 산출한다. 도 8b) 독립적으로 합성된 D15 단독올리고머 11과 비교한 보호된 블록 코-올리고머 Pyr-D15:A12 10 및 탈보호 및 염기-촉매 재배열 후의 GPC 트레이스.
도 9a 내지 도 9d. eGFP mRNA 전달을 위한 CART의 평가와 관련된 데이터를 도시한다. 도 9a) 다양한 수송체로 처리된 HeLa 세포로부터의 유세포 분석법-결정된 평균 eGFP 형광값. 도 9b) eGFP mRNA 수송체로 처리된 HeLa 세포에서 % 형질주입을 도시한 eGFP 형광의 대표적인 유세포 분석법 히스토그램. 도 9c) D13:A11 7에 의한 mRNA 전달로부터 유발된 eGFP 발현에 대한 전하비의 효과. 도 9d) 네이키드 mRNA, 리포펙타민과 복합체를 이룬 mRNA 또는 D13:A11 7과 복합체를 이룬 mRNA로 처리된 HeLa 세포의 에피형광(epifluorescence) 현미경 영상. 24웰 플레이트에서 8시간 동안 0.125 μg/웰의 mRNA 농도로 처리된 HeLa 세포에서 도시된 모든 데이터.
도 10a 내지 도 10d. mRNA의 발현은 mRNA 방출 및 CART 올리고머에 의한 엔도좀 탈출을 유도하는 전하-교체, 자가-희생 기전으로 인한 것이다. 도 10a) 엔도시토시스를 저해하는 조건인 4℃에서 Cy5-mRNA/ D13:A11 7 복합체의 흡수. 도 10b) 분해 및 비-분해 수송체 시스템으로 형성된 복합체로 처리한 후 eGFP mRNA의 상대적인 흡수 및 발현. 채워진 막대는 GFP 발현을 나타내고, 열린 막대는 Cy5-mRNA 형광을 나타낸다. 도 10c) mRNA/ D13:A11 7 복합체가 엔도좀 산성화를 저해하는 것으로 알려진 화합물(콘카나마이신 A, Con A) 및 엔도좀 파열제(클로로quine, Chl)로 공동 처리된 화합물인 경우 eGFP 발현. 도 10d) 4시간 동안 처리한 후 CART D13:A11 7 또는 비-방출 올리고머 7로 처리한 후 세포의 공초점 현미경. 세포를 수송체/Cy5-mRNA 복합체 및 TRITC-Dextran4400으로 함께 공동 처리하였다.
도 11a 내지 도 11f. 다수의 세포주 및 마우스에서 CART를 사용한 mRNA 전달의 응용 프로그램을 나타낸다. 도 11a) HeLa(A), J774(B), HEK 293(C), CHO(D) 및 HepG2(E) 세포주에서 리포펙타민과 비교한 D13:A11 ##에 의한 eGFP mRNA 전달의 형질주입 효율. 도 11b) CART 7에 의한 Fluc mRNA의 전달은 eGFP와 동일한 전하 비율 경향을 따른다. 이론적(+/-) 비율로 보고된 전하. 도 11c) 네이키드 Fluc mRNA(개방 원) 및 mRNA/D13:A11 ## 복합체(채워진 원)의 근육내 주사 후 생체내 BLI. 막대는 모든 동물의 평균을 나타낸다(1시간, 4시간 및 7시간의 경우 n = 3, 24시간 및 48시간의 경우 n = 5). 도 11d) 네이키드 mRNA(왼쪽 옆구리) 또는 mRNA/CART 복합체(오른쪽 옆구리)의 근육내 주사 후 대표적인 생물발광 영상. 도 11e) 네이키드 mRNA(개방 원) 및 mRNA/CART 복합체(채워진 원)의 IV 꼬리 정맥 주사 후 생체내 BLI. 막대는 모든 동물의 평균을 나타낸다(1시간 및 7시간의 경우 n = 2; 4시간, 24시간 및 48시간의 경우 n = 4). 점선은 D-루시퍼린을 주사하지 않은 동물의 배경 생물발광 신호이다. 도 11f) IV 꼬리 정맥 주사를 통해 mRNA/ D13:A11 복합체로 처리된 마우스의 대표적인 생물발광 영상.
도 12. BDK-CART-Fluc mRNA로 형질주입된 마우스의 생체내 생물발광 영상화. BDK(형광) CART로 패키징된 5 μg Fluc mRNA를 함유하는 150 μL PBS를 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주사하였다. 1. 마우스를 생물발광 분포를 위해 영상화하였다. 2. 마우스를 희생시키고 간 비장 및 폐를 수거하였다. 이들 장기로부터 BLI를 정량한 결과 비장에서(간 + 폐)에 대한 상대 비율이 99:1(99 %)로 나타났다. 3. 이 마우스로부터의 비장을 수거하고, 균질화했다. BDK 형광단에 대한 유동 세포 분석법 게이팅을 사용하여 비장에서 세포 집단을 표현형결정하였다.
도 13. 항 CD-19 발현 T 세포(CAR-T 세포)는 CAR19 mRNA-CART 전달과 함께 생체내에서 생산된다. 세포 표면 상에서 CAR-19 작제물을 발현하는 각각의 세포 계통의 집단의 백분율(상단 줄), 5 ug의 CAR19 mRNA-CART로 처리된 마우스(하단 줄), 5 ug의 무관한(SEAP) mRNA-CART로 처리된 마우스. 세포를 처리 후 36시간에 검정하였다. 본 발명자들은 T 세포 이외의 세포주도 CAR19 작제물을 얻는 경우 치료 효과에 기여할 수 있다고 제안한다.
CAR-19 작제물은 다중 림프구 계통으로 전달되고 발현된다. 1.) 마우스에 5 ug의 CAR19 mRNA-CART 또는 무관한 mRNA-CART(10:1 +/- 비율)를 IV 주사하였다. 2.) 주사 24시간 후 비장을 단리하고 균질화하였다. 3.) 단일 세포 현탁액을 세포 하위세트 및 세포 표면 상에 제시된 CAR 19 작제물을 식별하는 형광단(항-CAR-19 항체)으로 염색하였다. 4.) CAR19 단백질을 발현하는 식별된 집단 내에서 세포 집단 및 세포의 분획을 식별하기 위해 유세포 분석법을 사용하였다(CAR19 작제물을 발현하는 집단의 백분율을 박스에 제시함). 중요하게도 CAR-19 B 세포와 CAR-19 NK 세포도 생산된다. CD-19 발현 T 세포(CAR-T 세포)는 CD-19 mRNA-CART 전달과 함께 생체내에서 생산된다.
도 14. CAR19 CAR을 발현하는 세포는 CD19 발현 세포를 특이적으로 사멸시킨다. 2일 연속 5 ug CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스를 희생시키고 비장을 수거하였다. 비장에서 T 세포를 단리하고, 이 T-세포를 CD19 발현 A20 종양 세포와 공동 배양하였다. 효과기:표적의 5:1, 10:1, 20:1 비율. 표적 세포의 특정 사멸을 48시간에 평가하였다.
처리된 마우스로부터 단리된 CAR 세포는 생체외에서 CD19 발현 세포를 사멸시킨다. CD19 CAR을 발현하는 세포는 CD19 발현 세포를 특이적으로 사멸시킨다. 0일: 5 ug의 CAR19 mRNA-CART가 주사된 마우스; +1일: 마우스에 5 ug의 CAR19 mRNA-CART를 두 번째 용량으로 주사함; +3일: T 세포를 비장으로부터 단리하고, 종양 CD19 발현 종양 세포와 5:1, 10:1, 및 20:1의 효과기:표적 비율로 공동 배양하였음; +5일: 종양-특이적 사멸을 정량함.
도 15. CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스는 종양의 극적인 퇴행을 나타낸다. A20 종양을 발현하는 루시퍼라제를 보유한 마우스를 11일에 걸쳐 생물발광(즉, 종양 크기)에 대해 영상화하였다. 왼쪽 패널: 무관한 mRNA(SEAP)로 처리된 마우스. 오른쪽 패널. CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스.
생체내 CAR-19 mRNA 전달은 종양을 축소시킨다. IV 주사를 통해 A20 림프종 세포를 발현하는 루시퍼라제를 접종 한 마우스; 종양을 3일 동안 확립되도록 하였다; 종양 크기/진행은 루시퍼라제 신호의 강도와 직접적으로 관련되고; 마우스를 5 ug의 CART-CAR-19 mRNA로 I.V.로 처리하였고; 마우스를 시간에 따라 모니터링하고 루시퍼라제 신호의 변화를 분석하였다. CART-CAR19-mRNA로 처리된 마우스는 종양 퇴행을 나타낸다. 일은 처리 시작 후 일로서 나타내었다. 치료는 종양 접종 3일 후에 투여하였다.
도 16. CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스는 종양의 극적인 퇴행을 나타낸다. A20 종양을 발현하는 루시퍼라제를 보유한 마우스를 14일에 걸쳐 생물발광(즉, 종양 크기)에 대해 영상화하였다. 14일에 걸쳐서 전체 신체 생물발광을 정량하였다. CAR19 mRNA-CART 처리된 마우스는 신호량의 극적인 감소를 보인 반면, ctr. 치료된 마우스는 증가하였다. 전신 생물발광은 종양 부담의 반-정량적 측정이다.
도 17. 5 ug의 CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스. 5 ug의 무관한 SEAP 또는 CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스. 마우스를 시간 경과에 따른 종양 부담에 대해서 모니터링하고, 하반신 마비의 발병, 이차 피하 종양, 현저하게 확대된 복막 및 외부 고통 징후 시에 희생시켰다. 생체내 CAR-19 mRNA 전달은 생존을 크게 연장시킨다. (이전 도면으로부터의) 마우스를 시간 경과에 따른 종양 부담에 대해서 모니터링하고, 하반신 마비의 발병, 이차 피하 종양, 현저하게 확대된 복막 및 외부 고통 징후 시에 희생시켰다. 표시된 데이터: 식염수, CART-무관한 mRNA(SEAP) 또는 CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스.
도 18. CAR19 작제물의 정맥내 전달은 면역계가 CD19 분자를 발현하는 종양 세포를 선택적으로 사멸시킬 수 있게 한다. 확립된 피하 CD19 발현 또는 CD19 음성 종양이 있는 마우스를 1회 용량의 CAR19 mRNA-CART로 처리하고 7일 동안 종양 성장/회귀에 대해 모니터링하였다.
도 19. CAR19 작제물의 종양 내 전달은 종양 침윤 세포가 CD19 발현 종양 세포를 사멸시킬 수 있게 한다. 확립된 피하 CD19 발현 또는 CD19 음성 종양이 있는 마우스를 종양 내에 직접 1회 용량의 CAR19 mRNA-CART로 처리하고 7일 동안 종양 성장/회귀에 대해 모니터링하였다.
도 20. 생체 외 CAR-T 세포 생성의 그림 다이어그램.
도 21. 인 시츄 유전 공학의 그림 다이어그램. 개념: 생체내에서 세포 내에서 유전자(mRNA)를 발현하고; 이 유전자는 CAR 단백질을 암호화하고; 신체는 자체 CAR-T 세포를 생산하고; 신체 밖에서는 아무것도 할 필요가 없고; 환자로부터 세포를 채취할 필요가 없고; 값비싼 환자 세포의 수송이 없다.
도 22. CART를 사용한 mRNA 전달의 그림 다이어그램. 요건: 치료 반응이 일어나기 위해서; T 세포(또는 다른 것)를 형질주입해야 하고; 기능성 단백질이 발현되어야 하고; 충분한 집단이 CAR을 발현해야 한다.
도 23. 생체내 CAR-T 세포 프로그래밍을 위한 mRNA 생성. 본 발명자들은 T- 세포를 형질주입시키는 전달 비히클과 기능성 CAR 단백질을 발현하는 mRNA를 갖는다.
도 24. 표준 CAR-T 세포 요법(상단 패널) 및 생체내 CAR-T 세포 프로그래밍(하단 패널)에 대한 도식. St
도 25. T- 세포 내로의 CAR 작제물의 통합 및 생체내에서 세포 내 CAR- 암호화 유전자의 발현의 그림 다이어그램.
도 26. 본 명세서에 제공된 CART 화합물에 의해 전달되는 키메라 항원 수용체 분자(예를 들어, 항-마우스 CD19 및 항-인간 CD19 CAR)의 도식적 표현.
도 27. CART-CAR-19 mRNA로 처리된 마우스는 종양의 퇴행을 나타낸다. 마우스에 1x106개의 Luc- 발현 A20 세포를 정맥내로 접종하였다. CD19+ A20 종양 모델을 발현하는 루시퍼라제를 보유한 마우스를 생물발광(즉, 종양 크기)에 대해 영상화하였다. 마우스를 종양 시험감염 후 D+4 및 D+7일에 CART-CAR19 mRNA 또는 대조군 CART-mRNA로 IV로 2회 처리하였다. 표시된 시점에서 발광 영상을 촬영하였다. CAR19 mRNA-CART 처리된 마우스는 신호량의 극적인 감소를 보였지만, CRT 처리된 마우스는 증가된 신호를 나타냈다. 전신 생물발광은 종양 부담의 반-정량적 측정이다.
도 28a 및 28b. 도 28a 및 28b. C3813(도 28a) 및 A20(도 28b) 종양 모델 모두에서 CD19+ 및 CD19넉아웃에서의 생체내 CAR19 mRNA 요법을 비교하는 그래프는 치료 반응의 특이성을 나타낸다. 파이어플라이 루시퍼라제 발현 종양 세포로부터의 생물발광을 종양 부담의 마커로 사용하였다. CD19 발현 종양 만이 생체내 CAR-19 mRNA 전달에 의해 영향을 받는다. 마우스에게 38C13 또는 A20, CD19KO 38C13 또는 A20 B 림프종 세포(마우스당 1x106개)를 발현하는 WT CD19를 발현하는 파이어플라이 루시퍼라제를 주사하였다. 도 28a: CART-CAR19 mRNA 또는 대조군 CART-mRNA로 처리된 확립된 전신 WT CD19 발현 또는 CD19KO 38C13 B 림프종 세포를 갖는 마우스에서의 종양 부담/생물발광. WT CD19+(흑색 원), CD19KO(흑색 다이아몬드), 무관한 mRNA가 있는 CD19+ 세포(열린 원) 및 무관한 mRNA로 처리된 CD19KO 세포(열린 다이아몬드). 치료 시작 시 측정된 강도에 따른 생물발광 강도의 상대적 증가로 표시된 데이터. 도 28b: 도CART-CAR19 mRNA 또는 대조군 CART-mRNA로 처리된 확립된 전신 WT CD19 발현 또는 CD19KO A20 B 림프종 세포를 갖는 마우스의 장기간 생존. WT CD19+(흑색 원), CD19KO(흑색 다이아몬드), 무관한 mRNA가 있는 CD19+ 세포(열린 원) 및 무관한 mRNA로 처리된 CD19KO 세포(열린 다이아몬드).
도 29. CART-CAR mRNA는 CAR19의 일시적인 발현을 유도하여 다중 투여량의 요법을 허용한다. 혈액을 채취하고 CAR 19+ 세포를 유세포 분석법에 의해 정량하였다. 그림 도식은 CAR 19+ 세포를 표적으로 하는 CART를 나타낸다(왼쪽 패널). 측정은 CART-무관한 mRNA 또는 CART-CAR19 mRNA의 투여 1, 2 및 3일 후 및 10 ug의 CART-CAR19 mRNA의 2차 투여 후(오른쪽 패널) 수행되었다. 최종 측정은 CAR-19+ 세포의 재출현을 나타낸다.
도 30a 내지 도 30c. CAR CART-mRNA 요법은 종양 세포 사멸에서 T 세포보다 더 많이 관여한다. CAR19 CART mRNA로 처리된 대식세포(도 30a) 및 B 세포(도 30b)는 효과기 대 표적 세포 비율 의존적 방식으로 CD19 발현 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. CAR19 CART-mRNA로 처리할 때 CD19 발현 WT A20 종양 보유 마우스에서의 장기간 생존은 T 세포의 존재에 의존하지 않는다(도 30c). 마우스는 처리 시작 전에 T 세포가 고갈되었고 고갈은 실험 내내 aCD4 및 aCD8 단클론성 항체를 사용하여 유지되었다.
도 31a 내지 31c. 인간 PBMC에서 CART-mRNA 인간화 CAR-19 요법은 인간 임상 시험에서 관찰된 네이티브 B 세포의 예상되는 사멸을 나타낸다. 대량의 건강한 공여자 PBMC를 생체외에서 인간 CAR19 CART mRNA로 처리하였다. 정상 CD19 발현 B 세포의 처리 12시간 후 유세포 분석법으로 평가하였다. 도 31a: Ctr CART-mRNA 처리된 PBMC의 대표적인 점선 플롯. 도 31b: 인간 CAR19 CART-mRNA 처리된 PBMC의 대표적인 점선 플롯. 도 31c: Ctr CART-mRNA 처리된 PBMC 및 인간 CAR19 CART-mRNA 처리된 PBMC에 남아있는 살아있는 CD19 발현 B 세포의 총 수. n = 5개의 개별 복제품.
도 32. 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 세포-침투 복합체에 포함된 예시적인 키메라 항원 수용체의 개략도.
도 33. 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 세포-침투 복합체에 포함된 예시적인 수용체 분자의 개략도.
도 34a 및 34b. B 세포 고갈 검정. 종양이 확립된 지 4일 후에 CAR CART -mRNA의 초기 용량을 투여하였다. 지정된 시점에 CAR CART mRNA를 IV 투여하고 순환 CD19 발현 B 세포를 지정된 날짜에 정량하였다. CAR CART mRNA 처리는 순환하는 CD19 발현 B 세포의 감소를 초래하였지만 대조군 mRNA(SEAP)의 투여로 기준선으로 유지되었다(도 34a). T 세포 수는 영향을 받지 않았다(도 34b).
도 35a 및 35b. CAR19+ 세포의 백분율은 B 세포 고갈과 관련이 있다. CART-CAR-19 mRNA로 처리한 후 내인성 CD19 발현 B 세포 정량. 도 35a: 증가된 CAR-19+ 세포는 전신 B 세포의 감소와 관련이 있다. 도 35b: 고갈되지 않은 B 세포는 낮은 CD19 발현을 나타내며, 이는 더 높은 CD19 발현 세포의 선택적 고갈을 나타낸다.
도 36a 및 36b. 표적 항원 CD19를 CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 A20(도 36a) 및 38C13(도 36b)에서 제거하였다. 그래프는 CD-19 발현 세포(상단 곡선), 이소타입 대조군(중간 곡선), CD-19 넉아웃(하단 곡선)을 나타낸다. WT A20 및 38C13은 표면 상에 중간 수준 내지 높은 수준의 CD19를 발현한다(상단 곡선).
도 37. DNA 및 mRNA는 효과적인 치료용 치료 비히클-pDNA(B) 비히클 -mRNA(A) CAR19-RNA(C) 및 CAR19-DNA(D)를 제공한다. 확립된 CD19 발현 A20 림프종을 갖는 마우스를 CAR CART-mRNA(C), CAR CART-플라스미드 DNA(D), CTR CART-mRNA(A) 또는 CTR CART-플라스미드 DNA(B)로 3회 처리하였다. 종양 주입 후 35일 동안 생존율을 측정하였다. 하반신 마비의 발병으로 정의되는 질환으로 인한 사망.
본 개시내용의 다양한 실시형태 및 양태가 도시되고 설명되었지만, 이러한 실시형태 및 양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이제 본 개시내용으로부터 벗어나지 않고 당업자에게 수많은 변형, 변경 및 대체가 일어날 것이다. 설명된 개시내용에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실행하는데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.
문맥이 달리 지시하지 않는 한, 구체적으로 설명된 개시내용의 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있다는 것이 의도된다. 더욱이, 본 개시내용은 또한 설명된 임의의 특징 또는 특징들의 조합에서 제외되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 설명을 위해서, 본 명세서에서 복합체가 성분 A, B 및 C를 갖는다고 명시하는 경우, A, B 또는 C 중 임의의 것 또는 이들의 조합은 생략될 수 있고, 단독으로 또는 임의의 조합으로 부인될 수 있음이 구체적으로 의도된다.
첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 달리 명확하게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어 "암 세포"에 대한 언급은 복수의 암 세포를 포함한다. 다른 예에서, "핵산" 또는 "핵산"에 대한 언급은 복수의 핵산 분자, 즉 핵산들을 포함한다.
용어 "약"은 특정 값을 포함하는 값의 범위를 의미하며, 당업자는 특정 값과 합리적으로 유사하다고 간주할 수 있다. 실시형태에서, 약은 당업계에서 일반적으로 허용되는 측정을 사용한 표준 편차 이내를 의미한다. 실시형태에서, 약은 지정된 값의 +/- 10 %까지 확장되는 범위를 의미한다. 실시형태에서, 약은 명시된 값을 의미한다.
또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, " 및/또는"은 하나 이상의 연관된 열거된 항목의 임의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안(" 또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 의미하고 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만 다른 요소를 배제하지 않음을 의미하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "본질적으로 이루어진"(및 문법적 변형) 과도기 문구는 언급된 물질 또는 단계 및 인용된 실시형태의 "기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것"을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "본질적으로 이루어진"은 "포함하는"과 동등한 것으로 해석되어서는 안 된다. "이루어진"은 다른 성분의 미량을 초과하는 원소를 배제하고, 본 명세서에 개시된 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 단계를 의미한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 양태는 본 개시내용의 범위 내에 있다.
정의
본 명세서에서 사용되는 약어는 화학 및 생물학 분야 내에서 일반적인 의미를 갖는다. 본 명세서에 명시된 화학 구조 및 화학식은 화학 분야에 공지된 화학 원자가의 표준 규칙에 따라 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 "올리고머" 및 "중합체"는 복수의 반복 소단위를 갖는 화합물을 지칭한다(예를 들어, 중합된 단량체). 용어 "코-올리고머" 또는 "공중합체"는 2개 이상의 상이한 잔기(단량체 단위 또는 단량체, 이것은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용됨)를 포함하는 올리고머 또는 중합체를 지칭한다. 올리고머에서 단량체의 수는 일반적으로 중합체 내의 단량체의 수보다 적다. 따라서, 실시형태에서, 올리고머는 1 내지 약 10개의 단량체, 1 내지 약 20개의 단량체, 1 내지 약 30개의 단량체, 1 내지 약 40개의 단량체, 1 내지 약 50개의 단량체, 1 내지 약 100개의 단량체, 1 내지 약 150개의 단량체, 1 내지 약 200개의 단량체, 1 내지 약 250개의 단량체, 1 내지 약 300개의 단량체, 1 내지 약 350개의 단량체, 1 내지 약 400개의 단량체, 1 내지 약 450개의 단량체 또는 1 내지 약 500개의 단량체 길이를 가질 수 있다. 실시형태에서, 올리고머는 약 500개 미만의 단량체, 약 450개 미만의 단량체, 약 400개 미만의 단량체, 약 350개 미만의 단량체, 약 300개 미만의 단량체, 약 250개 미만의 단량체, 약 200개 미만의 단량체, 약 150개 미만의 단량체, 약 100개 미만의 단량체, 약 50개 미만의 단량체, 약 40개 미만의 단량체, 약 30개 미만의 단량체, 약 20개 미만의 단량체 또는 약 10개 미만의 단량체 길이를 가질 수 있다. 중합체의 맥락에서, 중합체 내의 단량체의 수는 일반적으로 올리고머 내의 단량체의 수보다 더 많다. 따라서, 실시형태에서, 중합체는 약 500 내지 약 1000개의 단량체, 약 500 내지 약 2000개의 단량체, 약 500 내지 약 3000개의 단량체, 약 500 내지 약 4000개의 단량체, 약 500 내지 약 5000개의 단량체, 약 500 내지 약 6000개의 단량체, 약 500 내지 약 7000개의 단량체, 약 500 내지 약 8000개의 단량체, 약 500 내지 약 9000개의 단량체, 약 500 내지 약 10000개의 단량체 또는 10000개 초과의 단량체 길이를 가질 수 있다.
용어 "중합성 단량체"는 중합체 화학 분야에서의 의미에 따라 사용되며, 다른 단량체 분자(예를 들어, 동일하거나 상이한 다른 중합성 단량체)에 화학적으로 공유 결합하여 중합체를 형성할 수 있는 화합물을 지칭한다.
용어 "블록 공중합체"는 일반적인 의미에 따라 사용되며 공유 결합에 의해 연결된 중합된 단량체의 2개 이상의 부분(예를 들어, 블록)을 지칭한다. 실시형태에서, 블록 공중합체는 중합체의 반복 패턴이다. 실시형태에서, 블록 공중합체는 주기적(예를 들어, 반복 패턴) 순서로 2개 이상의 단량체를 포함한다. 예를 들어, 이블록 공중합체는 화학식 ―B-B-B-B-B-B―A-A-A-A-A―를 갖고, 식 중, 'B'는 제1 소단위이고, 'A'는 함께 공유 결합된 제2 소단위이다. 따라서 삼블록 공중합체는 3개의 구별되는 블록을 갖는 공중합체이고, 이들 중 2개는 동일할 수 있거나(예를 들어, ―A-A-A-A-A―B-B-B-B-B-B―A-A-A-A-A―) 또는 이들 모두는 상이하다(예를 들어, ―A-A-A-A-A―B-B-B-B-B-B―C-C-C-C-C―)(식 중, 'A'는 제1 소단위이고, 'B'는 제2 소단위이고, 'C'는 함께 공유 결합된 제3 소단위임).
용어 "알킬"은 달리 언급되지 않는 한 그 자체로 또는 다른 치환기의 일부로서 완전히 포화, 단일- 또는 다중불포화될 수 있고, 2가 또는 다가 라디칼을 포함할 수 있는 직쇄형(즉, 비분지형) 또는 분지쇄형 또는 이들의 조합물을 의미한다. 알킬은 지정된 탄소 원자의 수를 가질 수 있다(즉, C1-C10은 1 내지 10개의 탄소를 의미함). 알킬은 비고리화된 쇄이다. 포화 탄화수소 라디칼의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, t-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 이의 동족체 및 이성질체, 예를 들어, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸, n-옥틸 등과 같은 기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 불포화 알킬기는 하나 이상의 이중 결합 또는 삼중 결합을 갖는 것이다. 불포화된 알킬기의 예는 비닐, 2-프로펜일, 크로틸, 2-이소펜텐일, 2-(부타디엔일), 2,4-펜타디엔일, 3-(1,4-펜타디엔일), 에틴일, 1- 및 3-프로핀일, 3-부틴일 및 이의 고급 동족체 및 이성질체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 알콕시는 산소 링커(-O-)를 통해서 분자의 잔여부에 부착된 알킬이다.
그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 용어 "알킬렌"은 달리 언급되지 않는 한 -CH2CH2CH2CH2-로 제한되지는 않지만 예시된 바와 같이 알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 전형적으로, 알킬(또는 알킬렌) 기는 1 내지 24개의 탄소 원자를 가질 것이며, 10개 이하의 탄소 원자를 갖는 기가 바람직하다. "저급 알킬" 또는 "저급 알킬렌"은 C1-C8 알킬 또는 알킬렌 기이다.
용어 "헤테로알킬"은 그 자체로 또는 다른 용어와 함께, 달리 언급되지 않는 한, 적어도 하나의 탄소 원자 및 O, N, P, Si 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자로 이루어진 안정한 직쇄 또는 분지쇄 또는 이들의 조합을 의미하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고 질소 헤테로원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로원자(들) O, N, P, S 및 Si는 헤테로알킬 기의 임의의 내부 위치 또는 알킬 기가 분자의 나머지 부분에 부착되는 위치에 배치될 수 있다. 헤테로알킬은 비고리화된 쇄이다. 예는 -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, 및 -CN을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, -CH2-NH-OCH3와 같이 최대 2개의 헤테로원자가 연속적일 수 있다.
유사하게, 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서 용어 "헤테로알킬렌"은 달리 언급되지 않는 한 -CH2-CH2-S-CH2-CH2- 및 -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-로 제한되지는 않지만 예시된 바와 같이 알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다. 헤테로알킬렌기의 경우, 헤테로원자는 또한 쇄 말단 중 하나 또는 둘 모두를 차지할 수 있고(예를 들어, 알킬렌 옥시, 알킬렌디옥시, 알킬렌아미노, 알킬렌디아미노 등), 헤테로 알킬기는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 나머지 부분에 부착된 기, 예컨대, -C(O)R', -C(O)NR', -NR'R'', -OR', -SR' 및/또는 -SO2R'를 포함한다. "헤테로알킬"이 언급되고, 그 다음 -NR'R'' 등과 같이 구체적인 헤테로알킬 기가 언급되는 경우, 용어 헤테로알킬 및 NR'R''는 중복되거나 상호 배타적이지 않음이 이해될 것이다. 오히려, 특정 헤테로 알킬 기는 명확성을 추가하기 위해 인용된다. 용어 "헤테로 알킬"은 NR'R''등과 같은 특정 헤테로알킬 기를 배제하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
용어 "시클로알킬" 및 "헤테로시클로알킬"은 달리 언급되지 않는 한 그 자체로 또는 다른 용어와 조합하여 각각 "알킬" 및 "헤테로알킬"의 환식 버전을 의미한다. 시클로알킬 및 헤테로알킬은 방향족이 아니다. 추가로, 헤테로시클로알킬의 경우, 헤테로원자는 헤테로사이클이 분자의 나머지에 부착된 위치를 차지할 수 있다. 시클로알킬의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 1-시클로헥센일, 3-시클로헥센일, 시클로헵틸 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 헤테로시클로알킬의 예는 1-(1,2,5,6-테트라하이드로피리딜), 1-피페리딘일, 2-피페리딘일, 3-피페리딘일, 4-모르폴리닐, 3-모르폴리닐, 테트라히드로푸란-2-일, 테트라히드로푸란-3-일, 테트라하이드로티엔-2-일, 테트라하이드로티엔-3-일, 1-피페라진일, 2-피페라진일 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "시클로알킬렌" 및 "헤테로시클로알킬렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 각각 시클로알킬 및 헤테로시클로알킬로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
용어 "할로" 또는 "할로겐"은 그 자체로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 달리 언급되지 않는 한, 플루오린, 염소, 브로민 또는 아이오딘 원자를 의미한다. 추가로, "할로알킬"과 같은 용어는 모노할로알킬 및 폴리할로알킬을 포함하는 의미이다. 예를 들어, 용어 "할로(C1-C4)알킬"은 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 2,2,2-트리플루오로에틸, 4-클로로부틸, 3-브로모프로필 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
용어 "아실"은, 달리 언급되지 않는 한, -C(O)R을 의미하고, 식 중, R은 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
용어 "아릴"은 달리 언급되지 않는 한, 다중불포화된, 방향족, 탄화수소 치환체이고, 이것은 함께 융합된(즉, 융합된 고리 아릴) 또는 공유 연결된 단일 고리 또는 다중 고리(바람직하게는 1 내지 3개의 고리)일 수 있다. 융합된 고리 아릴은 함께 융합된 다중 고리를 지칭하고, 여기서 융합된 고리 중 적어도 하나는 아릴 고리이다. 용어 "헤테로아릴"은 N, O, 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 아릴기(또는 고리)를 지칭하며, 여기서 질소 및 황 원자는 선택적으로 산화되고, 질소 원자(들)는 선택적으로 4차화된다. 따라서, 용어 "헤테로아릴"은 융합된 고리 헤테로아릴 기(즉, 융합된 다중 고리, 여기서 융합된 고리 중 적어도 하나는 헤테로방향족 고리임)를 포함한다. 5,6-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하는데, 여기서 하나의 고리는 5개의 구성원을 갖고, 나머지 고리는 6개의 구성원을 갖고, 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 마찬가지로, 6,6-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하는데, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고, 나머지 고리는 6개의 구성원을 갖고, 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 그리고, 6,5-융합된 고리 헤테로아릴렌은 함께 융합된 2개의 고리를 지칭하는데, 여기서 하나의 고리는 6개의 구성원을 갖고, 나머지 고리는 5개의 구성원을 갖고, 적어도 하나의 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴 기는 탄소 또는 헤테로원자를 통해서 분자의 잔여부에 부착될 수 있다. 아릴 및 헤테로아릴 기의 비제한적인 예는 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸, 4-바이페닐, 1-피롤릴, 2-피롤릴, 3-피롤릴, 3-피라졸릴, 2-이미다졸릴, 4-이미다졸릴, 피라진일, 2-옥사졸릴, 4-옥사졸릴, 2-페닐-4-옥사졸릴, 5-옥사졸릴, 3-이속사졸릴, 4-이속사졸릴, 5-이속사졸릴, 2-티아졸릴, 4-티아졸릴, 5-티아졸릴, 2-푸릴, 3-푸릴, 2-티엔일, 3-티엔일, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-피리미딜, 4-피리미딜, 5-벤조티아졸릴, 푸린일, 2-벤즈이미다졸릴, 5-인돌릴, 1-이소퀴놀릴, 5-이소퀴놀릴, 2-퀴녹살린일, 5-퀴녹살린일, 3-퀴놀릴 및 6-퀴놀릴을 포함한다. 상기에 언급된 아릴 및 헤테로아릴 고리 시스템 각각에 대한 치환체는 하기에 기재된 허용 가능한 치환체의 예로부터 선택된다. "아릴렌" 및 "헤테로아릴렌"은 단독으로 또는 또 다른 치환체의 일부로서, 각각 아릴 및 헤테로아릴로부터 유래된 2가 라디칼을 의미한다.
간략성을 위해, 다른 용어(예를 들어, 아릴옥시, 아릴티옥시, 아릴알킬)와 조합하여 사용되는 경우 용어 "아릴"은 상기에 정의된 바와 같은 아릴 및 헤테로아릴 고리 둘 모두를 포함한다. 따라서, 용어 "아릴알킬"은 탄소 원자(예를 들어, 메틸렌 기)가 예를 들어, 산소 원자에 의해서 대체된(예를 들어, 페녹시메틸, 2-피리딜옥시메틸, 3-(1-나프틸옥시)프로필 등) 알킬 기를 포함하는 아릴 기가 알킬 기에 부착된 라디칼(예를 들어, 벤질, 펜에틸, 피리딜메틸 등)을 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "옥소"는 탄소 원자에 이중 결합된 산소를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "알킬설폰일"은 화학식 -S(O2)-R'를 갖는 모이어티를 의미하고, 식 중, R'는 상기에 정의된 바와 같은 알킬기이다. R'는 명시된 수의 탄소를 가질 수 있다(예를 들어, "C1-C4 알킬설폰일").
상기 용어(예를 들어, "알킬", "헤테로알킬", "아릴" 및 "헤테로아릴") 각각은 제시된 라디칼의 치환된 형태 및 비치환된 형태 둘 모두를 포함한다.
알킬 및 헤테로알킬 라디칼에 대한 치환체(종종 알킬렌, 알켄일, 헤테로알킬렌, 헤테로알켄일, 알킨일, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 시클로알켄일 및 헤테로시클로알켄일이라고도 지칭되는 기 포함)는 비제한적으로 0 내지 (2m'+1)의 범위의 수의 -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -NRSO2R', -CN 및 -NO2로부터 선택된 다양한 기 중 하나 이상일 수 있고, 식 중, m'는 이러한 라디칼 내의 탄소 원자의 총 수이다. R', R'', R''', 및 R''''는 각각 바람직하게는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, 아릴 로 치환된 1-3 할로겐), 치환된 또는 비치환된 알킬, 알콕시 또는 티오알콕시 기 또는 아릴알킬 기를 지칭한다. 본 명세서에 개시된 화합물이 1개 초과의 R 기를 갖는 경우, 예를 들어, R 기 각각은 이들 기 중 1개 초과가 존재하는 경우 각각의 R', R'', R''' 및 R'''' 기와 같이 독립적으로 선택된다. R' 및 R''가 동일한 질소 원자에 부착된 경우, 이것은 질소 원자와 조합하여 4-, 5-, 6- 또는 7원 고리를 형성한다. 예를 들어, -NR'R''는 1-피롤리딘일 및 4-모르폴리닐을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 상기 치환체의 논의로부터, 당업자는 용어 "알킬"이 수소 기 이외의 기에 결합된 탄소 원자를 포함하는 기, 예컨대, 할로알킬(예를 들어, -CF3 및 -CH2CF3) 및 아실(예를 들어, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3 등)를 포함하는 의미이다.
알킬 라디칼에 대해서 설명된 치환체와 유사하게, 아릴 및 헤테로아릴 기에 대한 치환체는 다양하며, 0 내지 방향족 고리 시스템의 개방 원자가의 총 수의 범위의 수의 예를 들어, -OR', -NR'R'', -SR', -할로겐, -SiR'R''R''', -OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R'', -OC(O)NR'R'', -NR''C(O)R', -NR'-C(O)NR''R''', -NR''C(O)2R', -NR-C(NR'R''R''')=NR'''', -NR-C(NR'R'')=NR''', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R'', -NRSO2R', -CN, -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, 플루오로(C1-C4)알콕시 및 플루오로(C1-C4)알킬로부터 선택되고; 식 중, R', R'', R''' 및 R''''는 바람직하게는 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다. 본 명세서에 개시된 화합물이 1개 초과의 R 기를 갖는 경우, 예를 들어, R 기 각각은 이들 기 중 1개 초과가 존재하는 경우 각각의 R', R'', R''' 및 R'''' 기와 같이 독립적으로 선택된다.
2개 이상의 치환체는 선택적으로 결합되어 아릴, 헤테로아릴, 시클로알킬 또는 헤테로시클로알킬 기를 형성할 수 있다. 이러한 소위 고리-형성 치환체는 반드시는 아니지만 일반적으로 환식 염기 구조에 부착되어 있는 것으로 발견된다. 실시형태에서, 고리-형성 치환체는 기본 구조의 인접한 구성원에 부착된다. 예를 들어, 환식 기본 구조의 인접한 구성원에 부착된 고리-형성 치환체는 융합된 고리 구조를 생성한다. 다른 실시형태에서, 고리-형성 치환체는 기본 구조의 단일 구성원에 부착된다. 예를 들어, 환식 기본 구조의 단일 구성원에 부착된 두 개의 고리-형성 치환체는 스피로시클릭 구조를 생성한다. 또 다른 실시형태에서, 고리-형성 치환체는 기본 구조의 비-인접한 구성원에 부착된다.
아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 상의 치환체 중 2개는 선택적으로 화학식 -T-C(O)-(CRR')q-U-의 고리를 형성할 수 있고, 식 중, T 및 U는 독립적으로 -NR-, -O-, -CRR'- 또는 단일 결합이고, q는 0 내지 3의 정수이다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 중 치환체 중 2개는 선택적으로 화학식 -A-(CH2)r-B-의 치환체로 대체될 수 있고, 식 중 A 및 B는 독립적으로 -CRR'-, -O-, -NR-, -S-, -S(O) -, -S(O)2-, -S(O)2NR'- 또는 단일 결합이고, r은 1 내지 4의 정수이다. 이렇게 형성된 새로운 고리의 단일 결합 중 하나는 선택적으로 이중 결합으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 아릴 또는 헤테로아릴 고리의 인접한 원자 중 치환체 중 2개는 선택적으로 화학식 -(CRR')s-X'-(C''R''')d-의 치환체로 대체될 수 있고, 식 중 s 및 d는 독립적으로 0 내지 3의 정수이고, X'는 -O-, -NR'-, -S-, -S(O)-, -S(O)2- 또는 -S(O)2NR'-이다. 치환체 R, R', R'' 및 R'''는 바람직하게는 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 및 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "헤테로원자" 또는 "고리 헤테로원자"는 산소(O), 질소(N), 황(S), 인(P) 및 규소(Si)를 포함하는 의미이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "치환체 기"는 하기 모이어티로부터 선택된 기를 의미한다:
(A) 옥소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3,-CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3,-OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬), 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬), 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬), 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬, 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬), 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐), 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴), 및
(B) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴:
(i) 옥소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3,-CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3,-OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬), 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬), 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬), 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬), 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐), 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴), 및
(ii) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴:
(a) 옥소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3,-CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3,-OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬), 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬), 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬), 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬, 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬), 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐), 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴), 및
(b) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 치환체로 치환된, 알킬, 헤테로알킬, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴 또는 헤테로아릴: 옥소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3,-CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3,-OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬), 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬), 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬), 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬), 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐), 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "크기-제한 치환체" 또는 "크기-제한 치환체 기"는 "치환체 기"에 대해서 상기에 기재된 치환체 모두로부터 선택된 기를 의미하고, 여기서 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C4-C8 시클로알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 4 내지 8원의 헤테로시클로알킬이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "저급 치환체" 또는 "저급 치환체 기"는 "치환체 기"에 대해서 상기에 기재된 치환체 모두로부터 선택된 기를 의미하고, 여기서 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C8 알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 8원의 헤테로알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C5-C7 시클로알킬이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 5 내지 7원의 헤테로시클로알킬이다.
실시형태에서, 본 명세서에서 화합물에 기재된 각각의 치환된 기는 적어도 하나의 치환체 기로 치환된다. 보다 구체적으로, 실시형태에서, 본 명세서에서 화합물에 기재된 각각의 치환된 알킬, 치환된 헤테로알킬, 치환된 시클로알킬, 치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 아릴, 치환된 헤테로아릴, 치환된 알킬렌, 치환된 헤테로알킬렌, 치환된 시클로알킬렌, 치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 아릴렌 및/또는 치환된 헤테로아릴렌은 적어도 하나의 치환체 기로 치환된다. 실시형태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 전부는 적어도 하나의 크기-제한 치환체 기로 치환된다. 실시형태에서, 이들 기 중 적어도 하나 또는 전부는 적어도 하나의 저급 치환체 기로 치환된다.
본 명세서에서 화합물의 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬일 수 있고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된 5 내지 10원의 헤테로아릴이다. 본 명세서에서 화합물의 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴렌은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환된 또는 비치환된 5 내지 10원의 헤테로아릴렌이다.
실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C8 알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 8원의 헤테로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 3 내지 7원의 헤테로시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된 5 내지 9원의 헤테로아릴이다. 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C1-C8 알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 2 내지 8원의 헤테로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 3 내지 7원의 헤테로시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴렌은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환된 또는 비치환된 5 내지 9원의 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, 화합물은 본 명세서에서 제시된 화학 종이다.
본 명세서에서 사용된 단수 표현은 하나 이상을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용된 바와 같은 구 "하나[n]개로 치환된"은 명시된 기가 명명된 치환체 중 임의의 것 중 하나 이상 또는 전부로 치환될 수 있다는 것을 의미한다. 예를 들어, 기, 예컨대, 알킬 또는 헤테로아릴 기가 "비치환된 C1-C20 알킬, 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬로 치환"되는 경우, 기는 하나 이상의 비치환된 C1-C20 알킬 및/또는 하나 이상의 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬을 함유할 수 있다. 더욱이, 모이어티가 R 치환체로 치환되는 경우, 기는 "R-치환된"으로 지칭될 수 있다. 모이어티가 R-치환된 경우, 그 모이어티는 적어도 하나의 R 치환체로 치환되고, 각각의 R 치환체는 선택적으로 상이하다.
용어 "친핵성 모이어티"는 친전자체에 하나 이상의 전자(예를 들어, 2)를 제공할 수 있는 화학 종 또는 작용기를 지칭한다. 실시형태에서, 친핵성 모이어티는 화학 반응에서 전자를 친전자체에 제공하여 결합을 형성할 수 있는 화학 종 또는 작용기를 지칭한다.
용어 "친전자성 모이어티"는 하나 이상의 전자(예를 들어, 2)를 수용할 수 있는 화학 종 또는 작용기를 지칭한다. 실시형태에서, 친전자성 모이어티는 공전 궤도를 가지며 따라서 화학 반응에서 결합을 형성하기 위해 전자를 받아들일 수 있는 화학 종 또는 작용기를 지칭한다.
용어 "올리고글리콜 모이어티"는 일반 화학식을 갖는 화학 엔티티를 지칭한다: R400-O-(CH2-CH2-O)n300-
Figure pct00001
(식 중, R400은 H, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, n300은 1 이상의 정수임). 실시형태에서, R400은 H 또는 알킬이다.
본 개시내용의 화합물의 설명은 당업자에게 공지된 화학 결합의 원리로 제한된다. 따라서, 군이 다수의 치환체 중 하나 이상에 의해서 치환될 수 있는 경우, 이러한 치환은 화학적 결합의 원리를 준수하고, 본질적으로 불안정적이지 않고/않거나 주변 조건, 예컨대, 수성, 중성 및 몇몇 공지된 생리 조건 하에서 본질적으로 불안정적이지 않을 가능성이 있는 바와 같은 당업자에게 공지된 화합물을 제공하도록 선택된다. 예를 들어, 헤테로시클로 알킬 또는 헤테로아릴은 당업자에게 공지된 화학적 결합 원리에 따라 고리 헤테로원자를 통해 분자의 잔여부에 부착되어 본질적으로 불안정한 화합물을 회피한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)]을 참고하기 바란다. 본 명세서에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다. 하기 정의는 자주 사용되는 특정 용어에 대한 이해를 돕기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 범주를 제한하는 것을 의미하지 않는다.
"핵산"은 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 이의 중합체 또는 이의 보체를 지칭한다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "올리고" 등은 통상적인 의미 및 종래의 의미의 뉴클레오티드의 선형 서열을 지칭한다. 용어 "뉴클레오티드"는 통상적인 의미 및 종래의 의미의 폴리뉴클레오티드의 단일 단위, 즉, 단량체를 지칭한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 이의 변형된 버전일 수 있다. 본 명세서에 고려되는 폴리뉴클레오티드의 예는 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 및 이중 가닥 RNA, 및 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 및 RNA의 혼합물을 갖는 혼성 분자를 포함한다. 본 명세서에서 고려되는 핵산, 예를 들어 폴리뉴클레오티드의 예는 임의의 유형의 RNA, 예를 들어 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA) 및 이의 임의의 단편을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 맥락에서 용어 "듀플렉스"는 통상적인 의미 및 종래의 의미의 이중 가닥성을 지칭한다. 핵산은 선형 또는 분지형일 수 있다. 예를 들어, 핵산은 뉴클레오티드의 선형 쇄일 수 있거나 핵산은, 핵산이 예를 들어, 핵산이 뉴클레오티드의 하나 이상의 아암 및 분지를 갖도록 분지형일 수 있다. 선택적으로, 분지형 핵산은 반복적으로 분지화되어 덴드리머 등과 같은 더 정렬된 구조를 형성한다.
예를 들어, 핵산을 포함하는 핵산은 포스포티오에이트 골격은 하나 이상의 반응성 모이어티를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 반응성 모이어티는 공유, 비공유 또는 다른 상호작용을 통해서 또 다른 분자, 예를 들어, 핵산 또는 폴리펩티드와 반응할 수 있는 임의의 기를 포함한다. 예로서, 핵산은 공유, 비공유 또는 다른 상호작용을 통해서 단백질 또는 폴리펩티드 상의 아미노산과 반응할 수 있는 아미노산 반응성 모이어티를 포함할 수 있다.
이 용어는 또한 합성, 자연 발생 및 비 자연 발생이며, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 연결을 함유하는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 포스포디에스테르 유도체, 예컨대, 예를 들어, 포스포르아미데이트, 포스포로디아미데이트, 포스포로티오에이트(포스페이트에서 산소를 대체한 이중 결합된 황을 갖는 포스포티오에이트라고도 알려짐), 포스포로디티오에이트, 포스포노카르복실산, 포스포노카르복실레이트, 포스포노아세트산, 포스포노포름산, 메틸 포스포네이트, 보론 포스포네이트 또는 O-메틸포스포로아미디트 링키지(예를 들어, 문헌[Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press])뿐만 아니라 5-메틸 시티딘 또는 슈도우리딘에서와 같은 뉴클레오티드 염기에 대한 변형; 및 펩티드 핵산 골격 및 링키지를 비제한적으로 포함한다. 다른 유사체 핵산은 양성 골격을 갖는 것; 비이온성 골격을 갖는 것, 변형된 당 및 비-리보스 골격을 갖는 것(예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고 또는 잠김 핵산(LNA)), 예컨대, 미국 특허 제5,235,033호 및 제5,034,506호 및 문헌[Chapters 6 and 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds]에 기재된 것을 포함한다. 하나 이상의 탄소환식 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 하나의 정의에 포함된다. 리보스-포스페이트 골격의 변형은 다양한 이유로, 예를 들어 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키거나 바이오칩 상의 프로브로서 수행될 수 있다. 자연 발생 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있고; 대안적으로, 상이한 핵산 유사체의 혼합물 및 자연 발생 핵산과 유사체의 혼합물이 제조될 수 있다. 실시형태에서, DNA에서 뉴클레오티드간 링키지는 포스포디에스테르, 포스포디에스테르 유도체 또는 이들의 조합물이다.
핵산은 비특이적 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "비특이적 서열"은 임의의 다른 핵산 서열에 상보적이거나 부분적으로 만 상보적인 것으로 설계되지 않은 일련의 잔기를 포함하는 핵산 서열을 의미한다. 예를 들어, 비특이적 핵산 서열은 세포 또는 유기체와 접촉할 때 저해성 핵산으로 기능하지 않는 핵산 잔기의 서열이다. "저해성 핵산" 표적 핵산(예를 들어, 단백질로 번역 가능한 mRNA)에 결합할 수 있고, 표적 핵산의 전사(예를 들어, DNA로부터의 mRNA)를 감소시킬 수 있거나, 표적 핵산(예를 들어, mRNA)의 번역을 감소시킬 수 있거나 또는 전사 스플라이싱(예를 들어, 단일 가닥 모르폴리노올리고)을 변경시킬 수 있는 핵산(예를 들어, DNA, RNA, 뉴클레오티드 유사체의 중합체)이다. 실시형태에서, 핵산은 RNA(예를 들어, mRNA)이다. 실시형태에서 핵산은 10 내지 100,000개 염기의 길이이다. 실시형태에서 핵산은 50 내지 10,000개 염기의 길이이다. 실시형태에서 핵산은 50 내지 5,000개 염기의 길이이다. 실시형태에서 핵산은 50 내지 1,000개 염기의 길이이다.
용어 "폴리펩티드," "펩티드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하고, 여기서 중합체는 아미노산으로 이루어지지 않은 모이어티에 접합될 수 있다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산 중합체 및 비-자연 발생 아미노산 중합체에 적용된다. 이 용어는 거대 고리 펩티드, 비-펩티드 작용기로 변형된 펩티드, 펩티드 모방체, 폴리아미드 및 마크로락탐에 적용된다. "융합 단백질"은 단일 모이어티로서 재조합 방식으로 발현되는 2개 이상의 개별 단백질 서열을 암호화하는 키메라 단백질을 지칭한다.
용어 "펩티딜" 및 "펩티딜 모이어티"는 1가 펩티드를 의미한다.
용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화된 것뿐만 아니라 추후에 변형되는 아미노산, 예를 들어, 히드록시 프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 갖는 화합물, 즉 수소, 카르복실기, 아미노기 및 R기에 결합된 α 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어, 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸 설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 골격을 갖지만 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 유지한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 구조가 상이하지만 자연 발생 아미노산과 유사한 기능을 하는 화합물을 지칭한다. 용어 "비-자연 발생 아미노산" 및 "비자연 아미노산"은 자연에서 발견되지 않는 아미노산 유사체, 합성 아미노산 및 아미노산 모방체를 지칭한다.
아미노산은 일반적으로 알려진 세 문자 기호 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명위원회(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)에서 권장하는 한 문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로 뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-12 단백질" 또는 "IL-12"는 인터류킨-12 소단위 베타로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨 12, 또는 IL-12 활성(예를 들어 IL-12와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-12 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-12 단백질은 UniProt 참조 번호 P29460으로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-15 단백질" 또는 "IL-15"는 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨 15, 또는 IL-15 활성(예를 들어 IL-15와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-15 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-15 단백질은 UniProt 참조 번호 P40933으로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-18 단백질" 또는 "IL-18"은 인터페론-감마 유도 인자로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨 18, 또는 IL-18 활성(예를 들어 IL-18과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-18 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-18 단백질은 UniProt 참조 번호 Q14116으로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-3 단백질" 또는 "IL-3"은 조혈 성장 인자, 비만 세포 성장 인자, P-세포-자극 인자로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨-3, 또는 IL-3 활성(예를 들어 IL-3과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-3 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-3 단백질은 UniProt 참조 번호 P08700으로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-21 단백질" 또는 "IL-21"은 Za11로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨 21, 또는 IL-21 활성(예를 들어 IL-21와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-21 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-21 단백질은 UniProt 참조 번호 Q9HBE4로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-7 단백질" 또는 "IL-7"은 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨-7, 또는 IL-7 활성(예를 들어 IL-7과 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-7 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-7 단백질은 UniProt 참조 번호 P13232로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IL-9 단백질" 또는 "IL-9"는 시토카인 P40, T-세포 성장 인자 P40으로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터류킨-9, 또는 IL-9 활성(예를 들어 IL-9와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IL-9 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IL-9 단백질은 UniProt 참조 번호 P15248로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 "IFNg 단백질" 또는 "IFNg"는 IFNγ, 타입 II 인터페론으로도 공지된 임의의 재조합 또는 자연 발생 형태의 인터페론 감마, 또는 IFNg 활성(예를 들어 IFNg와 비교하여 적어도 50%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%활성 이내)을 유지하는 이의 변이체 또는 동족체를 포함한다. 일부 양태에서, 변이체 또는 동족체는 자연 발생 IFNg 단백질과 비교하여 전체 서열 또는 서열의 일부(예를 들어, 50, 100, 150 또는 200 개의 연속 아미노산 부분)에 걸쳐 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 실시형태에서 IFNg 단백질은 UniProt 참조 번호 P01579로 확인된 단백질 또는 실질적인 동일성을 갖는 변이체 또는 동족체와 실질적으로 동일하다.
"접촉하는"은 평범한 일반적인 의미에 따라 사용되며 적어도 두 개의 별개의 종(예를 들어, 생체 분자 또는 세포를 포함하는 화학 화합물)이 반응, 상호 작용 또는 물리적으로 접촉하기에 충분히 근접하게 되는 과정을 지칭한다. 그러나, 생성된 반응 생성물은 첨가된 시약 사이의 반응으로부터 직접 또는 반응 혼합물에서 생성될 수 있는 하나 이상의 첨가된 시약으로부터의 중간체로부터 생성될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 실시형태에서, "접촉하는"은 예를 들어, 핵산이 엔도뉴클레아제와 상호작용하게 하는 것을 포함한다.
"대조군" 샘플 또는 값은 시험 샘플과 비교를 위해서, 기준, 일반적으로 기지의 기준으로서 제공되는 샘플을 의미한다. 예를 들어, 시험 샘플은 예를 들어, 시험 화합물 존재 하에서, 시험 상태로부터 취할 수 있고, 기지 상태, 예를 들어 시험 화합물 부재(음성 대조군) 하에서, 또는 기지 화합물 존재(양성 대조군) 하에서, 샘플을 비교할 수 있다. 대조군은 또한 수많은 시험 또는 결과로부터 모아진 평균 값을 나타낸다. 당업자는 임의 수의 변수의 평가에 대해 대조군을 디자인할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 대조군은 약학 데이터(예를 들어, 반감기) 또는 치료적 측정(예를 들어, 부작용의 비교)을 기반으로 치료 이득을 비교하기 위해 고안될 수 있다. 당업자는 표준 대조군이 소정 상황에서 가장 적절하고, 표준 대조군 값의 비교를 기반으로 데이터를 분석할 수 있음을 이해할 것이다. 표준 대조군은 또한 데이터의 유의성(예를 들어, 통계학적 유의성)을 결정하기 위해서도 가치가 있다. 예를 들어, 소정의 변수에 대한 값이 대조군에서 광범위하게 변동적이면, 시험 샘플의 변동은 유의한 것으로 간주되지 않을 것이다.
"표지" 또는 "검출 가능한 모이어티"는 분광분석, 광화학, 생화학, 면역화학, 화학 또는 다른 물리적 수단에 의해 검출할 수 있는 조성물이다. 예를 들어, 유용한 표지는 32P, 형광발광 염료, 전자-밀도 시약, 효소(예를 들어, ELISA에서 통상적으로 사용되는 것과 같음), 비오틴, 딕옥시게닌, 또는 햅텐 및 단백질 또는 예를 들어, 표적 펩티드와 특이적으로 반응하는 펩티드 또는 항체에 방사능표지를 도입시킴으로써, 검출 가능하게 만들 수 있는 다른 엔티티를 포함한다. 표지에 항체를 접합시키기 위한 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법은 예를 들어, 문헌[Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego]에 기술된 방법을 사용해 적용될 수 있다.
"생물학적 샘플" 또는 "샘플"은 대상체 또는 환자로부터 획득하거나 또는 유도된 물질을 지칭한다. 생물학적 샘플은 조직학적 목적을 위해 채취된 조직 절개부 예컨대 생검 및 검시 샘플, 및 냉동 절개부를 포함한다. 이러한 샘플은 체액 예컨대 혈액 및 혈액 분획 또는 생성물(예를 들어, 혈청, 혈장, 혈소판, 적혈구 세포 등), 객담, 조직, 배양 세포(예를 들어, 원발성 배양물, 외식편, 및 형질전환 세포), 대변, 소변, 활액, 관절 조직, 활액 조직, 활막세포, 섬유아세포-유사 활막세포, 마크로파지-유사 활막세포, 면역 세포, 조혈 세포, 섬유아세포, 대식세포, T 세포 등을 포함한다. 생물학적 샘플은 전형적으로 진핵생물 유기체, 예컨대 포유동물 예컨대, 영장류, 예를 들어, 침팬지 또는 인간; 소; 개; 고양이; 설치류, 예를 들어, 기니 피그, 래트, 마우스; 토끼; 또는 조류; 파충류; 또는 어류로부터 획득된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "세포"는 이의 게놈 DNA를 보존하거나 또는 복제하기에 충분한 물질대사 또는 다른 기능을 수행하는 세포를 지칭한다. 세포는 예를 들어, 온전한 막의 존재, 특정 염료에 의한 염색, 자손 생성 능력, 또는 생식 세포의 경우, 생존 자손을 생성하기 위해 제2 생식세포와 조합하는 능력을 포함한 당업계에 널리 공지된 방법으로 인지될 수 있다. 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포를 포함할 수 있다. 원핵 세포는 비제한적으로 박테리아를 포함한다. 진핵 세포는 비제한적으로 효모 세포 및 식물과 동물, 예를 들어 포유동물, 곤충(예를 들어, 스포돕테라(spodoptera)) 및 인간 세포에서 유도된 세포를 포함한다.
용어 "줄기 세포" 또는 "줄기 세포들"은 다능성(multipotent)이어서, 몇몇 분화하는 세포 유형을 생성시킬 수 있는 클론성, 자가-재생 세포 집단을 지칭한다.
용어 "유전자"는 단백질을 생산하는 데 관여하는 DNA의 절편을 의미하고, 개별 암호 절편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 비롯하여 암호 영역을 선행하고 후속하는 영역을 포함한다. 리더, 트레일러를 비롯한 인트론은 유전자의 전사 및 번역 동안 필요한 조절 성분을 포함한다. 또한, "단백질 유전자 산물"은 특정 유전자에서 발현되는 단백질이다.
유전자와 관련하여 본 명세서에서 사용하는 단어 "발현" 또는 "발현되는"은 유전자의 전사 및/또는 번역 산물을 지칭한다. 세포에서 DNA 분자의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생산되는 DNA에 의해 암호화된 단백질의 양을 기준으로 결정할 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88]).
형질주입된 유전자의 발현은 세포에서 일시적으로 또는 안정적으로 일어날 수 있다. "일시적인 발현" 동안 형질주입된 유전자는 세포 분열 동안 딸 세포로 전달되지 않는다. 그 발현은 형질주입된 세포로 제한되기 때문에 유전자의 발현은 시간이 지남에 따라 손실된다. 대조적으로, 형질주입된 유전자의 안정된 발현은 유전자가 형질 감염된 세포에 선택 이점을 부여하는 다른 유전자와 공동 형질주입될 때 발생할 수 있다. 이러한 선택 이점은 세포에 제공되는 특정 독소에 대해 내성일 수 있다.
용어 "플라스미드"는 유전자 및/또는 유전자 발현에 필요한 조절 요소를 암호화하는 핵산 분자를 지칭한다. 플라스미드로부터의 유전자의 발현은 시스 또는 트랜스로 일어날 수 있다. 유전자가 시스로 발현되면, 유전자와 조절 요소가 동일한 플라스미드에 의해 암호화된다. 트랜스에서의 발현은 유전자와 조절 요소가 별도의 플라스미드에 의해 암호화되는 경우를 지칭한다.
용어 "외인성"은 주어진 세포 또는 유기체 밖에서 기원하는 분자 또는 물질(예를 들어, 화합물, 핵산 또는 단백질)을 지칭한다. 반대로, 용어 "내인성" 또는 "내인성 프로모터"는 주어진 세포 또는 유기체 내에서 기원하거나, 또는 그에 네이티브인 분자 또는 물질을 지칭한다.
"벡터"는 또 다른 핵산을 세포로 수송할 수 있는 핵산이다. 벡터는 적절한 환경에 존재할 때 벡터에 의해 운반되는 하나 이상의 유전자에 의해 암호화된 단백질 또는 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
다양한 숙주의 형질전환을 위한 핵산 분자의 유전자 또는 암호 영역을 지칭하는 바와 같은 용어 "코돈-최적화된"은 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 변경하지 않으면서 숙주 유기체의 전형적인 코돈 사용을 반영하는 유전자의 코돈 또는 핵산 분자의 암호 영역의 변경을 의미한다. 이러한 최적화는 적어도 하나 또는 하나 초과 또는 상당한 수의 코돈을 그 유기체의 유전자에서 더 자주 사용되는 하나 이상의 코돈으로 대체하는 것을 포함한다. 다양한 동물, 식물 및 미생물 종에 사용할 수 있는 많은 수의 유전자 서열을 고려할 때, 코돈 사용의 상대적 빈도를 계산할 수 있다. 코돈 사용 테이블은 예를 들어, www.kazusa.or.jp/codon/에서 입수 가능한 "Codon Usage Database"에서 쉽게 입수 가능하다. 각각의 유기체에서 코돈 사용 또는 코돈 선호도에 대한 지식을 활용함으로써, 당업자는 임의의 주어진 폴리펩티드 서열에 빈도를 적용하고 폴리펩티드를 암호화하는 코돈 최적화된 암호 영역의 핵산 단편을 생성할 수 있지만, 주어진 종에 대해서 최적화된 코돈을 사용한다. 코돈 최적화된 암호 영역은 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 설계될 수 있다.
"세포 배양물"은 유기체 외부 에있는 시험관내 세포 집단이다. 세포 배양물은 세포 은행 또는 동물로부터 단리된 1차 세포, 또는 이러한 공급원 중 하나에서 유래하고 장기 시험관 배양을 위해 불멸화된 2차 세포로부터 확립될 수 있다.
용어 "형질주입", "형질도입", "형질감염시키는"또는 "형질도입하는"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있으며 핵산 분자 및/또는 단백질을 세포에 도입하는 과정으로 정의된다. 비-바이러스 또는 바이러스-기반 방법을 사용하여 핵산을 세포에 도입할 수 있다. 핵산 분자는 완전한 단백질 또는 이의 기능적 부분을 암호화하는 서열일 수 있다. 일반적으로 단백질 발현에 필요한 요소(예를 들어, 프로모터, 전사 시작 부위 등)를 갖는 핵산 벡터이다. 비-바이러스 형질주입 방법은 핵산 분자를 세포에 도입하기 위한 전달 시스템으로 바이러스 DNA 또는 바이러스 입자를 사용하지 않는 적절한 방법을 포함한다. 예시적인 비-바이러스 형질주입 방법은 칼슘 포스페이트 형질주입, 리포솜 형질주입, 뉴클레오펙션, 소노포레이션, 열 충격을 통한 주입, 마그네티펙션(magnetifection) 및 전기천공을 포함한다. 바이러스-기반 방법의 경우, 본 명세서에 기재된 방법에서 유용한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노관련 바이러스 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 핵산 분자는 당업계에 널리 공지된 표준 절차에 따라 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 도입된다. 용어 "형질주입" 또는 "형질도입"은 또한 외부 환경으로부터 세포로 단백질을 도입하는 것을 지칭한다. 일반적으로, 단백질의 형질도입 또는 형질주입은 관심대상 단백질에 세포막을 통과할 수 있는 펩티드 또는 단백질의 부착에 의존한다. 예를 들어, 문헌[Ford et al. (2001) Gene Therapy 8:1-4 and Prochiantz (2007) Nat. Methods 4:119-20] 참고.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 생리 조건 하에서 비교적 안정한 복합체(예를 들어, 리보뉴클레오단백질 및 형질주입 펩티드)를 형성하는 2개의 분자를 지칭한다.
리간드가 또 다른 종(예를 들어, 단백질 또는 핵산)에 결합하는지의 여부를 결정하는 방법 및/또는 이러한 리간드-종의 친화성은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단백질에 대한 리간드의 결합은 다양한 기술, 예컨대, 비제한적으로 웨스턴 블롯, 도트 블롯, 표면 플라스몬 공명 방법(예를 들어, BIAcore system; Pharmacia Biosensor AB, 스웨덴 업살라 소재 및 미국 뉴저지주 피스케이타웨이 소재), 등온 적정 열량계법(isothermal titration calorimetry: ITC) 또는 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)을 사용하여 검출 및/또는 정량될 수 있다.
리간드의 면역특이적 결합 및 교차 반응성을 분석하는 데 사용될 수 있는 면역검정은 웨스턴 블롯, RIA, ELISA(효소 결합 면역흡착 검정), "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 면역확산 검정, 응집반응 검정, 보체-고정 검정, 면역방사선측정 검정 및 형광 면역검정과 같은 기술을 사용한 경쟁적 및 비경쟁적 검정 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 검정은 일상적이고, 당업계에 널리 공지되어 있다.
"항체"는 항원에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자를 비롯하여, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다.
용어 "항원" 및 "에피토프"는 면역계의 성분, 예를 들어, 항체, T 세포 수용체 또는 기타 면역 수용체, 예컨대, 자연 살해(NK) 세포의 수용체에 의해 특이적으로 인식되는 분자(예를 들어, 폴리펩티드)의 부분을 상호 교환적으로 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "항원"은 항원성 에피토프 및 이의 항원성 단편을 포함한다.
예시적인 면역글로불린(항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 하나의 "중"쇄(약 50 내지 70 kDa)를 갖는다. 각 사슬의 N-말단은 항원 인식을 주로 담당하는 약 100 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 영역을 한정한다. 용어 "가변 중쇄", "VH" 또는 "VH"는 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭하는 반면; 용어 "가변 경쇄", "VL" 또는 "VL"은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.
항체 기능성 단편의 예는 완전 항체 분자, 항체 단편, 예컨대, Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 상보성 결정 영역(CDRs), VL(경쇄 가변 영역), VH(중쇄 가변 영역), Fab, F(ab)2' 및 이들의 임의의 조합 또는 표적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 펩티드의 임의의 다른 기능성 부분을 포함한다(예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology (Paul ed., 4th ed. 2001)] 참고). 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 항체 단편은 다양한 방법, 예를 들어 펩신과 같은 효소를 사용한 온전한 항체의 분해; 또는 드 노보 합성에 의해서 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종종 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용하여 새로운 방식으로 합성된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 항체는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드 노보로 합성된 것(예를 들어, 단일 쇄 Fv) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 식별된 것을 포함한다(예를 들어, 문헌[McCafferty et al., (1990) Nature 348:552] 참고). 용어 "항체"는 또한 2가 또는 이중 특이적 분자, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 2가 및 이중특이적 분자는 예를 들어, 문헌[Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148:1547, Pack and Pluckthun (1992) Biochemistry 31:1579], 문헌[Hollinger et al.(1993), PNAS. USA 90:6444], 문헌[Gruber et al. (1994) J Immunol. 152:5368], 문헌[Zhu et al. (1997) Protein Sci. 6:781], 문헌[Hu et al. (1996) Cancer Res. 56:3055], 문헌[Adams et al. (1993) Cancer Res. 53:4026] 및 문헌[McCartney, et al. (1995) Protein Eng. 8:301]에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "희생", "자가-희생", "자가-희생 기전", "희생 모이어티", "희생 도메인" 등은 본 명세서에서 분자내 반응을 겪어서 그것이 부착된 화합물의 잔여부로부터의 재배열된 화학 기의 방출 및 화학 기의 화학적 재배열을 야기하는 화학 기의 능력을 지칭한다. "pH-감응성" 희생 도메인은 신중한 pH 범위 내에서는 희생 반응을 겪고, 신중한 pH 범위(예를 들어, pH 약 1-5, pH 약 5-7 또는 pH 약 7-10) 밖에서는 희생 반응을 실질적으로 격지 않는 화학 기를 지칭한다. 실시형태에서, 신중한 pH 범위는 pH 1-3, pH 2-4, pH 3-5, pH 4-6, pH 5-7, pH 6-8, pH 7-9 또는 pH 8-10이다. 실시형태에서, pH-감응성 희생 영역은 양이온성 알파 아미노 에스테르(올리고(α-아미노에스테르))를 포함한다. 실시형태에서, 양이온성 알파 아미노 에스테르의 양이온성 성분은 양으로 하전된 질소 원자(예를 들어, 양이온성 아민)이다. 실시형태에서, 양이온성 알파 아미노 에스테르의 양이온성 성분은 구아니디늄 기가 아니다. 실시형태에서, 양이온성 알파 아미노 에스테르의 양이온성 성분은 피페리디늄 기가 아니다.
용어 "세포-침투 복합체" 등은 세포 (생물학적 세포, 예컨대, 진핵 세포 또는 원핵 세포) 내로 관통할 수 있는 통상적인 의미 및 종래의 의미의 화학 복합체(예를 들어, 본 명세서 및 이의 실시형태에 개시된 복합체 또는 조성물)을 지칭한다. 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 양이온성 양친매성 중합체에 이온 결합된 핵산을 포함한다. 실시형태에서, 핵산은 양이온성 양친매성 중합체의 부재 하에서 세포를 실질적으로 관통할 수 없다. 따라서, 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 세포 내로의 핵산의 수송을 용이하게 한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "양이온성 전하 교체 방출 가능성 수송체", "CART" 등은 본 명세서에 개시된 세포-침투 복합체를 지칭한다. CART 화합물은 양이온성 양친매성 중합체 성분 내에서 pH-감응성 희생 도메인의 작용을 통해 세포 내로 핵산 성분을 방출할 수 있는데, 이것은 세포내 pH에 응답하여 반응하여 핵산을 세포 내로 방출할 수 있다. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 세포 내에서 신속하게 분해된다(예를 들어, pH 7.4에서 6시간 미만의 T1/2). 적어도 일부 실시형태에서, 폴리플렉스, 복합체, 정전기 복합체, CART/mRNA 복합체, CART/올리고뉴클레오티드 복합체 및 나노입자는 세포-침투 복합체를 지칭하도록 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어 "양친매성 중합체"는 친수성 부분 및 소수성 부분을 둘 다 함유하는 중합체를 지칭한다. 실시형태에서, 친수성 부분 대 소수성 부분은 1 대 1 질량비로 존재한다. 실시형태에서, 친수성 부분 대 소수성 부분은 1 대 2 질량비로 존재한다. 실시형태에서, 친수성 부분 대 소수성 부분은 1 대 5 질량비로 존재한다. 실시형태에서, 친수성 부분 대 소수성 부분은 2 대 1 질량비로 존재한다. 실시형태에서, 친수성 부분 대 소수성 부분은 5 대 1 질량비로 존재한다. 양친매성 중합체는 이블록 또는 삼블록 공중합체일 수 있다. 실시형태에서, 양친매성 중합체는 2개의 친수성 부분(예를 들어, 블록) 및 1개의 소수성 부분(예를 들어, 블록)을 포함할 수 있다.
종종 "지질 블록"으로 지칭되는 용어 "친유성 중합체 도메인" 등은 친수성이 아닌(예를 들어, 물 단독 중에서 불용성인) 양이온성 양친매성 중합체의 영역을 지칭한다. 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 수 중에서 낮은 용해도를 갖는다. 예를 들어, 수 중의 낮은 용해도는 수 중에서 약 0.0005 mg/mL 내지 약 10 mg/mL인 친유성 중합체 도메인의 용해도를 지칭한다.
용어 "개시제"는 중합 반응을 개시하는 목적을 갖는 양이온성 양친매성 중합체를 합성하는 반응에 참여하는 화합물을 지칭한다. 따라서, 개시제는 전형적으로 합성된 중합체의 마지막에 혼입된다. 예를 들어, 하나의 유형(또는 화학식)의 단량체 또는 하나 초과의 유형의 단량체(예를 들어, 2개의 상이한 유형의 단량체)의 복수의 분자를 개시제와 반응시켜 양이온성 양친매성 중합체를 제공할 수 있다. 개시제는 생성된 중합체의 적어도 하나의 말단에 존재할 수 있고 중합체에 존재하는 반복(또는 중합된) 단위(들)를 구성하지 않을 수 있다.
용어 "질환" 또는 "병태"는 본 명세서에서 제공하는 화합물, 약제학적 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 환자 또는 대상체의 상태 또는 건강 상태를 의미한다. 질환은 자가면역, 염증성, 암, 감염성, 물질대사성, 발달성, 심혈관, 간, 장, 내분비, 신경, 또는 다른 질환일 수 있다. 실시형태에서, 질환은 암(예를 들어, 폐암, 난소암, 골육종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 신장암, 피부암(예를 들어, 메르켈 세포(Merkel cell) 암종), 고환암, 백혈병, 림프종, 두경부암, 직결장암, 전립선암, 췌장암, 흑색종, 유방암, 신경아세포종)이다.
용어 "감염" 또는 "감염 질환"은 유기체, 예컨대, 박테리아, 바이러스, 진균 또는 임의의 다른 병원성 미생물제에 의해서 유발되는 질환 또는 병태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 신경내분비 종양, 암종 및 육종을 포함한, 포유동물에서 발견되는 모든 유형의 암, 신생물 또는 악성 종양을 의미한다. 본 명세서에서 제공하는 화합물, 약학 조성물, 또는 방법으로 치료될 수 있는 예시적인 암은 림프종, 육종, 방광암, 골암, 뇌 종양, 자궁경부암, 결장암, 식도암, 위암, 두경부암, 신장암, 흑색종, 갑상선암, 백혈병, 전립선암, 유방암(예를 들어, 삼중 음성, ER 양성, ER 음성, 화학요법 내성, 허셉틴 내성 HER2 양성, 독소루비신 내성, 타목시펜 내성, 관성 암종, 소엽 암종, 원발성, 전이성), 난소암, 췌장암, 간암(예를 들어, 간세포 암종), 폐암(예를 들어, 비소세포 폐 암종, 편평 세포 폐 암종, 선암종, 거대 세포 폐 암종, 소세포 폐 암종, 유암종, 육종), 다형성 교아세포종, 신경교종, 흑색종, 전립선 암, 거세-내성 전립선암, 유방암, 삼중 음성 유방암, 교아세포종, 난소암, 폐암, 편평 세포 암종(예를 들어, 머리, 목, 또는 식도), 직결장암, 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, B 세포 림프종, 또는 다발성 흑색종을 포함한다. 추가의 예는 갑상선암, 내분비계의 암, 뇌암, 유방암, 자궁경관암, 결장암, 머리 및 목의 암, 식도암, 간암, 신장암, 폐암, 비소세포 폐암, 흑색종, 중피종, 난소암, 육종, 위암, 자궁암 또는 수아세포종, 호지킨 질환, 비호지킨 림프종, 다발성 흑색종, 신경아세포종, 신경교종, 다형성 교아세포종, 난소암, 횡문근육종, 원발성 혈소판 증가증, 원발성 마크로글로불린혈증, 원발성 뇌 종양, 암, 악성 췌장 인슐린종, 악성 유암종, 방광암, 전악성 피부 병변, 고환암, 림프종, 갑상선암, 신경아세포종, 식도암, 비뇨생식관암, 악성 고칼슘혈증, 자궁내막암, 부신피질암, 내분비 또는 외분비 췌장의 신생물, 수질 갑상선암, 수질 갑상선 암종, 흑색종, 직결장암, 유두상 갑상선암, 간세포 암종, 유두의 파제트 질환, 가엽 종양, 소엽 암종, 관성 암종, 췌장 성상 세포의 암, 간성상 세포의 암, 또는 전립선암을 포함한다.
본 명세서에서 정의된 바와 같이, 분자 (예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 단백질)의 활성 및/또는 기능과 관련하여 용어 "저해", "저해하다", "저해하는" 등은 저해의 부재 하에서의 단백질의 활성 또는 기능에 비해서 단백질의 활성 또는 기능에 부정적으로 영향을 미치는(예를 들어, 저하 또는 감소시키는) 것을 의미한다. 따라서, 저해는 자극을 적어도 부분적으로, 부분적으로 또는 전체적으로 차단하는 것, 활성화를 감소, 예방 또는 지연시키는 것 또는 신호 전달 또는 효소 활성 또는 단백질 또는 폴리뉴클레오티드의 양을 비활성화, 탈감작 또는 하향 조절하는 것을 포함한다. 유사하게, "저해제"는 예를 들어, 표적 생체-분자의 결합, 부분 또는 전체 차단, 감소, 예방, 지연, 불활성화, 탈감작 또는 이의 활성의 하향 조절에 의해 표적 생체-분자(즉, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 자연에서 발견될 수 있는 임의의 다른 분자)를 저해하는 화합물이다. 질환 예방 치료의 맥락에서, 저해는 질환 또는 질환 증상의 감소를 지칭한다.
"치료", "치료" 및 "치료"는 질병, 장애 또는 상태에 작용하여 약제를 사용하여 질병, 장애 또는 병태 및/또는 그 증상의 유해하거나 기타 원치 않는 효과를 줄이거나 개선하는 것으로 정의된다. 치료를 필요로 하는 병태 또는 대상체를 "치료하는" 또는 "이의 치료"는 (1) 증상 감소와 같은 임상 결과를 포함하는 유익하거나 바람직한 결과를 얻기 위한 단계를 취하는 것; (2) 질환 저해, 예를 들어, 질환의 발병 또는 이의 임상 증상의 정지 또는 감소; (3) 예를 들어, 질환 또는 이의 임상 증상의 퇴행을 유발하는 질병 완화; 또는 (4) 질환 지연을 지칭한다. 예를 들어, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 암 세포의 감소 및/또는 제거 및 암 세포의 전이의 예방 및/또는 감소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
질환과 관련하여 용어 "예방하다", "예방하는" 또는 "예방"은 질환의 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않는 대상체에서 질환의 임상 증상이 발생하지 않도록 하는 것을 지칭한다. 실시형태에서, 이러한 예방은 질환에 걸리기 쉬운 것으로 간주될 수 있는 대상체에게 적용될 수 있는 반면, 일부 다른 예에서, 대상체는 반드시 질환에 걸리기 쉬운 것으로 간주되지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "투여하는"은 당업자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 대상체에게 조성물을 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 기재된 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 척추 또는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어, 주사 또는 주입을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 구 "비경구 투여"는 일반적으로 주사에 의한 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 척수강내, 림프내, 병변내, 캡슐내, 안와내, 심장내, 피내, 기관내, 피하, 피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척추내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입뿐만 아니라 생체 내 전기천공을 포함한다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 조성물은 비경구 경로, 예컨대 국소, 표피 또는 점막 투여 경로를 통해, 예를 들어 비강내, 경구, 질내, 직장, 설하 또는 국소로 투여될 수 있다. 투여는 또한 예를 들어, 한 번, 여러 번 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전이", "전이성" 및 "전이성 암"은 상호 교환 가능하게 사용할 수 있고 하나의 장기 또는 다른 비인접 장기 또는 신체 부분으로부터, 증식성 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 확산을 의미한다. 암은 발원 부위, 예를 들어, 유방에서 일어나고, 그 부위를 원발성 종양, 예를 들어, 원발성 유방암이라고 한다. 발원 부위 또는 원발성 종양에서의 일부 암 세포는 국소 영역에서 주변 정상 조직을 침투하여 침윤하는 능력 및/또는 체내에서 다른 부위 및 조직으로 전신을 통해 순환하는 림프계 또는 혈관계의 벽을 침투하는 능력을 획득한다. 원발성 종양의 암 세포로부터 형성된 2차적인 임상적으로 검출 가능한 종양을 전이성 또는 2차 종양이라고 한다. 암 세포가 전이될 때, 전이성 종양 및 이의 세포는 본래 종양의 것과 유사한 것으로 추정된다. 따라서, 폐암이 유방으로 전이되면, 유방 부위에서의 2차 종양은 비정상적인 폐 세포로 이루어지고 비정상적인 유방 세포가 아니다. 이러한 유방에서의 2차 종양을 전이성 폐암이라고 한다. 따라서, 어구 전이성 암은 대상체가 원발성 종양을 갖거나 또는 가졌고, 1개 이상의 2차 종양을 갖는 질환을 지칭한다. 구 비전이성 암 또는 전이성이 아닌 암을 갖는 대상체는 대상체가 원발성 종양을 갖지만 1개 이상의 2차 종양을 갖지 않는 질환을 지칭한다. 예를 들어, 전이성 폐암은 원발성 폐 종양을 갖거나 또는 이러한 이력을 갖고, 제2 부위 또는 다수 부위, 예를 들어 유방에 1개 이상의 2차 종양을 갖는 대상체의 질환을 지칭한다.
"항암제"는 암의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 항암 활성을 갖는 치료제이다. 항암제는 큰 분자 또는 소분자일 수 있다. 예시적인 항암제는 항체, 소분자 및 큰 분자 또는 이들의 조합물을 포함한다. "항암 활성"의 예는 암 세포 수의 감소, 암 크기의 감소, 암 세포의 사멸, 전이의 감소 및/또는 저해 및 암 세포 성장 및/또는 증식의 감소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
질환과 연관된 물질 또는 물질 활성 또는 기능과 관련하여 용어 "연관되는" 또는 "~와 연관되는"은 질환이 (전체로 또는 일부) 야기되거나, 또는 질환의 증상이 (전체로 또는 일부) 물질 또는 물질 활성 또는 기능에 의해 야기되는 것을 의미한다. 용어가 증상, 예를 들어, 질환 또는 병태와 관련된 증상의 맥락에서 사용되는 경우, 이는 증상이 증상을 나타내는 대상체에게 존재하는 질환 또는 병태를 나타낼 수 있음을 의미한다.
용어 "대상체", "개체", "숙주" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 질환 또는 병태를 앓고 있거나 미래에 질환 또는 병태를 가질 가능성이 있는 살아있는 유기체를 지칭한다. 용어 "환자"는 질환 또는 병태를 이미 갖는 살아있는 유기체, 예를 들어, 이미 질환 또는 병태를 갖는 것으로 진단되었거나 질환 또는 병태와 연관된 하나 이상의 증상을 갖는 환자를 지칭한다. 비제한적 예는 인간, 다른 포유동물, 소, 래트, 마우스, 개, 원숭이, 염소, 양, 소, 사슴 및 기타 비-포유동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 환자는 인간이다.
용어 "백신"은 특정 질환 또는 병원체에 대한 활성 획득 면역 및/또는 치료 효과(예를 들어, 치료)를 제공할 수 있는 조성물을 지칭한다. 백신은 일반적으로 대상체에서 병원체 또는 질환, 즉, 표적 병원체 또는 질환에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 하나 이상의 작용제를 함유한다. 면역원성은 인체의 면역 체계를 자극하여 표적 병원체 또는 질환의 존재를 위협하거나 표시함으로써 면역 기억을 유도하여 면역 체계가 후속 노출 시 병원체를 더 쉽게 인식하고 파괴할 수 있도록 한다. 백신은 예방적(예를 들어, 임의의 자연 또는 병원체에 의한 미래 감염의 효과 또는 소인이 있는 대상체에서 예상되는 암 발생의 예방 또는 개선) 또는 치료(예를 들어, 암으로 진단된 대상체에서의 암의 치료)일 수 있다. 백신의 투여는 예방접종이라고 지칭된다. 실시형태에서, 백신 조성물은 대상체에게 핵산, 예를 들어, 항원성 분자(예를 들어, 펩티드)를 암호화하는 mRNA를 제공할 수 있다. 대상체에서 백신 조성물을 통해 전달되는 핵산은 항원성 분자로 발현될 수 있고, 이것은 대상체가 항원성 분자에 대한 면역을 획득할 수 있게 한다. 감염 질환에 대한 백신접종의 맥락에서, 백신 조성물은 특정 병원체, 예를 들어, 병원체에서 발현되는 것으로 알려진 1종 이상의 펩티드(예를 들어, 병원성 박테리아 또는 바이러스)와 관련된 항원성 분자를 암호화하는 mRNA를 제공할 수 있다. 암 백신의 맥락에서, 백신 조성물은 암과 관련된 특정 펩티드, 예를 들어, 정상 세포와 비교하여 암세포에서 실질적으로 배타적으로 또는 고도로 발현되는 펩티드를 암호화하는 mRNA를 제공할 수 있다. 암 백신 조성물로 백신접종 한 후 대상체는 암과 연관된 펩티드에 대한 면역을 갖고, 특이성으로 암세포를 사멸시킬 수 있다.
용어 "면역 반응"은 "후천 면역 반응"이라고도 알려진 "적응 면역 반응"을 포함하지만 이들로 제한되지 않는데, 적응 면역은 특정 병원체 또는 면역 반응에 의해서 표적화된 특정 유형의 세포에 대한 초기 반응 후 면역원성 기억을 도출하고, 후속 만남 시에 그 표적에 대한 향상된 반응으로 이어진다. 면역학적 기억의 유도는 예방접종의 기초를 제공할 수 있다.
용어 "면역원성" 또는 "항원성"은 면역적격 대상체에게 투여될 때 면역 반응, 예를 들어, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응, B 세포 반응(예를 들어, 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체의 생산), NK 세포 반응 또는 이들의 임의의 조합을 유도하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 면역원성 또는 항원성 조성물은 면역적격 대상체에서 면역 반응을 도출할 수 있는 조성물이다. 예를 들어, 면역원성 또는 항원성 조성물은 병원체 또는 면역 반응에 의해 표적화되는 특정 유형의 세포와 연관된 하나 이상의 면역원성 에피토프를 포함할 수 있다. 추가로, 면역원성 조성물은 에피토프(들)를 발현하는 데 사용될 수 있는(따라서 이러한 폴리펩티드 또는 표적화된 병원체 또는 세포 유형과 연관된 관련 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 도출하는 데 사용될 수 있는) 또는 항원성 폴리펩티드의 하나 이상의 면역원성 에피토프를 암호화하는 단리된 핵산 작제물(예컨대, DNA 또는 RNA)을 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 방법에 따라서, 대상체는 유효량의 1종 이상의 작용제, 조성물 또는 복합체가 투여될 수 있고, 이들 모두는 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다(예를 들어, 세포-침투 복합체 또는 백신 조성물). 용어 "유효량" 및 "유효 용량"은 상호 교환 가능하게 사용된다. 용어 "유효량"은 목적하는 효과(예를 들어, 핵산을 세포 내에 형질주입시키고, 형질주입된 핵산의 의도된 결과를 나타냄)를 생성하는 데 필요한 임의의 양으로 정의된다. 작용제를 투여하기 위한 유효량 및 일정은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 투여를 위한 투여량 범위는 예를 들어, 목적하는 효과, 예를 들어, 핵산의 형질주입, 유전자 발현 조절, 유전자 편집, 줄기 세포 유도, 면역 반응 유도 등을 생성하기에 충분히 큰 범위이다. 투여량은 원하지 않는 교차 반응, 아나필락시스 반응 등과 같은 실질적인 부작용을 유발할 정도로 커서는 안 된다. 일반적으로, 투여량은 연령, 병태, 성별, 질환 유형, 질환 또는 장애의 정도, 투여 경로 또는 다른 약물이 요법에 포함되는지 여부에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 결정될 수 있다. 금기 사항이 있는 경우 개별 의사가 복용량을 조정할 수 있다. 투여량은 다양할 수 있으며 하루 또는 며칠 동안 매일 하나 이상의 용량으로 투여될 수 있다. 주어진 종류의 의약품에 대한 적절한 투여량에 대한 지침은 문헌에서 찾을 수 있다. 예를 들어, 주어진 파라미터수의 경우, 유효량은 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 적어도 100%의 증가 또는 감소를 나타낼 수 있다. 효능은 "-배" 증가 또는 감소로 표현될 수도 있다. 예를 들어, 치료 유효량은 대조군보다 적어도 1.2-배, 1.5-배, 2-배, 5-배 또는 그 초과 배수의 효과를 가질 수 있다. 정확한 용량 및 제형은 치료 목적에 좌우될 수 있고, 공지된 기술을 사용하여 당업자에 의해서 인식될 수 있다(예를 들어, 문헌[Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)]; 문헌[Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)]; 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)], 및 문헌[Pickar, Dosage Calculations (1999)] 참고).
암 치료와 관련하여 용어 "사멸시키다"는 암 세포 또는 암 세포의 집단의 적어도 일부분의 사멸로 이어질 임의의 유형의 조작을 포함하는 것을 나타낸다.
세포-침투 복합체
제1 양태에서, 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체(cell-penetrating complex)가 제공되며, 이러한 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 포함한다. 실시형태에서, 하나 이상의 반대 이온(예를 들어, 음이온)이 또한 양이온성 양친매성 중합체에서 양전하에 대한 반대전하로서 존재할 수 있다. 실시형태에서, 핵산은 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된다. 실시형태에서, 핵산은 양이온성 양친매성 중합체에 이온 결합된다. 실시형태에서, 세포 침투 복합체는 복수의 선택적으로 상이한 핵산(예를 들어 1 내지 10개의 추가 핵산, 1 내지 5개의 추가 핵산, 1 내지 5개의 추가 핵산, 2개의 추가 핵산 또는 1개의 추가 핵산)을 포함한다. 실시형태에서, 핵산은 RNA이다. 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다.
실시형태에서, 세포-침투 복합체에 존재하는 양이온성 양친매성 중합체 분자 내의 양이온의 수와 핵산 분자 상의 음이온의 수 간의 비는 약 1:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1, 약 102:1, 약 103:1, 약 104:1, 약 105:1, 약 106:1, 약 107:1, 약 108:1, 약 109:1, 약 1010:1, 또는 그 초과 또는 상기의 사이 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포-침투 복합체에 존재하는 핵산 분자 상의 음이온의 수와 양이온성 양친매성 중합체 분자 상의 양이온의 수 간의 비는 약 1:1, 약 5:1, 약 10:1, 약 20:1, 약 30:1, 약 40:1, 약 50:1, 약 60:1, 약 70:1, 약 80:1, 약 90:1, 약 10:1, 약 102:1, 약 103:1, 약 104:1, 약 105:1, 약 106:1, 약 107:1, 약 108:1, 약 109:1, 약 1010:1, 또는 그 초과 또는 상기의 사이 범위일 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 이러한 비는 양친매성 중합체 분자 상의 대략 10개의 양이온성 전하 대 핵산 상의 1개의 음전하이다. 다른 실시형태는 양친매성 중합체 분자 상의 5개의 양이온성 전하 대 1개의 핵산 상의 음전하 또는 양친매성 중합체 분자 상의 20개의 양이온성 전하 대 핵산 상의 1개의 음전하를 가질 수 있다.
실시형태에서, 세포-침투 복합체에 존재하는 핵산 분자의 수와 양이온성 양친매성 중합체 분자의 수 간의 비는 약 1:1, 약 10:1, 약 102:1, 약 103:1, 약 104:1, 약 105:1, 약 106:1, 약 107:1, 약 108:1, 약 109:1, 약 1010:1, 또는 그 초과 또는 상기의 사이 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 세포-침투 복합체에 존재하는 양이온성 양친매성 중합체 분자의 수와 핵산 분자의 수 간의 비는 약 1:1, 약 10:1, 약 102:1, 약 103:1, 약 104:1, 약 105:1, 약 106:1, 약 107:1, 약 108:1, 약 109:1, 약 1010:1, 또는 그 초과 또는 상기의 사이 범위일 수 있다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 양이온성 전하 교체 방출 가능성 수송체(CART)일 수 있다. 실시형태에서, CART는 양이온성에서 중성 또는 양이온성에서 음이온성으로의 전하의 pH-감응성 변화를 겪는 일련의 양이온성 서열을 함유하는 올리고머성 쇄를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 갖는다. 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 세포 침투, 세포 전달 및/또는 세포 막을 통한 수송을 용이하게 할 수 있다. 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 수 중에 실질적으로 불용성일 수 있다(예를 들어, 수 중 약 0.0005 mg/mL 미만 내지 약 10 mg/mL의 용해성). 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 양이온성 양친매성 중합체의 나노입자로의 응집을 용이하게 할 수 있다. 실시형태에서, 이러한 나노입자는 약 50 nm 내지 약 500 nm의 평균 최장 치수를 가질 수 있다. 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 엔도좀 내로의 도입 및 희생 이후에 양이온성 양친매성 중합체의 잔여부의 엔도좀 융합을 용이하게 할 수 있다. 실시형태에서, 본 개시내용의 세포-침투 복합체는 핵산 카고를 분해로부터 보호한다. 용어 "핵산 카고" 등은 본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체에 의한 세포 내로의 수송에 바람직한 통상적인 의미 및 종래의 의미의 종을 지칭한다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식 (I)을 갖는다: H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)(식 중, L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 C1-C3 알킬렌이다. 실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 메틸렌이다. 실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌 또는 치환된 또는 비치환된 2 내지 6원의 헤테로알킬렌이다. 실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 C1-C3 알킬렌 또는 치환된 또는 비치환된 2 내지 3원의 헤테로알킬렌이다.
실시형태에서, L1은 치환된 또는 비치환된 알킬렌(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 또는 5원, 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴렌(예를 들어, C6-C10 또는 페닐렌) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원, 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, L1은 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L1은 비치환된 알킬렌, 비치환된 헤테로알킬렌, 비치환된 시클로알킬렌, 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 비치환된 아릴렌, 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L1은 비치환된 알킬렌(예를 들어, C1-C6 알킬렌)이다. 실시형태에서, L1은 결합이다.
실시형태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 C1-C3 알킬렌이다. 실시형태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 메틸렌이다. 실시형태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬렌 또는 치환된 또는 비치환된 2 내지 6원의 헤테로알킬렌이다. 실시형태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 C1-C3 알킬렌 또는 치환된 또는 비치환된 2 내지 3원의 헤테로알킬렌이다.
실시형태에서, L2는 치환된 또는 비치환된 알킬렌(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 또는 5원, 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴렌(예를 들어, C6-C10 또는 페닐렌) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원, 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, L2는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L2는 비치환된 알킬렌, 비치환된 헤테로알킬렌, 비치환된 시클로알킬렌, 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 비치환된 아릴렌, 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L2는 비치환된 알킬렌(예를 들어, C1-C6 알킬렌)이다. 실시형태에서, L2는 결합이다.
실시형태에서 z2는 2 내지 90(예를 들어 5 내지 90, 10 내지 90 또는 20 내지 90), 2 내지 80(예를 들어 5 내지 80, 10 내지 80 또는 20 내지 80), 2 내지 70(예를 들어 5 내지 70, 10 내지 70 또는 20 내지 70), 2 내지 50(예를 들어 5 내지 50, 10 내지 50 또는 20 내지 50) 또는 2 내지 25의 정수이다. 실시형태에서, z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 90(예를 들어 5 내지 90, 10 내지 90 또는 20 내지 90), 0 내지 80(예를 들어 5 내지 80, 10 내지 80 또는 20 내지 80), 0 내지 70(예를 들어 5 내지 70, 10 내지 70 또는 20 내지 70), 0 내지 50(예를 들어 5 내지 50, 10 내지 50 또는 20 내지 50) 또는 2 내지 25의 정수이다. 실시형태에서, z1 및 z3은 독립적으로 2 내지 90(예를 들어 5 내지 90, 10 내지 90 또는 20 내지 90), 2 내지 80(예를 들어 5 내지 80, 10 내지 80 또는 20 내지 80), 2 내지 70(예를 들어 5 내지 70, 10 내지 70 또는 20 내지 70), 2 내지 50(예를 들어 5 내지 50, 10 내지 50 또는 20 내지 50) 또는 2 내지 25의 정수이다. 실시형태에서, z4는 1 내지 90(예를 들어 5 내지 90, 10 내지 90 또는 20 내지 90), 1 내지 80(예를 들어 5 내지 80, 10 내지 80 또는 20 내지 80), 1 to 70(예를 들어 5 내지 70, 10 내지 70 또는 20 내지 70), 1 to 50(예를 들어 5 내지 50, 10 내지 50 또는 20 내지 50) 또는 2 내지 25의 정수이다. 실시형태에서, z4는 2 내지 90(예를 들어 5 내지 90, 10 내지 90 또는 20 내지 90), 2 내지 80(예를 들어 5 내지 80, 10 내지 80 또는 20 내지 80), 2 내지 70(예를 들어 5 내지 70, 10 내지 70 또는 20 내지 70), 2 내지 50(예를 들어 5 내지 50, 10 내지 50 또는 20 내지 50) 또는 2 내지 25의 정수이다.
세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 제1 친핵성 모이어티 및 제1 친전자성 모이어티를 포함하고, 여기서 제1 친핵성 모이어티는 pH 범위 내에서 제1 친전자성 모이어티와 반응성이고, 그 pH 범위(예를 들어, pH 약 1 내지 5, pH 약 5 내지 7 또는 pH 약 7 내지 10) 밖에서는 친전자성 모이어티와 실질적으로 반응성이 아니다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 1 내지 3, pH 2 내지 4, pH 3 내지 5, pH 4 내지 6, pH 5 내지 7, pH 6 내지 8, pH 7 내지 9 또는 pH 8 내지 10이다. 친핵성 모이어티는 화학 분야에서의 이의 일반적인 통상의 의미에 따라서 사용되고, 전자를 공여할 수 있는 모이어티(예를 들어, 작용기)를 지칭한다.
실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 1 내지 3이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 2 내지 4이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 3 내지 5이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 4 내지 6이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 5 내지 7이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 6 내지 8이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 7 내지 9이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티가 제1 친전자성 모이어티와 가장 반응성인 pH 범위는 pH 8 내지 10이다. 실시형태에서, pH는 1이다. 실시형태에서, pH는 2이다. 실시형태에서, pH는 3이다. 실시형태에서, pH는 4이다. 실시형태에서, pH는 5이다. 실시형태에서, pH는 6이다. 실시형태에서, pH는 7이다. 실시형태에서, pH는 8이다. 실시형태에서, pH는 9이다. 실시형태에서, pH는 10이다. 실시형태에서, pH는 약 1이다. 실시형태에서, pH는 약 2이다. 실시형태에서, pH는 약 3이다. 실시형태에서, pH는 약 4이다. 실시형태에서, pH는 약 5이다. 실시형태에서, pH는 약 6이다. 실시형태에서, pH는 약 7이다. 실시형태에서, pH는 약 8이다. 실시형태에서, pH는 약 9이다. 실시형태에서, pH는 약 10이다.
실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티는 낮은 pH(예를 들어, pH 약 1 내지 약 5)에서 실질적으로 양성자화된다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티는 pH 5 내지 7의 범위에서 실질적으로 양성자화된다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티는 양이온성이다. 실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티는 양이온성 질소(예를 들어, 양이온성 아민)를 포함한다.
실시형태에서, 제1 친핵성 모이어티는 pH-불안정한 보호 기이다. 용어 "pH-불안정한 보호 기" 등은 통상적인 의미 및 종래의 의미로 그것이 부착된 또 다른 작용기를 보호할 수 있는 화학 모이어티를 지칭하고, 보호 기는 특정 pH 조건(예를 들어, pH를 감소시킴) 하에서 절단될 수 있거나 보호 기로서 달리 불활성화될 수 있다. 일 실시형태에서 pH-불안정한 보호 기는 산성 조건(예를 들어, 7 미만의 pH) 하에서 제거되는 기인 ―CO2-t-Bu이다. 추가적인 친핵성 보호 기는 또한 광, 열, 친핵체 및 염기에 의해서 절단되는 것을 포함할 수 있다.
상기 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(II)의 구조를 갖는다:
Figure pct00002
(II), (식 중, n은 2 이상의 정수이고; n1은 0 내지 50의 정수이고; Z는 친핵성 모이어티이고; X1은 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고; X2는 ―O- 또는 ―S-이고, R1, R2, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 2 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0 내지 25, 0 내지 10, 0 내지 5의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 실시형태에서, n1은 1 또는 2이다.
실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 수소이다.
상기 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기의 구조를 갖는다:
Figure pct00003
, (식 중, R1, R2, R3, R4, X1, Z 및 X2는 본 명세서에서 정의된 바와 같고, n1 및 n2는 1 초과의 정수임).
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(III)의 구조를 갖는다:
Figure pct00004
(III), (식 중, n은 2 이상의 정수이고; Z는 친핵성 모이어티이고; X1는 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고; X2는 ―O- 또는 ―S-이고, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 2 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범의의 정수이다.
실시형태에서, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R5, R6, R7, 및 R8은 수소이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00005
(IV), (식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범의의 정수이다. 일부 실시형태에서, n은 2 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 15의 정수이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(IVa)의 구조를 갖는다:
Figure pct00006
(IVa), (식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범의의 정수이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(V)의 구조를 갖는다:
Figure pct00007
(V), (식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범의의 정수이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(Va)의 구조를 갖는다:
Figure pct00008
(식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 2 또는 2 내지 10의 범위의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범의의 정수이다.
실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00009
(Ia), (식 중, X6은 -O-, -NH-, -CONH-, -COO-, -OCO-, 또는 -NHCO-이고; R20은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R21은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, R21은 올리고글리콜 모이어티이다. 실시형태에서, R20은 올리고글리콜 모이어티이다.
실시형태에서, R20은 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R20은 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R20은 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R20은 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R20은 수소이다.
실시형태에서, R21은 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R21은 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R21은 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R21은 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R21은 수소이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00010
, (식 중, R24, R25 및 R26은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, n3은 0 내지 50의 정수임).
실시형태에서, R24, R25 및 R26은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R24, R25 및 R26은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R24, R25 및 R26은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R24, R25 및 R26은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R24, R25 및 R26은 독립적으로 수소이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(VI)의 구조를 갖는다:
Figure pct00011
(VI), (식 중, n은 2 이상의 정수이고; n1은 0 내지 50의 정수이고; X1은 결합, -O-, -NR5-, -C(R5)(R6)- 또는 -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고; X2는 결합, -O-, -C(R9)(R10)- 또는 -C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-이고; X4는 결합, -NR16-, -O-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고; X5는 친핵성 모이어티이고; R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 수소이다.
실시형태에서, Z는 친핵성 모이어티이다. 실시형태에서, Z는 -S-, -O+R13-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이고, 식 중, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, Z는 ―S-이다. 실시형태에서, Z는 -S+R13-이다. 실시형태에서, Z는 -NR13-이다. 실시형태에서, Z는 -N+(R13)(H)-이다. 실시형태에서, Z는 -S+H-이다. 실시형태에서, Z는 -NH-이다. 실시형태에서, Z는 -N+H2-이다. 실시형태에서, Z는 ―O+H-이다.
실시형태에서, R13은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R13은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R13은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R13은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R13은 수소이다.
실시형태에서, Z는
Figure pct00012
이고, 식 중, X3은 -C(R15)- 또는 ―N-이고; X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고; X5는 친핵성 모이어티이고; R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, X3은 -CH이다.
실시형태에서, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서 R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
실시형태에서, X5는 -N(R13)(H)이고, 식 중, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로, 실시형태에서 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00013
(식 중, n2는 1 내지 100의 정수이고; R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, R20은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C1-C30 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C1-C20 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8-C30 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8-C20 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9-C20 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9-C18 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C18 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C17 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C16 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C15 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C14 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C13 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C12 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C11 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C10 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C7 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C6 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C5 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C4 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C3 알킬이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C2 알킬이다.
실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C1-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C1-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9-C18 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C18 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C17 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C16 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C15 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C14 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C13 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C12 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C11 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C10 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C9 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C8 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C7 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C6 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C5 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C4 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C3 알켄일이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 비치환된 C2 알켄일이다.
실시형태에서, R20은 독립적으로 스테아릴 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알킬)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 올레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 리놀레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 도데실 모이어티(예를 들어, 비치환된 C12 알킬)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로 노넨일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C9 알켄일)이다. 실시형태에서, R20은 독립적으로
Figure pct00014
이다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로, 실시형태에서 LP1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00015
(식 중, n21은 0 내지 100의 정수이고; R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R201은 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C1-C30 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C1-C20 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8-C30 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8-C20 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9-C20 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9-C18 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C18 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C17 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C16 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C15 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C14 알킬이다. 실시형태에서, R201은 비치환된 C13 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C12 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C11 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C10 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C7 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C6 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C5 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C4 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C3 알킬이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C2 알킬이다.
실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C1-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C1-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9-C18 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C18 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C17 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C16 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C15 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C14 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C13 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C12 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C11 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C10 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C9 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C8 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C7 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C6 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C5 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C4 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C3 알켄일이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 비치환된 C2 알켄일이다.
실시형태에서, R201은 독립적으로 스테아릴 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알킬)이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 올레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 리놀레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 도데실 모이어티(예를 들어, 비치환된 C12 알킬)이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로 노넨일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C9 알켄일)이다. 실시형태에서, R201은 독립적으로
Figure pct00016
이다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로, 실시형태에서 LP2는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00017
(식 중, n22는 0 내지 100의 정수이고; R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, R202는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C1-C30 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C1-C20 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8-C30 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8-C20 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9-C20 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9-C18 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C18 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C17 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C16 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C15 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C14 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C13 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C12 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C11 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C10 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C7 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C6 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C5 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C4 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C3 알킬이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C2 알킬이다.
실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C1-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C1-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8-C30 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9-C20 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9-C18 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C18 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C17 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C16 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C15 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C14 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C13 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C12 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C11 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C10 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C9 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C8 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C7 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C6 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C5 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C4 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C3 알켄일이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 비치환된 C2 알켄일이다.
실시형태에서, R202는 독립적으로 스테아릴 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알킬)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 올레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 리놀레일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C18 알켄일)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 도데실 모이어티(예를 들어, 비치환된 C12 알킬)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로 노넨일 모이어티(예를 들어, 비치환된 C9 알켄일)이다. 실시형태에서, R202는 독립적으로
Figure pct00018
이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식(Ia)의 화합물이다:
Figure pct00019
(Ia), (식 중, X6은 독립적으로 -O-, -NH-, -CO2-, -CONH-, -OC(O)-, 또는 -NHCO-이고, R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R21은 독립적으로 수소 또는 치환된 또는 비치환된 알킬이고, n은 본 명세서에 정의된 바와 같음). 실시형태에서, R20은 올리고글리콜 모이어티이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00020
, (식 중, n4는 0 내지 50의 정수임). 실시형태에서, n4는 0 내지 10이다. 실시형태에서, n4는 1 내지 15의 정수이다.
본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, 친유성 중합체는 하기 구조식을 갖는다:
Figure pct00021
(식 중, X7은 독립적으로 -O-, -NH-, -CO2-, -CONH-, -OC(O)-, 또는 -NHCO-이고; R22는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, R23은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, R22는 올리고글리콜 모이어티이다. 실시형태에서, R23은 올리고글리콜 모이어티이다.
실시형태에서, R22는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R22는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R22는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R22 is 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식(Ib)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00022
(Ib), (식 중, R100은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, n100은 2 이상의 정수임).
실시형태에서, R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1, R2, R3, 및 R4는 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R1, R2, R3, 및 R4 are 독립적으로 수소.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식(Ic)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00023
(Ic), (식 중, R200은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, n200은 2 이상의 정수임). 실시형태에서 R200은 올리고글리콜 모이어티이다. 실시형태에서, R200은 독립적으로 아민-말단화된 올리고글리콜 모이어티이다. 용어 "올리고글리콜 모이어티"는
Figure pct00024
를 지칭하고, "아민-말단화된 올리고글리콜 모이어티"는
Figure pct00025
를 지칭한다(식 중, n200은 2 이상의 정수임).
실시형태에서, R200은 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R200은 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R200은 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R200은 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다. 실시형태에서, R200은 독립적으로 수소이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식(Id)의 화합물일 수 있다:
Figure pct00026
(Id), (식 중, R300, R301, 및 R302는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고, n300은 본 명세서에 정의된 바와 같음). 실시형태에서 R300 및 R301은 독립적으로 수소 또는 치환된 또는 비치환된 알킬이다. 실시형태에서 R302는 독립적으로 올리고글리콜 모이어티이다. 실시형태에서, R302는 독립적으로 아민-말단화된 올리고글리콜 모이어티이다. 실시형태에서 R300, R301, 및 R302는 독립적으로 수소이다.
실시형태에서, R300, R301, 및 R302는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는r C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R300, R301, 및 R302는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R300, R301, 및 R302는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R300, R301, 및 R302는 독립적으로 수소 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C6 알킬)이다.
일 양태에서, 본 개시내용은 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 갖는 세포-침투 복합체를 제공한다. 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 갖는다. 일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 하기 화학식(VII)의 양이온성 양친매성 중합체를 갖는다:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R1A는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬, 치환된 또는 비치환된 2 내지 6원의 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 C3-C6 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 치환된 또는 비치환된 5 내지 6원의 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는독립적으로 치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R1A는 치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다.
실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 일부 다른 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, R1A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일이다.
실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8, C1-C6, C1-C4, 또는 C1-C2), 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원, 2 내지 6원, 4 내지 6원, 2 내지 3원 또는 4 내지 5원), 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8, C3-C6, C4-C6, 또는 C5-C6), 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원, 3 내지 6원, 4 내지 6원, 4 내지 5원 또는 5 내지 6원), 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 또는 페닐) 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원, 5 내지 9원 또는 5 내지 6원)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 아릴 또는 치환된(예를 들어, 치환체 기, 크기-제한 치환체 기 또는 저급 치환체 기로 치환된) 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 알킬, 비치환된 헤테로알킬, 비치환된 시클로알킬, 비치환된 헤테로시클로알킬, 비치환된 아릴, 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R2A는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 C1-C6 알킬, 치환된 또는 비치환된 2 내지 6원의 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 C3-C6 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 치환된 또는 비치환된 5 내지 6원의 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 알킬(예를 들어, C1-C8 알킬, C1-C6 알킬 또는 C1-C4 알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 헤테로알킬(예를 들어, 2 내지 8원의 헤테로알킬, 2 내지 6원의 헤테로알킬 또는 2 내지 4원의 헤테로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 비치환된 시클로알킬(예를 들어, C3-C8 시클로알킬, C3-C6 시클로알킬 또는 C5-C6 시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 헤테로시클로알킬(예를 들어, 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬, 3 내지 6원의 헤테로시클로알킬 또는 5 내지 6원의 헤테로시클로알킬)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R2A는 치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 아릴(예를 들어, C6-C10 아릴, C10 아릴 또는 페닐)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 비치환된 헤테로아릴(예를 들어, 5 내지 10원의 헤테로아릴, 5 내지 9원의 헤테로아릴 또는 5 내지 6원의 헤테로아릴)이다.
일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 하기 화학식(VIII)을 갖는 양이온성 양친매성 중합체를 가질 수 있다:
Figure pct00027
(VIII);
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A를 갖고,
(식 중,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이고, LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고, z5는 1 내지 10의 정수이고, z1 및 z3은 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 독립적으로 2 내지 100의 정수임).
일부 실시형태에서, 상기-화학식(VIII)에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 일부 다른 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, 고리 A는 페닐 또는 나프탈렌일이다.
실시형태에서, 고리 A는 비치환된 아릴(즉, CART 모이어티를 지나서 비치환됨)이다. 실시형태에서, 고리 A는 비치환된 페닐(즉, CART 모이어티를 지나서 비치환됨)이다. 실시형태에서, 고리 A는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일(즉, CART 모이어티를 지나서 비치환됨)이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 아릴(즉, CART 모이어티에 더하여 치환됨)이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 페닐(즉, CART 모이어티에 더하여 치환됨)이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 페닐 또는 나프탈렌일(즉, CART 모이어티에 더하여 치환됨)이다.
실시형태에서, 세포-침투 복합체는 검출 가능한 작용제를 갖는다(예를 들어, 형광단).
실시형태에서, R1A는 메톡시 링커로 치환된 아릴이다. 실시형태에서, R1A는 링커(예를 들어, -CH2-O-)로 치환된 아릴이다. 비제한적인 예(식 중, R1A는 메톡시 링커로 치환된 아릴임)는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00028
.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식(IX)을 갖는다:
Figure pct00029
.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식(X)을 갖는다:
Figure pct00030
.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식(XI)을 가질 수 있다:
Figure pct00031
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 화학식(VIII)에서 정의된 바와 같은 CART 모이어티(예를 들어, -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A)임). 실시형태에서 각각의 CART 모이어티는 선택적으로 상이하다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00032
,
Figure pct00033
,
Figure pct00034
,
Figure pct00035
, 또는
Figure pct00036
.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00037
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00038
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00039
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00040
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00041
.
실시형태에서, 고리 A는 링커(예를 들어, 결합, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌)를 통해 검출 가능한 작용제로 치환된다.
일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 상기 화학식 중 임의의 것을 갖는 양이온성 양친매성 중합체를 가지며, 식 중, L1은 ―CH2-O-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L1은 ―CH2-O-이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것을 가지며, 식 중, L1은 ―CH2-O-,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
, 또는
Figure pct00044
이다. 실시형태에서, L1은 ―CH2-O-이다. 실시형태에서, L1은
Figure pct00045
이다. 실시형태에서, L1은
Figure pct00046
이다. 실시형태에서, L1은
Figure pct00047
이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것을 가질 수 있고, 식 중, z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고, z4는 1 내지 100의 정수이다. 일부 실시형태에서, z1, z3 및 z4는 독립적으로 2 내지 100, 2 내지 90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 2 또는 2 내지 10의 범위의 정수일 수 있고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니다. 실시형태에서, z1, z3 및 z4는 독립적으로 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범위의 정수일 수 있고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니다.
실시형태에서, z1은 0 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, z1은 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z1은 0이다. 실시형태에서, z1은 1이다. 실시형태에서, z1은 2이다. 실시형태에서, z1은 3이다. 실시형태에서, z1은 4이다. 실시형태에서, z1은 5이다. 실시형태에서, z1은 6이다. 실시형태에서, z1은 7이다. 실시형태에서, z1은 8이다. 실시형태에서, z1은 9이다. 실시형태에서, z1은 10이다. 실시형태에서, z1은 11이다. 실시형태에서, z1은 12이다. 실시형태에서, z1은 13이다. 실시형태에서, z1은 14이다. 실시형태에서, z1은 15이다. 실시형태에서, z1은 16이다. 실시형태에서, z1은 17이다. 실시형태에서, z1은 18이다. 실시형태에서, z1은 19이다. 실시형태에서, z1은 20이다. 실시형태에서, z1은 21이다. 실시형태에서, z1은 22이다. 실시형태에서, z1은 23이다. 실시형태에서, z1은 24이다. 실시형태에서, z1은 25이다. 실시형태에서, z1은 26이다. 실시형태에서, z1은 27이다. 실시형태에서, z1은 28이다. 실시형태에서, z1은 29이다. 실시형태에서, z1은 30이다. 실시형태에서, z1은 31이다. 실시형태에서, z1은 32이다. 실시형태에서, z1은 33이다. 실시형태에서, z1은 34이다. 실시형태에서, z1은 35이다. 실시형태에서, z1은 36이다. 실시형태에서, z1은 37이다. 실시형태에서, z1은 38이다. 실시형태에서, z1은 39이다. 실시형태에서, z1은 40이다. 실시형태에서, z1은 41이다. 실시형태에서, z1은 42이다. 실시형태에서, z1은 43이다. 실시형태에서, z1은 44이다. 실시형태에서, z1은 45이다. 실시형태에서, z1은 46이다. 실시형태에서, z1은 47이다. 실시형태에서, z1은 48이다. 실시형태에서, z1은 49이다. 실시형태에서, z1은 50이다. 실시형태에서, z1은 51이다. 실시형태에서, z1은 52이다. 실시형태에서, z1은 53이다. 실시형태에서, z1은 54이다. 실시형태에서, z1은 55이다. 실시형태에서, z1은 56이다. 실시형태에서, z1은 57이다. 실시형태에서, z1은 58이다. 실시형태에서, z1은 59이다. 실시형태에서, z1은 60이다. 실시형태에서, z1은 61이다. 실시형태에서, z1은 62이다. 실시형태에서, z1은 63이다. 실시형태에서, z1은 64이다. 실시형태에서, z1은 65이다. 실시형태에서, z1은 66이다. 실시형태에서, z1은 67이다. 실시형태에서, z1은 68이다. 실시형태에서, z1은 69이다. 실시형태에서, z1은 70이다. 실시형태에서, z1은 71이다. 실시형태에서, z1은 72이다. 실시형태에서, z1은 73이다. 실시형태에서, z1은 74이다. 실시형태에서, z1은 75이다. 실시형태에서, z1은 76이다. 실시형태에서, z1은 77이다. 실시형태에서, z1은 78이다. 실시형태에서, z1은 79이다. 실시형태에서, z1은 80이다. 실시형태에서, z1은 81이다. 실시형태에서, z1은 82이다. 실시형태에서, z1은 83이다. 실시형태에서, z1은 84이다. 실시형태에서, z1은 85이다. 실시형태에서, z1은 86이다. 실시형태에서, z1은 87이다. 실시형태에서, z1은 88이다. 실시형태에서, z1은 89이다. 실시형태에서, z1은 90이다. 실시형태에서, z1은 91이다. 실시형태에서, z1은 92이다. 실시형태에서, z1은 93이다. 실시형태에서, z1은 94이다. 실시형태에서, z1은 95이다. 실시형태에서, z1은 96이다. 실시형태에서, z1은 97이다. 실시형태에서, z1은 98이다. 실시형태에서, z1은 99이다. 실시형태에서, z1은 100이다.
실시형태에서, z3은 0 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, z3은 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z3은 0이다. 실시형태에서, z3은 1이다. 실시형태에서, z3은 2이다. 실시형태에서, z3은 3이다. 실시형태에서, z3은 4이다. 실시형태에서, z3은 5이다. 실시형태에서, z3은 6이다. 실시형태에서, z3은 7이다. 실시형태에서, z3은 8이다. 실시형태에서, z3은 9이다. 실시형태에서, z3은 10이다. 실시형태에서, z3은 11이다. 실시형태에서, z3은 12이다. 실시형태에서, z3은 13이다. 실시형태에서, z3은 14이다. 실시형태에서, z3은 15이다. 실시형태에서, z3은 16이다. 실시형태에서, z3은 17이다. 실시형태에서, z3은 18이다. 실시형태에서, z3은 19이다. 실시형태에서, z3은 20이다. 실시형태에서, z3은 21이다. 실시형태에서, z3은 22이다. 실시형태에서, z3은 23이다. 실시형태에서, z3은 24이다. 실시형태에서, z3은 25이다. 실시형태에서, z3은 26이다. 실시형태에서, z3은 27이다. 실시형태에서, z3은 28이다. 실시형태에서, z3은 29이다. 실시형태에서, z3은 30이다. 실시형태에서, z3은 31이다. 실시형태에서, z3은 32이다. 실시형태에서, z3은 33이다. 실시형태에서, z3은 34이다. 실시형태에서, z3은 35이다. 실시형태에서, z3은 36이다. 실시형태에서, z3은 37이다. 실시형태에서, z3은 38이다. 실시형태에서, z3은 39이다. 실시형태에서, z3은 40이다. 실시형태에서, z3은 41이다. 실시형태에서, z3은 42이다. 실시형태에서, z3은 43이다. 실시형태에서, z3은 44이다. 실시형태에서, z3은 45이다. 실시형태에서, z3은 46이다. 실시형태에서, z3은 47이다. 실시형태에서, z3은 48이다. 실시형태에서, z3은 49이다. 실시형태에서, z3은 50이다. 실시형태에서, z3은 51이다. 실시형태에서, z3은 52이다. 실시형태에서, z3은 53이다. 실시형태에서, z3은 54이다. 실시형태에서, z3은 55이다. 실시형태에서, z3은 56이다. 실시형태에서, z3은 57이다. 실시형태에서, z3은 58이다. 실시형태에서, z3은 59이다. 실시형태에서, z3은 60이다. 실시형태에서, z3은 61이다. 실시형태에서, z3은 62이다. 실시형태에서, z3은 63이다. 실시형태에서, z3은 64이다. 실시형태에서, z3은 65이다. 실시형태에서, z3은 66이다. 실시형태에서, z3은 67이다. 실시형태에서, z3은 68이다. 실시형태에서, z3은 69이다. 실시형태에서, z3은 70이다. 실시형태에서, z3은 71이다. 실시형태에서, z3은 72이다. 실시형태에서, z3은 73이다. 실시형태에서, z3은 74이다. 실시형태에서, z3은 75이다. 실시형태에서, z3은 76이다. 실시형태에서, z3은 77이다. 실시형태에서, z3은 78이다. 실시형태에서, z3은 79이다. 실시형태에서, z3은 80이다. 실시형태에서, z3은 81이다. 실시형태에서, z3은 82이다. 실시형태에서, z3은 83이다. 실시형태에서, z3은 84이다. 실시형태에서, z3은 85이다. 실시형태에서, z3은 86이다. 실시형태에서, z3은 87이다. 실시형태에서, z3은 88이다. 실시형태에서, z3은 89이다. 실시형태에서, z3은 90이다. 실시형태에서, z3은 91이다. 실시형태에서, z3은 92이다. 실시형태에서, z3은 93이다. 실시형태에서, z3은 94이다. 실시형태에서, z3은 95이다. 실시형태에서, z3은 96이다. 실시형태에서, z3은 97이다. 실시형태에서, z3은 98이다. 실시형태에서, z3은 99이다. 실시형태에서, z3은 100이다.
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실시형태에서, n은 2 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, n은 2 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, n은 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 2이다. 실시형태에서, n은 3이다. 실시형태에서, n은 4이다. 실시형태에서, n은 5이다. 실시형태에서, n은 6이다. 실시형태에서, n은 7이다. 실시형태에서, n은 8이다. 실시형태에서, n은 9이다. 실시형태에서, n은 10이다. 실시형태에서, n은 11이다. 실시형태에서, n은 12이다. 실시형태에서, n은 13이다. 실시형태에서, n은 14이다. 실시형태에서, n은 15이다. 실시형태에서, n은 16이다. 실시형태에서, n은 17이다. 실시형태에서, n은 18이다. 실시형태에서, n은 19이다. 실시형태에서, n은 20이다. 실시형태에서, n은 21이다. 실시형태에서, n은 22이다. 실시형태에서, n은 23이다. 실시형태에서, n은 24이다. 실시형태에서, n은 25이다. 실시형태에서, n은 26이다. 실시형태에서, n은 27이다. 실시형태에서, n은 28이다. 실시형태에서, n은 29이다. 실시형태에서, n은 30이다. 실시형태에서, n은 31이다. 실시형태에서, n은 32이다. 실시형태에서, n은 33이다. 실시형태에서, n은 34이다. 실시형태에서, n은 35이다. 실시형태에서, n은 36이다. 실시형태에서, n은 37이다. 실시형태에서, n은 38이다. 실시형태에서, n은 39이다. 실시형태에서, n은 40이다. 실시형태에서, n은 41이다. 실시형태에서, n은 42이다. 실시형태에서, n은 43이다. 실시형태에서, n은 44이다. 실시형태에서, n은 45이다. 실시형태에서, n은 46이다. 실시형태에서, n은 47이다. 실시형태에서, n은 48이다. 실시형태에서, n은 49이다. 실시형태에서, n은 50이다. 실시형태에서, n은 51이다. 실시형태에서, n은 52이다. 실시형태에서, n은 53이다. 실시형태에서, n은 54이다. 실시형태에서, n은 55이다. 실시형태에서, n은 56이다. 실시형태에서, n은 57이다. 실시형태에서, n은 58이다. 실시형태에서, n은 59이다. 실시형태에서, n은 60이다. 실시형태에서, n은 61이다. 실시형태에서, n은 62이다. 실시형태에서, n은 63이다. 실시형태에서, n은 64이다. 실시형태에서, n은 65이다. 실시형태에서, n은 66이다. 실시형태에서, n은 67이다. 실시형태에서, n은 68이다. 실시형태에서, n은 69이다. 실시형태에서, n은 70이다. 실시형태에서, n은 71이다. 실시형태에서, n은 72이다. 실시형태에서, n은 73이다. 실시형태에서, n은 74이다. 실시형태에서, n은 75이다. 실시형태에서, n은 76이다. 실시형태에서, n은 77이다. 실시형태에서, n은 78이다. 실시형태에서, n은 79이다. 실시형태에서, n은 80이다. 실시형태에서, n은 81이다. 실시형태에서, n은 82이다. 실시형태에서, n은 83이다. 실시형태에서, n은 84이다. 실시형태에서, n은 85이다. 실시형태에서, n은 86이다. 실시형태에서, n은 87이다. 실시형태에서, n은 88이다. 실시형태에서, n은 89이다. 실시형태에서, n은 90이다. 실시형태에서, n은 91이다. 실시형태에서, n은 92이다. 실시형태에서, n은 93이다. 실시형태에서, n은 94이다. 실시형태에서, n은 95이다. 실시형태에서, n은 96이다. 실시형태에서, n은 97이다. 실시형태에서, n은 98이다. 실시형태에서, n은 99이다. 실시형태에서, n은 100이다.
실시형태에서, n1은 0 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 2 내지 45의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, n1은 5 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 15 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 25 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 35 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 45 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n1은 0이다. 실시형태에서, n1은 1이다. 실시형태에서, n1은 2이다. 실시형태에서, n1은 3이다. 실시형태에서, n1은 4이다. 실시형태에서, n1은 5이다. 실시형태에서, n1은 6이다. 실시형태에서, n1은 7이다. 실시형태에서, n1은 8이다. 실시형태에서, n1은 9이다. 실시형태에서, n1은 10이다. 실시형태에서, n1은 11이다. 실시형태에서, n1은 12이다. 실시형태에서, n1은 13이다. 실시형태에서, n1은 14이다. 실시형태에서, n1은 15이다. 실시형태에서, n1은 16이다. 실시형태에서, n1은 17이다. 실시형태에서, n1은 18이다. 실시형태에서, n1은 19이다. 실시형태에서, n1은 20이다. 실시형태에서, n1은 21이다. 실시형태에서, n1은 22이다. 실시형태에서, n1은 23이다. 실시형태에서, n1은 24이다. 실시형태에서, n1은 25이다. 실시형태에서, n1은 26이다. 실시형태에서, n1은 27이다. 실시형태에서, n1은 28이다. 실시형태에서, n1은 29이다. 실시형태에서, n1은 30이다. 실시형태에서, n1은 31이다. 실시형태에서, n1은 32이다. 실시형태에서, n1은 33이다. 실시형태에서, n1은 34이다. 실시형태에서, n1은 35이다. 실시형태에서, n1은 36이다. 실시형태에서, n1은 37이다. 실시형태에서, n1은 38이다. 실시형태에서, n1은 39이다. 실시형태에서, n1은 40이다. 실시형태에서, n1은 41이다. 실시형태에서, n1은 42이다. 실시형태에서, n1은 43이다. 실시형태에서, n1은 44이다. 실시형태에서, n1은 45이다. 실시형태에서, n1은 46이다. 실시형태에서, n1은 47이다. 실시형태에서, n1은 48이다. 실시형태에서, n1은 49이다. 실시형태에서, n1은 50이다.
실시형태에서, n은 1 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, n은 1 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, n은 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n은 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n2는 1이다. 실시형태에서, n2는 2이다. 실시형태에서, n2는 3이다. 실시형태에서, n2는 4이다. 실시형태에서, n2는 5이다. 실시형태에서, n2는 6이다. 실시형태에서, n2는 7이다. 실시형태에서, n2는 8이다. 실시형태에서, n2는 9이다. 실시형태에서, n2는 10이다. 실시형태에서, n2는 11이다. 실시형태에서, n2는 12이다. 실시형태에서, n2는 13이다. 실시형태에서, n2는 14이다. 실시형태에서, n2는 15이다. 실시형태에서, n2는 16이다. 실시형태에서, n2는 17이다. 실시형태에서, n2는 18이다. 실시형태에서, n2는 19이다. 실시형태에서, n2는 20이다. 실시형태에서, n2는 21이다. 실시형태에서, n2는 22이다. 실시형태에서, n2는 23이다. 실시형태에서, n2는 24이다. 실시형태에서, n2는 25이다. 실시형태에서, n2는 26이다. 실시형태에서, n2는 27이다. 실시형태에서, n2는 28이다. 실시형태에서, n2는 29이다. 실시형태에서, n2는 30이다. 실시형태에서, n2는 31이다. 실시형태에서, n2는 32이다. 실시형태에서, n2는 33이다. 실시형태에서, n2는 34이다. 실시형태에서, n2는 35이다. 실시형태에서, n2는 36이다. 실시형태에서, n2는 37이다. 실시형태에서, n2는 38이다. 실시형태에서, n2는 39이다. 실시형태에서, n2는 40이다. 실시형태에서, n2는 41이다. 실시형태에서, n2는 42이다. 실시형태에서, n2는 43이다. 실시형태에서, n2는 44이다. 실시형태에서, n2는 45이다. 실시형태에서, n2는 46이다. 실시형태에서, n2는 47이다. 실시형태에서, n2는 48이다. 실시형태에서, n2는 49이다. 실시형태에서, n2는 50이다. 실시형태에서, n2는 51이다. 실시형태에서, n2는 52이다. 실시형태에서, n2는 53이다. 실시형태에서, n2는 54이다. 실시형태에서, n2는 55이다. 실시형태에서, n2는 56이다. 실시형태에서, n2는 57이다. 실시형태에서, n2는 58이다. 실시형태에서, n2는 59이다. 실시형태에서, n2는 60이다. 실시형태에서, n2는 61이다. 실시형태에서, n2는 62이다. 실시형태에서, n2는 63이다. 실시형태에서, n2는 64이다. 실시형태에서, n2는 65이다. 실시형태에서, n2는 66이다. 실시형태에서, n2는 67이다. 실시형태에서, n2는 68이다. 실시형태에서, n2는 69이다. 실시형태에서, n2는 70이다. 실시형태에서, n2는 71이다. 실시형태에서, n2는 72이다. 실시형태에서, n2는 73이다. 실시형태에서, n2는 74이다. 실시형태에서, n2는 75이다. 실시형태에서, n2는 76이다. 실시형태에서, n2는 77이다. 실시형태에서, n2는 78이다. 실시형태에서, n2는 79이다. 실시형태에서, n2는 80이다. 실시형태에서, n2는 81이다. 실시형태에서, n2는 82이다. 실시형태에서, n2는 83이다. 실시형태에서, n2는 84이다. 실시형태에서, n2는 85이다. 실시형태에서, n2는 86이다. 실시형태에서, n2는 87이다. 실시형태에서, n2는 88이다. 실시형태에서, n2는 89이다. 실시형태에서, n2는 90이다. 실시형태에서, n2는 91이다. 실시형태에서, n2는 92이다. 실시형태에서, n2는 93이다. 실시형태에서, n2는 94이다. 실시형태에서, n2는 95이다. 실시형태에서, n2는 96이다. 실시형태에서, n2는 97이다. 실시형태에서, n2는 98이다. 실시형태에서, n2는 99이다. 실시형태에서, n2는 100이다.
실시형태에서, z2는 2 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, z2는 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, z2는 2이다. 실시형태에서, z2는 3이다. 실시형태에서, z2는 4이다. 실시형태에서, z2는 5이다. 실시형태에서, z2는 6이다. 실시형태에서, z2는 7이다. 실시형태에서, z2는 8이다. 실시형태에서, z2는 9이다. 실시형태에서, z2는 10이다. 실시형태에서, z2는 11이다. 실시형태에서, z2는 12이다. 실시형태에서, z2는 13이다. 실시형태에서, z2는 14이다. 실시형태에서, z2는 15이다. 실시형태에서, z2는 16이다. 실시형태에서, z2는 17이다. 실시형태에서, z2는 18이다. 실시형태에서, z2는 19이다. 실시형태에서, z2는 20이다. 실시형태에서, z2는 21이다. 실시형태에서, z2는 22이다. 실시형태에서, z2는 23이다. 실시형태에서, z2는 24이다. 실시형태에서, z2는 25이다. 실시형태에서, z2는 26이다. 실시형태에서, z2는 27이다. 실시형태에서, z2는 28이다. 실시형태에서, z2는 29이다. 실시형태에서, z2는 30이다. 실시형태에서, z2는 31이다. 실시형태에서, z2는 32이다. 실시형태에서, z2는 33이다. 실시형태에서, z2는 34이다. 실시형태에서, z2는 35이다. 실시형태에서, z2는 36이다. 실시형태에서, z2는 37이다. 실시형태에서, z2는 38이다. 실시형태에서, z2는 39이다. 실시형태에서, z2는 40이다. 실시형태에서, z2는 41이다. 실시형태에서, z2는 42이다. 실시형태에서, z2는 43이다. 실시형태에서, z2는 44이다. 실시형태에서, z2는 45이다. 실시형태에서, z2는 46이다. 실시형태에서, z2는 47이다. 실시형태에서, z2는 48이다. 실시형태에서, z2는 49이다. 실시형태에서, z2는 50이다. 실시형태에서, z2는 51이다. 실시형태에서, z2는 52이다. 실시형태에서, z2는 53이다. 실시형태에서, z2는 54이다. 실시형태에서, z2는 55이다. 실시형태에서, z2는 56이다. 실시형태에서, z2는 57이다. 실시형태에서, z2는 58이다. 실시형태에서, z2는 59이다. 실시형태에서, z2는 60이다. 실시형태에서, z2는 61이다. 실시형태에서, z2는 62이다. 실시형태에서, z2는 63이다. 실시형태에서, z2는 64이다. 실시형태에서, z2는 65이다. 실시형태에서, z2는 66이다. 실시형태에서, z2는 67이다. 실시형태에서, z2는 68이다. 실시형태에서, z2는 69이다. 실시형태에서, z2는 70이다. 실시형태에서, z2는 71이다. 실시형태에서, z2는 72이다. 실시형태에서, z2는 73이다. 실시형태에서, z2는 74이다. 실시형태에서, z2는 75이다. 실시형태에서, z2는 76이다. 실시형태에서, z2는 77이다. 실시형태에서, z2는 78이다. 실시형태에서, z2는 79이다. 실시형태에서, z2는 80이다. 실시형태에서, z2는 81이다. 실시형태에서, z2는 82이다. 실시형태에서, z2는 83이다. 실시형태에서, z2는 84이다. 실시형태에서, z2는 85이다. 실시형태에서, z2는 86이다. 실시형태에서, z2는 87이다. 실시형태에서, z2는 88이다. 실시형태에서, z2는 89이다. 실시형태에서, z2는 90이다. 실시형태에서, z2는 91이다. 실시형태에서, z2는 92이다. 실시형태에서, z2는 93이다. 실시형태에서, z2는 94이다. 실시형태에서, z2는 95이다. 실시형태에서, z2는 96이다. 실시형태에서, z2는 97이다. 실시형태에서, z2는 98이다. 실시형태에서, z2는 99이다. 실시형태에서, z2는 100이다.
실시형태에서, z5는 1이다. 실시형태에서, z5는 2이다. 실시형태에서, z5는 3이다. 실시형태에서, z5는 4이다. 실시형태에서, z5는 5이다. 실시형태에서, z5는 6이다. 실시형태에서, z5는 7이다. 실시형태에서, z5는 8이다. 실시형태에서, z5는 9이다. 실시형태에서, z5는 10이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것을 가질 수 있고, 식 중, z2는 2 내지 100의 정수이다. 일부 실시형태에서, z2는 2 내지 100, 2-90, 2 내지 80, 2 내지 70, 2 내지 60, 2 내지 50, 2 내지 40, 2 내지 30, 2 내지 20 또는 2 내지 10의 범위의 정수일 수 있다. 실시형태에서, z2는 2 내지 100 또는 2 내지 50의 범위의 정수일 수 있다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것을 가질 수 있고, 식 중, z5는 1 내지 3의 정수이다. 일부 다른 실시형태에서, z5는 1 또는 3이다. 추가의 일부 다른 실시형태에서, z5는 1이다. 일부 추가의 다른 실시형태에서, z5는 3이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것일 수 있고, 식 중, R2는 수소이다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 상기 화학식 중 임의의 것일 수 있고, 식 중, L2는 결합이다.
실시형태에서, CART는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00048
,
Figure pct00049
,
Figure pct00050
,
Figure pct00051
,
Figure pct00052
,
Figure pct00053
,
Figure pct00054
,
Figure pct00055
,
Figure pct00056
,
Figure pct00057
, 또는
Figure pct00058
.
일부 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00059
, (식 중, n은 2 이상의 정수이고; n1은 0 내지 50의 정수이고; X1은 결합, -O-, -NR5-, -C(R5)(R6)- 또는 -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고; X2는 결합, -O-, -C(R9)(R10)- 또는 -C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-이고; X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고; X5는 친핵성 모이어티이고; R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
일부 실시형태에서, 지정된 상기 화학식 중 임의의 것을 갖는 pH-감응성 희생 도메인에서, Z는 -S-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이고, 식 중, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
일부 실시형태에서, 지정된 상기 화학식 중 임의의 것을 갖는 pH-감응성 희생 도메인에서, Z는 -S-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이고, 식 중, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
일부 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 가질 수 있다: 본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체의 실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식(IV)의 구조를 갖는다:
Figure pct00060
일부 실시형태에서, 친유성 중합체 도메인 또는 친유성 중합체 도메인이라고 상호 교환 가능하게 지칭되는 것은 R 기의 하기 변수 중 하나를 가질 수 있다:
Figure pct00061
본 명세서 및 이의 실시형태에 개시된 세포-침투 복합체에 추가로, 실시형태에서, 핵산은 DNA 또는 RNA, 예컨대, 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)일 수 있다. 세포-침투 복합체는 단백질 또는 펩티드를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로 실시형태에서 세포-침투 복합체는 복수의 친유성 모이어티를 추가로 포함한다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로 실시형태에서 세포-침투 복합체는 복수의 희생 도메인을 추가로 포함한다.
본 명세서 및 이의 실시형태에 게시된 세포-침투 복합체에 추가로, 실시형태에서, 반대-음이온 대 상기 양이온성 서열은 당업계에 공지된 일반적인 반대이온, 예를 들어, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리플레이트, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 석신에이트 또는 시트레이트 등을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 반대-음이온은 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 트리플레이트, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 포스페이트, 석신에이트 또는 시트레이트이다.
형질주입
또 다른 양태에서, 핵산을 세포에 형질주입시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포를 본 명세서 또는 이의 실시형태에 개시된 바와 같은 세포-침투 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 방법은 양이온성 양친매성 중합체를 세포 내에서 분해시켜 분해 생성물을 형성하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진이다.
핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법의 임의의 실시형태에 추가로, 실시형태에서 핵산은 mRNA이다. 실시형태에서, 방법은 mRNA가 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 세포는 유기체의 부분을 형성한다. 실시형태에서, 유기체는 인간이다.
본 명세서에는 특히 시험관내 및 생체내에 둘 다에서 표적 세포, 조직 및 기관 내로의 올리고뉴클레오티드 및 다음이온성 카고, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA)의 전달 및 방출, 복합체화, 보호가 가능할 수 있거나 이를 향상시키는 신규한 물질 및 전략이 제공된다.
예를 들어, mRNA 전달을 위한 본 명세서에 개시된 하나의 전략은 생분해성 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르) 올리고머 및 이의 변형을 통해 달성되는데, 이것은 mRNA 카고를 보호하고, 세포에 쉽게 도입되고, 올리고뉴클레오티드 카고를 고유하게 방출하는 비공유 마크로분자 입자를 생성시키는 다가음이온, 예컨대, mRNA과 정전기적으로 복합체를 형성하는 것을 발견하였다. 이어서 세포에서 방출된 mRNA는 세포 과정에 의해 펩티드 및 단백질로 전환되며, 그 서열 및 이에 따른 활성은 mRNA 서열에 의해 결정된다.
따라서, 예를 들어, 핵산 자체 및 공지된 유전자 전달 벡터의 사용에 비해 크게 증가된 세포 형질주입 효율이 제공된다. mRNA 전달에 사용되는 물질 및 전략은 올리고뉴클레오티드, 예컨대, siRNA, pDNA, shRNA 및 gDNA를 전달하는 데에도 사용될 수 있다. 이들은 추가로 헤파린, 무기 폴리포스페이트 및 이노시톨 폴리포스페이트(예를 들어, IP3, IP7, IP8)와 같은 기타 음이온성 생체분자를 전달하는 데 사용될 수 있다. 이러한 전달은 다양한 인간 및 비인간 세포주뿐만 아니라 근육내, 정맥내, 복강내, 안구내, 비강내, 피하, 협측 및 국소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 생체내 투여의 다중 모드를 통해 달성될 수 있다. 본 명세서에 개시된 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르)는, 예를 들어, 생의학 요법, 영상화 및 장치에 적용하기 위한 맞춤형, 생분해성, 생체 적합성 물질로서 사용될 수 있다. 발레로락톤, 카프로락톤, 락티드 및 환식 카르보네이트와 같은 생분해성 무독성 화합물 물질과의 공중합은 카고 방출 속도, 소수성, 표적 리간드의 통합, 생체 분포 및 독성을 포함한 물성 및 생물학적 특성을 조정할 수 있다.
따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 작용제 중 일부는 식 아미노-에스테르 및 환식 메틸 트리메틸렌 카르보네이트(MTC) 단량체로부터 유래될 수 있는 올리고머, 중합체, 코-올리고머 및 중합체를 포함한다. 환식 아미노-에스테르는 모르폴린-2-온 및 이의 동족체의 기본 구조를 가지며, 하기를 포함하는 다수의 치환 패턴이 가능하다.
(1) 다양한 소수성 기(예를 들어, R= 알킬, 알켄일, 아릴, 스테로이드를 포함하는 폴리사이클, 헤테로사이클), 양이온성 기(예를 들어, 암모늄, 포스포늄, 설포늄, 구아니디늄, 아미노산, 예컨대, 글리신, 라이신, 오르니틴, 아르기닌으로의 아실화 포함), 음이온성 기(예를 들어, 카르복실레이트, 설페이트, 포스페이트) 또는 친수성(예를 들어, PEG) 카르바메이트로의 N-아실화. N-Boc 또는 N-Cbz 기로의 모르폴린 질소의 보호, 그 다음 유기촉매 개환 올리고머화 또는 중합은 탈보호 시 양이온성 중합체 또는 올리고머 골격을 제공할 수 있다.
(2) 카고 복합체화 및 그 다음 생물 분해에 의한 카고 방출을 허용하도록 선택된 상기에 언급된 가능한 작용기로의 에스테르 카르보닐 옆의 알파-알킬화 또는 작용화.
(3) 상기에 언급된 작용기로의 모르폴린 질소에 인접한 알킬화.
(4) 상기 변형의 조합.
추가로, 공중합체 또는 코-올리고머(블록 또는 통계)는 2종 이상의 모르폴린-2-온 단량체를 혼합함으로써 또는 1종 또는 다수의 모르폴린-2-온 단량체를 본 명세서에 기재된 1종 또는 다수의 환식 카르보네이트 단량체의 공중합(또는 코-올리고머화)에 의해서 제조될 수 있다. 이들 카르보네이트 단량체는 유사한 다양한 측쇄 작용기, 특히, 친유성 기 또는 양이온성 기를 혼입하여 올리고뉴클레오티드 안정성, 전달 및 방출 특성을 조절할 수 있다. 추가로, 락티드, 글리콜리드, 발레로락톤 및/또는 카프로락톤을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 다른 상업적으로 입수 가능한 환식 에스테르 단량체를 사용하여 친유성 작용기를 혼입할 수 있다.
폴리아미노에스테르 및 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르)의 합성은 개환 중합 및/또는 모르폴린-2-온 및 환식 카르보네이트 단량체의 공중합을 통해서 달성된다. N-Boc 보호된 모르폴리논(MBoc)은 유기촉매 시스템을 사용하여 높은 전환율(85% 초과), 조정 가능한 Mn(1 kDa 내지 20 kDa) 및 낮은 분자량 분포(Mw/Mn-1.1 내지 1.3)로 중합된다. Boc 기의 중합 후 탈보호는 양이온성(이양자성(diprotic), 2차 아민) 수용성 중합체(D20 중의 --0.5M, 3일 초과 동안 안정적임)를 제공한다. 더욱이, MBoc와 MTC-도데실 카르보네이트 단량체의 공중합에 이어 탈보호는 좁은 다분산도(1.4 미만의 PDI) 및 조정 가능한 블록 길이로 높은 수율(60% 초과)로 적당히 하전된 양이온성 물질을 생성시킨다. 블록 길이는 개시제 대 단량체의 비에 의해서 제어된다.
폴리아미노에스테르 및 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르)는 생체 적합성 및 생물 분해성이다. 양이온성 폴리아미노에스테르는 신규한 pH- 및 완충제-의존성 희생 기전을 통해서 신속하게 분해되어 일 실시형태에서 비스-N-히드록시에틸-2,5-피페리진디온비스-히드록시에틸 글리신을 생성시킨다. 이러한 예측하지 못한 분해는 치료 농도에서 무독성인 생성물을 생성시키고, 단량체 형태(추가 가수분해의 예측된 생성물)는 말라드(Maillard) 반응에서 인지질 변형을 위한 자연 바이오마커이다. 아미노 에스테르/카르보네이트 공중합체의 카르보네이트 분절은 가수분해 및 탈카르복실화를 통해 분해되며, 그 부산물은 이전에 무독성인 것으로 밝혀져 있다. 새로운 폴리- 및 올리고(카르보네이트-코-아미노에스테르)는 고유한 분해 기전으로 인해 유전자 전달제로서 예상치 못한 성능을 나타낸다. 이러한 새로운 물질은 적당한 이론적 전하 비율(예를 들어, 약 10:1)에서 mRNA와 비공유적으로 복합체를 형성하고, 보호하고, 전달하고, 방출하여, 시험관내 및 생체내에서 이례적인 형질주입 효율(일부 경우에 99%초과) 및 유전자 발현의 강력한 유도를 야기한다. 이러한 전략은 길이가 상이한 mRNA 분자의 전달에 효과적이다(시험된 1000 및 2000개 뉴클레오티드 전사체). 일 실시형태에서, 유전자 전달은 200 내지 400 nm 크기의 자가 조립된 입자를 형성하기 위해서 음이온성 카고와 양이온성 폴리(카르보네이트-코-아미노 에스테르)의 제형을 통해 달성된다. 이 입자는 세포내 유전자 전달에 필요한 시간 척도에서 안정적이며, 일단 세포 내에서는 올리고뉴클레오티드 카고를 방출한다. 특정 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, 이러한 물질은 비스-N-히드록시에틸-2,5-피페리진디온 생성물 비스-히드록시에틸 글리신으로 분해된다. 다양한 인간 및 비인간 세포주(예를 들어, HeLa, HaCaT, J774, HEK293)를 mRNA/양친매체(amphiphile) 복합체로 처리하면 다중 투여 모드(근육내 및 정맥내 시험됨)를 통해서 시험관내 및 생체내에서 단백질 발현(예를 들어, GFP, 루시퍼라제)이 유도된다.
단백질 발현은 유세포 분석법 및 형광 현미경(GFP) 및 생물발광(파이어플라이 루시퍼라제)에 의해 형광 리포터 유전자를 암호화하는 mRNA를 사용하여 측정되었다. 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르)는 상용 표준인 Lipofectamine 2000 및 이전에 siRNA 전달에 대해 설명된 많은 다른 리드 화합물보다 더 효율적인 형질주입제인 것이 밝혀져 있다.
실시형태에서, 유전자 전달은 생성된 복합체의 안정성 및 크기를 조정하고, 세포 흡수를 증가시키고, 복합체로부터의 mRNA 방출 속도를 조정하고, 카고 mRNA의 발현을 향상시키기 위해서 선택된 제3 성분의 존재 하에서 혼합된 양친매성 올리고머와 mRNA 카고의 제형화에 의해서 달성된다. 3차 성분은 배위 금속, 예컨대, Zn+2, Mg+2, Ca+2 등; 동적 비공유 가교 링커, 예컨대, 탄수화물, 반대이온, 예컨대, Cl-, AcO-, 석신에이트 및 시트레이트; 및 용해도 조정제, 예컨대, 지질 및 PEG를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
이러한 기술의 응용 분야는 하기를 포함할 수 있다: 임상 응용: (1a) 핵산 형질주입 벡터: DNA 및 RNA를 활용하여 수 년 동안 유전 질환을 치료하는 것이 제안되었지만, 유전자 요법의 임상 사용에 가장 큰 장애물은 여전히 올리고뉴클레오티드 카고의 효과적인 전달임. (lb) 감염 질환을 예방하기 위한 RNA 백 접종: mRNA 기반 백신은 DNA 백신에 비해 강력한 안전성 이점을 나타내지만 현재 세포로의 mRNA 전달에 의해 임상적으로 제한되어 있음. 이러한 응용 분야는 현재 임상적으로 조사되고 있지만, 가장 진보된 기술은 전기천공법을 사용한 시험관내 형질 주입을 위해 환자로부터 1차 세포를 제거하고, 이어서 형질전환된 세포를 환자에게 재도입해야 함. 이 방법은 생체내에서 mRNA 발현을 직접 유도하는 전달 기술을 사용하여 크게 향상될 수 있음. (1c) 줄기 세포 유도: 본 발명자들의 기술을 사용하여 4가지 공지된 전사 인자의 발현을 유도함으로써 미분화 줄기 세포에서 다능성을 유도할 수 있음. 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르) 전달 비히클의 모듈형 특성은 4개의 필요한 모든 mRNA 전사체를 동시에 쉽게 전달할 수 있다. (1) 배양된 세포의 시험관내 형질주입, CRISPR/Cas9를 사용한 유전자 편집, 조합 유전자 발현(mRNA 번역) 및 유전자 넉다운(RNAi)을 사용한 경로 검증을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 기본 연구 응용. 암 면역요법, 알레르기 내약성, 단백질 대체 요법, 유전자 편집, 진단.
본 명세서에 개시된 복합체, 조성물 및 방법의 장점은 예를 들어 하기를 포함한다:
(1) J774 대식세포와 같이 형질주입이 어려운 세포주에서도 Lipofectamine 2000과 같은 상업적으로 입수 가능한 형질주입제보다 시험관내에서 mRNA 형질주입 효율이 더 높기 때문에, 내약성이 증가하면서 효능을 향상시킴.
(2) 생체내에서의 강력한 유전자 발현(BALB/c 마우스), 이는 이러한 기술의 임상적 적용 가능성을 입증하여 리포펙타민과 같은 양이온성 담체의 독성을 방지하고, 생체외 유전자 전달 및 발현 방법에 대한 임상적 대안을 제공함.
(3) 상이한 투여 경로를 사용하여 차별적인 생체내 유전자 발현이 달성될 수 있으며, 간 및 비장 발현은 정맥 주사 시 우세한 반면, 국소 발현은 (예를 들어) 근육내 전달로 투여 부위에서 지속됨. 비강 전달은 점막 및/또는 폐 흡수 경로를 제공함.
(4) 효율적인 유전자 발현을 가능하게 하는 공지된 대사산물(비스-히드록시에틸글리신)으로의 신속한 분해
(5) 낮은 pH 환경(예컨대, 피부 또는 장관)에서 안정성을 나타내는 올리고뉴클레오티드-보유 입자와 같이 pH-의존적 방식의 mRNA의 방출, 그러나 더 높은 pH 환경에서는 분해됨.
(6) 무-금속 합성을 통해 재료에 쉽게 접근하여 목표 분자량 및 분산에 대한 높은 수준의 제어를 갖는 올리고머, 중합체 또는 블록/통계 공중합체 또는 코-올리고머를 제조함.
(7) 물질은 형성된 입자의 표면에 폴레이트 또는 비오틴과 같은 표적화 리간드의 첨가를 통해서 또는 단클론성 항체에 대한 부착을 통해서를 통해서 표적화가 가능함.
(8) 양이온성 폴리아미노에스테르 도메인의 단리 가능한 중성 소분자에 대한 특이적 희생 기전은 히드록시에틸글리신의 환식 이량체인 생체 적합성/생물 분해성 생성물인 비스-N-히드록시에틸-2,5-피페리진디온의 형성을 초래함.
복합체, 조성물 및 방법의 특징은 하기를 포함한다. 실시형태에서, 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르) 폴리(아미노에스테르) 및 이의 유래된 양이온성 물질은 하기 특성 및 기능 중 적어도 하나를 나타낼 수 있다:
(1) 생체 적합성/생물 분해성 히드록시에틸글리신 이량체를 초래하는 양이온성 폴리아미노에스테르의 특이적, pH-반응성 희생 기전; 올리고뉴클레오티드 카고의 방출로 이어지는 이러한 물질의 도메인은, 이것이 양이온성 암모늄을 비가역적으로 중화시켜 음이온성 카고의 방출을 신속하게 촉발하는 예상하지 못한 분자내 결합-형성 사건을 통해서 발생할 수 있다는 점에서 다른 응답성 생물물질 중에서도 고유함.
(2) 분자내 분해의 단리 가능한 생성물, 예컨대, 비스-N-히드록시에틸-2,5-피페리클라-7-인디온(이것은 히드록시에틸 글리신으로 추가로 분해됨).
(3) 음이온성 카고가 전달을 위해 입자로 정전기적으로 패키징된 다음, 세포 내재화 후 빠르게 방출되도록 일시적인 활동창을 제공함.
(4) 마크로분자 구조보다 제어되는 다중 락톤 단량체의 공중합이 가능함. 작용화된 단량체는 블록 또는 통계 구조로 중합될 수 있고, 이것은 다중 단량체 유형, 예컨대, 환식 카르보네이트 또는 포스페이트의 조합을 추가로 가능하다.
(5) 이러한 물질을 생체내에서 사용하는 것은 국소적으로 또는 전신으로 투여되는 경우에도 급성 독성 없이 일어날 수 있는데, 이는 치료 응답에 필요한 농도에서 높은 내약성을 나타냄.
(6) 유전자 전달 비히클, 폴리(카르보네이트-코-아미노에스테르)로서 사용하는 것은 메신저 RNA를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 효율적인 전달 및 방출을 가능하게 함. MTC-도데실 카르보네이트 및 N-Boc 모르폴린-2-온 단량체의 양친매성 블록 코-올리고머를 큰 음이온성 카고, 예컨대, mRNA와 제형화하여 안정적인 400 nm 미만의 입자를 형성할 수 있다. 이러한 생성된 입자는 세포에 의해서 효과적으로 흡수되고, 이의 mRNA 카고를 방출하여, 강력한 유전자 발현을 초래할 수 있다. 이러한 개념은, 다수의 세포주에서 시험관내에서 뿐만 아니라 마우스 연구에서 생체내에서 입증되었다. 이러한 물질의 효능은 양이온성 아미노에스테르 블록의 pH-반응성 재배열로 인해서 중성 소분자 비스-N-히드록시에틸-2,5-피페리딘디온 비스-히드록시에틸글리신을 형성하기 때문이라 것을 발견하였다. 다른 양이온성 유전자 전달 비히클은 이전에 보고되어 있지만, 이러한 올리고(카르보네이트-코-아미노에스테르)는 세포 흡수에 적절한 시간 척도에서 mRNA(또는 다른 올리고뉴클레오티드) 카고를 방출하는 고유한 능력 및 내약성으로 인해 고유하고, 최고의 성능을 발휘한다.
(7) mRNA 전달을 위한 경험적으로 결정된 최적 길이는 MTC-도데실 카르보네이트 및 N-Boc 모르폴린-2-온 도메인 모두의 경우 평균 DP 12의 이블록이 최적으로 성능을 발휘한다는 점에서 종래 기술과는 거리가 멈. 이 길이는 상업적으로 입수 가능한 양이온성 폴리아민 벡터, 예컨대, PEI보다 훨씬 더 짧고; 이것은 또한 본 발명자들이 이전에 발견한 siRNA 전달 벡터보다 더 길다(WO2013036532 A1 및 문헌[PNAS 2012, 109 (33), 13171―13176] 참고).
일 양태에서, 본 명세서에는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를 본 출원 다른 곳에 기재된 세포-침투 복합체와 접촉시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 이 방법은 세포에서 유전자-편집(gene-edition)을 초래할 수 있다. 실시형태에서, 유전자-편집은 게놈-편집 또는 게놈 편집을 포함할 수 있는데, 이것은 DNA가 단리된 또는 조작된 뉴클레아제 시스템을 사용하여 살아있는 유기체의 게놈 내에 삽입되거나, 결실되거나, 대체되는 유전자 조작의 유형이다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 형질주입된 세포에서 유전자-편집을 초래할 수 있는 유전자 툴 또는 시스템을 전달할 수 있다. 유전자-편집을 위한 유전자 툴 또는 시스템의 일부 비제한적인 예는 CRISPR-Cas 시스템 및 트랜스포존 시스템을 포함한다.
일 양태에서, 일부 실시형태에 따른 형질주입 방법에 의해서 형질주입된 핵산(즉, 카고 핵산)은 세포의 게놈 내에서 표적 서열과 혼성화하는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 Cas9 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 벡터를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치될 수 있다.
일반적으로 CRISPR/Cas9를 채택한 시스템은 유전자 편집에 대해 높은 수준의 충실도 및 비교적 간단한 작제를 제공한다. 이 시스템은 특이성에 대해서 두 가지 인자, 즉, 표적 서열 및 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 좌우될 수 있다. 표적 서열은 예를 들어, crRNA 어레이의 각각의 CRISPR 유전자좌의 부분으로서 20개 염기 길이일 수 있다. crRNA 어레이는 여러 개의 고유한 표적 서열을 가질 수 있다. Cas9 단백질은 숙주 DNA 상의 염기쌍과 결합하는 서열을 활용하여 숙주 게놈에서 올바른 위치를 선택할 수 있다. 숙주 게놈의 PAM 서열은 Cas9에 의해 인식될 수 있다. 요소가 예를 들어, 하나 이상의 플라스미드 내에서 조립되고, 세포 내에 형질주입되면, crRNA의 도움으로 Cas9 단백질은 숙주 세포의 DNA에서 올바른 서열을 찾을 수 있고, Cas9 변이체에 따라서, DNA에서 단일 또는 이중 가닥을 생성시킨다. 숙주 DNA에서 적절하게 이격된 브레이크는 상동성 직접 수선(homology directed repair)을 촉발할 수 있다. DNA 수선 주형을 제공하면 게놈 내의 의도된 위치에 특정 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 일단 혼입되면, 새로운 서열은 이제 세포의 유전 물질의 일부가 되며 딸 세포에 전달될 수 있다. 효과적인 sgRNA 서열을 설계하는 데 도움이 되는 많은 온라인 툴이 당업계에서 입수 가능하다. 일부 실시형태에 따르면, 특정 실시형태에 따른 방법 및 조성물은 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 Cas9 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 전달하거나 형질주입시켜 형질주입된 세포에서 유전자-편집을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 특정 실시형태에 따른 형질주입 방법에 의해서 형질주입된 카고 핵산은 CRISPR RNA(crRNA)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 crRNA는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열의 동일한 벡터 내에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 특정 실시형태에 따른 형질주입 방법에 의해서 형질주입된 카고 핵산은 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA)를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 tracrRNA는 Cas9 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열의 동일한 벡터 내에 존재할 수 있다.
일부 실시형태에서, 일부 실시형태에 따른 형질주입 방법에서 사용되는 Cas9 단백질은 형질주입된 세포에서 발현을 위해서 코돈 최적화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 일부 실시형태에 따른 형질주입 방법에 의해서 형질주입된 핵산(즉, 카고 핵산)은 트랜스포사제를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열 및 트랜스포사제 인식 부위가 측접된 관심대상 유전자의 핵산 서열을 갖는 제2 뉴클레오티드 서열을 갖는 하나 이상의 벡터를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 뉴클레오티드 서열 및 제2 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 상이한 벡터 상에 위치될 수 있다.
수송 가능한(transposable) 요소(또는 트랜스포존)는 일반적으로 게놈 내에서 이의 위치를 변화시키고, 때때로 돌연변이를 생성하거나 반전시키고, 세포의 유전 조성물 및 게놈 크기를 변경할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 트랜스포사제는 일반적으로 트랜스포존에 결합하고, 예를 들어, 컷 앤 페이스트 기전(cut and paste mechanism) 또는 복제 전치 기전에 의해서 트랜스포존이 게놈의 다른 부분으로 이동하는 것을 촉매할 수 있는 효소를 지칭한다. 트랜스포사제 및 세포에서 트랜스포사제 인식 부위가 측접된 관심대상 유전자의 도입은 세포 게놈 내의 관심대상 유전자의 삽입을 유도할 수 있다. 일부 실시형태에 따라서, 본 명세서 특정 실시형태에 따른 방법 및 조성물은 트랜스포사제 및 관심대상 유전자를 암호화하는 핵산을 전달 또는 형질주입시켜 형질주입된 세포에서 유전자-편집을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 일부 실시형태에 따른 형질주입에서 사용된 트랜스포사제는 게놈 서열을 인식하고, 절제할 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 형질주입 방법을 통해 형질주입된 관심대상 유전자의 핵산 서열은 형질주입된 세포의 게놈 내에 통합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 일부 실시형태에 따른 형질주입 방법을 통해서 수행된 게놈-편집은 DNA 결실, 유전자 파괴, DNA 삽입, DNA 역전, 점 돌연변이, DNA 대체, 넉인 및 넉아웃 중 하나 이상을 유발할 수 있다.
면역 반응의 유도 방법
또 다른 양태에서, 본 명세서에는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 방법은 세포-침투 복합체를 사용하여 질환 또는 병태를 치료 및/또는 예방할 수 있다. 방법은 일반적으로 이를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 세포-침투 복합체 또는 본 명세서에 기재된 세포-침투 복합체를 갖는 약제학적 조성물을 단독으로(예를 들어, 단일요법으로) 또는 1종 이상의 추가 성분, 예를 들어, 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 추가 치료제와 조합하여(예를 들어, 병용 요법)투여하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체 또는 세포-침투 복합체를 갖는 약제학적 조성물은 세포-침투 복합체 또는 이의 약제학적 조성물로 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신으로 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신은 대상체에서 질환 또는 병태의 발생 가능성을 예방하거나 감소시킬 수 있도록 예방적 활성을 가질 수 있다. 실시형태에서, 백신이 예방적 목적을 위해서 사용되는 경우, 대상체는 질환 또는 병태를 갖지 않는 동물, 예를 들어, 질환 또는 병태로 진단되지 않은 인간 또는 질환 또는 병태와 연관된 인지 가능한 증상을 갖지 않는 인간일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 백신은 백신이 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있도록 치료 효과를 갖는다. 치료용 백신의 일부 예는 암을 이미 앓고 있는 환자에게 투여될 수 있는 암 백신을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다. 암 백신은 하나 이상의 항암 활성, 예를 들어, 암 세포 수의 감소, 암 크기의 감소, 암 세포의 사멸, 전이의 감소 및/또는 저해 및 암 세포 성장 및/또는 증식의 감소를 나타낼 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, 암 백신은 또한 예방적 목적으로, 특히 암에 걸리기 쉬운 것으로 간주되지만, 현재는 암을 갖지 않는 대상체에서 사용될 수 있다. 예방적 백신은 특정 암을 갖는 병에 취약한 대상체에게 투여되어, 대상체에서 암 발생 가능성을 예방하거나 감소시킬 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에서 본 개시내용은 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 질환에 대해서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 유효량의 세포-침투 복합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 복합체가 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있는 백신으로 사용될 수 있다. 복합체는 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 함유할 수 있고, 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신 또는 백신 조성물에 의해서 표적화되는 질환 또는 병태는 자가면역 질환, 염증 질환, 암 질환, 감염 질환, 대사 질환, 발달 질환, 심혈관 질환, 간 질환, 장 질환, 내분비 질환, 신경 질환 또는 다른 질환을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 백신 또는 이의 조성물에 함유된 핵산은 항원성 또는 면역원성 에피토프를 암호화하는 핵산 서열일 수 있다. 예를 들어, 감염 질환이 고려되는 경우, 백신에 함유된 핵산은 감염 질환의 병원체(예를 들어, 병원성 박테리아 또는 바이러스)에서 발현되는 것으로 알려진 1종 이상의 펩티드를 암호화할 수 있고, 대상체에게 투여될 때 면역 반응을 유도할 수 있다. 질환이 특정 유형의 암인 또 다른 예에서, 백신 조성물을 사용하여 대상체에게 투여되는 핵산은 암과 연관된 1종 이상의 펩티드, 예를 들어, 그러한 유형의 암에서만 실질적으로 발현되는 펩티드를 암호화할 수 있고, 이의 발현 수준은 비-암 세포와 비교할 때 암 세포에서 상당히 더 높다. 항원성 또는 면역원성 펩티드(들)를 암호화하는 핵산이 대상체에게 투여되어 대상체의 특정 세포 내에 전달(즉, 형질주입)되는 경우, 형질주입된 핵산은 항원성 펩티드(들) 내에서 결국 번역되고, 발현될 수 있다. 발현된 펩티드(들)는 항원성 또는 면역원성이기 때문에, 발현된 펩티드에 대한 면역 반응이 대상체에서 유도될 수 있다. 유도된 면역 반응은 예를 들어, 대상체가 이미 질환을 앓고 있는 경우 영향을 받은 세포의 집단을 특이성으로 감소시켜, 치료 효과를 나타냄으로써, 표적 질환을 치료하는 기능할 수 있다. 대안적으로, 대상체는 이러한 백신접종을 통해서 획득된 면역 반응을 가질 수 있는데, 여기서 후천 면역 반응은 면역 반응에 의해 표적화되어, 후속 만남 시에 그 표적에 대한 향상된 반응으로 이어져서, 예방적 효과를 나타내는 면역원성 펩티드에 대한 초기 반응 후에 면역학적 기억을 도출할 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신접종은 단일 백신 조성물에서 핵산의 2개의 별개의 유형(또는 서열)을 전달함으로써 치료적 효과 및 예방적 효과의 이중 활성을 제공할 수 있다. 2개의 별개의 핵산은 2개의 상이한 면역원성 펩티드를 암호화할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 (1) 기존의 질환 또는 병태에 대한 보다 즉각적인 치료 효과를 유도할 수 있는 제1 면역원성 펩티드를 암호화하는 제1 핵산 및 (2) 상이한 질환 또는 병태의 미래 발생에서 후천 면역을 목적으로 하는 상이한 제2 면역원성 펩티드를 암호화하는 제2 핵산을 형질주입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 백신은 대상체에게 2종 이상의 상이한 핵산을 전달할 수 있고, 각각의 핵산은 독립적으로 각각 치료적 효과 또는 예방적 효과를 나타낸다.
실시형태에서 백신 조성물은 2종 이상의 상이한 유형(또는 상이한 화학식)의 양이온성 양친매성 중합체를 가질 수 있다. 대안적으로, 백신 조성물은 단지 단일 유형(또는 단일 화학식)의 양이온성 양친매성 중합체를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 유형의 양이온성 양친매성 중합체는 하나의 유형(서열)의 핵산에 비-공유 결합될 수 있다. 대안적으로, 단일 유형의 양이온성 양친매성 중합체는 2종 이상의 유형(서열)의 핵산에 비-공유 결합될 수 있다. 따라서 실시형태에서, 각각 상이한 서열의 핵산에 결합된, 상이한 유형의 양이온성 양친매성 중합체의 혼합물이 2종 이상의 서열(또는 유형)의 핵산을 전달하기 위해서 대상체에게 함께 투여될 수 있다. 대안적으로, 다수의 유형(또는 서열)의 핵산에 결합된 단일 유형(또는 화학식)의 양이온성 양친매성 중합체가 2종 이상의 서열(또는 유형)의 핵산을 전달하기 위해서 대상체에게 투여될 수 있다. 더 대안적으로, 단일 서열(또는 유형)의 핵산에 결합된 단일 유형(또는 화학식)의 양이온성 양친매성 중합체가 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 백신 또는 이의 조성물에 함유된 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)일 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 백신 또는 이의 조성물에 함유된 핵산은 mRNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 백신접종을 통해서 대상체에서 하나 이상의 세포에 형질주입된다. 일부 실시형태에서, 하나 또는 하나를 초과하는 핵산 서열이 백신 조성물을 통해서 형질주입될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 백신 조성물은 각각 상이한 항원성 펩티드를 암호화하는 2개의 상이한 핵산을 함유한다. 따라서, 백신이 백신접종을 필요로 하는 대상체에게 투여되는 경우, 2종 이상의 항원성 에피토프가 발현되어, 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 하나의 유형의 핵산이 백신접종을 통해서 형질주입되어 하나의 유형의 에피토프가 발현되어 대상체에서 면역반응을 유도할 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법은 대상체에게 유효량의 세포-침투 복합체를 투여하는 것에 더하여, 대상체에게 유효량으로 1종 이상의 추가적인 약제학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 추가적인 약제학적 조성물은 항암제 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 추가적인 항암제는 예를 들어, 항체, 소분자 및 큰 분자 또는 이들의 조합물일 수 있다. "항암 활성"의 예는 암 세포 수의 감소, 암 크기의 감소, 암 세포의 사멸, 전이의 감소 및/또는 저해 및 암 세포 성장 및/또는 증식의 감소를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 세포-침투 복합체와 추가적인 약제학적 조성물의 투여는 개별 투여의 합보다 더 양호한 상승작용적 효과를 나타낼 수 있다.
조성물
일 양태에서, 본 명세서에서 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 양친매성 중합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 핵산에 비-공유 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하나 이상의 친유성 중합체 도메인 및 하나 이상의 pH-감응성 희생 도메인을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 1종 이상의 선택적인 성분과 함께 조성물로 제형화될 수 있다. 양이온성 양친매성 중합체 또는 이의 조성물은 1종 이상의 핵산과의 비-공유 결합을 통해서 세포-침투 복합체 내에 제형화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 명세서의 개시내용은 핵산 및 양이온성 양친매성 중합체를 함유하는 세포 침투 복합체를 제공한다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 핵산에 비-공유 결합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하나 이상의 친유성 중합체 도메인 및 하나 이상의 pH-감응성 희생 도메인을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포-침투 복합체는 1종 이상의 선택적인 성분과 함께 조성물로 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체 또는 세포-침투 복합체는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 데 사용될 수 있는 조성물로 제형화될 수 있다. 핵산을 세포 내에 형질주입시킬 수 있는 조성물은 적어도 일부 실시형태에서 형질주입 조성물로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체에 결합되어 세포-침투 복합체를 형성할 수 있는 카고 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)일 수 있다. 양이온성 양친매성 중합체를 갖지만 카고 핵산을 갖지 않는 형질주입 조성물은 예를 들어, 형질주입 전에 양이온성 양친매성 중합체 및 핵산을 접촉(또는 혼합)시켜, 카고 핵산과 제형화될 수 있다.
실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하는 형질주입은 하나 이상의 세포 특성을 변화시킬 수 있다. 실시형태에서, 형질주입은 형질주입된 세포에서 유전자 발현 프로파일의 변화를 초래할 수 있고, 예를 들어, 하나 이상의 유전자 산물(예를 들어, RNA 또는 펩티드)의 발현을 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 일부 다른 예에서, 형질주입은 예를 들어, 게놈 구조를 변화시킬 수 있고, 예를 들어, CRISPR/Cas9 시스템 또는 트랜스포존 시스템의 형질주입 성분을 통한 유전자-편집을 초래할 수 있다. 일부 다른 예에서, 형질주입은 세포 경로의 활성을 조절하게 할 수 있다. 따라서 이러한 예 중 일부에서, 형질주입은 줄기 세포의 유도를 초래할 수 있다. 일부 다른 예에서, 조성물은 형질주입이 질환 또는 병태를 치료 및/또는 예방할 수 있도록 치료 효과를 갖는 카고 핵산을 전달(또는 형질주입)할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료용 카고 핵산을 전달(또는 형질주입)하는 조성물은 조성물이 투여된 대상체에서 면역 반응을 유도할 수 있다. 상기로부터 자명한 바와 같이, 카고 핵산 및 이의 기능성에 따라 양이온성 양친매성 중합체 또는 세포-침투 복합체를 갖는 조성물을 포함하는 본 개시내용에 따른 조성물을 사용하여 형질주입된 세포 또는 투여된 대상체에서 다양한 결과를 제공할 수 있다.
약제학적 조성물
일부 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체 또는 세포-침투 복합체를 갖는 조성물은 치료 목적을 위해서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료 목적은 예방적 목적(질환 또는 병태가 발생하는 것을 예방하는 목적) 및 치료 목적(존재하는 질환 또는 병태를 치료하는 목적)을 포함한다. 조성물이 양이온성 양친매성 중합체를 갖지만 카고 핵산을 갖지 않는 경우, 치료 효과를 나타낼 수 있는 카고 핵산은 대상체에게 투여되기 전에 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 백신 또는 이의 조성물, 즉, 백신 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 조성물일 수 있다. 백신 또는 백신 조성물을 사용하여 질환 또는 병태 또는 질환 또는 병태와 연관된 병원체를 예방 및/또는 치료할 수 있다. 일부 실시형태에서, 백신 또는 백신 조성물은 양이온성 양친매성 중합체 및 카고 핵산을 갖는 세포-침투 복합체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 경우 세포-침투 복합체는 면역 반응, 즉, 면역원성을 유도할 수 있다. 이러한 면역원성은 카고 핵산에 의해서 암호화된 하나 이상의 항원성 펩티드가 형질주입된 세포에서 발현되는 경우 적어도 부분적으로 유도될 수 있다.
일 양태에서, 본 명세서에 개시된 양이온성 양친매성 중합체 또는 세포-침투 복합체는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다. 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 가질 수 있다. 일 실시형태에서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 활성 성분으로서 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 갖고, 투여 경로에 따라서 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 첨가제를 더 함유하는 세포-침투 복합체를 가질 수 있다. 이러한 부형제 또는 첨가제의 물, 약제학적으로 허용 가능한 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 크산탄검, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토스, 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제 등을 포함한다. 사용되는 첨가제는 적절한 경우 본 개시내용의 투여 형태에 따라서, 비제한적으로 상기 또는 이의 조합물로부터 선택될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 면역학적 아주반트이다. 실시형태에서, 면역학적 아주반트는 Toll-유사 수용체(TLR)의 효능제, STING 경로의 효능제, CD40, OX40, CTLA4, PD1 또는 PD1-L에 대한 효능성 항체, 프로인트 아주반트, 브리오스타틴 또는 CD40, OX40, CD137, PD1, CTLA4에 대한 리간드 및 이들의 임의의 조합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 아주반트는 세포-침투 복합체가 대상체에게 복합체와 공동 투여되는 경우 유도되는 면역원성을 증가시킬 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물의 제형은 선택된 투여 경로(예를 들어, 용액, 에멀젼)에 따라서 달라질 수 있다. 투여 경로는 예를 들어, 근육내, 피하, 정맥내, 림프내, 피하, 근육내, 안내, 국소 피부, 국소 결막, 경구, 방광내(방광), 항문내 및 질내일 수 있다.
일부 실시형태에서, 조성물은 동결보호제를 포함할 수 있다. 동결보호제의 비제한적인 예는 글리콜(예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 글리세롤), 디메틸 설폭시드(DMSO), 포름아미드, 수크로스, 트레할로, 덱스트로스 및 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 제형은 제어 방출 제형이다. 용어 "제어 방출 제형"은 지속 방출 및 시간-방출 제형을 포함한다. 제어 방출 제형은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이것은 조성물의 지속적인, 주기적인, 펄스형 또는 지연된 방출을 허용하는 부형제를 포함한다. 제어 방출 제형은 비제한적으로 조성물을 매트릭스; 장용 코팅; 마이크로-캡슐화; 겔 및 히드로겔; 이식편; 및 조성물의 제어 방출을 허용하는 임의의 다른 제형에 내장시키는 것을 포함한다.
일 양태에서 세포-침투 복합체 또는 이의 조성물을 갖는 키트 부품이 제공된다. 또 다른 양태에서 핵산 또는 이의 조성물에 결합되지 않은 양이온성 양친매성 중합체를 갖는 키트 부품이 제공된다. 키트는 양이온성 양친매성 중합체 및 카고 핵산을 사용하여 세포-침투 복합체를 제조하기 위한 프로토콜을 설명하는 문서 또는 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 키트의 문서 또는 지침서는 또한 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 프로토콜을 설명할 수 있다.
본 명세서에 기재된 제형은 활성 성분, 즉, 목적하는 순도를 갖는 면역원성제(들)를 선택적인 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써 저장을 위해서 제조될 수 있다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성일 수 있고, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 산화방지제, 예컨대, 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 다당류 및 다른 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.
본 명세서에서 제형은 또한 1종 초과의 활성 화합물(예를 들어, 세포-침투 복합체를 갖는 면역원성제(들) 이외의 제2 활성제)을 함유할 수 있는데, 이것은 서로에 부정적인 영향을 미치지 않는 상보성 활성을 위해서 선택될 수 있다. 이러한 분자는 의도된 목적에 효과적일 수 있는 양으로 조합물로 적합하게 존재할 수 있다.
투여
일부 양태에서 세포 또는 대상체 내에서 목적하는 활성을 제공하도록 조성물을 세포 또는 대상체에게 전달하는 방법이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 카고 핵산을 갖는 세포-침투 복합체를 함유할 수 있다. 카고 핵산은, 세포에 형질주입되거나 대상체에게 투여되는 경우, 핵산 서열의 본성에 따라서 다양한 의도된 효과를 제공할 수 있다. 의도된 효과의 일부 비제한적인 예는 유전자 발현에 대한 조절, 세포 경로의 조절, 게놈-편집 및 면역 반응의 유도를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 대상체에서 의도된 효과의 적어도 일부를 달성하기에 충분한 유효량으로 대상체에게 투여될 수 있다.
조성물과 관련하여 사용되는 경우, "투여", "투여하는"등은 시험관내에서 세포에 투여될 수 있는 직접 투여, 생체내에서 세포에 대한 투여, 의료 전문가에 의한 대상체에 대한 투여 또는 대상체에 의한 자가 투여 및/또는 본 개시내용의 조성물을 처방하는 행동일 수 있는 간접 투여 둘 다를 지칭한다. 세포와 관련하여 본 명세서에서 사용되는 경우, 조성물을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 유효량이 투여되며, 이 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 임의의 투여 방법이 사용될 수 있다. 화합물(예를 들어, 약물 및 항체)은 예를 들어, 화합물을 세포 배양 배지에 첨가하거나 생체내에 주사함으로써 세포에 투여될 수 있다. 대상체에 대한 투여는 예를 들어, 혈관내 주사, 직접 종양내 전달 등에 의해 달성될 수 있다.
투여는 경구 투여, 좌약으로서의 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 척수강내, 비강내 또는 피하 투여, 또는 대상체에 대한 서방형 장치, 예를 들어, 미니 삼투 펌프의 이식을 의미할 수 있다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 협측, 설하, 구개, 치은, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함한 모든 경로로 의해서 실시된다. 비경구 투여는 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포솜 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "공동 투여"란 본 명세서에 기재된 조성물이 하나 이상의 추가 요법, 예를 들어, 암 요법, 예컨대, 화학 요법, 호르몬 요법, 방사선 요법 또는 면역요법의 투여와 동시에, 직전에 또는 직후에 투여된다는 것을 의미한다. 본 개시내용의 화합물은 단독으로 투여될 수 있거나 환자에게 공동 투여될 수 있다. 공동 투여는 화합물을 개별적으로 또는 조합하여(1종 초과의 화합물) 동시에 또는 순차적으로 투여를 포함하는 것을 포함하는 의미이다.
대상체에게 투여되는 투여량 및 빈도(단일 또는 다중 용량)는 다양한 인자, 예를 들어, 대상체가 다른 질환을 앓고 있는지의 여부, 투여 경로; 수용자의 체격, 연령, 성별, 건강, 체중, 체질량 지수 및 식단; 치료될 질환의 증상의 특징 및 정도, 동반 치료의 유형, 치료될 질환으로부터의 합병증 또는 다른 건강 관련 문제에 따라서 달라질 수 있다. 다른 치료 요법 또는 작용제는 이의 실시형태를 포함하여 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 확립된 투여량(예를 들어, 빈도 및 기간)의 조정 및 조작은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
본 명세서에 제공된 교시를 이용하여, 실질적인 독성을 유발하지 않지만, 특정 환자에 의해 입증된 임상 증상을 치료하는 데 효과적인, 효과적인 예방적 또는 치료적 치료 요법을 계획할 수 있다. 이 계획은 화합물 효능, 상대적인 생체이용률, 환자 체중, 부작용의 존재 및 중증도, 선호하는 투여 방식 및 선택된 약제의 독성 프로필과 같은 요인을 고려하여 활성 화합물을 신중하게 선택하는 것을 포함할 것이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물, 예를 들어, 인간, 비-인간 영장류, 뮤린(즉, 마우스 및 래트), 개과, 고양이과 및 말과이다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시형태에서, 조성물은 약 1 ng/kg 대상체 체중, 약 10 ng/kg 대상체 체중, 약 50 ng/kg 대상체 체중, 약 100 ng/kg 대상체 체중, 약 500 ng/kg 대상체 체중, 약 1 ug/kg 대상체 체중, 약 10 μg /kg 대상체 체중, 약 50 ug/kg 대상체 체중, 약 100 μg /kg 대상체 체중, 약 150 μg /kg 대상체 체중, 약 200 μg /kg 대상체 체중, 약 250 μg /kg 대상체 체중, 약 300 μg /kg 대상체 체중, 약 350 μg /kg 대상체 체중, 약 375 μg /kg 대상체 체중, 약 400 μg /kg 대상체 체중, 약 450 μg /kg 대상체 체중, 약 500 μg /kg 대상체 체중, 약 550 μg /kg 대상체 체중, 약 600 μg /kg 대상체 체중, 약 650 μg /kg 대상체 체중, 약 700 μg /kg 대상체 체중, 약 750 μg /kg 대상체 체중, 약 800 μg /kg 대상체 체중, 약 850 μg /kg 대상체 체중, 약 900 μg /kg 대상체 체중, 약 1 mg/kg 대상체 체중, 약 10 mg/kg 대상체 체중, 약 50 mg/kg 대상체 체중, 약 100 mg/kg 대상체 체중, 약 500 mg/kg 대상체 체중, 약 1 g/kg 대상체 체중 초과 또는 상기의 임의의 사이 범위의 용량(양)으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 0.5 μg, 약 1.0 μg, 약 1.5 μg, 약 2.0 μg, 약 2.5 μg, 약 3.0 μg, 약 3.5 μg, 약 4.0 μg, 약 4.5 μg 약 5.0 μg, 약 5.5 μg, 약 6.0 μg, 약 6.5 μg, 약 7.0 μg, 약 7.5 μg, 약 8.0 μg, 약 8.5 μg, 약 9.0 μg, 약 9.5 μg, 약 1.0 mg, 약 1.5 mg, 약 2.0 mg, 약 2.5 mg, 약 3.0 mg, 약 3.5 mg, 약 4.0 mg, 약 4.5 mg 약 5.0 mg, 약 5.5 mg, 약 6.0 mg, 약 6.5 mg, 약 7.0 mg, 약 7.5 mg, 약 8.0 mg, 약 8.5 mg, 약 9.0 mg, 약 9.5 mg, 약 1 g 초과 또는 상기의 임의의 사이 범위의 용량(양)으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 7.5 μg 또는 약 0.375 mg/kg 대상체 체중의 용량(양)으로 투여될 수 있다. 투여는 목적하는 기간에 걸쳐서 반복될 수 있고, 예를 들어, 약 1일 내지 약 5일의 기간에 걸쳐서 또는 약 1개월, 약 2개월 등에 걸쳐서, 수 일, 예를 들어, 약 5일마다 1회 반복될 수 있다. 본 명세서에서 중량은 세포-침투 복합체의 중량 또는 조성물 또는 이의 약제학적 제형의 중량일 수 있다. 일부 실시형태에서,
일 실시형태에서 조성물은 목적하는 이익을 도출하거나 또는 치료 효과를 달리 제공하도록 6시간, 12시간, 일 단위 또는 격일마다 또는 주 단위 또는 월 단위 기준의 간격으로 전신으로 또는 국지적으로(예를 들어, 종양내 주사, 정맥내 주사) 투여될 수 있다.
일 실시형태에서, 특정 암 백신에서 조성물에 대한 반응률은 기준선 표준품 또는 대조군 표준품과 비교할 때 감소될 수 있다. 용어 "반응률"은 본 명세서에서 치료 이후에 암 후퇴로 반응한 환자의 백분율을 나타내는 종래의 의미로 사용된다. 반응률은 예를 들어, 부분 또는 완전 후퇴를 포함한다. 부분 반응은 암 세포의 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 후퇴를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대조군 표준품은 건강한 대상체, 암 대상체(예를 들어, 치료될 암 대상체 또는 또 다른 암 대상체) 또는 이의 임의의 집단으로부터 얻어진다.
본 명세서에 기재된 실시예 및 실시형태는 단지 예시의 목적을 위한 것이며, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 시사될 것이며, 본 출원의 사상 및 범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되고자 한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해서 전문이 참조에 의해 포함된다.
조성물 및 방법
본 명세서에 제공된 조성물 및 방법은 생체내에서 수용체 단백질(예를 들어, 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체)을 암호화하는 핵산을 세포에 전달하는 데 특히 유용하다. 본 명세서에 제공된 조성물은 놀랍게도 비-면역원성이고, 생체내에서 이를 필요로 하는 대상체에서 핵산을 세포, 예컨대, 골수성 또는 림프계 세포에 표적화 전달하기 위한 우수한 수단을 제공한다. 본 명세서에 제공된 방법 및 조성물을 사용하면, 다수의 유전자를 암호화하는 핵산이 용이하게 제형화되어 생체내에 전달될 수 있다. 이러한 조성물 및 방법은 생체내에서 강력한 발현을 제공하고, DNA 또는 mRNA를 전달할 수 있다. 실시형태에서, 표면 또는 분비 단백질을 암호화하는 핵산이 함께 전달될 수 있다(본 명세서에 제공된 복합체의 부분을 형성함). 표면 또는 분비 단백질은 효과기 기능을 향상시키고, 유해 효과(adverse effect)를 감소시키고, 전달된 수용체 단백질(예를 들어, CAR)의 억제를 저해할 수 있다. 일 양태에서, 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체가 제공되며, 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하고, 여기서 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
상기 화학식의 치환체는 전체 출원 전체에 기재된 바와 같이 정의된다. 따라서, 본 명세서에서 화합물의 다른 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬일이고, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된 5 내지 10원의 헤테로아릴이다. 본 명세서에서 화합물의 일부 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C1-C20 알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 2 내지 20원의 헤테로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C3-C8 시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 3 내지 8원의 헤테로시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴렌은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환된 또는 비치환된 5 내지 10원의 헤테로아릴렌이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 하기 실시예 부분, 도면 또는 표에 제시된 화학종이다.
일부 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬은 치환된 또는 비치환된 C1-C8 알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬은 치환된 또는 비치환된 2 내지 8원의 헤테로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬은 치환된 또는 비치환된 3 내지 7원의 헤테로시클로알킬이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴은 치환된 또는 비치환된 5 내지 9원의 헤테로아릴이다. 일부 실시형태에서, 각각의 치환된 또는 비치환된 알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C1-C8 알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 2 내지 8원의 헤테로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 C3-C7 시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌은 치환된 또는 비치환된 3 내지 7원의 헤테로시클로알킬렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 아릴렌은 치환된 또는 비치환된 C6-C10 아릴렌이고/이거나, 각각의 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌은 치환된 또는 비치환된 5 내지 9원의 헤테로아릴렌이다. 일부 실시형태에서, 화합물은 하기 실시예 부분, 도면 또는 표에 제시된 화학종이다.
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다.
R1A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br 또는 -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R1A는 독립적으로 R1A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R1A1- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R1A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R1A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R1A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R1A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R1A1는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R1A1는 독립적으로 R1A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R1A2- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R1A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R1A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R1A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R1A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R1A2는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R1A2는 독립적으로 R1A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R1A3- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R1A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R1A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R1A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R1A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R1A3은 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R1A3은 독립적으로 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R2A는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br 또는 -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R2A는 독립적으로 R2A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R2A1- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R2A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R2A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R2A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R2A1-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R2A1은 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R2A1은 독립적으로 R2A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R2A2- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R2A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R2A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R2A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R2A2-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R2A2는 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R2A2는 독립적으로 R2A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, R2A3- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R2A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R2A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R2A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R2A3-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
R2A3은 독립적으로 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br -OCH2I, 또는 -OCH2F일 수 있다. 실시형태에서, R2A3은 독립적으로 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
L1은 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L1은 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬렌, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬렌, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬렌, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬렌, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴렌, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L1은 RL1-치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬렌, RL1-치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬렌, RL1-치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬렌, RL1-치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬렌, RL1-치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴렌 또는 RL1-치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴렌이다. RL1은 독립적으로 수소, 할로겐, =O, =S, -CF3, -CN, -CCl3, -COOH, --CH2COOH, -CONH2, -OH, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, SO2NH2, -NO2, -NH2, - -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴일 수 있다.
L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L2는 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬렌, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬렌, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬렌, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬렌, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴렌, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴렌이다. 실시형태에서, L2는 RL2-치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬렌, RL2-치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬렌, RL2-치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬렌, RL2-치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬렌, RL2-치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴렌 또는 RL2-치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴렌이다. RL2는 독립적으로 수소, 할로겐, =O, =S, -CF3, -CN, -CCl3, -COOH, --CH2COOH, -CONH2, -OH, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, SO2NH2, -NO2, -NH2, - -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, 비치환된(예를 들어, C1-C20 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴일 수 있다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00062
; (식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고, R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1 및 LP2는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고, z5는 1 내지 10의 정수이고, z1 및 z3은 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 독립적으로 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 다른 실시형태에서, 고리 A는 페닐 또는 나프탈렌일이다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00063
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00064
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00065
, (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 CART임).
실시형태에서, z5는 1 내지 3의 정수이다. 실시형태에서, z5는 1 또는 3이다. 실시형태에서, z5는 1이다. 실시형태에서, z5는 3이다. 실시형태에서, R2A는 수소이다. 실시형태에서, L2는 결합이다.
실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00066
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 50의 범의의 정수이다. 실시형태에서, n은 7이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00067
, (식 중, n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, LP1은 화학식을 갖는다:
Figure pct00068
, (식 중, n21은 1 내지 100의 정수이고;
R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, R201은 독립적으로 R201A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, R201A- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R201A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R201A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R201A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R201A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R201A는 독립적으로 R201B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, R201B- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R201B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R201B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R201B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R201B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R201B는 독립적으로 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일이다. 실시형태에서, 비치환된 C18 알켄일은 올레일이다.
실시형태에서, n21은 0 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 90의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, n21은 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n21은 0이다. 실시형태에서, n21은 1이다. 실시형태에서, n21은 2이다. 실시형태에서, n21은 3이다. 실시형태에서, n21은 4이다. 실시형태에서, n21은 5이다. 실시형태에서, n21은 6이다. 실시형태에서, n21은 7이다. 실시형태에서, n21은 8이다. 실시형태에서, n21은 9이다. 실시형태에서, n21은 10이다. 실시형태에서, n21은 11이다. 실시형태에서, n21은 12이다. 실시형태에서, n21은 13이다. 실시형태에서, n21은 14이다. 실시형태에서, n21은 15이다. 실시형태에서, n21은 16이다. 실시형태에서, n21은 17이다. 실시형태에서, n21은 18이다. 실시형태에서, n21은 19이다. 실시형태에서, n21은 20이다. 실시형태에서, n21은 21이다. 실시형태에서, n21은 22이다. 실시형태에서, n21은 23이다. 실시형태에서, n21은 24이다. 실시형태에서, n21은 25이다. 실시형태에서, n21은 26이다. 실시형태에서, n21은 27이다. 실시형태에서, n21은 28이다. 실시형태에서, n21은 29이다. 실시형태에서, n21은 30이다. 실시형태에서, n21은 31이다. 실시형태에서, n21은 32이다. 실시형태에서, n21은 33이다. 실시형태에서, n21은 34이다. 실시형태에서, n21은 35이다. 실시형태에서, n21은 36이다. 실시형태에서, n21은 37이다. 실시형태에서, n21은 38이다. 실시형태에서, n21은 39이다. 실시형태에서, n21은 40이다. 실시형태에서, n21은 41이다. 실시형태에서, n21은 42이다. 실시형태에서, n21은 43이다. 실시형태에서, n21은 44이다. 실시형태에서, n21은 45이다. 실시형태에서, n21은 46이다. 실시형태에서, n21은 47이다. 실시형태에서, n21은 48이다. 실시형태에서, n21은 49이다. 실시형태에서, n21은 50이다. 실시형태에서, n21은 51이다. 실시형태에서, n21은 52이다. 실시형태에서, n21은 53이다. 실시형태에서, n21은 54이다. 실시형태에서, n21은 55이다. 실시형태에서, n21은 56이다. 실시형태에서, n21은 57이다. 실시형태에서, n21은 58이다. 실시형태에서, n21은 59이다. 실시형태에서, n21은 60이다. 실시형태에서, n21은 61이다. 실시형태에서, n21은 62이다. 실시형태에서, n21은 63이다. 실시형태에서, n21은 64이다. 실시형태에서, n21은 65이다. 실시형태에서, n21은 66이다. 실시형태에서, n21은 67이다. 실시형태에서, n21은 68이다. 실시형태에서, n21은 69이다. 실시형태에서, n21은 70이다. 실시형태에서, n21은 71이다. 실시형태에서, n21은 72이다. 실시형태에서, n21은 73이다. 실시형태에서, n21은 74이다. 실시형태에서, n21은 75이다. 실시형태에서, n21은 76이다. 실시형태에서, n21은 77이다. 실시형태에서, n21은 78이다. 실시형태에서, n21은 79이다. 실시형태에서, n21은 80이다. 실시형태에서, n21은 81이다. 실시형태에서, n21은 82이다. 실시형태에서, n21은 83이다. 실시형태에서, n21은 84이다. 실시형태에서, n21은 85이다. 실시형태에서, n21은 86이다. 실시형태에서, n21은 87이다. 실시형태에서, n21은 88이다. 실시형태에서, n21은 89이다. 실시형태에서, n21은 90이다. 실시형태에서, n21은 91이다. 실시형태에서, n21은 92이다. 실시형태에서, n21은 93이다. 실시형태에서, n21은 94이다. 실시형태에서, n21은 95이다. 실시형태에서, n21은 96이다. 실시형태에서, n21은 97이다. 실시형태에서, n21은 98이다. 실시형태에서, n21은 99이다. 실시형태에서, n21은 100이다.
실시형태에서, LP2는 화학식을 갖는다:
Figure pct00069
(식 중, n22는 1 내지 100의 정수이고; R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일이다. 실시형태에서, 비치환된 C9 알켄일은 노넨일이다.
실시형태에서, R202는 독립적으로 R202A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, R202A- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R202A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R202A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R202A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R202A-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R202A는 독립적으로 R202B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, R202B- 치환된 또는 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, R202B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, R202B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, R202B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴 또는 R202B-치환된 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, R202B는 독립적으로 비치환된(예를 들어, C1-C30 또는 C1-C6) 알킬, 비치환된(예를 들어, 2 내지 20원 또는 2 내지 6원) 헤테로알킬, 비치환된(예를 들어, C3-C8 또는 C5-C7) 시클로알킬, 비치환된(예를 들어, 3 내지 8원 또는 3 내지 6원) 헤테로시클로알킬, 비치환된(예를 들어, C5-C10 또는 C5-C6) 아릴, 또는 비치환된(예를 들어, 5 내지 10원 또는 5 내지 6원) 헤테로아릴이다.
실시형태에서, n22는 0 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 90정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 80의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 70의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 60의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 50의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 40의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 30의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 20의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0 내지 10의 정수이다. 실시형태에서, n22는 5 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 15 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 25 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 35 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 45 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 55 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 65 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 75 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 85 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 95 내지 100의 정수이다. 실시형태에서, n22는 0이다. 실시형태에서, n22는 1이다. 실시형태에서, n22는 2이다. 실시형태에서, n22는 3이다. 실시형태에서, n22는 4이다. 실시형태에서, n22는 5이다. 실시형태에서, n22는 6이다. 실시형태에서, n22는 7이다. 실시형태에서, n22는 8이다. 실시형태에서, n22는 9이다. 실시형태에서, n22는 10이다. 실시형태에서, n22는 11이다. 실시형태에서, n22는 12이다. 실시형태에서, n22는 13이다. 실시형태에서, n22는 14이다. 실시형태에서, n22는 15이다. 실시형태에서, n22는 16이다. 실시형태에서, n22는 17이다. 실시형태에서, n22는 18이다. 실시형태에서, n22는 19이다. 실시형태에서, n22는 20이다. 실시형태에서, n22는 21이다. 실시형태에서, n22는 22이다. 실시형태에서, n22는 23이다. 실시형태에서, n22는 24이다. 실시형태에서, n22는 25이다. 실시형태에서, n22는 26이다. 실시형태에서, n22는 27이다. 실시형태에서, n22는 28이다. 실시형태에서, n22는 29이다. 실시형태에서, n22는 30이다. 실시형태에서, n22는 31이다. 실시형태에서, n22는 32이다. 실시형태에서, n22는 33이다. 실시형태에서, n22는 34이다. 실시형태에서, n22는 35이다. 실시형태에서, n22는 36이다. 실시형태에서, n22는 37이다. 실시형태에서, n22는 38이다. 실시형태에서, n22는 39이다. 실시형태에서, n22는 40이다. 실시형태에서, n22는 41이다. 실시형태에서, n22는 42이다. 실시형태에서, n22는 43이다. 실시형태에서, n22는 44이다. 실시형태에서, n22는 45이다. 실시형태에서, n22는 46이다. 실시형태에서, n22는 47이다. 실시형태에서, n22는 48이다. 실시형태에서, n22는 49이다. 실시형태에서, n22는 50이다. 실시형태에서, n22는 51이다. 실시형태에서, n22는 52이다. 실시형태에서, n22는 53이다. 실시형태에서, n22는 54이다. 실시형태에서, n22는 55이다. 실시형태에서, n22는 56이다. 실시형태에서, n22는 57이다. 실시형태에서, n22는 58이다. 실시형태에서, n22는 59이다. 실시형태에서, n22는 60이다. 실시형태에서, n22는 61이다. 실시형태에서, n22는 62이다. 실시형태에서, n22는 63이다. 실시형태에서, n22는 64이다. 실시형태에서, n22는 65이다. 실시형태에서, n22는 66이다. 실시형태에서, n22는 67이다. 실시형태에서, n22는 68이다. 실시형태에서, n22는 69이다. 실시형태에서, n22는 70이다. 실시형태에서, n22는 71이다. 실시형태에서, n22는 72이다. 실시형태에서, n22는 73이다. 실시형태에서, n22는 74이다. 실시형태에서, n22는 75이다. 실시형태에서, n22는 76이다. 실시형태에서, n22는 77이다. 실시형태에서, n22는 78이다. 실시형태에서, n22는 79이다. 실시형태에서, n22는 80이다. 실시형태에서, n22는 81이다. 실시형태에서, n22는 82이다. 실시형태에서, n22는 83이다. 실시형태에서, n22는 84이다. 실시형태에서, n22는 85이다. 실시형태에서, n22는 86이다. 실시형태에서, n22는 87이다. 실시형태에서, n22는 88이다. 실시형태에서, n22는 89이다. 실시형태에서, n22는 90이다. 실시형태에서, n22는 91이다. 실시형태에서, n22는 92이다. 실시형태에서, n22는 93이다. 실시형태에서, n22는 94이다. 실시형태에서, n22는 95이다. 실시형태에서, n22는 96이다. 실시형태에서, n22는 97이다. 실시형태에서, n22는 98이다. 실시형태에서, n22는 99이다. 실시형태에서, n22는 100이다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00070
,
(식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
실시형태에서, 핵산은 신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)이다. 실시형태에서, 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 서열을 포함한다.
일 양태에서, 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는 나노입자 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 복합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
일 양태에서, 핵산을 세포에 형질주입시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포를 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 세포 내에서 분해되어 분해 생성물을 형성한다. 실시형태에서, 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진이다.
실시형태에서, 핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 암호화하는 CAR을 포함한다.
실시형태에서, 방법은 mRNA가 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함한다. 실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 실시형태에서, 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 실시형태에서, 세포는 유기체의 부분을 형성한다. 실시형태에서, 유기체는 인간이다. 실시형태에서, 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포이다. 실시형태에서, 세포는 T 세포이다. 실시형태에서, 세포는 골수성 세포이다.
일 양태에서, 면역 반응 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이 방법은 유효량의 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 면역 반응은 항암 면역 반응이다.
일 양태에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 유효량의 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 바와 같은 복합체를 투여하는 단계를 포함한다. 실시형태에서, 투여는 정맥내 주사 또는 피하 주사를 포함한다.
일 양태에서, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 세포를 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하며, 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 서열을 포함한다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00071
; (식 중, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A를 갖고,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 다른 실시형태에서, 고리 A는 페닐 또는 나프탈렌일이다. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00072
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00073
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00074
, (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 CART임).
실시형태에서, L1은 ―CH2-O-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이다.
실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00075
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00076
;
(식 중, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고; LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
[0365] 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 다른 실시형태에서, 고리 A는 페닐 또는 나프탈렌일이다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00077
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00078
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00079
, (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 CART임).
실시형태에서, z5는 1 내지 3의 정수이다. 실시형태에서, z5는 1 또는 3이다. 실시형태에서, z5는 1이다. 실시형태에서, z5는 3이다. 실시형태에서, R2A는 수소이다. 실시형태에서, L2는 결합이다.
실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00080
(IV), (식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 50의 범의의 정수이다. 실시형태에서, n은 7이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00081
(식 중, n2는 1 내지 100의 정수이고; R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, LP1은 화학식을 갖는다:
Figure pct00082
(식 중, n21은 0 내지 100의 정수이고; R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일이다.
실시형태에서, LP2는 화학식을 갖는다:
Figure pct00083
(식 중, n22는 1 내지 100의 정수이고; R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일이다.
실시형태에서, 세포는 진핵 세포이다. 실시형태에서, 세포는 포유동물 또는 인간 세포이다. 실시형태에서, 세포는 유기체의 부분을 형성한다. 실시형태에서, 유기체는 인간이다. 실시형태에서, 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포이다. 실시형태에서, 세포는 T 세포이다. 실시형태에서, 세포는 골수성 세포이다.
일 양태에서, 양이온성 양친매성 중합체가 제공된다. 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00084
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고; CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고; IM은 pH-감응성 희생 도메인이고; z5는 1 내지 10의 정수이고; z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고, z2는 2 내지 100의 정수임). 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 실시형태에서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴이다. 다른 실시형태에서, 고리 A는 페닐 또는 나프탈렌일이다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00085
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00086
. 실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00087
,
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 본 명세서에 정의된 바와 같은 CART임).
실시형태에서, z5는 1 내지 3의 정수이다. 실시형태에서, z5는 1 또는 3이다. 실시형태에서, z5는 1이다. 실시형태에서, z5는 3이다. 실시형태에서, R2A는 수소이다. 실시형태에서, L2는 결합이다.
실시형태에서, pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00088
(IV), (식 중, n은 2 이상의 정수임). 실시형태에서, n은 2 내지 50의 범의의 정수이다. 실시형태에서, n은 7이다.
실시형태에서, 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00089
,
(식 중, n2는 1 내지 100의 정수이고; R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, LP1은 화학식을 갖는다:
Figure pct00090
, (식 중, n21은 1 내지 100의 정수이고;
R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태에서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일이다. 실시형태에서, 비치환된 C18 알켄일은 올레일이다.
실시형태에서, LP2는 화학식을 갖는다:
Figure pct00091
, (식 중, n22는 1 내지 100의 정수이고;
R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임). 실시형태에서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일이다. 실시형태에서, 비치환된 C9 알켄일은 노넨일이다.
실시형태에서, 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00092
,
(식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
일 양태에서, 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 대상체에게 화합물에 결합하는 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 화합물은 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시킨다. 본 명세서에서 지칭되는 "수용체 단백질"은 표면 상의 세포에 의해서 발현되고, 리간드에 결합할 수 있는 단백질이다. 수용체 단백질의 비제한적인 예는 키메라 항원 수용체, T 세포 수용체, B 세포 수용체, 성장 인자 수용체 및 시토카인 수용체이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 키메라 항원 수용체이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 T 세포 수용체이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항체이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-IL10이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-PD1이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-PDL1이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-TGF베타이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-TNF 알파이다. 실시형태에서, 수용체 단백질은 항-IL-6이다.
일 양태에서, 대상체에서 분비 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 대상체에게 화합물에 결합하는 분비 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 화합물은 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 분비 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시킨다. 본 명세서에서 지칭되는 "분비 단백질"은 세포에 의해서 세포외 환경에 분비되는 단백질이다. 분비 단백질의 비제한적인 예는 성장 인자 또는 시토카인을 포함한다. 실시형태에서, 분비 단백질은 인터류킨이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-12이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-15이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-18이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-3이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-21이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-7이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-9이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IFNg이다. 실시형태에서, 분비 단백질은 IL-1R 길항제이다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 T 세포 수용체(TCR)을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 대상체에게 화합물에 결합하는 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 화합물은 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 TCR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시킨다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 키메라 항원 수용체(CAR)을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법이 제공된다. 대상체에게 화합물에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 CAR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시킨다.
실시형태에서, 세포 수용체는 T 세포 수용체(TCR)이다. 실시형태에서, 세포 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)이다. 실시형태에서, CAR은 루이스(Lewis) Y 항원 CAR(즉, 루이스 Y 항원에 결합하는 키메라 항원 수용체)이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD44v6 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-NKG2D 리간드 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-폴레이트 수용체 베타 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD38 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD20 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD22 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-FLT3 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD7 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD33 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD123 CAR이다. 실시형태에서, CAR은 항-CLEC12A CAR이다.
실시형태에서, 화합물은 양이온성 양친매성 중합체 화합물이다. 실시형태에서, 화합물은 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 화합물이다. 실시형태에서, 핵산은 mRNA이다. 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 실시형태에서, CAR은 항-CD19 CAR이다. 실시형태에서, 핵산은 효과기 향상 단백질을 추가로 암호화한다. 효과기 향상 단백질은 본 명세서에 제공된 바와 같은 단백질 또는 수용체 단백질(예를 들어, IL-12, 항-PD1)일 수 있다. 실시형태에서, 핵산은 복수의 핵산이다. 본 명세서에 제공된 핵산이 복수의 핵산인 경우, 본 명세서에 제공된 복합체는 실시형태를 포함하는 본 명세서에 제공된 화합물에 결합된 1종 초과의 핵산(2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 그 초과)을 포함할 수 있다. 실시형태에서, 핵산은 다시스트론성(polycistronic) 핵산이다.
실시형태에서, 세포는 골수성 세포 또는 림프계 세포이다. 실시형태에서, 세포는 골수성 세포이다. 실시형태에서, 세포는 림프계 세포이다. 실시형태에서, 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포이다. 실시형태에서, 세포는 T 세포이다. 실시형태에서, 세포는 B 세포이다. 실시형태에서, 세포는 자연 살해 세포이다. 실시형태에서, 세포는 대식세포, 호산구 또는 호중구이다. 실시형태에서, 세포는 대식세포이다. 실시형태에서, 세포는 호산구이다. 실시형태에서, 세포는 호중구이다. 실시형태에서, 투여는 정맥내, 피하 또는 종양내이다. 실시형태에서, 투여는 정맥내이다. 실시형태에서, 투여는 피하이다. 실시형태에서, 투여는 종양내이다.
실시예
실시예 1:
일반적인 방법 및 실험
물질
시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, 달리 제시되지 않는 한 제공된 그대로 사용하였다. 1-(3,5-비스-트리플루오로메틸-페닐)-3-시클로헥실-티오우레아(문헌[Macromolecules 39(23):7863―7871]), MTC-구아니딘 단량체(문헌[J Am Chem Soc 131(45):16401―16403]), MTC-도데실 단량체(문헌[Proc Natl Acad Sci 109(33):13171―13176]), MTC-피페리딘 단량체(문헌[Chem Commun (1):114―116]), N-Boc 모르폴리논 단량체(문헌[J Am Chem Soc 136(26):9252―9255]), 및 단실 알코올(문헌[J Am Chem Soc 131(45):16401―16403])은 모두 문헌 절차에 따라서 제조하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 상업적 용매 및 시약은 추가 정제 없이 사용하였다. 메틸렌 클로라이드(CH2Cl2) 및 테트라히드로푸란(THF)을 질소 압력을 사용하여 알루미나 건조 컬럼(Solv-tek Inc.)에 통과시켰다. 석유 에테르, 펜탄, 헥산, 에틸 아세테이트(EtOAc) 및 메탄올(MeOH)은 Fisher Scientific에서 구입하였다. 중수소화된 용매는 Cambridge Isotope Laboratories에서 구입하였다. 재생 셀룰로스 투석막(Spectra/Por® 6 Standard RC; MWCO 1000)은 Spectrum Laboratories, Inc.에서 구입하였다.
mRNA
하기 모든 예에서, eGFP mRNA(5meC, Ψ, L-6101), Fluc mRNA(5meC, Ψ, L-6107), OVA mRNA(5meC, Ψ, L-7210) 및 Cy5-eGFP mRNA(5meC, Ψ, L-6402)는 TriLink BioTechnologies Inc에서 구입하였다.
계측
입자 크기는 Malvern Zetasizer Nano ZS90에서 동적 광산란에 의해 측정하였다. BD LSRII FACS 분석기(Stanford University Shared FACS Facility)에서 유세포 분석법 분석을 수행하였다. 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 40x HC PL APO, CS2 오일 대물 렌즈(Stanford University Cell Sciences Imaging Facility)가 있는 Leica SP8 White Light Confocal 현미경을 사용하여 수행하였다. CCD(charge-coupled device) 카메라(IVIS 100, Xenogen Corp., 미국 캘리포니아주 알라메다 소재)를 사용하여 생물 발광을 측정하고 Living Image Software(Perkin-Elmer)를 사용하여 분석하였다. X-Cite 120Q 광시야 여기 광원 및 GFP 필터 세트를 사용하여 Zeiss Axio Observer.Z1에서 Epi형광 현미경을 수행하였다. CoolSNAP HQ2 카메라로 영상을 수집하고 영상 분석을 위해 컴퓨터로 전송하였다.
세포주
HeLa, J774, HepG2 및 HEK-293 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토 마이신이 보충된 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)에서 유지시켰다. CHO 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 F12 배지에서 유지시켰다. 모든 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 대략 80% 컨플루언스로 계대시켰다.
중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell: MSC)는 문헌[Huang et al (J. Orthopaedic Trans. 3(1):26-33)]의 방법에 따라 준비하였다. 간략하면, 8주령의 암컷 CD1 마우스 2마리에서 대퇴골을 절제하고 뼈 바깥 쪽에서 조직을 제거하였다. 그런 다음 뼈의 끝을 멸균 가위로 절단하였다. 10 cm 조직 배양 처리된 페트리 접시에서 3 mL 주사기 및 25 g 바늘을 사용하여 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 DMEM 10% 소 태아 혈청으로 4개의 뼈에서 골수를 플러싱하였다. 골수를 피펫팅 의해 파괴하고, 분산시켰지만, 여과하거나, 달리 조작하지 않았다. 접시를 6일 동안 인큐베이션시킨 후 특징적인 단층이 형성되었다. 배양물을 PBS로 2회 세척하고 37℃에서 5분 동안 0.25% 트립신(Gibco)으로 트립신처리하였다. 그 후, 세포를 수거하여 75 cm2 조직 배양 플라스크로 옮기고, 90% 컨플루언스가 달성될 때까지 3일 동안 인큐베이션시켰다. 배양물을 2 초과의 계대 동안 유지시킬 수 있었지만, 성장은 4 계대 시에 상당히 감소되었다. 형질 감염을 위해, 세포를 24-웰 플레이트에서 웰당 1.2 x 104개로 플레이팅하였다.
실시예 2:
단량체의 합성
일부 실시예에서, 다양한 양이온성 희생 도메인의 CART를 새로운 락톤 또는 카르보네이트 단량체로부터 생성시켰다. 전구체 및 단량체의 합성의 예를 기재한다:
실시예 2.1. tert-부틸 2-옥소모르폴린-4-카르복실레이트(N-Boc 모르폴리논)의 합성:
이들 실시예에서, N-Boc 모르폴리논 단량체의 합성을 문헌[Chung, et al. J. Am. Chem. Soc., 2013, 135 (20), 7593―7602]으로부터 개작하였다.
Figure pct00093
tert-부틸 2-옥소모르폴린-4-카르복실레이트의 합성 : 2.086 g(10.2 mmol) tert-부틸 비스(2-히드록시에틸)카르바메이트를 75 mL CH3CN에 용해시키고, 5분 동안 산소로 버블링하였다. 398 mg(0.38 mmol)의 [(네오쿠프로인)Pd(OAc)]2(OTf)2를 첨가하였고, 암적색 용액이 형성되었다. 반응물을 60℃에서 오일조에 넣고, 산소를 반응 혼합물에 버블링하고, TLC(1:1 헥산:EtOAc)로 모니터링하였다. 24시간 후, 263 mg(0.25 mmol)의 [(네오)Pd(OTf)(Ac)]2를 반응에 첨가하였다. 48시간 후 추가의 426 mg(0.41 mmol)의 [(네오쿠프로인)Pd(OAc)]2(OTf)2를 반응에 첨가하였다. 총 72시간 후 산소 유동을 중단하고, 반응물을 실온까지 냉각시켰다. 반응 혼합물을 5 내지 10 mL로 농축하여, 흑색 비점성 혼합물이 형성되었고, 1:1 헥산:EtOAc로 용리하는 SiO2의 플러그 상에 로딩하였다. 농축은 1.766 g의 황색 오일(8.78 mmol, 86.4%)을 제공하였고, 이것은 정치 시 고화되었다. 이러한 조 생성물을 10 mL Et2O에 용해시키고, 그 다음 20 mL 헥산을 첨가하고, -30℃에서 밤새 저장하였다. 침전물을 여과에 의해 수집하고, 펜탄으로 세척하여 1.54 g의 백색 분말을 제공하였다(7.67 mmol, 76% 수율). 1 H NMR (500 MHz, CDCl3): δ 4.41 (br, 2 H), 4.26 (s, 2 H), 3.66 (t, 2H), 1.47 (s, 9H). 13C NMR (125 MHz, CD3Cl): δ 28.24, 40.63, 45.49, 67.19, 81.33, 153.49, 166.63. HRMS (m/z): 에 대한 M+ 계산치 C9H15NO4Na, 224.0893; 실측치, 224.0896.
실시예 2.2. tert-부틸 7-옥소-1,4-옥사제판-4-카르복실레이트(7-lact)의 합성:
Figure pct00094
화염 건조된 플라스크에 tert-부틸 4-옥소피페리딘-1-카르복실레이트(205.8 mg, 1.03 mmol) 및 DCM(10 mL)을 넣고, 이어서 0℃에서 15분 동안 교반하였다. DCM(5 mL) 중의 mCPBA(600.1 mg, 2.9 mmol)를 2개의 분획으로 첨가하고, 이어서 실온까지 가온시켰다. 18시간 후 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 포화 NaCHO3(20 mL x 3)로 세척하고, 이어서 Na2SO4로 건조하고, 여과하였다. 감압 하에서의 용매의 제거는 317.0 mg의 백색 고체를 제공하였다. 9:1 DCM: EtOAc로 용리하는 실리카겔 크로마토그래피를 수행하였다. 관련 분획의 농축은 151.0 mg(0.71 mmol, 68.9% 수율)의 백색 고체를 제공하였다. 1H NMR (500 MHz, CD3Cl): δ 4.21 (s, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.65 (s, 2H), 2.81 (s, 2H), 1.46 (s, 9H). 13C NMR (101 MHz, CD3Cl): δ 173.9, 154.4, 81.1, 69.5, 47.3, 41.3, 37.6, 28.4
실시예 2.3. tert-부틸 (2-(비스(2-히드록시에틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트의 합성.
Figure pct00095
화염 건조된 플라스크에 디에탄올아민(225 mg, 2.15 mmol) 및 메틸 (tert-부톡시카르보닐)글리신에이트(370 mg, 1.95 mmol)을 넣고, 75℃에서 가열 욕조에서 교반하였다. 18시간 후 반응물을 아세톤으로 용리하는 실리카 플러그를 통해서 전개시켰다. 용매를 감압 하에서 제거하여 505.1 mg의 연황색 오일을 수득하였다(1.93 mmol, 99% 수율). 1H NMR (500 MHz, CD3Cl): δ 5.7-5.6 (br, 1H), 3.99 (d, 2H), 3.78-3.65 (m, 4H), 3.53-3.35 (m, 4H), 3.05 (br, 1H). 13C NMR (101 MHz, CD3Cl): δ 170.4, 156.3, 79.9, 60.0, 51.1, 42.4, 28.3
실시예 2.4. tert-부틸 (2-옥소-2-(2-옥소모르폴리노)에틸)카르바메이트(글리신 단량체)의 합성:
Figure pct00096
화염 건조된 플라스크에 디올(450 mg, 1.72 mmol) 및 아세토니트릴(12 mL)을 첨가하고, 이어서 공기로 5분 동안 버블링하였다. Pd(Neo)OAc(84.1 mg, 0.16 mmol, 9.4 mol%)를 반응에 첨가하고, 50℃에서 일정한 공기 유동 하에서 교반하였다. 18시간 후 반응물을 농축하고, EtOAc(30 mL)로 배산처리하고, 이어서 여과하여 220 mg의 거품같은 오렌지색 잔류물을 수득하였다. 100% EtOAc로 용리하는 실리카겔 크로마토그래피를 수행하였다. 관련 분획의 농축은 53.1 mg(0.205 mmol, 12% 수율)의 투명한 오일을 제공하였고, 이것은 정치 시 고화되었다. 1H NMR (500 MHz, CD3Cl): δ 5.45-5.3 (br, 1 H), 4.5-4.45 (q, 2H), 4.28-4.4 (d, 2H), 4.0-3.93 (dd, 2H), 3.85-3.7 (dt, 2H), 1.45 (s, 9H) 13C NMR (125 MHz, CD3Cl): δ 167.7, 166.1, 164.8, 155.8, 80.2, 66.9, 65.9, 45.8, 44.1, 42.4, 41.2, 39.3, 28.3, 15.316
실시예 2.5. 7-Gly(케톤)의 합성:
Figure pct00097
10 mL THF 중의 히드록시벤조트리아졸(600 mg, 4.4 mmol), EDC-HCl(453 mg, 2.9 mmol), (tert-부톡시카르보닐)글리신(520 mg)을 넣은 플라스크에, TEA(500 uL)를 첨가하고, 20분 동안 교반하였다. 10:1 혼합물의 THF:H2O(총 11 ml) 중의 4-피페리디논-HCl-일수화물(462 mg, 3.0 mmol)의 용액을 한 번에 첨가하였다. 반응물을 밤새 교반하였다. 반응물을 감압 하에서 농축하고, 이어서 15 mL EtOAc에 취하고, H2O(10 mL) 중의 AcOH(500 uL)로 세척하고, 수성상을 15 mL EtOAc로 추출하였다. 이어서 합한 유기층을 NaHCO3(2x 20 mL) 및 염수(1x 20 mL)로 세척하고, 이어서 MgSO4로 건조하였다. 감압 하에서의 농축은 375 mg의 백색 결정질 분말(50% 수율)을 제공하였고, 이것을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.
실시예 2.6. 7-Gly 단량체의 합성:
Figure pct00098
7-Gly 단량체: N-글리신일(Boc) 4-피페리디논(28 mg, 0.11 mmol)이 있는 플라스크에, 5 mL DCM 중의 mCPBA(60 mg, 0.35 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 2 mL DCM 중의 또 다른 부분의 mCPBA(20 mg, 0.12 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 반응물을 감압 하에서 농축하고, 이어서 10 mL EtOAc에 취하고, NaHCO(4x 10 mL)로 세척하고, MgSO4로 건조하였다. 조 생성물을 9:1 EtOAc:DCM 용매 시스템을 사용하여 SiO2 크로마토그래피로 정제하였다. 감압 하에서 관련 분획의 농축은 21 mg의 생성물을 수득하였다(71% 수율).
실시예 2.7. 8원 카르보네이트 기반 단량체의 합성:
Figure pct00099
8원 카르보네이트 기반 단량체: 본 실시예는 문헌[J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 13851―13860]에 보고된 절차를 통해서 제조하였다.
실시예 2.8. Tert-부틸 (2-옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)카르바메이트(Mglut)의 합성
Figure pct00100
Tert-부틸 (2-옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)카르바메이트(Mglut)의 합성: 1.078 g(4.9 mmol)의 (S)-(―)-2-(Boc-아미노)-1,5-펜탄디올을 10 ml의 CH3CN(0.49 M)에 용해시키고, 5분 동안 공기로 버블링하였다. 0.233 g(0.45 mmol)의 [(네오)Pd(OTf)(OAc)]2를 첨가하였고, 투명한 용액이 오렌지색으로 변했고, 이것은 흑색으로 어두워졌다. 반응물을 45℃에서 오일조에 넣고, 공기를 반응 혼합물에 버블링하였다. 반응물을 1H NMR로 모니터링하였고, 5.1 ppm에서 락톨 피크의 사라짐을 찾았다. 44시간에 걸쳐서, 총 0.310 g(0.6 mmol, 12 mol%)의 [(네오)Pd(OTf)(OAc)]2를 반응 진행에 기초하여 나누어 반응에 첨가하였다. 44시간에, 1H NMR이 반응이 완결되었음을 나타내었다. 공기 유동을 중단하고, 반응물을 실온까지 냉각시켰다. 반응 혼합물을 농축하고, 잔류물을 50 mL EtOAc에 취하고, 초음파처리하고, 셀라이트 플러그로 여과하고, 이어서 농축하여, 0.940 g의 분홍-오렌지색 오일을 얻었고, 이것은 정치 시 고화되었다. 4:1 DCM:EtOAc로 용리하는 실리카겔 크로마토그래피를 수행하였다. 관련 분획의 농축은 0.480 g(2.23 mmol)의 백색 고체(46% 수율)를 제공하였다. 스펙트럼 데이터는 이전 기록과 일관된다. 문헌[Xie, X. and Stahl, S.S. J. Am. Chem. Soc., 2015, 137 (11): 3767―3770]
실시예 2.9. 포스포에스테르-기반 단량체의 합성
Figure pct00101
포스포에스테르-기반 단량체: 일부 실시예는 포스페이트 또는 포스포에스테르-기반 양이온성 희생 도메인의 합성을 포함한다. 이의 일 실시예에서, 필요한 단량체를 이전 문헌 절차(문헌[McKinlay, C. J. et. al. J. Am. Chem. Soc. 2016, 138 (10), 3510―3517], 국제공개 제WO2017083637 A1호)에 따라서 합성하였다. 간략하면, (실시예 2-(6-비스-boc 구아니디노 헥실옥시)-1,3,2-디옥사포스포란-2-옥시드의 경우): 2-클로로-1,3,2-디옥사포스포란-2-옥시드(797 mg, 5.59 mmol, 1.25 eq.)를 불활성 N2 분위기(글러브 박스) 하에서 쉬링크 플라스크에서 칭량하였다. 이것을 질소 하의 얼음에 넣고, THF(75 mL)를 첨가하였다. 별개의 바이알에서, 구안 헥산올(7.16 g, 20.0 mmol, 1 eq.)을 THF(10 mL)에 용해시키고, 트리에틸아민(2.8 mL, 20 mmol, 1 eq)을 첨가하였다. 바이알 내용물을 시린지를 통해서 쉬링크 플라스크에 10분에 걸쳐 적가하고, 20시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 생성물을 Celite® 패드 상에서 여과하였다. 조 생성물을 소량(5 mL)의 THF에 용해시키고, 20 mL 무수 펜탄으로 배산처리하였다. 생성물을 -55℃ 동결기에서 밤새 오일링(oiling)하였다. 펜탄층을 제거하고, 진공 하에서 10시간 동안 건조하여 순수한 생성물을 약간 황색 오일로서 제공하였다(79% 수율). 이 단량체를 합성하였고, 하기 표준 절차에 따라서 탈보호시켰다.
실시예 3.
CART의 중합
일반 절차
톨루엔 중의 단량체 및 개시제의 용액에 DBU:TU 공촉매 시스템의 용액에 첨가하였다. 반응을 2시간 동안 교반하고, 이어서 희생 도메인을 갖는 단량체를 고체로서 첨가하고, 이어서 2시간 동안 교반한다. 반응을 아세트산(또는 벤조산)을 반응정지시키고, 이어서 MeOH에 대해서 DCM 중에서 투석한다. 투석 후, 감압 하에서의 용매의 제거는 순수한 올리고머를 산출한다. 이어서 올리고머를 TFA/DCM 또는 HCl/Et2O를 사용하여 탈보호시켜 양친매성 CART를 제공한다. CART를 DMSO 중의 2.0 mM에 희석하고, 이어서 추가로 정제하지 않고 형질 주입 연구에 사용한다.
Figure pct00102
TFA/DCM 또는 HCl Et2O의 사용을 포함하는 탈보호
TFA 탈보호의 실시예: 1.0 mL 무수 DCM에 용해된 10.5 mg의 올리고머에 100 uL TFA를 첨가한다. 반응을 8시간 동안 교반한다. 용매를 감압 하에서 제거하여 10.3 mg의 CART(TFA 염)을 잔류물로서 수득하였다.
HCl 탈보호의 예: 15 mg의 보호된 CART에 Et2O 중의 2.0 M HCl을 2개의 분획(총 2 mL)으로 첨가한다. 반응물을 18시간 동안 교반하고, 이어서 감압 하에서 농축하여 12.1 mg의 CART(HCl 염)를 잔류물로서 수득하였다.
개시제의 예: 일작용성 알코올(즉, 벤질 알코올, 1-피렌부탄올) PEG, 형광 염료(단실, BHQ, BDK), 다작용성 알코올(트리스 벤질 알코올, PEG 디올), 표적화 리간드(Biotin, Folate) 및 접합 리간드(Biotin).
모 모르폴리논 기반 cart를 문헌 보고(문헌[McKinlay, et al. PNAS, 2017, E448-E456])에 기재된 것으로부터 개작하였다.
Figure pct00103
코-올리고머s Dn:Am의 제조. D13:A11의 대표적인 합성:
화염 건조된 바이알에 MTC-도데실 단량체 5(33.2 mg, 0.1 mmol), 단실 개시제 3(3.9 mg, 0.013 mmol) 및 50 μL CH2Cl2를 넣었다. 50 μL CH2Cl2 중의 디아자바이시클로운데센(DBU)(0.8 mg, 0.005 mmol) 및 티오우레아 촉매(TU)(2.0 mg, 0.005 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후, N-Boc 단량체(22.3 mg, 0.11 mmol)를 고체로서 바이알에 첨가하고, 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 총 5시간 후, 반응물을 5방울의 AcOH로 반응정지시키고, 감압 하에서 농축하였다. 조 물질을 CH2Cl2 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0-kDa 투석 백). 농축은 37.9 mg의 연녹색 잔류물을 제공하였다. 1 H NMR에 의한 말단 기 분석(2.8 ppm)은 DP 13:11을 나타낸다.
0.8 mL 무수 DCM에 용해된 23.5 mg의 올리고머에 20 uL TFA를 첨가한다. 반응을 18시간 동안 교반한다. 용매를 감압 하에서 제거하여 23.1 mg의 CART를 잔류물로서 수득하였다.
aCl-기반 CART
다양한 양이온성 희생 도메인의 CART의 예는 다음과 같다:
Figure pct00104
화염 건조된 바이알에 도데실-MTC(33.0 mg, 0.1 mmol) 및 1-피렌 부탄올(2.3 mg, 0.0083 mmol) 및 50 μL 톨루엔을 넣었다. 50 μL 톨루엔 중의 DBU(0.76 mg, 0.005 mmol) 및 TU(1.85 mg, 0.005 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후 7-lact(실시예 1.2)(21.5 mg, 0.1 mmol)를 고체로 첨가하고, 반응물을 교반하였다. 추가 2시간의 교반 후 반응물을 1방울의 아세트산으로 반응정지시켰다. 조 물질을 DCM 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0 kDa 투석 백). 감압 하에서의 농축은 41 mg(76% 수율)을 제공하였다.
1.0 mL 무수 DCM에 용해된 10.5 mg의 올리고머에 100 uL TFA를 첨가한다. 반응을 8시간 동안 교반한다. 용매를 감압 하에서 제거하여 10.3 mg의 CART를 잔류물로서 수득하였다.
6-Gly-기반 CART
Figure pct00105
화염 건조된 바이알에 도데실-MTC(32.8 mg, 0.1 mmol) 및 1-피렌 부탄올(2.3 mg, 0.0083 mmol) 및 50 μL DCM을 넣었다. 50 μL DCM 중의 DBU(0.76 mg, 0.005 mmol) 및 TU(1.85 mg, 0.005 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후 tert-부틸 (2-옥소-2-(2-옥소모르폴리노)에틸)카르바메이트(36 mg, 0.14 mmol)를 고체로 첨가하고, 반응물을 교반하였다. 추가 2시간의 교반 후 반응물을 1방울의 아세트산으로 반응정지시켰다. 조 물질을 DCM 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0 kDa 투석 백). 감압 하에서의 농축은 47 mg(68 % 수율)을 제공하였다.
1.0 mL 무수 DCM에 용해된 11.1 mg의 올리고머에 100 uL TFA를 첨가한다. 반응을 8시간 동안 교반한다. 용매를 감압 하에서 제거하여 11 mg의 CART를 잔류물로서 수득하였다.
7-Gly-기반 CART
Figure pct00106
화염 건조된 바이알에 도데실-MTC(32.2 mg, 0.1 mmol) 및 벤질 알코올(0.9 mg, 0.0083 mmol) 및 50 μL 톨루엔을 넣었다. 50 μL 톨루엔 중의 DBU(0.76 mg, 0.005 mmol) 및 TU(1.85 mg, 0.005 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후 tert-부틸(2-옥소-2-(7-옥소-1,4-옥사제판-4-일)에틸)카르바메이트(32.1 mg, 0.1 mmol)를 고체로 첨가하고, 반응물을 교반하였다. 추가 2시간의 교반 후 반응물을 1방울의 아세트산으로 반응정지시켰다. 조 물질을 DCM 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0 kDa 투석 백). 감압 하에서의 농축은 49 mg(77 % 수율)을 제공하였다.
2.0 mL 무수 DCM에 용해된 21 mg 올리고머에 200 uL TFA를 첨가하였다. 반응을 8시간 동안 교반한다. 용매를 감압 하에서 제거하여 21.3 mg의 CART를 투명한 황색 잔류물로서 수득하였다.
Carb-기반 CART
Figure pct00107
화염 건조된 바이알에 도데실-MTC(33.1 mg, 0.1 mmol) 및 5-(디메틸아미노)-N-(2-히드록시에틸)나프탈렌-1-설폰아미드(단실 알코올)(2.8 mg, 0.0083 mmol) 및 50 DCM을 넣었다. 50 μL DCM 중의 DBU(0.76 mg, 0.005 mmol) 및 TU(1.85 mg, 0.005 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후 8-carb(23.2 mg, 0.1 mmol)를 고체로 첨가하였다. 추가 2시간의 교반 후 반응물을 1방울의 아세트산으로 반응정지시켰다. 조 물질을 DCM 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0 kDa 투석 백). 감압 하에서의 농축은 54.1 mg(96% 수율)을 제공하였다.
1.0 mL 무수 DCM에 용해된 12 mg의 올리고머에 100 uL TFA를 첨가한다. 반응을 9시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여 12 mg의 CART를 잔류물로서 수득하였다.
Glu-기반 CART
Figure pct00108
화염 건조된 바이알에 도데실-MTC(15.5 mg, 0.05 mmol) 및 벤질 알코올(0.5 mg, 0.004 mmol) 및 50 DCM을 넣었다. 50 μL DCM 중의 DBU(0.4 mg, 0.0025 mmol) 및 TU(0.9 mg, 0.0025 mmol)를 반응 바이알에 첨가하고, 교반하였다. 2시간 후 tert-부틸 (2-옥소테트라하이드로-2H-피란-3-일)카르바메이트(MGlut)(18.1 mg, 0.084 mmol)를 고체로서 첨가하였다. 추가 2시간의 교반 후 반응물을 1방울의 아세트산으로 반응정지시켰다. 조 물질을 DCM 중에서 MeOH에 대해서 투석하였다(1.0 kDa 투석 백). 감압 하에서의 농축은 17.9 mg(51% 수율)을 제공하였다.
1.0 mL 무수 DCM에 용해된 9.0 mg의 올리고머에 100 uL TFA를 첨가한다. 반응을 9시간 동안 교반하였다. 용매를 감압 하에서 제거하여 9.0 mg의 CART를 잔류물로서 수득하였다.
이들 방법을 통해서 합성된 CART의 추가 예는 하기 표에 상세하게 기재한다:
Figure pct00109
실시예 4:
CART/핵산 복합체
일부 실시예에서, 5.71 μL의 RNAse-무함유 PBS(1 N HCl을 사용하여 pH 5.5로 조정됨) 및 eGFP mRNA(PBS 중의 0.2 μg/μL 스톡 pH 7.4)를 0.59 μL의 CART(DMSO 중의 2 mM 스톡)와 혼합하여 10:1 +/- CART/mRNA 비를 달성함으로써 CART/mRNA 폴리플렉스를 제조하였다. 이들 CART/mRNA 복합체를 처리 또는 분석 전에 20초 동안 실온에서 인큐베이션시켰다.
비교예에서, 상응하는 양의 다른 CART를 사용하여 동일한 10:1 +/- 전하 비로 동일하게 만들었다.
입자 크기 및 제타 전위의 DLS 특징규명
특정 예는, 동적 광산란(DLS)을 사용하여 CART D13:A11 및 그것과 eGFP mRNA 사이에 형성된 고분자전해질 복합체를 분석할 수 있음을 입증한다. pH 5.5에서 생성된 폴리플렉스의 유체역학적 직경은 254 ± 10 nm였다. 이러한 폴리플렉스를 세포 배지에 첨가한 경우, 유체역학적 직경이 2시간에 걸쳐 254 nm에서 512 nm로 변화되었다.
CART/mRNA 복합체를 비완충수에 첨가한 경우, 크기는 전체 2시간 실험에 걸쳐 257±24 nm로 유지된다.
제타 전위 측정은 입자 크기 데이터와 일치하며, 표면 전하는 + 33 ± 7 mV에서 시작하여 2시간에 걸쳐 ― 30 ± 3 mV로 변화된다. 이것은 중성 아미드로 재배열되는 양이온성 암모늄과 일치하며, 회합된 올리고뉴클레오티드로 인해 표면이 주로 음이온성으로 남아있다. 이론에 얽매이지 않지만, 단독올리고머(분) 및 mRNA 폴리플렉스(시간)에 대한 재 배열 속도의 차이는 완충 수성 환경에서 α- 아미노 에스테르 물질의 안정성의 복합체화-의존적 증가를 반영하는 것으로 보인다. 이는 CART/mRNA 복합체가 세포내 분해 이전에 pH 7.4에서 치료 관련 시간 척도에 걸쳐 안정적으로 유지될 수 있게 한다.
비교예로서, 비-희생 수송체 D13:G12(도 7b)로 복합체를 형성한 경우, 입자가 250 nm의 크기 정도로 형성되었다. 그러나, 이러한 입자의 크기와 제타 전위는 시간의 함수로 변하지 않았으며, 이는 분해가 일어나지 않았음을 나타낸다.
비교예로서, 제형화된 폴리플렉스의 크기는 카고-의존적이지 않았다. eGFP 길이의 대략 2배(Fluc = 1929 nt vs. eGFP = 996 nt)인 루시퍼라제(Fluc) mRNA로 폴리플렉스를 형성하고, pH 7.4에서 세포 배지에 첨가한 경우, 폴리플렉스는 eGFP mRNA로 형성된 것과 동일한 거동을 나타내었는데, 이는 CART-가능한 전달이 다양한 mRNA 크기에서 일반적인 작동할 수 있음을 시사한다.
구체적으로 이러한 예의 경우, mRNA/코-올리고머 복합체를 500 ng eGFP mRNA를 사용하여 상기와 같이 10:1(양이온:음이온) 전하 비율로 제조하였고, 120 μL RNase-무함유 PBS pH 5.5, 7.4 또는 중성 RNAse-무함유 수에 첨가하였다. 용액을 즉시 일회용 투명 플라스틱 큐벳으로 옮기고, 크기를 측정하였다. 크기 측정은 초기 시간(1분) 및 2시간 동안 15분 간격으로 수행하였다. 보고된 크기는 z-평균이다. 제타 전위 측정은 DLS 용으로 제형화된 mRNA:코-올리고머 복합체를 800 μL 물로 희석하고, 제타 세포(DTS1060)로 전달하고, 제타 전위를 측정하여 수행하였다. 보고된 모든 값은 최소 3개의 시험 실시의 평균이다. 오류는 ± SD로 나타낸다. 일부 다른 실시예에서, 양이온과 음이온 간의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, at 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:30 또는 그 초과일 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 음이온과 양이온 간의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9, 약 1:10, at 약 1:11, 약 1:12, 약 1:13, 약 1:14, 약 1:15, 약 1:16, 약 1:17, 약 1:18, 약 1:19, 약 1:20, 약 1:30 또는 그 초과일 수 있다.
실시예 5:
CART에 의한 mRNA 전달 [0460] 다수의 세포주에서 eGFP mRNA 전달 및 발현
일부 실시예에서, CART, D13:A11은 HeLa 세포에서 99% 초과의 형질주입 효율 및 높은 평균 형광 강도로 우수한 eGFP 발현을 제공하였다. (도 9a, 도 9b, 도 9d)
예를 들어, CART, D13:A11에 의한 형질주입 시, HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포로 시딩하고 밤새 부착되도록 두었다. RNAse-무함유 PBS pH 5.5 및 eGFP mRNA를 DMSO 스톡 용액으로부터의 다양한 양의 올리고머와 혼합하여 특정 코-올리고머/mRNA 비율(10:1의 이론적 양이온:음이온 비율까지 최적화됨, 총 부피 8.4 μL)을 달성함으로써 올리고머/mRNA 폴리플렉스를 제조하였다. 복합체를 처리 전에 20초 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. Lipofectamine™ 2000 대조군은 제조사의 지침에 따라 OptiMEM에서 준비하였다. 세포를 무혈청 DMEM으로 세척하고, mRNA/Lipo 용액을 최종 부피 200 μL/웰 및 125 ng mRNA/웰로 첨가하였다. 무혈청 DMEM으로 세척한 후, 125 ng/웰의 최종 mRNA 농도를 위해서, 2.5 μL의 mRNA/코-올리고머 복합체를 총 부피 200 μL로 첨가하였고, 모든 조건을 3회 반복하였다. 세포를 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 트립신-EDTA(0.05%)로 트립신처리하였다. 혈청-함유 DMEM을 첨가하고, 각각의 웰의 내용물을 원심분리하고, 상청액을 제거하고, 펠릿화된 세포를 PBS(125 μL)에 재분산하고 FACS 튜브로 옮기고, 유세포 분석법 분석기(LSR-II.UV, 스탠포드 대학교)에서 판독하였다. 제시된 데이터(도 9)는 분석된 10,000개 세포의 기하 평균 형광 신호이다. 형질주입 효율을 위해, 미처리 세포를 eGFP 발현이 없는지에 대해 게이팅하였고, 제시된 데이터는 미처리 세포보다 더 높은 eGFP 발현으로 분석된 10,000개 세포의 비율이다. 오류는 ± SD로 나타낸다. 주석: 모든 다른 세포주를 각각의 배지에서 상기와 같이 사용하였다. HepG2 세포의 경우, 유세포 분석법을 위해 세포 펠릿을 재현탁하는 데 사용되는 PBS에 5 mM EDTA를 첨가하였다.
더 긴 블록 길이의 제2 CART(D18:A17)는 높은 형질주입 효율(90% 초과)을 제공하였지만, 평균 형질감염 값은 더 낮았다(도 9a). 비교예에서, α-아미노 에스테르 단독-올리고머 A13으로 형성된 복합체는 eGFP 발현을 유도하지 않았는데, 이는 올리고뉴클레오티드 전달을 위해 소수성 도메인이 필요함을 나타내었다. 추가 비교예로서, HeLa 세포를 Lipofectamine으로 제형화된 mRNA로 처리한 경우, 적당한 수준의 eGFP 발현 만이 관찰되었고, 세포의 약 50%만 형광을 나타내었다.
일부 다른 예에서, CART D13:A11에 의한 전달 파라미터를 최적화하기 위해, 양이온성 올리고머 대 음이온성 mRNA의 전하 비율을 1:1에서 50:1(+/-)로 변경하고, 생성된 eGFP 형광을 측정하였다(도 9c). 값은 완전한 아민 양성자화 및 포스페이트 탈양성자화를 가정하여, 암모늄 양이온의 몰 대 포스페이트 음이온의 몰의 이론적(+/-) 전하 비율로 보고하였다. eGFP 발현은 10:1(+/-) 전하 비율로 형성된 복합체에서 발생하는 최대 eGFP 형광과 함께 전하 비율에 대한 대략 포물선 의존성을 나타내었다. 이 값은 4.8:1 전하 비율에서 최적으로 수행된 siRNA 전달에 사용된 구아니디늄-풍부 올리고카르보네이트 복합체에서 관찰된 값보다 높다. 유세포 분석법 결과를 확인하기 위해 에피형광 현미경을 추가로 사용하였다(도 9d). CART/mRNA 복합체로 처리된 HeLa 세포는 거의 모든 가시 세포에서 상당한 형광을 나타낸다. 대조적으로, Lipofectamine으로 처리된 세포는 부분적인 eGFP 발현을 나타내었고, 나머지는 형질주입되지 않은 채로 남아있었다.
추가 예에서, CART, D13:A11에 의한 전달 후 eGFP mRNA 발현을 전형적으로 형질주입이 어려운 것으로 간주되는 것을 포함하는 세포주 패널에서 검정하였다. HeLa 세포 외에도, eGFP mRNA로 형성된 CART 복합체로 처리함으로써, 뮤린 대식세포(J774), 인간 배아 신장(HEK-293), 중국 햄스터 난소(CHO) 및 인간 간세포 암종(HepG2) 세포에서 mRNA 발현을 Lipofectamine의 발현과 비교하였다(도 6a). 시험된 모든 세포주에서, CART D13:A11을 사용하여 eGFP를 발현하는 세포의 백분율은 90% 초과였고, 세포의 22 내지 55%에서만 Lipofectamine 유도 발현으로 처리하였다(도 11a). 이는 이러한 전달 시스템이 다양한 인간 및 비인간 세포 유형에 대해서 일반적임을 시사한다. 불멸화된 세포주 외에도, mRNA 발현은 높은 형질주입 효율(85% 초과)로 일차 CD1 마우스-유래 중간엽 줄기 세포(MSC)에서도 관찰되었다.
다른 예는 Jurkat T-세포(CART로 11% 형질주입 대 Lipofectamine의 경우 7%), 일차 T 세포(6% 형질주입 대 0%)뿐만 아니라 3T3 섬유모세포(CART의 경우 70% 대 Lipo의 경우 59%) 및 영양막 줄기 세포(CART의 경우 19% 대 Lipo의 경우 69%)를 포함하여 형질주입이 훨씬 더 어려운 다른 세포주에서 CART 활성을 나타내었다.
일부 예에서, CART D13:A11에 의한 일관된 mRNA 형질주입은 또한 더 큰 파이어플라이 루시퍼라제(Fluc) mRNA와 같은 상이한 길이의 mRNA를 사용하여 관찰되며, 실질적으로 Lipofectamine을 3배를 초과하게 능가한다(도 11b). eGFP mRNA에서 관찰된 경향과 유사하게, 10:1(양이온:음이온) 비율은 mRNA 길이의 차이에도 불구하고 가장 높은 수준의 Fluc 생물발광을 초래하였고, 이는 전달 효율이 카고 크기와 상당히 무관함을 나타낸다.
이러한 예에서, HeLa 세포를 흑색 96-웰 플레이트에 웰당 10,000개의 세포로 시딩하고 밤새 부착되도록 두었다. mRNA 폴리플렉스 및 Lipofectamine™ 2000 대조군은 Fluc mRNA를 사용하여 상기와 같이 준비하였다(총 부피 50 μL에서 50 ng mRNA/웰의 최종 농도). 모든 조건은 6회 반복 수행하였다. 세포를 37℃에서 8시간 동안 처리하면서 인큐베이션시키고, 이어서 배지를 제거하고, DMEM 중의 D-루시퍼린 용액(300 μg/mL) 100 μL를 세포에 첨가하였다. 생성된 발광을 IVIS 50 또는 IVIS 200(Perkin-Elmer의 Xenogen 제품 라인) 전하-커플링 장치 카메라 및 Living Image Software를 사용하여 측정하였다. 데이터는 3개의 실험의 평균을 나타내고, 오류를 ± SD로 나타낸다.
전하-교체 희생 도메인
eGFP mRNA 및 Cy5-표지된 eGFP mRNA의 혼합물을 전달함으로써 mRNA 내재화 및 발현 분석을 디커플링시키고, 동시에 정량할 수 있고; Cy5 형광은 국소화에 관계없이 내재화된 mRNA를 나타내고, eGFP 형광은 세포질 방출 및 mRNA의 후속 발현을 나타낸다. 이 방법은 두 올리고머의 세포 흡수 및 mRNA 발현을 CART D13:A11: 비-희생, 구아니디늄-함유 D13:G12 및 비-희생, 암모늄-함유 D13:Pip13과 비교함으로써 골격 구조 및 양이온 유형의 효과를 나타낸다.
본 실시예에서, Cy-5 mRNA를 CART, D13:A11과 제형화한 경우, 세포내 Cy5 및 eGFP 형광 둘 다의 높은 수준이 관찰되었다(도 10b, 도 10d). 비교예로서, 비-희생 구아니디늄-함유 D13:G12 또는 비-희생 암모늄-함유 D13:Pip13을 사용한 경우, Cy5-형광만 관찰되었다. 본 실시예는, 3개 mRNA 복합체 모두가 세포에 의해서 효율적으로 내재화되지 않지만, 골격을 신속하게 분해시키지 않으며, D13:G12 및 D13:Pip13으로부터 유래된 비-희생 폴리플렉스는 검출 가능한 번역 수준을 가능하게 하는데 필요한 시간 척도에서 mRNA를 방출하지 않았음을 나타낸다. 암모늄-함유 D13:Pip13으로 형성된 복합체에 의한 eGFP 발현의 결여는, CART, D13:A11의 효능이 암모늄 대 구아니디늄 양이온의 정전기적 결합 친화도의 차이로 인해서 단순하지 않음을 추가로 시사한다. 오히려, 희생 재배열을 통한 양이온성 전하의 제어된 손실이 효능에 중요하다.
특히 본 실시예에서, 올리고머/mRNA 폴리플렉스의 세포 흡수 및 방출을 측정하기 위해서, HeLa 세포를 62.5 ng의 mRNA/웰의 최종 농도에서 Cy5-표지된 eGFP mRNA를 사용하여 상기와 같이 제조된 폴리플렉스로 처리하였다. 세포를 제조하였고, 상기와 같이 eGFP 및 Cy5 형광 둘 다에 대해서 유세포 분석법으로 분석하였다.
추가 예는, 공초점 현미경을 사용하여 본 실시형태예에서 희생의 필요성을 확인한다. 비효과적인 수송체(D13:G12)와 비교한 CART, D13:A11에 의한 CART-매개된 mRNA 방출 및 엔도좀 방출을 단실화된 수송체, Cy5-mRNA 및 엔도좀 반대부분에 대한 착색제인 테트라메틸로다민(TRITC)-Dextran4400의 동시 검출과 함께 공초점 현미경으로 추가로 확인하였다. CART D13:A11 /Cy5-mRNA 복합체로 처리한 후 4시간 후에 세포를 영상화단 경우, Cy5 및 단실 형광단 모두에 대해 확산 형광이 관찰되었는데, 이는 이 물질이 엔도좀에서 성공적으로 빠져나와 폴리플렉스로부터 분리되었음을 나타낸다(도 10d). (TRITC)-Dextran4400의 확산 형광이 또한 관찰되는데, 이는 엔도좀 파열 및 포획된 덱스트란의 방출에 기인할 수 있다. 비교예로서, 세포를 비-희생 D13:G12/Cy5-mRNA 복합체로 처리한 경우, Cy5 및 단실 형광은 모두 점상 상태로 유지되고, 공동 국지화되었다. 이들 신호는 또한 엔도좀 포획을 나타내는 점상 TRITC-Dextran4400과 강하게 중첩된다(도 10d). 종합하면, 이러한 데이터는 CART D13:A11의 전하-변경 거동이 엔도좀 파열 및 mRNA 방출을 가능하게 하여 mRNA 전달을 위한 이러한 물질의 고성능에 기여한다는 것을 강력하게 시사한다.
구체적으로, 공초점 현미경 실시예: HeLa 세포를 8-챔버 유리-바닥 접시(Nunc Lab-Tek II, Thermo Scientific)에 10,000개 세포/웰로 시딩하고, 밤새 부착되게 두었다. 처리 전, 세포를 무혈청 DMEM으로 세척하고, 200 μL의 무혈청 DMEM과 100 μM TRITC-Dextran(Sigma, 평균 분자량 = 4,400)을 각각의 웰에 첨가하였다. 상기와 같이 Cy5-eGFP mRNA 폴리플렉스를 제조하고(최종 농도 125 ng mRNA/웰), 각각의 상응하는 웰에 첨가하였다. 세포를 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 이어서 배지를 제거하고, 10 mM HEPES 완충 용액을 함유하는 500 μL의 PBS를 첨가하였다. 세포를 DAPI(단실), GFP, DsRed(TRITC-Dextran), 및 Cy5 Leica SP8 White Light Confocal 현미경을 사용하여 영상화하였다.
CART에 의한 mRNA의 생체내 전달
특정 실시예에서, CART, 예컨대, D13:A11은 생체내에서 우수한 유전자 발현을 나타내었다. 일 실시예에서, 루시퍼라제 mRNA와 복합체 형성하고, Balb/c 마우스 내에 근육내로 투여된 CART D13:A11은 높은 수준의 생물발광을 나타내었다. 비교예로서, 전달제와 복합체를 형성하지 않은 mRNA는 생물발광을 생성시키지 않는다. 이러한 발현은 4시간에 최대였고, 48시간 후에 여전히 관찰 가능하였다. 이러한 실시예에서, 7.5 μg의 루시퍼라제 mRNA는 75 μL의 PBS(pH 5.5)의 총 부피로 D13:A11과 10:1 전하비로 복합체를 형성하였고, 이를 Balb/c 마우스의 우측 넓적다리 근육에 주사하였다(도 11c, 도 11d).
추가 실시예에서, 루시퍼라제 mRNA와 복합체를 형성한 D13:A11은 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해서 투여되는 경우 높은 수준의 생물발광을 나타낸다. 높은 수준의 발현은 24시간 동안 지속되었고, 48시간 후 생물발광은 검출 가능하였다. 생물 발광은 주로 이들 영상에서 비장 및 간에 국한된다(도 11e, 도 11f). 네이키드 mRNA를 IV 투여한 경우 생물발광 신호가 관찰되지 않았다. 연구된 모든 마우스에 대해 주사 직후 또는 치료 후 몇 주 동안 독성이 관찰되지 않았다.
추가 예로서, CART O11:A9, D12:Gly10.5, 및 D14:a-메틸14.5와 복합체를 형성한 Fluc mRNA의 IV 투여는 모두 간 및/또는 비장에서 상당한 루시퍼라제 발현을 초래하였다. 이러한 실시예에서, 7.5 μg의 루시퍼라제 mRNA는 75 μL의 PBS(pH 5.5)의 총 부피로 CART와 10:1 전하비로 복합체를 형성하였고, 이를 Balb/c 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다.
추가 실시예에서, 루시퍼라제 mRNA와 복합체를 형성한 D13:A11은 종양내 주사를 통해서 투여되는 경우 높은 수준의 생물발광을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 4 μg의 루시퍼라제 mRNA는 75 μL의 PBS(pH 5.5)의 총 부피로 D13:A11과 10:1 전하비로 복합체를 형성하였고, 이를 고형 피하 A20 림프종 종양의 중심에 주사하였다.
추가 실시예에서, 루시퍼라제 mRNA와 복합체를 형성한 CART O11:A9, D12:Gly10.5, 및 D14:a-메틸14.5는 피하 주사를 통해서 투여되는 경우 높은 수준의 생물발광을 나타낸다. 이러한 실시예에서, 5 μg의 루시퍼라제 mRNA는 75 μL의 PBS(pH 5.5)의 총 부피로 D13:A11과 10:1 전하비로 복합체를 형성하였고, 이를 Balb/C 마우스의 등 피부 하에 주사하였다.
비교예로서, 선행 기술 D12:G12가 Fluc mRNA와 복합체를 형성한 경우, 생성된 생물발광이 관찰되지 않았다. 이러한 실시예에서, 5 μg의 루시퍼라제 mRNA는 75 μL의 PBS(pH 5.5)의 총 부피로 D13:A11과 10:1 전하비로 복합체를 형성하였고, 이를 Balb/C 마우스의 등 피부 하에 주사하였다.
새로운 하전된 도메인을 사용한 mRNA 전달 및 발현
비교예: 본래 실시형태에 의해서 입증된 전하-변경 모티프를 사용하여, 다양한 화학 구조의 새로운 단량체 및 새로운 CART 올리고머를 합성하였다. 이러한 CART는, 형광 표지된(Cy5) mRNA를 효과적으로 패키징하고, 형질주입시키는 것으로 나타났고, 일부 변형(예컨대, D9:(7-lact)11 및 D12:(7-글리신)11)은 모 D13:A11 시스템보다 더 높은(1.1 내지 1.2배) 세포내 Cy5 형광을 초래하였다. 이러한 CART의 일부 종(a-Me, a-Me-co-A)은 일부 mRNA 발현을 나타낸다.
친유성 중합체 도메인
일부 실시예는 물질의 친유성 중합체 도메인(또는 상호 교환 가능하게 지질 블록)에서 변형을 함유하는 CART를 포함한다. 본 출원인은 친유성 중합체 도메인으로서 혼입된 콜레스테롤, 노넨일, 스테아릴, 올레일 및 리놀레일 측쇄를 함유하는 CART의 합성을 입증하였다. eGFP mRNA와 복합체를 형성할 때, 이러한 변이체는 올레일 및 리놀레일 작용화 물질과 함께 다양한 성능을 나타내어, 도데실-기반 시스템과 유사한 형질주입 효율을 제공한다.
일부 연구는, 지질 블록 또는 친유성 중합체 도메인 변화가 동적 광산란으로 측정되는 경우 입자 크기 및 제타 전위에 영향을 미치며, 리놀레일 및 올레일 물질은 스테아릴 및 도데실-기반 CART보다 더 오랫동안 양의 제타 전위를 유지한다는 것을 시사한다.
새로운 개시제
일부 예는, 추가 작용기를 CART에 혼입하기 위해서 개환 중합을 위한 개시 알코올의 변형을 탐색하였다. 탐색된 개시제는 형광단(단실 및 BDK), 분지형(3-아암(arm)) 모이어티, 형광 소광제(BHQ) 및 비오틴화된 유도체를 포함한다. 상이한 개시제 기능을 함유하는 유사한 단량체 블록 길이의 CART는 일반적으로 본래 실시형태와 유사한 eGFP mRNA 형질주입 효율을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 개시제는 하기 화학식을 가질 수 있다:
Figure pct00110
유세포 분석법 및 공초점 현미경을 통해 카고(mRNA) 및 수송체(단실 또는 BDK)의 흡수를 독립적으로 추적하는 데 형광 개시제를 사용하여 왔다. 켄칭된 입자로부터 방출될 때 형광의 재-출현을 모니터링함으로써 형광 표지된 mRNA 또는 miRNA 카고의 방출을 모니터링하는 데 켄칭 개시제를 사용하여 왔다.
초기 결과는 3-아암 개시제가 mRNA 형질주입 효율을 유지하면서 CART/mRNA 입자(예를 들어, 크기 및 제타 전위)에 구조적 변화를 도입할 수 있음을 시사한다.
초기 결과는, 비오틴-유래 개시제가 암 세포의 표적화에 사용되거나 비오틴/스트렙타비딘 상보성을 통해 추가 카고를 부착하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
실시예 6:
반대이온
이전의 실시예는 암모늄 양이온에 대한 트리플루오로 아세테이트 반대 음이온을 초래하는 트리플루오로 아세트산을 사용한 Boc-탈보호를 포함한다. 본 출원인은 또한 클로라이드 반대이온을 제공하기 위해 염산(HCl)을 포함한 상이한 조건 하에서 탈보호된 CART에 대해 유사한 효능을 입증하였다. 생성된 CART 염은 본래 실시예와 거의 동일한 형질주입 효율/발현을 나타낸다.
실시예 7:
mRNA의 조합물
일부 실시형태에서, 다중 mRNA를 단일 CART 복합체로 조합할 수 있다. 이에 대한 일례는 eGFP mRNA 및 mCherry mRNA의 이원 혼합물과 CART D13:A11의 공동 제형이다. 이러한 조건 하에서, eGFP 대 mCherry의 결과 비율은 mRNA 전사체의 복합체 내로의 공급 비율을 반영한다. 추가 유세포 분석법 분석은, 모든 세포가 이중 양성이거나 이중 음성임을 보여주며, 이는 두 전사체가 각각의 전사체를 함유하는 별개의 입자가 아니라 동일한 CART/mRNA 입자에 혼입됨을 시사한다. 이러한 공동 제형은, CART 및 치료제를 첨가하기 전에 두 전사체의 간단한 혼합을 통해 달성되며 추가 최적화가 필요하지 않다.
추가 예에서, 다중 mRNA 전사체의 동시 발현은 eGFP 및 Fluc mRNA의 이원 혼합물과 함께 CART D13:A11/mRNA 복합체를 공동 제형화함으로써 입증되었다. 이러한 폴리플렉스는 제형에서 해당 전사체의 질량 %에 비례하는 수준으로 2개의 고유한 단백질의 발현을 유도한다.
실시예 8:
다른 올리고뉴클레오티드 카고
mRNA 전달에 대한 작업 외에도, 본 출원인은 다른 핵산 카고 전달을 위한 다양한 CART 시스템을 탐색하였다. siRNA, miRNA, 미니서클(minicircle) DNA 및 pDNA의 흡수 및 활성은 CART 기술이 가능함을 나타내었다. 이러한 카고 중 다수의 경우, CART 최적화를 경험적으로 결정하였다(예를 들어, 전하 비율, 지질 도메인의 불포화 길이/불포화도).
siRNA
비치환 된 모르폴리논(D13:A11) 및 7원 글리신 작용화된 락톤(D10:(7-gly)11)을 포함한 여러 CART는 siRNA-유도된 유전자 넉다운에 대해 높은 수준의 효능을 입증하였다. (D10:(7-gly)11)과 같은 시스템이 형광성 mRNA의 흡수를 나타내었지만, 생성된 mRNA 번역은 낮은 siRNA 용량(예를 들어 5 pmoles/웰)의 siRNA의 전달에 의해서 단백질 발현의 85% 초과의 넉다운을 초래할 것이라는 것은 예상치 못한 것이었다.
비교예: 이들 2개의 CART 전달제는 D:G 4:4(국제공개 제WO2013036532 A1호 및 문헌[PNAS 2012, 109 (33), 13171―13176])와 같은 비-방출 수송체로 이루어진 선행 기술을 상당히 능가하였는데, 이것은 이러한 조건 하에서 50%의 넉다운을 나타내었다.
구체적으로, siRNA 넉다운 실험은 문헌[Geihe, et. al. PNAS 2012, 109 (33), 13171―13176]으로부터 변경된 절차에 따라 수행하였다. HaCaT 세포를 발현하는 TdTomato/EGFP를 96-웰 플레이트에서 10,000개 세포/웰로 플레이팅하고, 37℃에서 18 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 먼저 pH 5.5에서 17.60 μL의 PBS와 2 μL의 25 μM 스톡 CBL3 siRNA를 사전 혼합함으로써 siRNA/CART 복합체를 제조하였다. DMSO 중의 2 mM 스톡으로부터 이것에 CART를 첨가하여 10:1의 순 양이온:음이온 전하 비율을 달성하였다. 이 용액을 20초 동안 혼합한 후, 100 μL의 무혈청 DMEM을 함유하는 96-웰 플레이트의 3개의 웰에 각각 5 μL를 첨가하여 siRNA의 순 농도가 5 pmol/웰이 되도록 하였다. 세포를 복합체와 함께 4시간 동안 인큐베이션시킨 후, 배지를 혈청-함유 DMEM으로 교체하고, 세포를 48시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 세척하고 트립신 처리하고 유세포 분석법으로 분석하였다. 표준화된 백분율 tdTOM 발현을 하기 수학식으로 계산하였다: (평균 형광 tdTOM처리된 세포/평균 형광 EGFP처리된 세포)/(평균 형광 tdTOM미처리 세포/평균 형광 EGFP미처리 세포) x 100.
miRNA
일부 실시예에서, 핵산 카고는 형광 표지된 miRNA이다. 유세포 분석법 분석은 Lipofectamine 및 폴리(l락트산-코-글리콜산) 나노입자와 같은 다른 형질주입 방법과 비교하여 CART D13:A11을 사용한 표지된 miRNA의 강력한 흡수를 나타낸다. 이 실시예에서, miRNA의 흡수에 대한 최적의 전하 비율은 20:1(양이온:음이온)인데, 이는 mRNA(10:1)에서 관찰된 것보다 더 높다.
구체적으로, miRNA 흡수를 Cy5-표지된 miRNA를 사용하여 측정하였다. 간략하면, HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 40,000개 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 부착되게 하였다. 먼저 2.1 μL의 0.2 μg/μL 스톡의 Cy5-miRNA(서열: Cy5-UpCpApACAUCAGUCUGAUAApGpCpUpA)을 5.72 μL의 PBS(pH 5.5)와 사전 혼합함으로써 CART/miRNA 복합체를 제조하였다. 이어서, 형질주입 직전에 DMSO 중의 2 mM 스톡으로부터 이것에 CART를 첨가하여 10:1의 순 양이온:음이온 전하 비율을 달성하였다. 이것을 20초 동안 혼합한 후, 125 ng/웰의 최종 miRNA 농도의 경우 200 μL의 무혈청 DMEM을 함유하는 24-웰 플레이트 중 3개의 웰 각각에 5 μL를 첨가하였다. 이것을 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고, 트립신 처리하고, 유세포 분석법에 의해서 세포내 Cy5-형광을 결정하였다.
pDNA
일부 실시예에서, 핵산 카고는 상기에 언급된 RNA 카고라기 보다는 이중 가닥 플라스미드-DNA(pDNA)이다. 이러한 경우에, CART는 상업적인 작용제, 예컨대, Lipofectamine보다 개선된 효능(대략 2.5-배)을 나타내는데, 이는 더 높은 형질주입 효율 및 중위 형광 강도를 초래한다. 구체적으로, pPKCδ-GFP를 암호화하는 플라스미드를 형광 리포터로서 사용하였다. 일부 경우에, 상이한 지질 블록 또는 친유성 중합체 도메인을 함유하는 CART는 CART D13:A11보다 플라스미드 전달에 대해서 더 효능이 있었고, 올레일- 및 리놀레일-작용화된 물질은 최고 형질주입 효율을 나타낸다.
CART/pDNA 복합체에 대한 입자 크기는 일반적으로 유사한 mRNA-함유 입자보다 더 작았으며, 대부분의 화합물의 경우 유체역학적 직경은 90 내지 110 nm이고, 리놀레일-작용화된 CART의 경우 390 nm이었다. 제타 전위는, 전하-교체 재배열이 일어날 때 대략 +40 mV에서 시작하여 -40 mV로 감소하는 mRNA 입자와 동일한 경향을 따른다.
형질주입에 대한 구체적인 실험 상세 사항: 예를 들어, CART O11:A9에 의한 형질주입 시, CHO 세포를 24-웰 플레이트에 웰당 40,000개 세포로 시딩하고 밤새 부착되도록 두었다. PBS pH 5.5 및 pPKCδ-GFP를 DMSO 스톡 용액으로부터의 다양한 양의 올리고머와 혼합하여 pDNA/CART 비율(25:1의 이론적 양이온:음이온 비율까지 최적화됨, 총 부피 115 μL)을 달성함으로써 pDNA:CART 복합체를 제조하였다. 복합체를 처리 전에 20초 동안 실온에서 인큐베이션시켰다. Lipofectamine 2000 대조군은 제조사의 지침에 따라 OptiMEM에서 준비하였다. 세포를 무혈청 F-12 배지로 세척하고, pDNA/Lipofectamine 용액을 최종 부피 500 μL/웰 및 679 ng pDNA/웰로 첨가하였다. 무혈청 F-12 배지로의 세척 후, 37.5 μL의 pDNA/CART 복합체를 3개의 웰 각각에 500 μL의 총 부피 및 674 ng/웰의 최종 pDNA 농도로 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 그 시간 후 배지를 혈청-함유 F-12 배지로 교체하였다. 세포를 추가 24시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 트립신-EDTA(0.25%)로 5분 동안 37℃에서 트립신처리하였다. 혈청-함유 F-12 배지를 첨가하고, 각각의 웰의 내용물을 원심분리시켰다. 상청액을 제거하고, 펠릿화된 세포를 PBS(200 μL)에 재분산하고 FACS 튜브로 옮기고, 유세포 분석법 분석기(LSR-II.UV, 스탠포드 대학교)에서 판독하였다. 제시된 데이터는 분석된 5,000 내지 10,000개 세포의 기하 평균 형광 신호이다. 형질주입 효율을 위해, 미처리 세포를 eGFP 발현이 없는지에 대해 게이팅하였고, 제시된 데이터는 미처리 세포보다 더 높은 eGFP 발현으로 분석된 세포의 비율이다. 오류는 ± SD로 나타낸다.
CART/pTransposase의 전달에 의한 안정한 형질주입
일부 실시예에서, pLuciferase(트랜스포사제 인식 부위 함유) 및 pTransposase를 별도로 암호화하는 플라스미드의 조합물과 같은 다중 플라스미드를 동시에 전달할 수 있고, 이는 표적 루시퍼라제의 안정적인 발현을 초래하였다. 6일 후, CART O11:A9는 Lipofectamine을 상당히 능가하였는데, 이는 생물발광 수준에서 10-배를 초과하게 증가하였다.
이러한 실시예의 경우, CHO 세포를 웰당 10,000개 세포로 흑색 96-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃에서 부착되게 하였다. 먼저 PBS(pH 5.5에서)를 파이어플라이 루시퍼라제 및 tdTomato 둘 다를 암호화하는 pDNA 470 ng 또는 pTransposase와 2:1 비율로 혼합된 동일한 플라스미드 총 585 ng과 사전 혼합함으로써 pDNA:CART 복합체를 제조하였다. Lipofectamine 대조군을 제조사의 시방서에 따라서 무혈청 OptiMEM 배지 중에서 구성하였다. 형질주입 직전에, CART를 DMSO 중의 2 mM 스톡 용액으로부터의 플라스미드/PBS 용액에 첨가하여 5:1의 순 +/- 전하 비율을 달성하였다. 생성된 복합체를 실온에서 20초 동안 인큐베이션시킨 후, 세포에 첨가하였다. 세포를 무혈청 F-12 배지로 헹구고, 이어서 7.3 μL의 복합체를 무혈청 배지를 함유하는 96-웰 플레이트의 3개의 웰 각각에 웰당 50 μL의 최종 부피 및 137 또는 171 ng/웰의 pDNA 농도로 첨가하였다. 세포를 24시간 동안 37℃에서 처리제와 함께 인큐베이션시키고, 그 시간 후 배지를 0.3 mg/mL의 루시퍼린을 함유하는 100 μL의 혈청-함유 F-12 배지로 교체하였다. 생성된 생물발광을 IVIS 50 또는 IVIS 200(Perkin-Elmer의 Xenogen 제품 라인) 전하-커플링 장치 카메라 및 Living Image Software를 사용하여 측정하였다. 오류는 ± SD로 나타낸다. 컨플루언시 후, 세포를 0.25% 트립신을 사용하여 새로운 웰로 통과시켰다.
추가 실시예는, CART를 사용한 다중 플라스미드로의 효과적인 전달 및 안정한 형질주입을 확인하였다. 이러한 경우에, pLuciferase(둘 다 퓨로마이신 내성을 부여하고, 트랜스포사제 인식 부위를 함유) 및 pTransposase를 별도로 암호화하는 플라스미드의 조합물은 퓨로마이신 내성과 함께 표적 루시퍼라제의 안정적인 발현을 초래하였다. 몇몇 세대에 걸친 퓨로마이신 선택성은 안정한 형질주입을 입증하였고, Lipofectamine에 비해서 생물발광은 2배 증가되었다.
이러한 실시예의 경우, CHO 세포를 웰당 10,000개 세포로 흑색 96-웰 플레이트에 시딩하고, 밤새 37℃에서 부착되게 하였다. 먼저 PBS(pH 5.5에서)를 파이어플라이 루시퍼라제 및 파이어플라이 루시퍼라제 및 tdTomato를 암호화하는 pLuc-tdTom/pTransposase 혼합물 585 ng과 혼합함으로써 pDNA:CART 복합체를 제조하였다. Lipofectamine 2000 대조군을 제조사의 시방서에 따라서 무혈청 OptiMEM 배지에서 준비하였다. 형질주입 직전에, CART를 DMSO 중의 2 mM 스톡 용액으로부터의 pDNA/PBS 용액에 첨가하여 5:1의 순 +/- 전하 비율을 달성하였다. 복합체를 실온에서 20초 동안 인큐베이션시킨 후, 세포에 첨가하였다. 세포를 무혈청 F-12 배지로 헹구고, 이어서 7.3 μL의 복합체를 무혈청 배지를 함유하는 96-웰 플레이트의 3개의 웰 각각에 웰당 50 μL의 최종 부피 및 171 ng/웰의 pDNA 농도로 첨가하였다. 24시간 후 배지를 0.3 mg/mL의 루시퍼린 및 6 μg/mL의 퓨로마이신을 함유하는 100 μL의 혈청-함유 F-12 배지로 교체하였다. 세포를 IVIS 50 또는 IVIS 200(Perkin-Elmer의 Xenogen 제품 라인) 전하-커플링 장치 카메라 및 Living Image Software를 사용하여 매일 영상화하였다. 오류는 ± SD로 나타낸다. 세포를 웰당 20 μL의 0.25% 트립신을 사용한 처리 후에 72시간 동안 계대시켰다. 세포를 5분 동안 인큐베이션시키고, 이어서 80 μL의 혈청-함유 F-12 배지로 웰당 100 μL의 최종 부피로 희석시켰다. 각각의 웰에 대해서, 30 μL의 세포 용액을 3개의 새로운 웰 각각에 첨가하고, 0.3 mg/mL 루시퍼린 및 6 μg/mL 퓨로마이신을 함유한 70 μL의 혈청-함유 F-12 배지로 희석하였다. 본래 웰 중의 남아있는 10 μL의 세포 용액을 0.3 mg/mL 루시퍼린 및 6 μg/mL 퓨로마이신을 함유하는 90 μL의 혈청-함유 F-12 배지로 각각의 웰에서 100 μL의 최종 부피로 희석하였다.
미니서클-DNA
추가 실시예는 CART를 사용한 미니서클-DNA(mcDNA)의 효과적인 전달을 나타내었다. 이러한 경우, 루시퍼라제를 암호화하는 미니서클-DNA를 CART D13:A11, 및 올레일 CART O11:A9 둘 다에 의해서 HeLa 세포에 전달하였다. 이는 Lipofectamine 및 폴리에틸렌이민(PEI) 제형 둘 다에 비해서 높은 수준의 루시퍼라제 발현(대략 10-배 더 높음)을 초래하였다.
구체적으로, 미니서클 DNA 흡수 및 발현을 루시퍼라제 리포터 시스템을 사용하여 측정하였다. 간략하면, HeLa 세포를 96-웰 플레이트에 15,000개 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 부착되게 하였다. 먼저 파이어플라이 루시퍼라제 유전자 및 구성적 프로모터를 함유하는 0.2 μg/μL 스톡의 미니서클 DNA 2.1 μL와 5.71 μL의 PBS(pH 5.5에서)를 사전 혼합함으로써 CART/미니서클 DNA 복합체를 제조하였다. Lipofectamine 및 PEI 대조군을 제조사의 시방서에 따라서 구성하였다. 이어서, 형질주입 직전에 DMSO 중의 2 mM 스톡으로부터 이것에 CART를 첨가하여 10:1의 순 양이온:음이온 전하 비율(또는 시험될 임의의 다른 전하 비율)을 달성하였다. 이것을 20초 동안 혼합한 후, 62.5 ng/웰의 최종 미니서클 DNA 농도의 경우 100 μL의 무혈청 DMEM을 함유하는 96-웰 플레이트 중 6개의 웰 각각에 2.5 μL를 첨가하였다. 이것을 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 이어서 배지를 0.3 mg/mL 루시퍼린을 함유하는 혈청-함유 DMEM으로 교체하고, 세포를 IVIS 카메라 시스템을 사용하여 생물발광에 대해서 영상화하였다.
실시예 9:
CRISPR/Cas9 편집
CART-매개된 형질주입의 일부 실시예에서, 특이적 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 통한 표적 유전자의 성공적인 넉인이 입증된다. 이 경우에, Cas9를 암호화하는 mRNA를 뮤린 베타-액틴 유전자의 미번역 영역을 표적으로 하는 sgRNA와 함께 D13:A11과 공동 제형화하였다. 또한 루시퍼라제 또는 mCherry 유전자 및 베타-액틴 유전자로부터의 동일한 CRISPR 절단 부위(프로모터 없음)를 함유하는 미니서클-DNA를 공동 제형화하였다. 이 시스템을 사용하면, 리포터 유전자의 발현은, 뮤린 게놈 및 미니서클 둘 다의 Cas9 절단이 미니서클 벡터의 베타-액틴 미번역 영역으로의 삽입을 초래하여 그것이 베타-액틴 프로모터의 제어하게 있는 경우에만 일어날 것이다.
Cas9 mRNA 및 sgRNA 작제물과 형광 리포터 유전자의 공동 제형을 수행하여 이들 카고가 CART에 의한 핵산 전달을 방해하지 않았다는 것을 확실히 하였다. 이 경우, eGFP mRNA를 Cas9 mRNA 또는 sgRNA을 함유하는 50% w/w 혼합물로서 또는 50% eGFP mRNA, 25% Cas9 mRNA 및 25% sgRNA로 이루어진 제형으로서 제형화하였다. 이러한 실시예 둘 다에서, 세포 eGFP 형광은 eGFP mRNA로만 이루어진 제형의 것의 대략 50%였다. 이러한 동일한 결과가 CART D13:A11 및 O11:A9 둘 다에서 얻어졌다. 이는, 상기에 언급된 CART에 의한 CRISPR 성분의 성공적인 공동 제형을 뒷받침한다. DLS(표준 절차에 따름)에 의한 추가 특징규명은, D13:A11 또는 O11:A9 및 Cas9 mRNA와 sgRNA의 혼합물로 입자가 대략 173 nm 크기였다는 것을 입증하였는데, 이는 다른 mRNA 전사체에 대해서 관찰된 크기와 일관된다.
3T3 뮤린 섬유모세포를 luc 미니서클과 상기와 같이 제형화된 복합체로 처리한 경우, 상당한 생물발광 판독치가 관찰되었다. 이러한 신호는, 스크램블드 sgRNA 서열을 사용한 경우에는 관찰되지 않았는데, 이는 루시퍼라제 유전자의 3T3 게놈 내로의 특이적 삽입으로 인한 것임을 확인해 준다. 생성된 생물발광은 제형에서 더 높은 비율의 미니서클-DNA가 사용된 경우 증가되었다. 추가적으로, 복합체가 mCherry-함유 미니서클과 함께 형성되고, 3T3 섬유모세포에 노출된 경우, 유세포 분석법 분석은 표적 집단의 대략 2%에서 강력한 mCherry 형광이 있음을 나타내었는데, 이는 효율적인 게놈 통합을 나타낸다.
구체적으로, CRISPR/Cas9 유전자 편집을 하기 일반 절차에 따라서 3T3 섬유모세포에서 수행하였다. 간략하면, HeLa 세포를 24-웰 플레이트에 40,000개 세포/웰로 플레이팅하고, 밤새 37℃에서 부착되게 하였다. 먼저 134 ng Cas9 mRNA, 134 ng sgRNA, 및 134 ng 미니서클 DNA(루시퍼라제 유전자 함유)를 22.8 μL의 PBS(pH 5.5에서)와 사전 혼합함으로써 CART/올리고뉴클레오티드 복합체를 제조하였다. 이어서, 형질주입 직전에 DMSO 중의 2 mM 스톡으로부터 이것에 CART를 첨가하여 10:1의 순 양이온:음이온 전하 비율을 달성하였다. 이것을 20초 동안 혼합한 후, 40 ng의 각각의 성분의 최종 농도의 경우 400 μL 무혈청 DMEM을 함유하는 24-웰 플레이트 중 3개의 웰 각각에 7.5 μL을 첨가하였다. 이것을 8시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 그 시간 후, 배지를 혈청-함유 DMEM으로 교체하고, 24 내지 48시간 동안 유지시켰다. 인큐베이션 후, 배지를 0.3 mg/mL 루시퍼린을 함유하는 혈청-함유 DMEM으로 교체하고, 세포를 IVIS 카메라 시스템을 사용하여 생물발광에 대해서 영상화하였다.
실시예 10:
mRNA 백신접종
백신접종 실시예에서, CART 단독 또는 아주반트(mRNA 존재하지 않음)와 조합된 CART 중 어느 것도 대리 항원 모델에서 보호 항-종양 면역을 유도하지 않았다(도 2). 구체적으로 이러한 실시예에서, 6 내지 8주령의 마우스에게 107개의 종양-특이적 항원(TSA)-발현 A20 세포를 동시에 접종하고, 종양과 상이한 해부학적 부위 상의 피하 주사에 의해서 206 μg CART 단독 또는 206 μg CART+50μg 아주반트로 처리하였다. 종양 크기를 매일 측정하고, 15 mm 초과의 종양 직경을 갖는 마우스를 동물 프로토콜에 따라서 안락사시켰다. 이들 대조군 중 어느 하나에 대해서도 접종된 마우스에서 수명 연장이 관찰되지 않았다. CART는 면역 반응을 유발하지 않는다.
동시 종양 노출을 통한 예방적 백신접종
항원-특이적 예방적 반응은 백신접종이 종양 접종 이전에 또는 종양 접종 시점에 수행될 때 제공된다. 이들 연구는, 공동 제형 실시형태로 또는 백신접종 시에 별도로 투여되는 TSA-mRNA + 아주반트를 함유하는 CART를 사용한 백신접종이 TSA-발현 종양 세포를 갖는 마우스 모델에서 보호 면역을 유도한다는 것을 나타낸다. CART/TSA-mRNA를 사용한 치료는 보호를 제공하고, 면역-자극성 아주반트를 사용하면 증가된 효능을 제공한다. 아주반트 단독으로 처리된 마우스는 큰 종양이 신속하게 성장되었으며, 이를 동물 프로토콜에 따라 희생시켰다. 강력한 반응은 단일 용량에서 얻어지며, 백신 부스트가 필요하지 않으며, 2차 종양 시험감염 시에 리콜될 수 있다(도 3).
구체적으로, 이러한 실시예에서, 6 내지 8주령의 마우스에게 107개의 종양-특이적 항원(TSA)-발현 A20 세포를 피하 주사를 통해서 동시에 접종하고, 종양과 상이한 해부학적 부위 상의 피하 주사에 의해서 CART + TSA-mRNA + 아주반트(상기에 기재된 바와 같이 제형화됨) 또는 아주반트 단독으로 처리하였다. 종양 크기를 최초 30일 동안 격일로 측정하였다. 15 mm 초과의 종양 직경을 갖는 마우스를 안락사시켰다. 리콜 반응 실험에서, CART+TSA-mRNA + 아주반트 처리군에서 살아남은 마우스에게 107개의 TSA-발현 A20 세포를 다시 시험감염시켰다.
확립된 종양의 치료
큰 종양 확립 후 CART/mRNA + 아주반트 백신접종을 투여하면 항원 특이적인 치료 반응이 유도된다. 큰 종양을 접종한 지 7일 후 CART/mRNA + 보조제의 투여는 종양의 퇴행 및 완화 둘 다를 제공한다(3x 3 μg TSA-mRNA/CART 복합체). 이 연구(총 5 마리)에서 마우스는 종양 성장의 진행이 현저하게 둔화된 반면, 마우스의 40%(2/5 마우스)는 약 60 내지 90일 후에도 종양이 완전히 치유되었다. mRNA/CART + 아주반트를 사용한 백신접종은 동물 연구에서 보호를 제공하는 것으로 반복적으로 입증된 확립된 단백질 백신접종 전략을 능가한다.
구체적으로 이러한 실시예에서, 6 내지 8주령의 마우스에게 107개의 종양-특이적 항원(TSA)-발현 A20 림프종 세포를 피하로 접종하였다. 종양 크기가 150 mm3에 도달하면, 3 μg TSA-mRNA + 아주반트와 복합체를 형성한 CART, 아주반트 단독 또는 식염수 용액을 각각의 치료 사이에 4일 동안 종양과 상이한 해부학적 부위에 피하 주사하여 마우스를 3회 처리하였다. 종양 크기를 최초 40일 동안 격일로 측정하였다. 15 mm 초과의 종양 직경을 갖는 마우스를 안락사시켰다.
종양내 백신접종
CART/mRNA 복합체의 종양내 주사는 종양의 퇴행을 초래한다. CART- 복합 mRNA로 치료된 확립된 A20 림프종 종양은 종양에서 4개의 상이한 세포 집단의 하위세트에서 단백질 발현을 초래한다. T-세포 기능을 향상시켜 항-종양 면역 반응을 조절하는 것으로 여겨지는 후보 단백질은 치료된 종양에 중대한 영향을 미쳤다. 특히, 동일한 동물에서 원위 미처리 종양에 대해서도 성장 지연 효과가 관찰되었다(도 5). 이러한 발견은 인 시추 예방접종/증강 전략이 전이성 질환에서 치료 잠재력을 가지고 있음을 시사한다.
구체적으로 이러한 실시예에서, 6 내지 8주령의 마우스에게 107개의 A20 세포를 두 개의 상이한 해부학적 위치 상에 피하로 동시에 접종하였다. 종양 크기가 150 mm3에 도달하면 각 마우스의 종양 중 하나에 CART + 10 μg 면역 조절 단백질 mRNA 또는 식염수 용액을 종양 내 주사 3회로 처리하였다. 다른 종양은 치료하지 않은 채로 두었다. 두 종양 모두 최초 20일 동안 또는 마우스가 안락사되어야 하는 크기에 도달할 때까지 격일로 측정하였다.
실시예 11:
메신저 RNA의 전달 및 방출을 위한 전하-교체 방출 가능성 수송체(CART).
본 명세서에는 새롭고, 조정 가능하고, 현저하게 효과적인 합성 생물 분해성 물질 부류인 전하-교체 방출 가능성 수송체(CART)의 단계-경제적인(step-economical) 합성 및 평가가 제공된다. 본 명세서의 일부 실시형태에 따라서 제공된 CART는 구조적으로 고유하고, 전례가 없는 기전을 통해 작동하고, 먼저 α-아미노 에스테르 양이온으로 제공되는데, 이것은 mRNA와 복합체를 형성하고, 이를 보호하고, 전달하고, 이어서 분해성 전하-중화 분자내 재배열을 통해 물리적 특성을 변화시켜, 세포 배양물 및 동물 둘 다에서 매우 효율적인 단백질 번역을 위해 mRNA를 방출한다. 이러한 새로운 mRNA 전달 기술은 수많은 연구 및 치료 응용 분야에 광범위하게 적용될 수 있다.
메신저 RNA(mRNA)는 그것이 암호화하는 단백질의 생체내 합성을 가능하게 하여 암, 유전 장애 및 감염 질환과 같은 다양한 질병의 치료를 변화시킬 수 있는 잠재력을 갖는 급속하게 부상하는 유전자 요법 약물의 부류의 기반을 제공한다. mRNA-암호화된 단백질의 특정 발현을 위한 본 명세서의 특정 실시형태에 따른 방법 및 조성물의 사용은, 연구 및 영상화 응용 분야, 단백질 대체 또는 증강을 필요로 하는 치료 용도 및 예방적 및 면역치료 적응증 모두를 위한 새로운 백신접종 요법을 위해 활용될 수 있다.
본 명세서에 제공된 일부 실시형태에 따른 전하-교체 방출 가능성 수송체(CART)는 먼저 다가양이온으로서 기능하여 다음이온성 mRNA와 일시적으로 복합체를 형성하고, 보호하고, 이어서 이의 양이온성 전하를 신속하게 변형시키고, 따라서 제어된 자가-희생 기전을 통해 음이온-결합 능력을 변형시킨다.
mRNA의 비-공유 복합체화, 보호, 세포내 전달 및 방출을 위해 설계된 새로운 부류의 물질로서 CART의 개발이 특정 실시형태의 실시예로서 제공된다. 이러한 CART는 고유한 자가-희생 기전을 통해 재배열되는 동적 양이온성 α-아미노 에스테르로 구성되어, 양이온성 아민을 중성 아미드로 전환시킨다. 이러한 물질은 유기 촉매 개환 중합(OROP) 및 탈보호를 통해 단계-경제적으로 합성(2단계)되고, 근육내 및 정맥내 투여를 통해 다수의 세포 유형 및 동물 모델에서 mRNA를 전달 및 방출하는 자가-조립된 고분자전해질 복합체로 mRNA와 효과적으로 복합체를 형성한다. 본 명세서의 실시예 10은 이들 물질에 의한 mRNA 전달의 효능이 강력한 엔도좀 탈출 및 세포질 mRNA 방출을 도출하는 고유한 전하-교체 분자내 재배열로 인한 것임을 추가로 입증한다.
본 발명자들은 mRNA 전달과 관련된 특정 문제를 해결하기 위해 동적 특성을 갖는 새로운 부류의 올리고 뉴클레오티드 전달 비히클인 양친매성 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르)를 설계하였다. siRNA에 대한 본 발명자들의 이전 연구는, 음이온성 siRNA 듀플렉스로 나노스케일 폴리플렉스를 형성하도록 설계된 친유성 및 양이온성 블록을 모두 함유하는 블록 코-올리고머를 사용하여 효율적인 전달을 달성할 수 있음을 입증하였다. 단일-가닥 mRNA가 siRNA 및 pDNA보다 세포내 반감기가 더 짧기 때문에, 본 발명자들은 신속한 엔도좀 탈출 및 후속 올리고뉴클레오티드 방출이 효율적인 발현에 중요할 것이라고 가정하였다. 이 두 가지 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 올리고머 골격을 동시에 절단하고 양이온성 아민을 중성 아미드로 전환하는 역할을 하는 신속한 자가-희생 양이온성 블록을 혼입한 양친매성 올리고머 전달 수단을 고안하였다. 세포 흡수 후 골격 분해는 엔도좀의 삼투압을 증가시켜 엔도좀 파열을 촉진시킨다는 가설을 세웠다. 또한, 이 기전은 다가음이온 및 다가양이온 성분의 다중 부위 및 정전기적 회합을 동시에 제거하여 세포질 mRNA 방출 및 후속 유전자 발현을 촉진시킨다.
본 발명자들은 이전에 N-보호된 모르폴린-2-온의 OROP에 의한 폴리(α-아미노 에스테르)(도 7a, 1)의 합성을 보고하였고, 이어서 본 명세서에 기재된 바와 같이 mRNA 전달을 위한 이들의 사용에 대한 연구로 이어졌다. 작용화된 락톤 단량체는 상업적으로 입수 가능한 출발 물질로부터 2개의 고수율 단계로 쉽게 생성된다. 이러한 단량체는 유기 촉매 조건에서 1차 알코올 개시제로 개환되어 쇄 길이와 분산성을 정밀하게 제어하여 폴리(α-아미노 에스테르)를 생성할 수 있다. 탈보호 시, 올리고머는 수용성(0.5 M 초과)이며, 비완충수에서 안정적이다(D2O에서 2일 초과). 그러나 널리 공지된 폴리(β- 아미노 에스테르)와 달리, 약간 염기성 조건에 노출되면 정전기 상호작용의 손실에 의한 mRNA 방출을 촉진하기 위해 본 명세서에서 사용되는 제어된 자가-희생 재배열을 통해 5분 미만 내에 분해된다.
이러한 분해의 기계론적 조사는, 암모늄 양이온의 부분적 탈양성자화를 입증하여 5원 전이 상태를 통해 골격 에스테르로의 분자내 고리화를 허용한다(도 7a). 골격의 초기 수축 이후, 인접한 단량체 단위 상의 질소 기는 6원 전이 상태를 통해 두 번째 고리화에 관여하여 말라드 반응의 공지된 무독성 대사산물인 히드록시 에틸글리신(HEGD, 2)의 소분자 이량체를 형성한다. 이러한 재배열은 매우 빠르고 효율적이고; 단독-올리고머는 pH 7.4에서 2분 미만의 t1/2에서 분해된다. 이 시스템의 고유한 반응성은 필요한 친핵성 아민의 카르보닐-보조 탈양자화와 동시에 진행되는 유도 및 수소 결합 상호작용에 의한 골격 에스테르 카르보닐의 상보적 활성화에 의해 설명될 수 있다. 새로 형성된 히드록시에틸아미드에 의한 6원 전이 상태의 경직화는 HEGD 2를 형성하기 위한 최종 고리화를 촉진시킨다. 이러한 재배열에 대한 기전 및 변화에 대한 추가 조사는 별도로 보고되지만, 다가양이온 올리고머를 전하-중성 단편으로 신속하게 전환시키는 이러한 시스템의 고유한 역학은 다음이온성 약물 및 프로브 전달에 대해 잠재적으로 광범위하게 활용 가능한 개념을 나타낸다.
본 발명자들은 mRNA를 전달하기 위한 물질을 설계하였는데, 이것은 자가-희생 α-아미노 에스테르의 양이온성 블록에 추가된 도데칸올-작용화된 친유성 카르보네이트 블록을 특징으로 하며, 이는 OROP 방법론을 사용하여 모르폴린-2-온 단량체와 환식 카르보네이트의 공중합을 통해 쉽게 달성된다(도 7b).
이 기술의 매력적인 양태는 이블록 코-올리고머에서 서로 상이한 길이의 친유성 중합체 도메인(또는 지질 블록)을 사용하여 성능을 조정할 수 있다는 것이다. 작은 일련의 올리고머 전달 비히클을 1차 알코올을 사용하여 합성하여 도데실-카르보네이트 블록의 개환을 시작하고, 이어서 양이온성 블록의 첨가 및 올리고머화를 시작하였다. 이 전략을 사용하여, 평균 13개의 지질 단량체 단위 및 11개의 양이온성 단량체 단위(D13:A11 7), 18개의 지질 및 17개의 양이온성 단위(D18:A17 8), 13개의 양이온성 단위의 단독-올리고머(A13 9)를 함유하는 올리고머를 합성하였다. 각각의 새로운 벡터는 단지 2개의 단계를 제조할 수 있으며, 공정은 단지 몇 시간이 필요하다.
CART 전달 수단에 적용되는 이러한 재배열에 대한 이해를 높이기 위해 생리학적 pH에서 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르)의 역학을 분석하기 위해 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 사용하였다. 재배열 반응이 친유성 도메인을 온전하게 남겨두면서, 양친매성 CART의 양이온-결합 부분에만 영향을 미친다는 것을 보여주기 위해서, 모델 코-올리고머인 Pyr-D15:A12 10을 pH 7.4에서 PBS 완충제에 용해시켜 재배열을 수행하였다(도 8a). 1시간 후, 용액을 농축하고, GPC로 분석하였다(도 8b). 분해된 코-올리고머의 GPC 트레이스를 재배열 및 Boc-탈보호 전에 독립적으로 합성된 Pyr-D15 올리고머 11, 및 Pyr-D15:A12와 비교하였다. 예상된 바와 같이, 보호된 D15:A12 블록-코-올리고머의 GPC 트레이스는 단독-올리고머 Pyr-D15 11(각각 6.4 kDa 및 4.6 kDa)보다 높은 분자량을 나타낸다. 그러나 pH 7.4 PBS 완충제에 노출된 후 탈보호된 블록 코-올리고머는 Pyr-D15 지질 블록(4.6 kDa)과 거의 동일한 감소된 분자량(4.3 kDa)을 보였으며, 이는 생리학적 pH에서 양이온성 CART의 일부는 분해되고, 전체 친유성 블록은 온전하게 남아있다는 것을 시사한다. 동일한 GPC 데이터의 UV 트레이스는, 초기 알코올(이 경우에는 피렌 부탄올이지만 다른 친핵성 알코올, 아민 및 티올을 사용할 수 있음)이 친유성 블록에 부착된 상태로 유지되어 향후 연구에서 이 알코올을 다양한 세포 및 기관에 대해서 CART를 표적으로 하는 리간드와 같은 다른 기능을 추가하는 데 사용할 수 있음을 나타낸다.
mRNA 전달 비히클로서 CART의 효능을 평가하기 위해서, 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP) mRNA를 모델 리포터 유전자로 선택하였다. 처리 후 eGFP 형광의 유세포 분석법 분석은, 평균 단백질 발현뿐만 아니라 기준선 초과의 수준의 형광을 나타내는 세포 분율(% 형질감염)을 동시에 정량할 수 있다. CART 복합체로 처리한 후 유전자 발현을 양성 대조군으로서 상업적인 작용제인 Lipofectamine 2000(Lipo) 및 siRNA 전달에 특히 효과적인 것으로 알려진 두 가지 화합물(D4:G4 12 및 D12:G12 13)과 비교하였다. 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine으로 제형화된 mRNA로 HeLa 세포를 처리한 경우, 적당한 수준의 유전자 발현이 관찰되었다(도 9a). 그러나, 이 조건은 단지 대략 50%의 세포 형질주입을 초래하였고, 세포 집단의 절반은 eGFP 발현을 나타내지 않았다(도 9b). 대조적으로, 본 발명자들의 설계된 (카르보네이트-b-α-아미노 에스테르) CART, D13:A11 7은 99%의 초과의 현저한 형질주입 효율 및 높은 평균 형광으로 우수한 eGFP 발현을 제공하였다. 더 긴 블록 길이를 갖는 제2 올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) CART(D18:A17 8)는 높은 형질주입 효율(90% 초과)을 제공하였지만, 평균 형질감염 값은 더 낮았다. α-아미노 에스테르 단독-올리고머로 형성된 복합체(A13 9)는 eGFP 발현을 유도하지 않았다. 이것은 또한 소수성 도메인과 친수성 도메인 사이의 상당한 상 분리가 나노 입자 형성을 안정화시키고, 증가된 친유성이 막 결합 및 흡수를 촉진한다는 이전 관찰을 확인해 준다. siRNA 전달제로서의 효능과는 대조적으로, 구아니디늄-작용화된 양친매성 올리고카르보네이트 D4:G4 12 및 D12:G12 13은 mRNA 발현을 나타내지 않았다. 이러한 물질은 수동 가수 분해(t1/2 8시간 초과) 초과의 분해 또는 카고 방출 기전을 포함하지 않기 때문에, 이는 siRNA에 비해 mRNA 전달에 대한 더 빠른 시간 척도 상에서 엔도좀 탈출 및 세포질 방출이 발생해야 한다는 본 발명의 가설을 뒷받침한다.
CART 7에 의한 전달 파라미터를 최적화하기 위해, 양이온성 올리고머 대 음이온성 mRNA의 전하 비율을 1:1에서 50:1(+/-)로 변경하고, 생성된 eGFP 형광을 측정하였다(도 9c). 값은 완전한 아민 양성자화 및 포스페이트 탈양성자화를 가정하여, 암모늄 양이온의 몰 대 포스페이트 음이온의 몰의 이론적(+/-) 전하 비율로 보고하였다. eGFP 발현은 10:1(+/-) 전하 비율로 형성된 복합체에서 발생하는 최대 eGFP 형광과 함께 전하 비율에 대한 대략 포물선 의존성을 나타내었다. 이 값은 4.8:1 전하 비율에서 최적으로 수행된 siRNA 전달에 사용된 구아니디늄-풍부 올리고카르보네이트 복합체에서 관찰된 값보다 높았는데, 이는 아마도 암모늄 양이온과 포스페이트 음이온 간의 약간 더 낮은 정전기적 상호작용(구아니디늄 이온의 경우 ΔG = -0.575 kcal/mol 대 암모늄 이온의 경우 -0.417 kcal/mol)으로 인한 것일 것이다. 모든 추가 실험은 최적화된 10:1(+/-) 전하 비율을 사용하여 수행하였다. 유세포 분석법 결과를 확인하기 위해 에피형광 현미경을 추가로 사용하였다(도 9d). CART/mRNA 복합체로 처리된 HeLa 세포는 거의 모든 가시 세포에서 상당한 형광을 나타낸다. 대조적으로, Lipofectamine으로 처리된 세포는 부분적인 eGFP 발현을 나타내었고, 나머지는 형질주입되지 않은 채로 남아있었다.
본 발명자들이 mRNA 전달에 적용되는 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르) CART의 성능에 관여한다고 가설을 세운 희생 재배열 기전을 더 이해하기 위해 일련의 실험을 수행하였다. 시험관내 형질주입에 사용된 것과 유사한 조건 하에서 동적 광산란(DLS)를 사용하여 CART 7과 mRNA 사이에 형성된 CART 7 및 고분자전해질 복합체를 분석하였다. mRNA-함유 폴리플렉스가 세포 배지에 추가되었을 때, 유체역학적 크기는 254 nm에서 시작했지만 2시간에 걸쳐 천천히 512 nm로 증가하였다. 관찰된 크기의 증가는 양이온성 α-아미노 에스테르 블록이 중성 아미드로 부분적으로 재배열되어 관련 지질 분절의 응집을 유발하는 것을 반영한다. 이것은, 동일한 시간 척도에 걸쳐 HEGD 소분자의 상대적 강도의 증가를 나타낸 ESI-MS에 의해 확인되었다. mRNA/CART 입자가 비완충수에 첨가되는 경우 전체 2시간 실험 과정에 걸쳐서 크기가 254 nm +/- 10 nm에서 일관되게 유지된다.이는 이러한 조건 하에서 재배열되지 않는 α-아미노 에스테르 단독올리고머에 대한 결과를 반영한다. 제타 전위 측정은 입자 크기 데이터와 일치하며, 표면 전하는 제형화 직후에 고도로 양이온성인 + 33 mV에서 시작하여 2시간에 걸쳐 ― 30 mV로 변화된다. 이것은 다시 중성 아미드로 재배열되는 양이온성 암모늄 모이어티와 일치하며, 회합된 올리고뉴클레오티드로 인해 표면이 주로 음이온성으로 남아있다.입자 크기는 카고-의존적이 아니었다. eGFP 길이(Fluc = 1929ntvs.eGFP = 996nt)의 2배 이상인 루시퍼라제(Fluc) mRNA로 폴리플렉스를 형성하고, pH 7.4에서 세포 배지에 첨가한 경우, 입자는 동일한 거동을 나타내었는데, 273 nm에서 시작하여 2시간의 기간에 걸쳐서 444 nm로 증가하였다. 이것은 동일한 CART로 다양한 올리고뉴클레오티드의 향후 전달이 가능함을 시사한다. mRNA 카고가 첨가되지 않은 경우, 올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) CART는 양친매성 구조로 인해 미셀을 형성하였다. 이러한 미셀은 비완충수에서 68 nm의 크기로 안정적으로 유지되었다. 그러나, 이러한 미셀을 세포 배지(pH 7.4)에 첨가한 경우, DLS로 특성규명될 수 없는 응집체가 빠르게 형성되었다. 단독-올리고머 단독(t1/2 = 2분), 올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르)미셀(30분 내에 500 nm 초과로 응집) 및 mRNA/CART 복합체(2시간 후 500 nm로 응집)에 대한 조합된 재배열 데이터는, mRNA와의 고분자전해질 복합체화가 수성 환경에서 α-아미노 에스테르 물질의 안정성을 증가시키고, 잠재적으로 탈양성자화 속도를 감소시켜 재배열함을 나타낸다. 이는 이러한 물질이 pH 7.4에서 치료 관련 시간 척도에서 분해되고, 비완충 조건에서 저장 및 제형화하기에 충분히 안정적인 것을 가능하게 한다.
첫째, 세포 진입 기전을 결정하기 위해 Cy5 표지된 eGFP mRNA를 사용하여 엔도시토시스 과정을 저해하는 것으로 알려진 조건인 4℃에서의 세포 흡수를 37℃에서의 정상적인 흡수와 비교하였다. HeLa 세포를 이러한 조건에서 처리한 경우, Cy5-mRNA 흡수의 상당한(85 %) 감소가 관찰되었다(도 10a). 이것은 250 nm 입자의 특징인 예상되는 엔도시토시스 기전과 일치한다.
올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) CART에 의한 자가-희생 방출 기전을 탐색하기 위해서, 7로의 처리로 인한 입자 흡수 및 유전자 발현을 mRNA 전달에 효과가 없는 양이온성 올리고머와 직접 비교하였다. eGFP mRNA 및 Cy5 표지된 eGFP mRNA의 혼합물을 전달함으로써, mRNA 내재화 및 유전자 발현을 디커플링시키고, 동시에 정량할 수 있고; Cy5 형광은 엔도좀 탈출 또는 방출에 관계없이 내재화된 mRNA를 나타내고, eGFP 형광은 mRNA의 세포질 방출을 나타내어 번역을 가능하게 한다. 본 발명자들은 이 방법을 사용하여 D13:A11 CART 7과 동일한 길이의 2개의 추가 양이온성 블록 코-올리고머를 준비함으로써 흡수 및 발현 모두에 대한 골격 구조 및 양이온 유형의 효과를 조사하였다.3개의 올리고머를, 세포 흡수 및 유전자 발현 둘 다에 대해서, 희생 암모늄-함유 CART(D13:A11 7), 비-전하-교체, 구아니디늄-함유 올리고머(D13:G12 13) 및 비-전하-교체, 암모늄-함유 올리고머(D13:Pip13 14)와 직접 비교하였다.
올리고머 7, 13 및 14를 Cy5-eGFP mRNA와 10:1(+/-) 비율로 혼합하고, 생성된 복합체를 HeLa 세포에 첨가하였다.Cy5 형광에 의해 정량화된 바와 같이, 모든 코-올리고머가 대략 유사한 수준의 mRNA 흡수를 제공하였지만(도 10b), 전하-교체 D13:A11 7만 검출 가능한 eGFP mRNA 발현을 초래한다.이 데이터는 모든 mRNA 복합체가 세포에 의해 효율적으로 내재화되지만, 빠르게 분해되는 골격이 없는 비-CART 복합체는 엔도좀을 탈출하지 않거나 세포질 eGFP 발현을 가능하게 하는 데 필요한 시간 척도로 mRNA를 방출하지 않음을 나타낸다.비-희생 암모늄-함유 올리고머인 D13:Pip13 14로 형성된 복합체에 의한 eGFP 발현의 결여는, 이러한 방출을 설명하는 것이 단순히 암모늄 양이온 대 구아니디늄 양이온의 정전기 결합 친화성의 차이가 아니라는 것을 추가로 나타낸다. 오히려, 양이온성 전하 및 소분자로의 재배열의 제어된 손실이 효능에 중요하다.
본 발명자들의 올리고(카르보네이트-b-α-아미노 에스테르) 물질로 관찰된 전하-교체 기전은 mRNA 결합을 중화시키고, HEGD 소분자의 형성을 촉발하여 엔도좀 탈출 및/또는 mRNA 방출을 용이하게 할 수 있다. 이 기전을 추가로 이해하기 위해서, HeLa 세포를 mRNA/CART 복합체와 엔도좀 미세 환경에 영향을 미치는 것으로 알려진 두 가지 화합물과 함께 처리하였다. 콘카나마이신 A(Con A)는 엔도좀 산성화를 저해하는 것으로 밝혀진 특이적 V-ATPase 저해제이다. 유전자 전달에 사용되는 다른 양이온성 암모늄-함유 물질은 양성자 스폰지 효과에 의한 엔도좀 완충 삼투성 파열의 감소로 인해 이것 또는 유사한 화합물과 함께 처리되는 경우 급격하게 감소된 세포질 올리고뉴클레오티드 농축 및 후속 유전자 발현을 나타낸다. 양이온성 지질 나노입자 및 PEI와 같은 화합물은 V-ATPase 저해제로 처리되는 경우 유전자 전달이 10 내지 200배 감소한 것으로 나타났지만, 본 발명자들의 α-아미노 에스테르 CART 7은 Con A 처리에 의해 거의 영향을 받지 않는다(도 10c, 21% 감소, p = 0.177). 이는 이 시스템으로 엔도좀 탈출 또는 유전자 발현을 달성하기 위해tj 엔도좀 산성화 및 완충이 필요하지 않음을 나타낸다. 클로로퀸(Chl)은 엔도좀 완충 및 파열을 증가시켜 유전자 전달을 증가시키는 데 사용되는 리소좀트로픽 작용제이다. 다른 발명자들은 메틸화 PEI와 같은 완충 기능을 포함하지 않는 유전자 전달 물질이 유전자 발현에서 상당한 증가(2 내지 3배)를 보이는 반면 PEI와 같은 완충 벡터는 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다. 본 발명자들의 CART는 발현에서 약간의 감소(22% 감소, p = 0.469)만을 나타내었는데, 이는 올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) CART에 의한 mRNA 전달의 제한 요인이 아니라는 것을 나타내는데, 이는 아마도 삼투성 파열을 통한 효과적인 탈출이 해중합 및 HEGD(2) 형성의 결과로 이미 발생하기 때문일 것이다.
샘플 비효과적 전달 비히클(D12:G12, 13)과 비교한 올리고(에스테르-b-아미노 에스테르) CART에 의한 mRNA의 방출 및 엔도좀 탈출의 효과는, 수송체(부착된 단실 형광된 3 사용), Cy5-mRNA 및 테트라메틸로다민(TRITC)-Dextran4400의 검출 및 엔도좀 구획에 대한 염색과 함께 공초점 현미경으로 추가로 확인할 수 있다. CART(7)/Cy5-mRNA 복합체로 처리한 후 4시간 후에 세포를 영상화하는 경우, 수송체에 부착된 Cy5 신호 및 단실(3) 둘 다의 형광이 모두 자연적으로 주로 확산하는데, 이는 이러한 물질이 엔도좀을 성공적으로 탈출하여, 나노입자 복합체로부터 분리되었다는 것을 나타낸다(도 10d, i). 단실 신호(도 10d, ii)에서 관찰된 점은 방출된 지질 블록의 일부 세포내 응집물에서 발생하는 것일 것이다. TRITC로부터의 신호는 또한 엔도좀이 파열되어, 포획된 덱스트란을 방출할 때 발생할 수 있는 상대적으로 확산된 형광을 나타낸다. 그러나, 세포를 비-희생 D:G(13)/Cy5-mRNA 복합체로 처리한 경우, Cy5 및 단실 형광은 둘 다 매우 점상 상태이고, 공동 국지화되었다(도 10d, iii). 이 형광은 추가적으로 점상 TRITC-Dextran4400과의 강한 중첩을 보여주며, 이는 지속적인 엔도좀 포획을 나타낸다. 종합하면, 이러한 데이터는 CART 7의 전하-교체 거동이 mRNA 전달에 대한 우수한 성능에 대한 책임이 있음을 강력하게 시사한다.
올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) D13:A11 7을 mRNA 전달을 위한 CART의 다양성을 조사하기 위해 추가 응용에서 평가하였다. CART, 7에 의한 전달 후 eGFP mRNA 발현을 전형적으로 형질주입이 어려운 것으로 간주되는 것을 포함하는 세포주 패널에서 검정하였다. 이전에 HeLa에서 수행된 최적화 실험 외에도, 0.125 μg/웰의 eGFP mRNA로 형성된 CART 복합체로 처리함으로써, CHO, HEK-293, 인간 간세포 암종(HepG2) 및 뮤린 대식세포 J774 세포에서 mRNA 발현을 Lipofectamine의 발현과 비교하였다(도 11a).시험된 모든 세포주에서, CART D13:A11 7을 사용한 형질주입 효율은 90% 초과인 반면, Lipofectamine은 22 내지 55%만 유도하였다. 이는 이러한 전달 시스템이 다양한 인간 및 비인간 세포주에 대해서 일반적임을 시사한다. D13:A11(7)은 파이어플라이 루시퍼라제(Fluc) mRNA의 전달에서 매우 효과적이고 실질적으로 Lipofectamine을 능가하기 때문에, CART-매개 전달은 상이한 세포주에서 뿐만 아니라 상이한 mRNA 길이에서도 일관된다(도 11b). eGFP mRNA에서 관찰된 경향과 유사하게, 10:1(+/-) 비율은 mRNA 길이 차이(1929 대 996 nt)에도 불구하고 가장 높은 수준의 Fluc 생물발광을 초래하였고, 이는 전달 효율이 mRNA 길이와 상당히 무관함을 나타낸다.
생물발광 영상화(BLI)는 살아있는 동물의 mRNA 전달, 발현 및 생체 분포를 정량하는 강력한 툴을 제공한다. 전신 및 국소 투여 경로 둘 다에서 CART-mRNA 복합체의 효능을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 BLI를 사용하여 마취된 BALB/c 마우스에서 CART-복합체 형성된 Fluc mRNA의 정맥내 및 근육내 주사를 평가하였다. 각각의 마우스에서 7.5 μg mRNA는 CART D13:A11 7과 복합체를 형성하였고, 75 μL PBS 중에서 넓적다리 근육에 근육 주사로 투여하였다.직접 대조군으로, 7.5 ug의 네이키드 mRNA를 반대쪽에 주사하였다.D-루시퍼린을 전신 투여하고, 주사 후 1시간에 시작하여 72시간에 걸쳐 루시퍼라제 발현을 평가하였다.mRNA가 D13:A11로 전달되었을 때, 주사 부위에서 높은 수준의 루시퍼라제 활성이 관찰되었다(도 11c, 도 11d).이 발현은 4시간에 피크였고, 72시간 후에도 여전히 관찰 가능하였다.그러나, 네이키드 mRNA는 모든 5마리 마우스에서 광자 플럭스에 의해 측정된 바와 같이 낮은 수준의 루시퍼라제 발현만을 제공하였다.
복합체가 동일한 용량으로 정맥내 꼬리 정맥 주사를 통해 투여된 경우, 본 발명자들은 주사 후 1시간만큼 빨리 강력한 복부 생물발광을 관찰하여, 4시간에 피크에 도달한 것을 관찰하였는데, 이는 본 발명자들의 복합체가 mRNA를 주로 국소화하여 높은 수준의 생물발광으로 비장에 전달한다는 것을 나타내며, 간에서도 높은 수준의 생물발광이 검출 가능하다(도 11e, 도 11f). 높은 수준의 발현은 24시간 동안 지속되었고, 48시간 후 생물발광은 검출 가능하였다. 이 발현은 주로 비장 및 간에 국한되어 있으며, 전체 복부 광 출력의 평균 23%는 전자에서 발생하고, 70%는 후자에서 발생한다. 네이키드 mRNA를 PBS 중에서 투여하는 경우 루시퍼라제 생물발광은 관찰되지 않았다. 주사된 모든 마우스에서, 주사 직후 또는 치료 후 몇 주 동안 독성이 관찰되지 않았다.
생체 내 여러 경로의 투여를 통해 기능성 mRNA를 전달하는 능력은 전달 기술에 매우 중요하다. 국소 근육 주사는 투여의 용이성 및 진피 및 근육 조직의 미경험 수지상 세포 및 항원 제시 세포에 접근할 수 있는 능력으로 인해 백신접종을 포함한 많은 요법에서 선호되는 투여 경로가 될 수 있다. 꼬리 정맥을 통한 mRNA 폴리플렉스 제형의 정맥 주사는 간, 림프절 및 비장과 같은 망상 내피 시스템을 따라 놓이는 특정 표적 또는 고형 종양의 표적화와 함께 전신 투여에 광범위하게 유용하다. 비장 국소화는 이러한 조직에서 높은 수준의 수지상 세포 및 기타 면역 세포로 인해 면역 요법과 관련된 향후 연구에서 특히 흥미롭다.간 국소화는 간 질환 치료에 활용될 수 있다.
메신저 RNA 치료제는 질환 치료를 변형시킬 수 있는 잠재력을 갖지만, mRNA를 사용하는 데 있어 중요한 기술적 도전은 안전하고 다양하며 효과적인 전달 방법을 개발하는 것이다. 본 발명자들은 우수한 효율성으로 mRNA를 세포와 동물에 효과적으로 전달하기 위해 전례없는 기전을 통해 작동하는 mRNA 전달을 위한 고유하고, 조정 가능하며, 단계-경제적인 전략을 개발하였다. 본 발명자들의 접근법은 올리고(카르보네이트-b-아미노 에스테르) 전달 비히클을 제조하기 위해서 OROP 및 포괄적인 탈보호를 사용하는 2-단계 공정을 사용한다. 세포내 전달 후, 이러한 전하-교체 물질은 현저한 분자내 재배열을 거치며, 그 동안 양이온성 아민이 중성 아미드로 전환되어 정전기적 복합체로부터 음이온성 mRNA를 방출하고, 번역을 위해서 핵산을 세포질로 배출한다. 이러한 CART를 사용한 mRNA 전달의 효과는 세포 및 동물 모두에서 기능성 단백질 발현을 초래하는 mRNA 전달을 위한 새로운 전략을 나타낸다.
실시예 12:
암을 치료하기 위한 mRNA 또는 DNA를 암호화하는 CAR의 생체내 전달
물질. 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, 달리 제시되지 않는 한 제공된 그대로 사용하였다. 1-(3,5-비스-트리플루오로메틸-페닐)-3-시클로헥실-티오우레아(1), 지질-작용화된 단량체(2,3) 및 Boc-모르폴리논 단량체(4)는 모두 문헌 절차에 따라서 제조하였다. 재생 셀룰로스 투석막(Spectra/Por 6 Standard RC; 분자량 컷 오프 1,000)은 Spectrum Laboratories, Inc.에서 구입하였다. Lipofectamine 2000은 Life Technologies에서 구입하였다. MTT는 Fluka에서 구입하였다.
mRNA. Fluc mRNA(5meC, Ψ, L-6107) 및 분비 알칼린 포스파타제(SEAP)(대조군 mRNA)는 Trilink BioTechnologies로부터 구입하였다. 모든 구입한 mRNA를 캡핑 및 폴리아데닐화하였고, 이것은 5-메톡시우리딘 변형을 함유한다.
CAR-19 작제물: mCD19_28_Z.1-3 서열을 pcDNA3.1(+) 플라스미드 내에 클로닝하여 인 하우스에서 CAR-19 mRNA를 생산하였다. 제조 프로토콜(New England biolabs)에 따라 NotI 제한 효소를 사용하여 플라스미드를 선형화하고, 후속 알코올 침전과 함께 페놀:클로로포름 추출을 사용하여 추출하였다. 이어서, INCOGNITO™ T7 ARCA 5mC- & Y-RNA 전사 키트(Cellscript)를 사용하여 선형화된 플라스미드로부터 mRNA를 전사하였다.
계측. BD LSRII.UV FACS 분석기(Stanford University Shared FACS Facility)에서 유세포 분석법 분석을 수행하였다. CCD 카메라(IVIS 100, Xenogen Corp.)를 사용하여 생물 발광을 측정하고 Living Image Software(PerkinElmer)를 사용하여 분석하였다.
세포주. A20 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI에서 유지시켰다. 비접착성 세포를 1% 폴리(비닐 알코올)(PVA)로 처리하여 접착을 예방하였다. 뮤린 일차 T 세포의 경우, 6 내지 8주량의 BALB/c 마우스의 비장으로부터 단일-세포 현탁액을 제조하였다. 이러한 현탁액으로부터, 접촉되지 않은 T 세포를 Pan T 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 단리하였다. 모든 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 대략 80% 컨플루언스로 계대시켰다.
혼합 지질 CART의 제조: 글로브 박스 내에서 N2 분위기 하에서 교반 막대가 장치된 오븐 건조된 1 dram 바이알에 MTColeyl(6 eq., 0.077 mmol, 31.1 mg) 및 TU(0.05eq., 0.0038 mmol, 1.4 mg)을 첨가하였다. 이것에 톨루엔(1 eq., 0.0128 mmol, 12.8 μL) 중의 1 M 용액으로서의 벤질 알코올, 그 다음 추가 134 μL의 톨루엔(1 M w.r.t. MBOC 단량체)를 첨가하였다. 이어서 촉매 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데스-7-엔(DBU)(1방울)을 용액에 첨가하고, 반응물을 글러브 박스에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때 MTCnonenyl(6 eq., 0.077 mmol, 21.7 mg)을 반응에 첨가하였다. 추가 1시간 동안 교반한 후, MBOC(12.66 eq., 0.123 mmol, 27 mg)를 반응에 첨가하고, 추가 4시간 동안 교반한 후, 벤조산으로 반응정지시켰다. 반응을 메탄올(1.0 kDa 투석 백)에서 밤새 투석하였다. 농축은 보호된 코-올리고머 S9를 투명한 오일로 제공하였다. 중합도는 THF에서 GPC에 의한 분산도 및 1H NMR 말단기 분석에 의해서 결정하였다. N2 하에서 실온에서 밤새 DCM 중의 10% TFA에서 후속 탈보호는 CART O5-b-N6:A9(9)를 제공하였다. 완전한 보호기 제거는 1H NMR(CD3OD)에 의해 확인하였다.
생체내 mRNA 전달 및 유세포 분석법. CART-mRNA 폴리플렉스를 마우스당 5 μg의 mRNA를 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 총 부피 100 μL로 제조하였다. 복합체를 20초 동안 혼합하였고, 그 후 암컷 BALB/c 마우스의 꼬리 정맥에 i.v. 주사하였다. Fluc 발현의 경우: 7시간 후, 150 mg/kg D-루시퍼린을 i.p. 주사하고, IVIS Imaging System CCD 카메라를 사용하여 발광을 측정하고, 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 비장 세포로부터 T 세포를 단리하기 위해서, 동물을 죽이고, 70 μm 세포 스트레이너를 통해 비장을 통과시킨 다음 ACK Lysing Buffer로 혈액 세포를 용해시키고, PBS로 2회 세척하여 단일 세포 현탁액을 준비하였다. T 세포를 제조 프로토콜에 따라서 pan T 세포 단리 키트(Miltney Biotec)를 사용하여 단리하였다. CAR19 mRNA-CART 처리 후 비장세포에서 CAR19 발현을 위해, 비장 세포를 2개의 염색 군으로 나누고, CD8(APC), CD4(PE) 및 B220(PerCp) 또는 CD49d(APC)에 대한 형광 항체를 염색하였다. CAR19 작제물을 FITC에 접합된 마우스 항-래트 카파 쇄 항체를 사용하여 검출하였다. 분석은 Pacific Blue 채널을 사용하여 LSR-II.UV(BD Biosciences)에서 수행하였다. 실험 프로토콜을 실험실 동물 관리에 관한 스탠포드 행정 패널에 의해 승인받았다.
생체내 생물발광. 생물발광 평가를 위해, 마우스를 주사 및 영상화 절차 동안 이소플루란 가스(산소 중의 2% 이소플루란, 1 l/분)로 마취시켰다. d-Luciferin(Biosynth AG)의 i.p. 주사를 150 mg/kg의 용량으로 수행하여, Fluc 효소에 대한 포화 기질 농도를 제공하였다(루시퍼린은 혈액 뇌 장벽을 통과함). 마우스를 냉각된 전하-결합 장치 카메라가 장착된 생체내 광학 이미징 시스템(IVIS 100; Xenogen Corp.)을 사용하여 광-기밀 챔버에서 영상화하였다. 영상을 기록하는 동안, 마우스는 노우즈 콘(nose cone)을 통해 전달되는 이소플루오란을 흡입하였으며, 카메라 시스템의 어두운 상자에서 체온을 37℃로 유지하였다. 루시퍼린 투여 후 10분 내지 20분 사이에 생물발광 영상을 획득하였다. 마우스는 일반적으로 영상 촬영 후 2분 이내에 마취에서 회복되었다.
마우스 및 세포주. 8 내지 12주령의 암컷 Balb/c 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하여 Stanford University Medical Center의 실험실 동물 시설에 두었다. 모든 실험은 실험실 동물 관리에 관한 스탠포드 행정 패널의 승인을 받았으며, 스탠포드 대학 동물 시설 및 NIH 지침에 따라 수행되었다.
CAR19 mRNA-CART를 사용하여 확립된 종양의 종양내 치료. CD19 발현 종양을 복부 우측에 피하로 이식하였다. 치료는 종양이 최대 직경 7 mm 내지 10 mm에 도달했을 때 시작되었다. 5 ug CAR19 mRNA-CART를 종양 내에 종양내로 주입하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼(Mitutoyo)로 2 내지 3일마다 모니터링하고, 부피(길이×너비×높이)로 나타내었다. 종양 크기가 지침에 따라 가장 큰 직경이 1.5 cm에 도달하면 마우스를 희생시킨다.
CAR19 mRNA-CART를 사용한 확립된 CD19 발현 및 CD19 음성 종양의 IV 처리. CD19 발현 및 CD19 음성 종양을 복부 우측에 피하로 이식하였다. 치료는 종양이 최대 직경 7 mm 내지 10 mm에 도달했을 때 시작되었다. 5 ug CAR19 mRNA-CART를 정맥내로 주입하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼(Mitutoyo)로 2 내지 3일마다 모니터링하고, 부피(길이×너비×높이)로 나타내었다. 종양 크기가 지침에 따라 가장 큰 직경이 1.5 cm에 도달하면 마우스를 희생시킨다.
통계 분석. Prism 소프트웨어(GraphPad; 미국 캘리포니아주 라 욜라 소재)를 사용하여 종양 성장을 분석하고, 비모수 Mann-Whitney U 검정을 적용하여 군 간 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다. Kaplan-Meier 방법을 생존 분석에 사용하였다.
실시예 13:
암을 치료하기 위한 mRNA 또는 DNA의 키메라 항원 수용체(CAR)의 생체내 전달
CAR-T 세포 요법은 암 치료제에 혁명을 일으켰다. CAR-T 세포 요법의 성과: 대부분의 다른 요법이 실패한 곳에서 CAR T 세포는 성공하였다. 매우 효과적이고 신속하며 오래 지속되는 항-종양 반응; 항-CD19 CAR T 세포를 사용한 매우 높은 반응률, B-ALL의 경우 약 90%, 림프종의 경우 약 80%. 현재 시장: 림프종의 경우 Yescarta(Axicabtagene Ciloleucel) 및 Kymriah(tisagenlecleucel)의 비용은 $ 373,000이고, 백혈병의 경우 Kymriah(tisagenlecleucel)는 $ 475,000이다.
CAR-T 세포 치료의 한계 및 단점. 기술적 제약: 생산에 오랜 시간이 걸림: 전형적으로 CAR T 세포 제품에 따라 대략 2 내지 6주; T 세포의 조작 및 배양이 매우 고비용임. 환자 측면: 활성 성장 공격성 암 환자를 위한 상당한 대기 기간이 뒤따르는 채집술(면역 세포가 수집되는 과정)이 필요하고; 환자는 CAR T 세포가 효과적일 수 있도록 림프 고갈에 대한 화학요법을 제공받아야 하고; 이러한 화학요법은 면역 체계에 손상을 일으켜 심각한 감염 위험을 증가시키고; 투여 후 환자의 신체에서 신속하게 확장되는 CAR T 세포는 종종 생명을 위협하는 부작용을 일으키고; 이러한 신속한 확장은 제어하기 어려울 수 있다.
인 시추 CAR-T 세포 프로그래밍은 훨씬 더 양호한 전략이다. CART는 비장을 표적으로 하기 때문에, 본 발명자들은 CAR로 프로그래밍할 T 세포에 직접 접근할 수 있다.
개요/청구. CART는 mRNA를 림프구에 효과적으로 전달하여 기능성 CAR-19 단백질을 발현하고; 중요하게는 본 발명자들은 T 세포에 제한되지 않고, 다른 세포가 CAR을 발현한다. CAR-19 mRNA로 CART를 I.V. 주사하는 것은 단 한 번의 투여 후 종양 부담을 줄이는 데 매우 효과적이다. 환자별 맞춤화가 필요하지 않다. 다중 CAR 특이성을 단일 용량으로 혼합할 수 있다. 시토카인을 암호화하는 mRNA와 같은 mRNA를 암호화하는 추가 단백질은 치료 효과를 조절하기 위해 CAR 작제물과 쉽게 공동 제형화될 수 있다. mRNA를 암호화하는 IL1 수용체 길항제와 같은 항-염증 단백질은 시토카인 방출 증후군과 같은 부작용을 완화하기 위해 CAR 작제물과 함께 공동 제형화 될 수 있다. 오프 더 쉘프 제품(Off the shelf product). 환자에게 즉시 제공된다. 복잡하고 값비싼 세포 배양 시설이 필요하지 않은 "믹스 앤드 슛(Mix and Shoot)"전략. 1회 용량으로 제한되지 않지만, 바람직하지 않은 효과가 달성될 때까지 반복될 수 있다. 25일 후 100% 생존(전체 대조군 sac. 15 일에). CAR-T 세포의 생체내 프로그래밍 mRNA은 전례가 없다. 이것은 이미 혁신적인 요법을 상당히 가속화할 수 있다.
실시예 14
물질 및 방법
물질. 시약은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였고, 달리 제시되지 않는 한 제공된 그대로 사용하였다. 1-(3,5-비스-트리플루오로메틸-페닐)-3-시클로헥실-티오우레아(1), 지질-작용화된 단량체(2,3) 및 Boc-모르폴리논 단량체(4)는 모두 문헌 절차에 따라서 제조하였다. 재생 셀룰로스 투석막(Spectra/Por 6 Standard RC; 분자량 컷 오프 1,000)은 Spectrum Laboratories, Inc.에서 구입하였다. Lipofectamine 2000은 Life Technologies에서 구입하였다. MTT는 Fluka에서 구입하였다.
mRNA. Fluc mRNA(5meC, Ψ, L-6107) 및 분비 알칼린 포스파타제(SEAP)(대조군 mRNA)는 Trilink BioTechnologies로부터 구입하였다. 모든 구입한 mRNA를 캡핑 및 폴리아데닐화하였고, 이것은 5-메톡시우리딘 변형을 함유한다.
CAR-19 작제물:
mCD19_28_Z.1-3 서열을 pcDNA3.1(+) 플라스미드 내에 클로닝하여 인 하우스에서 CAR-19 mRNA를 생산하였다. 제조 프로토콜(New England biolabs)에 따라 NotI 제한 효소를 사용하여 플라스미드를 선형화하고, 후속 알코올 침전과 함께 페놀:클로로포름 추출을 사용하여 추출하였다. 이어서, INCOGNITO™ T7 ARCA 5mC- & Y-RNA 전사 키트(Cellscript)를 사용하여 선형화된 플라스미드로부터 mRNA를 전사하였다.
계측. BD LSRII.UV FACS 분석기(Stanford University Shared FACS Facility)에서 유세포 분석법 분석을 수행하였다. CCD 카메라(IVIS 100, Xenogen Corp.)를 사용하여 생물 발광을 측정하고 Living Image Software(PerkinElmer)를 사용하여 분석하였다.
세포주. A20 세포를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI에서 유지시켰다. 비접착성 세포를 1% 폴리(비닐 알코올)(PVA)로 처리하여 접착을 예방하였다. 뮤린 일차 T 세포의 경우, 6 내지 8주량의 BALB/c 마우스의 비장으로부터 단일-세포 현탁액을 제조하였다. 이러한 현탁액으로부터, 접촉되지 않은 T 세포를 Pan T 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotec GmbH)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 단리하였다. 모든 세포를 5% CO2 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. 세포를 대략 80% 컨플루언스로 계대시켰다.
0.077 mmol, 31.1 mg) 및 TU(0.05eq., 0.0038 mmol, 1.4 mg). 이것에 톨루엔(1 eq., 0.0128 mmol, 12.8 μL) 중의 1 M 용액으로서의 벤질 알코올, 그 다음 추가 134 μL의 톨루엔(1 M w.r.t. MBOC 단량체)를 첨가하였다. 이어서 촉매 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운데스-7-엔(DBU)(1방울)을 용액에 첨가하고, 반응물을 글러브 박스에서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 이때 MTCnonenyl(6 eq., 0.077 mmol, 21.7 mg)을 반응에 첨가하였다. 추가 1시간 동안 교반한 후, MBOC(12.66 eq., 0.123 mmol, 27 mg)를 반응에 첨가하고, 추가 4시간 동안 교반한 후, 벤조산으로 반응정지시켰다. 반응을 메탄올(1.0 kDa 투석 백)에서 밤새 투석하였다. 농축은 보호된 코-올리고머 S9를 투명한 오일로 제공하였다. 중합도는 THF에서 GPC에 의한 분산도 및 1H NMR 말단기 분석에 의해서 결정하였다. N2 하에서 실온에서 밤새 DCM 중의 10% TFA에서 후속 탈보호는 CART O5-b-N6:A9(9)를 제공하였다. 완전한 보호기 제거는 1H NMR(CD3OD)에 의해 확인하였다.
생체내 mRNA 전달 및 유세포 분석법 CART-mRNA 폴리플렉스를 마우스당 5 μg의 mRNA를 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 총 부피 100 μL로 제조하였다. 복합체를 20초 동안 혼합하였고, 그 후 암컷 BALB/c 마우스의 꼬리 정맥에 i.v. 주사하였다. Fluc 발현의 경우: 7시간 후, 150 mg/kg D-루시퍼린을 i.p. 주사하고, IVIS Imaging System CCD 카메라를 사용하여 발광을 측정하고, 리빙 이미지 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 비장 세포로부터 T 세포를 단리하기 위해서, 동물을 죽이고, 70 μm 세포 스트레이너를 통해 비장을 통과시킨 다음 ACK Lysing Buffer로 혈액 세포를 용해시키고, PBS로 2회 세척하여 단일 세포 현탁액을 준비하였다. T 세포를 제조 프로토콜에 따라서 pan T 세포 단리 키트(Miltney Biotec)를 사용하여 단리하였다. CAR19 mRNA-CART 처리 후 비장세포에서 CAR19 발현을 위해, 비장 세포를 2개의 염색 군으로 나누고, CD8(APC), CD4(PE) 및 B220(PerCp) 또는 CD49d(APC)에 대한 형광 항체를 염색하였다. CAR19 작제물을 FITC에 접합된 마우스 항-래트 카파 쇄 항체를 사용하여 검출하였다. 분석은 Pacific Blue 채널을 사용하여 LSR-II.UV(BD Biosciences)에서 수행하였다. 실험 프로토콜을 실험실 동물 관리에 관한 스탠포드 행정 패널에 의해 승인받았다.
생체내 생물발광
d-Luciferin(Biosynth AG)의 i.p. 주사를 150 mg/kg의 용량으로 수행하여, Fluc 효소에 대한 포화 기질 농도를 제공하였다(루시퍼린은 혈액 뇌 장벽을 통과함). 마우스를 냉각된 전하-결합 장치 카메라가 장착된 생체내 광학 이미징 시스템(IVIS 100; Xenogen Corp.)을 사용하여 광-기밀 챔버에서 영상화하였다. 영상을 기록하는 동안, 마우스는 노우즈 콘(nose cone)을 통해 전달되는 이소플루오란을 흡입하였으며, 카메라 시스템의 어두운 상자에서 체온을 37℃로 유지하였다. 루시퍼린 투여 후 10분 내지 20분 사이에 생물발광 영상을 획득하였다. 마우스는 일반적으로 영상 촬영 후 2분 이내에 마취에서 회복되었다.
마우스 및 세포주
8 내지 12주령의 암컷 Balb/c 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하여 Stanford University Medical Center의 실험실 동물 시설에 두었다. 모든 실험은 실험실 동물 관리에 관한 스탠포드 행정 패널의 승인을 받았으며, 스탠포드 대학 동물 시설 및 NIH 지침에 따라 수행되었다.
CAR19 mRNA-CART를 사용하여 확립된 종양의 종양내 치료.
CD19 발현 종양을 복부 우측에 피하로 이식하였다. 치료는 종양이 최대 직경 7 mm 내지 10 mm에 도달했을 때 시작되었다. 5 ug CAR19 mRNA-CART를 종양 내에 종양내로 주입하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼(Mitutoyo)로 2 내지 3일마다 모니터링하고, 부피(길이×너비×높이)로 나타내었다. 종양 크기가 지침에 따라 가장 큰 직경이 1.5 cm에 도달하면 마우스를 희생시킨다.
CAR19 mRNA-CART를 사용한 확립된 CD19 발현 및 CD19 음성 종양의 IV 처리.
CD19 발현 및 CD19 음성 종양을 복부 우측에 피하로 이식하였다. 치료는 종양이 최대 직경 7 mm 내지 10 mm에 도달했을 때 시작되었다. 5 ug CAR19 mRNA-CART를 정맥내로 주입하였다. 종양 크기는 디지털 캘리퍼(Mitutoyo)로 2 내지 3일마다 모니터링하고, 부피(길이×너비×높이)로 나타내었다. 종양 크기가 지침에 따라 가장 큰 직경이 1.5 cm에 도달하면 마우스를 희생시킨다.
통계 분석.
Prism 소프트웨어(GraphPad; 미국 캘리포니아주 라 욜라 소재)를 사용하여 종양 성장을 분석하고, 비모수 Mann-Whitney U 검정을 적용하여 군 간 차이의 통계적 유의성을 결정하였다. 0.05 미만의 P 값은 유의한 것으로 간주되었다. Kaplan-Meier 방법을 생존 분석에 사용하였다.
실시예 15:
전하 교체 방출 가능성 수송체(CART)를 사용한 효과기 세포를 생성하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 인 시추 생성
CART를 사용한 생체내 CAR19 mRNA 요법.
개념. CAR-암호화 유전자는 잠재적으로 다수의 유전자를 암호화할 수 있는 mRNA 및/또는 DNA를 사용하여 세포 내에서 생체 내에서 발현된다. 이 방법을 사용하면, 유전 공학을 환자의 신체 외부에서 수행할 필요가 없으며, 환자로부터 세포를 채취할 필요가 없고, 환자 세포의 값비싼 수송이 필요하지 않다. 본 명세서에 기재된 CART 전달 시스템은 제형화가 용이하고, 생체내에서 강력한 mRNA 발현을 제공하며, 비면역원성(비-바이러스성)이다. 중요하게는, 시스템은 도 25의 개략도에 도시된 바와 같이 생체내에서 mRNA(일시적) 및 DNA(안정적) 모두를 전달하고 발현할 수 있다.
결과. 원리 검증 연구는 도 26에 도시된 바와 같이 항-마우스 CD19 및 항-인간 CD19 CAR을 암호화하는 CART-전달 mRNA로 완결되었다. 이중 표적 접근법, 즉, 신세대의 CAR(Loaded/Armored CAR, TRUCKS)의 발현, 및 표면 또는 분비 분자를 암호화하고, 효과기 기능을 향상시키고, 유해 효과를 감소시키고, CAR 억제를 저해하는 mRNA의 공동 전달을 포함하는 새로운 전략이 CART를 사용한 생체내 mRNA 요법 내에서 추구될 것이다.
"전신" 투여 시 CART는 카고를 백혈구 및 단핵구에 전달한다.
본 출원인은 CD19 발현 표적 세포를 사멸시키는 데 관여하는 세포를 평가하였다. 결과는, 도 30c에 도시된 바와 같이 관찰된 효과가 T 세포 의존적이 아님을 보여준다. 연장된 전체 생존은 CD4, CD8 및 CD4+CD8 T 세포가 고갈되더라도 CAR19 mRNA-CART 처리된 동물에서 여전히 관찰된다. CART는 생체내에서 대식세포 및 B 세포를 형질주입시켰고, 결과는 CAR-19 작제물이 형질주입된 T 세포 이외의 백혈구가 CD-19+ 세포를 사멸시킨다는 것을 나타낸다. CAR19 mRNA-CART로 처리된 단리된 대식세포 및 미경험 B 세포는 도 30a 및 도 30b에 나타낸 바와 같이 CD19 발현 표적 세포를 사멸시키는데, 따라서 이는 세포 사멸이 생체내 CAR-T 세포 기동이 아님을 입증한다. 이러한 결과는 CAR-T, CAR-B, CAR-Mac 및 가능한 CAR-NK가 표적 세포를 사멸시킬 수 있음을 나타낸다.
인간 PBMC에서 CART-mRNA 인간화 CAR-19 요법은 인간 임상 시험에서 관찰된 네이티브 B 세포의 예상되는 사멸을 나타낸다.
인간 임상 시험에서, 효과적인 CAR T 세포 요법은 네이티브 CD19 발현 세포(B 세포 무형성)를 사멸시키는 표적외 효과를 초래한다. CART-mRNA CAR19가 인간 PBMC에 전달될 때, 본 출원인은 CD19 발현 세포의 임상적으로 예상되는 고갈을 관찰하였다. CAR19를 발현하는 순환 세포의 증가된 수준은 더 낮은 수준의 B- 세포와 관련이 있다. 살아남은 B 세포는 전형적으로 사멸된 B 세포보다 적은 CD19를 발현한다. 인간 CAR-19는, PBMC에서 B-세포를 제거하는 반면, 비-CD19 표적화 mRNA는 도 31a 내지 도 31c에 제시된 바와 같이 B-세포에 영향을 미치지 않는다.
요약: CAR을 위한 CART
CAR-T 세포 요법은 이미 암 치료 혁명에 대한 놀라운 가능성을 보여주었지만, 현재의 제조 공정은 비용, 시간, 공급 및 규모를 포함한 수많은 한계를 갖는다. CART-CAR-mRNA의 전신 전달을 사용하는 면역 세포의 인 시추/생체내 프로그래밍은 이러한 많은 문제를 해결한다. 예를 들어, CART를 사용한 CAR-mRNA 전달은 여러 단백질의 패키징을 허용하므로, CAR은 혁신적이고 개선된 버전의 CAR뿐만 아니라 다른 면역조절 성분으로 조정될 수 있다. 또한, mRNA를 암호화하는 CAR-19의 전신 전달은 효과적으로, 특이적으로, 그리고 치료적으로 CD19 발현 종양을 표적으로 한다. 중요하게는, mRNA에 의해 생산된 CAR은 일시적이며, 반복적인 투여에 의해 재생될 수 있다는 것이다. 본 명세서에 기재된 실험은 모델 시스템 종양이 CD 19+ 또는 CD 19-인 것으로 엄격하게 제시되었음을 입증한다. CAR은 T 세포, B 세포, 대식세포, NK 세포에 의해 발현된다. T- 세포는 종양을 사멸시키는 데 필요하지 않기 때문에, CAR-19 발현 B-세포, 대식세포 및 NK 세포가 또한 치료적으로 관련이 있다. 마지막으로, 본 출원인은 인간 세포로의 CAR-19 mRNA의 생체외 CART 전달이 CD19 발현 인간 세포를 사멸시키는 것을 입증하는데, 이는 이의 치료 효능을 확인해 준다.
참고문헌
Dove AP, Pratt RC, Lohmeijer BGG, Waymouth RM, Hedrick JL (2005) Thiourea-based bifunctional organocatalysis: Supramolecular recognition for living polymerization. J Am Chem Soc 127:13798―13799.
McKinlay CJ, et al. (2017) Charge-altering releasable transporters (CARTs) for the delivery and release of mRNA in living animals. Proc Natl Acad Sci USA 114: E448―E456.
Geihe EI, et al. (2012) Designed guanidinium-rich amphipathic oligocarbonate molecular transporters complex, deliver and release siRNA in cells. Proc Natl Acad Sci USA 109:13171―13176.
Blake TR, Waymouth RM (2014) Organocatalytic ring-opening polymerization of morpholinones: New strategies to functionalized polyesters. J Am Chem Soc 136: 9252―9255.
비공식 서열 목록
서열번호 1
CAR cDNA 서열
ATGTATCGCATGCAGCTGCTGAGCTGCATTGCGCTGAGCCTGGCGCTGGTGACCAACAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCGCTTCTCTGAGCACATCCCTGGGCGAGACCGTGACAATCCAGTGCCAGGCTAGCGAGGATATCTACTCCGGCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACGGAGCTTCCGACCTGCAGGATGGAGTGCCTTCTAGGTTCTCTGGAAGCGGCTCCGGAACCCAGTACTCTCTGAAGATCACCAGCATGCAGACAGAGGACGAGGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGGGACTGACCTACCCAAGAACATTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGCTGAAGGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAACCTCCGTGAAGCTGTCTTGTAAGGTGAGCGGCGACACCATCACATTCTACTACATGCACTTTGTGAAGCAGAGGCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGAATCGACCCAGAGGATGAGTCCACAAAGTACTCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACCCTGACAGCTGATACCAGCTCCAACACAGCTTACCTGAAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCACATACTTCTGCATCTACGGAGGCTACTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTGATGGTGACAGTGTCCTCTATCGAGTTTATGTACCCCCCTCCATACCTGGACAACGAGAGATCCAACGGCACCATCATCCACATCAAGGAGAAGCACCTGTGCCACACACAGAGCTCCCCAAAGCTGTTCTGGGCTCTGGTGGTGGTGGCTGGCGTGCTGTTTTGCTACGGACTGCTGGTGACCGTGGCCCTGTGCGTGATCTGGACAAACAGCAGGAGAAACCGGGGAGGCCAGTCCGATTACATGAACATGACCCCACGGCGCCCTGGACTGACAAGGAAGCCATACCAGCCATACGCTCCTGCTCGCGACTTCGCTGCTTACAGGCCAAGAGCCAAGTTCAGCAGGAGCGCCGAGACCGCTGCTAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTGTTCAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTTTGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCTCAGGAGGGCGTGTACAACGCCCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACTCTGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTTCCAGGGACTGAGCACCGCCACAAAGGACACCTTTGATGCTCTGCACATGCAGACACTGGCCCCTCGGTGA
서열번호 2
T7 중합효소 프로모터 부위 및 AflIII 제한 부위를 갖는 CAR cDNA:
TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGGCCACCATGTATCGCATGCAGCTGCTGAGCTGCATTGCGCTGAGCCTGGCGCTGGTGACCAACAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCGCTTCTCTGAGCACATCCCTGGGCGAGACCGTGACAATCCAGTGCCAGGCTAGCGAGGATATCTACTCCGGCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACGGAGCTTCCGACCTGCAGGATGGAGTGCCTTCTAGGTTCTCTGGAAGCGGCTCCGGAACCCAGTACTCTCTGAAGATCACCAGCATGCAGACAGAGGACGAGGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGGGACTGACCTACCCAAGAACATTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGCTGAAGGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAACCTCCGTGAAGCTGTCTTGTAAGGTGAGCGGCGACACCATCACATTCTACTACATGCACTTTGTGAAGCAGAGGCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGAATCGACCCAGAGGATGAGTCCACAAAGTACTCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACCCTGACAGCTGATACCAGCTCCAACACAGCTTACCTGAAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCACATACTTCTGCATCTACGGAGGCTACTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTGATGGTGACAGTGTCCTCTATCGAGTTTATGTACCCCCCTCCATACCTGGACAACGAGAGATCCAACGGCACCATCATCCACATCAAGGAGAAGCACCTGTGCCACACACAGAGCTCCCCAAAGCTGTTCTGGGCTCTGGTGGTGGTGGCTGGCGTGCTGTTTTGCTACGGACTGCTGGTGACCGTGGCCCTGTGCGTGATCTGGACAAACAGCAGGAGAAACCGGGGAGGCCAGTCCGATTACATGAACATGACCCCACGGCGCCCTGGACTGACAAGGAAGCCATACCAGCCATACGCTCCTGCTCGCGACTTCGCTGCTTACAGGCCAAGAGCCAAGTTCAGCAGGAGCGCCGAGACCGCTGCTAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTGTTCAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTTTGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCTCAGGAGGGCGTGTACAACGCCCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACTCTGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTTCCAGGGACTGAGCACCGCCACAAAGGACACCTTTGATGCTCTGCACATGCAGACACTGGCCCCTCGGTGA
서열번호 3
T7 중합효소 프로모터 부위 및 AflIII 5` 및 BamHI 3`제한 부위, 2xb-글로빈 3` UTR 영역 및 120 폴리 A 테일을 갖는 CAR cDNA:
TAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGGCCACCATGTATCGCATGCAGCTGCTGAGCTGCATTGCGCTGAGCCTGGCGCTGGTGACCAACAGCGACATCCAGATGACCCAGTCCCCCGCTTCTCTGAGCACATCCCTGGGCGAGACCGTGACAATCCAGTGCCAGGCTAGCGAGGATATCTACTCCGGCCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCTGGAAAGTCTCCCCAGCTGCTGATCTACGGAGCTTCCGACCTGCAGGATGGAGTGCCTTCTAGGTTCTCTGGAAGCGGCTCCGGAACCCAGTACTCTCTGAAGATCACCAGCATGCAGACAGAGGACGAGGGCGTGTACTTCTGCCAGCAGGGACTGACCTACCCAAGAACATTTGGCGGAGGCACAAAGCTGGAGCTGAAGGGAGGAGGAGGCTCCGGCGGAGGAGGCTCTGGAGGAGGAGGCAGCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGAACCTCCGTGAAGCTGTCTTGTAAGGTGAGCGGCGACACCATCACATTCTACTACATGCACTTTGTGAAGCAGAGGCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGAAGAATCGACCCAGAGGATGAGTCCACAAAGTACTCTGAGAAGTTCAAGAACAAGGCCACCCTGACAGCTGATACCAGCTCCAACACAGCTTACCTGAAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAGGACACCGCCACATACTTCTGCATCTACGGAGGCTACTACTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTGATGGTGACAGTGTCCTCTATCGAGTTTATGTACCCCCCTCCATACCTGGACAACGAGAGATCCAACGGCACCATCATCCACATCAAGGAGAAGCACCTGTGCCACACACAGAGCTCCCCAAAGCTGTTCTGGGCTCTGGTGGTGGTGGCTGGCGTGCTGTTTTGCTACGGACTGCTGGTGACCGTGGCCCTGTGCGTGATCTGGACAAACAGCAGGAGAAACCGGGGAGGCCAGTCCGATTACATGAACATGACCCCACGGCGCCCTGGACTGACAAGGAAGCCATACCAGCCATACGCTCCTGCTCGCGACTTCGCTGCTTACAGGCCAAGAGCCAAGTTCAGCAGGAGCGCCGAGACCGCTGCTAACCTGCAGGACCCCAACCAGCTGTTCAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGAGAGGAGTTTGACGTGCTGGAGAAGAAGCGGGCTCGCGATCCCGAGATGGGAGGCAAGCAGCAGCGGCGCAGGAACCCTCAGGAGGGCGTGTACAACGCCCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCTTACTCTGAGATCGGCACCAAGGGAGAGAGACGGCGCGGCAAGGGACACGATGGCCTGTTCCAGGGACTGAGCACCGCCACAAAGGACACCTTTGATGCTCTGCACATGCAGACACTGGCCCCTCGGTGA
GGATCCgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcgctcgctttcttgctgtccaatttctattaaaggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagcatctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAA
특정 실시형태
실시형태 1
양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체로서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 포함하는, 세포-침투 복합체.
실시형태 2
실시형태 1에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하는, 세포-침투 복합체.
실시형태 3
실시형태 2에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
R1-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2]z5
(식 중,
R1은 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태 4
실시형태 3에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00111
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2를 갖고,
R2는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태 5
실시형태 4에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 6
실시형태 4에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 세포-침투 복합체.
실시형태 7
실시형태 4에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 8
실시형태 4에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 세포-침투 복합체.
실시형태 9
실시형태 4에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00112
.
실시형태 10
실시형태 4에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00113
.
실시형태 11
실시형태 4에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00114
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 실시형태 4에 정의된 바와 같은 CART임).
실시형태 12
실시형태 4에 있어서, L1 ―CH2-O-는 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌인, 세포-침투 복합체.
실시형태 13
실시형태 4에 있어서, L1 ―CH2-O-는
Figure pct00115
,
Figure pct00116
, 또는
Figure pct00117
인, 세포-침투 복합체.
실시형태 14
실시형태 4에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 세포-침투 복합체.
실시형태 15
실시형태 4에 있어서, z5는 1 또는 3인, 세포-침투 복합체.
실시형태 16
실시형태 4에 있어서, z5는 1인, 세포-침투 복합체.
실시형태 17
실시형태 4에 있어서, z5는 3인, 세포-침투 복합체.
실시형태 18
실시형태 4에 있어서, R2는 수소인, 세포-침투 복합체.
실시형태 19
실시형태 3에 있어서, L2는 결합인, 세포-침투 복합체.
실시형태 20
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00118
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 21
실시형태 20에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 세포-침투 복합체.
실시형태 22
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00119
(식 중,
n은 2 이상의 정수이고;
n1은 0 내지 50의 정수이고;
Z는 상기 친핵성 모이어티이고;
X1은 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 ―O- 또는 ―S-이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 23
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00120
(식 중,
n은 2 이상의 정수이고;
Z는 상기 친핵성 모이어티이고;
X1은 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 ―O- 또는 ―S-이고;
R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8 are 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 24
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00121
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 25
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00122
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 26
실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00123
(식 중, n은 2 이상의 정수이고;
n1은 0 내지 50의 정수이고;
X1은 결합, -O-, -NR5-, -C(R5)(R6)- 또는 -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 결합, -O-, -C(R9)(R10)- 또는 -C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-이고;
X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고;
X5는 친핵성 모이어티이고;
R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 27
실시형태 4에 있어서, Z는 -S-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이되, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 28
실시형태 23에 있어서, Z는 -S-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이되, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 29
실시형태 4에 있어서, Z는 하기인, 세포-침투 복합체.
Figure pct00124
,
(식 중,
X3은 C(R15) 또는 N이고;
X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고;
X5는 친핵성 모이어티이고;
R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19 are 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 30
실시형태 23에 있어서, Z는 하기인, 세포-침투 복합체.
Figure pct00125
,
(식 중,
X3은 C(R15) 또는 N이고;
X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고;
X5는 친핵성 모이어티이고;
R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19 are 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 31
실시형태 29에 있어서, X5는 -N+(R13)(H)-이되, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 32
실시형태 2에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00126
(식 중,
n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 33
실시형태 1에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)인, 세포-침투 복합체.
실시형태 34
나노입자 조성물로서, 실시형태 1에 따른 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는, 나노입자 조성물.
실시형태 35
하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체:
R1-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2]z5
(식 중,
R1은 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태 36
실시형태 1에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00127
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2를 갖고,
(식 중,
R2는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임)).
실시형태 37
핵산을 세포에 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 실시형태 1의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는, 방법.
실시형태 38
실시형태 37에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체를 상기 세포 내에서 분해시켜 분해 생성물을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 39
실시형태 38에 있어서, 상기 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진인, 방법.
실시형태 40
실시형태 37에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 방법.
실시형태 41
실시형태 40에 있어서, 상기 mRNA를 상기 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 42
실시형태 37에 있어서, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 증가되는, 방법.
실시형태 43
실시형태 37에 있어서, 하나 이상의 유전자 산물의 발현이 감소되는, 방법.
실시형태 44
실시형태 37에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
실시형태 45실시형태 37에 있어서, 상기 세포는 포유동물 또는 인간 세포인, 방법.
실시형태 46
실시형태 37에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
실시형태 47
실시형태 46에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
실시형태 48
실시형태 37에 있어서, 세포에서 유전자-편집을 유발하는, 방법.
실시형태 49
실시형태 48에 있어서, 상기 핵산은 하나 이상의 벡터를 포함하되, 상기 벡터는,
세포의 게놈 내에서 표적 서열과 혼성화하는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열, 및
Cas9 단백질을 암호화하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
상기 (a) 및 (b)는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 위치되는, 방법.
실시형태 50
실시형태 48에 있어서, 상기 핵산은 CRISPR RNA(crRNA)를 포함하는, 방법.
실시형태 51
실시형태 50에 있어서, 상기 crRNA는 제1 뉴클레오티드 서열의 동일한 벡터 내에 존재하는, 방법.
실시형태 52
실시형태 48에 있어서, 상기 핵산은 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA)를 포함하는, 방법.
실시형태 53
실시형태 52에 있어서, 상기 tracrRNA는 제2 뉴클레오티드 서열의 동일한 벡터 내에 존재하는, 방법.
실시형태 54
실시형태 48에 있어서, Cas9 단백질은 상기 세포에서의 발현을 위해서 코돈 최적화된, 방법.
실시형태 55
실시형태 48에 있어서, 상기 핵산은,
a) 트랜스포사제를 암호화하는 제1 뉴클레오티드 서열; 및
b) 트랜스포사제 인식 부위가 측접된 관심대상 유전자의 핵산 서열을 포함하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하되,
상기 (a) 및 (b)는 동일한 벡터 또는 상이한 벡터에 위치되는, 방법.
실시형태 56
실시형태 55에 있어서, 상기 트랜스포사제는 관심대상 게놈 서열을 인식하고, 절단하는, 방법.
실시형태 57
실시형태 55에 있어서, 관심대상 유전자의 핵산 서열은 세포의 게놈 내에 통합되는, 방법.
실시형태 58
실시형태 48에 있어서, 상기 게놈-편집은 DNA 결실, 유전자 파괴, DNA 삽입, DNA 역전, 점 돌연변이, DNA 대체, 넉인 및 넉아웃으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 59
실시형태 37에 있어서, 상기 방법은 줄기 세포의 유도를 유발하는, 방법.
실시형태 60
면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서,
유효량의 실시형태 1의 복합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 복합체는 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는, 방법.
실시형태 61
실시형태 60에 있어서, 질환은 감염 질환인, 방법.
실시형태 62
실시형태 60에 있어서, 질환은 암인, 방법.
실시형태 63
실시형태 60에 있어서, 대상체는 질환으로 이미 진단된, 방법.
실시형태 64
실시형태 60에 있어서, 대상체는 질환과 연관된 측정 가능한 증상을 갖지 않는, 방법.
실시형태 65
실시형태 60에 있어서, 대상체는 인간인, 방법.
실시형태 66
실시형태 60에 있어서, 실시형태 1의 복합체는 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 포함되는, 방법.
실시형태 67
실시형태 66에 있어서, 약제학적 조성물은 암 백신인, 방법.
실시형태 68
실시형태 67에 있어서, 대상체는 암을 갖지 않고, 암 백신은 대상체에서 면역 반응을 유도하여 암의 발생을 예방하는, 방법.
실시형태 69
실시형태 67에 있어서, 대상체는 암으로 진단되었고, 암 백신은 암을 치료하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는, 방법.
실시형태 70
실시형태 60에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)인, 방법.
실시형태 71
실시형태 60에 있어서, 상기 핵산은 대상체에서 하나 이상의 세포에 형질주입되는, 방법.
실시형태 72
실시형태 71에 있어서, 형질주입된 핵산은 대상체에서 항암 활성을 제공하는, 방법.
실시형태 73
실시형태 71에 있어서, 핵산은 암과 연관된 하나 이상의 펩티드를 암호화하는, 방법.
실시형태 74
실시형태 72에 있어서, 상기 항암 활성은 암 세포 수의 감소, 암 크기의 감소, 암 세포의 사멸, 전이의 감소 및/또는 저해 및 암 세포 성장 및/또는 증식의 감소로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
실시형태 75
실시형태 66에 있어서, 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 면역학적 아주반트를 포함하는, 방법.
실시형태 76
실시형태 60에 있어서, 방법은,
1종 이상의 약제학적 조성물을 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 추가적인 약제학적 조성물은 항암제 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 방법.
실시형태 77
양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체로서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인을 포함하는, 세포-침투 복합체.
실시형태 78
실시형태 77에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하는, 세포-침투 복합체.
실시형태 79
실시형태 78에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H (I)
(식 중,
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태 80
실시형태 77 내지 실시형태 79 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00128
(식 중,
n은 2 이상의 정수이고;
n1은 0 내지 50의 정수이고;
Z는 상기 친핵성 모이어티이고;
X1은 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 ―O- 또는 ―S-이고;
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 81
실시형태 77 내지 실시형태 80 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00129
(식 중,
n은 2 이상의 정수이고;
Z는 상기 친핵성 모이어티이고;
X1은 결합, -C(R5)(R6)-, -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-, -O-C(R5)(R6)-, 또는 -O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 ―O- 또는 ―S-이고;
R1.1, R1.2, R2.1, R2.2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8 are 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 82
실시형태 77 내지 실시형태 80 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00130
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 83
실시형태 77 내지 실시형태 82 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00131
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 84
실시형태 77 내지 실시형태 82 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00132
(식 중, n은 2 이상의 정수이고;
n1은 0 내지 50의 정수이고;
X1은 결합, -O-, -NR5-, -C(R5)(R6)- 또는 -C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-이고;
X2는 결합, -O-, -C(R9)(R10)- 또는 -C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-이고;
X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고;
X5는 친핵성 모이어티이고;
R1, R2, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R15, R16, R17, R18 및 R19는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 85
실시형태 77 내지 실시형태 80 중 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00133
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
실시형태 86
실시형태 85에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 세포-침투 복합체.
실시형태 87
실시형태 78 또는 79에 있어서, Z는 -S-, -S+R13-, -NR13-, 또는 -N+(R13)(H)-이되, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 88
실시형태 78 또는 79에 있어서, Z는 하기인, 세포-침투 복합체.
Figure pct00134
,
(식 중,
X3은 C(R15) 또는 N이고;
X4는 결합, -C(O)-, -P(O)(OR16)2-, -S(O)(OR17)2-, -C(R16)(R17)- 또는 -C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-이고;
X5는 친핵성 모이어티이고;
R13, R14, R15, R16, R17, R18 및 R19 are 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 89
실시형태 88에 있어서, X5는 -N+(R13)(H)-이되, R13은 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 세포-침투 복합체.
실시형태 90
실시형태 78 내지 89 중 하나에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00135
(식 중,
n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
실시형태 91
실시형태 77 내지 87 중 하나에 있어서, 상기 핵산은 mRNA, siRNA, pDNA, shRNA 또는 gDNA인, 세포-침투 복합체.
실시형태 92
나노입자 조성물로서, 실시형태 77 내지 91 중 하나에 따른 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는, 나노입자 조성물.
실시형태 93
하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체:
H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H (I)
(식 중,
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z1, z3 및 z4는 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고;
z2는 2 내지 100의 정수임).
실시형태 94
핵산을 세포에 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 실시형태 77 내지 90 중 어느 하나의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
실시형태 95
실시형태 94에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체를 상기 세포 내에서 분해시켜 분해 생성물을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 96
실시형태 95에 있어서, 상기 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진인, 방법.
실시형태 97
실시형태 94 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 방법.
실시형태 98
실시형태 97에 있어서, 상기 mRNA를 상기 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
실시형태 99
실시형태 94 내지 97 중 하나에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
실시형태 100
실시형태 99에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
P 실시형태
P 실시형태 1. 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체로서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하되,
상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 2. P 실시형태 1에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00136
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 3. P 실시형태 2에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 4. P 실시형태 2에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 5. P 실시형태 2에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 6. P 실시형태 2에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 7. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00137
.
P 실시형태 8. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00138
.
P 실시형태 9. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00139
,
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제2항에 정의된 바와 같은 CART임).
P 실시형태 10. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 11. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, z5는 1 또는 3인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 12. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, z5는 1인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 13. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, z5는 3인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 14. 실시형태 1 또는 2에 있어서, R2A는 수소인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 15. 실시형태 1 또는 2에 있어서, L2는 결합인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 16. P 실시형태 1에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00140
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
P 실시형태 17. P 실시형태 16에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 18. P 실시형태 16에 있어서, n은 7인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 19. P 실시형태 1 또는 2에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00141
,
(식 중,
n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 20. P 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00142
,
(식 중,
n21은 1 내지 100의 정수이고;
R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 21. 제20항에 있어서, n21은 5이고, R201 은 비치환된 C18 알켄일인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 22. P 실시형태 21에 있어서, 상기 비치환된 C18 알켄일은 올레일인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 23. P 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00143
,
(식 중,
n22는 1 내지 100의 정수이고;
R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 24. P 실시형태 23에 있어서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 25. P 실시형태 24에 있어서, 상기 비치환된 C9 알켄일은 노넨일인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
Figure pct00144
,
(식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
P 실시형태 27. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)인, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 28. P 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 서열을 포함하는, 세포-침투 복합체.
P 실시형태 29. 나노입자 조성물로서, P 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 따른 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는, 나노입자 조성물.
P 실시형태 30. P 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 복합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
P 실시형태 31. 핵산을 세포에 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 P 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나 중 어느 하나의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
P 실시형태 32. P 실시형태 31에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체를 상기 세포 내에서 분해시켜 분해 생성물을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
P 실시형태 33. P 실시형태 32에 있어서, 상기 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진인, 방법.
P 실시형태 34. P 실시형태 31에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 암호화하는 CAR을 포함하는, 방법.
P 실시형태 35. P 실시형태 34에 있어서, 상기 mRNA를 상기 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
P 실시형태 36. P 실시형태 35에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
P 실시형태 37. P 실시형태 35에 있어서, 상기 세포는 포유동물 또는 인간 세포인, 방법.
P 실시형태 38. P 실시형태 35에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
P 실시형태 39. P 실시형태 38에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
P 실시형태 40. P 실시형태 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포인, 방법.
P 실시형태 41. P 실시형태 35 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 방법.
P 실시형태 42. P 실시형태 35 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포인, 방법.
P 실시형태 43. 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 P 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 복합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
P 실시형태 44. P 실시형태 43에 있어서, 상기 면역 반응은 항암 면역 반응인, 방법.
P 실시형태 45. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나의 복합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
P 실시형태 46. P 실시형태 43 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 피하 주사를 포함하는, 방법.
P 실시형태 47. 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하고, 상기 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법.
P 실시형태 48. P 실시형태 47에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 49. P 실시형태 47 또는 48에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00145
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A를 갖고,
(식 중,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임)).
P 실시형태 50. P 실시형태 49에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
P 실시형태 51. P 실시형태 49에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
P 실시형태 52. P 실시형태 49에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
P 실시형태 53. P 실시형태 49에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 방법.
P 실시형태 54. P 실시형태 48 또는 49에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00146
P 실시형태 55. P 실시형태 48 또는 49에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00147
P 실시형태 56. P 실시형태 48 또는 49에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00148
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제4항에 정의된 바와 같은 CART임).
P 실시형태 57. P 실시형태 48 또는 49에 있어서, L1은 ―CH2-O-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌인, 방법.
P 실시형태 58. 실시형태 47 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00149
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
P 실시형태 59. P 실시형태 47에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 60. P 실시형태 47 또는 49에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00150
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
(식 중,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임)).
P 실시형태 61. P 실시형태 60에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
P 실시형태 62. P 실시형태 60에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
P 실시형태 63. P 실시형태 60에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
P 실시형태 64. P 실시형태 60에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 방법.
P 실시형태 65. P 실시형태 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00151
.
P 실시형태 66. P 실시형태 59 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00152
.
P 실시형태 67. P 실시형태 59 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00153
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 P 실시형태 4에 정의된 바와 같은 CART임).
P 실시형태 68. P 실시형태 59 내지 67 중 어느 하나에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 방법.
P 실시형태 69. P 실시형태 59 내지 67 중 어느 하나에 있어서, z5는 1 또는 3인, 방법.
P 실시형태 70. P 실시형태 59 내지 67 중 어느 하나에 있어서, z5는 1인, 방법.
P 실시형태 71. P 실시형태 59 내지 67 중 어느 하나에 있어서, z5는 3인, 방법.
P 실시형태 72. P 실시형태 59 내지 71 중 어느 하나에 있어서, R2A는 수소인, 방법.
P 실시형태 73. P 실시형태 59 내지 72 중 어느 하나에 있어서, L2는 결합인, 방법.
P 실시형태 74. P 실시형태 59 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00154
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
P 실시형태 75. P 실시형태 74에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 방법.
P 실시형태 76. P 실시형태 74에 있어서, n은 7인, 방법.
P 실시형태 77. P 실시형태 59 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00155
(식 중,
n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 78. P 실시형태 59 내지 77 중 어느 하나에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00156
(식 중,
n21은 1 내지 100의 정수이고;
R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 79. P 실시형태 78에 있어서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일인, 방법.
P 실시형태 80. P 실시형태 59 내지 77 중 어느 하나에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 방법:
Figure pct00157
(식 중,
n22는 1 내지 100의 정수이고;
R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 81. P 실시형태 80에 있어서, n22는 5 및 R202는 비치환된 C9 알켄일인, 방법.
P 실시형태 82. P 실시형태 47 내지 81항 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
P 실시형태 83. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 포유동물 또는 인간 세포인, 방법.
P 실시형태 84. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
P 실시형태 85. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
P 실시형태 86. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포인, 방법.
P 실시형태 87. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 방법.
P 실시형태 88. P 실시형태 47 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포인, 방법.
P 실시형태 89. 하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체:
R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
(식 중,
R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 90. P 실시형태 89에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00158
;
(식 중,
고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
z5는 1 내지 10의 정수이고;
z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
z2는 2 내지 100의 정수임).
P 실시형태 91. P 실시형태 90에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 92. P 실시형태 90에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 93. P 실시형태 90에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 94. P 실시형태 90에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 95. P 실시형태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00159
.
P 실시형태 96. P 실시형태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00160
.
P 실시형태 97. P 실시형태 89 내지 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00161
,
(식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 P 실시형태 4에 정의된 바와 같은 CART임).
P 실시형태 98. P 실시형태 89 내지 97 중 어느 하나에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 99. P 실시형태 89 내지 97 중 어느 하나에 있어서, z5는 1 또는 3인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 100. P 실시형태 89 내지 97 중 어느 하나에 있어서, z5는 1인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 101. P 실시형태 89 내지 97 중 어느 하나에 있어서, z5는 3인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 102. P 실시형태 89 내지 101 중 어느 하나에 있어서, R2A는 수소인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 103. 실시형태 89 내지 102 중 어느 하나에 있어서, L2는 결합인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 104. P 실시형태 89 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00162
(IV),
(식 중, n은 2 이상의 정수임).
P 실시형태 105. P 실시형태 104에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 106. P 실시형태 105에 있어서, n은 7인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 107. P 실시형태 89 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00163
,
(식 중,
n2는 1 내지 100의 정수이고;
R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 108. P 실시형태 89 내지 107 중 어느 하나에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00164
,
(식 중,
n21은 1 내지 100의 정수이고;
R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 109. P 실시형태 108에 있어서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 110. P 실시형태 109에 있어서, 상기 비치환된 C18 알켄일은 올레일인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 111. P 실시형태 89 내지 110 중 어느 하나에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00165
,
(식 중,
n22는 1 내지 100의 정수이고;
R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
P 실시형태 112. P 실시형태 111에 있어서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 113. P 실시형태 112항에 있어서, 상기 비치환된 C9 알켄일은 노넨일인, 양이온성 양친매성 중합체.
P 실시형태 114. P 실시형태 89 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
Figure pct00166
,
(식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
P 실시형태 115. 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
P 실시형태 116. P 실시형태 115에 있어서, 상기 세포 수용체는 T 세포 수용체(TCR)인, 방법.
P 실시형태 117. P 실시형태 115에 있어서, 상기 세포 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
P 실시형태 118. 대상체에서 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 TCR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
P 실시형태 119. 대상체에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 CAR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
P 실시형태 120. P 실시형태 115, 118 또는 119에 있어서, 상기 화합물은 양이온성 양친매성 중합체 화합물인, 방법.
P 실시형태 121. P 실시형태 115, 118 또는 119에 있어서, 상기 화합물은 P 실시형태 89 내지 114 중 어느 하나의 화합물인, 방법.
P 실시형태 122. P 실시형태 115 또는 118 내지 121에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 방법.
P 실시형태 123. P 실시형태 115 또는 118 내지 121에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 방법.
P 실시형태 124. P 실시형태 119 내지 123 중 어느 하나에 있어서, 상기 CAR은 항-CD19 CAR인, 방법.
P 실시형태 125. P 실시형태 115 또는 118 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 효과기 향상 단백질을 더 암호화하는, 방법.
P 실시형태 126. P 실시형태 115 또는 118 내지 125 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 복수의 핵산인, 방법.
P 실시형태 127. P 실시형태 115 또는 118 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포 또는 림프계 세포인, 방법.
P 실시형태 128. P 실시형태 115 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포인, 방법.
P 실시형태 129. P 실시형태 115 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 대식세포, 호산구 또는 호중구인, 방법.
P 실시형태 130. P 실시형태 115 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 피하 또는 종양내인, 방법.
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University <120> Hybrid Immolative Cell-Penetrating Complexes for Nucleic Acid Delivery <130> 041243-533001WO <150> 62/758,487 <151> 2018-11-09 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1428 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 atgtatcgca tgcagctgct gagctgcatt gcgctgagcc tggcgctggt gaccaacagc 60 gacatccaga tgacccagtc ccccgcttct ctgagcacat ccctgggcga gaccgtgaca 120 atccagtgcc aggctagcga ggatatctac tccggcctgg cctggtacca gcagaagcct 180 ggaaagtctc cccagctgct gatctacgga gcttccgacc tgcaggatgg agtgccttct 240 aggttctctg gaagcggctc cggaacccag tactctctga agatcaccag catgcagaca 300 gaggacgagg gcgtgtactt ctgccagcag ggactgacct acccaagaac atttggcgga 360 ggcacaaagc tggagctgaa gggaggagga ggctccggcg gaggaggctc tggaggagga 420 ggcagcgagg tgcagctgca gcagagcgga gctgagctgg tgaggcctgg aacctccgtg 480 aagctgtctt gtaaggtgag cggcgacacc atcacattct actacatgca ctttgtgaag 540 cagaggcctg gccagggact 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acactggccc ctcggtga 1428 <210> 2 <211> 1485 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa ggccaccatg 60 tatcgcatgc agctgctgag ctgcattgcg ctgagcctgg cgctggtgac caacagcgac 120 atccagatga cccagtcccc cgcttctctg agcacatccc tgggcgagac cgtgacaatc 180 cagtgccagg ctagcgagga tatctactcc ggcctggcct ggtaccagca gaagcctgga 240 aagtctcccc agctgctgat ctacggagct tccgacctgc aggatggagt gccttctagg 300 ttctctggaa gcggctccgg aacccagtac tctctgaaga tcaccagcat gcagacagag 360 gacgagggcg tgtacttctg ccagcaggga ctgacctacc caagaacatt tggcggaggc 420 acaaagctgg agctgaaggg aggaggaggc tccggcggag gaggctctgg aggaggaggc 480 agcgaggtgc agctgcagca gagcggagct gagctggtga ggcctggaac ctccgtgaag 540 ctgtcttgta aggtgagcgg cgacaccatc acattctact acatgcactt tgtgaagcag 600 aggcctggcc agggactgga gtggatcgga agaatcgacc cagaggatga gtccacaaag 660 tactctgaga agttcaagaa caaggccacc ctgacagctg ataccagctc caacacagct 720 tacctgaagc tgtctagcct gaccagcgag gacaccgcca catacttctg catctacgga 780 ggctactact ttgattactg gggccaggga gtgatggtga cagtgtcctc tatcgagttt 840 atgtaccccc ctccatacct ggacaacgag agatccaacg gcaccatcat ccacatcaag 900 gagaagcacc tgtgccacac acagagctcc ccaaagctgt tctgggctct ggtggtggtg 960 gctggcgtgc tgttttgcta cggactgctg gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggaca 1020 aacagcagga gaaaccgggg aggccagtcc gattacatga acatgacccc acggcgccct 1080 ggactgacaa ggaagccata ccagccatac gctcctgctc gcgacttcgc tgcttacagg 1140 ccaagagcca agttcagcag gagcgccgag accgctgcta acctgcagga ccccaaccag 1200 ctgttcaacg agctgaacct gggcaggaga gaggagtttg acgtgctgga gaagaagcgg 1260 gctcgcgatc ccgagatggg aggcaagcag cagcggcgca ggaaccctca ggagggcgtg 1320 tacaacgccc tgcagaagga caagatggcc gaggcttact ctgagatcgg caccaaggga 1380 gagagacggc gcggcaaggg acacgatggc ctgttccagg gactgagcac cgccacaaag 1440 gacacctttg atgctctgca catgcagaca ctggcccctc ggtga 1485 <210> 3 <211> 1878 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 taatacgact cactataggg agacccaagc tggctagcgt ttaaacttaa ggccaccatg 60 tatcgcatgc agctgctgag ctgcattgcg ctgagcctgg cgctggtgac caacagcgac 120 atccagatga cccagtcccc cgcttctctg agcacatccc tgggcgagac cgtgacaatc 180 cagtgccagg ctagcgagga tatctactcc ggcctggcct ggtaccagca gaagcctgga 240 aagtctcccc agctgctgat ctacggagct tccgacctgc aggatggagt gccttctagg 300 ttctctggaa gcggctccgg aacccagtac tctctgaaga tcaccagcat gcagacagag 360 gacgagggcg tgtacttctg ccagcaggga ctgacctacc caagaacatt tggcggaggc 420 acaaagctgg agctgaaggg aggaggaggc tccggcggag gaggctctgg aggaggaggc 480 agcgaggtgc agctgcagca gagcggagct gagctggtga ggcctggaac ctccgtgaag 540 ctgtcttgta aggtgagcgg cgacaccatc acattctact acatgcactt tgtgaagcag 600 aggcctggcc agggactgga gtggatcgga agaatcgacc cagaggatga gtccacaaag 660 tactctgaga agttcaagaa caaggccacc ctgacagctg ataccagctc caacacagct 720 tacctgaagc tgtctagcct gaccagcgag gacaccgcca catacttctg catctacgga 780 ggctactact ttgattactg gggccaggga gtgatggtga cagtgtcctc tatcgagttt 840 atgtaccccc ctccatacct ggacaacgag agatccaacg gcaccatcat ccacatcaag 900 gagaagcacc tgtgccacac acagagctcc ccaaagctgt tctgggctct ggtggtggtg 960 gctggcgtgc tgttttgcta cggactgctg gtgaccgtgg ccctgtgcgt gatctggaca 1020 aacagcagga gaaaccgggg aggccagtcc gattacatga acatgacccc acggcgccct 1080 ggactgacaa ggaagccata ccagccatac gctcctgctc gcgacttcgc tgcttacagg 1140 ccaagagcca agttcagcag gagcgccgag accgctgcta acctgcagga ccccaaccag 1200 ctgttcaacg agctgaacct gggcaggaga gaggagtttg acgtgctgga gaagaagcgg 1260 gctcgcgatc ccgagatggg aggcaagcag cagcggcgca ggaaccctca ggagggcgtg 1320 tacaacgccc tgcagaagga caagatggcc gaggcttact ctgagatcgg caccaaggga 1380 gagagacggc gcggcaaggg acacgatggc ctgttccagg gactgagcac cgccacaaag 1440 gacacctttg atgctctgca catgcagaca ctggcccctc ggtgaggatc cgctcgcttt 1500 cttgctgtcc aatttctatt aaaggttcct ttgttcccta agtccaacta ctaaactggg 1560 ggatattatg aagggccttg agcatctgga ttctgcctaa taaaaaacat ttattttcat 1620 tgcgctcgct ttcttgctgt ccaatttcta ttaaaggttc ctttgttccc taagtccaac 1680 tactaaactg ggggatatta tgaagggcct tgagcatctg gattctgcct aataaaaaac 1740 atttattttc attgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaagaa 1878

Claims (130)

  1. 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체(cell-penetrating complex)로서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인(pH-sensitive immolation domain) 및 친유성 중합체 도메인을 포함하되,
    상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
    (식 중,
    R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  2. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00167
    ;
    (식 중,
    고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  3. 제2항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
  4. 제2항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 세포-침투 복합체.
  5. 제2항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 세포-침투 복합체.
  6. 제2항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 세포-침투 복합체.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00168
    .
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00169
    .
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00170
    ,
    (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제2항에 정의된 바와 같은 CART임).
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 세포-침투 복합체.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, z5는 1 또는 3인, 세포-침투 복합체.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, z5는 1인, 세포-침투 복합체.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, z5는 3인, 세포-침투 복합체.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2A는 수소인, 세포-침투 복합체.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, L2는 결합인, 세포-침투 복합체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00171
    (IV),
    (식 중, n은 2 이상의 정수임).
  17. 제16항에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 세포-침투 복합체.
  18. 제16항에 있어서, n은 7인, 세포-침투 복합체.
  19. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인인 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00172
    ,
    (식 중,
    n2는 1 내지 100의 정수이고;
    R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  20. 제1항에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00173
    ,
    (식 중,
    n21은 1 내지 100의 정수이고;
    R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  21. 제20항에 있어서, n21은 5이고, R201 은 비치환된 C18 알켄일인, 세포-침투 복합체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 비치환된 C18 알켄일은 올레일인, 세포-침투 복합체.
  23. 제1항에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00174
    ,
    (식 중,
    n22는 1 내지 100의 정수이고;
    R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  24. 제23항에 있어서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일인, 세포-침투 복합체.
  25. 제24항에 있어서, 상기 비치환된 C9 알켄일은 노넨일인, 세포-침투 복합체.
  26. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 세포-침투 복합체:
    Figure pct00175
    ,
    (식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
  27. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 가이드 RNA(gRNA), CRISPR RNA(crRNA), 트랜스액티베이팅 RNA(tracrRNA), 플라스미드 DNA(pDNA), 미니서클 DNA, 게놈 DNA(gNDA)인, 세포-침투 복합체.
  28. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 서열을 포함하는, 세포-침투 복합체.
  29. 나노입자 조성물로서, 제1항에 따른 복수의 세포-침투 복합체를 포함하는, 나노입자 조성물.
  30. 제1항의 복합체 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  31. 핵산을 세포에 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 제1항의 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체를 상기 세포 내에서 분해시켜 분해 생성물을 형성하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 분해 생성물은 치환된 또는 비치환된 다이케토피페라진인, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 암호화하는 CAR을 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 mRNA를 상기 세포에서 발현되도록 하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 또는 인간 세포인, 방법.
  38. 제35항에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포인, 방법.
  41. 제35항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 방법.
  42. 제35항에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포인, 방법.
  43. 면역 반응의 유도를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 유효량의 제1항의 복합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 면역 반응은 항암 면역 반응인, 방법.
  45. 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항의 복합체를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제43항에 있어서, 상기 투여는 정맥내 또는 피하 주사를 포함하는, 방법.
  47. 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 형질주입시키는 방법으로서, 세포를 양이온성 양친매성 중합체에 비-공유 결합된 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 pH-감응성 희생 도메인 및 친유성 중합체 도메인을 포함하고, 상기 핵산은 키메라 항원 수용체를 암호화하는 서열을 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
    (식 중,
    R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  49. 제47항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00176
    ;
    (식 중,
    고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A를 갖고,
    (식 중,
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 결합 또는 친유성 중합체 도메인이되; LP1 또는 LP2 중 적어도 하나는 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임)).
  50. 제49항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
  51. 제49항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
  52. 제49항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
  53. 제49항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 방법.
  54. 제48항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00177
    .
  55. 제48항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00178
    .
  56. 제48항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00179

    (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제4항에 정의된 바와 같은 CART임).
  57. 제48항에 있어서, L1은 ―CH2-O-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌인, 방법.
  58. 제47항에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00180
    (IV),
    (식 중, n은 2 이상의 정수임).
  59. 제47항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
    (식 중,
    R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  60. 제47항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00181
    ;
    (식 중,
    고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
    (식 중,
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임)).
  61. 제60항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
  63. 제60항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 방법.
  64. 제60항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프탈렌일인, 방법.
  65. 제59항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00182
    .
  66. 제59항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00183
    .
  67. 제59항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00184

    (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제4항에 정의된 바와 같은 CART임).
  68. 제59항에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 방법.
  69. 제59항에 있어서, z5는 1 또는 3인, 방법.
  70. 제59항에 있어서, z5는 1인, 방법.
  71. 제59항에 있어서, z5는 3인인, 방법.
    Figure pct00185
  72. 제59항에 있어서, R2A는 수소인, 방법.
  73. 제59항에 있어서, L2는 결합인, 방법.
  74. 제59항에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00186
    (IV),
    (식 중, n은 2 이상의 정수임).
  75. 제74항에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 방법.
  76. 제74항에 있어서, n은 7인, 방법.
  77. 제59항에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00187

    (식 중,
    n2는 1 내지 100의 정수이고;
    R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  78. 제59항에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00188

    (식 중,
    n21은 1 내지 100의 정수이고;
    R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  79. 제78항에 있어서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일인, 방법.
  80. 제59항에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 방법:
    Figure pct00189

    (식 중,
    n22는 1 내지 100의 정수이고;
    R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  81. 제80항에 있어서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일인, 방법.
  82. 제47항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 방법.
  83. 제47항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 또는 인간 세포인, 방법.
  84. 제47항에 있어서, 상기 세포는 유기체의 부분을 형성하는, 방법.
  85. 제47항에 있어서, 상기 유기체는 인간인, 방법.
  86. 제47항에 있어서, 상기 세포는 림프계 세포 또는 골수성 세포인, 방법.
  87. 제47항에 있어서, 상기 세포는 T 세포인, 방법.
  88. 제47항에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포인, 방법.
  89. 하기 화학식의 양이온성 양친매성 중합체:
    R1A-[L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A]z5
    (식 중,
    R1A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  90. 제89항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00190
    ;
    (식 중,
    고리 A는 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    CART는 화학식 -L1-[(LP1)z1-(LP2)z3-(IM)z2]z4-L2-R2A를 갖고,
    R2A는 수소, 할로겐, -CCl3, -CBr3, -CF3, -CI3, CHCl2, -CHBr2, -CHF2, -CHI2, -CH2Cl, -CH2Br, -CH2F, -CH2I, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC(O)NHNH2, -NHC(O)NH2, -NHSO2H, -NHC(O)H, -NHC(O)OH, -NHOH, -OCCl3, -OCF3, -OCBr3, -OCI3, -OCHCl2, -OCHBr2, -OCHI2, -OCHF2, -OCH2Cl, -OCH2Br, -OCH2I, -OCH2F, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 결합, -C(O)O-, -O-, -S-, -NH-, -C(O)NH-, -NHC(O)-, -S(O)2-, -S(O)NH-, -NHC(O)NH-, 치환된 또는 비치환된 알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬렌, 치환된 또는 비치환된 아릴렌 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴렌이고;
    LP1 및 LP2는 독립적으로 친유성 중합체 도메인이고;
    IM은 상기 pH-감응성 희생 도메인이고;
    z5는 1 내지 10의 정수이고;
    z1 및 z3은 독립적으로 0 내지 100의 정수이고, z1 또는 z3 중 적어도 하나는 0이 아니고; z4는 1 내지 100의 정수이고,
    z2는 2 내지 100의 정수임).
  91. 제90항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 양이온성 양친매성 중합체.
  92. 제90항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 양이온성 양친매성 중합체.
  93. 제90항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 아릴인, 양이온성 양친매성 중합체.
  94. 제90항에 있어서, 고리 A는 치환된 또는 비치환된 페닐 또는 나프틸인, 양이온성 양친매성 중합체.
  95. 제89항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00191
    .
  96. 제89항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00192
    .
  97. 제89항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00193
    ,
    (식 중, CART1, CART2 및 CART3은 독립적으로 제4항에 정의된 바와 같은 CART임).
  98. 제89항에 있어서, z5는 1 내지 3의 정수인, 양이온성 양친매성 중합체.
  99. 제89항에 있어서, z5는 1 또는 3인, 양이온성 양친매성 중합체.
  100. 제89항에 있어서, z5는 1인, 양이온성 양친매성 중합체.
  101. 제89항에 있어서, z5는 3인, 양이온성 양친매성 중합체.
  102. 제89항에 있어서, R2A는 수소인, 양이온성 양친매성 중합체.
  103. 제89항에 있어서, L2는 결합인, 양이온성 양친매성 중합체.
  104. 제89항에 있어서, 상기 pH-감응성 희생 도메인은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00194
    (IV),
    (식 중, n은 2 이상의 정수임).
  105. 제104항에 있어서, n은 2 내지 50의 범위의 정수인, 양이온성 양친매성 중합체.
  106. 제105항에 있어서, n은 7인, 양이온성 양친매성 중합체.
  107. 제89항에 있어서, 상기 친유성 중합체 도메인은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00195
    ,
    (식 중,
    n2는 1 내지 100의 정수이고;
    R20은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  108. 제89항에 있어서, LP1은 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00196
    ,
    (식 중,
    n21은 1 내지 100의 정수이고;
    R201은 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  109. 제108항에 있어서, n21은 5이고, R201은 비치환된 C18 알켄일인, 양이온성 양친매성 중합체.
  110. 제109항에 있어서, 상기 비치환된 C18 알켄일은 올레일인, 양이온성 양친매성 중합체.
  111. 제89항에 있어서, LP2는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00197
    ,
    (식 중,
    n22는 1 내지 100의 정수이고;
    R202는 독립적으로 수소, 치환된 또는 비치환된 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로알킬, 치환된 또는 비치환된 시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴임).
  112. 제111항에 있어서, n22는 5이고, R202는 비치환된 C9 알켄일인, 양이온성 양친매성 중합체.
  113. 제112항에 있어서, 상기 비치환된 C9 알켄일은 노넨일인, 양이온성 양친매성 중합체.
  114. 제89항에 있어서, 상기 양이온성 양친매성 중합체는 하기 화학식을 갖는, 양이온성 양친매성 중합체:
    Figure pct00198
    ,
    (식 중, n21은 5이고, R201은 올레일이고, n22는 5이고, R202는 노넨일이고 n은 7임).
  115. 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 수용체 단백질을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
  116. 제115항에 있어서, 상기 세포 수용체는 T 세포 수용체(TCR)인, 방법.
  117. 제115항에 있어서, 상기 세포 수용체는 키메라 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  118. 대상체에서 T 세포 수용체(TCR)를 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 TCR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 TCR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
  119. 대상체에서 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는 방법으로서, 대상체에게 화합물에 결합하는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 세포-침투 복합체를 투여하는 단계를 포함하되, 상기 화합물은 상기 세포에 전달될 때 분해되어, 대상체에서 CAR을 암호화하는 핵산을 세포 내에 형질주입시키는, 방법.
  120. 제115항, 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 화합물은 양이온성 양친매성 중합체 화합물인, 방법.
  121. 제115항, 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 화합물은 제89항의 화합물인, 방법.
  122. 제115항, 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 방법.
  123. 제115항, 제118항 또는 제119항에 있어서, 상기 핵산은 DNA인, 방법.
  124. 제119항에 있어서, 상기 CAR은 항-CD19 CAR인, 방법.
  125. 제115항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 효과기 향상 단백질(effector enhancing protein)을 더 암호화하는, 방법.
  126. 제115항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 복수의 핵산인, 방법.
  127. 제115항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 골수성 세포 또는 림프계 세포인, 방법.
  128. 제115항, 제118호 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, B 세포 또는 자연 살해 세포인, 방법.
  129. 제115항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대식세포, 호산구 또는 호중구인, 방법.
  130. 제115항, 제118항 및 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 피하 또는 종양내인, 방법.
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