CN115252807A - 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物 - Google Patents

用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物 Download PDF

Info

Publication number
CN115252807A
CN115252807A CN202210904257.4A CN202210904257A CN115252807A CN 115252807 A CN115252807 A CN 115252807A CN 202210904257 A CN202210904257 A CN 202210904257A CN 115252807 A CN115252807 A CN 115252807A
Authority
CN
China
Prior art keywords
substituted
unsubstituted
substituent group
group
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210904257.4A
Other languages
English (en)
Inventor
R·M·韦茂思
P·温德
J·R·瓦尔加斯
T·R·布莱克
C·米金雷
R·利维
O·A·W·哈贝特
N·本纳
K·尼尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
Publication of CN115252807A publication Critical patent/CN115252807A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/593—Polyesters, e.g. PLGA or polylactide-co-glycolide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)

Abstract

本文涉及用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物。本文尤其提供了用于将包括核酸的治疗剂、诊断剂和成像剂递送至细胞中的复合物、组合物和方法。所述复合物、组合物和方法可以促进对寡核苷酸和聚阴离子货物的复合、保护，向体外和体内的靶细胞、组织和器官中的递送和释放。

Description

用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
本申请是2017年7月27日提交的发明名称为“用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物”的中国专利申请201780058858.5的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年7月27日提交的美国临时申请号62/367,555的权益，所述临时申请的内容整体且出于所有的目的地并入本文。
关于在联邦政府资助的研究和开发下的公开的权利声明
本发明是在由能源部授予的合同DE-SC0005430下、在由国家科学基金会授予的合同1306730下和在由国立卫生研究院授予的合同CA031841和CA031845下通过政府支持进行的。政府具有本发明的一定权利。
对以ASCII文件提交的“序列表”、表或计算机程序列表附录的引用
不适用
背景技术
需要用于实现或增强如为广泛的临床、诊断和/或研究应用所需的跨越细胞质膜和其他生物屏障对治疗剂、诊断性探针和/或研究工具的递送的新的材料和策略。这种货物(例如核酸)的递送具有与用于传染性疾病、癌症免疫疗法、蛋白质疗法和基因编辑的疫苗接种策略相关的相当大的临床潜力。本文提供了解决本领域中的这些和其他问题的解决方法。
发明内容
在第一方面，提供了细胞穿透性复合物，其包括与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，所述阳离子两性聚合物包括pH敏感性解体结构域。
在另一方面，提供了纳米颗粒组合物，其包括如本文所公开的多种细胞穿透性复合物。
在另一方面，提供了下式的阳离子两亲性聚合物：H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)，其中：L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；IM为pH敏感性解体结构域；z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且z2为2至100的整数。在实施方案中，L1为取代或未取代的亚烷基。在实施方案中，L1为肽(例如，氨基酸序列)。
在另一方面，提供了下式的阳离子两亲性聚合物：H-L1-[(LP1)z1-(LP3)z1a-(IM)z2-(LP2)z3-(LP4)z3b]z4-L2-H(I)，其中：L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；LP1、LP2、LP3和LP4独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1、LP2、LP3和LP4中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；IM为pH敏感性解体结构域；z1、z1a、z3、z3b和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且z2为2至100的整数。在实施方案中，L1为取代或未取代的亚烷基。在实施方案中，L1为肽(例如，氨基酸序列)。
在另一方面，提供了将核酸转染至细胞中的方法，所述方法包括使细胞与本文所公开的复合物接触。
在另一方面，提供了下式的阳离子两亲性聚合物：R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5，其中R1A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，R2A独立地为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；IM独立地为pH敏感性解体结构域，z5为1至10的整数，z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0，并且z2独立地为2至100的整数。在实施方案中，R1A为氢。在R1A为氢的情况下，z5为1。
在另一方面，提供了在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括施用有效量的本文所公开的细胞穿透性复合物。
附图说明
图1示出了说明用CART体系稳定转染之后的细胞的平均辐射率(p/s/cm2/sr)的数据。
图2示出了说明CART以及CART和佐剂的组合的抗肿瘤免疫原性的数据。
图3A、B和C示出了说明预防性疫苗接种策略的功效的数据。A：肿瘤大小曲线图，B：存活曲线图，C：用表达TSA的A20淋巴瘤重新激发的小鼠的肿瘤大小曲线图(注意：单独示出了重叠的线；黑线值全部在零处)。
图4A和B示出了预先建立的肿瘤大小和存活数据(在第7天初始疫苗接种，在第10和13天加强。A：肿瘤大小数据。B：存活曲线数据。
图5A和B示出了说明使用CART和编码免疫刺激蛋白的mRNA原位免疫接种的数据。
图6示出了说明用于mRNA递送的电荷交替可释放转运蛋白(CART)的图表。
图7A、B和C示出了被合成用于递送mRNA的寡聚(碳酸酯-b-α-氨基酯)CART。A)寡聚(α-氨基酯)通过串联的5元然后6元过渡态进行酰胺形成的重排机制。B)通过环状碳酸酯和酯单体的OROP合成用于mRNA递送的寡聚(碳酸酯-b-α-氨基酯)CART。C)通过先前报道的OROP方法合成的两亲性寡聚(碳酸酯)。
图8A和B示出了对寡聚(α-氨基酯)CART重排机制的探究。A)嵌段共聚寡聚物的α-氨基酯部分的自我解体型重排产生具有连接的引发剂的完整亲脂性寡聚碳酸酯嵌段和小分子HEGD2。B)与独立合成的D15同型寡聚物11相比受保护的嵌段共聚寡聚物Pyr-D15:A1210(红色)的GPC迹线，并且随后进行脱保护和碱催化的重排(蓝色)。
图9A、B、C和D示出了与评价CART用于eGFP mRNA递送有关的数据。A)来自用各种转运蛋白处理的HeLa的流式细胞术测定的平均eGFP荧光值。B)示出用eGFP mRNA转运蛋白处理的HeLa细胞的转染％的eGFP荧光的代表性流式细胞术直方图。C)电荷比对由D13:A117进行mRNA递送导致的eGFP表达的影响。D)用裸mRNA、与Lipofectamine复合的mRNA或与D13:A117复合的mRNA处理的HeLa细胞的落射荧光显微术图像。示出的所有数据均在于24孔板中用0.125μg/孔的mRNA浓度处理8小时的HeLa细胞中。
图10A、B、C和D显示mRNA的表达是由于通过CART寡聚物驱动mRNA释放和内体逃逸的电荷改变的自我解体型机制。A)在4℃、抑制内吞的条件下对Cy5-mRNA/D13:A117复合物的摄取。B)在用由降解和非降解的转运蛋白体系形成的复合物处理之后eGFP mRNA的相对摄取和表达。实心条表示GFP表达并且空心条表示Cy5-mRNA荧光C)当将mRNA/D13:A11 7复合物与已知用于抑制内体酸化的化合物(刀豆素A，Con A)和内体破裂剂(氯喹，Chl)共同处理时的eGFP表达D)在用CART D13:A117或非释放寡聚物7处理之后(处理4小时之后)的细胞的共聚焦显微术。用转运蛋白/Cy5-mRNA复合物和TRITC-葡聚糖4400共处理的细胞。
图11A、B、C、D、E和F示出在多个细胞系和小鼠中使用CART的mRNA递送的应用。A)在HeLa(蓝色)、J774(红色)、HEK 293(灰色)、CHO(黄色)和HepG2(绿色)细胞系中通过D13:A11##相比于Lipofectamine进行eGFP mRNA递送的转染效率。B)通过CART 7对Fluc mRNA的递送遵循与eGFP相同的电荷比趋势。将电荷报告为理论(+/-)比。C)在肌内注射裸FlucmRNA(空心圆圈)和mRNA/D13:A11##复合物(填充圆圈)之后的体内BLI。条表示所有动物的平均值(对于1h、4h和7h，n＝3；对于24h和48h，n＝5)。D)在肌内注射裸mRNA(左侧腹)或mRNA/CART复合物(右侧腹)之后的代表性生物发光图像。E)在静脉内尾静脉注射裸mRNA(空心圆圈)和mRNA/CART复合物(填充圆圈)之后的体内BLI。条表示所有动物的平均值(对于1h和7h，n＝2；对于4h、24h和48h，n＝4)。虚线是来自未注射D-荧光素的动物的背景生物发光信号。F)经由静脉内尾静脉注射用mRNA/D13:A11复合物处理的小鼠的代表性生物发光图像。
具体实施方式
虽然本文中已示出并描述了本公开的各种实施方案和方面，对本领域技术人员而言将显而易见的是，仅通过实例的方式提供此类实施方案和方面。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现将会想到众多变化、改变和替代。应当理解，本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案可用于实行本公开。
除非上下文另有指明，否则特别地旨在可以以任何组合使用本文所述的本公开的各种特征。此外，本公开还预期在一些实施方案中，可以排除或省略本文中阐述的任何特征或特征组合。为了说明，如果说明书陈述了复合物具有组分A、B和C，则特别地旨在可以单独地或以任何组合方式省略和放弃A、B或C中的任一种或其组合。
必须指出，如本文和在所附权利要求书中所用，单数形式“一个(a)/一种(an)”和“所述(the)”包括复数对象，除非上下文另有清楚地指出。因此，例如，对“一个癌细胞”的提及包括多个癌细胞。在其他实例中，对“一种核酸”或“核酸”的提及包括多个核酸分子，即多种核酸。
术语“约”意指包括指定值的值范围，本领域普通技术人员将合理地认为所述值范围与指定值相似。在实施方案中，约意指在使用本领域通常可接受的测量值的标准偏差内的平均值。在实施方案中，约意指延伸至指定值的+/-10％的范围。在实施方案中，约意指指定值。
还如本文所用，“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项目的任意及所有可能的组合，以及在替代性(“或”)中解释时的组合的缺乏。
如本文所用，术语“包含”旨在是指组合物和方法包括所述要素，但不排除其他要素。如本文所用，过渡短语“基本上由…组成”(和语法变型)被解释为涵盖所述材料或步骤“以及那些本质上不影响所述权利要求的基本和新颖特征的材料或步骤”。因此，如本文所用，术语“基本上由…组成”不应被解释为等同于“包含”。“由…组成”将意指排除对于施用本文所公开的组合物的超过痕量元素的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语各者定义的方面在本公开的范围内。
定义
本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域中的常规含义。根据在化学科学中已知的化学价的标准规则对本文阐述的化学结构和化学式进行构建。
如本文所用，术语“寡聚物”和“聚合物”是指具有多个重复亚单元的化合物(例如，聚合的单体)。术语“共聚寡聚物”或“共聚物”是指包含2个或更多个不同残基(单体单元或单体，其在本文中可互换使用)寡聚物或聚合物。寡聚物中单体的数量通常小于聚合物中单体的数量。因此，在一些实例中，寡聚物在长度上可以具有1至约10个单体、1至约20个单体、1至约30个单体、1至约40个单体、1至约50个单体、1至约100个单体、1至约150个单体、1至约200个单体、1至约250个单体、1至约300个单体、1至约350个单体、1至约400个单体、1至约450个单体或1至约500个单体。在一些实例中，寡聚物在长度上可以具有小于约500个单体、小于约450个单体、小于约400个单体、小于约350个单体、小于约300个单体、小于约250个单体、小于约200个单体、小于约150个单体、小于约100个单体、小于约50个单体、小于约40个单体、小于约30个单体、小于约20个单体或小于约10个单体。在聚合物的背景下，聚合物中单体的数量通常多于寡聚物中单体的数量。因此，在一些实例中，聚合物在长度上可以具有约500至约1000个单体、约500至约2000个单体、约500至约3000个单体、约500至约4000个单体、约500至约5000个单体、约500至约6000个单体、约500至约7000个单体、约500至约8000个单体、约500至约9000个单体、约500至约10000个单体、或超过10000个单体。
术语“可聚合单体”根据其在聚合物化学领域中的含义使用，并且是指可以与其他单体分子(诸如相同或不同的其他可聚合单体)化学共价结合以形成聚合物的化合物。
术语“嵌段共聚物”根据其通常含义使用，并且是指通过共价键连接的聚合单体的两个或更多个部分(例如嵌段)。在实施方案中，嵌段共聚物是聚合物的重复模式。在实施方案中，嵌段共聚物包含周期性(例如重复模式)序列中的两种或更多种单体。例如，两嵌段共聚物具有式：–B-B-B-B-B-B–A-A-A-A-A–，其中‘B’是第一亚基并且‘A’是共价结合在一起的第二亚基。因此，三嵌段共聚物是具有三个不同嵌段的共聚物，其中两个可以是相同的(例如，–A-A-A-A-A–B-B-B-B-B-B–A-A-A-A-A–)或者所有三个是不同的(例如，–A-A-A-A-A–B-B-B-B-B-B–C-C-C-C-C–)，其中‘A’是第一亚基，‘B’是第二亚基，并且‘C’是第三亚基，它们共价结合在一起。
除非另有说明，否则术语“烷基”本身或作为另一个取代基的部分意指直链(即，非支链的)或支链的链，或其组合，其可以为完全饱和的、单或多不饱和的并且可包括二价和多价基团。烷基可以具有指定的碳原子数(即C1-C10意指1至10个碳)。烷基是未环化链。饱和烃基的实例包括但不限于诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体的基团。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。烷氧基为通过氧接头(O)连接至分子的其余部分的烷基。
除非另有说明，否则术语“亚烷基”本身或作为另一个取代基的部分意指衍生自烷基的二价基团，如由-CH2CH2CH2CH2-所例示但不限于其。通常，烷基(或亚烷基)将具有1至24个碳原子，并且具有10或更少个碳原子的那些基团是优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”是C1-C8烷基或亚烷基。
除非另有说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一个术语组合意指稳定的直链或支链或其组合，其由至少一个碳原子和选自由O、N、P、Si和S组成的组的至少一个杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化，并且氮杂原子可任选地被季胺化。杂原子O、N、P、S和Si可置于杂烷基的任何内部位置或烷基连接至分子的其余部分所处的位置处。杂烷基是未环化链。实例包括但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2、-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH＝CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH＝N-OCH3、-CH＝CH-N(CH3)-CH3、-O-CH3、-O-CH2-CH3和-CN。多至两个杂原子可为连续的，例如像-CH2-NH-OCH3。
类似地，除非另有说明，否则术语“亚杂烷基”本身或作为另一个取代基的部分意指衍生自杂烷基的二价基团，如通过-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所例示但不限于其。对于亚杂烷基，杂原子也可占据链末端之一或二者(例如上文所述的亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等)。如本文所用，杂烷基包括通过杂原子连接至分子的其余部分的那些基团，诸如-C(O)R'、-C(O)NR'、-NR'R”、-OR'、-SR'和/或-SO2R'。在叙述“杂烷基”，后面接着具体杂烷基诸如-NR'R”等的叙述时，将理解，术语杂烷基和-NR'R”并不冗余或互相排斥。相反，叙述具体杂烷基以增加清晰性。因此，术语“杂烷基”在本文不应解释为排除具体杂烷基，诸如-NR'R”等。
除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其他术语组合分别意指“烷基”和“杂烷基”的环状型式。环烷基和杂烷基不是芳族的。另外，对于杂环烷基，杂原子可占据杂环连接至分子的其余部分所处的位置处。环烷基的实例包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括但不限于：1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。“亚环烷基”和“亚杂环烷基”独自或作为另一个取代基的部分分别意指衍生自环烷基和杂环烷基的二价基团。
除非另有说明，否则术语“卤代基”或“卤素”本身或作为另一个取代基的部分意指氟、氯、溴或碘原子。另外，如“卤代烷基”的术语意在包括单卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”包括但不限于：氟代甲基、二氟甲基、三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另有说明，否则术语“酰基”意指-C(O)R，其中R为取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，或取代或未取代的杂芳基。
除非另有说明，否则术语“芳基”意指多不饱和的、芳族的烃取代基，其可以是单环或稠合在一起(即，稠环芳基)或共价连接的多环(优选1至3个环)。稠环芳基是指稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是芳环。术语“杂芳基”是指芳基(或环)，其含有1至4个选自N、O和S的杂原子，其中氮和硫原子任选地被氧化，并且氮原子任选地被季铵化。因此，术语“杂芳基”包括稠环杂芳基(即，稠合在一起的多个环，其中至少一个稠环是杂芳环)。5,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有5元，并且另一个环具有6元，并且其中至少一个环是杂芳环。类似地，6,6-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6元，并且另一个环具有6元，并且其中至少一个环是杂芳环。并且6,5-稠环亚杂芳基是指两个稠合在一起的环，其中一个环具有6元，并且另一个环具有5元，并且其中至少一个环是杂芳环。杂芳基可通过碳或杂原子连接至分子的其余部分。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基，2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。以上所提到的芳环和杂芳环体系中每个的取代基选自由以下所述的可接受取代基组成的组。“亚芳基”和“亚杂芳基”独自或作为另一个取代基的部分分别意指衍生自芳基和杂芳基的二价基团。
为简明起见，术语“芳基”当与其他术语组合使用(例如，芳氧基、芳硫氧(arylthioxy)、芳基烷基)时包括上文定义的芳环或杂芳环。因此，术语“芳烷基”意指包括其中芳基连接至烷基的那些基团(例如苄基、苯乙基、吡啶甲基等)，所述烷基包括其中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子替换的那些烷基(例如苯氧甲基、2-吡啶基氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。
如本文所用，术语“氧代基”意指双键键合至碳原子的氧。
如本文所用，术语“烷基磺酰基”意指具有式-S(O2)-R'的部分，其中R'为如上文定义的烷基。R'可以具有指定数目的碳(例如，“C1-C4烷基磺酰基”)。
以上术语(例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”和“杂芳基”)中的每个包括所指示基团的取代和未取代形式。
烷基和杂烷基(包括通常称为亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基和杂环烯基的那些基团)的取代基可为选自但不限于以下的基团种类中的一种或多种：OR'、＝O、＝NR'、＝N-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R’、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、-CN和-NO2，其数目在0至(2m'+1)的范围内，其中m'为这种基团中碳原子的总数。R'、R”、R”'和R””各自优选独立地是指氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基(例如被1-3个卤素取代的芳基)、取代或未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。当本文所公开的化合物包括多于一个R基团时，例如独立地选自每个R基团，当存在多于一个这些基团时，也独立地选择每个R'、R”、R”'和R””基团。当R'和R”连接至相同的氮原子时，它们可与氮原子组合形成4元、5元、6元或7元环。例如，-NR'R”包括但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。由取代基的以上论述，本领域技术人员将理解，术语“烷基”意指包括包含结合至非氢基团的基团的碳原子的基团，诸如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等)。
与针对烷基描述的取代基类似，用于芳基和杂芳基的取代基是不同的并且选自例如：-OR'、-NR'R”、-SR'、-卤素、-SiR'R”R”'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R”、-OC(O)NR'R”、-NR”C(O)R'、-NR'-C(O)NR”R”'、-NR”C(O)2R'、-NR-C(NR'R”R”')＝NR””、-NR-C(NR'R”)＝NR”'、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R”、-NRSO2R'、-CN、-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数目在0至芳环体系上开放化合价的总数的范围内；并且其中R'、R”、R”'和R””优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的杂芳基。当本文所公开的化合物包括多于一个R基团时，例如独立地选自每个R基团，当存在多于一个这些基团时，也独立地选择每个R'、R”、R”'和R””基团。
两个或更多个取代基可任选地连结以形成芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基。据发现，这种所谓的成环取代基通常但不必须连接至环状基本结构。在实施方案中，成环取代基连接至基本结构的相邻成员。例如，两个成环取代基连接至环状基本结构的相邻成员形成稠环结构。在另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的单个成员。例如，两个成环取代基连接至环状基本结构的单个成员形成螺状结构。在另一个实施方案中，成环取代基连接至基本结构的不相邻成员。
芳环或杂芳环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地形成式-T-C(O)-(CRR')q-U-的环，其中T和U独立地为-NR-、-O-、-CRR'-，或单键，并且q为0至3的整数。可替代地，芳环或杂芳环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被式-A-(CH2)r-B-的取代基替换，其中A和B独立地为-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-，或单键，并且r为1至4的整数。如此形成的新环的单键中的一个可任选地被双键替换。可替代地，芳环或杂芳环的相邻原子上的取代基中的两个可任选地被式-(CRR')s-X'-(C”R”')d-的取代基替换，其中s和d独立地为0至3的整数，并且X'为-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。取代基R、R'、R”和R”'优选独立地选自氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的杂芳基。
如本文所用，术语“杂原子”或“环杂原子”意指包括氧(O)、氮(N)、硫(S)、磷(P)和硅(Si)。
如本文所用，“取代基团”意指选自以下部分的基团：
(A)氧代基、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如C6-C10芳基、C10芳基或苯基)，或未取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)，以及
(B)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基：
(i)氧代基、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如C6-C10芳基、C10芳基或苯基)，或未取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)，以及
(ii)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基：
(a)氧代基、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如C6-C10芳基、C10芳基或苯基)，或未取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)，以及
(b)被选自以下的至少一个取代基取代的烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基：氧代基、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、未取代的烷基(例如C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)、未取代的杂烷基(例如2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)、未取代的环烷基(例如C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)、未取代的杂环烷基(例如3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)、未取代的芳基(例如C6-C10芳基、C10芳基或苯基)，或未取代的杂芳基(例如5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。
如本文所用，“大小有限的取代基”或“大小有限的取代基团”意指选自以上针对“取代基团”所描述的全部取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C20烷基，每个取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2至20元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C4-C8环烷基，并且每个取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的4至8元杂环烷基。
如本文所用，“低级取代基”或“低级取代基团”意指选自以上针对“取代基团”所描述的全部取代基的基团，其中每个取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，每个取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2至8元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C5-C7环烷基，并且每个取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的5至7元杂环烷基。
在实施方案中，在本文的化合物中所述的每个取代的基团被至少一个取代基团取代。更确切地，在实施方案中，在本文的化合物中描述的每个取代的烷基、取代的杂烷基、取代的环烷基、取代的杂环烷基、取代的芳基、取代的杂芳基、取代的亚烷基、取代的亚杂烷基、取代的亚环烷基、取代的亚杂环烷基、取代的亚芳基和/或取代的亚杂芳基被至少一个取代基团取代。在实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个大小有限的取代基团取代。在实施方案中，这些基团中的至少一个或全部被至少一个低级取代基团取代。
在本文化合物的实施方案中，每个取代或未取代的烷基可以为取代或未取代的C1-C20烷基，每个取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2至20元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C8环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3至8元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，并且/或者每个取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5至10元杂芳基。在本文化合物的实施方案中，每个取代或未取代的亚烷基可以为取代或未取代的C1-C20亚烷基，每个取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2至20元亚杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C8亚环烷基，每个取代或未取代的亚杂环烷基为取代或未取代的3至8元亚杂环烷基，每个取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10亚芳基，并且/或者每个取代或未取代的亚杂芳基为取代或未取代的5至10元亚杂芳基。
在实施方案中，每个取代或未取代的烷基为取代或未取代的C1-C8烷基，每个取代或未取代的杂烷基为取代或未取代的2至8元杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7环烷基，每个取代或未取代的杂环烷基为取代或未取代的3至7元杂环烷基，每个取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10芳基，并且/或者每个取代或未取代的杂芳基为取代或未取代的5至9元杂芳基。在实施方案中，每个取代或未取代的亚烷基为取代或未取代的C1-C8亚烷基，每个取代或未取代的亚杂烷基为取代或未取代的2至8元亚杂烷基，每个取代或未取代的环烷基为取代或未取代的C3-C7亚环烷基，每个取代或未取代的亚杂环烷基为取代或未取代的3至7元亚杂环烷基，每个取代或未取代的芳基为取代或未取代的C6-C10亚芳基，并且/或者每个取代或未取代的亚杂芳基为取代或未取代的5至9元亚杂芳基。在实施方案中，化合物为本文中阐述的化学物质。
如本文所用，术语“一个”或“一种”意指一个/种或多个/种。此外，如本文所用，短语“用[n]取代”意指用所指定取代基中的任何或全部中的一个或多个取代特定的基团。例如，在基团，诸如烷基或杂芳基“被未取代的C1-C20烷基或未取代的2至20元杂烷基取代”时，所述基团可含有一个或多个未取代的C1-C20烷基，和/或一个或多个未取代的2至20元杂烷基。此外，在部分被R取代基取代的情况下，所述基团可被称为“R-取代的”。在部分为R取代的情况下，所述部分被至少一个R取代基取代并且每个R取代基任选地为不同的。
术语“亲核部分”是指能够将一个或多个电子(例如2个)供给至亲电体的化学物质或官能团。在实施方案中，亲核部分是指可以在化学反应中将电子供给至亲电体以形成键的化学物质或官能团。
术语“亲电子部分”是指能够将接受一个或多个电子(例如2个)的化学物质或官能团。在实施方案中，亲电子部分是指具有空轨道的化学物质或官能团，并且因此可以接受电子以在化学反应中形成键。
术语“寡聚二醇部分”是指具有以下通式的化学实体：
Figure BDA0003771948270000081
其中R400为H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基并且n300为1或更多的整数。在一些实例中，R400为H或烷基。
本公开化合物的描述受限于本领域技术人员已知的化学键合的原理。因此，在基团可被多个取代基中的一个或多个取代的情况下，对所述取代进行选择，以便遵循化学键合的原理并且得到这样的化合物，所述化合物并非固有地不稳定和/或本领域的技术人员将已知为在环境条件(诸如水性、中性以及若干已知的生理条件)下可能不稳定。例如，根据本领域技术人员已知的化学键合的原理，杂环烷基或杂芳基通过环杂原子连接至分子的其余部分，从而避免固有地不稳定化合物。
除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的意义。参见例如Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGY ANDMOLECULAR BIOLOGY,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994)；Sambrook等人,MOLECULARCLONING,A LABORATORY MANUAL,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY1989)。与本文所描述的类似或等同的任何方法、设备和材料可被用于实践本公开。提供以下定义以有利于理解本文中频繁使用的某些术语，并且不意味着限制本公开的范围。
“核酸”是指呈单链、双链或多链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸和其聚合物、或其补体。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“寡聚物”等在通常和常规意义上是指核苷酸的线性序列。术语“核苷酸”在通常和常规意义上是指多核苷酸的单个单元，即单体。核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或其修饰型式。本文涵盖的多核苷酸的实例包括单链和双链DNA、单链和双链RNA、和具有单链和双链的DNA和RNA的混合物的杂化分子。核酸，例如本文涵盖的多核苷酸的实例包括任何类型的RNA，例如信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)及其任何片段。在多核苷酸的背景下，术语“双链体”在通常和常规意义上是指双链。核酸可以是直链或支链的。例如，核酸可以是核苷酸的直链或者核酸可以是支链的，例如，使得核酸具有核苷酸的一个或多个臂或分支。任选地，分支的核酸重复地分支以形成更高级的结构，诸如树枝状大分子等。
核酸，包括例如具有硫代磷酸酯主链的核酸，可包括一个或多个反应性部分。如本文所用，术语反应性部分包括能够通过共价、非共价或其他相互作用与另一分子(例如核酸或多肽)反应的任何基团。例如，核酸可包括氨基酸反应性部分，其通过共价、非共价或其他相互作用与蛋白质或多肽上的氨基酸反应。
所述术语还涵盖了含有已知核苷酸类似物或被修饰的主链残基或键的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，它们具有与参考核酸类似的结合特性，并且它们以与参考核苷酸类似的方式进行新陈代谢。此类类似物的实例包括但不限于磷酸二酯衍生物，包括例如氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)(也称为硫代磷酸酯(phosphothioate)，其具有代替磷中的氧的双键键合的硫)、二硫代磷酸酯、膦酰基羧酸、膦酰基羧酸酯、膦酰基乙酸、膦酰甲酸、膦酸甲酯、膦酸硼或O-甲基氨基磷酸酯(O-methylphosphoroamidite)键(参见Eckstein,OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:APRACTICAL APPROACH,Oxford University Press)以及对核苷酸碱基的修饰，诸如5-甲基胞苷或假尿苷；和肽核酸主链和键。其他类似物核酸包括具有以下主链的那些核酸：正性主链；非离子主链；修饰的糖和非核糖主链(例如本领域已知的磷二酰胺吗啉代寡聚物或锁核酸(LNA))，包括美国专利号5,235,033和5,034,506，以及第6章和第7章,ASC SymposiumSeries580,CARBOHYDRATE MODIFICATIONS IN ANTISENSE RESEARCH,Sanghui&Cook编辑中描述的那些。含有一个或多个碳环糖的核酸也包括在核酸的定义内。对磷酸核糖主链的修饰可出于各种原因来完成，例如增加磁力分子在生理环境中的稳定性和半衰期，或作为生物芯片上的探针。可制备天然存在的核酸和类似物的混合物；可替代地，可制备不同核酸类似物的混合物，和天然存在的核酸和类似物的混合物。在实施方案中，DNA中的核苷酸间键是磷酸二酯、磷酸二酯衍生物或两者的组合。
核酸可包括非特异性序列。如本文所用，术语“非特异性序列”是指含有一系列残基的核酸序列，所述残基未被设计成与任何其他核酸序列互补或仅与任何其他核酸序列部分互补。以举例的方式，非特异性核酸序列是核酸残基的序列，所述序列在与细胞或生物体接触时不起抑制性核酸的作用。“抑制性核酸”是这样的核酸(例如DNA、RNA、核苷酸类似物的聚合物)，所述核酸能够结合靶核酸(例如可翻译成蛋白质的mRNA)并且减少靶核酸的转录(例如，来自DNA的mRNA)或减少靶核酸(例如mRNA)的翻译或改变转录物剪接(例如单链吗啉代寡聚物)。在实施方案中，核酸为RNA(例如mRNA)。在实施方案中，核酸的长度为10至100,000个碱基。在实施方案中，核酸的长度为50和10,000个碱基。在实施方案中，核酸的长度为50和5,000个碱基。在实施方案中，核酸的长度为50和1,000个碱基。
本文可交换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物，其中聚合物可缀合至不包含氨基酸的部分。所述术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。所述术语适用于大环肽、已经用非肽官能团修饰的肽、肽模拟物、聚酰胺和大环内酰胺。“融合蛋白”是指编码两个或更多个单独的蛋白质序列的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白被重组地表达为单一部分。
术语“肽基”和“肽基部分”意指单价肽。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及后期修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即，结合到氢的α碳、羧基、氨基和R基团)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或修饰的肽主链，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有不同于氨基酸的一般化学结构的结构、但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。术语“非天然存在的氨基酸”和“非天然氨基酸”是指在自然界中未发现的氨基酸类似物、合成氨基酸和氨基酸模拟物。
氨基酸可以在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，核苷酸可以由其普遍接受的单字母码表示。
“接触”根据其简单普通的含义使用并且是指允许至少两个不同的物质(例如包括生物分子的化学化合物或细胞)变得足够近以反应、相互作用或物理碰触的过程。然而应认识到，所得的反应产物可以由所添加的试剂之间的反应直接产生，或由来自一种或多种所添加的试剂的中间体产生，所述中间体可以在反应混合物中产生。在实施方案中，接触包括例如允许核酸与内切核酸酶相互作用。
“对照”样品或值是指充当与测试样品比较的参考物(通常是已知的参考物)的样品。例如，测试样品可以从测试条件中，例如在测试化合物存在下获取，并且与来自已知条件，例如，在测试化合物(阴性对照)不存在下，或在已知化合物(阳性对照)存在下的样品比较。对照还可以表示从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到，可以设计对照以评估任何数量的参数。例如，可以设计对照以基于药理学数据(例如，半衰期)或治疗性测量(例如，副作用的比较)来比较治疗益处。本领域技术人员将理解哪些标准对照在给定的情况中最适当，并能够基于与标准对照值的比较来分析数据。标准对照对于确定数据的显著性(例如统计显著性)也是有价值的。例如，如果对于给定参数的值在标准对照中有很大差异，那么测试样品中的变化将不被视为显著的。
“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其他物理方式检测的组合物。例如，可用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、地高辛或半抗原和蛋白质或可例如通过将放射性标记并入至与靶肽特异性反应的肽或抗体中而可检测的其他实体。可以采用本领域已知用于将抗体缀合至标记的任何适当方法，例如使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,AcademicPress,Inc.,San Diego中描述的方法。
“生物样品”或“样品”是指从受试者或患者获得或衍生自受试者或患者的材料。生物样品包括组织切片，诸如活检样品和尸检样品，以及用于组织学目的的冷冻切片。此类样品包括体液，诸如血液和血液级分或产品(例如血清、血浆、血小板、红细胞等)、唾液、组织、培养细胞(例如原代培养物、外植体和转化的细胞)、粪便、尿液、滑液、关节组织、滑膜组织、滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、免疫细胞、造血细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、T细胞等。生物学样品通常获自真核生物体，诸如灵长类动物，例如黑猩猩或人；牛；狗；猫；啮齿动物，例如豚鼠、大鼠、小鼠；兔；或鸟类；爬行类动物；或鱼。
如本文所用，“细胞”是指执行足以保留或复制其基因组DNA的新陈代谢或其他功能的细胞。细胞可由本领域中熟知方法鉴定，所述方法包括例如完整细胞膜的存在、通过特定染料染色、产生子代的能力或者与第二配子组合以产生能存活的后代的能力(在配子的情况下)。细胞可包括原核细胞和真核细胞。原核细胞包括但不限于细菌。真核细胞包括但不限于酵母细胞和源自植物或动物的细胞，例如哺乳动物细胞、昆虫(例如夜蛾)细胞和人细胞。
术语“干细胞”或“干细胞”是指克隆的、自我更新的细胞群，其是多能的并且因此可以产生若干种分化的细胞类型。
术语“基因”意指参与产生蛋白质的DNA区段；它包括在编码区之前和之后的区域(前导序列和尾随序列)，以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。前导序列、尾随序列以及内含子包括在基因的转录和翻译过程中必需的调控元件。此外，“蛋白质基因产物”是由特定基因表达的蛋白质。
如本文所用，关于基因的字词“表达”或“表达的”意指该基因的转录和/或翻译产物。细胞中DNA分子的表达水平可以基于细胞内存在的相应mRNA的量或由细胞产生的该DNA编码的蛋白质的量来确定(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,18.1-18.88)。
转染基因的表达可以在细胞中瞬时或稳定地发生。在“瞬时表达”期间，转染的基因在细胞分裂期间不转移到子细胞。由于其表达仅限于转染细胞，因此基因的表达随着时间的推移而丧失。相比之下，当基因与另一种赋予转染细胞选择优势的基因共转染时，可以发生转染基因的稳定表达。这种选择优势可以是对呈递至细胞的某种毒素的抗性。
术语“质粒”是指编码基因表达所必需的基因和/或调控元件的核酸分子。来自质粒的基因的表达可以顺式或反式发生。如果基因以顺式表达，则基因和调控元件由相同的质粒编码。反式表达是指基因和调控元件由单独的质粒编码的情况。
术语“外源性”是指源自给定细胞或生物体外的分子或物质(例如，核酸或蛋白质)。相反，术语“内源性”是指对于给定细胞或生物体为天然的或源自其内的分子或物质。
“载体”是能够将另一种核酸转运到细胞中的核酸。当载体存在于适当的环境中时，载体能够指导由载体携带的一种或多种基因编码的一种或多种蛋白质的表达。
术语“密码子优化的”在涉及用于转化各种宿主的核酸分子的基因或编码区时是指核酸分子的基因或编码区中的密码子的改变以反映宿主生物体的典型密码子使用，而不改变由DNA编码的多肽。这种优化包括用一种或多种更常用于该生物体的基因中的密码子代替至少一种或多于一种或大量的密码子。鉴于可用于多种动物、植物和微生物物种的大量基因序列，可以计算密码子使用的相对频率。密码子使用表例如可在www.kazusa.or.jp/codon/处获得的“密码子使用数据库”处容易地获得。通过利用每种生物体中密码子使用或密码子偏好的知识，本领域普通技术人员可以将频率应用于任何给定的多肽序列，并且产生编码多肽但是使用针对给定物种最佳的密码子的密码子优化的编码区的核酸片段。密码子优化的编码区可以通过本领域技术人员已知的各种方法设计。
“细胞培养物”是位于生物体外的体外细胞群。细胞培养物可以从分离自细胞库或动物的原代细胞，或来源于这些来源之一并且永生化为长期体外培养物的次代细胞建立。
术语“转染(transfection)”、“转导(transduction)”、“转染(transfecting)”或“转导(transducing)”可互换使用，并且定义为将核酸分子和/或蛋白质引入至细胞的过程。可以使用基于非病毒或病毒的方法将核酸引入至细胞。核酸分子可以是编码完整蛋白质或其功能部分的序列。通常，核酸载体具有蛋白质表达所必需的元件(例如，启动子、转录起始位点等)。非病毒转染方法包括不使用病毒DNA或病毒颗粒作为递送系统以将核酸分子引入到细胞中的任何适当方法。示例性的非病毒转染方法包括磷酸钙转染、脂质体转染、核转染、声波穿孔、通过热休克转染、磁转染和电穿孔。对于基于病毒的方法，任何可用的病毒载体均可用于本文所述的方法中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体。在一些方面，使用逆转录载体遵循本领域熟知的标准程序将核酸分子引入到细胞中。术语“转染”或“转导”还指将蛋白质从外部环境引入到细胞中。通常，蛋白质的转导或转染依赖于能够穿过细胞膜的肽或蛋白质与感兴趣的蛋白质的附着。参见,例如Ford等人(2001)Gene Therapy 8:1-4和Prochiantz(2007)Nat.Methods 4:119-20。
如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性地结合”是指两个分子形成在生理条件下相对较稳定的复合物(例如，核蛋白和转染肽)。
用于确定配体是否结合另一物质(例如，蛋白质或核酸)和/或这种配体-物质相互作用的亲和力的方法是本领域已知的。例如，可使用多种技术来检测和/或定量配体与蛋白质的结合，所述技术诸如但不限于蛋白质印迹、斑点印迹、表面等离子体共振法(例如，BIAcore系统；Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)、等温滴定量热法(ITC)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。
可用于分析配体的免疫特异性结合和交叉反应性的免疫测定包括但不限于使用诸如以下的技术的竞争性和非竞争性测定系统：蛋白质印迹、RIA、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“三明治法”免疫测定、免疫沉淀测定、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定和荧光免疫测定。此类测定是常规的且是本领域熟知的。
术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因或其功能片段编码的特异性结合并识别抗原的多肽。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε、和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，其进而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
术语“抗原”和“表位”可互换地指由免疫系统的组分(例如抗体、T细胞受体或其他免疫受体诸如自然杀伤(NK)细胞上的受体)特异性识别的分子(例如，多肽)的部分。如本文所用，术语“抗原”包括抗原表位及其抗原性片段。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元可以具有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一个“轻”(约25kDa)链和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的N端界定了主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语“可变重链”、“VH”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab；术语“可变轻链”、“VL”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
抗体功能片段的实例包括但不限于完整抗体分子、抗体片段诸如Fv、单链Fv(scFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)、VH(重链可变区)、Fab、F(ab)2’以及这些或任何能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽的其他功能部分的任何组合(参见，例如FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul编辑,第4版2001)。本领域技术人员所了解的，可以通过多种方法获得各种抗体片段，所述方法例如用酶(诸如胃蛋白酶)消化完整抗体；或从头合成。常常以化学方式或通过使用重组DNA方法从头合成抗体片段。因此，如本文所用，术语抗体包括通过修饰完整抗体产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的那些抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示文库鉴定的那些抗体片段(参见，例如，McCafferty等人,(1990)Nature348:552)。术语“抗体”还包括二价或双特异性分子、双抗体、三抗体和四抗体。二价且双特异性分子描述于例如Kostelny等人(1992)J.Immunol.148:1547；Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 31:1579；Hollinger等人(1993),PNAS.USA 90:6444；Gruber等人(1994)JImmunol.152:5368；Zhu等人(1997)Protein Sci.6:781；Hu等人(1996)CancerRes.56:3055；Adams等人(1993)Cancer Res.53:4026；以及McCartney等人(1995)ProteinEng.8:301中。
如本文所用，术语“解体”、“自我解体”、“自我解体机制”、“解体部分”、“解体结构域”等在本文中是指化学基团经历分子内反应从而导致化学基团化学重排并且重排的化学基团从与其连接的化合物的其余部分释放的能力。“pH敏感的”解体结构域是指在离散的pH范围内经历解体反应并且在离散的pH范围(例如，pH约1-5、pH约5-7或pH约7-10)之外基本上不经历解体反应的化学基团。在实施方案中，离散的pH范围为pH 1-3、pH 2-4、pH 3-5、pH4-6、pH 5-7、pH 6-8、pH 7-9或pH 8-10。在实施方案中，pH敏感性解体区包括阳离子α氨基酯(寡聚(α-氨基酯))。在实施方案中，阳离子α氨基酯的阳离子组分是带正电荷的氮原子(例如阳离子胺)。在实施方案中，阳离子α氨基酯的阳离子组分不是胍鎓基团。在实施方案中，阳离子α氨基酯的阳离子组分不是哌啶鎓基团。
术语“细胞穿透性复合物”等在通常和常规意义上是指能够穿透到细胞(生物细胞，诸如真核细胞或原核细胞)中的化学复合物(例如，本文所公开的复合物或组合物及其实施方案)。在实施方案中，细胞穿透性复合物包括与阳离子两亲性聚合物离子结合的核酸。在实施方案中，在不存在阳离子两亲性聚合物的情况下，核酸不能实质上穿透细胞。因此，在实施方案中，阳离子两亲性聚合物有助于核酸转运到细胞中。如本文所用，术语“阳离子电荷改变可释放转运蛋白”、“CART”等是指本文所公开的细胞穿透性复合物。CART化合物能够通过阳离子两亲性聚合物组分内的pH敏感的解体结构域的作用而在细胞内释放核酸组分，所述pH敏感的解体结构域响应于细胞内pH而反应，从而在细胞中释放核酸。在实施方案中，阳离子两亲性聚合物在细胞内快速降解(例如在pH 7.4下T1/2小于6小时)。至少在一些实施方案中，聚合复合物、复合物、静电复合物、CART/mRNA复合物、CART/寡核苷酸复合物和纳米颗粒可互换地用于指细胞穿透性复合物。
如本文所用，术语“两亲性聚合物”是指含有亲水性部分和疏水性部分的聚合物。在实施方案中，亲水性部分与疏水性部分以1比1质量比存在。在实施方案中，亲水性部分与疏水性部分以1比2质量比存在。在实施方案中，亲水性部分与疏水性部分以1比5质量比存在。在实施方案中，亲水性部分与疏水性部分以2比1质量比存在。在实施方案中，亲水性部分与疏水性部分以5比1质量比存在。两亲性聚合物可以是二嵌段或三嵌段共聚物。在实施方案中，两亲性聚合物可包括两个亲水性部分(例如，嵌段)和一个疏水性部分(例如，嵌段)。
术语“亲脂性聚合物结构域”等(常常称为“脂质嵌段”)是指阳离子两亲性聚合物的非亲水性(例如不溶于单独的水)的区域。在实施方案中，亲脂性聚合物结构域在水中具有低溶解度。例如，在水中的低溶解度是指约0.0005mg/mL至约10mg/mL可溶于水的亲脂性聚合物结构域的溶解度。
术语“引发剂”是指参与合成阳离子两亲性聚合物的反应的化合物，其目的是引发聚合反应。因此，引发剂通常掺入在合成聚合物的末端。例如，一种类型(或式)的单体或多于一种类型的单体(例如两种不同类型的单体)的多个分子可以与引发剂反应以提供阳离子两亲聚合物。引发剂可以存在于所得聚合物的至少一端，并且不构成聚合物中存在的重复(或聚合)单元。
术语“疾病”或“病状”是指能够用本文所提供的化合物、药物组合物或方法治疗的受试者的所处状态或健康情况。所述疾病可以是自身免疫疾病、炎症疾病、癌症疾病、传染性疾病、代谢疾病、发育疾病、心血管疾病、肝脏疾病、肠道疾病、内分泌疾病、神经疾病或其他疾病。在一些实例中，所述疾病是癌症(例如乳腺癌、卵巢癌、肉瘤、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌(例如、梅克尔(Merkel)细胞癌)、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、头颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤)。
术语“传染”或“传染性疾病”是指可由诸如细菌、病毒、真菌或任何其他病原微生物剂的生物体引起的疾病或病状。
如本文所用，术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的所有类型的癌症、赘生物或恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤、黑素瘤、神经内分泌肿瘤、癌和肉瘤。可用本文提供的化合物、药物组合物或方法治疗的示例性癌症包括淋巴瘤、肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑肿瘤、宫颈癌、结肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、骨髓瘤、甲状腺癌、白血病、前列腺癌、乳腺癌(例如三阴性、ER阳性、ER阴性、化学疗法耐受性、赫赛汀耐受性、HER2阳性、多柔比星耐受性、他莫昔芬耐受性、导管癌、小叶癌、原发性、转移性)、卵巢癌、胰腺癌、肝癌(例如肝细胞癌)、肺癌(例如非小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌、腺癌、大细胞肺癌、小细胞肺癌、类癌、肉瘤)、多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤、黑素瘤、前列腺癌、去势抵抗性前列腺癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌、胶质母细胞瘤、卵巢癌、肺癌、鳞状细胞癌(例如头部、颈部或食道)、结肠直肠癌、白血病、急性髓性白血病、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤。另外的实例包括甲状腺癌、内分泌系统癌、脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、食道癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌或成神经管细胞瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛素瘤、恶性类癌、膀胱癌、癌变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌或外分泌胰腺肿赘生物、甲状腺髓样癌(medullary thyroid cancer)、甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma)、黑素瘤、结肠直肠癌、乳头状甲状腺癌、肝细胞癌、佩吉特乳头病、叶状肿瘤、小叶癌、导管癌、胰腺星状细胞癌、肝星状细胞癌或前列腺癌。
如本文所定义，关于分子(例如多核苷酸或蛋白质)的活性和/或功能性的术语“抑制(inhibition/inhibit/inhibiting)”等意指相对于不存在抑制情况下蛋白质的活性或功能负面地影响(例如减少或降低)分子的活性或功能。因此，抑制包括至少部分、部分地或完全地阻断刺激、减少、防止或延迟激活、或失活、脱敏、或下调信号转导或酶活性或蛋白质或多核苷酸的量。类似地，“抑制剂”是例如通过结合、部分或完全阻断、减少、预防、延迟、灭活、脱敏或下调靶生物分子的活性来抑制靶生物分子(即核酸、肽、碳水化合物、脂质或可以从自然界中发现的任何其他分子)的化合物。在疾病预防治疗的背景下，抑制是指疾病或疾病症状的减少。
“治疗(treatment/treating/treat)”定义为用药剂对疾病、病症或病状作用以减少或改善疾病、病症或病状和/或其症状的有害的或任何其他不所需的影响。“治疗”病状或有需要的受试者是指(1)采取步骤以获得有益或所需的结果，包括临床结果，诸如症状的减少；(2)抑制疾病，例如，阻止疾病或其临床症状的发展或减少疾病或其临床症状；(3)缓解疾病，例如引起疾病或其临床症状消退；或(4)延迟疾病。例如，有益或所需的临床结果包括但不限于癌细胞的减少和/或消除以及癌细胞转移的预防和/或减少。
在疾病的背景下，术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指使所述疾病的临床症状不在尚未经历或显示疾病症状的受试者中发展。在一些实例中，这种预防可以应用于可能被认为易患所述疾病的受试者，而在一些其他实例中，受试者可能不一定被认为易患所述疾病。
如本文所用，“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将组合物物理引入至受试者。优选的用于本文所述化合物的施用途径包括静脉内、腹膜内、肌内、皮内、腹膜内、脊柱或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用，短语“肠胃外施用”意指非肠内和局部施用的、通常是通过注射的施用方式，并且包括但不限于静脉内、腹膜内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眼眶内、心内、皮内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注，以及体内电穿孔。可替代地，本文所述的组合物可以通过非肠胃外途径施用，所述非肠胃外途径诸如局部、表皮或粘膜施用途径，例如以鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部方式。施用还可进行例如一次、多次和/或在一个或多个延长的时间段内进行。
如本文所用，术语“转移性”、“转移性的”和“转移性癌症”可互换使用并且是指增殖性疾病或病症(例如癌症)从一个器官到另一个非相邻器官或身体部分的传播。癌症在原始位点(例如乳腺)处发生，所述位点被称为原发性肿瘤，例如原发性乳腺癌。原发性肿瘤或原始位点中的一些癌细胞获得了穿透并渗入局部区域的正常周围组织的能力和/或穿透淋巴系统或脉管系统的壁而通过所述系统循环到身体中的其他位点和组织的能力。由原发性肿瘤的癌细胞形成的第二临床可检测肿瘤被称为转移性或继发性肿瘤。当癌细胞转移时，推测转移性肿瘤及其细胞与原始肿瘤的那些是相似的。因此，如果肺癌转移到乳腺，则乳腺位点处的继发性肿瘤由异常肺细胞和非异常乳腺细胞组成。乳腺中的继发性肿瘤被称为转移性肺癌。因此，短语转移性癌症是指其中受试者具有或已具有原发性肿瘤并且具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。短语非转移性癌症或罹患为非转移性的癌症的受试者是指其中受试者具有原发性肿瘤但未具有一种或多种继发性肿瘤的疾病。例如，转移性肺癌是指罹患原发性肺肿瘤或具有原发性肺肿瘤病史并且在第二位置或多个位置处(例如在乳腺中)罹患一种或多种继发性肿瘤的受试者中的疾病。
“抗癌剂”是具有抗癌活性的治疗剂，其可用于治疗或预防癌症。抗癌剂可以是大分子或小分子。抗癌剂的实例包括抗体、小分子和大分子或其组合。“抗癌活性”的实例包括但不限于减少癌细胞数量、减小癌大小、杀伤癌细胞、减少和/或抑制转移以及减少癌细胞生长和/或增殖。
在与疾病相关的物质或物质活性或功能的背景下，术语“相关的”或“与...相关”意指疾病可(全部或部分地)由物质或物质活性或功能引起，或者疾病的症状可以(全部或部分地)由物质或物质活性或功能引起。当所述术语在症状的背景下使用(例如，症状与疾病或病状相关)时意指症状可以指示疾病或病状存在于显示出症状的受试者中。
术语“受试者”、“个体”、“宿主”或“有需要的受试者”是指罹患疾病或病状或具有将来患有疾病或病状的可能性的活生物体。术语“患者”是指已经患有疾病或病状的活生物体，例如，已被诊断患有疾病或病症或具有与疾病或病症相关的一种或多种症状的患者。非限制性实例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、牛、鹿，以及其他非哺乳动物。在一些实施方案中，患者为人。
术语“疫苗”是指可以对特定疾病或病原体提供活性获得性免疫和/或治疗性效果(例如治疗)的组合物。疫苗通常含有一种或多种可以在受试者中诱导针对病原体或疾病(即靶病原体或疾病)的免疫应答的药剂。免疫原性剂刺激身体的免疫系统，以将药剂识别为靶病原体或疾病的威胁或靶病原体或疾病存在的指示，从而诱导免疫记忆，使得免疫系统可以更容易地识别和破坏随后暴露时的任何病原体。疫苗可以是预防性的(例如，预防或改善任何天然病原体产生的未来传染的影响，或癌症在易感受试者中的预期发生率的影响)或治疗性的(例如，治疗已被诊断患有癌症的受试者中的癌症)。疫苗的施用是指疫苗接种。在一些实例中，疫苗组合物可以将编码抗原性分子(例如肽)核酸，例如mRNA提供至受试者。通过疫苗组合物递送在受试者中的核酸可以表达为抗原性分子并允许受试者获得针对抗原分子的免疫力。在针对传染性疾病的疫苗接种的背景下，疫苗组合物可以提供编码与某种病原体相关的抗原性分子，例如已知在病原体(例如病原性细菌或病毒)中表达的一种或多种肽的mRNA。在癌症疫苗的背景下，疫苗组合物可以提供编码与癌症相关的某些肽，例如与正常细胞相比基本上全部或高度表达于癌细胞中的肽的mRNA。在接种癌症疫苗组合物后，受试者可以具有针对与癌症相关的肽的免疫力并且特异性地杀伤癌细胞。
本文使用的术语“免疫应答”涵盖但不限于“适应性免疫应答”，也称为“获得性免疫应答”，其中适应性免疫在对免疫应答所靶向的特定病原体或特定细胞类型的初始应答后引发免疫记忆，并且在随后遇到时产生对该靶标的增强应答。免疫记忆的诱导可以提供疫苗接种的基础。
术语“免疫原性”或“抗原性”是指当施用至免疫活性受试者时诱导免疫应答，例如细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答、B细胞应答(例如，产生特异性结合表位的抗体)、NK细胞应答或其任何组合的化合物或组合物。因此，免疫原性或抗原性组合物是能够在免疫活性受试者中引发免疫应答的组合物。例如，免疫原性或抗原性组合物可包含一种或多种与免疫应答所靶向的病原体或特定细胞类型相关的免疫原性表位。此外，免疫原性组合物可包含分离的核酸构建体(诸如DNA或RNA)，其编码抗原性多肽的一个或多个免疫原性表位，可用于表达表位(并因此用于引发针对该多肽或与靶向病原体或细胞类型相关的相关多肽的免疫应答)。
根据本文提供的方法，可以向受试者施用有效量的本文提供的一种或多种药剂、组合物或复合物(所述药剂、组合物或复合物全部在本文中可互换使用)(例如，细胞穿透性复合物或疫苗组合物)。术语“有效量”和“有效剂量”可互换使用。术语“有效量”定义为产生所需效果(例如，将核酸转染至细胞中并表现出转染的核酸的预期结果)所必需的任何量。用于施用药剂的有效量和时间表可由本领域技术人员凭经验确定。用于施用的剂量范围是足够大以产生所需效果，例如转染核酸、调节基因表达、基因编辑、诱导干细胞、诱导免疫应答等的剂量范围。剂量不应太大，以致于导致大量的不良副作用，诸如不希望的交叉反应、过敏反应等。通常，剂量可以随着年龄、病状、性别、疾病类型、疾病或病症的程度、施用途径或者方案中是否包括其他药物而变化，并且可由本领域技术人员确定。在任何禁忌症的情况下，可由个体医师调整剂量。剂量可变化，并且可以每天一次或多次剂量施用进行施用，持续一天或几天。对给定类别药物产品的适当剂量的指导可见于文献中。例如，对于给定参数，有效量可以显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％的增加或减少。功效还可以表达为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量可以具有相对于对照至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍，或更多的作用。精确的剂量和配方可以取决于治疗目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定(参见，例如，Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷,1992)；Lloyd,The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Remington:The Science andPractice of Pharmacy,第20版,Gennaro编辑(2003)和Pickar,Dosage Calculations(1999))。
关于癌症治疗的术语“杀伤”涉及包括将导致该癌细胞或至少一部分癌细胞群的死亡的任何类型的操作。
细胞穿透性复合物
在第一方面，提供了细胞穿透性复合物，其包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，所述阳离子两性聚合物包含pH敏感性解体结构域。在实施方案中，一种或多种抗衡离子(例如阴离子)也可以作为阳离子两亲性聚合物中的正电荷的反电荷存在。在实施方案中，核酸与阳离子两亲性聚合物非共价结合。在实施方案中，核酸与阳离子两亲性聚合物离子结合。在实施方案中，细胞穿透性复合物包含多种任选不同的核酸(例如1至10个附加核酸、1至5个附加核酸、1至5个附加核酸、2个附加核酸或1个附加核酸)。在实施方案中，核酸为RNA。在实施方案中，核酸为mRNA。
在实施方案中，细胞穿透性复合物中存在的阳离子两亲性聚合物分子中的阳离子数与核酸分子上的阴离子数之间的比率可以为约1:1、约5:1、约10:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约1010:1或更大或前述值的任何间插范围。在其他实施方案中，细胞穿透性复合物中存在的核酸分子上的阴离子数与阳离子两亲性聚合物分子上的阳离子数之间的比率可以为约1:1、约5:1、约10:1、约20:1、约30:1、约40:1、约50:1、约60:1、约70:1、约80:1、约90:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约1010:1或更大或前述值的任何间插范围。在一些优选的实施方案中，该比率是两亲性聚合物分子上的大约10个阳离子电荷与核酸上的1个负电荷。其他实施方案可以具有两亲性聚合物分子上的5个阳离子电荷对比核酸上的1个负电荷，或两亲性聚合物分子上的20个阳离子电荷对比核酸上的1个负电荷。
在实施方案中，细胞穿透性复合物中存在的核酸分子数与阳离子两亲性聚合物分子数之间的比率可以为约1:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约1010:1或更大或前述值的任何间插范围。在其他实施方案中，细胞穿透性复合物中存在的阳离子两亲性聚合物分子数与核酸分子数之间的比率可以为约1:1、约10:1、约102:1、约103:1、约104:1、约105:1、约106:1、约107:1、约108:1、约109:1、约1010:1或更大或前述值的任何间插范围。
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以是阳离子电荷改变可释放转运蛋白(CART)。在实施方案中，CART可包括含有一系列阳离子序列的寡聚链，所述阳离子序列经历电荷从阳离子至中性或从阳离子至阴离子的pH敏感性变化。
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有pH敏感性解体结构域和亲脂性聚合物结构域。在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可有利于细胞穿透、细胞递送和/或跨细胞膜转运。在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可以基本上不溶于水(例如，小于约0.0005mg/mL至约10mg/mL可溶于水)。在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可以有利于阳离子两亲性聚合物聚集成纳米颗粒。在实施方案中，此类纳米颗粒可以具有约50nm至约500nm的平均最长尺寸。在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可有利于阳离子两性聚合物在进入内体内并在内体内解体后的残余物的内体融合。在实施方案中，本公开的细胞穿透性复合物保护核酸货物免于降解。术语“核酸货物”等在通常和常规意义上是指希望通过本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案转运到细胞中的物质。
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有式(I)：
H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)，其中L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；IM为pH敏感性自我解体结构域；z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且z2为2至100的整数。
在实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C3亚烷基。在实施方案中，L1为取代或未取代的亚甲基。在实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C6亚烷基或取代或未取代的2至6元亚杂烷基。在实施方案中，L1为取代或未取代的C1-C3亚烷基或取代或未取代的2至3元亚杂烷基。
在实施方案中，L1为取代或未取代的亚烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的亚杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的亚环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的亚杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的亚芳基(例如，C6-C10或亚苯基)或取代或未取代的亚杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，L1为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L1是未取代的亚烷基、未取代的亚杂烷基、未取代的亚环烷基、未取代的亚杂环烷基、未取代的亚芳基或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L1为未取代的亚烷基(例如，C1-C6亚烷基)。在实施方案中，L1为键。
在实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C3亚烷基。在实施方案中，L2为取代或未取代的亚甲基。在实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C6亚烷基或取代或未取代的2至6元亚杂烷基。在实施方案中，L2为取代或未取代的C1-C3亚烷基或取代或未取代的2至3元亚杂烷基。
在实施方案中，L2为取代或未取代的亚烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的亚杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的亚环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的亚杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的亚芳基(例如，C6-C10或亚苯基)或取代或未取代的亚杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，L2为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L2是未取代的亚烷基、未取代的亚杂烷基、未取代的亚环烷基、未取代的亚杂环烷基、未取代的亚芳基或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L2为未取代的亚烷基(例如，C1-C6亚烷基)。在实施方案中，L2为键。
在实施方案中，z2为2至90(例如5至90、10至90或20至90)、2至80(例如5至80、10至80或20至80)、2至70(例如5至70、10至70或20至70)、2至50(例如5至50、10至50或20至50)或2至25的整数。在实施方案中，z1、z3和z4独立地为0至90(例如5至90、10至90或20至90)、0至80(例如5至80、10至80或20至80)、0至70(例如5至70、10至70或20至70)、0至50(例如5至50、10至50或20至50)或2至25的整数。在实施方案中，z1、z3和z4独立地为2至90(例如5至90、10至90或20至90)、2至80(例如5至80、10至80或20至80)、2至70(例如5至70、10至70或20至70)、2至50(例如5至50、10至50或20至50)或2至25的整数。
在细胞穿透性复合物的实施方案中，pH敏感性解体结构域包括第一亲核部分和第一亲电子部分，其中第一亲核部分在pH范围内与第一亲电子部分反应并且在该pH范围(例如，pH约1-5、pH约5-7或pH约7-10)之外基本上不与亲电子部分反应。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围是：pH 1-3、pH 2-4、pH 3-5、pH 4-6、pH5-7、pH 6-8、pH 7-9或pH 8-10。亲核部分根据其在化学中的普通含义使用，并且是指能够供给电子的部分(例如，官能团)。
在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 1-3。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 2-4。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 3-5。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 4-6。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 5-7。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 6-8。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 7-9。在实施方案中，第一亲核部分与第一亲电子部分最具反应性的pH范围为pH 8-10。在实施方案中，pH为1。在实施方案中，pH为2。在实施方案中，pH为3。在实施方案中，pH为4。在实施方案中，pH为5。在实施方案中，pH为6。在实施方案中，pH为7。在实施方案中，pH为8。在实施方案中，pH为9。在实施方案中，pH为10。在实施方案中，pH为约1。在实施方案中，pH为约2。在实施方案中，pH为约3。在实施方案中，pH为约4。在实施方案中，pH为约5。在实施方案中，pH为约6。在实施方案中，pH为约7。在实施方案中，pH为约8。在实施方案中，pH为约9。在实施方案中，pH为约10。
在实施方案中，第一亲核部分在低pH(例如，pH约1至约5)下基本上质子化。在实施方案中，第一亲核部分在pH 5-7的范围内基本上质子化。在实施方案中，第一亲核部分是阳离子的。在实施方案中，第一亲核部分包括阳离子氮(例如阳离子胺)。
在实施方案中，第一亲核部分可以连接至pH不稳定的保护基团。术语“pH不稳定的保护基团”等在通常和常规意义上是指能够保护与其连接的另一种官能团的化学部分，并且所述保护基团可以在某些pH条件下(例如降低pH)裂解或以其他方式作为保护基团失活。在一个实施方案中，pH不稳定的保护基团是–CO2-t-Bu，在酸性条件下(例如，pH低于7)除去的基团。另外的亲核试剂保护基团还可包括通过光、热、亲核试剂和碱裂解的那些。
在上文公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式(II)的结构：
Figure BDA0003771948270000171
其中n为2或更大的整数；n1为0至50的整数；Z为亲核部分；X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；X2为–O-或–S-，并且R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n1为在0-25、0-10、0-5范围内的整数。在实施方案中，n1为0、1、2、3、4或5。在实施方案中，n1为1或2。
在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8为氢。
在上文公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有以下结构
Figure BDA0003771948270000172
其中R1、R2、R3、R4、X1、Z和X2如先前所定义，并且n1和n2为大于1的整数。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(III)的结构：
Figure BDA0003771948270000181
其中n为2或更大的整数；Z为亲核部分；X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；X2为–O-或–S-，并且R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在实施方案中，R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8为氢。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(IV)的结构：
Figure BDA0003771948270000182
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。在实施方案中，n为2至15。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(IV)的结构：
Figure BDA0003771948270000183
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(V)的结构：
Figure BDA0003771948270000191
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(Va)的结构：
Figure BDA0003771948270000192
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在实施方案中，pH敏感性解体结构域具有以下结构：
Figure BDA0003771948270000193
其中X6为-O-、-NH-、-CONH-、-COO-、-OCO-、-NHCO-，R20为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，并且R21为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为寡聚二醇部分。
在实施方案中，R20为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R20为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R20为氢。
在实施方案中，R21为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R21为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R21为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R21为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R21为氢。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有以下结构：
Figure BDA0003771948270000201
其中R24、R25和R26为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，并且n3为0至50的整数。
在实施方案中，R24、R25和R26独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R24、R25和R26独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1.1、R24、R25和R26独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R24、R25和R26独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在具体实施方案中，R24、R25和R26独立地为氢。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(VI)的结构：
Figure BDA0003771948270000202
其中n为2或更大的整数；n1为0至50的整数；X1为键、-O-、-NR5-、-C(R5)(R6)-或-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；X2为键、-O-、-C(R9)(R10)-或-C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-；X4为键、-NR16-、-O-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；X5为亲核部分；并且R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19为氢。
在实施方案中，Z为亲核部分。在实施方案中，Z为-S-、-OR13-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，Z为-S-。在实施方案中，Z为-S+R13-。在实施方案中，Z为-NR13-。在实施方案中，Z为-N+(R13)(H)-。在实施方案中，Z为-S+H-。在实施方案中，Z为-NH-。在实施方案中，Z为-N+H2-。在实施方案中，Z为-OH-。
在实施方案中，R13独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R13独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R13独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R13独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R13为氢。
在实施方案中，Z为
Figure BDA0003771948270000211
其中X3为-C(R15)-或-N-；X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；X5为亲核部分；并且R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，X3为-CH。
在实施方案中，R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在实施方案中，X5为-N+(R13)(H)，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
关于本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案，在实施方案中亲脂性聚合物结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000221
其中，n2为1至100的整数，R20独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R20为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R20为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在实施方案中，R20为未取代的C1-C30烷基。在实施方案中，R20为未取代的C1-C20烷基。在实施方案中，R20为未取代的C8-C30烷基。在实施方案中，R20为未取代的C8-C20烷基。在实施方案中，R20为未取代的C9-C20烷基。在实施方案中，R20为未取代的C9-C18烷基。在实施方案中，R20为未取代的C18烷基。在实施方案中，R20为未取代的C17烷基。在实施方案中，R20为未取代的C16烷基。在实施方案中，R20为未取代的C15烷基。在实施方案中，R20为未取代的C14烷基。在实施方案中，R20为未取代的C13烷基。在实施方案中，R20为未取代的C12烷基。在实施方案中，R20为未取代的C11烷基。在实施方案中，R20为未取代的C10烷基。在实施方案中，R20为未取代的C9烷基。在实施方案中，R20为未取代的C8烷基。在实施方案中，R20为未取代的C7烷基。在实施方案中，R20为未取代的C6烷基。在实施方案中，R20为未取代的C5烷基。在实施方案中，R20为未取代的C4烷基。在实施方案中，R20为未取代的C3烷基。在实施方案中，R20为未取代的C2烷基。
在实施方案中，R20为未取代的C1-C30烯基。在实施方案中，R20为未取代的C1-C20烯基。在实施方案中，R20为未取代的C8-C30烯基。在实施方案中，R20为未取代的C8-C20烯基。在实施方案中，R20为未取代的C9-C20烯基。在实施方案中，R20为未取代的C9-C18烯基。在实施方案中，R20为未取代的C18烯基。在实施方案中，R20为未取代的C17烯基。在实施方案中，R20为未取代的C16烯基。在实施方案中，R20为未取代的C15烯基。在实施方案中，R20为未取代的C14烯基。在实施方案中，R20为未取代的C13烯基。在实施方案中，R20为未取代的C12烯基。在实施方案中，R20为未取代的C11烯基。在实施方案中，R20为未取代的C10烯基。在实施方案中，R20为未取代的C9烯基。在实施方案中，R20为未取代的C8烯基。在实施方案中，R20为未取代的C7烯基。在实施方案中，R20为未取代的C6烯基。在实施方案中，R20为未取代的C5烯基。在实施方案中，R20为未取代的C4烯基。在实施方案中，R20为未取代的C3烯基。在实施方案中，R20为未取代的C2烯基。
在实施方案中，R20为硬脂酰基部分(例如未取代的C18烷基)。在实施方案中，R20为油基部分(例如未取代的C18烯基)。在实施方案中，R20为亚油基部分(例如未取代的C18烯基)。在实施方案中，R20为十二烷基部分(例如未取代的C12烷基)。在实施方案中，R20为壬烯基部分(例如未取代的C9烯基)。在实施方案中，R20为
Figure BDA0003771948270000231
在实施方案中，亲脂性聚合物结构域为下式(Ia)的化合物：
Figure BDA0003771948270000232
其中X6可以为-O-、-NH-、-CO2-、-CONH-、-O2C-或-NHCO-，R20为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，R21为氢、取代或未取代的烷基，并且n如本文所定义。在实施方案中，R20为寡聚二醇部分。
在实施方案中，R20为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R20为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R20为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在实施方案中，R21为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R21为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R21为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R21为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有以下结构：
Figure BDA0003771948270000241
其中n4为0至50的整数。在实施方案中，n4为0至10。在实施方案中，n4为1至15的整数。
在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，亲脂性聚合物具有以下结构：
Figure BDA0003771948270000242
其中X7为-O-、-NH-、-CO2-、-CONH-、-O2C-或-NHCO-；R22为氢、或取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，并且R23为取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在实施方案中，R22为寡聚二醇部分。
在实施方案中，R22为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R22为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R22为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R22为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可以为下式(Ib)的化合物：
Figure BDA0003771948270000251
其中R100为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。R1、R2、R3、R4为氢、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，并且n100为2或更大的整数，如本文所定义的。
在实施方案中，R1、R2、R3、R4独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R1、R2、R3、R4独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R3、R4独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1、R2、R3、R4独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4是氢。
在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可以为下式(Ic)的化合物：
Figure BDA0003771948270000252
其中R200为取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，并且n200为2或更大的整数。在实施方案中，R200为寡聚二醇部分。在实施方案中，R200为胺封端的寡聚二醇部分。术语“寡聚二醇部分”是指
Figure BDA0003771948270000253
并且“胺封端的寡聚二醇部分”是指
Figure BDA0003771948270000254
其中n200为2或更大的整数。
在实施方案中，R200为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R200为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R200为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R200为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。在实施方案中，R200为氢。
在实施方案中，亲脂性聚合物结构域可以为下式(Id)的化合物：
Figure BDA0003771948270000261
其中R为取代或未取代的烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，R300和R301独立地为氢或取代或未取代的烷基，并且n300如本文所定义。在实施方案中，R302为寡聚二醇部分。在实施方案中，R为胺封端的寡聚二醇部分。在实施方案中，R300、R301和R302为氢。
在实施方案中，R300、R301和R302独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R300、R301和R302独立地为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R300、R301和R302独立地为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。在实施方案中，R300、R301和R302独立地为氢或未取代的烷基(例如，C1-C6烷基)。
在一方面，本文的公开内容提供了细胞穿透性复合物，其具有与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸。阳离子两亲性聚合物可以具有pH敏感性解体结构域。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有pH敏感性解体结构域和亲脂性聚合物结构域。在一些实施方案中，细胞穿透性复合物具有下式(VII)的阳离子两亲性聚合物：
R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
其中
R1A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
R2A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且z2为2至100的整数。
在实施方案中，R1A为取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R1A独立地为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8、C1-C6、C1-C4或C1-C2)、取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元、2至6元、4至6元、2至3元或4至5元)、取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8、C3-C6、C4-C6或C5-C6)、取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元、3至6元、4至6元、4至5元或5至6元)、取代或未取代的芳基(例如，C6-C10或苯基)或取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元、5至9元或5至6元)。在实施方案中，R1A为取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂环烷基、取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的芳基，或取代(例如，被取代基团、大小有限的取代基团或低级取代基团取代)或未取代的杂芳基。在实施方案中，R1A为未取代的烷基、未取代的杂烷基、未取代的环烷基、未取代的杂环烷基、未取代的芳基或未取代的杂芳基。
在实施方案中，R1A为氢、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的2至6元杂烷基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3至6元杂环烷基、取代或未取代的苯基或取代或未取代的5至6元杂芳基。
在实施方案中，R1A为取代或未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)。在实施方案中，R1A为取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)。在实施方案中，R1A为未取代的烷基(例如，C1-C8烷基、C1-C6烷基或C1-C4烷基)。在实施方案中，R1A为取代或未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，R1A为取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，R1A为未取代的杂烷基(例如，2至8元杂烷基、2至6元杂烷基或2至4元杂烷基)。在实施方案中，R1A为取代或未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)。在实施方案中，R1A为取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)。在实施方案中，R1A为未取代的环烷基(例如，C3-C8环烷基、C3-C6环烷基或C5-C6环烷基)。在实施方案中，R1A为取代或未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)。在实施方案中，R1A为取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)。在实施方案中，R1A为未取代的杂环烷基(例如，3至8元杂环烷基、3至6元杂环烷基或5至6元杂环烷基)。在实施方案中，R1A为取代或未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)。在实施方案中，R1A为取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)。在实施方案中，R1A为未取代的芳基(例如，C6-C10芳基、C10芳基或苯基)。在实施方案中，R1A为取代或未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，R1A为取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。在实施方案中，R1A为未取代的杂芳基(例如，5至10元杂芳基、5至9元杂芳基或5至6元杂芳基)。
在实施方案中，R1A为取代或未取代的芳基。在一些其他实施方案中，R1A为取代或未取代的苯基。在仍一些其他实施方案中，R1A为取代或未取代的芳基。在仍一些其他实施方案中，R1A为取代或未取代的苯基或萘基。
在一些实施方案中，细胞穿透性复合物可以具有具有下式(VIII)的阳离子两亲性聚合物：
Figure BDA0003771948270000281
其中
环A为取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
CART可以具有下式：-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A
其中，
R2A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；IM为pH敏感性解体结构域；z5为1至10的整数；z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且z2为2至100的整数。
在一些实施方案中，在上式(VIII)中，环A为取代或未取代的芳基。在一些其他实施方案中，环A为取代或未取代的苯基。在仍一些其他实施方案中，环A为取代或未取代的芳基。在仍一些其他实施方案中，环A为取代或未取代的苯基或萘基。
在实施方案中，环A为未取代的芳基(即，除CART部分以外未取代)。在实施方案中，环A为未取代的苯基(即，除CART部分以外未取代)。在实施方案中，环A为未取代的苯基或萘基(即，除CART部分以外未取代)。在实施方案中，环A为取代的芳基(即，除CART部分之外被取代)。在实施方案中，环A为取代的苯基(即，除CART部分之外被取代)。在实施方案中，环A为取代的苯基或萘基(即，除CART部分之外被取代)。
在实施方案中，细胞穿透性复合物具有可检测剂(例如荧光团)。
在实施方案中，R1A为被甲氧基接头取代的芳基。在实施方案中，R1A为被接头(例如，-CH2-O-)取代的芳基。其中R1A为被甲氧基接头取代的芳基的非限制性实例具有下式：
Figure BDA0003771948270000282
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有式(IX)：
Figure BDA0003771948270000283
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有式(X)：
Figure BDA0003771948270000284
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有式(XI)：
Figure BDA0003771948270000291
其中CART1、CART2和CART3独立地为如式(VIII)中所定义的CART部分(例如，-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A)。在实施方案中，每个CART部分任选地是不同的。
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000292
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000301
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000302
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000303
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000304
在实施方案中，阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000305
在实施方案中，环A通过接头(例如，键、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基)被可检测剂取代。
在一些实施方案中，细胞穿透性复合物具有阳离子两亲性聚合物，所述阳离子两亲性聚合物具有前述式中的任一种，其中L1为–CH2-O-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。在实施方案中，L1为–CH2-O-。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中L1为–CH2-O-、
Figure BDA0003771948270000306
在实施方案中，L1为–CH2-O-。在实施方案中，L1为
Figure BDA0003771948270000311
在实施方案中，L1为
Figure BDA0003771948270000312
在实施方案中，L1为
Figure BDA0003771948270000313
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中z1、z3和z4可独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0。在一些实施方案中，z1、z3和z4可以独立地为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0。在实施方案中，z1、z3和z4可以独立地为在2-100或2-50的范围内的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0。
在实施方案中，z1为0。在实施方案中，z1为1。在实施方案中，z1为2。在实施方案中，z1为3。在实施方案中，z1为4。在实施方案中，z1为5。在实施方案中，z1为6。在实施方案中，z1为7。在实施方案中，z1为8。在实施方案中，z1为9。在实施方案中，z1为10。在实施方案中，z1为11。在实施方案中，z1为12。在实施方案中，z1为13。在实施方案中，z1为14。在实施方案中，z1为15。在实施方案中，z1为16。在实施方案中，z1为17。在实施方案中，z1为18。在实施方案中，z1为19。在实施方案中，z1为20。在实施方案中，z1为21。在实施方案中，z1为22。在实施方案中，z1为23。在实施方案中，z1为24。在实施方案中，z1为25。在实施方案中，z1为26。在实施方案中，z1为27。在实施方案中，z1为28。在实施方案中，z1为29。在实施方案中，z1为30。在实施方案中，z1为31。在实施方案中，z1为32。在实施方案中，z1为33。在实施方案中，z1为34。在实施方案中，z1为35。在实施方案中，z1为36。在实施方案中，z1为37。在实施方案中，z1为38。在实施方案中，z1为39。在实施方案中，z1为40。在实施方案中，z1为41。在实施方案中，z1为42。在实施方案中，z1为43。在实施方案中，z1为44。在实施方案中，z1为45。在实施方案中，z1为46。在实施方案中，z1为47。在实施方案中，z1为48。在实施方案中，z1为49。在实施方案中，z1为50。在实施方案中，z1为51。在实施方案中，z1为52。在实施方案中，z1为53。在实施方案中，z1为54。在实施方案中，z1为55。在实施方案中，z1为56。在实施方案中，z1为57。在实施方案中，z1为58。在实施方案中，z1为59。在实施方案中，z1为60。在实施方案中，z1为61。在实施方案中，z1为62。在实施方案中，z1为63。在实施方案中，z1为64。在实施方案中，z1为65。在实施方案中，z1为66。在实施方案中，z1为67。在实施方案中，z1为68。在实施方案中，z1为69。在实施方案中，z1为70。在实施方案中，z1为71。在实施方案中，z1为72。在实施方案中，z1为73。在实施方案中，z1为74。在实施方案中，z1为75。在实施方案中，z1为76。在实施方案中，z1为77。在实施方案中，z1为78。在实施方案中，z1为79。在实施方案中，z1为80。在实施方案中，z1为81。在实施方案中，z1为82。在实施方案中，z1为83。在实施方案中，z1为84。在实施方案中，z1为85。在实施方案中，z1为86。在实施方案中，z1为87。在实施方案中，z1为88。在实施方案中，z1为89。在实施方案中，z1为90。在实施方案中，z1为91。在实施方案中，z1为92。在实施方案中，z1为93。在实施方案中，z1为94。在实施方案中，z1为95。在实施方案中，z1为96。在实施方案中，z1为97。在实施方案中，z1为98。在实施方案中，z1为99。在实施方案中，z1为100。
在实施方案中，z3为0。在实施方案中，z3为1。在实施方案中，z3为2。在实施方案中，z3为3。在实施方案中，z3为4。在实施方案中，z3为5。在实施方案中，z3为6。在实施方案中，z3为7。在实施方案中，z3为8。在实施方案中，z3为9。在实施方案中，z3为10。在实施方案中，z3为11。在实施方案中，z3为12。在实施方案中，z3为13。在实施方案中，z3为14。在实施方案中，z3为15。在实施方案中，z3为16。在实施方案中，z3为17。在实施方案中，z3为18。在实施方案中，z3为19。在实施方案中，z3为20。在实施方案中，z3为21。在实施方案中，z3为22。在实施方案中，z3为23。在实施方案中，z3为24。在实施方案中，z3为25。在实施方案中，z3为26。在实施方案中，z3为27。在实施方案中，z3为28。在实施方案中，z3为29。在实施方案中，z3为30。在实施方案中，z3为31。在实施方案中，z3为32。在实施方案中，z3为33。在实施方案中，z3为34。在实施方案中，z3为35。在实施方案中，z3为36。在实施方案中，z3为37。在实施方案中，z3为38。在实施方案中，z3为39。在实施方案中，z3为40。在实施方案中，z3为41。在实施方案中，z3为42。在实施方案中，z3为43。在实施方案中，z3为44。在实施方案中，z3为45。在实施方案中，z3为46。在实施方案中，z3为47。在实施方案中，z3为48。在实施方案中，z3为49。在实施方案中，z3为50。在实施方案中，z3为51。在实施方案中，z3为52。在实施方案中，z3为53。在实施方案中，z3为54。在实施方案中，z3为55。在实施方案中，z3为56。在实施方案中，z3为57。在实施方案中，z3为58。在实施方案中，z3为59。在实施方案中，z3为60。在实施方案中，z3为61。在实施方案中，z3为62。在实施方案中，z3为63。在实施方案中，z3为64。在实施方案中，z3为65。在实施方案中，z3为66。在实施方案中，z3为67。在实施方案中，z3为68。在实施方案中，z3为69。在实施方案中，z3为70。在实施方案中，z3为71。在实施方案中，z3为72。在实施方案中，z3为73。在实施方案中，z3为74。在实施方案中，z3为75。在实施方案中，z3为76。在实施方案中，z3为77。在实施方案中，z3为78。在实施方案中，z3为79。在实施方案中，z3为80。在实施方案中，z3为81。在实施方案中，z3为82。在实施方案中，z3为83。在实施方案中，z3为84。在实施方案中，z3为85。在实施方案中，z3为86。在实施方案中，z3为87。在实施方案中，z3为88。在实施方案中，z3为89。在实施方案中，z3为90。在实施方案中，z3为91。在实施方案中，z3为92。在实施方案中，z3为93。在实施方案中，z3为94。在实施方案中，z3为95。在实施方案中，z3为96。在实施方案中，z3为97。在实施方案中，z3为98。在实施方案中，z3为99。在实施方案中，z3为100。
在实施方案中，z4为0。在实施方案中，z4为1。在实施方案中，z4为2。在实施方案中，z4为3。在实施方案中，z4为4。在实施方案中，z4为5。在实施方案中，z4为6。在实施方案中，z4为7。在实施方案中，z4为8。在实施方案中，z4为9。在实施方案中，z4为10。在实施方案中，z4为11。在实施方案中，z4为12。在实施方案中，z4为13。在实施方案中，z4为14。在实施方案中，z4为15。在实施方案中，z4为16。在实施方案中，z4为17。在实施方案中，z4为18。在实施方案中，z4为19。在实施方案中，z4为20。在实施方案中，z4为21。在实施方案中，z4为22。在实施方案中，z4为23。在实施方案中，z4为24。在实施方案中，z4为25。在实施方案中，z4为26。在实施方案中，z4为27。在实施方案中，z4为28。在实施方案中，z4为29。在实施方案中，z4为30。在实施方案中，z4为31。在实施方案中，z4为32。在实施方案中，z4为33。在实施方案中，z4为34。在实施方案中，z4为35。在实施方案中，z4为36。在实施方案中，z4为37。在实施方案中，z4为38。在实施方案中，z4为39。在实施方案中，z4为40。在实施方案中，z4为41。在实施方案中，z4为42。在实施方案中，z4为43。在实施方案中，z4为44。在实施方案中，z4为45。在实施方案中，z4为46。在实施方案中，z4为47。在实施方案中，z4为48。在实施方案中，z4为49。在实施方案中，z4为50。在实施方案中，z4为51。在实施方案中，z4为52。在实施方案中，z4为53。在实施方案中，z4为54。在实施方案中，z4为55。在实施方案中，z4为56。在实施方案中，z4为57。在实施方案中，z4为58。在实施方案中，z4为59。在实施方案中，z4为60。在实施方案中，z4为61。在实施方案中，z4为62。在实施方案中，z4为63。在实施方案中，z4为64。在实施方案中，z4为65。在实施方案中，z4为66。在实施方案中，z4为67。在实施方案中，z4为68。在实施方案中，z4为69。在实施方案中，z4为70。在实施方案中，z4为71。在实施方案中，z4为72。在实施方案中，z4为73。在实施方案中，z4为74。在实施方案中，z4为75。在实施方案中，z4为76。在实施方案中，z4为77。在实施方案中，z4为78。在实施方案中，z4为79。在实施方案中，z4为80。在实施方案中，z4为81。在实施方案中，z4为82。在实施方案中，z4为83。在实施方案中，z4为84。在实施方案中，z4为85。在实施方案中，z4为86。在实施方案中，z4为87。在实施方案中，z4为88。在实施方案中，z4为89。在实施方案中，z4为90。在实施方案中，z4为91。在实施方案中，z4为92。在实施方案中，z4为93。在实施方案中，z4为94。在实施方案中，z4为95。在实施方案中，z4为96。在实施方案中，z4为97。在实施方案中，z4为98。在实施方案中，z4为99。在实施方案中，z4为100。
在实施方案中，n为2。在实施方案中，n为3。在实施方案中，n为4。在实施方案中，n为5。在实施方案中，n为6。在实施方案中，n为7。在实施方案中，n为8。在实施方案中，n为9。在实施方案中，n为10。在实施方案中，n为11。在实施方案中，n为12。在实施方案中，n为13。在实施方案中，n为14。在实施方案中，n为15。在实施方案中，n为16。在实施方案中，n为17。在实施方案中，n为18。在实施方案中，n为19。在实施方案中，n为20。在实施方案中，n为21。在实施方案中，n为22。在实施方案中，n为23。在实施方案中，n为24。在实施方案中，n为25。在实施方案中，n为26。在实施方案中，n为27。在实施方案中，n为28。在实施方案中，n为29。在实施方案中，n为30。在实施方案中，n为31。在实施方案中，n为32。在实施方案中，n为33。在实施方案中，n为34。在实施方案中，n为35。在实施方案中，n为36。在实施方案中，n为37。在实施方案中，n为38。在实施方案中，n为39。在实施方案中，n为40。在实施方案中，n为41。在实施方案中，n为42。在实施方案中，n为43。在实施方案中，n为44。在实施方案中，n为45。在实施方案中，n为46。在实施方案中，n为47。在实施方案中，n为48。在实施方案中，n为49。在实施方案中，n为50。在实施方案中，n为51。在实施方案中，n为52。在实施方案中，n为53。在实施方案中，n为54。在实施方案中，n为55。在实施方案中，n为56。在实施方案中，n为57。在实施方案中，n为58。在实施方案中，n为59。在实施方案中，n为60。在实施方案中，n为61。在实施方案中，n为62。在实施方案中，n为63。在实施方案中，n为64。在实施方案中，n为65。在实施方案中，n为66。在实施方案中，n为67。在实施方案中，n为68。在实施方案中，n为69。在实施方案中，n为70。在实施方案中，n为71。在实施方案中，n为72。在实施方案中，n为73。在实施方案中，n为74。在实施方案中，n为75。在实施方案中，n为76。在实施方案中，n为77。在实施方案中，n为78。在实施方案中，n为79。在实施方案中，n为80。在实施方案中，n为81。在实施方案中，n为82。在实施方案中，n为83。在实施方案中，n为84。在实施方案中，n为85。在实施方案中，n为86。在实施方案中，n为87。在实施方案中，n为88。在实施方案中，n为89。在实施方案中，n为90。在实施方案中，n为91。在实施方案中，n为92。在实施方案中，n为93。在实施方案中，n为94。在实施方案中，n为95。在实施方案中，n为96。在实施方案中，n为97。在实施方案中，n为98。在实施方案中，n为99。在实施方案中，n为100。
在实施方案中，n1为0。在实施方案中，n1为1。在实施方案中，n1为2。在实施方案中，n1为3。在实施方案中，n1为4。在实施方案中，n1为5。在实施方案中，n1为6。在实施方案中，n1为7。在实施方案中，n1为8。在实施方案中，n1为9。在实施方案中，n1为10。在实施方案中，n1为11。在实施方案中，n1为12。在实施方案中，n1为13。在实施方案中，n1为14。在实施方案中，n1为15。在实施方案中，n1为16。在实施方案中，n1为17。在实施方案中，n1为18。在实施方案中，n1为19。在实施方案中，n1为20。在实施方案中，n1为21。在实施方案中，n1为22。在实施方案中，n1为23。在实施方案中，n1为24。在实施方案中，n1为25。在实施方案中，n1为26。在实施方案中，n1为27。在实施方案中，n1为28。在实施方案中，n1为29。在实施方案中，n1为30。在实施方案中，n1为31。在实施方案中，n1为32。在实施方案中，n1为33。在实施方案中，n1为34。在实施方案中，n1为35。在实施方案中，n1为36。在实施方案中，n1为37。在实施方案中，n1为38。在实施方案中，n1为39。在实施方案中，n1为40。在实施方案中，n1为41。在实施方案中，n1为42。在实施方案中，n1为43。在实施方案中，n1为44。在实施方案中，n1为45。在实施方案中，n1为46。在实施方案中，n1为47。在实施方案中，n1为48。在实施方案中，n1为49。在实施方案中，n1为50。
在实施方案中，n2为1。在实施方案中，n2为2。在实施方案中，n2为3。在实施方案中，n2为4。在实施方案中，n2为5。在实施方案中，n2为6。在实施方案中，n2为7。在实施方案中，n2为8。在实施方案中，n2为9。在实施方案中，n2为10。在实施方案中，n2为11。在实施方案中，n2为12。在实施方案中，n2为13。在实施方案中，n2为14。在实施方案中，n2为15。在实施方案中，n2为16。在实施方案中，n2为17。在实施方案中，n2为18。在实施方案中，n2为19。在实施方案中，n2为20。在实施方案中，n2为21。在实施方案中，n2为22。在实施方案中，n2为23。在实施方案中，n2为24。在实施方案中，n2为25。在实施方案中，n2为26。在实施方案中，n2为27。在实施方案中，n2为28。在实施方案中，n2为29。在实施方案中，n2为30。在实施方案中，n2为31。在实施方案中，n2为32。在实施方案中，n2为33。在实施方案中，n2为34。在实施方案中，n2为35。在实施方案中，n2为36。在实施方案中，n2为37。在实施方案中，n2为38。在实施方案中，n2为39。在实施方案中，n2为40。在实施方案中，n2为41。在实施方案中，n2为42。在实施方案中，n2为43。在实施方案中，n2为44。在实施方案中，n2为45。在实施方案中，n2为46。在实施方案中，n2为47。在实施方案中，n2为48。在实施方案中，n2为49。在实施方案中，n2为50。在实施方案中，n2为51。在实施方案中，n2为52。在实施方案中，n2为53。在实施方案中，n2为54。在实施方案中，n2为55。在实施方案中，n2为56。在实施方案中，n2为57。在实施方案中，n2为58。在实施方案中，n2为59。在实施方案中，n2为60。在实施方案中，n2为61。在实施方案中，n2为62。在实施方案中，n2为63。在实施方案中，n2为64。在实施方案中，n2为65。在实施方案中，n2为66。在实施方案中，n2为67。在实施方案中，n2为68。在实施方案中，n2为69。在实施方案中，n2为70。在实施方案中，n2为71。在实施方案中，n2为72。在实施方案中，n2为73。在实施方案中，n2为74。在实施方案中，n2为75。在实施方案中，n2为76。在实施方案中，n2为77。在实施方案中，n2为78。在实施方案中，n2为79。在实施方案中，n2为80。在实施方案中，n2为81。在实施方案中，n2为82。在实施方案中，n2为83。在实施方案中，n2为84。在实施方案中，n2为85。在实施方案中，n2为86。在实施方案中，n2为87。在实施方案中，n2为88。在实施方案中，n2为89。在实施方案中，n2为90。在实施方案中，n2为91。在实施方案中，n2为92。在实施方案中，n2为93。在实施方案中，n2为94。在实施方案中，n2为95。在实施方案中，n2为96。在实施方案中，n2为97。在实施方案中，n2为98。在实施方案中，n2为99。在实施方案中，n2为100。
在实施方案中，z2为2。在实施方案中，z2为3。在实施方案中，z2为4。在实施方案中，z2为5。在实施方案中，z2为6。在实施方案中，z2为7。在实施方案中，z2为8。在实施方案中，z2为9。在实施方案中，z2为10。在实施方案中，z2为11。在实施方案中，z2为12。在实施方案中，z2为13。在实施方案中，z2为14。在实施方案中，z2为15。在实施方案中，z2为16。在实施方案中，z2为17。在实施方案中，z2为18。在实施方案中，z2为19。在实施方案中，z2为20。在实施方案中，z2为21。在实施方案中，z2为22。在实施方案中，z2为23。在实施方案中，z2为24。在实施方案中，z2为25。在实施方案中，z2为26。在实施方案中，z2为27。在实施方案中，z2为28。在实施方案中，z2为29。在实施方案中，z2为30。在实施方案中，z2为31。在实施方案中，z2为32。在实施方案中，z2为33。在实施方案中，z2为34。在实施方案中，z2为35。在实施方案中，z2为36。在实施方案中，z2为37。在实施方案中，z2为38。在实施方案中，z2为39。在实施方案中，z2为40。在实施方案中，z2为41。在实施方案中，z2为42。在实施方案中，z2为43。在实施方案中，z2为44。在实施方案中，z2为45。在实施方案中，z2为46。在实施方案中，z2为47。在实施方案中，z2为48。在实施方案中，z2为49。在实施方案中，z2为50。在实施方案中，z2为51。在实施方案中，z2为52。在实施方案中，z2为53。在实施方案中，z2为54。在实施方案中，z2为55。在实施方案中，z2为56。在实施方案中，z2为57。在实施方案中，z2为58。在实施方案中，z2为59。在实施方案中，z2为60。在实施方案中，z2为61。在实施方案中，z2为62。在实施方案中，z2为63。在实施方案中，z2为64。在实施方案中，z2为65。在实施方案中，z2为66。在实施方案中，z2为67。在实施方案中，z2为68。在实施方案中，z2为69。在实施方案中，z2为70。在实施方案中，z2为71。在实施方案中，z2为72。在实施方案中，z2为73。在实施方案中，z2为74。在实施方案中，z2为75。在实施方案中，z2为76。在实施方案中，z2为77。在实施方案中，z2为78。在实施方案中，z2为79。在实施方案中，z2为80。在实施方案中，z2为81。在实施方案中，z2为82。在实施方案中，z2为83。在实施方案中，z2为84。在实施方案中，z2为85。在实施方案中，z2为86。在实施方案中，z2为87。在实施方案中，z2为88。在实施方案中，z2为89。在实施方案中，z2为90。在实施方案中，z2为91。在实施方案中，z2为92。在实施方案中，z2为93。在实施方案中，z2为94。在实施方案中，z2为95。在实施方案中，z2为96。在实施方案中，z2为97。在实施方案中，z2为98。在实施方案中，z2为99。在实施方案中，z2为100。
在实施方案中，z5为1。在实施方案中，z5为2。在实施方案中，z5为3。在实施方案中，z5为4。在实施方案中，z5为5。在实施方案中，z5为6。在实施方案中，z5为7。在实施方案中，z5为8。在实施方案中，z5为9。在实施方案中，z5为10。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中z2为2至100的整数。在一些实施方案中，z2可以为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，z2可以为在2-100或2-50范围内的整数。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中z5为1至3的整数。在一些其他实施方案中，z5为1或3。在仍一些其他实施方案中，z5为1。在仍一些其他实施方案中，z5为3。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中R2为氢。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有前述式中的任一种，其中L2为键。
在实施方案中，CART具有下式：
Figure BDA0003771948270000351
Figure BDA0003771948270000361
Figure BDA0003771948270000371
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000372
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在一些实施方案中，在前述式(IV)中，n为在2-50范围内的整数。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000381
其中
n为2或更大的整数；
n1为0至50的整数；
Z为亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000382
其中
n为2或更大的整数；
Z为亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000383
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000391
其中n为2或更大的整数。在实施方案中，n为在2-100、2-90、2-80、2-70、2-60、2-50、2-40、2-30、2-2或2-10的范围内的整数。在实施方案中，n为在2-100或2-50范围内的整数。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式：
Figure BDA0003771948270000392
其中n为2或更大的整数；n1为0至50的整数；X1为键、-O-、-NR5-、-C(R5)(R6)-或-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；X2为键、-O-、-C(R9)(R10)-或-C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-；X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；X5为亲核部分；并且R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，在具有所指定的上述式中的任一种的pH敏感性解体结构域中，Z为-S-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，在具有所指定的上述式中的任一种的pH敏感性解体结构域中，Z为-S-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，在具有所指定的上述式中的任一种的pH敏感性解体结构域中，Z为
Figure BDA0003771948270000393
其中
X3为C(R15)或N；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，在具有所指定的上述式中的任一种的pH敏感性解体结构域中，Z为
Figure BDA0003771948270000401
其中
X3为C(R15)或N；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，在具有所指定的上述式中的任一种的pH敏感性解体结构域中，X5为-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，pH敏感性解体结构域可以具有下式之一：在本文所公开的细胞穿透性复合物及其实施方案的实施方案中，pH敏感性解体结构域具有下式(IV)的结构：
Figure BDA0003771948270000402
在一些实施方案中，亲脂性聚合物结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000403
其中n2为1至100的整数；
R20独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
在一些实施方案中，亲脂性聚合物结构域，或可互换地称为亲脂性聚合物结构域，可以具有以下R基团变体之一：
Figure BDA0003771948270000411
关于本文所公开的细胞穿透复合物及其实施方案，在实施方案中，核酸可以为DNA或RNA，诸如信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。细胞穿透复合物可以还包括蛋白质或肽。
关于本文所公开的细胞穿透复合物及其实施方案，在实施方案中，细胞穿透性复合物还包括多个亲脂性部分。
关于本文所公开的细胞穿透复合物及其实施方案，在实施方案中，细胞穿透性复合物还包括多个解体结构域。
关于本文所公开的细胞穿透复合物及其实施方案，在实施方案中，上述阳离子序列的抗衡阴离子可以包括本领域已知的常见抗衡离子，例如像乙酸根、三氟乙酸根、三氟甲磺酸根、氯离子、溴离子、硫酸根、磷酸根、琥珀酸根或柠檬酸根。在实施方案中，抗衡阴离子为乙酸根、三氟乙酸根、三氟甲磺酸根、氯离子、溴离子、硫酸根、磷酸根、琥珀酸根或柠檬酸根。
转染
在另一方面，提供了将核酸转染至细胞中的方法或其实施方案，所述方法包括使细胞与本文所公开的细胞穿透性复合物接触。
在实施方案中，所述方法还包括使阳离子两亲性聚合物在细胞内降解，从而形成降解产物。在实施方案中，降解产物是取代或未取代的二酮哌嗪。
关于将核酸转染至细胞中的方法的任何实施方案，在实施方案中，核酸为mRNA。在实施方案中，所述方法还包括允许mRNA在细胞中表达。在实施方案中，细胞形成生物体的一部分。在实施方案中，生物体为人。
本文尤其提供的是新颖的材料和策略，其实现或增强对寡核苷酸和聚阴离子货物(例如信使RNA(mRNA))的复合、保护，向体外和体内的靶细胞、组织和器官中的递送和释放。
例如，本文所公开的用于mRNA递送的一种策略是使用可生物降解的聚(碳酸酯-共-氨基酯)寡聚物及其变体实现的，所述寡聚物及其变体被发现静电复合聚阴离子诸如mRNA，产生保护mRNA货物、容易进入细胞并独特地释放寡核苷酸货物的非共价大分子颗粒。然后通过细胞过程将细胞中释放的mRNA转化成肽和蛋白质，其序列并且由此其活性由mRNA序列决定。
因此，例如，提供了与使用核酸本身和已知的基因递送载体相比大大提高的细胞转染效率。用于递送mRNA的材料和策略也可用于递送其他寡核苷酸，诸如siRNA、pDNA、shRNA和gDNA。它们另外可以用于递送其他阴离子生物分子，诸如肝素、无机多磷酸盐和肌醇多磷酸盐(例如IP3、IP7、IP8)。这种递送可以用多种人和非人细胞系，以及通过体内多种施用方式实现，包括但不限于肌内、静脉内、腹膜内、眼内、鼻内、皮下、口腔和局部。本文所公开的聚(碳酸酯-共-氨基酯)可以用作例如可定制的、可生物降解的生物相容材料以用于生物医学疗法、成像和装置中的应用。与可生物降解的无毒化合物材料诸如戊内酯、己内酯、丙交酯和环状碳酸酯的共聚合允许调节物理和生物学特性，包括货物释放速率、疏水性、靶向配体的掺入、生物分布和毒性。
因此，在一些实施方案中，本文所提供的剂包括可衍生自环状氨基酯和环状甲基三亚甲基碳酸酯(MTC)单体的寡聚物、聚合物、共聚寡聚物和共聚物。环状氨基酯具有吗啉-2-酮及其同系物的基本结构，其中可能的多种取代模式包括以下项。
(1)用多种疏水性基团(例如，R＝烷基、烯基、芳基、多环包括类固醇、杂环)、阳离子基团(例如，铵、鏻、锍、胍鎓，包括用氨基酸，例如甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸的酰化)、阴离子基团(例如羧酸根、硫酸根、磷酸根)或亲水性(例如PEG)氨基甲酸酯的N-酰化。用N-Boc或N-Cbz基团保护吗啉氮，然后进行有机催化的开环寡聚或聚合可以在脱保护时提供阳离子聚合物或寡聚物主链。
(2)用选择的上述可能的官能团在酯羰基旁边进行α-烷基化或官能化，以允许货物复合并随后通过生物降解释放货物。
(3)用上述官能团靠近吗啉氮烷基化。
(4)上述改性的组合。
另外，共聚物或共聚寡聚物(嵌段或统计的)可以通过混合两种或更多种吗啉-2-酮单体，或通过一种或多种吗啉-2-酮单体与一种或多种本文所述的多环碳酸酯单体的共聚(或共聚寡聚)来制得。这些碳酸酯单体可以掺入类似种类的侧链官能团，特别是亲脂性基团或阳离子基团，以调节寡核苷酸稳定性、递送和释放特性。此外，可以使用多种其他可商购获得的环酯单体，包括但不限于丙交酯、乙交酯、戊内酯和/或己内酯，以掺入亲脂性官能团。聚氨基酯和聚(碳酸酯-共-氨基酯)的合成是通过吗啉-2-酮和环状碳酸酯单体的开环聚合和/或共聚合来实现的。使用有机催化体系，将N-Boc保护的吗啉酮(MBoc)聚合为高转化率(>85％)、可调Mn(1kDa-20kDa)和低分子量分布(Mw/Mn-1.1-1.3)。Boc基团的聚合后脱保护得到阳离子(二元，仲胺)水溶性聚合物(在D20中--0.5M，稳定>3天)。此外，MBoc与MTC-十二烷基碳酸酯单体共聚合然后脱保护产生适度带电的阳离子材料，所述阳离子材料收率高(>60％)，具有窄多分散性(<1.4PDI)和可调嵌段长度。嵌段长度由引发剂与单体的比率控制。
聚氨基酯和聚(碳酸酯-共-氨基酯)是生物相容的和可生物降解的。阳离子聚氨基酯通过新颖的pH和缓冲剂依赖性解体机制快速降解，以在一个实施方案中产生双-N-羟乙基-2,5-哌嗪二酮双-羟乙基甘氨酸。这种无法预料的降解产生了在处理浓度下无毒的产物，并且单体形式(进一步水解的预期产物)是美拉德反应中磷脂改性的天然生物标志物。氨基酯/碳酸酯共聚物的碳酸酯链段通过水解和脱羧降解，并且其副产物先前已显示为无毒的。新的聚-和寡聚(碳酸酯-共-氨基酯)由于其独特的降解机制而作为基因递送剂表现出意想不到的性能。这些新材料以适度理论电荷比(例如，约10:1)非共价复合、保护、递送和释放mRNA，从而在体外和体内导致异常的转染效率(在一些情况下>99％)和基因表达的稳健诱导。该策略对于递送不同长度的mRNA分子(测试的1000和2000个核苷酸转录物)是有效的。在一个实施方案中，通过将阳离子聚(碳酸酯-共-氨基酯)与阴离子货物配制以形成大小为200-400nm的自组装颗粒来实现基因递送。这些颗粒在对于细胞内基因递送，并且然后它们一旦在细胞内就释放寡核苷酸货物所需的时间尺度上是稳定的。虽然不受任何特定理论的束缚，但这些物质降解为双-N-羟乙基-2,5-哌嗪二酮产物双-羟乙基甘氨酸。用mRNA/两亲物复合物处理多种人和非人细胞系(例如，HeLa、HaCaT、J774，HEK293)导致通过多种施用方式(肌内和静脉内试验)在体外和体内诱导蛋白质表达(例如，GFP、荧光素酶)。
已经使用编码荧光报告基因的mRNA通过流式细胞术和荧光显微术(GFP)以及生物发光(萤火虫荧光素酶)测量蛋白质表达。已显示聚(碳酸酯-共-氨基酯)为比商业标准Lipofectamine 2000以及先前描述的用于siRNA递送的许多其他先导化合物更有效的转染剂。
在实施方案中，通过在存在经选择以调节所得复合物的稳定性和大小、增加细胞摄取、调节从复合物释放mRNA的速率并增强货物mRNA的表达的第三组分的情况下将混合的两亲性寡聚物与mRNA货物配制来实现基因递送。第三组分包括但不限于配位金属，诸如Zn+2、Mg+2、Ca+2等；动态非共价交联剂，诸如碳水化合物、抗衡离子，诸如Cl-、AcO-、琥珀酸盐和柠檬酸盐；和溶解度调节剂，诸如脂质和PEG。
该技术的应用可包括：临床应用：(1a)核酸转染载体：虽然多年来已经提出利用DNA和RNA治疗遗传性疾病，但临床使用基因疗法的最大障碍仍然是将寡核苷酸货物(lb)RNA疫苗接种有效传递以预防传染性疾病：基于mRNA的疫苗相比于DNA疫苗显示出强大的安全性优势，然而，它们在临床上目前受到mRNA递送到细胞中的限制。目前正在临床上研究该应用，但是最先进的技术需要从患者中移除原代细胞以用于电穿孔的体外转染，随后将转化的细胞重新引入患者体内。使用我们的递送技术可以显著改进该方法以直接诱导体内mRNA表达。(1c)干细胞诱导：通过使用我们的技术诱导4种已知转录因子的表达，可以在未分化的干细胞中诱导多能性。聚(碳酸酯-共-氨基酯)递送媒介物的模块化性质使得能够同时容易地递送所有四种必需的mRNA转录物。(1)基础研究应用，包括但不限于：培养细胞的体外转染、使用CRISPR/Cas9的基因编辑、使用组合性基因表达(mRNA翻译)和基因敲低(RNAi)的途径验证。癌症免疫疗法、过敏耐受、蛋白质替换疗法、基因编辑、诊断法，
本发明公开的复合物、组合物和方法的优点可以包括，例如：
(1)体外mRNA转染效率高于可商购获得的转染剂诸如Lipofectamine 2000，甚至在难以转染的细胞系诸如J774巨噬细胞中，从而在增加耐受性的同时改善功效。
(2)基因表达在体内(BALB/c小鼠)稳健，这证明了该技术的临床适用性，从而避免了阳离子载体诸如lipofectamine的毒性并且为基因递送和表达的离体方法提供了临床替代方案。
(3)可以使用不同的施用途径可实现体内基因差异表达，在静脉内注射时肝脏和脾脏表达占主导地位，而在肌内(例如)递送的情况下在施用位点维持局部表达。鼻腔递送提供了粘膜和/或肺摄入的途径。
(4)对已知代谢物(双羟乙基甘氨酸)快速降解，这能够有效地进行基因表达
(5)以pH依赖性方式释放mRNA，诸如使用带有寡核苷酸的颗粒，所述颗粒在低pH环境(诸如皮肤或肠道)中显示出稳定性，但在较高pH环境中降解。
(6)通过无金属合成容易获得材料，来制备具有目标分子量和高度分散性控制的寡聚物、聚合物或嵌段/统计共聚物或共聚寡聚物。
(7)材料适于通过向成形颗粒的表面添加靶向配体(诸如叶酸或生物素)或通过连接至单克隆抗体来进行靶向。
(8)阳离子聚氨基酯结构域至可分离的中性小分子的特异性解体机制导致形成生物相容/可生物降解的产物，双-N-羟乙基-2,5-哌嗪二酮，即羟乙基甘氨酸的环状二聚体。
所述复合物、组合物和方法的特征包括以下项。在实施方案中，聚(碳酸酯-共-氨基酯)的聚(氨基酯)和由其衍生的阳离子材料可以表现出以下性质特性和功能中的至少一种：
(1)阳离子聚氨基酯的特定的pH响应性解体机制，其产生生物相容/可生物降解的羟乙基甘氨酸二聚体；导致寡核苷酸货物释放的这些材料的结构域甚至在其他响应性生物材料中是独特的，因为它通过意外的分子内键形成事件发生，从而导致阳离子铵的不可逆中和以快速触发阴离子货物的释放。
(2)分子内降解的可分离产物，诸如双-N-羟乙基-2,5-pipericla-7-inedione，其进一步降解为羟乙基甘氨酸。
(3)提供瞬时的活性窗口，使得阴离子货物静电包装成颗粒以用于递送，然后在细胞内化后快速释放。
(4)通过控制大分子结构实现多种内酯单体的共聚。官能化单体可以在嵌段或统计结构中聚合，并且这进一步允许多种单体类型，诸如环状碳酸酯或磷酸酯的组合。
(5)这些材料在体内的使用可以在没有急性毒性的情况下发生，甚至在局部或全身性施用时，这指示了在治疗应答所需的浓度下的高耐受性。
(6)用作基因递送媒介物的用途，聚(碳酸酯-共-氨基酯)实现对寡核苷酸(包括信使RNA)的有效递送和释放。MTC-十二烷基碳酸酯和N-Boc吗啉-2-酮单体的两亲性嵌段共聚寡聚物可以与大阴离子货物诸如mRNA配制形成稳定的亚400nm颗粒。这些产生的颗粒可以有效地被细胞摄取并且释放其mRNA货物，从而产生稳健的基因表达。该概念已经在多种细胞系中体外证明并且在小鼠研究中体内证明。已显示这些材料的功效归因于阳离子氨基酯嵌段的pH响应性重排形成中性小分子双-N-羟乙基-2,5-哌啶二酮双羟乙基甘氨酸。虽然之前已经报道了其他阳离子基因递送媒介物，但这些寡聚(碳酸酯-共-氨基酯)是独特的并且在最佳表现者之中，这是由于它们在适于细胞摄取及其耐受性的时间尺度上释放mRNA(或其他寡核苷酸)货物的独特能力。
(7)经验确定的mRNA递送的最佳长度背离我们现有技术教导了MTC-十二烷基碳酸酯和N-Boc吗啉-2-酮结构域的平均DP 12的二嵌段表现最佳。该长度比可商购获得的阳离子多胺载体诸如PEI短得多；它也比我们先前发现的siRNA递送载体更长(参考文献WO2013036532A1和PNAS 2012,109(33),13171-13176)。
在一方面，本文提供了将核酸转染至细胞中的方法。该方法可以包括使细胞与本申请中其他地方描述的细胞穿透性复合物接触。在一些实施方案中，所述方法可以在细胞中引起基因编辑。在实施方案中，基因编辑可以涵盖基因组编辑(genome-edition)或基因组编辑(genome editing)，其是一种基因工程类型，其中使用分离的或工程化的核酸酶系统在活生物体的基因组中插入、缺失或替换DNA。在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于递送可在转染细胞中引起基因编辑的遗传工具或系统。用于基因编辑的遗传工具或系统的一些非限制性实例包括CRISPR-Cas系统和转座子系统。
在一方面，通过根据一些实施方案的转染方法转染的核酸(即货物核酸)可以具有一种或多种载体，所述一种或多种载体具有编码与细胞的基因组中的靶序列杂交的CRISPR-Cas系统指导RNA的第一核苷酸序列和编码Cas9蛋白的第二核苷酸序列。在某些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以位于相同或不同的载体上。
一般来讲，采用CRISPR/Cas9的系统为基因编辑提供高度保真度和相对简单的构建。所述系统对于其特异性可以依赖于两个因素：靶序列和原型间隔区相邻基序(PAM)。靶序列可以是例如20个碱基长，作为crRNA阵列中每个CRISPR基因座的一部分。crRNA阵列可以具有多种独特的靶序列。Cas9蛋白可以通过利用与宿主DNA上的碱基对结合的序列在宿主基因组上选择正确的位置。Cas9可以识别宿主基因组上的PAM序列。一旦将元件组装到例如一个或多个质粒中并且转染至细胞中，Cas9蛋白在crRNA的帮助下就可以在宿主细胞的DNA中找到正确的序列，并且-根据Cas9变体-在DNA中产生单链或双链断裂。宿主DNA中适当间隔的断裂可以触发同源定向修复。提供DNA修复模板可以允许在基因组内的预期位置处插入特定DNA序列。一旦掺入，新序列现在就是细胞遗传物质的一部分并且可以进入其子细胞。本领域中可得许多在线工具来用于帮助设计有效的sgRNA序列。根据一些实施方案，根据本文的某些实施方案的方法和组合物可以递送或转染编码CRISPR-Cas系统指导RNA的核苷酸序列和编码Cas9蛋白的核苷酸序列，以在转染细胞中诱导基因编辑。
在一些实施方案中，通过根据某些实施方案的转染方法转染的货物核酸可以具有CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，该crRNA可以与编码CRISPR-Cas系统指导RNA的第一核苷酸序列在同一载体中。
在一些实施方案中，通过根据某些实施方案的转染方法转染的货物核酸可以具有反式激活RNA(tracrRNA)。在一些实施方案中，该tracrRNA可以与编码Cas9蛋白的第二核苷酸序列在同一载体中。
在一些实施方案中，在根据一些实施方案的转染方法中利用的Cas9蛋白可以进行密码子优化以在转染细胞中表达。
在另一方面，通过根据一些实施方案的转染方法转染的核酸(即货物核酸)可以具有一种或多种载体，所述一种或多种载体具有编码转座酶的第一核苷酸序列和具有侧接转座酶识别位点的目标基因的核酸序列的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列可以位于相同或不同的载体上。
可转座元件(或转座子)通常是指可以改变其在基因组内的位置，有时产生或逆转突变并改变细胞的遗传组成和基因组大小的DNA序列。转座酶通常是指可以结合转座子并且通过例如剪切和粘贴机制或复制转置机制催化转座子移动到基因组另一部分的酶。将转座酶和侧接转座酶识别位点的目标基因引入在细胞中可以诱导目标基因插入到细胞基因组中。根据一些实施方案，根据本文某些实施方案的方法和组合物可以递送或转染编码转座酶和目标基因的核酸，以在转染细胞中诱导基因编辑。
在一些实施方案中，在根据一些实施方案的转染方法中使用的转座酶可以识别和切除基因组序列。在一些其他实施方案中，通过转染方法转染的目标基因的核酸序列可以整合到转染细胞的基因组中。
在一些实施方案中，通过根据一些实施方案的转染方法进行的基因编辑可以引起以下中的一种或多种：DNA缺失、基因破坏、DNA插入、DNA倒位、点突变、DNA替换、敲入和敲低。
诱导免疫应答的方法
在另一方面，本文提供了在受试者中诱导免疫应答的方法。在一些实施方案中，所述方法可使用细胞穿透性复合物治疗和/或预防疾病或病状。所述方法通常包括向有需要的受试者施用治疗有效量的细胞穿透性复合物或具有本文所述的细胞穿透性复合物的药物组合物，单独地(例如，在单一疗法中)或与一种或多种附加成分，例如药学上可接受的赋形剂和/或附加的治疗剂组合(例如，在组合疗法中)。
在一些实施方案中，细胞穿透性复合物或具有细胞穿透性复合物的药物组合物可以用作疫苗，其可以在施用细胞穿透性复合物或药物组合物的受试者中诱导免疫应答。
在一些实施方案中，疫苗可以具有预防活性，使得疫苗可以预防或降低受试者中发生疾病或病状的可能性。在疫苗用于预防目的的一些实例中，受试者可以是未患有疾病或病状的动物，例如，未被诊断患有疾病或病状或没有与疾病或病状相关的明显症状的人。在一些其他实施方案中，疫苗具有治疗效果，使得疫苗可以用于治疗疾病或病状。治疗性疫苗的一些实例可以包括但不限于可以施用至已经罹患癌症的患者的癌症疫苗。癌症疫苗可以表现出一种或多种抗癌活性，例如减少癌细胞数量、减小癌大小、杀伤癌细胞、减少和/或抑制转移以及减少癌细胞生长和/或增殖。在一些其他实施方案中，癌症疫苗也可以用于预防目的，尤其是在被认为易患癌症但目前未患有癌症的受试者中。预防性疫苗可以施用至易患某种癌症的受试者并且预防或降低受试者中癌症发生的可能性。
在一方面，本文的公开内容提供了在有需要的受试者中诱导针对疾病的免疫应答的方法。所述方法可以包括向受试者施用有效量的细胞穿透性复合物。
在一些实施方案中，细胞穿透性复合物可以用作疫苗，其可以在施用复合物的受试者中诱导免疫应答。所述复合物可以含有与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，并且阳离子两亲性聚合物可以具有pH敏感性解体结构域。
在一些实施方案中，疫苗或疫苗组合物靶向的疾病或病状可以包括但不限于自身免疫疾病、炎性疾病、癌症疾病、传染性疾病、代谢疾病、发育疾病、心血管疾病、肝疾病、肠疾病、内分泌疾病、神经学疾病或其他疾病。
在一些实施方案中，疫苗或其组合物中包含的核酸可以是编码抗原性或免疫原性表位的核酸序列。例如，当涉及传染性疾病时，疫苗中包含的核酸可以编码一种或多种已知在传染性疾病的病原体(例如病原细菌或病毒)中表达的肽，并且在受试者中施用时可以诱导免疫应答。在疾病是特定类型的癌症的另一个实例中，使用疫苗组合物施用至受试者的核酸可以编码一种或多种与癌症相关的肽，例如基本上全部表达于癌症类型中或其在癌细胞中表达水平与非癌细胞相比显著更高的肽。当将编码抗原性或免疫原性肽的核酸施用至受试者并递送(即转染)到受试者的某些细胞中时，转染的核酸可以最终翻译并表达成抗原性肽。由于表达的肽是抗原性的或免疫原性的，因此可以在受试者中诱导针对表达的肽的免疫应答。诱导的免疫应答可以用于治疗靶疾病，例如通过在受试者已罹患疾病时特异性减少受影响细胞的群体，从而表现出治疗效果。可替代地，受试者可以通过该疫苗接种具有获得性免疫应答，其中适应性免疫可以在对免疫应答所靶向的免疫原性肽的初始应答后引发免疫记忆，并且在随后遇到时产生对该靶标的增强应答，从而表现出预防效果。
在一些实施方案中，疫苗接种可以通过在单一疫苗组合物中递送两种单独类型(或序列)的核酸来提供治疗效果和预防效果的双重活性。两种单独的核酸可以编码两种不同的免疫原性肽。因此，在一些实施方案中，疫苗组合物可以转染(1)编码第一免疫原性肽的第一核酸，所述第一免疫原性肽可以对现有疾病或病状诱导更直接的治疗效果，以及(2)编码不同的第二免疫原性肽的第二核酸，所述第二免疫原性肽旨在在受试者中诱导针对将来发生的不同疾病或病状的适应性免疫。在一些实施方案中，疫苗可以向受试者递送两种或更多种不同的核酸，并且每种核酸分别独立地表现出治疗效果或预防效果。
在实施方案中，疫苗组合物可以具有两种或更多种不同类型(或不同式)的阳离子两亲性聚合物。可替代地，疫苗组合物可以仅具有单一类型(或单一式)的阳离子两亲性聚合物。在一些实施方案中，单一类型的阳离子两亲性聚合物可以与一种类型(序列)的核酸非共价结合。可替代地，单一类型的阳离子两亲性聚合物可以与两种或更多种类型(序列)的核酸非共价结合。因此，在一些实例中，可以将不同类型的阳离子两亲聚合物的混合物(其各自与不同的核酸序列结合)一起施用至受试者以递送两种或更多种序列(或类型)的核酸。可替代地，可以将与多种类型(或序列)的核酸结合的单一类型(或式)阳离子两亲性聚合物施用至受试者，以递送两种或更多种序列(或类型)的核酸。仍可替代地，可以将与单一序列(或类型)的核酸结合的单一类型(或式)的阳离子两亲性聚合物施用至受试者。
在一些实施方案中，疫苗或其组合物中包含的核酸可以为信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。在替代实施方案中，疫苗或其组合物中包含的核酸可以为mRNA。在一些实施方案中，通过疫苗接种将核酸转染至受试者的一个或多个细胞中。在一些实施方案中，可以通过疫苗组合物转染一种或多于一种核酸序列。因此，在一些实施方案中，疫苗组合物含有两种不同的核酸，每种核酸分别编码不同的抗原肽。因此，当将疫苗施用至需要接种疫苗的受试者中时，可以表达两种或更多种类型的抗原性表位并且在受试者中诱导免疫应答。在替代实施方案中，可以通过疫苗接种转染一种类型的核酸，使得可以表达一种类型的表位并且在受试者中诱导免疫应答。
在一些实施方案中，在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法除了向受试者施用有效量的细胞穿透性复合物外，还可以包括向受试者施用有效量的一种或多种附加的药物组合物。在一些实施方案中，附加的药物组合物可以含有抗癌剂和任选的药学上可接受的载体。附加的抗癌剂可以例如为抗体、小分子和大分子或其组合。抗癌活性的实例包括但不限于减少癌细胞数量、减小癌大小、杀伤癌细胞、减少和/或抑制转移以及减少癌细胞生长和/或增殖。在一些实例中，细胞穿透性复合物和附加的药物组合物的施用可以表现出超过单独施用总和的协同效应。
组合物
在一方面，本文的公开内容提供了如本文所述的阳离子两亲性聚合物。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以与核酸非共价结合。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有一个或多个亲脂性聚合物结构域和一个或多个pH敏感性解体结构域。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以与一种或多种任选成分配制成组合物。阳离子两亲性聚合物或其组合物可通过与一种或多种核酸的非共价结合配制成细胞穿透性复合物。
在另一方面，本文的公开内容提供了细胞穿透性复合物，其含有核酸和阳离子两亲性聚合物。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以与核酸非共价结合。在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物可以具有一个或多个亲脂性聚合物结构域和一个或多个pH敏感性解体结构域。在一些实施方案中，细胞穿透性复合物可以与一种或多种任选成分配制成组合物。
在一些实施方案中，阳离子两亲性聚合物或细胞穿透性复合物可以配制成可以用于将核酸转染至细胞中的组合物。这些能够将核酸转染至细胞中的组合物至少在一些实施方案中称为转染组合物。在一些实施方案中，可以与阳离子两亲性聚合物结合并形成细胞穿透性复合物的货物核酸可以是信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。具有阳离子两亲性聚合物但不具有货物核酸的转染组合物可以与货物核酸一起配制，例如，在转染之前使阳离子两亲性聚合物和核酸接触(或混合)。
在实施方案中，使用本文所公开的组合物和方法的转染可以改变一种或多种细胞特性。在一些实例中，转染可以导致改变转染细胞中的基因表达谱，例如减少或增加一种或多种基因产物(例如RNA或肽)的表达。在一些其他实例中，转染可以导致改变基因组结构，例如，通过转染CRISPR/Cas9系统或转座子系统的组分进行基因编辑。在一些其他实例中，转染可以导致调节细胞途径的活性。因此，在一些此类实例中，转染可以导致干细胞的诱导。在一些其他实例中，组合物可以递送或(转染)具有治疗效果的货物核酸，使得转染可以治疗和/或预防疾病或病状。在一些实施方案中，递送(或转染)治疗性货物核酸的组合物可以在施用组合物的受试者中诱导免疫应答。从前述内容显而易见，取决于货物核酸及其功能，根据本公开的组合物，包括具有阳离子两亲性聚合物或细胞穿透性复合物的组合物，可以用于在转染细胞或施用受试者中提供多种结果。
药物组合物
在一些实施方案中，具有阳离子两亲性聚合物或细胞穿透性复合物的组合物可以用于治疗性目的。在一些实施方案中，治疗性目的包括预防目的(预防疾病或病状发生的目的)和治疗目的(治疗现有疾病或病状的目的)。当组合物具有阳离子两亲性聚合物但不具有货物核酸时，可以将可以表现出治疗效果的货物核酸在施用至受试者之前与阳离子两亲性聚合物非共价结合。
在一些实施方案中，组合物可以是疫苗或其组合物，即含有疫苗和任选的药学上可接受的载体的组合物。疫苗或疫苗组合物可以用于预防和/或治疗疾病或病状或与疾病或病状相关的病原体。在一些实施方案中，疫苗或疫苗组合物含有细胞穿透性复合物，其具有阳离子两亲性聚合物和货物核酸。在一些实施方案中，当向受试者施用时，细胞穿透性复合物可以诱导免疫应答，即免疫原性。当由货物核酸编码的一种或多种抗原性肽在转染细胞中表达时，可以至少部分地诱导这种免疫原性。
在一方面，本文所公开的阳离子两亲性聚合物或细胞穿透性复合物可以配制在药物组合物中。阳离子两亲性聚合物可以具有pH敏感性解体结构域。在一个实施方案中，药物组合物可以还含有药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，药物组合物可以具有细胞穿透性复合物，其具有与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸作为活性成分，并且根据施用途径还含有药学上可接受的赋形剂或添加剂。此类赋形剂或添加剂的实例包括水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、海藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖、药学上可接受的表面活性剂等。适当时，所使用的添加剂选自但不限于上述物质或其组合，这取决于本公开的剂量形式。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体是免疫学佐剂。在一些实例中，免疫佐剂可以包括但不限于Toll样受体(TLR)的激动剂，STING途径的激动剂，针对CD40、OX40、CTLA4、PD1或PD1-L的激动剂抗体，弗氏佐剂，苔藓虫素和针对CD40、OX40、CD137、PD1、CTLA4的配体及其任何组合。在一些实施方案中，佐剂可以通过与细胞渗透性复合物共同施用至受试者而增加所述复合物时诱导的免疫原性。
本公开的药物组合物的制剂可以根据所选择的施用途径而变化(例如，溶液、乳液)。施用途径可以为，例如，肌内、皮下、静脉内、淋巴管内、皮下、肌内、眼内、局部皮肤、局部结膜、口服、膀胱内(膀胱)、肛门内和阴道内。
在一些实施方案中，组合物可以包含冷冻保护剂。冷冻保护剂的非限制性实例包括二醇(例如乙二醇、丙二醇和甘油)、二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、蔗糖、海藻糖、右旋糖及其任何组合。
在一些实施方案中，制剂为控制释放制剂。术语“控制释放制剂”包括持续释放制剂和定时释放制剂。控制释放制剂在本领域中是熟知的。这些包括允许组合物持续、周期性、脉冲或延迟释放的赋形剂。控制释放制剂包括但不限于将组合物包埋到基质中；肠溶衣；微胶囊；凝胶和水凝胶；植入物；和任何其他允许控制释放组合物的制剂。
在一方面，提供了具有细胞穿透性复合物或其组合物的试剂盒。在另一方面，提供了具有未与核酸或其组合物结合的阳离子两亲性聚合物的试剂盒。所述试剂盒可以还含有描述用于使用阳离子两亲性聚合物和货物核酸制备细胞穿透性复合物的方案的文件或说明书。试剂盒的文件或说明书还可以描述用于将组合物施用至有需要的受试者的方案。
通过将具有所需纯度的活性成分即免疫原性剂与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合，可以制备本文所述的治疗性制剂用于储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下可以对接受者无毒性，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六烃季铵、氯化苯二甲羟铵、苄索氯铵、苯酚、丁醇或苄醇、对羟苯甲酸烷酯(诸如对羟苯甲酸甲酯或丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇以及间-甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、凝胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠离子；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子界面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
本文的制剂还可以含有超过一种的活性化合物(例如，除了具有细胞穿透性复合物的免疫原性剂之外的第二活性剂)，其可以被选择用于实现互补活性而不会相互产生不利影响。此类分子可以适当地以可以对预期的目的有效的量组合存在。
施用
在一些方面，提供了用于将组合物递送至细胞或受试者以便向细胞或受试者提供所需活性的方法。在一些实施方案中，组合物可含有细胞穿透性复合物，其具有与阳离子两亲性聚合物非共价结合的货物核酸。当转染至细胞中或施用至受试者时，货物核酸可以提供多种预期效果，这取决于核酸序列的性质。预期效果的一些非限制性实例包括对基因表达的调节、细胞途径的调节、基因组编辑和免疫应答的诱导。在一些实施方案中，组合物可以以足以在受试者中实现至少部分预期效果的有效量施用至受试者。
当与组合物一起使用时，“施用(Administration/administering)”等是指直接施用，其可以是向体外细胞的施用、向体内细胞的施用、由医学专业人员向受试者的施用或通过受试者的自身施用，和/或间接施用，其可以是为本公开的组合物开处方的行为。当在本文中关于细胞使用时，是指将组合物引入至细胞。通常，施用有效量，所述量可以由本领域技术人员确定。可以使用任何施用方法。化合物(例如药物和抗体)可以通过例如将化合物添加至细胞培养基或体内注射来施用至细胞。可以通过例如血管内注射、直接肿瘤内递送等来实现向受试者的施用。
施用可以意指向受试者口服施用、作为栓剂施用、局部接触、静脉内、腹膜内、肌内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用，或植入缓释装置，例如，小型渗透泵。通过任何途径进行施用，包括肠胃外和经粘膜(例如，经颊、经舌下、经上腭、经牙龈、经鼻、经阴道、经直肠或经皮)。肠胃外施用包括例如，静脉内、肌内、动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。其他递送模式包括但不限于使用脂质体制剂、静脉内输注、经皮贴剂等。“共同施用”意指本文所述的组合物在施用一种或多种附加外疗法(例如癌症疗法，例如化学疗法、激素疗法、放射疗法或免疫治疗)的同时、紧临所述施用之前或紧临所述施用之后施用。本公开的化合物可以单独施用或可以共同施用至患者。共同施用意在包括个别或组合地(超过一种化合物)同时或顺序地施用化合物。
向受试者施用的剂量和频率(单次或多次剂量)可以根据多种因素而变化，例如，所述受试者是否罹患另一种疾病；其施用途径；大小、年龄、性别、健康、体重、身体质量指数和接受者的饮食；所治疗疾病的症状的性质和程度、同时治疗的种类、来自所治疗疾病的并发症或其他健康相关问题。其他治疗性方案或药剂可以与本文所述的方法和化合物(包括其实施方案)结合使用。所确立剂量(例如，频率和持续时间)的调节和操作完全在本领域中技术人员的能力范围内。
利用本文所提供的教义，可以规划出有效的预防性或治疗性治疗方案，其不导致显著的毒性但是对治疗特定患者所展现出的临床症状仍是有效的。这种规划应涉及通过考虑以下因素而对活性化合物进行谨慎选择，所述因素诸如化合物效力、相对生物利用率、患者体重、不良副作用的存在和严重程度、所选药剂的优选施用模式和毒性曲线。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、鼠(即小鼠和大鼠)、犬科动物、猫科动物或马科动物。在一个实施方案中，受试者为人。
在一些实施方案中，组合物可以以下述剂量(或量)施用：约1ng/kg受试者体重、约10ng/kg受试者体重、约50ng/kg受试者体重、约100ng/kg受试者体重、约500ng/kg受试者体重、约1ug/kg受试者体重、约10μg/kg受试者体重、约50ug/kg受试者体重、约100μg/kg受试者体重、约150μg/kg受试者体重、约200μg/kg受试者体重、约250μg/kg受试者体重、约300μg/kg受试者体重、约350μg/kg受试者体重、约375μg/kg受试者体重、约400μg/kg受试者体重、约450μg/kg受试者体重、约500μg/kg受试者体重、约550μg/kg受试者体重、约600μg/kg受试者体重、约650μg/kg受试者体重、约700μg/kg受试者体重、约750μg/kg受试者体重、约800μg/kg受试者体重、约850μg/kg受试者体重、约900μg/kg受试者体重、约1mg/kg受试者体重、约10mg/kg受试者体重、约50mg/kg受试者体重、约100mg/kg受试者体重、约500mg/kg受试者体重、约1g/kg受试者体重或更多或前述值的任何间插范围。在一些实施方案中，组合物可以以下述剂量(或量)施用：约0.5μg、约1.0μg、约1.5μg、约2.0μg、约2.5μg、约3.0μg、约3.5μg、约4.0μg、约4.5μg、约5.0μg、约5.5μg、约6.0μg、约6.5μg、约7.0μg、约7.5μg、约8.0μg、约8.5μg、约9.0μg、约9.5μg、约1.0mg、约1.5mg、约2.0mg、约2.5mg、约3.0mg、约3.5mg、约4.0mg、约4.5mg、约5.0mg、约5.5mg、约6.0mg、约6.5mg、约7.0mg、约7.5mg、约8.0mg、约8.5mg、约9.0mg、约9.5mg、约1g或更多或前述值的任何间插范围。在一些实施方案中，组合物可以以约7.5μg或约0.375mg/kg受试者体重的剂量(或量)施用。可以在期望的时间段内重复施用，例如，在约1天至约5天内重复施用或每隔几天一次，例如每隔约5天、约1个月、约2个月等一次。本文的重量可以是细胞穿透性复合物的重量或其组合物或药物制剂的重量。在一些实施方案中，
在一个实施方案中，组合物可以以6小时、12小时、每日或每隔一天或基于每周或每月为间隔全身或局部(例如肿瘤内注射、静脉内注射)施用以引起所需的益处或以其他方式提供治疗效果。
在一个实施方案中，可能与基线参考或对照参照相比降低了对组合物，特别是癌症疫苗的应答率。术语“应答率”在本文中以其常规意义使用，以指示在治疗后对癌症消退作出应答的患者的百分比。应答率包括例如部分或完全的消退。部分的应答包括约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％或约99％的癌细胞消退。在一些实施方案中，对照参考获自健康受试者、癌症受试者(例如，正在治疗的癌症受试者或另一种癌症受试者)或其任何群体。
通过以下实施例和详细方案进一步说明本文的实施方案。然而，实施例仅旨在说明实施方案，而不应解释为限制本文的范围。贯穿本申请引用的所有参考文献以及公布的专利以及专利申请的内容以引用方式并入本文。
实施例
一般方法和实验
材料
除非另有指明，否则试剂购自Sigma-Aldrich并且按原样使用。1-(3,5-双-三氟甲基-苯基)-3-环己基-硫脲(Macromolecules 39(23):7863–7871)、MTC-胍单体(J Am ChemSoc131(45):16401–16403)、MTC-十二烷基单体(Proc Natl Acad Sci 109(33):13171–13176)、MTC-哌啶单体(Chem Commun(1):114–116)、N-Boc吗啉酮单体(J Am Chem Soc 136(26):9252–9255)和丹磺酰醇(J Am Chem Soc 131(45):16401–16403)全部根据文献步骤制备。除非另有说明，否则使用所有商业溶剂和试剂而不进一步纯化。使用氮气压力使二氯甲烷(CH2Cl2)和四氢呋喃(THF)通过氧化铝干燥柱(Solv-tek Inc.)。石油醚、戊烷、己烷、乙酸乙酯(EtOAc)和甲醇(MeOH)获自Fisher Scientific。氘化溶剂购自Cambridge IsotopeLaboratories。再生纤维素透析膜(
Figure BDA0003771948270000491
6标准RC；MWCO 1000)购自SpectrumLaboratories,Inc.。
mRNA
在所有以下实施例中，eGFP mRNA(5meC，Ψ，L-6101)、Fluc mRNA(5meC，Ψ，L-6107)、OVA mRNA(5meC，Ψ，L-7210)和Cy5-eGFP mRNA(5meC，Ψ，L-6402)购自TriLinkBioTechnologies Inc.。
仪器
通过Malvern Zetasizer Nano ZS90上的动态光散射测量粒度。在BD LSRII FACS分析仪(Stanford University Shared FACS Facility)上进行流式细胞术分析。使用具有40x HC PL APO，CS2油物镜(Stanford University Cell Sciences Imaging Facility)的Leica SP8白光共聚焦显微镜进行激光扫描共聚焦显微术。使用电荷耦合器件(CCD)相机(IVIS 100，Xenogen Corp.,Alameda,CA)测量生物发光，并且使用Living Image软件(Perkin-Elmer)进行分析。在具有X-Cite 120Q宽场激发光源和GFP滤光器组的Zeiss AxioObserver.Z1上进行落射荧光显微术。使用CoolSNAP HQ2相机获取图像并且将其转移到计算机进行图像分析。
细胞系
将HeLa、J774、HepG2和HEK-293细胞维持在补充有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素/链霉素的杜氏改良型伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)(DMEM)中。将CHO细胞维持在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素的F12培养基中。使所有细胞在5％CO2气氛中在37℃下生长。将细胞在大约80％汇合时传代。
根据Huang等人(J.Orthopaedic Trans.3(1):26-33)的方法制备间充质干细胞(MSC)。简而言之，从两只8周龄雌性CD1小鼠切下股骨，并且将组织从骨外去除。然后用无菌剪刀切割骨的末端。使用3mL注射器和25g针头用含有青霉素/链霉素的DMEM 10％胎牛血清将骨髓从四块骨中冲洗在10cm组织培养物处理的培养皿中。通过吸液将骨髓破裂并分散，但不过滤或以其他方式操作。将皿孵育6天，随后形成特征性单层。然后用PBS洗涤培养物两次，并用0.25％胰蛋白酶(Gibco)在37℃下胰蛋白酶化5分钟。然后收集细胞并转移到75cm2组织培养瓶，并且孵育3天，直至实现90％汇合。可以将培养物再维持两次传代，但在四次传代后，生长大大减少。对于转染，将细胞以1.2x 104/孔铺板在24孔板中。
实施例1.单体的合成
在一些实施例中，各种阳离子解体型结构域的CART由新的内酯或碳酸酯单体产生。描述了前体和单体的合成实施例：
实施例1.1. 2-氧代吗啉-4-甲酸叔丁酯(N-Boc吗啉酮)的合成：
在这些实施例中，N-Boc吗啉酮单体的合成改编自以下文献：Chung等人J.Am.Chem.Soc.,2013,135(20),7593–7602
Figure BDA0003771948270000501
2-氧代吗啉-4-甲酸叔丁酯的合成：将2.086g(10.2mmol)双(2-羟乙基)氨基甲酸叔丁酯溶解于75mL CH3CN中并用氧气鼓泡5分钟。添加398mg(0.38mmol)[(新亚铜试剂)Pd(OAc)]2(OTf)2，导致形成深红色溶液。将反应物置于60℃的油浴中并且将氧气鼓泡通过反应混合物，通过TLC(1:1己烷:EtOAc)监测。24小时后，向反应中添加263mg(0.25mmol)[(新)Pd(OTf)(Ac)]2。48小时后，向反应中添加另外的426mg(0.41mmol)[(新亚铜试剂)Pd(OAc)]2(OTf)2。总共72小时后，停止氧气流并使反应冷却至室温。将反应混合物浓缩至5-10mL，得到黑色非粘性混合物并且加载到SiO2塞上，用1:1己烷:EtOAc洗脱。浓缩得到1.766g黄色油状物(8.78mmol，86.4％)，其在静置时固化。将该粗产物溶解于10mL Et2O中，然后添加20mL己烷并且在-30℃下储存过夜。通过过滤收集沉淀物，用戊烷洗涤，得到1.54g白色粉末(7.67mmol，76％收率)。1H NMR(500MHz,CDCl3):δ4.41(br,2H),4.26(s,2H),3.66(t,2H),1.47(s,9H)。13C NMR(125MHz,CD3Cl):δ28.24,40.63,45.49,67.19,81.33,153.49,166.63。HRMS(m/z)：对于C9H15NO4Na的M+计算值224.0893；实际值，224.0896。
实施例1.2. 7-氧代-1,4-氧氮杂环庚烷-4-甲酸叔丁酯(7-lact)的合成：
Figure BDA0003771948270000502
向火焰干燥的烧瓶中装入4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(205.8mg，1.03mmol)和DCM(10mL)，然后在0C下搅拌15分钟。分两份添加在DCM(5mL)中的mCPBA(600.1mg，2.9mmol)，然后温热至室温。18小时后，将反应混合物转移至分液漏斗中并且用饱和NaCHO3(20mL x3)洗涤，然后用Na2SO4干燥并过滤。减压除去溶剂，得到317.0mg白色固体。进行硅胶色谱，用9:1DCM:EtOAc洗脱。浓缩相关级分得到151.0mg(0.71mmol，68.9％产率)白色固体。1H NMR(500MHz,CD3Cl):δ4.21(s,2H),3.82(s,2H),3.65(s,2H),2.81(s,2H),1.46(s,9H)。13C NMR(101MHz,CD3Cl):δ173.9,154.4,81.1,69.5,47.3,41.3,37.6,28.4
实施例1.3.(2-(双(2-羟乙基)氨基)-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成。
Figure BDA0003771948270000511
向火焰干燥的烧瓶中装入二乙醇胺(225mg，2.15mmol)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸甲酯(370mg，1.95mmol)，然后在75C的热浴中搅拌。18小时后，使反应通过硅胶塞，用丙酮洗脱。减压除去溶剂，产生505.1mg淡黄色油状物(1.93mmol，99％收率)。1H NMR(500MHz,CD3Cl):δ5.7-5.6(br,1H),3.99(d,2H),3.78-3.65(m,4H),3.53-3.35(m,4H),3.05(br,1H)。13CNMR(101MHz,CD3Cl):δ170.4,156.3,79.9,60.0,51.1,42.4,28.3
实施例1.4.(2-氧代-2-(2-氧代吗啉代)乙基)氨基甲酸叔丁酯(甘氨酸单体)的合成：
Figure BDA0003771948270000512
向火焰干燥的烧瓶中装入二醇(450mg，1.72mmol)和乙腈(12mL)，然后用空气鼓泡5分钟。将Pd(Neo)OAc(84.1mg，0.16mmol，9.4mol％)添加到反应中，并且在恒定空气流下在50C下搅拌。18小时后，浓缩反应物，用EtOAc(30mL)研磨，然后过滤，产生220mg泡沫状橙色残余物。进行硅胶色谱，用100％EtOAc洗脱。浓缩相关级分，得到53.1mg(0.205mmol，12％收率)透明油状物，其在静置时固化。1H NMR(500MHz,CD3Cl):δ5.45-5.3(br,1H),4.5-4.45(q,2H),4.28-4.4(d,2H),4.0-3.93(dd,2H),3.85-3.7(dt,2H),1.45(s,9H)13C NMR(125MHz,CD3Cl):δ167.7,166.1,164.8,155.8,80.2,66.9,65.9,45.8,44.1,42.4,41.2,39.3,28.3,15.316
实施例1.5. 7-Gly(酮)的合成：
Figure BDA0003771948270000513
向装有在10mL THF中的羟基苯并三唑(600mg，4.4mmol)、EDC-HCl(453mg，2.9mmol)、(叔丁氧基羰基)甘氨酸(520mg)的烧瓶中添加TEA(500uL)并且使其搅拌20分钟。一次性添加4-哌啶酮-HCl-一水合物(462mg，3.0mmol)在THF:H2O(总共11ml)的10:1混合物中的溶液。使反应搅拌过夜。将反应物减压浓缩，然后溶于15mL EtOAc中并且用在H2O(10mL)中的AcOH(500uL)洗涤，将水相用15mL EtOAc萃取。然后将合并的有机层用NaHCO3(2x 20mL)和盐水(1x 20mL)洗涤，然后用MgSO4干燥。减压浓缩产生375mg白色结晶粉末(50％收率)，将其不经进一步纯化而使用。
实施例1.6. 7-Gly单体的合成：
Figure BDA0003771948270000521
7-Gly单体：向装有N-甘氨酰基(Boc)4-哌啶酮(28mg，0.11mmol)的烧瓶中添加在5mL DCM中的mCPBA(60mg，0.35mmol)。将反应物在0C下搅拌2小时，然后将另一部分在2mLDCM中的mCPBA(20mg，0.12mmol)添加到反应混合物并搅拌过夜。减压浓缩反应物，然后溶于10mL EtOAc中并且用NaHCO(4x 10mL)洗涤，然后用MgSO4干燥。使用9:1EtOAc:DCM溶剂体系，通过SiO2色谱法纯化粗产物。减压浓缩相关级分产生21mg pdt(71％收率)。
实施例1.7.基于8元碳酸酯的单体的合成：
Figure BDA0003771948270000522
基于8元碳酸酯的单体：这些实施例通过J.Am.Chem.Soc.2015,137,13851-13860中报道的文献程序制备
实施例1.8.(2-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(Mglut)的合成
Figure BDA0003771948270000523
(2-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(Mglut)的合成：将1.078g(4.9mmol)(S)-(-)-2-(Boc-氨基)-1,5-戊二醇溶解于10ml CH3CN(0.49M)中并用空气鼓泡5分钟。添加0.233g(0.45mmol)[(新)Pd(OTf)(OAc)]2，使澄清溶液变为橙色，其变暗成黑色。将反应物置于45℃的油浴中并且将空气鼓泡通过反应混合物。通过1H NMR监测反应，寻找5.1ppm处内半缩醛峰的消失。在44小时的过程中，基于反应进程，将总共0.310g(0.6mmol，12mol％)的[(新)Pd(OTf)(OAc)]2分批添加到反应。在44小时，1H NMR显示反应完成。停止气流并使反应冷却至室温。浓缩反应混合物并且将残余物溶于50mL EtOAc中并超声处理，然后通过硅藻土塞过滤，然后浓缩，得到产生0.940g粉红色-橙色油状物，其在静置时固化。进行硅胶色谱，用4:1DCM:EtOAc洗脱。浓缩相关级分得到0.480g(2.23mmol)白色固体(46％收率)。光谱数据与先前的报告一致。Xie,X.和Stahl,S.S.J.Am.Chem.Soc.,2015,137(11):3767–3770
实施例1.9.基于磷酸酯的单体的合成
Figure BDA0003771948270000524
基于磷酸酯的单体：一些实例包括基于磷酸酯(phosphate)或磷酸酯(phosphoester)的阳离子解体结构域的合成。在其一个实例中，根据先前的文献程序合成必需的单体(McKinlay,C.J.等人J.Am.Chem.Soc.2016,138(10),3510–3517；WO2017083637A1)。简而言之(对于实施例2-(6-双-boc胍基己氧基)-1,3,2-二氧磷杂环戊烷-2-氧化物)：在惰性N2气氛(手套箱)下将2-氯-1,3,2-二氧磷杂环戊烷-2-氧化物(797mg，5.59mmol，1.25当量)称入schlenk烧瓶中。将该烧瓶在氮气下置于冰上，并且添加THF(75mL)。在单独的小瓶中，将guan己醇(7.16g，20.0mmol，1当量)溶解于THF(10mL)中并且添加三乙胺(2.8mL，20mmol，1当量)。在10分钟的过程内通过注射器将小瓶内容物逐滴添加到Schlenk烧瓶并使其反应20小时。反应后，将产物用
Figure BDA0003771948270000533
垫过滤。将粗产物溶解于少量(5mL)THF中并且用20mL无水戊烷研磨。在-55℃冷冻机中过夜产物呈油状析出。除去戊烷层并在真空下干燥10小时，得到呈浅黄色油状物的纯产物(79％收率)。合成该单体并且根据下面的标准程序脱保护。
实施例2.CART的聚合
一般程序
向单体和引发剂在甲苯中的溶液中添加DBU:TU共催化体系的溶液。将反应物搅拌2小时，然后将具有解体型结构域的单体以固体添加，并且然后搅拌2小时。用乙酸(或苯甲酸)淬灭反应，然后在DCM中用MeOH透析。透析后，减压除去溶剂产生纯的寡聚物。然后使用TFA/DCM或HCl/Et2O将寡聚物脱保护，得到两亲性CART。将CART在DMSO中稀释至2.0mM并且然后用于转染研究而无需进一步纯化。
Figure BDA0003771948270000531
脱保护包括使用TFA/DCM或HCl Et2O
TFA脱保护的实施例：向溶解于1.0mL无水DCM中的10.5mg寡聚物中添加100uLTFA。将反应物搅拌8小时。减压除去溶剂产生作为残余物的10.3mg CART(TFA盐)。
HCl脱保护的实施例：向15mg受保护的CART中分两份添加在Et2O中的2.0M HCl(总共2mL)。将反应物搅拌18小时，然后减压浓缩，产生作为残余物的12.1mg CART(HCl盐)。
引发剂的实例：单官能醇(即苄醇，1-芘丁醇)PEG、荧光染料(丹磺酰基、BHQ、BDK)、多官能醇(三苄醇、PEG二醇)、靶向配体(生物素、叶酸盐)和缀合配体(生物素)。
基于母体吗啉酮的cart改编自以下文献报道中描述的cart：McKinlay等人PNAS,2017,E448-E456
Figure BDA0003771948270000532
共聚寡聚物Dn:Am的制备。对于D13:A11的代表性合成：
向火焰干燥的小瓶中装入MTC-十二烷基单体5(33.2mg，0.1mmol)、丹磺酰基引发剂3(3.9mg，0.013mmol)和50μL CH2Cl2。将在50μL CH2Cl2中的二氮杂双环十一碳烯(DBU)(0.8mg，0.005mmol)和硫脲催化剂(TU)(2.0mg，0.005mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将N-Boc单体(22.3mg，0.11mmol)以固体添加到小瓶并且将反应物搅拌3小时。总共5小时后，用5滴AcOH淬灭反应，然后减压浓缩。将粗物质在CH2Cl2中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。浓缩得到37.9mg淡绿色残余物。通过1H NMR进行的端基分析(2.8ppm)显示DP 13:11。
向溶解于0.8mL无水DCM中的23.5mg寡聚物中添加20uL TFA。将反应物搅拌18小时。减压除去溶剂产生作为残余物的23.1mg CART。
基于aCl的CART
各种阳离子解体型结构域的CART的实施例如下：
Figure BDA0003771948270000541
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基-MTC(33.0mg，0.1mmol)和1-芘丁醇(2.3mg，0.0083mmol)和50μL甲苯。将在50μL甲苯中的DBU(0.76mg，0.005mmol)和TU(1.85mg，0.005mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将7-lact(实施例1.2)(21.5mg，0.1mmol)以固体添加并且搅拌反应物。再搅拌2小时后，用一滴乙酸淬灭反应。将粗物质在DCM中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。减压浓缩产生41mg(76％收率)。
向溶解于1.0mL无水DCM中的10.5mg寡聚物中添加100uL TFA。将反应物搅拌8小时。减压除去溶剂产生作为残余物的10.3mg CART。
基于6-Gly的CART
Figure BDA0003771948270000542
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基-MTC(32.8mg，0.1mmol)和1-芘丁醇(2.3mg，0.0083mmol)和50μL DCM。将在50μL DCM中的DBU(0.76mg，0.005mmol)和TU(1.85mg，0.005mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将(2-氧代-2-(2-氧代吗啉代)乙基)氨基甲酸叔丁酯(36mg，0.14mmol)以固体添加并且搅拌反应物。再搅拌2小时后，用一滴乙酸淬灭反应。将粗物质在DCM中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。减压浓缩产生47mg(68％收率)。
向溶解于1.0mL无水DCM中的11.1mg寡聚物中添加100uL TFA。将反应物搅拌8小时。减压除去溶剂产生作为残余物的11mg CART
基于7-Gly的CART
Figure BDA0003771948270000543
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基-MTC(32.2mg，0.1mmol)和苄醇(0.9mg，0.0083mmol)，和50μL甲苯。将在50μL甲苯中的DBU(0.76mg，0.005mmol)和TU(1.85mg，0.005mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将(2-氧代-2-(7-氧代-1,4-氧氮杂环庚烷-4-基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(32.1mg，0.1mmol)以固体添加并且搅拌反应物。再搅拌2小时后，用一滴乙酸淬灭反应。将粗物质在DCM中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。减压浓缩产生49mg(77％收率)。
向溶解于2.0mL无水DCM中的21mg寡聚物中添加200uL TFA。将反应物搅拌8小时。减压除去溶剂产生作为澄清黄色残余物的21.3mg CART。
基于Carb的CART
Figure BDA0003771948270000551
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基-MTC(33.1mg，0.1mmol)和5-(二甲基氨基)-N-(2-羟乙基)萘-1-磺酰胺(丹磺酰基醇)(2.8mg，0.0083mmol)，和50DCM。将在50μL DCM中的DBU(0.76mg，0.005mmol)和TU(1.85mg，0.005mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将8-carb(23.2mg，0.1mmol)以固体添加。再搅拌2小时后，用一滴乙酸淬灭反应。将粗物质在DCM中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。减压浓缩产生54.1mg(96％收率)。
向溶解于1.0mL无水DCM中的12mg寡聚物中添加100uL TFA。将反应物搅拌9小时。减压除去溶剂产生作为残余物的12mg CART。
基于Glu的CART
Figure BDA0003771948270000552
向火焰干燥的小瓶中装入十二烷基-MTC(15.5mg，0.05mmol)和苄醇(0.5mg，0.004mmol)，和50DCM。将在50μL DCM中的DBU(0.4mg，0.0025mmol)和TU(0.9mg，0.0025mmol)添加到反应小瓶并将其搅拌。2小时后，将(2-氧代四氢-2H-吡喃-3-基)氨基甲酸叔丁酯(MGlut)(18.1mg，0.084mmol)以固体添加。再搅拌2小时后，用一滴乙酸淬灭反应。将粗物质在DCM中用MeOH透析(1.0kDa透析袋)。减压浓缩产生17.9mg(51％收率)。
向溶解于1.0mL无水DCM中的9.0mg寡聚物中添加100uL TFA。将反应物搅拌9小时。减压除去溶剂产生作为残余物的9.0mg CART。
通过这些方法合成的CART的另外实施例详述于下表中：
Figure BDA0003771948270000561
实施例3.CART/核酸复合物
在一些实施例中，通过将5.71μL无RNA酶PBS(用1N HCl调节至pH 5.5)和eGFPmRNA(来自0.2μg/μL在PBS pH 7.4中的原液)与0.59μL CART(来自2mM在DMSO中的原液)混合以实现10:1+/-CART/mRNA比率来制备CART/mRNA聚合复合物。在处理或分析之前，将这些CART/mRNA复合物在室温下孵育20s。
在比较例中，使用相应量的其他CART等同于相同的10:1+/-电荷比。
粒度和ζ电位的DLS表征
某些实施例证明动态光散射(DLS)可以用于分析CART D13:A11和它与eGFP mRNA之间形成的聚电解质复合物。在pH 5.5下，所得聚合复合物的流体动力学直径为254±10nm。当将这些聚合复合物添加到细胞培养基时，在两小时内发生从254nm至512nm的流体动力学直径变化。
当将CART/mRNA复合物添加到未缓冲的水时，在整个两小时的实验中，尺寸保持在257±24nm。
ζ电位测量值与粒度数据一致，其中表面电荷在+33±7mV处开始并且在两小时内演变至-30±3mV。这与以下说法相一致：阳离子铵重新排列成中性酰胺，从而由于相缔合的寡核苷酸而使表面主要为阴离子。虽然不受理论束缚，但同型寡聚物(分钟)和mRNA聚合复合物(小时)的重排速率的差异似乎反映了α-氨基酯材料在缓冲的水性环境中的稳定性的复合依赖性增加。这使得CART/mRNA复合物能够在pH 7.4下在细胞内降解之前的治疗相关时间尺度内保持稳定。
作为比较例，当与非解体型转运蛋白D13:G12(图7B)形成复合物时，也形成大约250nm的颗粒。然而，这些颗粒的大小和ζ电位不随时间变化，这表明没有发生降解。
作为比较例，配制的聚合复合物的大小不是货物依赖性的。当聚合复合物是由大约为eGFP长度的两倍的荧光素酶(Fluc)mRNA(Fluc＝1929nt相对于eGFP＝996 nt)形成的，并且在pH 7.4下添加到细胞培养基时，聚合复合物表现出由用eGFP mRNA形成的那些相同的行为，这表明CART启用的递送可能是通用的，适用于多种mRNA大小工。
对于这些实施例具体地，使用500ng eGFP mRNA如上以10:1(阳离子:阴离子)电荷比制备mRNA/共聚寡聚物复合物，并且将其添加至120μL无RNA酶的PBS pH 5.5、7.4或中性无RNA酶的水中。立即将溶液转移到一次性透明塑料比色杯中并测量大小。在初始时间(1分钟)和以15分钟的间隔在2小时内进行大小测量。报告的大小是z平均值。通过将配制用于DLS的mRNA:共聚寡聚物复合物稀释到800μL水中、转移至ζ池(DTS1060)并测量ζ电位来进行ζ电位测量。报告的所有值均为最少三次试验运行的平均值。将误差表示为±SD。在一些其他实施例中，阳离子与阴离子之间的比率可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:30或更多。在一些其他实施例中，阴离子与阳离子之间的比率可以为约1:1、约1:2、约1:3、约1:4、约1:5、约1:6、约1:7、约1:8、约1:9、约1:10、约1:11、约1:12、约1:13、约1:14、约1:15、约1:16、约1:17、约1:18、约1:19、约1:20、约1:30或更多。
实施例4.通过CART进行的mRNA递送
在多细胞系中的eGFP mRNA递送和表达
在一些实施例中，CART,D13:A11在HeLa细胞中提供优异的eGFP表达，具有>99％的转染效率和高平均荧光强度。(图9A、B、D)
例如，通过CART,D13:A11的转染，将HeLa细胞以40,000个细胞/孔接种在24孔板中并使其粘附过夜。通过将无RNA酶的pH 5.5PBS和eGFP mRNA与各种量的来自DMSO原液的寡聚物混合，以实现特定的共聚寡聚物/mRNA比率(优化至理论阳离子:阴离子比率为10:1，8.4μL总体积)来制备寡聚物/mRNA复合物。在处理之前，将复合物在室温下孵育20s。根据制造商的说明书，在OptiMEM中制备LipofectamineTM2000对照。将细胞用无血清DMEM洗涤，并且将mRNA/Lipo溶液添加至终体积200μL/孔和125ng mRNA/孔。用无血清DMEM洗涤后，将2.5μL mRNA/共聚寡聚物复合物添加至总体积200μL，所有条件一式三份，最终mRNA浓度为125ng/孔。将细胞在37℃下孵育8小时，然后用胰蛋白酶-EDTA(0.05％)在37℃下胰蛋白酶化10分钟。添加含血清的DMEM，并且将每个孔的内容物离心，除去上清液，并且将沉淀的细胞再分散于PBS(125μL)中并转移至FACS管，并且在流式细胞仪分析仪(LSR-II.UV，Stanford University)上读取。所呈现的数据(图9)是来自分析的10,000个细胞的几何平均荧光信号。对于转染效率，将未处理的细胞针对无eGFP表达进行门控，并且所呈现的数据是分析的10,000个细胞中具有高于未处理细胞的eGFP表达的百分比。将误差表示为±SD。注意：所有其他细胞系如上在其相应的培养基中使用。对于HepG2细胞，向用于重新悬浮细胞沉淀的PBS中添加5mM EDTA以用于流式细胞术。
具有较长嵌段长度的第二CART(D18:A17)提供了高转染效率(>90％)但提供了较低的平均转染值(图9A)。在比较例中，由α-氨基酯同型寡聚物A13形成的复合物未诱导eGFP表达，这表明疏水性结构域是寡核苷酸递送所必需的。作为进一步的比较例，当用与Lipofectamine一起配制的mRNA处理HeLa细胞时，观察到仅中等水平的eGFP表达，并且仅大约50％的细胞表现出荧光。
在一些其他实施例中，为了优化CART D13:A11的递送参数，将阳离子寡聚物与阴离子mRNA的电荷比从1:1至50:1(+/-)变化，并且确定了所得的eGFP荧光(图9C)。假定完全的胺质子化和磷酸根去质子化，将值报告为铵阳离子的摩尔数与磷酸根阴离子的摩尔数的理论(+/-)电荷比。eGFP表达显示出对电荷比的大致抛物线型依赖性，其中最大eGFP荧光由以10:1(+/-)电荷比形成的复合物产生。该值高于在用于siRNA递送的富含胍鎓的寡聚碳酸酯复合物(其在4.8:1的电荷比下最佳地进行)的情况下观察到的值。进一步使用落射荧光显微术确认流式细胞术结果(图9D)。用CART/mRNA复合物处理的HeLa细胞在几乎所有可见细胞中显示出显著的荧光。相比之下，用Lipofectamine处理的细胞显示出部分eGFP表达，而剩余的其他细胞未转染。
在进一步的实施例中，在一组细胞系(包括通常被认为难以转染的那些细胞系)中测定通过CART,D13:A11递送后的eGFP mRNA表达。除HeLa细胞外，还通过用由eGFP mRNA形成的CART复合物处理，将mRNA表达与Lipofectamine的mRNA表达在鼠巨噬细胞(J774)、人胚肾(HEK-293)、中国仓鼠卵巢(CHO)和人肝细胞癌(HepG2)细胞中进行比较(图6A)。在所有测试的细胞系中，使用CART D13:A11的表达eGFP的细胞的百分比>90％，而用Lipofectamine处理仅在22％-55％的细胞中诱导表达(图11A)。这表明该递送系统对于多种人和非人细胞类型是通用的。除永生化细胞系外，还在原代CD1小鼠来源的间充质干细胞(MSC)中观察到mRNA表达，具有高转染效率(>85％)。
其他实施例已经显示了在对转染更具挑战性的其他细胞系中的CART活性，所述细胞系包括Jurkat T细胞(在CART情况下11％转染相对于针对Lipofectamine的7％)、原发性T细胞(6％转染率相对于针对Lipo的0％)，以及3T3成纤维细胞(针对CART的70％相对于Lipo的59％)和滋养层干细胞(针对CART的19％相对于针对Lipo的69％)。
在一些实施例中，使用不同长度的mRNA(诸如较大的萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA)也观察到通过CART D13:A11进行的一致mRNA转染，其基本上优于Lipofectamine>3倍(图11B)。类似于用eGFP mRNA观察到的趋势，尽管mRNA长度不同，10:1(阳离子:阴离子)比率导致最高水平的Fluc生物发光，这表明递送效率在很大程度上独立于货物大小。
对于这些实施例，将HeLa细胞以10,000个细胞/孔接种在黑色96孔板中并使其粘附过夜。如上使用Fluc mRNA(50μL总体积中的50ng mRNA/孔的终浓度)制备mRNA聚合复合物和LipofectamineTM2000对照。所有条件均以6个平行测定进行。将细胞在处理下在37℃下孵育8小时，然后除去培养基并向细胞中添加100μL在DMEM中的D-荧光素溶液(300μg/mL)。使用IVIS 50或IVIS 200(Perkin-Elmer的Xenogen产品线)电荷耦合器件相机和LivingImage软件测量所得的发光。数据代表三次实验的平均值，将误差表示为±SD。
电荷改变的解体结构域
通过递送eGFP mRNA和Cy5标记的eGFP mRNA的混合物，可以将mRNA内化和表达的分析解耦并且同时进行量化；Cy5荧光指示内化的mRNA，而与定位无关，并且eGFP荧光表示细胞溶质释放和随后的mRNA表达。该方法通过比较针对CART D13:A11:非解体型含胍鎓的D13:G12和非解体型含铵的D13:Pip13的两种寡聚物的细胞摄取和mRNA表达，揭示了主链结构和阳离子类型的影响。
在这些实施例中，当将Cy-5mRNA与CART,D13:A11一起配制时，观察到高水平的细胞内Cy5和eGFP荧光(图10B、D)。作为比较例，当使用非解体型含胍鎓的D13:G12或非解体型含铵的D13:Pip13时，仅观察到Cy5-荧光。该实施例表明，所有三种mRNA复合物均由细胞有效地内化，但没有快速降解的主链，来源于D13:G12和D13:Pip13的非解体型聚合复合物在实现可检测翻译水平所需的时间尺度上不释放mRNA。由含铵的D13:Pip13形成的复合物缺乏eGFP表达进一步表明CART，D13:A11的功效不仅仅是由于铵与胍鎓阳离子的静电结合亲和力的差异。相反，由解体型重排导致的特定受控的阳离子电荷损失对于功效是至关重要的。
具体地，在这些实施例中，为了测量寡聚物/mRNA聚合复合物的细胞摄取和释放，用如上使用Cy5标记的eGFP mRNA制备的聚合复合物以62.5ng mRNA/孔的终浓度处理HeLa细胞。如上制备细胞并且通过流式细胞术分析eGFP和Cy5荧光两者。
另外的实施例使用共聚焦显微术确认了在当前实施方案中进行解体的必要性。通过共聚焦显微术，并同时检测丹磺酰基化转运蛋白、Cy5-mRNA和内体区室染色剂四甲基罗丹明(TRITC)-葡聚糖4400进一步确认相比于无效转运蛋白(D13:G12)通过CART，D13:A11进行的CART介导的mRNA释放和内体逃逸。当在用CART D13:A11/Cy5-mRNA复合物处理后4小时对细胞成像时，观察到针对Cy5和丹磺酰基荧光团的弥散荧光，这表明那些材料成功地逃逸内体并从聚合复合物中解离(图10D)。还观察到来自(TRITC)-葡聚糖4400的弥散荧光，其可归因于内体破裂和包埋的葡聚糖的释放。作为比较例，当用非解体型D13:G12/Cy5-mRNA复合物处理细胞时，Cy5和丹磺酰基荧光都保持为点状并共定位。这些信号也与指示内体包埋的点状TRITC-葡聚糖4400强烈重叠(图10D)。总之，这些数据强烈表明CART D13:A11的电荷改变行为使得能够内体破裂和mRNA释放，从而有助于这些材料对于mRNA递送的高性能。
具体地对于共聚焦显微术实施例：将HeLa细胞以10,000个细胞/孔接种在8室玻璃底皿(Nunc Lab-Tek II，Thermo Scientific)中并使其粘附过夜。在处理之前，用无血清DMEM洗涤细胞，并且向每个孔中添加200μL的具有100μM TRITC-葡聚糖(Sigma，平均分子量＝4,400)的无血清DMEM。如上制备Cy5-eGFP mRNA聚合复合物(终浓度为125ng mRNA/孔)并且添加至每个对应孔中。将细胞在37℃下孵育4小时，然后除去培养基并且添加500μL含有10mM HEPES缓冲溶液的PBS。使用针对DAPI(丹磺酰基)、GFP、DsRed(TRITC-葡聚糖)和Cy5调节的Leica SP8白光共聚焦显微镜对细胞成像。
通过CART对mRNA的体内递送
在某些实施例中，CART诸如D13:A11在体内表现出优异的基因表达。在一个实施例中，与萤光素酶mRNA复合并肌内施用至Balb/c小鼠中的CART D13:A11表现出高水平的生物发光。作为比较例，未与递送剂复合的mRNA未显示出所得的生物发光。该表达在4小时时到达峰值，并且在48小时后仍然可观察到。在这些实施例中，将7.5μg荧光素酶mRNA以10:1电荷比与D13:A11在75μL PBS(pH 5.5)的总体积中复合并且注射到Balb/c小鼠的右大腿肌肉中(图11C、D)。
在另外的实施例中，当通过静脉内尾静脉注射施用时，与荧光素酶mRNA复合的D13:A11显示高水平的生物发光。高水平的表达持续24小时，48小时后具有可检测的生物发光。在这些图像中生物发光主要定位于脾脏和肝脏(图11E、F)。在静脉内施用裸mRNA时，未观察到生物发光信号。对于所有研究的小鼠，在注射后未立即观察到毒性或在处理后数周未观察到毒性。
作为另外的实施例，静脉内施用与CART O11:A9、D12:Gly10.5和D14:a-甲基14.5复合的Fluc mRNA均导致肝脏和/或脾脏中显著的荧光素酶表达。在这些实施例中，将7.5μg荧光素酶mRNA以10:1电荷比与CART在75μL PBS(pH 5.5)的总体积中复合并且注射到Balb/c小鼠的尾静脉中。
在另外的实施例中，当通过肿瘤内注射施用时，与荧光素酶mRNA复合的D13:A11显示高水平的生物发光。在该实施例中，将4μg荧光素酶mRNA以10:1电荷比与D13:A11在75μLPBS(pH 5.5)的总体积中复合并且注射到实体皮下A20淋巴瘤肿瘤的中心中。
在另外的实施例中，当通过皮下注射施用时，与荧光素酶mRNA复合的CART O11:A9、D12:Gly10.5和D14:a-甲基14.5显示出高水平的生物发光。在该实施例中，将5μg荧光素酶mRNA以10:1电荷比与D13:A11在75μL PBS(pH 5.5)的总体积中复合并且注射到Balb/C小鼠的背部上的皮肤下。
作为比较例，当将现有技术D12:G12与Fluc mRNA复合时，未观察到所得的生物发光。在该实施例中，将5μg荧光素酶mRNA以10:1电荷比与D13:A11在75μL PBS(pH 5.5)的总体积中复合并且注射到Balb/C小鼠的背部上的皮肤下。
用新的带电结构域进行的mRNA递送和表达
比较例：使用原始实施方案证明的电荷改变基序，合成了具有不同化学结构的新单体和新的CART寡聚物。这些CART显示出有效地包装和转染荧光标记的(Cy5)mRNA，其中一些变化(诸如D9:(7-lact)11和D12:(7-甘氨酸)11导致比母体D13:A11体系高的(1.1至1.2x)细胞内Cy5荧光。这些CART的一些变体(a-Me、a-Me-共-A)显示出一些mRNA表达。
亲脂性聚合物结构域
一些实例包括含有材料的亲脂性聚合物结构域(或可互换的脂质嵌段)的变化的CART。申请人已展示出含有作为亲脂性聚合物结构域掺入的胆固醇、壬烯基、硬脂酰基、油基和亚油基侧链的CART的合成。当与eGFP mRNA复合时，这些变体表现出不同的性能，其中油基和亚油基官能化材料给出与基于十二烷基的体系相似的转染效率。
一些工作表明，如通过动态光散射所测量脂质嵌段或亲脂性聚合物结构域变化影响粒度和ζ电位，其中亚油基和油基材料保持正ζ电位的时间长于基于硬脂酰和十二烷基的CART。
新的引发剂
一些实例已经探究了用于开环聚合的引发醇的变体，以便将另外的官能团掺入到CART中。已经探究的引发剂包括荧光团(丹磺酰基和BDK)、支链(3-臂)部分、荧光淬灭剂(BHQ)和生物素化衍生物。含有不同引发剂官能团的类似单体嵌段长度的CART通常显示与原始实施方案相似的eGFP mRNA转染效率。
在一些实施方案中，引发剂可具有下式：
Figure BDA0003771948270000601
已经使用荧光引发剂通过流式细胞术和共聚焦显微术独立地跟踪货物(mRNA)和转运蛋白(丹磺酰基或BDK)的摄取。已经使用淬灭引发剂以通过监测从淬灭颗粒释放时荧光的重新出现来监测荧光标记的mRNA或miRNA货物的释放。
初步结果表明，3-臂引发剂可以在保持mRNA转染效率的同时将结构变化引入到CART/mRNA颗粒中(例如，大小和ζ电位)。
初始结果表明，生物素衍生的引发剂可用于靶向癌细胞或通过生物素/链霉抗生物素蛋白互补性连接额外的货物。
实施例5.抗衡离子
先前的实施例涉及使用三氟乙酸进行Boc脱保护，这导致针对铵阳离子的三氟乙酸根抗衡离子。本申请人还证明了在不同条件(包括盐酸(HCl)以提供氯离子抗衡离子)下脱保护的CART的相似功效。所得的CART盐显示出与原始实施方案几乎相同的转染效率/表达。
实施例6.mRNA的组合
在一些实施方案中，多个mRNA可以组合成单一CART复合物。其中一个实例是CARTD13:A11与eGFP mRNA和mCherry mRNA的二元混合物的共同配制。在这些条件下，eGFP与mCherry的所得比率反映了mRNA转录物到复合物中的进料比。另外的流式细胞术分析证明所有细胞都是双阳性或双阴性，这表明两种转录物掺入到相同的CART/mRNA颗粒中而不是含有每种转录物的单独颗粒中。这种共同配制是通过在添加CART和处理之前简单混合两种转录物来实现的，并且不需要额外的优化。
在另外的实施例中，通过用eGFP和Fluc mRNA的二元混合物共同配制CART D13:A11/mRNA复合物展示了多种mRNA转录物的同时表达。这些聚合复合物诱导两种独特蛋白质的表达，所述蛋白质的水平与制剂中那种转录物的质量％成比例。
实施例7.其他寡核苷酸货物
除了对mRNA递送的研究外，本申请人还探究了我们的各种CART体系用于递送其他核酸货物。siRNA、miRNA、小环DNA和pDNA的摄取和活性显示出适于CART技术。对于许多这些货物，根据经验确定CART优化(例如电荷比、脂质结构域的长度/不饱和度)。
siRNA
若干种CART，包括未取代的吗啉酮(D13:A11)和7元甘氨酸官能化的内酯(D10:(7-gly)11)，已对siRNA诱导的基因敲低展示出高水平的功效。出乎意料的是，诸如(D10:(7-gly)11)的体系显示出荧光mRNA的摄取但没有产生mRNA翻译，然而将通过以低siRNA剂量(例如5皮摩尔/孔)递送siRNA导致蛋白质表达>85％的敲低。
比较例：这两种CART递送剂显著优于现有技术，所述现有技术由非释放转运蛋白诸如D:G 4:4(参考文献WO2013036532 A1和PNAS 2012,109(33),13171–13176)组成，其在这些条件下仅展示出50％敲低。
具体地，siRNA敲低实验根据修改自(Geihe等人PNAS 2012,109(33),13171–13176)的程序进行。将表达TdTomato/EGFP的HaCaT细胞以10,000个细胞/孔铺板在96孔板中，并使其在37℃下孵育18-24小时。通过首先将2μL的25μM CBL3 siRNA原液与17.60μL的pH 5.5下的PBS预混合来制备siRNA/CART复合物。将CART从2mM DMSO中的原液中添加至该混合物，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将溶液混合20秒，然后向含有100μL无血清DMEM的96孔板的3个孔中的每个孔中添加5μL，使得净浓度为5pmol/孔的siRNA。将细胞与复合物一起孵育4小时，在此时间后用含血清的DMEM替换培养基，并且将细胞孵育48小时。该孵育后，将细胞用PBS洗涤、胰蛋白酶化，并且通过流式细胞术分析。归一化tdTOM表达百分比使用下式计算：(平均荧光tdTOM处理的细胞/平均荧光EGFP处理的细胞)/(平均荧光tdTOM未处理的细胞/平均荧光EGFP未处理的细胞)x 100。
miRNA
在一些实施例中，核酸货物是荧光标记的miRNA。流式细胞术分析显示与其他转染方法诸如Lipofectamine和聚(乳酸-共-羟基乙酸)纳米颗粒相比，使用CART D13:A11对标记的miRNA的稳健摄取。在这些实施例中，miRNA摄取的最佳电荷比为20:1(阳离子:阴离子)，其高于对于mRNA观察到的电荷比(10:1)。
具体地，使用Cy5标记的miRNA测量miRNA摄取。简而言之，将HeLa细胞以40,000个细胞/孔铺板在24孔板中并使其在37℃下粘附过夜。通过首先将2.1μL的0.2μg/μLCy5-miRNA原液(序列：Cy5-UpCpApACAUCAGUCUGAUAApGpCpUpA)与5.72μL的pH5.5下的PBS预混合来制备CART/miRNA复合物。然后，在临转染之前，将CART从2mM DMSO中的原液中添加至该混合物，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将其混合20秒，然后向含有200μL无血清DMEM的24孔板的3个孔中的每个孔中添加5μL，最终miRNA浓度为125ng/孔。将其在37℃下孵育8小时。此时间后，将细胞用PBS洗涤、胰蛋白酶化，并且通过流式细胞术确定细胞内Cy5-荧光。
pDNA
在一些实例中，核酸货物是双链质粒-DNA(pDNA)而不是前述RNA货物。在这些情况下，CART相比于商业剂诸如Lipofectamine显示出改善的功效(大约2.5倍)，从而导致更高的转染效率和中值荧光强度。具体地，将编码pPKCδ-GFP的质粒用作荧光报告分子。在一些情况下，含有不同脂质嵌段或亲脂性聚合物结构域的CART对于质粒递送比CART D13:A11有效，其中油基-和亚油基-官能化材料显示出最高的转染效率。
CART/pDNA复合物的粒度通常小于类似的含mRNA颗粒，流体动力学直径对于大多数化合物为90-110nm，并且对于亚油酰基官能化的CART为390nm。ζ电位遵循与mRNA颗粒相同的趋势，从大约+40mV开始并且随着电荷改变重排发生而降低至-40mV。
转染的具体实验细节：例如通过CART O11:A9进行的转染，将CHO细胞以40,000个细胞/孔接种在24孔板中并使其粘附过夜。通过将PBS pH 5.5和pPKCδ-GFP与各种量的来自DMSO原液的寡聚物混合来制备pDNA:CART复合物，以实现特定的pDNA/CART比率(优化至理论阳离子:阴离子比率为25:1，115μL总体积)。在处理之前，将复合物在室温下孵育20s。根据制造商的说明书，在OptiMEM中制备Lipofectamine 2000对照。将细胞用无血清F-12培养基洗涤，并且添加pDNA/Lipofectamine溶液，最终体积为500μL/孔和679ng pDNA/孔。用无血清F-12培养基洗涤后，将37.5μL pDNA/CART复合物添加至三个孔中的每一个中，总体积为500μL并且最终pDNA浓度为674ng/孔。将细胞在37℃下孵育24小时，此时用含血清的F-12培养基替代培养基。将细胞再孵育24小时，并且然后用胰蛋白酶-EDTA(0.25％)在37℃下胰蛋白酶化5分钟。添加含血清的F-12培养基并且将每个孔的内容物离心。除去上清液并且将沉淀的细胞再分散于PBS(200μL)中，转移至FACS管，并且在流式细胞仪分析仪(LSR-II.UV，Stanford University)上读取。所呈现的数据是来自分析的5,000-10,000个细胞的几何平均荧光信号。对于转染效率，将未处理的细胞针对无eGFP表达进行门控，并且所呈现的数据是分析的细胞中具有高于未处理细胞的eGFP表达的百分比。将误差表示为±SD。
通过CART/pTransposase的递送进行的稳定转染
在一些实施例中，可以同时递送多种质粒，诸如分别编码pLuciferase(含有转座酶识别位点)和pTransposase的质粒的组合，导致靶荧光素酶基因的稳定表达。6天后，CARTO11:A9显著优于Lipofectamine，生物发光水平增加大于10倍。
对于这些实施例，将CHO细胞以10,000个细胞/孔接种在黑色96孔板中并使其在37℃下粘附过夜。通过首先将pH 5.5下的PBS与470ng编码萤火虫荧光素酶和tdTomato两者的pDNA或总共585ng的与pTransposase以2:1比率混合的相同质粒预混合来制备pDNA:CART复合物。根据制造商的说明书，在无血清OptiMEM培养基中制备Lipofectamine对照。在临转染之前，将CART从2mM DMSO中的原液中添加至质粒/PBS溶液，以实现5:1的净+/-电荷比。将所得的复合物在室温下孵育20s，然后添加至细胞。用无血清F-12培养基冲洗细胞，然后将7.3μL复合物添加至含有无血清培养基的96孔板的3个孔中的每个孔中，每孔最终体积为50μL并且pDNA浓度为137或171ng/孔。将细胞在处理下在37℃下孵育24小时，此时用100μL的具有0.3mg/mL荧光素的含血清的F-12培养基替换培养基。使用IVIS 50或IVIS 200(Perkin-Elmer的Xenogen产品线)电荷耦合器件相机和Living Image软件测量所得的生物发光。将误差表示为±SD。在汇合时，使用0.25％胰蛋白酶将细胞传代至新孔。
进一步的实施例已确认用使用CART的多种质粒进行了有效递送和稳定转染。在这些情况下，分别编码pLuciferase(均赋予嘌呤霉素抗性并含有转座酶识别位点)和pTransposase的质粒的组合导致靶荧光素酶基因的稳定表达连同嘌呤霉素抗性。经几代的嘌呤霉素选择验证了稳定转染，相对于Lipofectamine，生物发光增加了两倍。
对于这些实施例，将CHO细胞以10,000个细胞/孔接种在黑色96孔板中并使其在37℃下粘附过夜。通过将pH 5.5下的PBS与585ng编码萤火虫荧光素酶和tdTomato的pLuc-tdTom/pTransposase混合物混合来制备pDNA:CART复合物。根据制造商的说明书，在无血清OptiMEM培养基中制备Lipofectamine 2000对照。在临转染之前，将CART从2mM DMSO中的原液中添加至pDNA/PBS溶液，以实现5:1的净+/-电荷比。将复合物在室温下孵育20s，然后添加至细胞。用无血清F-12培养基冲洗细胞，然后将7.3μL复合物添加至含有无血清培养基的96孔板的3个孔中的每个孔中，每孔最终体积为50μL并且pDNA浓度为171ng/孔。24小时后，用100μL的具有0.3mg/mL荧光素和6μg/mL嘌呤霉素的含血清的F-12培养基替换培养基。使用IVIS 50或IVIS 200(Perkin-Elmer的Xenogen产品线)电荷耦合器件相机和LivingImage软件每日对细胞成像。将误差表示为±SD。处理结束后72小时，使用20μL 0.25％胰蛋白酶/孔将细胞传代。将细胞孵育5分钟，并且然后用80μL含血清的F-12培养基稀释，每孔的最终体积为100μL。从每个孔中，将30μL细胞溶液添加至3个新孔中的每一个孔中，并且用70μL的具有0.3mg/mL荧光素和6μg/mL嘌呤霉素的含血清的F-12培养基稀释。将原始孔中剩余的10μL细胞溶液用90μL的具有0.3mg/mL荧光素和6μg/mL嘌呤霉素的含血清的F-12培养基稀释，每孔的最终体积为100μL。
小环DNA
进一步的实施例显示出使用CART对小环DNA(mcDNA)的有效递送。在这些情况下，通过CART D13:A11和油基CART O11:A9两者将编码荧光素酶的小环DNA递送至HeLa细胞。与Lipofectamine和聚乙烯亚胺(PEI)制剂两者相比，这导致高水平的荧光素酶表达(大约高10倍)。
具体地，使用荧光素酶报告系统测量小环DNA摄取和表达。简而言之，将HeLa细胞以15,000个细胞/孔铺板在96孔板中并使其在37℃下粘附过夜。通过首先将2.1μL的含有萤火虫荧光素酶基因和组成型启动子的0.2μg/μL小环DNA原液与5.71μL的pH 5.5下的PBS预混合来制备CART/小环DNA复合物。根据制造商的说明书制备Lipofectamine和PEI对照。然后，在临转染之前，将CART从2mM DMSO中的原液中添加至该混合物，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比(或任何其他待测试的电荷比)。将其混合20秒，然后向含有100μL无血清DMEM的96孔板的6个孔中的每个孔中添加2.5μL，最终小环DNA浓度为62.5ng/孔。将其在37℃下孵育8小时，然后用含有0.3mg/mL荧光素的含血清的DMEM替换培养基，并且使用IVIS相机系统对细胞进行生物发光成像。
实施例8.CRISPR/Cas9编辑
在CART介导的转染的一些实施例中，证明了通过特异性CRISPR/Cas9基因编辑成功敲入靶基因。在这种情况下，将编码Cas9的mRNA与D13:A11连同靶向鼠β-肌动蛋白基因的非翻译区的sgRNA共同配制。还共同配制的是小环DNA，所述小环DNA含有荧光素酶或mCherry基因和来自β-肌动蛋白基因的相同CRISPR裂解位点，并且不含启动子。使用该系统，只有当Cas9裂解鼠基因组和小环两者导致小环载体插入到β-肌动蛋白非翻译区中以使得其处于β-肌动蛋白启动子的控制下时，才会发生报告基因的表达。
进行Cas9 mRNA和sgRNA构建体与荧光报告基因的共同配制以确保这些货物的存在不破坏CART的核酸递送。在这种情况下，将eGFP mRNA配制成具有Cas9 mRNA或sgRNA的50％w/w混合物，或由50％eGFP mRNA、25％Cas9 mRNA和25％sgRNA组成的制剂。在这两种实施例中，细胞eGFP荧光为完全由eGFP mRNA组成的制剂的细胞eGFP荧光的大约50％。使用CART D13:A11和O11:A9两者获得该相同的结果。这支持了由上述CART成功共同配制了CRISPR组分。通过DLS的另外表征(根据标准程序)证明，用D13:A11或O11:A9和Cas9 mRNA和sgRNA的混合物形成的颗粒的大小为大约173nm，这与针对其他mRNA转录物观察到的大小一致。
当用如上与luc小环构建体配制的复合物处理3T3鼠成类纤维细胞时，观察到显著的生物发光读数。当使用乱序sgRNA序列时未观察到该信号，这确认了它是由于荧光素酶基因特异性插入到3T3基因组中。当在制剂中使用较高比率的小环DNA时，所得的生物发光增加。另外，当由含有mCherry的小环形成复合物并将其暴露于3T3成纤维细胞时，流式细胞术分析表明在大约2％的靶群体中存在强mCherry荧光，这表明了有效的基因组整合。
具体地，根据以下一般程序，在3T3成纤维细胞中进行CRISPR/Cas9基因编辑。简而言之，将HeLa细胞以40,000个细胞/孔铺板在24孔板中并使其在37℃下粘附过夜。通过首先将134ng Cas9 mRNA、134ng sgRNA和134ng含有荧光素酶基因的小环DNA与22.8μL的pH 5.5下的PBS预混合来制备CART/寡核苷酸复合物。然后，在临转染之前，将CART从2mM DMSO中的原液中添加至该混合物，以实现10:1的净阳离子:阴离子电荷比。将其混合20秒，然后向含有400μL无血清DMEM的24孔板的3个孔中的每个孔中添加7.5μL，最终浓度为每种组分40ng。将其在37℃下孵育8小时。此时间后，用含血清的DMEM替换培养基并放置24-48小时。孵育后，用具有0.3mg/mL荧光素的含血清的DMEM替换培养基并且使用IVIS相机系统对细胞进行生物发光成像。
实施例9.mRNA疫苗接种
在疫苗接种实施例中，单独的CART和CART与佐剂(不存在mRNA)的组合都不会在替代抗原模型中诱导保护性抗肿瘤免疫(图2)。具体地，在该实施例中，将6-8周龄的小鼠同时接种107个表达肿瘤特异性抗原(TSA)的A20细胞，并且用单独的206μg CART或206μgCART+50μg佐剂通过在除肿瘤之外的不同的解剖位点的皮下注射进行治疗。每日测量肿瘤大小，并且根据动物方案使肿瘤直径>15mm的小鼠安乐死。对于这些对照组中的任一个，在接种的小鼠中未观察到生命延长。CART不会引发免疫应答。
通过同时肿瘤暴露进行的预防性疫苗接种
当在肿瘤接种之前或之时进行疫苗接种时，提供抗原特异性预防性应答。这些研究表明，疫苗接种含有TSA-mRNA的CART+佐剂(在共同配制实施方案中或在疫苗接种时单独施用)在具有TSA表达肿瘤细胞的小鼠模型中诱导保护性免疫。用CART/TSA-mRNA治疗提供了保护，并且使用免疫刺激佐剂提供增加的功效。用单独的佐剂治疗的小鼠快速生长大肿瘤并且根据动物方案处死。由单次剂量产生稳健应答，不需要疫苗加强，并且可以在继发性肿瘤激发时可被召回(图3)。
具体地，在该实施例中，通过皮下注射将6-8周龄的小鼠同时接种107个表达肿瘤特异性抗原(TSA)的A20细胞，并且用CART+TSA-mRNA+佐剂(如前所述配制)或单独的佐剂通过在除肿瘤之外的不同的解剖位点的皮下注射进行治疗。在前30天每隔一天测量肿瘤大小。将肿瘤直径>15mm的小鼠安乐死。在再召回应答实验中，将来自CART+TSA-mRNA+佐剂治疗组的存活小鼠用107个表达TSA的A20细胞再次激发。
对已建立肿瘤的治疗
当在建立大肿瘤后施用CART/mRNA+佐剂疫苗接种时，诱导抗原特异性治疗性应答。接种大肿瘤后7天，用CART/mRNA+佐剂施用治疗提供了肿瘤的消退和缓解(3x 3μgTSA-mRNA/CART复合物)。在该研究中(总共5只动物)，小鼠显示出肿瘤生长的进展显著减慢，而40％的小鼠(2/5小鼠)甚至在约60-90天后完全治愈了肿瘤。使用mRNA/CART+佐剂的疫苗接种优于已建立的已在动物研究中反复显示出提供保护的蛋白质疫苗接种策略。
具体地，在该实施例中，对6-8周龄的小鼠皮下接种107个表达肿瘤特异性抗原(TSA)的A20淋巴瘤细胞。当肿瘤大小达到150mm3时，将小鼠用与3μg TSA-mRNA复合的CART+佐剂、单独的佐剂或盐水溶液通过在除肿瘤之外的不同的解剖位点的皮下注射治疗三次，每次治疗之间隔4天。在前40天每隔一天测量肿瘤大小。将肿瘤直径>15mm的小鼠安乐死。
肿瘤内疫苗接种
肿瘤内注射CART/mRNA复合物导致肿瘤消退。用CART复合的mRNA治疗的已建立的A20淋巴瘤肿瘤导致肿瘤中四种不同细胞群的亚群中的蛋白质表达。认为通过增强T细胞功能调节抗肿瘤免疫应答的候选蛋白质对治疗的肿瘤显示出深远的作用。值得注意的是，在同一动物的远侧未治疗肿瘤上也观察到具有延迟生长速度的作用(图5)。这些发现表明原位疫苗接种/增强策略在转移性疾病中具有治疗潜力。
具体地，在该实施例中，将6-8周龄的小鼠同时在两个不同的解剖位置皮下接种107个A20细胞。当肿瘤大小达到150mm3时，用CART+10μg免疫调节蛋白mRNA，或盐水溶液的三次肿瘤内注射来治疗每只小鼠中的一个肿瘤。另一个肿瘤未经治疗。在前20天每隔一天测量两个肿瘤，或直到肿瘤达到小鼠必须被安乐死的大小。
实施例10.用于递送和释放信使RNA的电荷改变可释放转运蛋白(CART)。
本文提供了对新的可调且非常有效的合成性可生物降解材料电荷改变可释放转运蛋白(CART)种类的步骤经济合成和评价。根据本文的一些实施方案提供的CART在结构上是独特的并且通过前所未有的机制操作，最初充当复合、保护和递送mRNA的α-氨基酯阳离子，并且然后通过降解的电荷中和分子内重排改变物理特性，以释放mRNA以用于细胞培养中和动物中的高效蛋白质翻译。这种新的mRNA递送技术可以广泛应用于众多研究和治疗性应用。
信使RNA(mRNA)能够体内合成其编码的蛋白质，为快速兴起的一类基因治疗药物提供基础，所述基因治疗药物具有转变癌症、遗传病症和传染性疾病等多种疾病的治疗的潜力。根据本文某些实施方案的方法和组合物用于mRNA编码蛋白的特异性表达的用途可以用于研究和成像应用、用于需要蛋白质替换或增强的治疗用途，以及用于针对预防性和免疫治疗性适应症的新疫苗接种策略。
根据本文提供的一些实施方案的电荷改变可释放转运蛋白(CART)首先作为聚阳离子起作用以暂时复合和保护聚阴离子mRNA，并且然后通过受控的自解体机制快速转变它们的阳离子电荷，并且由此快速转变阴离子结合能力。
作为某些实施方案的实例提供了对作为被设计用于mRNA的非共价复合、保护、细胞内递送和释放的新种类材料的CART的开发。这些CART由动态阳离子α-氨基酯组成，所述α-氨基酯通过独特的自解体机制重排，将阳离子胺转化为中性酰胺。所述材料是通过有机催化开环聚合(OROP)和脱保护而步骤上经济合成的(两个步骤)并且有效复合mRNA成为自组装的聚电解质复合物，所述复合物通过肌内和静脉内施用在多种细胞类型和动物模型中递送和释放mRNA。本文的实施例10进一步证明，这些材料的mRNA递送的功效是由于它们独特的电荷改变分子内重排，所述分子内重排引发稳健的内体逃逸和细胞溶质mRNA释放。
我们设计了一类新的寡核苷酸递送媒介物即两性寡聚(碳酸盐-b-α-氨基酯)，其具有动态特性以解决与mRNA递送相关的特定挑战。我们先前关于siRNA的研究证明，使用含有亲脂性嵌段和阳离子嵌段的嵌段共聚寡聚物可以实现有效递送，所述阳离子嵌段被设计用于由阴离子siRNA双链体形成纳米级聚合复合物。由于单链mRNA显示出比siRNA和pDNA更短的细胞内半衰期，所以我们假设快速内体逃逸和随后的寡核苷酸释放对于有效表达是至关重要的。为了解决这两个问题，我们设计了两亲性寡聚物递送媒介物，其掺入了快速自解体的阳离子嵌段，所述阳离子嵌段同时用于裂解寡聚物主链并将阳离子胺转化为中性酰胺。假设细胞摄取后的主链降解增加内体中的渗透压，从而促进内体破裂。另外，该机制同时消除了聚阴离子和聚阳离子组分的多位点和静电缔合，促进细胞溶质mRNA释放和随后的基因表达。
我们先前已经报道了由N-保护的吗啉-2-酮的OROP合成聚(α-氨基酯)(图7，1)，随后导致其用于如本文所述的mRNA递送的研究。官能化的内酯单体易于从可商购获得的起始物质的两个高产率步骤中产生。这些单体可以在有机催化条件下用伯醇引发剂开环以产生聚(α-氨基酯)，对链长和分散性具有精确控制。脱保护后，寡聚物是水溶性的(>0.5M)并且在未缓冲的水中是稳定的(在D2O中>2天)。然而，与众所周知的聚(β-氨基酯)不同，在暴露于轻微碱性条件下，它们通过受控的自我解体型重排在<5分钟内降解，这在此用于通过失去静电相互作用促进mRNA释放。
对该降解的机制研究表明铵阳离子的部分去质子化，从而允许通过5元过渡态分子内环化成主链酯(图7A)。在主链的初始收缩之后，相邻单体单元上的氮基团通过6元过渡态参与第二次环化，形成羟乙基甘氨酸的小分子二聚体(HEGD，2)，即已知的美拉德反应的无毒代谢物。这种重排非常快速且有效；同型寡聚物在pH 7.4下以t1/2<2分钟降解。该体系的独特反应性可以通过感应性和氢键相互作用对主链酯羰基的补充活化来解释，所述补充活化与羰基辅助的所需亲核胺的去质子化同时进行。通过新形成的羟乙基酰胺使6元过渡态刚性化促进最终环化形成HEGD 2。虽然将分别报告对该重排的机制和变型的进一步研究，但将聚阳离子寡聚物快速转化为电荷中性片段的该体系的独特动力学代表了用于聚阴离子药物和探针递送的潜在广泛可利用的原理。
我们设计的用于递送mRNA的材料特征在于附接至自我解体型α-氨基酯阳离子嵌段的十二烷醇官能化的亲脂性碳酸酯嵌段，所述亲脂性碳酸酯嵌段使用OROP方法通过吗啉-2-酮单体与环状碳酸酯的共聚合而容易地实现(图7B)。
该技术的一个有吸引力的方面是在二嵌段共聚寡聚物中使用不同长度的亲脂性聚合物结构域(或脂质嵌段)来调节性能的能力。使用伯醇引发十二烷基-碳酸酯嵌段的开环，然后添加阳离子嵌段并使其寡聚来合成一小系列寡聚物递送媒介物。使用该策略，合成了含有平均13个脂质单体单元和11个阳离子单体单元(D13:A11 7)、18个脂质和17个阳离子单元(D18:A178)的寡聚物和13个阳离子单元的同型寡聚物(A13 9)。每个新的载体可以仅进行两个步骤(仅需要几个小时的过程)来制备。
为了增加我们对适用于CART递送媒介物时的这种重排的理解，使用凝胶渗透色谱法(GPC)来分析生理pH下的寡聚(碳酸酯-b-α-氨基酯)的动力学。为了显示重排反应仅影响两亲性CART的阳离子结合部分同时保持亲脂性结构域完整，将模型共聚寡聚物Pyr-D15:A1210溶解于pH 7.4下的PBS缓冲液中以实现重排(图8A)。一小时后，将溶液浓缩并通过GPC分析(图8B)。将降解的共聚寡聚物的GPC迹线(黑色)与独立合成的Pyr-D15寡聚物11(蓝色)和重排和Boc-脱保护之前的Pyr-D15:A12嵌段共聚寡聚物(红色)进行比较。如所预期的，受保护的D15:A12嵌段共聚寡聚物的GPC迹线显示出比同型寡聚物Pyr-D15 11高的分子量(分别为6.4kDa和4.6kDa)。然而，在暴露于pH 7.4PBS缓冲液后，脱保护的嵌段共聚寡聚物显示出减小的分子量(4.3kDa)，与Pyr-D15脂质嵌段(4.6kDa)几乎相同，这表明在生理pH下，CART的阳离子部分降解，而完整的亲脂性嵌段保持完整。来自相同GPC数据的UV迹线表明，起始醇(在这种情况下为芘丁醇，但可以使用其他亲核醇、胺和硫醇)保持与亲脂性嵌段连接，使得未来的研究能够使用该醇来附接其他官能团，诸如用于将CART靶向至各种细胞和器官的配体。
为了评价CART作为mRNA递送媒介物的功效，选择增强的绿色荧光蛋白(eGFP)mRNA作为模型报告基因。处理后的eGFP荧光的流式细胞术分析允许同时定量平均蛋白质表达，以及表现出高于基线的荧光水平的细胞分数(转染％)。将用CART复合物处理后的基因表达与作为阳性对照的商业剂Lipofectamine 2000(Lipo)以及已知对siRNA递送特别有效的两种化合物(D4:G4 12和D12:G12 13)进行比较。当根据制造商的说明书用与Lipofectamine一起配制的mRNA处理HeLa细胞时，观察到中等水平的基因表达(图9A)。然而，这种情况仅导致大约50％的细胞转染，其中细胞群的一半未显示出eGFP表达(图9B)。形成了鲜明的对比，我们设计的寡聚(碳酸酯-b-α-氨基酯)CART，D13:A11 7提供了优异的eGFP表达，值得注意地，具有>99％的转染效率和高平均荧光。具有较长嵌段长度的第二种寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)CART(D18:A17 8)也提供了高转染效率(>90％)但提供较低的平均转染值。由α-氨基酯同型寡聚物(A13 9)形成的复合物不诱导eGFP表达。这也确认了先前的观察结果：疏水性结构域与亲水性结构域之间的显著相分离稳定了纳米颗粒形成，并且增加的亲脂性促进了膜缔合和摄取。与它们作为siRNA递送剂的效力相比，胍鎓官能化的两亲性寡聚碳酸酯D4:G4 12和D12:G12 13没有表现出mRNA表达。由于这些材料不包含被动水解(t1/2 >8小时)之外的降解或货物释放机制，这支持了我们的假设，即对于mRNA递送必须在与siRNA相比更快速的时间尺度上发生内体逃逸和细胞溶质释放。
为了优化CART7的递送参数，将阳离子寡聚物与阴离子mRNA的电荷比从1:1至50:1(+/-)变化，并且确定了所得的eGFP荧光(图9C)。假定完全的胺质子化和磷酸根去质子化，将值报告为铵阳离子的摩尔数与磷酸根阴离子的摩尔数的理论(+/-)电荷比。eGFP表达显示出对电荷比的大致抛物线型依赖性，其中最大eGFP荧光由以10:1(+/-)电荷比形成的复合物产生。该值高于在用于siRNA递送的富含胍鎓的寡聚碳酸酯复合物(其在4.8:1电荷比下最佳地进行)的情况下观察到的值，这可能是由于铵阳离子与磷酸根阴离子的稍低静电相互作用，对于胍鎓离子ΔG＝-0.575kcal/mol相对于对于铵离子的-0.417kcal/mol。使用该优化的10:1(+/-)电荷比进行所有进一步的实验。进一步使用落射荧光显微术确认流式细胞术结果(图9D)。用CART/mRNA复合物处理的HeLa细胞在几乎所有可见细胞中显示出显著的荧光。相比之下，用Lipofectamine处理的细胞显示出部分eGFP表达，而剩余的其他细胞未转染。
进行了一系列实验以进一步理解我们假设寡聚(碳酸盐b-α-氨基酯)CART在应用于mRNA递送时的性能中所涉及的解体型重排机制。在与用于体外转染的那些条件类似的条件下，将动态光散射(DLS)用于分析CART7和在7与mRNA之间形成的聚电解质复合物。当将含有mRNA的聚合复合物添加至细胞培养基时，它们的流体动力学大小在254nm处开始，但经两小时缓慢增加至512nm。观察到的大小增加反映了阳离子α-氨基酯嵌段向中性酰胺的部分重排，从而引起相关脂质链段的聚集。这通过ESI-MS确认，所述ESI-MS显示在相同时间尺度上HEGD小分子的相对强度增加。当将mRNA/CART颗粒添加至未缓冲的水时，在整个2小时的实验过程中，大小在254nm+/-10nm下保持一致。这反映了α-氨基酯同型寡聚物在这些条件下不重排的结果。ζ电位测量值与粒度数据一致，表面电荷在配制后立即从高阳离子+33mV开始，经2小时达到-30mV。这同样符合以下结果：阳离子铵部分重新排列成中性酰胺，并且由于相缔合的寡核苷酸而使表面主要为阴离子。粒度不是货物依赖性的。当将聚合复合物是与荧光素酶(Fluc)mRNA(其大约是eGFP长度的两倍(Fluc＝1929nt相对于eGFP＝996nt))形成的并且在pH 7.4下添加至细胞培养基时，颗粒表现出相同的行为，在273nm处开始并且经两小时过程缓慢地增加至444nm。这表明使用相同的CART在将来递送多种寡核苷酸是可能的。当没有添加mRNA货物时，寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)CART由于它们的两亲性结构而形成胶束。这些胶束在未缓冲的水中保持稳定，大小为68nm。然而，当将这些胶束添加至细胞培养基(pH 7.4)时，它们快速形成不能用DLS表征的聚集体。针对单独的同型寡聚物(t1/2＝2分钟)、寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)胶束(30分钟内聚集至>500nm)和mRNA/CART复合物(2小时后聚集至500nm)的组合重排数据表明，与mRNA的聚电解质复合作用推定通过降低去质子化的速率并由此重排增加了α-氨基酯材料在水性环境中的稳定性。这使得这些材料能够在pH7.4下在治疗相关的时间尺度上降解，同时保持足够稳定以用于在未缓冲的条件下储存和配制。
首先，为了确定细胞进入的机制，使用Cy5标记的eGFP mRNA来比较4℃(已知抑制内吞过程的条件)下的细胞摄取与37℃下的正常摄取。当在这些条件下处理HeLa细胞时，观察到Cy5-mRNA摄取的显著(85％)降低(图10A)。这与预期的250nm颗粒特有的内吞机制一致。
为了探究寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)CART的自我解体型释放机制，将用7处理产生的颗粒摄取和基因表达直接与对mRNA递送无效的阳离子寡聚物进行比较。通过递送eGFPmRNA和Cy5标记的eGFP mRNA的混合物，可以将mRNA内化和基因表达解耦并且同时进行量化；Cy5荧光指示内化的mRNA，而与内体逃逸或释放无关，并且eGFP荧光表示mRNA的细胞溶质释放，从而能够翻译。我们使用这种方法通过制备两个另外的与D13:A11 CART 7等同长度的阳离子嵌段共聚寡聚物来探究主链结构和阳离子类型对摄取和表达两者的影响。对三种寡聚物，即解体型含铵的CART(D13:A11 7)、非电荷改变的含胍鎓的寡聚物(D13:G12 13)和非电荷改变的含铵的寡聚物(D13:Pip13 14)直接比较细胞摄取和基因表达。
将寡聚物7、13和14与Cy5-eGFP mRNA以10:1(+/-)比率混合，并且将所得的复合物添加至HeLa细胞。虽然如通过Cy5荧光所定量所有共聚寡聚物提供大致相似的mRNA摄取水平(图10B)，但仅电荷改变的D13:A11 7导致可检测的eGFP mRNA表达。这个数据表明所有mRNA复合物有效地由细胞内化，但没有快速降解的主链，非CART复合物从未从内体逃逸或者它们均不会在实现细胞溶质eGFP表达所必需的时间尺度上释放mRNA。与非解体型含铵的寡聚物D13:Pip13 14形成的复合物缺乏eGFP表达进一步表明不仅仅是铵阳离子与胍鎓阳离子的静电结合亲和力的差异解释这种释放。相反，阳离子电荷的特定受控的损失和重排至小分子对于功效是至关重要的。
用我们的寡聚(碳酸酯-b-α-氨基酯)材料观察到的电荷改变机制可以中和mRNA结合并触发HEGD小分子的形成，促进内体逃逸和/或mRNA释放。为了进一步理解这种机制，将HeLa细胞用mRNA/CART复合物和已知影响内体微环境的两种化合物共同处理。刀豆素A(ConA)是一种特异性V-ATP酶抑制剂，已显示出可抑制内体酸化。用于基因递送的其他含阳离子铵的材料当与该化合物或类似化合物共同处理时显示出细胞溶质寡核苷酸浓度并随后的基因表达急剧降低，这是由于由质子海绵效应导致的内体缓冲渗透破裂的减少。虽然当用V-ATP酶抑制剂处理时，诸如阳离子脂质纳米颗粒和PEI的化合物显示基因递送的10-200倍减少，但是我们的α-氨基酯CART 7几乎不受Con A处理的影响(图10C，21％减少，p＝0.177)。这表明内体酸化和缓冲对于用该体系实现内体逃逸或基因表达不是必需的。氯喹(Chl)是已被用于通过增加内体缓冲和破裂来增加基因递送的一种向溶酶体剂。其他已表明，不掺入缓冲官能团的基因递送材料(诸如甲基化的PEI)显示出基因表达的显著增加(2-3倍)，而缓冲载体诸如PEI不受影响。我们的CART仅显示出表达的轻微下降(22％减少，p＝0.469)，这表明内体逃逸不是寡聚(碳酸盐-b-氨基酯)CART的mRNA递送的限制因素，可能是因为已经由于解聚和HEGD(2)形成而发生通过渗透破裂进行的有效逃逸。
与样品无效递送媒介物(D12:G12,13)相比，寡聚(酯-b-氨基酯)CART对mRNA的释放和内体逃逸的作用可通过共聚焦显微术并检测转运蛋白(使用连接的丹磺酰基荧光团3)、Cy5-mRNA和用于内体区室的染色剂四甲基罗丹明(TRITC)-葡聚糖4400进一步确认。当用CART(7)/Cy5-mRNA复合物处理后4小时对细胞成像时，连接至转运蛋白的Cy5信号和丹磺酰基(3)的荧光本质上都是弥散性的，这表明这些材料已经成功从内体逃逸并从纳米颗粒复合物解离(图10D，i)。在丹磺酰基信号中观察到的斑点(图ii)可能是由释放的脂质嵌段的一些细胞内聚集引起的。来自TRITC的信号也显示出相对弥散的荧光，所述荧光当内体破裂并释放包埋的葡聚糖时将产生。然而，当用非解体型D:G(13)/Cy5-mRNA复合物处理细胞时，Cy5和丹磺酰基荧光都为非常点状的并共定位(图5D，iii)。该荧光另外显示出与点状TRITC-葡聚糖4400的强烈重叠，这表明持续的内体包埋。总之，这些数据强烈表明CART 7的电荷改变行为是其对mRNA递送的优异性能的原因。
在另外的应用中评价了寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)D13:A11 7以探究CART用于mRNA递送的多功能性。在一组细胞系(包括通常被认为难以转染的那些细胞系)中测定通过CART 7递送后的eGFP mRNA表达。除了先前在HeLa中进行的优化实验之外，通过用由0.125μg/孔eGFP mRNA形成的CART复合物处理，将mRNA表达与Lipofectamine的mRNA表达在CHO、HEK-293、人肝细胞癌(HepG2)和鼠巨噬细胞J774细胞中进行比较(图11A)。在所有测试的细胞系中，使用CART D13:A117的转染效率>90％，而Lipofectamine仅诱导22％-55％。这表明该递送系统对于多种人和非人细胞系是通用的。不仅CART介导的递送在不同细胞系中是一致的，而且在不同长度的mRNA的情况下也是一致的，因为D13:A11(7)在萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA的递送中也是非常有效的，显著优于Lipofectamine(图11B)。类似于用eGFP mRNA观察到的趋势，尽管mRNA长度不同(1929相对于996nt)，10:1(+/-)比率导致最高水平的Fluc生物发光，这表明递送效率在很大程度上独立于mRNA长度。
生物发光成像(BLI)提供了定量活体动物中的mRNA递送、表达和生物分布的有力工具。为了评估CART-mRNA复合物在全身性和局部施用途径中的功效，我们使用BLI评价了CART复合的Fluc mRNA在麻醉的BALB/c小鼠中的静脉内和肌内注射。在每只小鼠中，将7.5μg mRNA与CART D13:A11 7复合，并且在75μL PBS中通过肌内注射施用到右大腿肌肉中。作为直接对照，将7.5ug的裸mRNA注射在相对侧腹中。全身性施用D-荧光素，并且在72小时内评价荧光素酶表达，从注射后一小时开始。当将mRNA用D13:A11递送时，在注射位点观察到高水平的荧光素酶活性(图11C、D)。该表达在4小时时到达峰值，并且在72小时后仍然可观察到。然而，在所有五只小鼠中，如通过光子通量所测量裸mRNA仅提供低水平的荧光素酶表达。
当以相同剂量通过静脉内尾静脉注射施用复合物时，我们在早至注射后一小时观察到稳健的腹部生物发光，在4小时处到达峰值并且表明我们的复合物将mRNA主要定位并递送至脾脏，也可在肝脏中检测到高水平的生物发光(图11E、F)。高水平的表达持续24小时，在48小时后具有可检测的生物发光。该表达主要定位于脾脏和肝脏中，平均总腹部光输出的23％源自前者并且70％来自后者。当在PBS中施用裸mRNA时，未观察到荧光素酶生物发光。在所有注射的小鼠中，在注射后未立即观察到毒性或在处理后数周未观察到毒性。
通过体内多种施用途径递送功能性mRNA的能力对于递送技术是至关重要的。局部肌内注射可以是许多疗法(包括疫苗接种)的优选施用途径，这是由于施用容易性和接近真皮和肌肉组织中的原初树突细胞和抗原呈递细胞的能力。通过尾静脉静脉内注射mRNA聚合复合物制剂对于全身性施用(其中特定靶标沿着网状内皮系统(诸如肝、淋巴结和脾)存在)或靶向实体瘤是广泛有用的。脾脏定位对于涉及免疫疗法的未来研究是特别令人兴奋的，这是由于在这些组织中高水平的树突状细胞和其他免疫细胞。肝脏定位可用于治疗肝脏疾病。
尽管使用mRNA的关键技术挑战仍然是安全、多功能化和有效递送方法的开发，但信使RNA治疗剂具有转变疾病治疗的潜力。我们已经开发出一种独特的可调且步骤经济的mRNA递送策略，所述策略通过前所未有的机制操作，以优异的效率有效地将mRNA递送至细胞和动物。我们的方法利用使用OROP和完全脱保护的两步法制备寡聚(碳酸酯-b-氨基酯)递送媒介物。在细胞内递送后，这些电荷改变材料经历值得注意的分子内重排，在此期间阳离子胺转化为中性酰胺以从其静电复合物释放阴离子mRNA并将核酸排出到细胞溶胶中以进行翻译。使用这些CART对mRNA递送的有效性代表了用于导致细胞和动物中的功能性蛋白质表达的mRNA递送的新策略。
某些实施方案
实施方案1
一种细胞穿透性复合物，其包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，所述阳离子两性聚合物包含pH敏感性解体结构域。
实施方案2
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物包含pH敏感性解体结构域和亲脂性聚合物结构域。
实施方案3
如实施方案2所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
R1-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2]z5
其中
R1为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案4
如实施方案3所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000691
其中
环A为取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
CART具有下式：-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2
其中，
R2为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案5
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中环A为取代或未取代的芳基。
实施方案6
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中环A为取代或未取代的苯基。
实施方案7
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中环A为取代或未取代的芳基。
实施方案8
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中环A为取代或未取代的苯基或萘基。
实施方案9
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000692
实施方案10
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000693
实施方案11
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000701
其中CART1、CART2和CART3独立地为如实施方案4中所定义的CART。
实施方案12
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中L1为–CH2-O-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基。
实施方案13
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中L1为–CH2-O-、
Figure BDA0003771948270000702
Figure BDA0003771948270000703
实施方案14
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中z5为1至3的整数。
实施方案15
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中z5为1或3。
实施方案16
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中z5为1。
实施方案17
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中z5为3。
实施方案18
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中R2为氢。
实施方案19
如实施方案3所述的细胞穿透性复合物，其中L2为键。
实施方案20
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000704
其中n为2或更大的整数。
实施方案21
如实施方案20所述的细胞穿透性复合物，其中n为在2-50范围内的整数。
实施方案22
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000705
其中
n为2或更大的整数；
n1为0至50的整数；
Z为所述亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案23
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000711
其中
n为2或更大的整数；
Z为所述亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案24
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000712
其中n为2或更大的整数。
实施方案25
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000713
其中n为2或更大的整数。
实施方案26
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000721
n为2或更大的整数；
n1为0至50的整数；
X1为键、-O-、-NR5-、-C(R5)(R6)-或-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为键、-O-、-C(R9)(R10)-或-C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案27
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中Z为-S-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案28
如实施方案23所述的细胞穿透性复合物，其中Z为-S-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案29
如实施方案4所述的细胞穿透性复合物，其中Z为
Figure BDA0003771948270000722
其中
X3为C(R15)或N；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案30
如实施方案23所述的细胞穿透性复合物，其中Z为
Figure BDA0003771948270000731
其中
X3为C(R15)或N；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案31
如实施方案29所述的细胞穿透性复合物，其中X5为-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案32
如实施方案2所述的细胞穿透性复合物，其中所述亲脂性聚合物结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000732
其中
n2为1至100的整数；
R20独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案33
如实施方案1所述的细胞穿透性复合物，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。
实施方案34
一种纳米颗粒组合物，其包含多种根据实施方案1的细胞穿透性复合物。
实施方案35
一种下式的阳离子两亲性聚合物：
R1-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2]z5
其中
R1为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
R2为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案36
如实施方案1所述的阳离子两亲性聚合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
Figure BDA0003771948270000741
其中
环A为取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
CART具有下式：-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2
其中，
R2为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案37
一种将核酸转染至细胞中的方法，所述方法包括使细胞与如实施方案1所述的复合物接触，所述复合物包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸。
实施方案38
如实施方案37所述的方法，其还包括使所述阳离子两亲性聚合物在所述细胞内降解，从而形成降解产物。
实施方案39
如实施方案38所述的方法，其中所述降解产物为取代或未取代的二酮哌嗪。
实施方案40
如实施方案37所述的方法，其中所述核酸包括选自由以下组成的组的一种或多种：信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。
实施方案41
如实施方案40所述的方法，其还包括使所述mRNA在所述细胞中表达。
实施方案42
如实施方案37所述的方法，其中一种或多种基因产物的表达是增加的。
实施方案43
如实施方案37所述的方法，其中一种或多种基因产物的表达是减少的。
实施方案44
如实施方案37所述的方法，其中所述细胞为真核细胞。
实施方案45
如实施方案37所述的方法，其中所述细胞为哺乳动物或人细胞。
实施方案46
如实施方案37所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
实施方案47
如实施方案46所述的方法，其中所述生物体为人。
实施方案48
如实施方案37所述的方法，其中所述方法在所述细胞中引起基因编辑。
实施方案49
如实施方案48所述的方法，其中所述核酸包含一种或多种载体，所述一种或多种载体包含：
a)第一核苷酸序列，其编码与所述细胞的基因组中的靶序列杂交的CRISPR-Cas系统指导RNA，以及
b)第二核苷酸序列，其编码Cas9蛋白，
其中所述(a)和(b)位于相同或不同的载体上。
实施方案50
如实施方案48所述的方法，其中所述核酸包括CRISPR RNA(crRNA)。
实施方案51
如实施方案50所述的方法，其中所述crRNA在与第一核苷酸序列相同的载体中。
实施方案52
如实施方案48所述的方法，其中所述核酸包括反式激活RNA(tracrRNA)。
实施方案53
如实施方案52所述的方法，其中所述tracrRNA在与所述第二核苷酸序列相同的载体中。
实施方案54
如实施方案48所述的方法，其中所述Cas9蛋白经密码子优化以在所述细胞中表达。
实施方案55
如实施方案48所述的方法，其中所述核酸包含：
a)第一核苷酸序列，其编码转座酶；以及
b)第二核苷酸序列，其包含侧接转座酶识别位点的目标基因的核酸序列，
其中所述(a)和(b)位于相同或不同的载体上。
实施方案56
如实施方案55所述的方法，其中所述转座酶识别并切除目标基因组序列。
实施方案57
如实施方案55所述的方法，其中所述目标基因的核酸序列被整合到所述细胞的基因组中。
实施方案58
如实施方案48所述的方法，其中所述基因编辑选自由以下组成的组：DNA缺失、基因破坏、DNA插入、DNA倒位、点突变、DNA替换、敲入和敲低。
实施方案59
如实施方案37所述的方法，其中所述方法引起干细胞的诱导。
实施方案60
一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的如实施方案1所述的复合物，所述复合物包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸。
实施方案61
如实施方案60所述的方法，其中所述疾病为传染性疾病。
实施方案62
如实施方案60所述的方法，其中所述疾病为癌症。
实施方案63
如实施方案60所述的方法，其中所述受试者先前被诊断患有所述疾病。
实施方案64
如实施方案60所述的方法，其中所述受试者不具有与所述疾病相关的可检测症状。
实施方案65
如实施方案60所述的方法，其中所述受试者为人。
实施方案66
如实施方案60所述的方法，其中如实施方案1所述的复合物被包括在包含药学上可接受的载体的药物组合物中。
实施方案67
如实施方案66所述的方法，其中所述药物组合物为癌症疫苗。
实施方案68
如实施方案67所述的方法，其中所述受试者未患有癌症并且所述癌症疫苗在所述受试者中诱导预防所述癌症发生的免疫应答。
实施方案69
如实施方案67所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有癌症并且所述癌症疫苗在所述受试者中诱导治疗所述癌症的免疫应答。
实施方案70
如实施方案60所述的方法，其中所述核酸为信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、指导RNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、反式激活RNA(tracrRNA)、质粒DNA(pDNA)、小环DNA、基因组DNA(gNDA)。
实施方案71
如实施方案60所述的方法，其中所述核酸转染到所述受试者中的一个或多个细胞中。
实施方案72
如实施方案71所述的方法，其中所述转染的核酸在所述受试者中提供抗癌活性。
实施方案73
如实施方案71所述的方法，其中所述核酸编码与癌症相关的一种或多种肽。
实施方案74
如实施方案72所述的方法，其中所述抗癌活性选自由以下组成的组：减少癌细胞数量、减小癌大小、杀伤癌细胞、减少和/或抑制转移以及减少癌细胞生长和/或增殖。
实施方案75
如实施方案66所述的方法，其中所述药学上可接受的载体包括免疫学佐剂。
实施方案76
如权利要求60所述的方法，其中所述方法还包括：
向所述受试者施用有效量的一种或多种药物组合物，所述另外的药物组合物包含抗癌剂和药学上可接受载体。
实施方案77
一种细胞穿透性复合物，其包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，所述阳离子两性聚合物包含pH敏感性解体结构域。
实施方案78
如实施方案77所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物包含pH敏感性解体结构域和亲脂性聚合物结构域。
实施方案79
如实施方案78所述的细胞穿透性复合物，其中所述阳离子两亲性聚合物具有下式：
H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)
其中，
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案80
如实施方案77至79中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000771
其中
n为2或更大的整数；
n1为0至50的整数；
Z为所述亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案81
如实施方案77至80中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000772
其中
n为2或更大的整数；
Z为所述亲核部分；
X1为键、-C(R5)(R6)-、-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-、-O-C(R5)(R6)-或-O-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为–O-或–S-；并且
R1.1、R1.2、R2.1、R2.2、R3、R4、R5、R6、R7和R8独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案82
如实施方案77至80中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000781
其中n为2或更大的整数。
实施方案83
如实施方案77至82中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000782
其中n为2或更大的整数。
实施方案84
如实施方案77至82中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000783
n为2或更大的整数；
n1为0至50的整数；
X1为键、-O-、-NR5-、-C(R5)(R6)-或-C(R5)(R6)-C(R7)(R8)-；
X2为键、-O-、-C(R9)(R10)-或-C(R9)(R10)-C(R11)(R12)-；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R1、R2、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案85
如实施方案77至80中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述pH敏感性解体结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000791
其中n为2或更大的整数。
实施方案86
如实施方案85所述的细胞穿透性复合物，其中n为在2-50范围内的整数。
实施方案87
如实施方案78或79所述的细胞穿透性复合物，其中Z为-S-、-S+R13-、-NR13-或-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案88
如实施方案78或79所述的细胞穿透性复合物，其中Z为
Figure BDA0003771948270000792
其中
X3为C(R15)或N；
X4为键、-C(O)-、-P(O)(OR16)2-、-S(O)(OR17)2-、-C(R16)(R17)-或-C(R16)(R17)-C(R18)(R19)-；
X5为亲核部分；并且
R13、R14、R15、R16、R17、R18和R19独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案89
如实施方案88所述的细胞穿透性复合物，其中X5为-N+(R13)(H)-，其中R13为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案90
如实施方案78-89中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述亲脂性聚合物结构域具有下式：
Figure BDA0003771948270000793
其中
n2是1至100的整数；
R20独立地为氢、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
实施方案91
如实施方案77至87中的一项所述的细胞穿透性复合物，其中所述核酸为mRNA、siRNA、pDNA、shRNA或gDNA。
实施方案92
一种纳米颗粒组合物，其包含多种根据实施方案77至91中的一项所述的细胞穿透性复合物。
实施方案93
一种下式的阳离子两亲性聚合物：
H-L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-H(I)
其中：
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
实施方案94
一种将核酸转染至细胞中的方法，所述方法包括使细胞与如实施方案77至90中的一项所述的复合物接触。
实施方案95
如实施方案94所述的方法，其还包括使所述阳离子两亲性聚合物在所述细胞内降解，从而形成降解产物。
实施方案96
如实施方案95所述的方法，其中所述降解产物为取代或未取代的二酮哌嗪。
实施方案97
如实施方案94至96中的一项所述的方法，其中所述核酸为mRNA。
实施方案98
如实施方案97所述的方法，其还包括使所述mRNA在所述细胞中表达。
实施方案99
如实施方案94至97中的一项所述的方法，其中所述细胞形成生物体的一部分。
实施方案100
如实施方案99所述的方法，其中所述生物体为人。

Claims (5)

1.一种细胞穿透性复合物，其包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸，所述阳离子两亲性聚合物包含pH敏感性解体结构域。
2.一种纳米颗粒组合物，其包含多种根据权利要求1的细胞穿透性复合物。
3.一种下式的阳离子两亲性聚合物：
R1A-[L1-[(LP1)z1-(IM)z2-(LP2)z3]z4-L2-R2A]z5
其中
R1A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
R2A为氢、卤素、-CCl3、-CBr3、-CF3、-CI3、CHCl2、-CHBr2、-CHF2、-CHI2、-CH2Cl、-CH2Br、-CH2F、-CH2I、-CN、-OH、-NH2、-COOH、-CONH2、-NO2、-SH、-SO3H、-SO4H、-SO2NH2、-NHNH2、-ONH2、-NHC(O)NHNH2、-NHC(O)NH2、-NHSO2H、-NHC(O)H、-NHC(O)OH、-NHOH、-OCCl3、-OCF3、-OCBr3、-OCI3、-OCHCl2、-OCHBr2、-OCHI2、-OCHF2、-OCH2Cl、-OCH2Br、-OCH2I、-OCH2F、取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
L1和L2独立地为键、-C(O)O-、-O-、-S-、-NH-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-S(O)2-、-S(O)NH-、-NHC(O)NH-、取代或未取代的亚烷基、取代或未取代的亚杂烷基、取代或未取代的亚环烷基、取代或未取代的亚杂环烷基、取代或未取代的亚芳基或取代或未取代的亚杂芳基；
LP1和LP2独立地为键或亲脂性聚合物结构域，其中LP1或LP2中的至少一个为亲脂性聚合物结构域；
IM为所述pH敏感性解体结构域；
z5为1至10的整数；
z1、z3和z4独立地为0至100的整数，其中z1或z3中的至少一个不为0；并且
z2为2至100的整数。
4.一种将核酸转染至细胞中的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求1所述的复合物接触，所述复合物包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸。
5.一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用有效量的如权利要求1所述的复合物，所述复合物包含与阳离子两亲性聚合物非共价结合的核酸。
CN202210904257.4A 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物 Pending CN115252807A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662367555P 2016-07-27 2016-07-27
US62/367,555 2016-07-27
PCT/US2017/044238 WO2018022930A1 (en) 2016-07-27 2017-07-27 Immolative cell-penetrating complexes for nucleic acid delivery
CN201780058858.5A CN109963564B (zh) 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780058858.5A Division CN109963564B (zh) 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115252807A true CN115252807A (zh) 2022-11-01

Family

ID=61011948

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210904257.4A Pending CN115252807A (zh) 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
CN201780058858.5A Active CN109963564B (zh) 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780058858.5A Active CN109963564B (zh) 2016-07-27 2017-07-27 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20180028688A1 (zh)
EP (1) EP3490562A4 (zh)
JP (3) JP7179715B2 (zh)
CN (2) CN115252807A (zh)
AU (3) AU2017302361C1 (zh)
CA (1) CA3031702A1 (zh)
WO (1) WO2018022930A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
EP3529347A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
KR20210125979A (ko) * 2018-11-09 2021-10-19 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 핵산 전달을 위한 혼성 희생 세포-침투 복합체
EP3917574A4 (en) * 2019-02-01 2022-11-02 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University IMMOLATIVE CELL-PENETRATING COMPLEXES FOR NUCLEIC ACID DELIVERY TO THE LUNG
BR112022002365A2 (pt) * 2019-08-09 2022-04-26 Nutcracker Therapeutics Inc Métodos e aparelhos para fabricar e para remover material de uma composição terapêutica
WO2022020810A1 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University A three component vaccine for covid-19
DE102021213746B3 (de) 2021-12-02 2023-02-09 BRANDENBURGISCHE TECHNISCHE UNIVERSITÄT COTTBUS-SENFTENBERG, Körperschaft des öffentlichen Rechts Vorrichtung, Verfahren und System zur Absorption von elektromagnetischer Strahlung, sowie Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung zur Absorption von elektromagnetischer Strahlung
WO2023172885A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Branched lipid charge-altering releasable transporters for nucleic acid delivery
WO2023178294A2 (en) * 2022-03-17 2023-09-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Compositions and methods for improved protein translation from recombinant circular rnas
WO2024073040A1 (en) 2022-09-29 2024-04-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University C-myc-targeting charge-altering releasable transporters as anti-tumor agents for breast cancer therapy
WO2024102797A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Charge-altering nucleic acid transporters with beta-amido carbonate backbones

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US6669951B2 (en) 1999-08-24 2003-12-30 Cellgate, Inc. Compositions and methods for enhancing drug delivery across and into epithelial tissues
US7256180B2 (en) * 2000-04-28 2007-08-14 Supratek Pharma Inc. Compositions and methods for inducing activation of dendritic cells
EP1461084A2 (en) * 2001-12-11 2004-09-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Guanidinium transport reagents and conjugates
FR2841260B1 (fr) * 2002-06-21 2004-10-22 Commissariat Energie Atomique Polynucleotides et polypeptides codes par lesdits polynucleotides impliques dans la synthese de derives des dicetopiperazines
EP2298829B1 (en) * 2005-05-31 2017-09-20 École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL) Triblock copolymers for cytoplasmic delivery of gene-based drugs
US20110081403A1 (en) * 2009-10-01 2011-04-07 Gradalis, Inc. Histone octamers for increased nucleic acid transfer
WO2013036532A1 (en) 2011-09-06 2013-03-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Amphipathic co-oligomers for the delivery of sirna
WO2014081299A1 (en) * 2012-11-22 2014-05-30 Tagworks Pharmaceuticals B.V. Activatable liposomes
WO2014093702A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Hiv therapeutics and methods of making and using same
RU2699523C2 (ru) * 2012-12-17 2019-09-05 Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж Рнк-направляемая инженерия генома человека
CN103088065B (zh) * 2013-01-25 2014-12-10 北京银杏德济生物技术有限公司 一种能够大规模并快速高纯度地诱导间充质干细胞转决定成造血干细胞的方法
CN106687585B (zh) * 2014-04-14 2021-11-02 美克斯细胞有限公司 用于修饰基因组dna的方法和组合物
US10654875B2 (en) 2015-11-12 2020-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell-penetrating, guanidinium-rich oligophosphotriesters for drug and probe delivery

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022246420B2 (en) 2024-02-15
AU2022246420A1 (en) 2022-11-03
AU2017302361C1 (en) 2022-10-20
JP2024045328A (ja) 2024-04-02
AU2017302361B2 (en) 2022-07-07
JP2019522028A (ja) 2019-08-08
JP7429280B2 (ja) 2024-02-07
CA3031702A1 (en) 2018-02-01
WO2018022930A1 (en) 2018-02-01
AU2017302361A1 (en) 2019-01-31
JP2023015306A (ja) 2023-01-31
EP3490562A1 (en) 2019-06-05
CN109963564A (zh) 2019-07-02
JP7179715B2 (ja) 2022-11-29
CN109963564B (zh) 2022-08-12
AU2024201370A1 (en) 2024-03-21
EP3490562A4 (en) 2020-04-22
US20180028688A1 (en) 2018-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109963564B (zh) 用于核酸递送的解体型细胞穿透性复合物
CN113811334B (zh) 用于将核酸递送至肺部的分解性细胞穿透复合物
WO2020028610A1 (en) 2H-PYRAZOLO[4,3-d]PYRIMIDINE COMPOUNDS AS TOLL-LIKE RECEPTOR 7 (TLR7) AGONISTS AND METHODS AND USES THEREFOR
CN113573740A (zh) 用于核酸递送的混合分解细胞穿透复合物
US20240148858A1 (en) A three component vaccine for covid-19
CN116490193A (zh) 多价sting激活组合物及其用途
Zhu et al. Protein-based delivery systems for RNA delivery
WO2023172885A1 (en) Branched lipid charge-altering releasable transporters for nucleic acid delivery
WO2023230201A1 (en) Small molecule conjugated charge-altering releasable transporters for nucleic acid delivery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination