JP2002524536A

JP2002524536A - 膨張性微粒子細胞内送達系

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Publication number: JP2002524536A
Application number: JP2000569847A
Authority: JP
Inventors: ロスマン，ジェームス，イー．
Original assignee: ロスマン，ジェームス，イー．
Priority date: 1998-09-17
Filing date: 1999-09-14
Publication date: 2002-08-06
Also published as: HUP0103841A3; US5952232A; AU771874B2; AU6044299A; WO2000015263A1; HUP0103841A2; EP1113820A1; CA2344441A1; IL141917A0

Abstract

(57)【要約】本発明は、凝縮相の状態のpH感応性ヒドロゲルより作製され、かつ細胞表面上のクラスリン被覆小孔を介する取込みに適したサイズと物理的特性を有する微粒子を利用して、化合物、最も好ましくはポリヌクレオチドを細胞の細胞質内へ送達するための方法および組成物に関する。ヒドロゲルが膨張するトリガーpHは細胞外環境の生理的pHよりも低いため、送達すべき化合物を含む微粒子は、細胞に取込まれるまでその圧縮サイズを維持することが可能であり、その結果、配合されている化合物が分解から保護されるという利点がさらに得られる。この保護特性は、ポリヌクレオチドまたはペプチドを送達すべき実施形態において特に有用である。クラスリン被覆小孔を介して取込まれた後、微粒子は細胞内エンドサイトーシス経路へ侵入して徐々にpHの低下を受ける。ヒドロゲルのトリガーpHに達すると、微粒子は水含有量を増して膨張し、該微粒子を含んでいる小胞を破裂させて、配合されている化合物を細胞質へ送り込む。本発明によれば、微粒子の膨張と薬剤放出は、外から化合物を添加したり、電場を印加したりする必要なく、元々備わっている機構によって実施することが可能である。さらに、ポリヌクレオチドを用いる実施形態に関しては、本発明は、細胞膜を通してポリヌクレオチドを細胞質へ送達する手段を提供する。従来慣用のトランスフェクション法では、細胞膜並びにエンドソームやリソソームに見られる細胞内膜が、侵入に対して強大な障害となっている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】１．はじめに本発明は、迅速に膨張し得るマトリックスと送達すべき化合物とを含んでなる
膨張性微粒子を利用して、化合物を細胞の細胞質内へ送達するための方法および
組成物に関する。本発明の系を使用して、ポリヌクレオチドまたはペプチド並び
に従来慣用の医薬化合物を送達することが可能である。本発明の膨張性微粒子を
遺伝子治療用途に用いれば、ウイルスベクターや従来慣用のトランスフェクショ
ン法に伴う多くの欠点が回避される。

【０００２】２．発明の背景 2.1 ポリヌクレオチドを細胞へ導入する現行の方法現代科学は、その目標のうち、全ヒトゲノムの配列決定に取り組んできた。こ
れは、得られた遺伝情報を生理学のさらなる解明に利用し、かつ疾患の治療の機
会を拡大することを意図してのことである。現在研究されている治療方法の１つ
は遺伝子治療技術であり、ポリヌクレオチドを細胞へ導入して治療効果を付与す
る(例えば、内在する遺伝子に欠陥がある場合に、遺伝子の機能的なコピーを供
給する)ものである。

【０００３】ポリヌクレオチドを細胞へ導入するには、いくつかの方法が慣用的に使用され
ており、例えば、リン酸カルシウム-DNA沈澱法、エレクトロポレーション、DEAE
-デキストラン・トランスフェクション、マイクロインジェクション、および「遺
伝子銃」の使用(オーストラリア国特許第9068389号を参照)等が挙げられる。ポリ
ヌクレオチドが効率よく取込まれなかったり、技術的な障害があることから、こ
れらの技術はそれぞれ問題を抱えている。

【０００４】ポリヌクレオチドの送達を改良しようとする試みでは、レトロウイルスベクタ
ー、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターといったウイル
スベクターが開発されている。しかしながら、これらの３種類のウイルスベクタ
ーには、それぞれ重大な欠点がある。レトロウイルスは活発に分裂している細胞
のみにポリヌクレオチドを挿入し、かつ挿入変異原として作用する可能性がある
。アデノウイルスベクターは、ベクターを宿主から排除する免疫反応を惹起する
ため、いずれの治療効果も一過性となってしまう。また、アデノ随伴ウイルスベ
クターは大量に生産することが困難である(Marshall, 1995, Science 269:1050-
1055; Paillard, 1998, Human Gene Therapy 9:1699-1700)。

【０００５】ウイルスベクターや従来慣用のトランスフェクション法に伴う欠点を回避する
ために、核酸を細胞へ導入する代替手段や組成物がいくつか考案されている。こ
のような代替案としては、ポリヌクレオチド-脂質複合体の凍結乾燥製剤(例えば
、国際特許出願第PCT96US7867号および同第PCT96US7866号を参照)、デンドリマ
ーポリカチオンに結合させたポリヌクレオチド(トランスフェクション効率を向
上させるため；米国特許第5,661,025号)、ポリヌクレオチドを標的細胞の細胞膜
を通して輸送するための膜透過剤を含んでなるポリヌクレオチド組成物(国際特
許出願第PCT93US3406号)、DNA縮合剤としてのポリリシンの使用(Wadhwaら, 1995
, Bioconjugate Chemistry 6:283-291；トランスフェリン等の輸送タンパク質へ
任意に結合させてもよい)、リポソーム(Ledleyら, 1987, J. Pediatrics 110:1)
またはプロテオリポソーム(Nicolauら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:1068)に封入したDNAが挙げられる。特異的な受容体／リガンド相互作用を利
用する受容体介在型遺伝子導入技術も開発されている(Wuら, 1988, J. Biol. Ch
em. 263:14621-14624; Christianoら, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 9
0:2122-2126; Huckettら, 1990, Biochem. Pharmacol. 40:253-263; Peralesら,
1994, Eur. J. Biochem. 226:255-266)。Felgnerによる米国特許第5,589,466号
では、DNAを間質腔へ導入することで、細胞への取込みを可能にしている。Truon
g-Leら, 1998, Human Gene Therapy 9:1709-1717には、200〜700nmのサイズ範囲
のDNA-ゼラチンマイクロスフェアによる制御遺伝子送達が報告されており、エン
ドソームの酸性化を妨害するクロロキンをマイクロスフェアへ配合することによ
って細胞のトランスフェクションを増強している。

【０００６】このような方法および組成物によって、ポリヌクレオチドの分解が回避され、
サイトゾルへの到達が可能となり、かつ細胞核に十分接近して効率のよい核への
取込みが生じるか否かは、まだ明らかにされていない。

【０００７】 2.2 クラスリン被覆小胞を介した取込みと輸送天然には、物質のインターナリゼーションに対して２つの主な機構が存在する
。即ち、比較的大型の粒子(直径＞0.5μm)を取込む食作用(文字どおり「細胞摂食
」)と、小型の粒子を小型の小胞(直径＜0.2μm)へ取込む飲作用(「細胞飲用」)であ
る(総説は、Mellman, 1996, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:575-625を参照さ
れたい)。飲作用による取込みは、典型的には、クラスリン被覆小孔と呼ばれる
細胞膜上の特定の部位で生じる(同著)。

【０００８】細胞外液と受容体結合リガンドの取込みは、現在クラスリン被覆小孔を介して
起こることが知られている。該小孔は、「エンドサイトーシス経路」と呼ばれる細
胞内小胞性オルガネラ系への侵入の入口として働くものである。エンドサイトー
シス経路は、細胞外空間にある化合物を細胞へ取込む機構として働くだけでなく
、受容体を再利用するための手段としても働く(受容体は、内部小胞中でそのリ
ガンドを放出した後、この経路を介して細胞表面へ戻ることが可能である)。個
々の受容体は、１時間当たり10回の割合で再利用されると推測されている(Stein
manら, 1983, J. Cell. Biol. 96:1-27)。このことから、クラスリンを介した取
込みとエンドサイトーシス経路が、細胞の代謝において重要かつ動的な役割を果
たしていることが判る。実際に、マクロファージや線維芽細胞といった細胞では
、１時間当たりその全表面積の200パーセント以上が取込まれると報告されてい
る(同著)。

【０００９】クラスリン被覆小孔は、一連の分子相互作用と構造変化(後述の小節で詳細に
説明する)によって、取込むべき物質(以下、「カーゴ(cargo)」という)を取り囲ん
で封入することにより、細胞膜からちぎれて細胞質へ侵入する封止カーゴ担持ク
ラスリン被覆小胞を生じる。このように取込まれた後速やかに、小胞はそのクラ
スリン被覆を失って初期エンドソームと融合する(Heleniusら, 1983, Trends Bi
ochem. Sci. 8:245-250)。初期エンドソームの主な役割は、「カーゴ」を、再利用
すべき分子(例えば、細胞表面へ送り返される受容体)または代謝すべき分子(リ
ソソーム中で代謝；Mellman, 1996, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:575-625)
へ分別することである。代謝すべき分子を含む小胞は核周囲の細胞質へ送られ、
後期エンドソームと融合する。次いで後期エンドソームはリソソームと融合し、
カーゴを酵素によって消化する。

【００１０】クラスリン被覆小胞から初期エンドソーム、後期エンドソームおよび最終的に
リソソームまでの経路は、小胞内pHの低下を特徴とする(Mellman, 1992, J. Exp
. Biol. 172:39-45)。このpHの低下は、小胞膜を通してプロトン伝導を促進する
V-ATPアーゼによって媒介される(Forgac, 1992, J. Exp. Biol. 172:155-169; N
elson, 1992, J. Exp. Biol. 172:149-153)。

【００１１】初期エンドソーム中では、pHは中程度の酸性(5.5〜6.3)であり、受容体に結合
したリガンドの放出に有利であるが、受容体に損傷を与えるほどではないため、
再利用が可能となる(Mellman, 1992, J. Exp. Biol. 172:39-45)。７未満のpHで
は、多くのリガンドがその受容体から解離することが観察されている(Maxfield
およびYamashiro, 1987, Adv. Exp. Med. Biol. 225:189-198)。６未満のpHでは
、鉄が二鉄(III)トランスフェリン(differic transferrin)から放出され(同著、
PrinciotoおよびZapolski, 1975, Nature 255:87; AisenおよびListowsky, 1980
, Annu. Rev. Biochem. 49:367)、上皮増殖因子受容体は大幅にコンフォメーシ
ョンを変化させてそのリガンドを放出する(MaxfieldおよびYamashiro,前出, DiP
aolaおよびMaxfield, 1984, J. Biol. Chem. 259:9163)。

【００１２】エンドサイトーシス経路に沿って進行するにつれ、小胞内環境がカーゴの分解
にさらに適したものとなる。後期エンドソームのpHは通常5.5未満であり、リソ
ソームのpHは4.6まで低下する場合がある(Mellman, 1992, J. Exp. Biol. 172:3
9-45; KornfeldおよびMellman, 1989, Annu. Rev. Cell Biol. 5:483-525)。さ
らに、酸加水分解酵素の含有量も増加する(同著)。分解すべきカーゴが受容体で
ある場合もあり、受容体ダウンレギュレーションの１つの機構は、リソソームに
おけるリガンド-受容体複合体の破壊である(IgGに結合したFc受容体に対して観
察される；MellmanおよびPlutner, 1984, J. Cell. Biol. 98:1170-1176; Mellm
anおよびUkkonen, 1984, J. Cell Biol. 98:1163-1169; Ukonnenら, 1986, J. E
xp. Med. 163:952-971)。

【００１３】分子の取込みと受容体の再利用における役割だけでなく、エンドサイトーシス
経路は、ジフテリア毒素や各種ウイルス(インフルエンザウイルスおよびセムリ
キ森林熱ウイルス等)といった特定の病原因子にも利用されている(Maxfieldおよ
びYamashiro, 1987, Adv. Exp. Med. Biol. 225:189-198; OlsnesおよびSandvig
, 1983, "Receptor-mediated Endocytosis: Receptors and Recognition", Cuat
recasaおよびRoth編, Chapman & Hall, London, 187〜236頁; KlielianおよびHe
lenius, 1985, J. Cell Biol. 101:2284; Whiteら, 1980, J. Cell Biol. 87:26
4; Marshら, 1983, Cell 32:931)。酸性のpHでは、場合によっては毒素またはウ
イルスのコートタンパク質がコンフォメーション変化を受けることで、小胞外へ
の脱出とサイトゾルへの侵入が可能となる。

【００１４】エンドサイトーシス経路への侵入および通過は、細胞内容積のかなり割合を必
要とする迅速な過程である。液相マーカーである西洋ワサビペルオキシダーゼ(「
HRP」)の経過を追ったところ、胎児ハムスターの腎細胞をHRPに曝露した直後の２
分間では、標識された構造の容積密度が急激に上昇し、続く13〜18分間では、細
胞質容積の約0.65％を占めるプラトーレベルにて一定になることが判明した(Gri
ffithsら, 1989, J. Cell Biol. 109:2703-2720)。続いて、容積密度は再度急激
に上昇し(HRPがリソソーム区画に到達するため)、標識後30〜60分の間に２度目
のプラトーに達して細胞質容積の3.5％を占めた(同著)。

【００１５】 2.3 クラスリン被覆小胞形成の分子的見地細胞膜からのクラスリン被覆小胞の形成にはいくつかの分子が関与しており、
例えば、クラスリン以外にも、AP2(「アダプタータンパク質」または「集合タンパ
ク質」の略)およびダイナミンが挙げられる(総説は、Schmid, 1997, Annu. Rev.
Biochem. 66:511-548を参照されたい)。AP2は、結合するとクラスリン格子の集
合を引き起こす(同著)。GTPアーゼであるダイナミンは構造変化を促進し、細胞
膜からのクラスリン被覆小胞の封止と出芽をもたらす(同著)。

【００１６】クラスリンは、３本の192kDa重鎖からなるタンパク質複合体であり、各重鎖は
、分子量が約30kDaの２本の異なる軽鎖のいずれかと結合している。この複合体
は、３本の足を有する外観をしているため「トリスケリオン」と呼ばれる(Kirchha
usenら, 1986, J. Ultrastructur. Mol. Struct. Res. 94:199-208; Ungewickel
landおよびBranton, 1981, Nature 289:420-422)。溶液の状態では、クラスリン
・トリスケリオンは自己集合して「ケージ」と呼ばれる閉鎖型の多面体構造を形成
する(Crowtherら, 1976, J. Mol. Biol. 103:785-798; Woodward, 1978, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:4394-4398)。細胞膜では、クラスリンの多面体集
合体によって被覆小孔が形成され、細胞外環境からカーゴが包み込まれるにつれ
て該小孔の曲率がきつくなる。陥入に必要なクラスリン小孔の形状変化は、通常
は六角形に配列しているトリスケリオンが五角形配置をとることと関連している
と考えられる(Schmid, 1997, Annu. Rev. Biochem. 66:511-548)。

【００１７】 AP2は、クラスリンが膜へ結合する際に重要な役割を果たすものであり、クラ
スリンとの結合部位を供給するために、まず膜表面へ動員される(Mellman, 1996
, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:575-625; Changら, 1993, EMBO J. 12:2169-
2180; Peelerら, 1993, J. Cell. Biol. 120:47-54; Robinson, 1994, Curr. Op
in. Cell Biol. 6:538-544; Traubら, 1995, J. Biol. Chem. 270:4933-4942)。
さらにAP2は、クラスリン被覆小胞のカーゴとなる予定の分子(例えば、受容体)
に含まれる様々な分子局在化シグナルを利用して、取込みに必要な膜タンパク質
を動員する。このようなシグナルのいくつかは特性決定されている(Mellman, 19
96, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:575-625)。広く規定されたペプチド共通配
列には、嵩高な疎水性側鎖を有する１つ以上のアミノ酸の近くに芳香族(通常は
チロシン)残基が含まれていてもよく(Trowbridgeら, 1993, Annu. Rev. Cell Bi
ol. 9:129-161)、また、隣接してロイシン残基(またはロイシンと他の小型疎水
性アミノ酸)が含まれていてもよい。後者は白血球で発現される受容体でよく見
られる(Matterら, 1994, J. Cell. Biol. 126:991-1004; HunzikerおよびFumey,
1994, EMBO J. 13:2963-2967)。

【００１８】その役割はまだ完全には解明されていないものの、ダイナミンは、GDPに結合
した状態では、陥入した被覆小孔のクラスリン格子と相互作用し、その際GTPの
結合によってダイナミンの再分配が引き起こされて細胞膜にくびれが生じ、それ
により出芽過程が開始されると考えられる。次いでGTPの加水分解によってさら
にくびれて、封止クラスリン被覆小胞が細胞質中へ放出される。クラスリン被覆
小胞の直径は約80〜100nm(0.08〜0.1μm)である(Griffithsら, 1989, J. Cell B
iol. 109:2703-2720)。

【００１９】 2.4 pH感応性ヒドロゲルヒドロゲルは、かなりの量の(通常は20％を超える)水を含む３次元のポリマー
網状構造体(即ち、マトリックス)である(BrondstedおよびKopecek, 1992, "Poly
electrolyte Gels", American Chemical Society, Washington, D.C., 285〜304
頁; WichterleおよびLim, 1960, Nature 185:117)。水含有量が高いため、ヒド
ロゲルは生体系に適合する傾向があり、それゆえ組織インプラント、ソフトコン
タクトレンズ、およびドラッグデリバリーシステム等の各種医療用途に使用され
ている(Mackら, 1987, "Hydrogels in Medicine and Pharmacy", Peppas編, CRC
Press, Boca Raton, Fla.,第３巻,65〜93頁)。

【００２０】高分子ヒドロゲルは、凝縮(収縮などとも表現される)および膨張(膨潤または
圧縮解除とも表現される)の２つの異なる相の状態で存在することができる。こ
れらの相の間では、ポリマーの性質や他の様々な要因(例えば、温度、溶媒組成
、pH、イオン組成、電場、および光)に応じて、連続的に(徐々に)または不連続
的に(急激に)容積が変化する。ヒドロゲルは、膨張時には水を吸収する。

【００２１】ゲルの相転移は近年特に関心を集めており、必要に応じて膨張または収縮して
様々な目的(例えば、高吸水性のオムツ、薬剤送達の促進、筋肉収縮の模倣)を果
たすゲルが開発されている(例えば、Tanaka, 1992, "Polyelectrolyte Gels",
American Chemical Society, Washington, D.C., 1〜21頁を参照)。不連続な相
転移のため、ゲル容積は千倍またはそれ以上変化する可能性もある。

【００２２】不連続な相転移は、ゲルを構成するポリマー成分間の引力(凝縮)相互作用と斥
力(膨張)相互作用との均衡が崩れることで発生する。このような相互作用は、イ
オン性、親水性／疎水性、ファンデルワールス力、または水素結合性のものであ
ってよい(同著)。ポリマー中の成分間の静電的(イオン性)相互作用は、ゲルを膨
張または凝縮させる特に強力な力として作用することが可能である。例えば、非
荷電の成分(例えば、-NH₂)を有するゲルが、このような成分が等しく荷電(例え
ば、-NH₃ ⁺)するような条件下(例えば、酸性pH下)に置かれると、その後に生じる
静電的斥力相互作用は内部圧力のように作用し、同一荷電間の距離を増加させる
ためにゲルが急速に膨張する。pH変化に応答して相転移するヒドロゲルは、典型
的には、カルボン酸や第一級アミン等の酸性もしくは塩基性のペンダント状基、
またはスルホン酸や第四級アンモニウム塩等の強酸および強塩基を含むものであ
り、そのためpHの増減に伴ってイオン化状態が変化する(BrondstedおよびKopece
k, 1992, "Polyelectrolyte Gels", American Chemical Society, Washington,
D.C., 285〜304頁; Kopecekら, 1971, J. Polym. Sci. 9:2801)。

【００２３】薬剤送達の目的で使用する場合には、ヒドロゲルはゲルの内外へ、親水性の低
分子量薬剤の場合には「細孔機構」によって、疎水性の強い化合物の場合には「分
配機構」によって薬剤を拡散させると考えられる。凍結乾燥させたポリアクリロ
ニトリルに対する各種化合物(分子量70,000Daまで)の透過性が観察されている(D
abrovskaら, 1978, J. Biomed. Mater. Res. 12:591)。pHに依存する透過性に対
しては架橋度が重要であることが分かっている(Weissら, 1986, AIChE Symposiu
m Series 82:85)。pH感応性ヒドロゲルへ疎水性基を付加することにより、相転
移に必要なpH変化が大きくなる可能性も観察されている(凝縮相の安定化による
；Philippovaら, 1997, Macromolecules 30:8278-8285)。

【００２４】最近、Kiserら(1998, Nature 394:459-462)は、天然の分泌顆粒を模倣した合
成顆粒を、抗癌剤である塩酸ドキソルビシンを含むpH感応性かつイオン感応性の
ポリマーから作製したマイクロスフェアの形状で製造し、脂質二重層被覆を用い
ることで該マイクロスフェアをpH変化から保護している(FernandezおよびKnudso
nによる米国特許第5,654,006号)。粒子をエレクトロポレーション場へ置くこと
により、脂質二重層を破壊して薬剤を放出させることが可能である(Siegel, 199
8 , Nature 394:427-428も参照されたい)。

【００２５】３．発明の概要本発明は、凝縮相の状態のpH感応性ヒドロゲルより作製され、かつ細胞表面上
のクラスリン被覆小孔を介する取込みに適したサイズと物理的特性を有する微粒
子を利用して、化合物、最も好ましくはポリヌクレオチドを細胞の細胞質内へ送
達するための方法および組成物に関する。ヒドロゲルが膨張するトリガーpHは細
胞外環境の生理的pHよりも低いため、送達すべき化合物を含む微粒子は、細胞に
取込まれるまでその圧縮サイズを維持することが可能であり、その結果、配合さ
れている化合物が分解から保護されるという利点がさらに得られる。この保護特
性は、ポリヌクレオチドまたはペプチドを送達すべき実施形態において特に有用
である。

【００２６】クラスリン被覆小孔を介して取込まれた後、微粒子は細胞内エンドサイトーシ
ス経路へ侵入して徐々にpHの低下を受ける。ヒドロゲルのトリガーpHに達すると
、微粒子は水含有量を増して膨張し、該微粒子を含んでいる小胞を破裂させて、
配合されている化合物を細胞質へ送り込む。

【００２７】本発明によれば、微粒子の膨張と薬剤放出は、外から化合物を添加したり、電
場を印加したりする必要なく、元々備わっている機構によって実施することが可
能である。さらに、ポリヌクレオチドを用いる実施形態に関しては、本発明は、
細胞膜を通してポリヌクレオチドを細胞質へ送達する手段を提供する。従来慣用
のトランスフェクション法では、細胞膜並びにエンドソームやリソソームに見ら
れる細胞内膜は、侵入に対して強大な障害となっている。

【００２８】４．発明の説明本発明は、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなり、かつ細胞内部へ送達
すべき化合物を含有する微粒子を提供する。該微粒子は、凝縮状態で、細胞表面
上のクラスリン被覆小孔を介して取込まれるサイズをしており、ヒドロゲルは７
未満のpHで膨張する。

【００２９】本発明は、化合物を含有する微粒子を細胞のエンドサイトーシス経路へ導入す
ることを含んでなる、化合物を細胞内部へ送達する方法を提供する。該微粒子は
、エンドサイトーシス経路へ導入されるまで凝縮状態であるが、エンドサイトー
シス経路内では膨張状態となるpH感応性ヒドロゲルを含んでなるものであり、こ
れにより該化合物が細胞内部へ送達される。

【００３０】本明細書中で使用する「凝縮状態」という用語は、pH感応性ゲルが目的とする標
的細胞のクラスリン被覆小孔と遭遇する際のゲルの状態をいう。pH感応性ゲルの
「膨張状態」は、pH感応性ゲルがエンドサイトーシス経路に侵入し、該環境下で最
大限に膨張した際のゲルの状態のことである。このような定義を行うことにより
、本発明に従って使用した場合の微粒子のサイズが明確になるが、このような微
粒子は、他の条件下では、さらに凝縮または膨張することも可能であることを理
解されたい。微粒子が「凝縮状態」の定義よりもさらに凝縮する場合には(例えば
、アルカリ性pH下、凍結乾燥、または特定の溶媒中)、「超凝縮状態」にあるとい
う。逆に、微粒子が「膨張状態」の定義よりもさらに膨張する場合には(例えば、
強酸系中、高温下、または特定の溶媒中)、「超膨張状態」にあるという。

【００３１】微粒子のサイズは、凝縮状態で、クラスリン被覆小孔を介してエンドサイトー
シス経路へ取込まれる大きさである。限定するわけではないが、具体的には、本
発明の微粒子の直径は50〜150nm(0.05〜0.15μm)、好ましくは50〜100nm(0.05〜
0.1μm)、より好ましくは50〜70nm(0.05〜0.07μm)である(特に断わらない限り
、本明細書に記載の数値範囲は全てその両端値を含むものとする)。微粒子のバ
ッチには、サイズが若干異なる微粒子が存在する可能性があるため、クラスリン
被覆小孔の直径を超える可能性のある微粒子を一部含む一定範囲のサイズを有す
る微粒子を含んでなる組成物を使用するものとする。

【００３２】微粒子は、細胞へ取込まれた後の膨張状態では、該微粒子を含んでいる小胞を
破裂させるのに十分なサイズを有するものでなければならないが、細胞の構造ま
たは機能を損なうほど大きなものであってはならない。この点については、初期
エンドソームの直径が約100〜400nm(0.1〜0.4μm)であり、大型の後期エンドソ
ームとリソソームの直径が最大約3000nm(３μm)であり、細胞の直径が約10,000n
m〜50,000nm程度(10〜50μm；但し、細胞の種類ごとに大きく変わる)である点に
注意すべきである。本発明は、微粒子の膨張に関わるものであれば、小胞を破裂
させる特定の物理的機構に限定されるものではない。例えば、膨張した微粒子の
容積が小胞の容積を超えることで破裂が生じるものであってもよいし、微粒子の
膨張によって小胞膜の構造に欠陥を生じさせて小胞を破裂させるものであっても
よい。限定するわけではないが、微粒子を含んでいる小胞の膜内面へ微粒子が付
着し、微粒子が膨張するにつれて膜が破れていくといった例も挙げられる。

【００３３】従って、限定するわけではないが、本発明では、例えば、膨張状態における微
粒子の直径は、膨張が初期エンドソーム内で生じる場合には好ましくは凝縮状態
の直径の５〜10倍であり、膨張が後期エンドソームまたはリソソーム内で生じる
場合には好ましくは10〜100倍である。本発明はさらに、100倍を超える膨張も意
図しているが、このような膨張は化合物の送達対象である細胞を破壊するもので
はない。

【００３４】開示を明瞭にするため、本説明をさらに以下の小節に分けて説明するが、限定
を意図したものではない： (i)pH感応性ヒドロゲル (ii)微粒子の調製 (iii)膨張性微粒子の用途

【００３５】 4.1 pH感応性ヒドロゲル本発明の微粒子は、膨張性マトリックスと、細胞内部(即ち、細胞の外側細胞
膜で区切られた境界の内側)へ送達すべき化合物から構成され、該化合物はマト
リックス中に均一または不均一に分散されている。

【００３６】微粒子用のマトリックスとして使用し得るヒドロゲルは、７未満のpHでは膨張
状態となるものである。エンドサイトーシス経路内で該微粒子を含んでいる小胞
を破裂させるのに十分な膨張が生じるpHを「トリガーpH」と呼ぶ。好ましくは、細
胞内での膨張に伴うヒドロゲルの相転移は不連続であり、この場合、転移が起こ
るpHを「臨界pH」と呼ぶ(従って、「臨界pH」は「トリガーpH」の特定種である)。本発
明の微粒子の使用目的に応じて、ヒドロゲルの膨張が望まれる細胞内位置にある
小胞のpHとトリガーpHとが一致するようにヒドロゲルを選択することが可能であ
る。限定するわけではないが、例えば、初期エンドソームにおける膨張が望まし
い場合には、トリガーpHが5.5〜6.3の範囲のヒドロゲルを使用すればよく、後期
エンドソームにおける膨張が望ましい場合には、トリガーpHが5.0〜5.5の範囲の
ヒドロゲルを選択すればよく、リソソームにおける膨張が望ましい場合には、ト
リガーpHは5.0以下であればよい。ポリヌクレオチドの送達が望まれる場合には
、後期エンドソームとリソソームが細胞核のより近傍に位置するため、エンドサ
イトーシス経路の比較的後期で膨張させるのが有利である。

【００３７】本発明に従って使用し得るpH感応性ヒドロゲルは、１以上のイオン性成分また
はイオン化しうる成分をポリマー主鎖および／または架橋部に含むものである(
総説は、BrondstedおよびKopecek, 1992, "Polyelectrolyte Gels", American C
hemical Society, Washington, D.C. 285〜304頁を参照されたい)。優勢なイオ
ン性またはイオン化しうる成分は塩基性であり(即ち、酸性pHで正に荷電する)、
これは、正に荷電したイオン間の静電反発によってマトリックスを膨張させるた
めである。限定するわけではないが、このような塩基性成分の例はアミンであり
、例えば、-NH₂、-N(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂、ビニルピリジン、イミダゾールもし
くはイミダゾール誘導体含有成分、および-N(CH₃)₃ ⁺等が挙げられるが、ほんの
一例に過ぎない。しかしながら、ある実施形態では酸性成分が存在してもよいが
、好ましくは、所定の酸性pHで優勢な荷電成分となるものであってはならない。
酸性成分と塩基性成分が両方とも存在するヒドロゲルは、高分子電解質ヒドロゲ
ルと呼ばれる。限定するわけではないが、送達すべき化合物が負に荷電する傾向
があるポリヌクレオチドである本発明の実施形態の１つでは、微粒子マトリック
スとして高分子電解質ヒドロゲルを使用するのが有利である。その理由は、微粒
子が膨張した後、pHが比較的中性であるサイトゾル中に置かれると、負に荷電し
た酸性成分によってポリヌクレオチドが粒子から放出され易くなるためである。
ヒドロゲルと送達すべき他の任意の化合物との適合性については、化合物を効率
的に保持および放出するために、静電的相互作用だけでなく、ファンデルワール
ス力、親水性／疎水性相互作用、および水素結合に対しても同様の考察を適用し
得る。

【００３８】本発明の微粒子においてマトリックスとして使用するpH感応性ヒドロゲルは、
適切なトリガーpHと送達すべき薬剤に適合した物理化学的プロフィールを有する
だけでなく、膨潤して膨張状態となった際に上述のサイズに関する規定に合致す
る大きさを有するものでなければならない。さらに、微粒子が細胞内で膨張状態
となって該微粒子を含んでいる小胞が破裂したら、微粒子に配合されている化合
物が放出され易くなるよう微粒子が膨張時よりもゆっくりと凝縮するのが好まし
い(「ヒステリシス」と呼ばれる現象)。中程度の酸性pHで膨潤する高分子電解質ゲ
ルに関しては、単にpHを変えるだけでは、このようなゲルを完全に解膨潤させて
ほぼ乾燥状態へ戻すことは不可能であったことが報告されており(Seigel, 1993,
Adv. Polymer Sci. 109:233-267)、細胞質における膨張微粒子の解膨潤が、化
合物の送達を実質的に妨害するとは考えられないことが明らかである。

【００３９】イオン性成分またはイオン化しうる成分を含むpH感応性ヒドロゲルの膨潤を左
右する要因としては、(i)該成分の荷電(Kopecekら, 1971, J. Polym. Sci. 9:28
01; Vacikら, 1975, J. Appl. Polym. Sci. 19:3029)、該成分のpKa(Brannon-Pe
ppasおよびPeppas, 1991, Chem. Eng. Sci. 46:715)、イオン化度、イオン化し
うる成分の濃度、架橋密度(Kouら, 1988, Pharm. Res. 5:592)、およびポリマー
主鎖の親水性／疎水性が挙げられる。膨潤を左右すると考えられるエンドサイト
ーシス経路内の要因としては、pH(SiegelおよびFirestone, 1988, Macromolecul
es 21:3254)、イオン強度、および対イオンの有無と原子価(Siegelら, 1991, Po
lym. Prep. 31:231; Siegel, 1990, "Pulsed and Self-regulated Drug Deliver
y", Kost編, CRC Press, Boca Raton, Fla. 129〜157頁)が挙げられる。本発明
のヒドロゲルにおける不連続な相転移は、イオン組成を変えることで誘導するこ
とが可能である(OhmineおよびTanaka, 1982, J. Chem. Phys. 77:5725; Shibaya
maおよびTanaka, 1993, Adv. Polym. Sci. 109:1-61)。

【００４０】他の全てのパラメータは意図した微粒子製剤に適合しているものの、ヒドロゲ
ルのトリガーpHが望ましいpHよりも高いことが判明した場合には、疎水性の繰返
し単位をヒドロゲルへ組込んで低pHで膨張するようにすればよい(Philippovaら,
1997, Macromolecules 30:8278-8285)。

【００４１】限定するわけではないが、本発明の特定の実施形態では、微粒子の調製に使用
するpH感応性ヒドロゲルは、以下の塩基性モノマー単位をポリマー中に含んでい
てもよい：アミノエチルメタクリレート、N,N-ジメチルアミノエチルメタクリレ
ート(SiegelおよびFirestone, 1988, Macromolecules 21:3254; Siegel, 1990,
"Pulsed and Self-regulated Drug Delivery", Kost編, CRC Press, Boca Raton
, Fla., 129〜157頁)、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート(Kopecekら, 1
971, J. Polym. Sci. 9:2801; VacikおよびKopecek, 1975, J. Appl. Polym. Sc
i. 19:3029; Ishiharaら, 1984, Polymer J. 8:625)、イミダゾール含有成分、
イミダゾール誘導体含有成分、ビニルピリジン、および塩化ビニルベンジルトリ
メチルアンモニウム(Michaelsら, 1961, J. Phys. Chem. 65:1765; Michaels, 1
965, Ind. Eng. Chem. 57:32)。

【００４２】限定するわけではないが、本発明のさらなる特定の実施形態では、微粒子の調
製に使用するpH感応性ヒドロゲルは、以下の酸性モノマー単位をポリマー中に含
んでいてもよい：アクリル酸またはメタクリル酸(RickaおよびTanaka, 1984, Ma
cromolecules 17:2916; Kopecekら, 1971, J. Polym. Sci. 9:2801; Kouら, 198
8, Pharm. Res. 5:592; VacikおよびKopecek, 1975, J. Appl. Polym. Sci. 19:
3029)、アルキルメタクリレートエステル、特にメチルメタクリレートエステル(
SiegelおよびFirestone, 1988, Macromolecules 21:3254-3259)、スチレンスル
ホン酸ナトリウム(Michaelsら, 1961, J. Phys. Chem. 65:1765; Michaels, 196
5, Ind. Eng. Chem. 57:32)、およびスルホキシエチルメタクリレート(Kudelaら
, 1980, J. Membrane Sci. 6:123)。

【００４３】限定するわけではないが、本発明のさらに別の特定の実施形態では、微粒子の
調製に使用するpH感応性ヒドロゲルは、アニオン性ポリマーとカチオン性ポリマ
ーから形成される高分子電解質複合体を含んでいてもよく、７未満のpHではカチ
オンが優勢なイオン種となるものであり、ポリマーの組としては以下のものが挙
げられる：ポリ(塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)とポリ(スチレン
スルホン酸)ナトリウム(RatnerおよびHoffman, 1976, "Hydrogels for Medical
and Related Applications", Andrade編, ACS Symposium Series 31, American
Chemical Society, Washington, D.C., 1〜36頁)、並びにn-アルキルメタクリレ
ートエステルと(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートに基づくコポリマー(Sie
gelおよびFirestone, 1988, Macromolecules 21:3254-3259)。

【００４４】本発明のさらに別の実施形態では、ヒドロゲルは膨張状態で溶解するものであ
ってもよい。水溶性アクリルポリマーがHunkelerおよびHamielec, 1992, "Polye
lectrolyte Gels", American Chemical Society, Washington, D.C., 24〜41頁
に記載されており、溶解性ヒドロゲルに関する他の参考文献としては、Hill-Wes
tら, 1994, Fertility and Sterility 62:630-634、およびMurphyら, 1992, Bio
materials 13:979-990が挙げられる。水溶性ゲルは共有結合による架橋を含んで
いなくてもよい。非架橋ヒドロゲルに関する参考文献としては、Gormanら, 1998
, J. Biomed. Mat. Res. 39:642-649; NarayaniおよびRao, 1996, Int. J. Phar
maceutics 138:121-124; Carelliら, 1993, Int. J. Pharmaceutics 94:103-113
;並びにKrohnおよびBreitfeller, 1976, Invest. Ophthalmol. 15:324-327が挙
げられる。場合によっては、溶解性を持たせることで、望ましくは送達すべき化
合物の放出を容易にすることが可能である。

【００４５】限定するわけではないが、本発明の好適な特定の実施形態の１つでは、微粒子
の調製に使用するpH感応性ヒドロゲルは、SiegelおよびFirestone, 1988, Macro
molecules 21:3254-3259並びにSiegel, 1993, Adv. Polymer Sci. 109:233-267
に記載されているような、n-メチルメタクリレートエステルと(ジメチルアミノ)
エチルメタクリレートをコモノマー比70:30で含む、わずかに架橋した高分子電
解質コポリマーである。

【００４６】 4.2 微粒子の調製本発明の微粒子は、まずpH感応性ヒドロゲル微粒子を形成し、次いで送達すべ
き化合物を配合することで、あるいは、ヒドロゲルの重合を行う系へ化合物を添
加することにより化合物を微粒子の形成と同時に配合することで調製可能である
。

【００４７】 pH感応性ヒドロゲル微粒子は、得られる微粒子が凝縮状態で、上述したクラス
リン被覆小孔を介した取込みに適した大きさを有するのであれば、当該技術分野
で公知の任意の方法で形成することができる。

【００４８】限定するわけではないが、「沈澱重合」と呼ばれる微粒子調製技術の１つの例で
は、成分モノマーを、生成物であるポリマーに対しては不溶性の溶媒に溶解し、
次いで、激しく混合を行う条件下で、溶解したモノマーを重合開始因子(化学化
合物もしくは光等の物理的因子のいずれであってもよい)へ曝露する。ポリマー
が不溶性である点と、溶液を攪拌することとを組み合わせることで、微粒子が形
成される。この技術を用いれば、反応を続ける時間の長さと架橋の量によって、
生成する微粒子のサイズを制御することが可能である(Kashiwabaraら, 1995, Co
lloid Polymer Science 273:339-345;Fernandezによる米国特許第5,654,006号;K
awaguchiら, 1991, Polymer J. 23:955-962; Kawaguchiら, 1993, Polym. Inter
nl. 30:225-236)。

【００４９】「乳化重合」と呼ばれる技術で微粒子を調製する別の方法では、乳化剤のミセル
を含む連続水相中にモノマーを溶解し、過剰の遊離モノマーを大型の懸濁液滴に
蓄積させる。系を開始因子へ曝露すると、ミセル領域内で重合が起こる(Kreuter
, 1992, "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy", CRC
Press, Boca Raton, Fla.; HunkalerおよびHamielec, 1992, "Polyelectrolyte
Gels", American Chemical Society, Washington, D.C., 24〜41頁)。「連続有機
相中での乳化重合」と呼ばれる関連技術では、重合が水相液滴中で開始されるよ
うな条件下で、水溶性モノマーを界面活性剤で安定化させた油中水型エマルジョ
ンへ添加する(Kreuter, 1992, "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine
and Pharmacy", CRC Press, Boca Raton, Fla.)。

【００５０】微粒子形成に続いて送達すべき化合物を配合する場合には、該化合物を含む溶
液にヒドロゲル微粒子を曝露し、化合物をゲルマトリックス中へ拡散させてもよ
い。化合物の配合には、化合物を高濃度にし、微粒子が膨潤する溶液pHを用いる
のが有利である。限定するわけではないが、具体的には、配合すべき化合物を含
むpHが５〜６のポリヌクレオチド水溶液中にヒドロゲル微粒子を置いてもよい。
望ましい量の化合物が微粒子に取込まれたら、溶液のpHを上げてヒドロゲルを凝
縮させ、微粒子のサイズを小さくすればよい。

【００５１】本発明の微粒子へ配合し得る化合物としては、細胞質へ送達するのが望ましく
、かつ、本明細書中に記載するように、ヒドロゲル微粒子中に保持され、また該
微粒子から放出可能な分子サイズと化学特性を有する化合物が挙げられる。例え
ば、本発明を使用して、極めて親水性が高いために膜透過性が制限された化合物
を送達することが可能である。限定するわけではないが、本発明の特定の実施形
態では、化合物はポリヌクレオチドである。さらに、本発明の微粒子を使用して
、通常は特異的な受容体を介して細胞へ侵入する因子(例えば、ペプチド)を送達
することが可能であり、これにより受容体の位置と飽和に関する制限が回避され
る。本発明のさらに別の実施形態では、送達すべき化合物は免疫原性ペプチド、
タンパク質またはアジュバントであってもよい。

【００５２】送達すべき化合物を１種以上、本発明の微粒子へ配合することが可能である。

【００５３】本発明に従って送達し得るポリヌクレオチドは、DNAまたはRNA分子であってよ
く、一本鎖または二本鎖のいずれでもよい。ポリヌクレオチドのサイズは、微粒
子から効率よく放出されるためには好ましくは50キロベース(50kb)未満であるが
、本発明はこれだけに限定されない。ポリヌクレオチドは化学合成または組換え
技術によって調製することが可能であり、また、天然の供給源から回収した核酸
から調製してもよい。ポリヌクレオチドは、細胞中での産生が望まれるRNAまた
はタンパク質をコードするものでもよく、リボザイム活性を有するものでもよく
、アンチセンスとして作用するものでもよく、および／または細胞中のタンパク
質因子に結合するものでもよい。従ってポリヌクレオチドは、プロモーターエレ
メント、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位といった１つ以上の機能性サ
ブ領域を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドが細胞核へ侵入するのが望ましい
場合には、核ターゲティング配列が含まれていてもよい。

【００５４】本発明の微粒子は、ヒドロゲルマトリックスと送達すべき化合物以外にも、他
のエレメントを含んでいてもよく、例えば、クラスリン被覆小孔による取込みの
効率を向上させるエレメントが挙げられるが、これに限定されない。限定するわ
けではないが、例えば、微粒子へ配合可能またはその表面に共有結合もしくは非
共有結合手段によって結合可能なターゲティング分子をこの目的に使用すること
が可能である。本発明に従うターゲティング分子は、エンドサイトーシスによっ
て取込まれる細胞表面分子へ結合する分子である。限定するわけではないが、タ
ーゲティング分子の例としては、マンノース、マンノース-6-リン酸、マンノー
ス-6-ホスホン酸、および細胞内レクチンに対する炭水化物リガンドといった炭
水化物成分、並びにインスリン、上皮増殖因子、または免疫グロブリン重鎖とい
った細胞内受容体に対する他の結合パートナーが挙げられる。前記分子の結合部
分または類似体もターゲティング目的に使用し得る。ターゲティング分子を選択
することにより、微粒子を特定の細胞サブ集団へ選択的に取込ませることが可能
となる。例えば、限定するわけではないが、微粒子を樹状細胞へ取込ませるのが
望ましい本発明の特定の実施形態では(例えば、免疫原性ペプチド、タンパク質
もしくはアジュバント、または免疫原性ペプチド、タンパク質等をコードするポ
リヌクレオチドを微粒子に送達させて抗原提示に利用しようとする場合には)、
樹状細胞は表面にマンノース受容体を有するため、微粒子にターゲティング分子
としてマンノース成分を含ませればよい。

【００５５】各種アッセイを使用して、本発明の微粒子が細胞への取込みに適しているか否
かを判定することが可能である。限定するわけではないが、適切なアッセイの例
としては、Schmid, 1997, Annu. Rev. Biochem. 66:511-548; Smytheら, 1992,
J. Cell Biol. 119:1163-1171; Smytheら, 1989, J. Cell Biol. 108:843-853;
SchmidおよびSmythe, 1991, J. Cell Biol. 114:869-880; Carterら, 1993, J.
Cell Biol. 120:37-45；並びにSchmid, 1993,Trends Cell Biol. 3:145-148に記
載のものが挙げられる(これらの引例はいずれも、引用によりその全内容が本明
細書に含まれるものとする)。例えば、微粒子の取込みは、細胞膜を機械的剪断
によって破裂させた一部損傷細胞または被穿孔細胞において、微粒子を標的とす
るプローブに対する微粒子の到達非容易度(サイトゾルにおける分離の指標)を見
積もることにより評価が可能である。あるいは、電子顕微鏡または、微粒子がポ
リヌクレオチドを含む場合には、in situハイブリダイゼーションもしくは細胞
のサブ画分に含まれる核酸へのハイブリダイゼーションによって、微粒子のエン
ドサイトーシス経路への侵入および通過の経過をモニターすることも可能である
。

【００５６】 4.3 膨張性微粒子の用途本発明の膨張性微粒子を使用して、薬剤、ペプチドおよびポリヌクレオチド等
の化合物を細胞の細胞質へ送達することが可能である。これらの化合物は、治療
、診断、研究または工業目的で送達することが可能である。

【００５７】本発明は、上述の膨張性微粒子を含んでなる組成物を提供する。このような組
成物は、液体、エーロゾル、エマルジョンおよび固体等の様々な物理的形態であ
ってよく、微粒子の使用目的に適合する他の各種物質を含んでいてもよい。限定
するわけではないが、具体的には、本発明の微粒子は、使用前に再構成される乾
燥粉末形態で保存してもよく、また、微粒子を凝縮時のコンフォメーションに維
持する１種以上の緩衝剤をさらに含む液体組成物に微粒子を配合してもよい(例
えば、超凝縮状態を誘導するアルカリ性pHの緩衝液中に微粒子を保存してもよい
)。

【００５８】限定するわけではないが、本発明はさらに、ヒドロゲルマトリックスおよび／
または送達すべき化合物が異なっていてもよい微粒子の混合物を含んでなる組成
物を提供する。このような混合物は、１種以上の化合物を細胞内部へ送達したり
、１種以上の化合物をエンドサイトーシス経路の異なる時点で導入したりする際
に有用である。

【００５９】様々な投与方法によって細胞を本発明の膨張性微粒子に接触させることが可能
であり、in vitroまたはin vivoのいずれでも実施可能である。in vivoにて細胞
へ投与する場合には(該細胞が含まれる生物へ投与を行う場合には)、該微粒子は
、静脈内、動脈内、髄腔内、腹腔内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、直腸、肺、
または局所経路等によって投与可能である。経口投与に関しては、本発明の微粒
子は、胃腸管の酸性pH下での微粒子の膨張を防止する被覆を必要とする場合があ
る。

【００６０】限定するわけでないが、送達すべき化合物がポリヌクレオチドである本発明の
ある実施形態では、本発明の方法を遺伝性疾患の治療に利用して、内在性核酸の
欠陥に起因する望ましくない作用を矯正もしくは改善したり、感染症、悪性腫瘍
、自己免疫疾患、変性性障害、および加齢に伴う障害といった後天性疾患の治療
もしくは予防に利用することが意図される。

【００６１】限定するわけではないが、具体例の１つとして、病原体または悪性腫瘍に関連
する抗原をコードするポリヌクレオチドを、本発明の微粒子を介して被験体の細
胞へ導入し、病原体への感染または悪性腫瘍の発症もしくは進行を予防または治
療する遺伝子ワクチン接種を行うことが可能である。

【００６２】本発明の関連する実施形態では、微粒子を使用して１種以上の免疫原性ペプチ
ド、タンパク質またはアジュバントを細胞へ導入することが可能である。このよ
うな実施形態では、微粒子によって該微粒子を含む小胞が破裂すると、ペプチド
、タンパク質またはアジュバントがクラスI経路に従って処理され、主要組織適
合クラスI抗原として細胞表面へ提示される。しかしながら、微粒子が、配合さ
れている免疫原性ペプチド、タンパク質またはアジュバントを送達するためには
十分膨張しているが、該微粒子を含む小胞を破裂させるほどには膨張しない場合
には(限定するわけではないが、本発明の特定の実施形態の１つ)、免疫原性ペプ
チド、タンパク質またはアジュバントは小胞中へ放出され、クラスII経路に従っ
て処理されて主要組織適合クラスII抗原として細胞表面に提示される。このよう
に、クラスIおよび／またはクラスII抗原に対する免疫反応を誘導することが可
能である。

【００６３】さらに、ポリヌクレオチドを非ヒト動物(例えば、家畜や愛玩動物等の家畜化
動物並びに非家畜化動物)へ導入する際に本発明の微粒子を使用し得ることも意
図され、ポリヌクレオチドを含んでなる膨張性微粒子を、(i)非ヒト動物の胚ま
たは(ii)幼体もしくは成体非ヒト動物のいずれかの１種以上の細胞へ導入するこ
とができる。限定するわけではないが、具体的には、このような微粒子を、非ヒ
ト動物胚の遺伝子操作、または家畜化動物もしくは野生動物集団の遺伝子ワクチ
ン接種に利用することが可能である。

【００６４】本明細書中では多岐にわたる刊行物を引用しているが、その全内容は引用によ
り本明細書に含まれるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/00 35/00 35/00 37/00 37/00 // Ａ６１Ｋ 38/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ１２Ｎ 15/09 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 AA11 AA20 CA01 CA11 DA02 GA11 HA17 4C076 AA09 AA11 AA17 AA24 BB13 BB14 BB15 BB16 BB21 BB25 BB29 CC09 CC26 CC27 CC31 EE11 EE13 EE14 EE16 FF63 FF68 4C084 AA02 AA13 AA17 BA03 CA27 MA05 NA14 ZB262 ZB312 4C086 AA01 EA16 MA02 MA05 NA13 ZA01 ZB07 ZB26 ZB31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなり、かつ細胞内部
へ送達すべき化合物を含有する微粒子であって、該微粒子は凝縮状態で、細胞表
面上のクラスリン被覆小孔を介して取込まれるサイズをしており、該pH感応性ヒ
ドロゲルは７未満のpHで膨張して膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微
粒子を生じる、前記微粒子。
【請求項２】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径が
、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の５〜10倍である、
請求項１記載の微粒子。
【請求項３】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径が
、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の10〜100倍である
、請求項１記載の微粒子。
【請求項４】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径が
、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の100倍を超える、
請求項１記載の微粒子。
【請求項５】 pH感応性ヒドロゲルが5.5〜6.3のpHで膨張する、請求項１記
載の微粒子。
【請求項６】 pH感応性ヒドロゲルが5.0〜5.5のpHで膨張する、請求項１記
載の微粒子。
【請求項７】 pH感応性ヒドロゲルが5.0未満のpHで膨張する、請求項１記
載の微粒子。
【請求項８】直径が50〜150nmである、請求項１記載の微粒子。
【請求項９】 pH感応性ヒドロゲルが、アミノエチルメタクリレート、N,N-
ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレー
ト、ビニルピリジン、イミダゾール含有成分、イミダゾール誘導体含有成分、お
よび塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される塩基
性モノマー単位を含んでなる、請求項１記載の微粒子。
【請求項１０】 pH感応性ヒドロゲルが、塩基性モノマー単位と、アクリル
酸、メタクリル酸、メチルメタクリレートエステル、スチレンスルホン酸ナトリ
ウム、およびスルホキシエチルメタクリレートからなる群より選択される酸性モ
ノマー単位とを含んでなる、請求項１記載の微粒子。
【請求項１１】 pH感応性ヒドロゲルが、n-メチルメタクリレートエステル
と(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートをコモノマー比70:30で含む高分子電
解質コポリマーである、請求項１記載の微粒子。
【請求項１２】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項１記載の微粒子。
【請求項１３】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２記載の微粒子。
【請求項１４】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３記載の微粒子。
【請求項１５】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項４記載の微粒子。
【請求項１６】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項５記載の微粒子。
【請求項１７】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項６記載の微粒子。
【請求項１８】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項７記載の微粒子。
【請求項１９】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項８記載の微粒子。
【請求項２０】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項９記載の微粒子。
【請求項２１】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項１０記載の微粒子。
【請求項２２】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項１１記載の微粒子。
【請求項２３】請求項１に記載の微粒子と緩衝剤とを含んでなる組成物。
【請求項２４】化合物を含有する微粒子を細胞のエンドサイトーシス経路
へ導入することを含んでなる、化合物を細胞内部へ送達する方法であって、該微
粒子は、エンドサイトーシス経路へ導入されるまで凝縮状態であるが、エンドサ
イトーシス経路内では膨張状態となるpH感応性ヒドロゲルを含んでなり、これに
より該化合物が細胞内部へ送達される、前記方法。
【請求項２５】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径
が、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の５〜10倍である
、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径
が、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の10〜100倍であ
る、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】膨張状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径
が、凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径の100倍を超える
、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】 pH感応性ヒドロゲルが5.5〜6.3のpHで膨張する、請求項２
４記載の方法。
【請求項２９】 pH感応性ヒドロゲルが5.0〜5.5のpHで膨張する、請求項２
４記載の方法。
【請求項３０】 pH感応性ヒドロゲルが5.0未満のpHで膨張する、請求項２
４記載の方法。
【請求項３１】凝縮状態のpH感応性ヒドロゲルを含んでなる微粒子の直径
が20〜150nmである、請求項２４記載の方法。
【請求項３２】 pH感応性ヒドロゲルが、アミノエチルメタクリレート、N,
N-ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレ
ート、イミダゾール含有成分、イミダゾール誘導体含有成分、ビニルピリジン、
および塩化ビニルベンジルトリメチルアンモニウムからなる群より選択される塩
基性モノマー単位を含んでなる、請求項２４記載の方法。
【請求項３３】 pH感応性ヒドロゲルが、塩基性モノマー単位と、アクリル
酸、メタクリル酸、メチルメタクリレートエステル、スチレンスルホン酸ナトリ
ウム、およびスルホキシエチルメタクリレートからなる群より選択される酸性モ
ノマー単位とを含んでなる、請求項２４記載の方法。
【請求項３４】 pH感応性ヒドロゲルが、n-メチルメタクリレートエステル
と(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートをコモノマー比70:30で含む高分子電
解質コポリマーである、請求項２４記載の方法。
【請求項３５】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２４記載の方法。
【請求項３６】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２５記載の方法。
【請求項３７】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２６記載の方法。
【請求項３８】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２７記載の方法。
【請求項３９】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２８記載の方法。
【請求項４０】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項２９記載の方法。
【請求項４１】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３０記載の方法。
【請求項４２】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３１記載の方法。
【請求項４３】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３２記載の方法。
【請求項４４】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３３記載の方法。
【請求項４５】細胞内部へ送達すべき化合物がポリヌクレオチドである、
請求項３４記載の方法。