WO2014157606A1 - 架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とその製造方法 - Google Patents

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polysaccharide nanogel
nanogel
hydrophobized
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一成 秋吉
義朗 田原
貞篤 向井
晋一 澤田
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国立大学法人京都大学
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Definitions

  • the present invention relates to a crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle and a method for producing the same.
  • nanogels can be used as important materials in molecular chaperones, clinical-level cancer immunotherapy, intracellular transfer, nasal vaccines, and the like.
  • Non-Patent Document 1 In the existing researches of the present inventors (Patent Document 1, Non-Patent Documents 1 and 2), an attempt was made to prepare a gel (nanogel crosslinked gel) with the nanogel as a crosslinking point in order to expand the application range of the nanogel. Specifically, a conventional cholesteryl group-introduced pullulan was modified with an acryloyl group to prepare a polymerizable nanogel. This polymerizable nanogel forms a nanogel cross-linked gel by reacting with a polyethylene glycol having a thiol group at its end. This nanogel cross-linked gel has the feature that the internal nanogel can encapsulate and release the protein drug, and has made many achievements as a scaffold material particularly for regenerative medicine (Non-patent Document 2).
  • Nanogel cross-linked gels obtained by conventional techniques such as Non-Patent Documents 3 to 7 are either particles having a particle size of less than about 100 nm or large particles of several millimeters or more, and have a size in the submicron to micrometer range.
  • a nanogel cross-linked gel having a thickness was not obtained. This is because particles with a size of about 100 mm are limited in the number of drugs that can be encapsulated, the controlled release rate cannot be adjusted, and with nanogel crosslinked gels of several mm or larger, the administration method to the body is surgical. It means that it is limited to manual embedding or sticking to the body surface.
  • crosslinked only nanogel without using a crosslinking agent was not able to be prepared.
  • the main object of the present invention is to provide nanogel particles having an appropriate particle size and a method for producing the same.
  • the present invention provides the following crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles and a method for producing the same.
  • Item 1 Crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles having a particle diameter of 1 to 100 micrometers.
  • Item 2 Crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles obtained by reacting a hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group with a crosslinker, or by reacting hydrophobized polysaccharide nanogels having a crosslinkable group with each other Item 2.
  • hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 2 wherein the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group comprises a polysaccharide part, a hydrophobic part and a crosslinkable part.
  • Item 4 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 3, wherein the polysaccharide moiety is pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethyldextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, xyloglucan or water-soluble cellulose.
  • Item 5 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 3, wherein the hydrophobic portion contains a hydrocarbon group or steryl group having 8 to 50 carbon atoms.
  • Item 6 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 5, wherein the hydrophobic portion contains a cholesteryl group.
  • Item 7 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 3, wherein the crosslinkable moiety contains at least one crosslinkable group selected from acryloyl, methacryloyl, vinyl and allyl.
  • Item 8 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 2, wherein the crosslinking agent is a mercaptoethyl polyethylene glycol compound.
  • Item 9 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 2, wherein the crosslinking agent is a condensate of a peptide containing a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound.
  • the crosslinking agent is a condensate of a peptide containing a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound.
  • Item 10 The hydrophobized polysaccharide nanogel according to any one of Items 1 to 9, which carries at least one selected from nucleic acid, drug and protein.
  • Item 12 The method according to Item 11, wherein the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group comprises a polysaccharide part, a hydrophobic part and a crosslinkable part.
  • Item 13 The method according to Item 12, wherein the polysaccharide moiety is pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethyldextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, xyloglucan or water-soluble cellulose.
  • Item 14 The method according to Item 12, wherein the hydrophobic part contains a hydrocarbon group or steryl group having 8 to 50 carbon atoms.
  • Item 15 The method according to Item 14, wherein the hydrophobic part contains a cholesteryl group.
  • Item 16 The method according to Item 12, wherein the crosslinkable moiety contains at least one crosslinkable group selected from acryloyl, methacryloyl, vinyl and allyl.
  • Item 17 The method according to Item 11, wherein the crosslinking agent is a mercaptoethyl polyethylene glycol compound.
  • Item 18 The hydrophobized polysaccharide nanogel particle according to Item 11, wherein the cross-linking agent is a condensate of a peptide containing a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound.
  • the cross-linking agent is a condensate of a peptide containing a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound.
  • Item 19 The production method according to any one of Items 11 to 18, wherein in the step (1), at least one selected from nucleic acids, drugs and proteins is further added.
  • the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles obtained by the present invention can be used as a sustained-release carrier for pharmaceuticals. Further, the controlled release rate can be controlled by the difference in size of the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles.
  • nanogel cross-linked gels obtained by conventional techniques cannot be encapsulated unless the drug is complexed with the nanogel, but encapsulation in the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles does not necessarily require the drug to be complexed with the nanogel. Expand the range of possible medicines.
  • the drug here refers to not only protein drugs but also those that can be encapsulated in crosslinked hydrophobic polysaccharide nanogel particles such as low molecular weight drugs and nucleic acids.
  • by performing this process a plurality of times it is possible to prepare gel particles encapsulating hydrophobic polysaccharide nanogel particles cross-linked inside, and it is also possible to perform time-dependent sustained release of many kinds of pharmaceuticals.
  • FIG. 1 is a method for preparing crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles.
  • FIG. 2 is a confocal microscope photograph (cross-sectional photograph) of the W / O emulsion.
  • FIG. 3 is a confocal microscopic observation photograph (cross-section photograph) of a crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle dispersed in water.
  • FIG. 4 is a confocal microscopic photograph (cross-sectional photograph) of a large-sized crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle dispersed in water.
  • FIG. 1 is a method for preparing crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles.
  • FIG. 2 is a confocal microscope photograph (cross-sectional photograph) of the W / O emulsion.
  • FIG. 3 is a confocal microscopic observation photograph (cross-section photograph) of a crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle dispersed
  • FIG. 5 is a confocal microscopic observation photograph (cross-sectional photograph) of a cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particle prepared by photopolymerization without using a cross-linking agent in water.
  • FIG. 6 is a confocal microscopic observation photograph (cross-sectional photograph) of a cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particle encapsulating Cy5-OVA dispersed in water.
  • Red (left) is fluorescence derived from rhodamine and represents crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles.
  • Green (second from the left) is the fluorescence derived from Cy5 and represents Cy5-OVA.
  • FIG. 7 shows the amount of IgG antibody released from cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating IgG antibody.
  • Figure 8 shows cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating IgG antibodies (rhodamine labeled) injected subcutaneously (sc) into the abdomen of mice for 3 weeks (Sample # 1) and 2 weeks (Sample # 2) It is the state of the skin of the mouse after progress.
  • FIG. 9 shows the IgG antibody concentration in blood after subcutaneous injection of cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating IgG antibody into the abdomen of mice.
  • FIG. 9 shows the IgG antibody concentration in blood after subcutaneous injection of cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating IgG antibody into the abdomen of mice.
  • FIG. 10 is a confocal microscopic observation photograph (cross-section photograph) of a hierarchically crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle dispersed in water.
  • the red color (left end) is Cy5-derived fluorescence and represents Cy5-OVA.
  • Green (second from left) is FITC-derived fluorescence and represents FITC-BSA.
  • FIG. 11 is a confocal microscopic photograph (cross-sectional photograph) of a crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle having a surface modified with FITC-DOPE.
  • Green (left figure, FITC-DOPE) is fluorescence derived from fluorescein and represents FITC-DOPE.
  • the red color (center diagram, CHPOA-Rh) is fluorescence derived from rhodamine and represents a nanogel crosslinked gel.
  • FIG. 12 shows cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles (left, In (PBS (in PBS buffer solution)) prepared using cysteine (Cys) as a linker, and skin one week after administration of these subcutaneously to mice. It is a confocal microscope observation photograph (cross-sectional photograph) of (right, In skin).
  • FIG. 12 shows cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles (left, In (PBS (in PBS buffer solution)) prepared using cysteine (Cys) as a linker, and skin one week after administration of these subcutaneously to mice. It is a confocal microscope observation photograph (cross-sectional photograph) of (right, In skin).
  • FIG. 13 shows a cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particle (left (in PBS buffer)) prepared using a peptide (KGPLGIAGQC) as a linker, and the skin (right) one week after the subcutaneous administration of the mouse. It is a confocal microscope observation photograph (cross-sectional photograph).
  • FIG. 14 is a diagram showing the degradability of a cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particle prepared using Cys as a linker and a cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particle prepared using peptide (GRC) as a linker.
  • FIGS. 2 to 6 and FIGS. 10 to 13 show a color-inverted image.
  • the present invention provides crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles.
  • the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles of the present invention are particles having a structure in which a hydrophobized polysaccharide nanogel that is a base compound is cross-linked via a portion derived from a crosslinkable portion described later.
  • crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles of the present invention are prepared by stirring the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group in the presence of a surfactant.
  • O water-in-oil
  • a W / O emulsion can be formed by further including a crosslinking agent as required.
  • the particle size of the crosslinked particles depends on the particle size of the W / O emulsion, and the particle size of the W / O emulsion is adjusted so that particles having a predetermined particle size can be obtained.
  • the particle size of the W / O emulsion can be adjusted by the stirring conditions of the mixed solution, the type and concentration of the surfactant, and the particle size of the W / O emulsion can also be adjusted through an extruder.
  • the emulsion can also be prepared by ultrasonic irradiation.
  • the particle diameter of the W / O emulsion refers to the particle diameter of the aqueous phase (aqueous droplet) in the W / O emulsion.
  • a W / O emulsion can be obtained by stirring a mixed solution containing a hydrophobic polysaccharide nanogel having a crosslinkable group, a surfactant, water, and an oil phase component.
  • the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group and water are included in the aqueous phase component.
  • a cross-linking agent can optionally be included in the mixture.
  • Stirring can be performed using a wide range of stirrers that are commonly used for producing emulsions, such as homogenizers and bladed stirrers.
  • the stirring conditions are appropriately set so that the average particle diameter of the finally obtained particles is 1 to 100 micrometers, preferably 5 to 50 micrometers, more preferably 5 to 10 or 40 to 50 micrometers. .
  • the particle diameter can be measured by, for example, a dynamic light scattering method (DLS, Dynamic light scattering).
  • DLS Dynamic light scattering
  • the oil phase component of the W / O emulsion includes aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene, aliphatic or alicyclic hydrocarbons such as hexane, heptane and cyclohexane, halogenated hydrocarbons such as chloroform and methylene chloride, Examples include solvents such as esters such as ethyl acetate, mineral oil, and liquid paraffin.
  • Each component in 100 parts by weight of a W / O emulsion comprising a hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group, a crosslinking agent (in the presence or absence), a surfactant, water and an oil phase component
  • the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group is 0.03 to 0.99 parts by weight, preferably 0.03 to 0.3 parts by weight, more preferably 0.03 to 0.06 parts by weight
  • the crosslinking agent is 0 to 3.3 parts by weight, preferably 0 to 1 part by weight, more preferably 0 to 0.2 parts by weight
  • Surfactant is 6.6 to 9.9 parts by weight, preferably 9 to 9.9 parts by weight, more preferably 9.8 to 9.9 parts by weight, * 0.87 to 28.71 parts by weight of water, preferably 0.87 to 8.7 parts by weight, more preferably 0.87 to 1.74 parts by weight.
  • the oil phase component is used in an amount of 59.4 to 89.9 parts by weight, preferably 81 to 89.9 parts by weight, more preferably 88.2 to 89.9 parts by weight, based on 100 parts by weight of the W / O emulsion.
  • the temperature at which cross-linking is formed in the emulsion is about 10 to 80 ° C., preferably about 20 to 60 ° C., and the time is about 1 minute to 24 hours, preferably about 5 minutes to 12 hours.
  • the above emulsion can be obtained by stirring the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group and a crosslinking agent (optional component) in the presence of a surfactant to form a W / O emulsion.
  • a crosslinking agent optional component
  • the reaction can be slowed by starting the reaction from a low temperature (about 15-25 ° C). Can be obtained.
  • the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group has a polysaccharide part, a hydrophobic part, and a crosslinkable part.
  • the hydrophobic part is composed of a hydrophobic group and a linker group
  • the crosslinkable part is a crosslinkable group and a linker. Consists of groups.
  • the hydrophobic group and the crosslinkable group are linked to the polysaccharide moiety directly or via an appropriate linker group.
  • the polysaccharide portion only needs to be a combination of one or two or more monosaccharide molecules such as glucose, galactose, mannose, and fructose.
  • the polysaccharide moiety may have a modifying group such as hydroxymethyl, hydroxyethyl, hydroxypropyl, carboxymethyl. Examples of the polysaccharide moiety include pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethyldextran, mannan, levan, inulin, chitin, chitosan, xyloglucan, water-soluble cellulose and the like.
  • pullulan, amylopectin, amylose, dextran, hydroxyethyl dextran and the like which are homopolysaccharides composed of ⁇ -glucose are preferable, and pullulan is particularly preferable.
  • the polysaccharide part may be a single polysaccharide or a combination of two or more polysaccharides.
  • the hydrophobic part is composed of a hydrocarbon group having 8 to 50 carbon atoms (may be 12 to 50 carbon atoms), a hydrophobic group such as a steryl group, and a linker group contained as necessary.
  • a hydrophobic group a steryl group is preferable, and a cholesteryl group is particularly preferable.
  • the crosslinkable part includes the above-described crosslinkable group and, if necessary, a linker group.
  • the crosslinkable group (which can be referred to as a polymerizable group) is a group that can form a chemical bond between a plurality of crosslinkable groups (in one embodiment, between two crosslinkable groups). It is not limited.
  • the crosslinkable group may be a group capable of directly forming a chemical bond with another crosslinkable group or a group capable of forming a chemical bond via a crosslinking agent.
  • the crosslinkable group is a group that reacts with a thiol group, and specific examples include (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylic acid amide, maleimide, and the like. And a group having an ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl moiety.
  • other polymerizable unsaturated groups such as vinyl and allyl are also exemplified as the crosslinkable group.
  • (meth) acrylic acid represents acrylic acid and methacrylic acid
  • (meth) acrylic acid ester represents acrylic acid ester and methacrylic acid ester.
  • the hydrophobic part is about 0.1 to 20%, preferably about 0.3 to 15%, more preferably about 0.5 to 10%, especially about 1 to 5% of the polysaccharide part by weight.
  • the crosslinkable part is about 1 to 50%, preferably about 15 to 30%, more preferably about 20 to 30%, and particularly about 20 to 25% of the polysaccharide part by weight.
  • the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group can be produced, for example, by introducing a crosslinkable moiety into a known hydrophobic polysaccharide nanogel.
  • Hydrophobized polysaccharide nanogel consists of a polysaccharide part and a hydrophobic part. Specific examples of the polysaccharide part and the hydrophobic part are as described above. In the hydrophobized polysaccharide nanogel, it is preferable that 1 to 5, more preferably 1 to 3 hydrophobic moieties, which are not limited to integer values, are introduced per 100 monosaccharides of the polysaccharide moiety.
  • the hydrophobized polysaccharide nanogel can be produced, for example, according to the method described in International Publication WO00 / 012564. Specifically, a hydroxyl group-containing hydrocarbon or sterol having 8 to 50 carbon atoms (or 12 to 50 carbon atoms) and OCN-R 1 -NCO (where R 1 is a hydrocarbon having 1 to 50 carbon atoms)
  • Second reaction step for producing a hydrocarbon group or steryl group having 8 to 50 carbon atoms as a hydrophobic group by further reacting the isocyanate group-containing hydrophobic compound obtained in the first stage reaction with a polysaccharide.
  • the method containing is mentioned.
  • the reaction product of the second stage reaction can be purified with a ket
  • hydrophobized polysaccharide nanogel a commercially available product may be used as the hydrophobized polysaccharide nanogel.
  • cholesterylated pullulan can be purchased from NOF Corporation.
  • a suitable hydrophobized polysaccharide nanogel is cholesterylated pullulan (CHP, for example, having a molecular weight of about 20,000 to 200,000 in which 1 to 10, preferably 1 to several cholesteryl groups are introduced per 100 monosaccharides of pullulan).
  • CHP cholesterylated pullulan
  • the cholesteryl group is introduced into pullulan via a linker group (preferably a urethane bond).
  • the introduction of the crosslinkable moiety into the hydrophobic polysaccharide nanogel can be performed by a known method.
  • a crosslinkable moiety can be introduced according to the method described in Patent Document 1 or Non-Patent Document 1.
  • a method of reacting a hydrophobic polysaccharide nanogel with a crosslinkable molecule having an isocyanate in the presence of an organometallic catalyst in a solvent for example, in DMSO
  • An example of specific conditions is as described in the examples.
  • the surfactant is not particularly limited as long as it can form a W / O emulsion, and examples thereof include cationic, anionic, amphoteric and nonionic surfactants. Ionic surfactants are preferred.
  • surfactant examples include phospholipid, glycerin fatty acid ester, polyglycerin fatty acid ester, propylene glycol fatty acid ester, polyglycerin condensed ricinoleic acid ester, sorbitan fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester and the like. More preferred are phospholipids, polyglycerin fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, sucrose fatty acid esters, and polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters. Surfactants may be used alone or in combination of two or more.
  • Examples of the phospholipid used in the present invention include soybean lecithin, egg yolk lecithin, soybean lecithin hydrogenated substance, egg yolk lecithin hydrogenated substance, phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, and phosphatidylinositol.
  • Examples of the glycerin fatty acid ester used in the present invention include esters of glycerin and fatty acids having 8 to 18 carbon atoms such as caprylic acid, capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and linoleic acid. Is mentioned.
  • Preferable examples of the glycerol fatty acid ester include glycerol monooleate, glycerol monostearate, glycerol monopalmitate, glycerol monomyristate, glycerol monolaurate, and the like.
  • polyglycerin fatty acid ester used in the present invention examples include polyglycerin having an average degree of polymerization of 2 or more, preferably 6 to 15, more preferably 8 to 10 and fatty acid having 8 to 18 carbon atoms such as caprylic acid and capric acid. , Esters with lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, and linoleic acid.
  • polyglycerol fatty acid esters include hexaglycerol monooleate, hexaglycerol monostearate, hexaglycerol monopalmitate, hexaglycerol monomyristate, hexaglycerol monolaurate, decaglycerol monooleate , Decaglycerin monostearic acid ester, decaglycerin monopalmitic acid ester, decaglycerin monomyristic acid ester, decaglycerin monolauric acid ester and the like.
  • sorbitan fatty acid ester used in the present invention those having 8 or more carbon atoms of fatty acids are preferable, and those having 12 or more are more preferable.
  • sorbitan fatty acid esters include sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monostearate, sorbitan tristearate, sorbitan tristearate, sorbitan isostearate, sorbitan sesquiisostearate, sorbitan oleate, sorbitan sesquioleate And sorbitan trioleate.
  • the sucrose fatty acid ester used in the present invention preferably has a fatty acid having 12 or more carbon atoms, more preferably 12-20.
  • Preferred examples of sucrose fatty acid esters include sucrose dioleate, sucrose distearate, sucrose dipalmitate, sucrose dimyristic ester, sucrose dilaurate, sucrose monooleate, sucrose Examples include sugar monostearate, sucrose monopalmitate, sucrose monomyristic ester, and sucrose monolaurate. Among these, sucrose monooleate, sucrose monostearate, sucrose Monopalmitate, sucrose monomyristate, and sucrose monolaurate are more preferable.
  • the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester used in the present invention preferably has 8 or more carbon atoms, more preferably 12 or more. Further, the length (number of added moles) of ethylene oxide of polyoxyethylene is preferably 2 to 100, more preferably 4 to 50.
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester examples include sorbitan polyoxyethylene monocaprylate, sorbitan polyoxyethylene monolaurate, sorbitan polyoxyethylene monostearate, sorbitan polyoxyethylene dextearate, sorbitan polyoxyethylene tristearate Sorbitan polyoxyethylene isostearate, sorbitan polyoxyethylene sesquiisostearate, sorbitan polyoxyethylene oleate, sorbitan polyoxyethylene sesquioleate, sorbitan polyoxyethylene trioleate, and the like.
  • a necessary cross-linking agent can be used according to the cross-linking group of the hydrophobized polysaccharide nanogel having a cross-linking group.
  • the crosslinker contains two or more thiol groups (—SH). The thiol group can react with the crosslinkable group of the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group to form a crosslink.
  • a group having an ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl moiety such as (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylic acid amide, maleimide, etc., in the hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group It is preferable to use a crosslinking agent containing two or more thiol groups.
  • One embodiment of the cross-linking agent containing two or more thiol groups includes a compound having a linear or branched polyethylene glycol chain and having two or more terminal thiol groups (—SH groups).
  • the molecular weight is not particularly limited, but is about 1,000 to 100,000, preferably about 2,000 to 10,000.
  • a cross-linking agent for example, a mercaptoethyl polyethylene glycol compound (mercaptoethyl polyethylene glycol derivative) can be used.
  • Mercaptoethyl polyethylene glycol compounds include PEG-dithiol (HS-PEG-SH), PEG-trithiol (glycerin nucleus) having 3 arms, and PEG- having 4 arms.
  • Mercaptoethyl polyethylene glycol compounds having multiple arms such as tetrathiol (pentaerythritol nucleus) or PEG-octathiol (hexaglycerin nucleus) having 8 arms are included.
  • a PEG reagent having a plurality of arms as described above may also have less than all thiol-functionalized arms.
  • an amino acid containing a thiol group such as cysteine or homocysteine (referred to as “thiol group-containing amino acid”), or a peptide having a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound (polyethylene glycol derivative) And a condensate (conjugate).
  • the condensate is a compound having a linear or branched polyethylene glycol chain and two or more thiol groups at its end, and at least a part of the thiol group is a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue. It is derived from the peptide containing. Examples of the thiol group-containing amino acid include cysteine and homocysteine, and cysteine is preferred.
  • the peptide having a thiol group-containing amino acid residue is preferably a peptide having a cysteine residue.
  • the polyethylene glycol chain and the terminal thiol group are relayed by a thiol group-containing amino acid residue or a peptide chain containing a thiol-containing amino acid residue. That is, these amino acid residues or peptide chains are used as a linker.
  • the above condensate is a linear or branched polyethylene glycol (molecular weight: about 1,000 to 100,000, preferably about 2,000 to 10,000) active ester and a peptide containing a thiol group-containing amino acid or a thiol group-containing amino acid residue. Can be obtained by reacting.
  • the above-mentioned active ester of linear or branched polyethylene glycol includes-of a polyethylene glycol compound having at least two -COOH groups at the ends of the linear or branched polyethylene glycol skeleton similar to the skeleton of the mercaptoethyl polyethylene glycol compound.
  • Active esters in COOH eg N-hydroxysuccinimide ester, p-nitrophenyl ester
  • COOH eg N-hydroxysuccinimide ester, p-nitrophenyl ester
  • the following is an example of a process for producing a condensate (conjugate) using N-hydroxysuccinimide ester (PEGNHS) of branched polyethylene glycol.
  • PEGNHS N-hydroxysuccinimide ester
  • the following formula reacts PEGNHS (A) with a peptide (B) containing a thiol group-containing amino acid residue to produce a condensate (C) of a peptide containing a thiol group-containing amino acid residue and a polyethylene glycol compound.
  • A PEGNHS
  • B a peptide
  • C condensate
  • the peptide containing a thiol group-containing amino acid residue may have a thiol group-containing amino acid residue at the N-terminus, C-terminus of the peptide, or any position other than these terminus, Is preferably a peptide having C at the C-terminus.
  • the number of amino acid residues of the peptide is preferably about 1 to 50 residues, preferably about 1 to 10 residues.
  • peptides containing cysteine residues include those whose amino acid sequences are GRC and KGPLGIAGQC (SEQ ID NO: 1).
  • crosslinking agent containing a peptide containing a cysteine residue as the crosslinking agent, various performances derived from the peptide can be imparted. For example, when the peptide is GRC, degradability is imparted to the crosslinked particles.
  • Still other crosslinkers include aromatic polyvalent thiols, dimercaptosuccinic acid, 2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid, thiol functionalized dextran, and thiol functionalities that may have PEG groups as spacers Hyaluronic acid is included.
  • the above is a polyethylene glycol derivative or the like in which the crosslinking agent has a thiol group (—SH group), and the crosslinking group is ⁇ such as (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylic acid amide, and maleimide.
  • ⁇ -unsaturated carbonyl group combinations are exemplified, but ⁇ , ⁇ -unsaturated crosslinkers such as (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylic acid amide, maleimide, etc.
  • a compound having a saturated carbonyl moiety may be used, and the crosslinkable group may be a thiol group (—SH group).
  • a polymerization initiator may be further included in the W / O emulsion as necessary. It can.
  • the necessary polymerization initiator can be appropriately selected.
  • the crosslinkable group has an ⁇ , ⁇ -unsaturated carbonyl moiety such as (meth) acrylic acid, (meth) acrylic acid ester, (meth) acrylic acid amide, maleimide, etc.
  • the photopolymerization initiator is not particularly limited as long as it absorbs energy rays such as light and generates radicals.
  • examples thereof include alkylphenone photopolymerization initiators such as ⁇ -hydroxyalkylphenone, acylphosphine oxide photopolymerization initiators, titanocene photopolymerization initiators, and the like.
  • alkylphenone photopolymerization initiators such as ⁇ -hydroxyalkylphenone, acylphosphine oxide photopolymerization initiators, titanocene photopolymerization initiators, and the like.
  • a commercially available product of Irgacure 2959 alkylphenone photopolymerization initiator, manufactured by BASF Japan Ltd.
  • the content of the polymerization initiator in the W / O emulsion can be appropriately set.
  • 0 to 5 parts by weight, preferably 0 to 1 part by weight, more preferably 0 to 0.5 part by weight can be used with respect to 100 parts by weight of the W / O emulsion.
  • the polymerization initiator may be used alone or in combination of two or more.
  • the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles of the present invention may further have modifications other than those exemplified above.
  • the modification is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired, and a fluorescent label is exemplified as a specific example.
  • Fluorescent labels include fluorescent dyes such as rhodamine and fluorescein.
  • the entire cross-linked particles obtained have a modification.
  • an isocyanate group-containing compound such as fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) or rhodamine isothiocyanate (RITC)) is used.
  • FITC fluorescein-5-isothiocyanate
  • RITC rhodamine isothiocyanate
  • a method for introducing a modification into the hydrophobized polysaccharide nanogel is exemplified. A specific method can be performed according to a method of introducing a crosslinkable moiety into the hydrophobic polysaccharide nanogel.
  • the surface of the obtained crosslinked particles has a modification.
  • a specific example of (ii) is a method of coating the crosslinked particles with a thin film having a modification.
  • a thin film having a modification can be prepared using a lipid (for example, phospholipid) having a modification such as FITC-labeled dioleyl phosphatidylethanolamine (FITC-DOPE).
  • the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles of the present invention are prepared by mixing a hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group, a crosslinking agent (optional component) and a surfactant in a solvent containing water and an oil phase component.
  • a crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particle having a particle size of 1 to 100 micrometers is obtained by a production method including a step of preparing a mold emulsion and a step of performing a crosslinking reaction of the obtained W / 0 emulsion. .
  • the particle size of the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles is preferably 5 to 50 micrometers, more preferably 5 to 10 or 40 to 50 micrometers.
  • the particle size of the aqueous phase constituting the W / 0 emulsion is about 1 to 100 micrometers, preferably 5 to 50 micrometers, more preferably 5 to 10 or 40 to 50 micrometers.
  • the particle size of the hydrophobized polysaccharide nanogel particles cross-linked with the particle size of the W / 0 type emulsion is the same value or cross-linked
  • the particle size of the hydrophobized polysaccharide nanogel particles is slightly reduced.
  • the particle size of the hydrophobized polysaccharide nanogel particle crosslinked is smaller than the particle size of the W / 0 type emulsion.
  • the particle size of the mold emulsion is adjusted to be slightly larger.
  • the particles having a plurality of layers can be obtained by performing the crosslinking reaction twice or more.
  • the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles of the present invention are further reacted with a hydrophobized polysaccharide nanogel having a crosslinkable group and a crosslinking agent (optional component) under conditions for forming a W / O emulsion.
  • the first drug is encapsulated in the first particle and the second drug is encapsulated in the second coating layer covering the particle, the first drug and the second drug are released at different rates. Can do.
  • the crosslinked particles of the present invention carry a physiologically active substance such as a nucleic acid, protein, or drug.
  • Physiologically active substances such as nucleic acids, proteins and drugs may be included in the crosslinked particles of the present invention.
  • the drug may be any drug and is not particularly limited.
  • an antitumor agent an antihypertensive agent, an antihypertensive agent, an antipsychotic agent, an analgesic agent, an antidepressant, an antidepressant, an anxiolytic agent, a sedative Agent, hypnotic, antidepressant, opioid agonist, asthma treatment, anesthetic, antiarrhythmic agent, arthritis treatment, antispasmodic agent, ACE inhibitor, decongestant, antibiotic, antianginal agent, diuretic, antiparkinson Disease agent, bronchodilator, antidiuretic, diuretic, antihyperlipidemic agent, immunosuppressant, immunomodulator, antiemetic, antiinfective agent, anti-neoplastic agent, antifungal agent, antiviral agent, Anti-diabetic agent, anti-allergic agent, antipyretic agent, anti-gout agent, antihistamine agent, antidiarrheal agent, bone
  • a preferred drug is an antitumor agent.
  • Antitumor agents include hormonal therapeutic agents (eg, phosfestol, diethylstilbestrol, chlorotrianiserin, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, chlormadinone acetate, cyproterone acetate, danazol, allylestrenol, gestrinone.
  • hormonal therapeutic agents eg, phosfestol, diethylstilbestrol, chlorotrianiserin, medroxyprogesterone acetate, megestrol acetate, chlormadinone acetate, cyproterone acetate, danazol, allylestrenol, gestrinone.
  • Mepartricin, raloxifene, olmeloxifen, levormeloxifene, antiestrogens eg, tamoxifen citrate, toremifene citrate, etc.
  • pill formulations mepithiostane, testrolactone, aminoglutethimide, LH-RH agonists (eg, goserelin acetate) , Buserelin, leuprorelin, etc.), droloxifene, epithiostanol, ethinyl estradiol sulfonate, aromatase inhibitors (eg, fadrozole hydrochloride, anastrozo) , Letrozole, exemestane, borozole, formestane, etc.), antiandrogens (eg, flutamide, bicalutamide, nilutamide, etc.), 5 ⁇ -reductase inhibitors (eg, finasteride,
  • the types of cancer that are targeted by anti-tumor agents are colorectal cancer, liver cancer, kidney cancer, head and neck cancer, esophageal cancer, stomach cancer, biliary tract cancer, gallbladder / bile duct cancer, pancreatic cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer.
  • Cervical cancer, endometrial cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular tumor, bone / soft tissue sarcoma, leukemia, malignant lymphoma, multiple myeloma, skin cancer, brain tumor, etc. preferably colorectal cancer, stomach cancer , Head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, liver cancer.
  • These drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • the nucleic acid is not particularly limited and may be any DNA, RNA, chimeric nucleic acid of DNA and RNA, DNA / RNA hybrid, or the like.
  • the nucleic acid can be any one of 1 to 3 strands, but is preferably single strand or double strand.
  • Nucleic acids may be other types of nucleotides that are N-glycosides of purine or pyrimidine bases, or other oligomers having a non-nucleotide backbone (eg, commercially available peptide nucleic acids (PNA), etc.) or other oligomers containing special linkages (However, the oligomer contains a nucleotide having a configuration allowing base pairing or base attachment as found in DNA or RNA).
  • PNA commercially available peptide nucleic acids
  • Intramolecular nucleotide modifications such as those having uncharged bonds (eg, methylphosphonates, phosphotriesters, phosphoramidates, carbamates, etc.), charged bonds or sulfur-containing bonds (eg, phosphorothioates, phosphoro Dithioate, etc.), for example, proteins (nucleases, nuclease inhibitors, toxins, antibodies, signal peptides, etc.) and sugars (eg, monosaccharides, etc.), side chain groups, intercalating compounds (Eg, acridine, psoralen, etc.), chelating Containing materials (eg, metals, radioactive metals, boron, oxidizing metals, etc.), containing alkylating agents, or having modified bonds (eg, ⁇ -
  • the siRNA is a nucleotide sequence homologous to the nucleotide sequence of the target gene mRNA or the initial transcript or a partial sequence thereof (preferably within the coding region) (including an intron in the case of the initial transcript) and a complementary sequence thereof. This is a single-stranded oligo RNA.
  • the length of a portion homologous to the target nucleotide sequence contained in siRNA is usually about 18 bases or more, for example, about 20 bases (typically about 21 to 23 bases) in length. Is not particularly limited as long as it can cause
  • the total length of siRNA is usually about 18 bases or more, for example, about 20 bases (typically about 21 to 23 bases in length), but is not particularly limited as long as it can cause RNA interference. .
  • the relationship between the target nucleotide sequence and the sequence homologous to that contained in the siRNA may be 100% identical or may have base mutations (at least 70%, preferably 80%, more preferably 90%, most preferably within 95% identity range).
  • SiRNA may have an additional base at the 5 'or 3' end of 5 bases or less, preferably 2 bases, which does not form a base pair.
  • the additional base may be DNA or RNA, but the use of DNA can improve the stability of siRNA.
  • additional base sequences include ug-3 ', uu-3', tg-3 ', tt-3', ggg-3 ', guuu-3', gttt-3 ', tttt-3 Examples of the sequence include ', uuuuuu-3', but are not limited thereto.
  • the siRNA may be directed to any target gene.
  • the nucleic acid introduction agent of the present invention when used as a prophylactic / therapeutic agent for diseases, siRNA encapsulated in exosomes has an enhanced expression of the target disease.
  • the target is a gene involved in exacerbation, and more specifically, the antisense nucleic acid for the gene is a clinically advanced or preclinical stage gene or a newly known gene And the like.
  • SiRNA may be used alone or in combination of two or more.
  • proteins include cytokines such as enzymes, receptors, antibodies, antigens, interferons, and interleukins.
  • physiologically active substances such as proteins, nucleic acids and drugs may be used alone or in combination of two or more.
  • Crosslinked particles carrying physiologically active substances such as proteins and drugs can be produced by including the physiologically active substance in a W / 0 emulsion that undergoes a crosslinking reaction.
  • the content ratio of the physiologically active substance can be appropriately set according to the purpose of supporting the physiologically active substance. For example, 0 to 5 parts by weight, preferably 0 to 1 part by weight, more preferably 0 to 0.5 part by weight can be used with respect to 100 parts by weight of the W / O emulsion.
  • the crosslinked particles of the present invention carry a physiologically active substance such as a nucleic acid, protein, or drug
  • the crosslinked particles are suitable as a carrier for introducing the physiologically active substance into a living body (in other words, an introduction agent).
  • an introduction agent can be used for
  • the supported physiologically active substance is gradually released (that is, a sustained release effect is exhibited).
  • the target to which the physiologically active substance is introduced may be a cell or a living body.
  • the target cells include cells derived from humans or non-human animals such as mice, particularly cultured cells.
  • living organisms to be used include humans; mammals such as monkeys, mice, rats, rabbits, cows, pigs, sheep and horses; birds such as chickens; and non-human animals such as fish.
  • a target to which a physiologically active substance or the like is introduced is a cell
  • a suitable amount of crosslinked particles encapsulating the physiologically active substance in the medium so that the substance can be used as a carrier or an introduction agent for introducing the substance into the cell.
  • the target to which the physiologically active substance is introduced is a living body such as a human, it is preferably used in dosage forms such as injections, eye drops, nasal drops, inhalants and suppositories.
  • introduction agents of various dosage forms can be obtained using an appropriate carrier that is suitably provided as a pharmaceutical composition and is usually used.
  • the daily dose of the introduction agent of the present invention for adults can be appropriately set according to the physiologically active substance to be introduced, but it is about 0.1 mg to 1 mg, preferably about 0.5 mg to 500 mg per day. It can be selected from a range of about mg.
  • the present invention also provides a method for introducing a physiologically active substance using the crosslinked particles of the present invention into cells, living bodies and the like.
  • CHPOA (CHPOA not labeled with rhodamine) was synthesized as follows. Hydrophobic polysaccharide nanogel CHP (2.5 g) was dissolved in 100 mL of dehydrated dimethyl sulfoxide (DMSO), and the organometallic catalyst DBTDL (595 ⁇ L) and crosslinkable molecule AOI (400 ⁇ L) with isocyanate were added. The reaction was allowed to proceed for 24 hours at ° C. The reaction solution was precipitated with a mixture of diethylether and ethanol, and the solid was dissolved in DMSO. Dialysis (molecular weight 3,500) in water for 1 week was performed to replace the solvent with water. After filtration through a 0.22 ⁇ m filter, lyophilization gave acryloyl group modified CHP (CHPOA). This CHPOA was confirmed to contain 21.3 acryloyl groups per 100 monosaccharides.
  • Rhodamine-labeled acryloyl group-modified CHP (CHPOA-Rh) was synthesized in the same manner.
  • the obtained rhodamine-labeled acryloyl group-modified CHP (CHPOA-Rh) was confirmed to contain 0.3 rhodamine and 20.3 acryloyl groups per 100 monosaccharides.
  • the time of exposure to an organic solvent can be shortened, and a decrease in the activity of an active ingredient such as an enclosed protein drug can be avoided. It has been confirmed by the present inventor that there is no decrease in antibody activity by lyophilization.
  • an anti-aggregation agent such as sucrose.
  • Cy5-labeled OVA was prepared by labeling Cy5 with ovalbumin (OVA), a model protein, in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) using cy5-monoreactive dye pack.
  • Cy5-OVA was added to the aqueous phase of the W / O emulsion, and crosslinked hydrophobic polysaccharide nanogel particles having a diameter of about 10 ⁇ m were prepared using CHPOA-Rh and PEGSH. From the results of confocal microscopy, it was confirmed that Cy5-OVA can be encapsulated inside the crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles (see FIG. 6).
  • a crosslinked hydrophobic polysaccharide nanogel particle having a diameter of about 10 ⁇ m and encapsulating a model IgG antibody (anti-OVA antibody from rabbit, ROCKLAND) was prepared.
  • Two CHPOA-Rh concentrations during gelation were prepared: 20 mg / mL (Sample ⁇ # 1) and 15 mg / mL (Sample ⁇ # 2).
  • mice Male, weight: 20-24 g
  • mice were purchased from Shimizu Experimental Materials.
  • a PBS solution of cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating IgG antibodies was subcutaneously administered to the shaved abdomen of mice. Serum was collected after time (Table 1).
  • the IgG antibody concentration in the serum and the supernatant after the release experiment was measured by the following enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • the sample was diluted 50 times or more with 2% BSA (in PBS), added at 20 L / well, and incubated at 37 ° C for 2 hours. Washed with 0.1% PBST (200 ⁇ L / well ⁇ 5 ⁇ 5 times). HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody (from goat, polyclonal) diluted 50,000 times with 2% BSA (in PBS) was added at 50 ⁇ L / well and incubated at 37 ° C for 2 hours. Washed with 0.1% PBST (200 ⁇ L / well ⁇ 5 ⁇ 5 times). Sigma TMB Liquid Substrate was added at 100 ⁇ L / well, and 30 minutes later, 2 M HCl was added at 50 ⁇ L / well, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • Sample # 1 and Sample # 2 were administered subcutaneously, and the appearance of the mouse skin after 3 weeks (Sample # 1) and 2 weeks (Sample # 2) was observed.
  • CHPOA-Rh 20 mg / mL
  • CHPOA-Rh 15 mg / mL
  • the lump of crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles remains in the skin after 3 weeks.
  • the lump of crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles disappeared from the skin after 2 weeks.
  • IgG antibody By measuring the IgG antibody concentration in the blood, IgG antibody can be detected in the blood for both Sample # 1 and Sample # 2, and the cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles are used to deliver the IgG antibody into the body. It was suggested that it can be used as a sustained release device. In addition, since the changes in IgG antibody concentration differ between Sample # 2 and Sample # 1, it was confirmed that the controlled release rate can be controlled by changing the method for preparing crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles ( (See FIG. 9).
  • FITC-labeled BSA was prepared by labeling fluorescein with bovine serum albumin (BSA), a model protein, in 0.1 M carbonate buffer (pH 9.3) using FITC.
  • Cy5-OVA was added to the aqueous phase of the W / O emulsion to prepare hydrophobized polysaccharide nanogel particles crosslinked with CHPOA and PEGSH. Furthermore, crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles encapsulating Cy5-OVA in the aqueous phase of W / O emulsion and FITC-BSA were added to prepare hydrophobized polysaccharide nanogel particles crosslinked using CHPOA and PEGSH.
  • FITC-labeled dioleyl phosphatidylethanolamine FITC-DOPE
  • FITC-DOPE FITC-labeled dioleyl phosphatidylethanolamine
  • Example 3 Insertion of Functional Linker 85.7 mg / mL of PEGNHS (N-hydroxysuccinimide ester of polyethylene glycol) (4-arm-Functional PEG Series (NHS PEG), molecular weight 10,000, purchased from NOF) (product number: SUNBRIGHT PTE-100CS)) and 2.96 of cysteine It was dissolved in 7.4 mM carbonate buffer (pH 11) at a concentration of mg / mL, and bath-type ultrasonic irradiation was performed for 30 minutes. Thereafter, 0.75 M phosphate buffer (pH 7) and CHPOA-Rh were added to 20 mg / mL.
  • PEGNHS N-hydroxysuccinimide ester of polyethylene glycol
  • NHS PEG 4-arm-Functional PEG Series (NHS PEG), molecular weight 10,000, purchased from NOF) (product number: SUNBRIGHT PTE-100CS)
  • cysteine It was dissolved in 7.4 mM carbonate buffer
  • PEGNHS was 17.1 mg / mL
  • cysteine was 0.593 mg / mL.
  • 100 ⁇ L of this solution and 10 g of EPC dissolved in cyclohexane at a concentration of 2% (w / w) were stirred in a round flask with a Polytron homogenizer (20,000 rpm, 2 minutes), and water-in-oil A (W / O) emulsion was obtained. This emulsion was subjected to bath type ultrasonic irradiation for 20 minutes to carry out a gelation reaction.
  • crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles were prepared using a peptide (KGPLGIAGQC) instead of cysteine.
  • the peptide was dissolved at a concentration of 24.1 mg / mL at the time of pH 11 and 4.82 mg / mL at the time of gelation.
  • crosslinked hydrophobized polysaccharide nanogel particles were prepared using a peptide (GRC) instead of cysteine.
  • GRC peptide
  • the pH of all reactions was 7, and the concentration at the time of gelation was 1.63 mg / mL.
  • nanogel crosslinked gel particles having a diameter of 10 micrometers could be prepared in the case of using Cys and a peptide (KGPLGIAGQC).
  • KGPLGIAGQC a peptide
  • Cross-linked hydrophobized polysaccharide nanogel particles can be used as a device for administration and sustained release of many drugs such as antibodies, cytokines and nucleic acids into the body.

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Abstract

　本発明は、適切な粒子サイズを有する架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を提供することを主な課題とする。　斯かる課題を解決する手段として、粒子径が1～100マイクロメートルである、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を提供する。

Description

架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とその製造方法
　［関連出願の相互参照］
　本出願は、２０１３年３月２９日に出願された、日本国特許出願第２０１３－０７２２５８号明細書（その開示全体が参照により本明細書中に援用される）に基づく優先権を主張する。
　本発明は、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とその製造方法に関する。
　バイオテクノロジーの発展によって、細胞内のシグナル伝達系に関与するペプチドや、細胞内で生理的に重要な役割を果たすタンパク質や核酸を細胞へデリバリーする試みが盛んに行われている。これらは従来の小分子化合物からなる医薬品では実現不可能な薬理効果を上げることができ、多くの成果が上がっている。代表的なものとしてインスリンやヒト成長ホルモン、モノクローナル抗体、各種サイトカインなどが挙げられ、近年では複雑な高次構造を有するタンパク質や核酸も比較的容易に単離及び精製できるようになったことから、バイオ医薬品は、医療現場において今後ますます普及し、重要視されるものと考えられる。しかしながら、これらのバイオ医薬品は、一般的に安定性が低く、体内での分解や不活化を受けやすいことから、薬としての半減期が非常に短いということが知られている。この短い半減期は、実際の臨床現場において有効に利用する際の最大の問題点である。現状では、抗体やサイトカインなどの多くのタンパク質医薬は、数日から数週間毎の投与を数ヶ月以上の期間で、投与し続けなければならない。多くの場合、点滴などの注射によって行われるこれらの治療法は、患者の生活の質（quality of life, QOL）が高いとは言えず、バイオ医薬品を利用した次世代の先端医療においては、適切なキャリアによって、適切な場所に、望ましい濃度及び時間パターンで送達できるドラッグデリバリーシステムおよび再生医療の開発が切望されている。
　一方で、近年、ナノテクノロジーやマテリアルサイエンスの分野より生まれた新規材料をドラッグデリバリーシステムや再生医療へ応用する試みが盛んに行われている。この中で本発明者らは主に多糖によって構成される物理架橋ナノゲルが、タンパク質医薬を封入できるキャリアとして大変有望であることを明らかにしてきた。これまでの研究によって、ナノゲルは分子シャペロン、臨床レベルの癌免疫療法、細胞内導入、経鼻型ワクチンなどにおける重要な材料として利用できることが明らかとなっている。
　本発明者らの既存の研究（特許文献１、非特許文献１，２）で、ナノゲルの応用範囲を拡大するために、ナノゲルを架橋点としたゲル（ナノゲル架橋ゲル）の調製を試みた。具体的には、従来のコレステリル基導入プルランにアクリロイル基を修飾し、重合性をもつナノゲルを調製した。この重合性ナノゲルは、チオール基を末端に付与したポリエチレングリコールと反応することによって、ナノゲル架橋ゲルを形成する。このナノゲル架橋ゲルは、内部のナノゲルがタンパク質医薬を封入かつ徐放可能であるという特徴をもち、特に再生医療のための足場材料として多くの成果を上げている（非特許文献２）。
　非特許文献３～７のような従来技術によって得られるナノゲル架橋ゲルは、粒子サイズが約100 nmより小さい粒子か、数mm以上の大きな粒子のいずれかであり、サブミクロンからマイクロメートル領域の大きさをもつナノゲル架橋ゲルは得られていなかった。これは約100 nm程度の大きさの粒子では封入可能な医薬品が限られるということや、徐放速度の調整ができないこと、数mm以上の大きさのナノゲル架橋ゲルでは体内への投与方法が外科的埋め込みまたは体表面への貼付けに限られるということを意味している。また架橋剤を用いずにナノゲル同士のみを架橋したナノゲル架橋ゲルも調製できていなかった。
日本国特許第4599550号 国際公開公報WO2007/83643号
Shimoda A et al. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 99 (2012), 38-44. Tahara Y et al. React. Funct. Polym. 73 (2013), 958-964. Hayashi C et al. J. Cell Physiol. 220 (2009), 1-7 Miyai K et al. J. Biol. Chem. 284 (2009), 10593-10600. Kamolratanakul P et al. Arthritis Rheum. 63 (2011), 1021-1033. Miyahara T et al. J. Tissue Eng. Regen. Med. 6 (2012), 666-672. Fujioka-Kobayashi M et al. Biomaterials 33 (2012), 7613-7620.
　本発明は、適切な粒子サイズを有するナノゲル粒子及びその製造方法を提供することを主な目的とする。
　本発明は、以下の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子及びその製造方法を提供するものである。
　項１、粒子径が1～100マイクロメートルである、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項２、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルと架橋剤を反応させて得られたもの、または架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル同士を反応させて得られたものである、項１に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項３、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルが、多糖部分、疎水性部分及び架橋性部分を含む、項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項４、多糖部分が、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンまたは水溶性セルロースである、項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項５、疎水性部分が炭素数8～50の炭化水素基またはステリル基を含む、項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項６、疎水性部分がコレステリル基を含む、項５に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項７、架橋性部分がアクリロイル、メタアクリロイル、ビニル及びアリルから選択される少なくとも１種の架橋性基を含む、項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項８、架橋剤がメルカプトエチルポリエチレングリコール化合物である、項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項９、架橋剤がチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドとポリエチレングリコール化合物との縮合物である、項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項１０、核酸、薬物及びタンパク質から選択される少なくとも１種を担持する、項１～９のいずれか１項に記載の疎水化多糖ナノゲル。
　項１１、（１）（i）架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル、架橋剤及び界面活性剤、又は、
（ii）架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル及び界面活性剤を、水及び油相成分を含む溶媒中で混合してW/0型エマルションを調製する工程、並びに、
（２）得られたW/0型エマルションの架橋反応を行い粒子径が1～100マイクロメートルである架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を得る工程を含む、項１～９のいずれか１項に記載の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の製造方法。
　項１２、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルが、多糖部分、疎水性部分及び架橋性部分を含む、項１１に記載の製造方法。
　項１３、多糖部分が、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンまたは水溶性セルロースである、項１２に記載の製造方法。
　項１４、疎水性部分が炭素数8～50の炭化水素基またはステリル基を含む、項１２に記載の製造方法。
　項１５、疎水性部分がコレステリル基を含む、項１４に記載の製造方法。
　項１６、架橋性部分がアクリロイル、メタアクリロイル、ビニル及びアリルから選択される少なくとも１種の架橋性基を含む、項１２に記載の製造方法。
　項１７、架橋剤がメルカプトエチルポリエチレングリコール化合物である、項１１に記載の製造方法。
　項１８、架橋剤がチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドとポリエチレングリコール化合物との縮合物である、項１１に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
　項１９、工程（１）において、さらに核酸、薬物及びタンパク質から選択される少なくとも１種を添加することを特徴とする、項１１～１８のいずれか１項に記載の製造方法。
　本発明によって得られる架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は、医薬品の徐放担体として利用できる。また架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子のサイズの違いによって、徐放速度の制御が可能である。また従来技術によって得られるナノゲル架橋ゲルでは、医薬品がナノゲルと複合化しなければ封入できないが、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子への封入では、必ずしも医薬品がナノゲルと複合化する必要は無いため、利用可能な医薬品の範囲が広がる。ここでの医薬品とは、タンパク質医薬だけでなく、低分子医薬や核酸など、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子中に封入可能であるものを指す。また本プロセスを複数回行うことによって、内部に架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を封入したゲル粒子の調製が可能であり、多種類の医薬品の時間差徐放も可能である。
図１は、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製方法である。 図２は、W/Oエマルションの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図３は、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を水中に分散したものの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図４は、サイズの大きい架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を水中に分散したものの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図５は、光重合によって架橋剤を用いずに調製した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を水中に分散したものの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図６は、Cy5-OVAを封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を水中に分散したものの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。赤色（左）はローダミン由来の蛍光であり、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を表す。緑色（左から２番目）はCy5由来の蛍光であり、Cy5-OVAを表す。 図７は、IgG抗体を封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子中からリリースされたIgG抗体の量である。 図８は、IgG抗体を封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子（ローダミンラベル化）をマウスの腹部に皮下注射（s.c.）して、３週間（Sample #1）および２週間（Sample #2）経過後のマウスの皮膚の様子である。 図９は、IgG抗体を封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子をマウスの腹部に皮下注射した後の、血中のIgG抗体濃度である。 図１０は、階層的に架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を水中に分散したものの共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。赤色（左端）はCy5由来の蛍光であり、Cy5-OVAを表す。緑色（左から２番目）はFITC由来の蛍光であり、FITC-BSAを表す。 図１１は、FITC-DOPEを表面に修飾した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。緑（左図、FITC-DOPE）はフルオレセイン由来の蛍光であり、FITC-DOPEを表す。赤色（中央図、CHPOA-Rh）はローダミン由来の蛍光であり、ナノゲル架橋ゲルを表す。 図１２は、システイン（Cys）をリンカーとして用いて調製した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子（左、In PBS（PBS緩衝液中））と、これらをマウス皮下に投与して1週間後の皮膚（右、In skin）の共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図１３は、ペプチド（KGPLGIAGQC）をリンカーとして用いて調製した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子（左（PBS緩衝液中））と、これをマウス皮下に投与して1週間後の皮膚（右）の共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）である。 図１４、Cysをリンカーとして用いて調製した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とペプチド（GRC）をリンカーとして用いて調製した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の分解性を示す図である。
　図２～６及び図１０～１３に示す共焦点顕微鏡観察写真（断面写真）については、色彩反転画像（Color inverted image）を併せて示す。
　１つの実施形態において、本発明は、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を提供するものである。本発明の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は、基盤化合物である疎水化多糖ナノゲルが、後述の架橋性部分に由来する部分を介して架橋された構造を有する粒子である。
　本発明の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子（以下、「架橋粒子」と記載する場合もある。）は、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルを界面活性剤の存在下で撹拌してW/O（water-in-oil）エマルションを形成し、含有成分をこのW/Oエマルション状態で反応させることにより、所定の粒子径を有する粒子として得ることができる。任意に、さらに必要に応じて架橋剤を含めて、W/Oエマルションを形成することもできる。
　架橋粒子の粒子径は、W/Oエマルションの粒子径に依存し、所定の粒子径の粒子が得られるようにW/Oエマルションの粒子径を調整する。W/Oエマルションの粒子径は、混合液の撹拌の条件、界面活性剤の種類と濃度などにより調整することができ、エクストルーダーを通してW/Oエマルションの粒子径を調整することもできる。エマルションの調製は、超音波の照射により行うこともできる。
　なお、W/Oエマルションの粒子径は、W/Oエマルションにおける水相（水性液滴）の粒子径を指す。
　W/Oエマルションは、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル、界面活性剤、水及び油相成分を含む混合液を撹拌することにより得ることができる。ここで、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル及び水が、水相成分に含まれる。混合液中には、任意で架橋剤を含めることができる。撹拌は、ホモジナイザー、羽根つき撹拌装置などのエマルションの製造に通常使用される撹拌装置を広く使用することができる。撹拌の条件は、最終的に得られる粒子の平均粒径が1～100マイクロメートル、好ましくは5～50マイクロメートル、より好ましくは5～10または40～50マイクロメートルになるように適宜設定される。
　本明細書において、粒径（直径）は、例えば、動的光散乱法（DLS、Dynamic light scattering）により測定をすることができる。
　W/Oエマルションの油相成分としては、ベンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサンなどの脂肪族又は脂環式炭化水素、クロロホルム、塩化メチレンなどのハロゲン化炭化水素、酢酸エチルなどのエステル類などの溶媒、ミネラルオイル、流動パラフィンなどが挙げられる。
　架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル、架橋剤（存在下又は非存在下）、界面活性剤、水及び油相成分からなるW/Oエマルション100重量部において各成分は、
＊架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルは0.03～0.99重量部、好ましくは0.03～0.3重量部、より好ましくは0.03～0.06重量部、
＊架橋剤は0～3.3重量部、好ましくは0～1重量部、より好ましくは0～0.2重量部、
＊界面活性剤は6.6～9.9重量部、好ましくは9～9.9重量部、より好ましくは9.8～9.9重量部、
＊水は0.87～28.71重量部、好ましくは0.87～8.7重量部、より好ましくは0.87～1.74重量部使用する。
　油相成分は、W/Oエマルション100重量部に対し59.4～89.9重量部、好ましくは81～89.9重量部、より好ましくは88.2～89.9重量部使用する。
　エマルション中で架橋を形成するときの温度は、１０～８０℃程度、好ましくは２０～６０℃程度であり、時間は、１分～２４時間程度、好ましくは５分～１２時間程度である。
　上記エマルションは、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルと架橋剤（任意成分）を界面活性剤の存在下で撹拌してW/Oエマルションを形成し、得ることができる。架橋剤を用いる場合においてナノゲルと架橋剤の反応性が高い場合には、低温（15～25℃程度）から反応を開始することによって、反応を遅くすることができるため、目的の大きさのエマルションを得ることができる。
　架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルは、多糖部分、疎水性部分、架橋性部分を有しており、疎水性部分は疎水性基とリンカー基から構成され、架橋性部分は架橋性基とリンカー基から構成される。疎水性基及び架橋性基は、直接或いは適当なリンカー基を介して多糖部分に連結されている。
　多糖部分は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトースなどの１種または２種以上の単糖分子が、２分子以上結合したものであればよい。多糖部分は、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、カルボキシメチルなどの修飾基を有していてもよい。多糖部分としては、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカン、水溶性セルロースなどが挙げられる。中でも、α－グルコースからなるホモ多糖であるプルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストランなどが好ましく、プルランが特に好ましい。多糖部分は、１種単独の多糖であってもよく、２種以上の多糖の組み合わせであってもよい。
　疎水性部分は、炭素数8～50の炭化水素基（炭素数12～50であってもよい。）、ステリル基などの疎水性基と必要に応じて含まれるリンカー基から構成される。疎水性基としてはステリル基が好ましく、特にコレステリル基が好ましい。架橋性部分は、上記の架橋性基と必要に応じてリンカー基を含む。
　架橋性基（重合性基と換言することができる。）は、複数の架橋性基間（1つの態様においては、２つの架橋性基間。）で化学結合を形成できる基であれば、特に限定されない。架橋性基は、他の架橋性基と直接化学結合を形成できる基であっても、架橋剤を介して化学結合を形成できる基であってもよい。本発明の好ましい態様の１つにおいては、架橋性基はチオール基と反応する基であり、具体例としては（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、マレイミドなどのα、β-不飽和カルボニル部分を有する基が挙げられる。別の態様において、ビニル、アリルなどの前記以外の重合性不飽和基も、架橋性基として例示される。
　なお、本明細書において、（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸およびメタクリル酸を表し、（メタ）アクリル酸エステルとは、アクリル酸エステルおよびメタクリル酸エステルを表す。
　疎水性基又は架橋性基と、多糖部分との連結を任意に中断するリンカー基としては、エステル結合（－ＣＯＯ－または－Ｏ－ＣＯ－）、エーテル基（－Ｏ－）、アミド基（－ＣＯＮＨ－または－ＮＨＣＯ－）、ウレタン結合（－ＮＨＣＯＯ－または－ＯＣＯＮＨ－）が挙げられ、これらが１個または複数個組み合わせられ、必要に応じて炭素数１～１０のアルキレン基、アリーレン基、アラルキレン基（ベンジレン基、フェネチレン基など）がさらに組み合わせられてもよい。
　疎水性部分は、重量比で多糖部分の０．１～２０％程度、好ましくは０．３～１５％程度、より好ましくは０．５～１０％程度、特に１～５％程度である。
　架橋性部分は、重量比で多糖部分の1～50％程度、好ましくは15～30％程度、より好ましくは20～30％程度、特に20～25％程度である。
　架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルは、例えば、公知の疎水性多糖ナノゲルに架橋性部分を導入することで製造することができる。
　疎水化多糖ナノゲルは、多糖部分及び疎水性部分からなる。多糖部分及び疎水性部分の具体例については、前述のとおりである。疎水化多糖ナノゲルにおいて、多糖部分100単糖あたり整数値に限定されない1～5個より好ましくは1～3個の疎水性部分が導入されていることが好ましい。
　疎水化多糖ナノゲルは、例えば国際公開公報WO00/012564号に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、炭素数8～50（または、炭素数12～50。）の水酸基含有炭化水素またはステロールと、OCN-R1-NCO（式中、R1は炭素数1～50の炭化水素基である。）で表されるジイソシアネート化合物を反応させて、炭素数12～50の水酸基含有炭化水素またはコレステロールが1分子反応したイソシアネート基含有疎水性化合物を製造する第１段階反応、及び、前記第１段階反応で得られたイソシアネート基含有疎水性化合物と多糖類とをさらに反応させて、疎水性基として炭素数8～50の炭化水素基またはステリル基を含有するを製造する第２反応工程を含む方法が挙げられる。この場合、第２段階反応の反応生成物をケトン系溶媒で精製して、高純度の疎水性基含有多糖類（疎水性多糖ナノゲル）の製造することができる。
　無論、疎水化多糖ナノゲルは市販品を用いてもよい。例えば、コレステリル化プルランは日油株式会社から購入することができる。
　好適な疎水化多糖ナノゲルは、コレステリル化プルラン（CHP、例えばプルランの100単糖あたりコレステリル基が1～10個、好ましくは1～数個導入された、分子量20,000～200,000程度もの。）である。コレステリル基は、リンカー基（好ましくは、ウレタン結合）を介してプルランに導入されている。
　疎水性多糖ナノゲルへの架橋性部分の導入は、公知の方法により行うことができる。例えば、特許文献１又は非特許文献１に記載の方法に準じて架橋性部分の導入をすることができる。具体的には、溶媒中（例えば、DMSO中。）で疎水性多糖ナノゲルにイソシアネートをもつ架橋性分子を有機金属触媒存在下で反応させる方法が挙げられる。具体的な条件の一例は、実施例に記載するとおりである。
　界面活性剤は、W/Oエマルションを形成できるものであれば特に限定されず、カチオン性、アニオン性、両性、非イオン性の各界面活性剤を挙げることができ、特に制限は無いが、非イオン性界面活性剤が好ましい。
　界面活性剤としては、リン脂質、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合リシノレイン酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルなどが挙げられる。より好ましくは、リン脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルである。界面活性剤は単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　本発明に用いられるリン脂質としては、大豆レシチン、卵黄レシチン、大豆レシチン水素添加物、卵黄レシチン水素添加物、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールが挙げられる。
　本発明に用いられるグリセリン脂肪酸エステルとしては、グリセリンと、炭素数８～１８の脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、およびリノール酸とのエステルが挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルの好ましい例としては、グリセリンモノオレイン酸エステル、グリセリンモノステアリン酸エステル、グリセリンモノパルミチン酸エステル、グリセリンモノミリスチン酸エステル、グリセリンモノラウリン酸エステル等が挙げられる。
　本発明に用いられるポリグリセリン脂肪酸エステルとしては、平均重合度が２以上、好ましくは６～１５、より好ましくは８～１０のポリグリセリンと、炭素数８～１８の脂肪酸、例えばカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、およびリノール酸とのエステルが挙げられる。ポリグリセリン脂肪酸エステルの好ましい例としては、ヘキサグリセリンモノオレイン酸エステル、ヘキサグリセリンモノステアリン酸エステル、ヘキサグリセリンモノパルミチン酸エステル、ヘキサグリセリンモノミリスチン酸エステル、ヘキサグリセリンモノラウリン酸エステル、デカグリセリンモノオレイン酸エステル、デカグリセリンモノステアリン酸エステル、デカグリセリンモノパルミチン酸エステル、デカグリセリンモノミリスチン酸エステル、デカグリセリンモノラウリン酸エステル等が挙げられる。
　本発明に用いられるソルビタン脂肪酸エステルとしては、脂肪酸の炭素数が８以上のものが好ましく、１２以上のものがより好ましい。ソルビタン脂肪酸エステルの好ましい例としては、モノカプリル酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、セキステアリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、イソステアリン酸ソルビタン、セスキイソステアリン酸ソルビタン、オレイン酸ソルビタン、セスキオレイン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
　本発明に用いられる、ショ糖脂肪酸エステルとしては、脂肪酸の炭素数が１２以上のものが好ましく、１２～２０のものがより好ましい。ショ糖脂肪酸エステルの好ましい例としては、ショ糖ジオレイン酸エステル、ショ糖ジステアリン酸エステル、ショ糖ジパルミチン酸エステル、ショ糖ジミリスチン酸エステル、ショ糖ジラウリン酸エステル、ショ糖モノオレイン酸エステル、ショ糖モノステアリン酸エステル、ショ糖モノパルミチン酸エステル、ショ糖モノミリスチン酸エステル、ショ糖モノラウリン酸エステル等が挙げられ、これらの中でも、ショ糖モノオレイン酸エステル、ショ糖モノステアリン酸エステル、ショ糖モノパルミチン酸エステル、ショ糖モノミリスチン酸エステル、ショ糖モノラウリン酸エステルがより好ましい。
　本発明に用いられるポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルとしては、脂肪酸の炭素数が８以上のものが好ましく、１２以上のものがより好ましい。またポリオキシエチレンのエチレンオキサイドの長さ（付加モル数）としては、２～１００が好ましく、４～５０がより好ましい。
　ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの好ましい例としては、ポリオキシエチレンモノカプリル酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノラウリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンモノステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセキステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレントリステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンイソステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセスキイソステアリン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンセスキオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレントリオレイン酸ソルビタン等が挙げられる。
　W/Oエマルションを得るために任意に用いることができる架橋剤は、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルの架橋性基に応じて必要なものを用いることができる。本発明の好ましい態様の1つにおいては、架橋剤は２つ以上のチオール基（－ＳＨ）を含む。チオール基は、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルの架橋性基と反応して架橋を形成することができる。特に、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルの架橋性基が（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、マレイミドなどのα、β-不飽和カルボニル部分を有する基などである場合に、２つ以上のチオール基を含む架橋剤を用いることが好ましい。
　２つ以上のチオール基を含む架橋剤の1つの態様としては、直鎖又は分岐のポリエチレングリコール鎖であって、２以上の末端がチオール基（－ＳＨ基）である化合物が含まれる。その分子量は特に限定されるものではないが、1,000～100,000程度、好ましくは2,000～10,000程度である。
　このような架橋剤として、例えば、メルカプトエチルポリエチレングリコール化合物（メルカプトエチルポリエチレングリコール誘導体）を使用することができる。メルカプトエチルポリエチレングリコール化合物（メルカプトエチルポリエチレングリコール誘導体）には、ＰＥＧ－ジチオール（ＨＳ－ＰＥＧ－ＳＨ）の他、３個のアームを有するＰＥＧ－トリチオール（グリセリン核）、４個のアームを有するＰＥＧ－テトラチオール（ペンタエリスリトール核）、または８個のアームを有するＰＥＧ－オクタチオール（ヘキサグリセリン核）などの複数のアームを有するメルカプトエチルポリエチレングリコール化合物（メルカプトエチルポリエチレングリコール誘導体）が含まれる。前述の複数のアームを有するＰＥＧ試薬は、すべてに満たない数の、チオールで官能化されたアームを有することもできる。
　架橋剤の別の態様として、システイン若しくはホモシステインの様なチオール基を含有するアミノ酸（「チオール基含有アミノ酸」という）、又はチオール基含有アミノ酸残基を有するペプチドとポリエチレングリコール化合物（ポリエチレングリコール誘導体）との縮合物（コンジュゲート）が挙げられる。該縮合物は、直鎖又は分岐のポリエチレングリコール鎖とその末端に２以上のチオール基を有する化合物であって、該チオール基の少なくとも一部が、チオール基含有アミノ酸又はチオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドに由来するものである。なお、チオール基含有アミノ酸としてはシステイン、ホモシステインなどが例示され、中でもシステインが好ましい。チオール基含有アミノ酸残基を有するペプチドとしては、システイン残基を有するペプチドが好ましい。
　上記縮合物は、ポリエチレングリコール鎖と末端のチオール基との間が、チオール基含有アミノ酸残基又はチオール含有アミノ酸残基を含むペプチド鎖によって中継されている。すなわち、これらアミノ酸残基またはペプチド鎖はリンカーとして使用されている。
　上記の縮合物（コンジュゲート）は、直鎖又は分岐のポリエチレングリコール（分子量：1,000～100,000程度、好ましくは2,000～10,000程度）の活性エステルとチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有アミノ酸残基含むペプチドとを反応させることにより得ることができる。
　直鎖又は分岐のポリエチレングリコールの上記活性エステルには、前記のメルカプトエチルポリエチレングリコール化合物の骨格と同様の直鎖又は分岐のポリエチレングリコール骨格の末端に少なくとも２つの－ＣＯＯＨ基を有するポリエチレングリコール化合物の-ＣＯＯＨに於ける活性エステル（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、p-ニトロフェニルエステル）を使用することができる。
　以下に、分岐ポリエチレングリコールのＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（PEGNHS）を用いて縮合物（コンジュゲート）を製造する工程の一例を示す。下式は、PEGNHS（A）とチオール基含有アミノ酸残基を含むペプチド（B）とを反応させて、チオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドとポリエチレングリコール化合物との縮合物（C）を製造する工程を示すものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　具体的な反応条件の一例は、実施例に示すとおりである。
　チオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、チオール基含有アミノ酸残基をこのペプチドのＮ末端、Ｃ末端、またはこれら末端以外のいずれの位置に有していてもよいが、チオール基含有アミノ酸残基をＣ末端に有しているペプチドであることが好ましい。該ペプチドのアミノ酸残基数は、好ましくは１～５０残基程度、好ましくは１～１０残基程度である。
　システイン残基を含むペプチドの具体例としては、そのアミノ酸配列がＧＲＣ、ＫＧＰＬＧＩＡＧＱＣで（配列番号１）あるものが例示される。
　架橋剤として、システイン残基を含むペプチドを含む架橋剤を用いることで、該ペプチドに由来する種々の性能を付与することができる。例えばペプチドがＧＲＣである場合、架橋粒子には分解性が付与される。
　さらに他の架橋剤としては、スペーサーとしてPEG基を有していてもよい芳香族多価チオール、ジメルカプトコハク酸、２，３－ジメルカプト－１－プロパンスルホン酸、チオール官能化デキストラン、およびチオール官能化ヒアルロン酸が含まれる。
　上記は、架橋剤がチオール基（－ＳＨ基）を有するポリエチレングリコール誘導体等であり、架橋性基が（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、マレイミドなどのα、β－不飽和カルボニル部分を有する基の組み合わせを例示しているが、架橋剤を（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、マレイミドなどのα、β－不飽和カルボニル部分を有する化合物とし、架橋性基をチオール基（－ＳＨ基）としてもよい。
　W/Oエマルションを得る際に架橋剤を用いない場合、すなわち、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル同士を反応させる場合、必要に応じて、重合開始剤をW/Oエマルションにさらに含めることができる。必要な重合開始剤は適宜選択することができるが、例えば架橋性基が（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸アミド、マレイミドなどのα、β－不飽和カルボニル部分を有する基、又は、ビニル、アリルなどのその他の重合性不飽和基である場合、重合開始剤としてラジカル重合開始剤、特に光重合開始剤が好ましい。
　光重合開始剤は、光等のエネルギー線を吸収してラジカルを発生するものであれば、特に限定されるものではない。例えば、α-ヒドロキシアルキルフェノンなどのアルキルフェノン系光重合開始剤、アシルフォスフィンオキサイド系光重合開始剤、チタノセン系光重合開始剤などが例示される。光重合開始剤は、Irgacure2959（アルキルフェノン系光重合開始剤、BASFジャパン社製）市販品を使用することができる。
　上記W/Oエマルションにおける重合開始剤の含有量は適宜設定することができる。例えば、上記W/Oエマルション100重量部に対し、0～5重量部、好ましくは0～1重量部、より好ましくは0～0.5重量部使用することができる。
　重合開始剤は、１種のみで使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本発明の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は、さらに上記に例示した以外の修飾を有していてもよい。修飾は本発明の効果を損なわない範囲であれば特に限定されず、具体例としては、蛍光標識が例示される。
　蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセインなどの蛍光色素が例示される。
　このような修飾の導入方法としては、（i）架橋粒子の形成前に上記架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルに修飾を導入する方法、（ii）架橋粒子の形成後に修飾を導入する方法が挙げられる。
　（i）の場合には、得られる架橋粒子の全体が修飾を有する。（i）の具体例としては、フルオレセンイソチアネート（fluorescein-5-isothiocyanate、FITC）、ローダミンイソチアネート（rhodamine isothiocyanate、RITC））などのイソシアネート基含有化合物を用いて、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルに修飾を導入する方法が例示される。具体的な方法は、疎水性多糖ナノゲルへ架橋性部分を導入する方法に準じて行うことができる。
　（ii）の場合には、得られる架橋粒子の表面が修飾を有する。（ii）の具体例としては、修飾を有する薄膜で架橋粒子を被覆する方法が挙げられる。修飾を有する薄膜は、例えばFITCラベル化ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（FITC-DOPE）などの修飾を有する脂質（例えば、リン脂質。）を用いて作製することができる。
　本発明の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルと架橋剤（任意成分）と界面活性剤を水と油相成分を含む溶媒中で混合してW/0型エマルションを調製する工程、得られたW/0型エマルションの架橋反応を行う工程を含む製造法により製造され、粒子径が1～100マイクロメートルである架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が得られる。架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の粒子径は、好ましくは5～50マイクロメートル、より好ましくは5～10または40～50マイクロメートルである。
　W/0型エマルションを構成する水相の粒子径は、1～100マイクロメートル程度、好ましくは5～50マイクロメートル、より好ましくは5～10または40～50マイクロメートルである。W/0型エマルションの水相粒子が溶剤などの油相成分を含まない場合、W/0型エマルションの粒子径と架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の粒子径は同様な値になるか、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の粒子径がやや小さくなる。W/0型エマルションの水相粒子が架橋に関与しない油相成分を含む場合、W/0型エマルションの粒子径よりも架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の粒子径が小さくなるため、W/0型エマルションの粒子径をやや大きくなるように調製する。
　架橋反応を２回以上行うことで、複数の層を有する粒子を得ることができる。例えば本発明の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子について、さらに架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルと架橋剤（任意成分）をW/Oエマルションを形成させる条件下で反応させることにより、複数の層を有する粒子を得ることができる。例えば、最初の粒子に第１の薬物を内包し、該粒子を覆う第２の被覆層に第２の薬物を内包させれば、第１の薬物と第２の薬物を異なる速度で放出することができる。
　本発明の態様の1つにおいて、本発明の架橋粒子は、核酸、タンパク質、薬物などの生理活性物質を担持する。核酸、タンパク質、薬物などの生理活性物質は、本発明の架橋粒子が内包するものであってもよい。
　薬物（薬剤）は任意の薬物が使用され特に限定されないが、例えば、抗腫瘍剤、抗高血圧剤、抗低血圧剤、抗精神病剤、鎮痛剤、抗鬱剤、抗躁剤、抗不安剤、鎮静剤、催眠剤、抗癲癇剤、オピオイドアゴニスト、喘息治療剤、麻酔剤、抗不整脈剤、関節炎治療剤、鎮痙剤、ＡＣＥインヒビター、鬱血除去剤、抗生物質、抗狭心症剤、利尿剤、抗パーキンソン病剤、気管支拡張剤、抗利尿剤、利尿剤、抗高脂血症剤、免疫抑制剤、免疫調節剤、制吐剤、抗感染症剤、抗新生物剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、解熱剤、抗痛風剤、抗ヒスタミン剤、止痒剤、骨調節剤、心血管剤、コレステロール低下剤、抗マラリア剤、鎮咳剤、去痰剤、粘液溶解剤、鼻詰り用薬剤、ドパミン作動剤、消化管用薬剤、筋弛緩剤、神経筋遮断剤、副交感神経作動剤、プロスタグランジン、興奮薬、食欲抑制剤、甲状腺剤又は抗甲状腺剤、ホルモン、抗偏頭痛剤、抗肥満剤、抗炎症剤などとして作用し得るものが挙げられる。好ましい薬物は抗腫瘍剤である。抗腫瘍剤としては、ホルモン療法剤（例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセリン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、アリルエストレノール、ゲストリノン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェンなど）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ－ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害薬（例、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、抗アンドロゲン（例、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミドなど）、５α－レダクターゼ阻害薬（例、フィナステリド、エプリステリドなど）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）、アンドロゲン合成阻害薬（例、アビラテロンなど）、レチノイドおよびレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例、リアロゾールなど）などが挙げられ、なかでもＬＨ－ＲＨアゴニスト（例、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど））、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード－Ｎ－オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、カルボコン、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン）、代謝拮抗剤（例えば、メルカプトプリン、６－メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５－ＦＵ系薬剤（例、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフールなど）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン）、抗癌性抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン）、植物由来抗癌剤（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビン、カンプトテシン、塩酸イリノテカン）、免疫療法剤（ＢＲＭ）（例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール）、細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤（例えば、トラスツズマブ（ハーセプチン（商標）；抗ＨＥＲ２抗体）、ＺＤ１８３９（イレッサ）、グリーベック（ＧＬＥＥＶＥＣ）などの抗体医薬）が挙げられる。抗腫瘍剤の対象となる癌の種類としては、結腸・直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、頭頸部癌、食道癌、胃癌、胆道癌、胆のう・胆管癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頚癌、子宮体癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣腫瘍、骨・軟部肉腫、白血病、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、皮膚癌、脳腫瘍等が挙げられ、好ましくは結腸・直腸癌、胃癌、頭頸部癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、胆道癌、肝臓癌が挙げられる。
　これらの薬物（薬剤）は、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　核酸としては、特に制限はなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ核酸、ＤＮＡ／ＲＮＡのハイブリッド等いかなるものであってもよい。また、核酸は１～３本鎖のいずれも用いることができるが、好ましくは１本鎖又は２本鎖である。核酸は、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－グリコシドであるその他のタイプのヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のオリゴマー（例えば、市販のペプチド核酸（ＰＮＡ）等）または特殊な結合を含有するその他のオリゴマー（但し、該オリゴマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などであってもよい。さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えば蛋白質（ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチドなど）や糖（例えば、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物（例えば、アクリジン、プソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。好ましい核酸としては、ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡやｓｈＲＮＡなどその前駆体が挙げられる。
　ｓｉＲＮＡとは、標的遺伝子のｍＲＮＡもしくは初期転写産物のヌクレオチド配列又はその部分配列（好ましくはコード領域内）（初期転写産物の場合はイントロン部分を含む）に相同なヌクレオチド配列とその相補鎖からなる二本鎖オリゴＲＮＡである。ｓｉＲＮＡに含まれる、標的ヌクレオチド配列と相同な部分の長さは、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基前後（代表的には約２１～２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。また、ｓｉＲＮＡの全長も、通常、約１８塩基以上、例えば約２０塩基前後（代表的には約２１～２３塩基長）の長さであるが、ＲＮＡ干渉を引き起こすことが出来る限り、特に限定されない。
　標的ヌクレオチド配列と、ｓｉＲＮＡに含まれるそれに相同な配列との関係については、１００％一致していてもよいし、塩基の変異があってもよい（少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％以上の同一性の範囲内であり得る）。
　ｓｉＲＮＡは、５’又は３’末端に５塩基以下、好ましくは２塩基からなる、塩基対を形成しない、付加的な塩基を有していてもよい。該付加的塩基は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよいが、ＤＮＡを用いるとｓｉＲＮＡの安定性を向上させることができる。このような付加的塩基の配列としては、例えばug-3’、uu-3’、tg-3’、tt-3’、ggg-3’、guuu-3’、gttt-3’、ttttt-3’、uuuuu-3’等の配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　ｓｉＲＮＡは任意の標的遺伝子に対するものであってよいが、本発明の核酸導入剤を疾患の予防・治療剤として用いる場合には、エキソソーム中に封入されるｓｉＲＮＡは、その発現亢進が対象疾患の発症および／または増悪に関与する遺伝子を標的とするものであることが好ましく、より具体的には、その遺伝子に対するアンチセンス核酸が、臨床もしくは前臨床段階に進んでいる遺伝子や新たに知られた遺伝子を標的とするもの等が挙げられる。
　ｓｉＲＮＡは、１種のみで使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　タンパク質としては、酵素、受容体、抗体、抗原、インターフェロン、インターロイキンなどのサイトカインなどが挙げられる。
　これらのタンパク質、核酸、薬物などの生理活性物質は１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
　タンパク質、薬物などの生理活性物質を担持する架橋粒子は、生理活性物質を架橋反応を行うW/0型エマルションに含めることで製造することができる。生理活性物質の含有割合は、生理活性物質を担持させる目的に応じて適宜設定することができる。例えば、上記W/Oエマルション100重量部に対し、0～5重量部、好ましくは0～1重量部、より好ましくは0～0.5重量部使用することができる。
　本発明の架橋粒子が核酸、タンパク質、薬物などの生理活性物質を担持する場合、該架橋粒子は、生理活性物質を生体へ導入するための担体（導入剤と換言することができる。）として好適に使用することができる。好ましい態様においては、担持する生理活性物質を徐々に放出する（すなわち、徐放性の効果を奏する。）。
　生理活性物質が導入される対象は、細胞であっても生体であってもよい。対象となる細胞としては、ヒト由来若しくはマウスなどの非ヒト動物由来の細胞、特に培養細胞が挙げられる。対象となる生体としては、ヒト；サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマなどの哺乳類、ニワトリなど鳥類、魚類等の非ヒト動物が挙げられる。
　生理活性物質などが導入される対象が細胞である場合、生理活性物質を内包する架橋粒子を培地中に適量含ませることで、該物質を細胞へ導入するための担体としてまたは導入剤として用いることができる。
　生理活性物質が導入される対象がヒトなどの生体である場合、注射剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、坐剤などの剤形で用いることが好ましい。この場合、医薬組成物として好適に提供され、通常用いられる適切な担体を用いて各種剤形の導入剤を得ることができる。本発明の導入剤の成人１日あたりの投与量は、導入される生理活性物質に応じて適宜設定することができるが、１日あたり約0.1 mg～1 g程度、好ましくは約0.5 mg ～500 mg程度の範囲から選択することができる。
　本発明はまた、本発明の架橋粒子を用いた生理活性物質を細胞、生体等へ導入する方法をも提供する。
　以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、本発明が実施例に限定されないことはいうまでもない。
　実施例１：架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製
＜実験方法＞
＜試薬＞
　Cholesterol-bearing pullulan（CHP, MW = 1.0 × 105 g/mol, コレステロール置換率1.2）、pentaerythritol tetra(mercaptoethyl) polyoxyethylene（PEGSH, MW = 1.0 × 104 g/mol）、egg yolk phosphatidylcholine（EPC）は日油より、di-n-butyltin (IV) dilaurate（DBTDL）は和光純薬より、2-acryloyloxyethylisocyanate（AOI）は昭和電工より、ovalbumin（OVA）、rhodamine isothiocyanate（RITC）、bovine serum albumin（BSA）はSigmaより、fluorescein-5-isothiocyanate（FITC）はLife Technologyより、cy5 monoreactivedyeはGE Healthcareよりそれぞれ購入した。
＜CHPOA-RhまたはCHPOAの合成＞
　非特許文献１の記載に従い、RITCとAOIを用いて、CHPに対してローダミンとアクリロイル基をそれぞれ修飾した。
　CHPOA（ローダミンをラベルしていないCHPOA）は、下記のとおり合成した。疎水性多糖ナノゲルCHP（2.5 g）を100 mLの脱水dimethyl sulfoxide（DMSO）に溶解し、有機金属触媒DBTDL（595 μL）とイソシアネートをもつ架橋性分子AOI（400 μL）を加え、遮光下、45 ℃で24時間反応させた。反応液をdiethyletherとethanolの混合液で沈殿し、固体をDMSO中に溶解させた。水中で1週間透析（分子量3,500）することによって、溶媒を水に置換し、0.22 μmのフィルターろ過後、凍結乾燥することによってacryloyl group modified CHP（CHPOA）を得た。このCHPOAは100単糖あたりアクリロイル基を21.3個含むことを確認した。
　ローダミンラベル化アクリロイル基修飾CHP（CHPOA－Rh）も同様にして合成した。得られたローダミンラベル化アクリロイル基修飾CHP（CHPOA－Rh）は、100単糖あたりローダミンを0.3個、アクリロイル基を20.3個含むことを確認した。またも合成し、
＜架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製＞
　CHPOA-Rhを20 mg/mL、PEGSHを11.7 mg/mL（SH/acryloyl = 1/5）の濃度で純水に溶解させた溶液200 μLと、EPCを1 %（w/w）の濃度でシクロヘキサン中に溶解させた溶液20 gをナス型フラスコでポリトロンホモジナイザーによって攪拌し（20,000 rpm、2分間）、water-in-oil（W/O）エマルションを得た。このエマルションにバス型超音波照射を20分間行い、ゲル化反応を行った。このエマルションに25 g/mL（= 25 %（w/v））のスクロース水溶液40 mLを加え、ポリトロンホモジナイザーによって攪拌し（20,000 rpm、2分間）、water-in-oil-in-water（W/O/W）エマルションを得た。このエマルションを凍結乾燥後、適量のPBSを加え、バス型超音波照射を20分間行った。さらに適量のPBSを加えることでスクロース濃度を20 g/mL（= 20 %（w/v））とし、ショ糖密度遠心分離（10,000×g, 20 min， 20℃）を2回行い、EPCの除去と架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の濃縮を行った。
　ゲル化反応後のW/Oエマルションの様子を共焦点顕微鏡によって観察すると、W/Oエマルションに存在する水相中にCHPOA-Rh由来の蛍光が観測された（図２参照）。
　次にW/Oエマルションにスクロース水溶液を添加して得たW/O/Wエマルションを凍結乾燥し、得られた固体を純水中に分散した様子を共焦点顕微鏡で観察すると、球形を保っていた。
　凍結乾燥を行うことで、有機溶媒に晒される時間を短くし、内封されるタンパク質医薬などの有効成分の活性低下を回避することができる。凍結乾燥を行うことで、抗体の活性低下がないことは本発明者により確認されている。凍結乾燥を行う場合、スクロースなどの凝集防止剤を加えることが好ましい。
　系中に含まれるEPCを除くため、ショ糖密度遠心分離を試みた。遠心分離後、EPCは上清に、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は沈殿として得られることから、沈殿物である架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を回収することで、EPCの除去ならびに架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の濃縮に成功した（図３参照）。
　ショ糖密度遠心分離によるEPCの除去は、EPCによる生体毒性は低いため任意であるが、他の毒性のある界面活性剤を使用するときは除去するのが好ましい。
＜サイズのコントロール＞
　上記の方法で、ポリトロンホモジナイザーを用いずに、ボルテックスミキサーとバス型超音波照射を行うことで、W/Oエマルションを調製後、上記と同様の方法にて、凍結乾燥およびEPCの除去を行った。この方法によって得られた架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を共焦点顕微鏡で観察すると、直径が30～100μmの架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が確認された（図４参照）。
＜架橋剤を用いない方法＞
　上記の方法で、CHPOA-RhナノゲルとIrgacure2959のみを水相に含むW/Oエマルションを調製後、365 nmの紫外光を照射することによってCHPOA-Rhナノゲルの光重合を行い、上記と同様の方法にて、凍結乾燥およびEPCの除去を行った。この方法によって得られた架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を共焦点顕微鏡で観察すると、直径が10 μm程度の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が確認された（図５参照）。
＜タンパク質・抗体の封入＞
　cy5-monoreactive dye packを用いて、0.1 M炭酸緩衝液（pH 9.3）中で、モデルタンパク質である卵白アルブミン（OVA）にCy5をラベル化し、Cy5ラベル化OVA（Cy5-OVA）を調製した。
　上記の方法で、W/Oエマルションの水相中にCy5-OVAを添加し、CHPOA-RhとPEGSHを用いて直径約10 μmの架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を調製した。共焦点顕微鏡観察の結果より、Cy5-OVAは架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の内部に封入できることを確認した（図６参照）。
　Cy5-OVAと同様の方法によって、モデルIgG抗体（anti-OVA antibody from rabbit, ROCKLAND）を封入した直径約10 μmの架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を調製した。ゲル化時のCHPOA-Rh濃度は、20 mg/mL（Sample #1）と、15 mg/mL（Sample #2）の2種類を調製した。
　6週齢のBALB/cマウス（雄、体重：20～24 g）を清水実験材料より購入した。マウスの剃毛した腹部に、IgG抗体を封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子のPBS溶液を50 μL皮下投与した。経時時間後に血清を採取した(表1)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　Sample #1とSample #2のPBS中へのIgG抗体のリリースを評価した。Sample #1とSample #2を37℃でインキュベートし、経時時間後、遠心（37℃、10,000 G、20分）を行い、上清を回収後、当量の新たなPBSを添加し、再び37℃でインキュベートした。
　血清およびリリース実験後の上清中のIgG抗体濃度を以下のenzyme linked immune-sorbent assay（ELISA）によって測定した。96 well maxisorp nunc-immuno plateに10 mg/mLのOVA（in water）を100 μL/wellで添加し、4℃で一晩インキュベートした。0.1 % PBSTで洗浄した（200 μL/well × 5 times）。2 % BSA（in PBS）を200 μL/wellで添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.1 % PBSTで洗浄した（200 μL/well × 5 times）。サンプルを2 % BSA（in PBS）で50倍以上に希釈し、20 μL/wellで添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.1 % PBSTで洗浄した（200 μL/well × 5 times）。HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody（from goat, polyclonal）を2 % BSA（in PBS）で5万倍に希釈したものを50 μL/wellで添加し、37℃で2時間インキュベートした。0.1 % PBSTで洗浄した（200 μL/well × 5 times）。Sigma TMB Liquid Substrateを100 μL/wellで添加し、30分後、2 M HClを50 μL/wellで添加し、450 nmにおける吸光度を測定した。
　IgG抗体の放出をELISAで確認するとSample #1と#2はともに徐々にIgG抗体を放出していた。リリースの速度はポリマーの濃度が低いSample #2のほうがやや速かったが、どちらも1週間後のIgG抗体の放出量は仕込みの2 %以下であった。今回のELISAでは、活性（OVA認識能力）をもったウサギ由来のIgG抗体のみを検出していることから、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子中に封入されたIgG抗体は、封入時も放出後も、活性をもっている（OVAを認識できる）ものがあるということが明らかとなった。また架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製法を変えることで、放出されるタンパク質医薬の放出速度を制御できるということも示唆された（図７参照）。
　Sample #1とSample #2を皮下投与し、３週間（Sample #1）および２週間（Sample #2）経過後のマウスの皮膚の様子を観察すると、ゲル化時のポリマー濃度が高いSample #1（CHPOA-Rh: 20 mg/mL）は、３週間後も架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が集まった固まりが皮膚中に残っているのに対し、Sample #2（CHPOA-Rh: 15 mg/mL）では、2週間後に架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の固まりは皮膚から消えていた。Sample #2については皮下投与した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が分解された、あるいは皮膚より深部の体内にデリバリーされたことを意味し、皮膚中に限らず、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を投与した際の体内動態を、制御可能であるということを示唆している（図８参照）。
　血中のIgG抗体濃度を測定すると、Sample #1とSample #2の両方について血中にIgG抗体を検出することができ、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子はIgG抗体を体内へデリバリーするための徐放デバイスとして利用できるということが示唆された。またSample #2とSample #1についてIgG抗体濃度変化が異なることから、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製方法を変更することで、徐放速度の制御も可能であることが確認された（図９参照）。
＜階層的に架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の調製（２種類のタンパク質を封入）＞
　FITCを用いて、0.1 M炭酸緩衝液（pH 9.3）中で、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミン（BSA）にフルオレセインをラベル化し、FITCラベル化BSA（FITC-OVA）を調製した。
　上記と同様にW/Oエマルションの水相中にCy5-OVAを添加し、CHPOAとPEGSHを用いて架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を調製した。さらにW/Oエマルションの水相中にCy5-OVAを封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とFITC-BSAを添加し、CHPOAとPEGSHを用いて架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を調製した。共焦点顕微鏡観察の結果より、Cy5-OVAを封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子がFITC-BSAを封入した架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子によって包まれた、階層的に架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が調製できることを確認した。
　これによって多種類の医薬品の時間差徐放が可能であることが予想できる（図１６参照）。
　実施例２：粒子表面の修飾
　＜試薬＞
FITCラベル化ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescien)、FITC-DOPE）は、Avanti Polar Lipidsより購入した。
＜実験手法＞
　実施例１と同様にして、CHPOA-RhとPEGSHを用いて、ゲル化時のCHPOA-Rhの濃度を20 mg/mL、SH/acryloyl = 1/5として、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を調製し、PBS中でCHPOA-Rhの濃度を1 mg/mLとした。
　その後、1 mgのFITCラベル化ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（FITC-DOPE）をフラスコ中でメタノールに溶かし、乾燥させる事でFITC-DOPEの薄膜を作り、これに上記の架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子1 mLを加え、バス型超音波照射を20分間行った。
　＜共焦点顕微鏡観察＞
　共焦点顕微鏡観察によって、球の中心の強度が大きいCHPOA-Rh由来のローダミンの蛍光と比較して、FITC-DOPE由来のフルオレセインの蛍光は球の縁の強度が大きいことから、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の表面にFITC-DOPEを修飾できたことが確認された（図１１参照）。
　実施例３：機能性リンカーの挿入
＜実験手法＞
　PEGNHS（N-hydroxysuccinimide ester of polyethylene glycol）（4-arm-Functional PEG Series（NHS PEG）、分子量10,000。日油より購入した。（品番：SUNBRIGHT PTE-100CS））を85.7 mg/mL、システインを2.96 mg/mLの濃度で7.4 mMの炭酸緩衝液（pH11）に溶解させ、バス型超音波照射を30分間行った。その後、0.75 Mのリン酸緩衝液（pH7）と、CHPOA-Rhを20 mg/mLとなるように加えた。このときPEGNHSは17.1 mg/mL、システインは0.593 mg/mLの濃度とした。この溶液100 μLと、EPCを2 %（w/w）の濃度でシクロヘキサン中に溶解させた溶液10 gをナス型フラスコでポリトロンホモジナイザーによって攪拌し（20,000 rpm、2分間）、water-in-oil（W/O）エマルションを得た。このエマルションにバス型超音波照射を20分間行い、ゲル化反応を行った。このエマルションに25 g/mL（= 25 %（w/v））のスクロース水溶液20 mLを加え、ポリトロンホモジナイザーによって攪拌し（20,000 rpm、2分間）、water-in-oil-in-water（W/O/W）エマルションを得た。このエマルションを凍結乾燥後、適量のPBSを加え、バス型超音波照射を20分間行った。さらに適量のPBSを加えることでスクロース濃度を20 g/mL（= 20 %（w/v））とし、ショ糖密度遠心分離（10,000×g, 20 min, 20°C）を2回行い、EPCの除去と架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の濃縮を行った。
　同様にして、システインに代えてペプチド（KGPLGIAGQC）を用いて、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を作製した。この場合、pH11の時点で、ペプチドを24.1 mg/mLの濃度で溶解させ、ゲル化の時点では4.82 mg/mLとした。
　さらに、同様にして、システインに代えてペプチド（GRC）を用いて、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を作製した。この場合、全ての反応のpHを7とし、ゲル化の時点の濃度は1.63 mg/mLとした。
＜実験データ＞
Cysとペプチド（KGPLGIAGQC）を用いて作製した場合においては、いずれの場合も直径10マイクロメートルのナノゲル架橋ゲル粒子を調製することができた。さらにこれらをマウス皮下に投与した場合、皮膚内の細胞にCHPOA-Rh由来のローダミンの蛍光が見られ、細胞によって分解されることが確認できた（図１２、図１３参照）。
　Cysとペプチド（GRC）を用いた場合の分解性について比較評価すると、GRCを用いた場合、PBS中で分解性が向上した（図１４参照）。
　架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子は、抗体やサイトカイン、核酸などの多くの医薬品を体内へ投与・徐放するためのデバイスとして利用可能である。

Claims (12)

  1. 粒子径が1～100マイクロメートルである、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子。
  2. 架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子が、架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルと架橋剤を反応させて得られたもの、または架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル同士を反応させて得られたものである、請求項１に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  3. 架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲルが、多糖部分、疎水性部分及び架橋性部分を含む、請求項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  4. 多糖部分が、プルラン、アミロペクチン、アミロース、デキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、マンナン、レバン、イヌリン、キチン、キトサン、キシログルカンまたは水溶性セルロースである、請求項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  5. 疎水性部分が炭素数8～50の炭化水素基またはステリル基を含む、請求項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  6. 疎水性部分がコレステリル基を含む、請求項５に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  7. 架橋性部分がアクリロイル、メタアクリロイル、ビニル及びアリルから選択される少なくとも１種の架橋性基を含む、請求項３に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  8. 架橋剤がメルカプトエチルポリエチレングリコール化合物である、請求項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  9. 架橋剤がチオール基含有アミノ酸又はチオール基含有アミノ酸残基を含むペプチドとポリエチレングリコール化合物との縮合物である、請求項２に記載の疎水化多糖ナノゲル粒子。
  10. 核酸、薬物及びタンパク質から選択される少なくとも１種を担持する、請求項１～９のいずれか１項に記載の疎水化多糖ナノゲル。
  11. （１）（i）架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル、架橋剤及び界面活性剤、又は、
    （ii）架橋性基を有する疎水化多糖ナノゲル及び界面活性剤を、水及び油相成分を含む溶媒中で混合してW/0型エマルションを調製する工程、並びに、
    （２）得られたW/0型エマルションの架橋反応を行い粒子径が1～100マイクロメートルである架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子を得る工程を含む、架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子の製造方法。
  12. 工程（１）において、さらに核酸、薬物及びタンパク質から選択される少なくとも１種を添加することを特徴とする、請求項１１に記載の製造方法。
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