CN115737682A - 一种用于骨关节炎治疗的工程化外泌体靶向缓释体系及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于骨关节炎治疗的工程化外泌体靶向缓释体系及其制备方法与应用，属于生物医用材料领域。该工程化外泌体靶向缓释体系包括靶向修饰的外泌体和巯基化透明质酸，所述巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联形成微凝胶，所述靶向修饰的外泌体利用表面暴露的巯基与巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联，从而固定到所述微凝胶中。本发明通过物理作用将软骨细胞靶向肽修饰到了外泌体表面构建CAP‑EXO，能够更好地靶向软骨细胞；同时，通过将外泌体表面蛋白的巯基暴露，可以构建结合在HA‑SH微凝胶上的外泌体靶向缓释体系，能够增强外泌体在关节部位的持续稳定留存性,在骨关节炎治疗中具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，特别涉及到一种工程化外泌体靶向缓释体系及其制备方法与应用。
背景技术
干细胞来源的外泌体中会高表达的miRNA对与骨关节炎的治疗有较好的促进作用。目前，干细胞来源的外泌体的常见给药方式是通过注射，但外泌体容易在体内扩散，不易在靶区富集，很难保留在软骨缺损部位，另外，外泌体注入体内后不可避免地会发生快速清除，使得这种方法效果大打折扣。
另一方面，软骨病变的再生通常需要相对较长的时间，因此有必要实现干细胞来源的外泌体靶向作用于软骨以及在软骨缺损部位的有效保留，以高效持久地发挥其功能。然而，现有的外泌体给药体系尚无法达到该效果。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明构建了一种用于骨关节炎治疗的工程化外泌体靶向缓释体系，一方面对外泌体进行表面改性可以使外泌体靶向骨关节炎软骨，另一方面通过与HA-SH微凝胶的结合可以实现外泌体的缓释，以此实现外泌体在骨关节部位的靶向递送及长效留存，该工程化外泌体靶向缓释体系在治疗骨关节炎方面展现出明显的优势。
本发明通过以下技术方案来实现：
一种用于骨关节炎治疗的工程化外泌体靶向缓释体系，包括靶向修饰的外泌体和巯基化透明质酸，所述巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联形成微凝胶，所述靶向修饰的外泌体利用表面暴露的巯基与巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联，从而固定到所述微凝胶中。本发明通过物理作用将软骨细胞靶向肽修饰到外泌体表面构建CAP-EXO，能够更好地靶向软骨细胞。同时，通过将外泌体表面蛋白的巯基暴露，可以构建结合在HA-SH微凝胶上的外泌体缓释体系，以提高注射后外泌体在关节部位的留存率。体系中存在的一定未结合的外泌体也可以随着扩散作用尽快释放，成为首先在关节软骨表面的富集的“先头兵”；随后在体内在细胞内分泌的还原性谷胱甘肽的作用下，交联的二硫键逐渐断裂，透明质酸微凝胶逐步降解，从而持续释放结合的外泌体，可以实现外泌体在体内的更长效的缓释，使标靶部位持续保持较高的外泌体浓度从而到达持续的治疗效果。而且通过二硫键的交联使外泌体与透明质酸结合更紧密，可以有效避免外泌体的突释以及被快速清除，从而保证其更高效地在骨关节炎病灶部位富集，以提高疗效。
作为可选方式，在上述工程化外泌体靶向缓释体系中，所述靶向修饰的外泌体包括外泌体和靶向分子，所述靶向分子包括胆固醇头部和靶向基团尾部，所述靶向分子通过胆固醇头部插入到所述外泌体的磷脂双分子层中。
作为可选方式，在上述工程化外泌体靶向缓释体系中，所述靶向分子由胆固醇-PEG-马来酰胺与巯基化的软骨细胞归巢肽(CAP-SH)通过巯基-丙烯酰胺点击化学法合成。
作为可选方式，在上述工程化外泌体靶向缓释体系中，所述外泌体为干细胞来源的外泌体。
本发明还提供了一种上述工程化外泌体靶向缓释体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外泌体的提取；
(2)外泌体的靶向修饰；
(3)靶向修饰的外泌体与巯基化透明质酸混合交联获得载外泌体的微凝胶。
作为可选方式，在上述制备方法中，使用梯度离心法提取外泌体。进一步地，将干细胞(如脐带间充质干细胞)的上清液在4℃下300g离心10min，以去除死细胞；取上清，加入离心管，4℃下2000g离心20min，以去除死细胞及微泡；取上清，4℃下10000g离心30min，以去除细胞碎片，将上清液在4℃下100000g离心70min，弃上清液；将沉淀用PBS重悬，并在4℃下100000g离心70min；将沉淀用少量PBS重悬，经0.22μm滤网过滤，获得外泌体，存于-80℃中备用。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤(2)具体为：将含胆固醇头部的靶向分子与外泌体混合后，在4摄氏度过夜，使所述靶向分子的胆固醇头部插入到所述外泌体的磷脂双分子层中，以通过物理作用实现对外泌体的表面修饰。进一步的，所述含胆固醇头部的靶向分子与外泌体以1：10的蛋白量比例混合，在4℃反应8小时以上。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述靶向分子的制备方法具体为：将胆固醇-PEG-马来酰胺溶于PBS中，将软骨细胞归巢肽(CAP-SH)溶于三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液中，将二者以物质的量1：1的比例混合，室温下震荡10h，随后将溶液装入透析袋在PBS中透析24h，冻干得到粉末状固体胆固醇-PEG-CAP。进一步的，所述三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液的浓度为5mM，所述透析袋的截留分子量Mw＝3000。
作为可选方式，在上述制备方法中，所述步骤(3)具体为：将靶向修饰的外泌体用三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理，以破坏外泌体上的二硫键从而暴露出巯基，然后将所得产物加入到巯基化透明质酸溶液中获得水相液体，将山梨醇酐油酸酯(span80)溶解到液态石蜡中获得油相液体，将所述水相液体滴加到所述油相液体中，搅拌10min后，滴加5％的H2O2再搅拌5min形成载外泌体的微凝胶，随后，用PBS通过离心(3000rpm，3-5min/次，清洗3-5次)将油相清洗干净，得到纯化的微凝胶体系。通过滴加双氧水使巯基化透明质酸与外泌体之间通过巯基交联形成二硫键，体系结构更稳定，缓释效果更好。作为可选，将外泌体用1mM的TCEP在4℃处理5h-10h或在37℃处理30min。进一步的，将0.2mL司班80溶解到8mL的液态石蜡中，将0.4mL的pH＝7.4的20mg/mL的混合了外泌体悬液的HA-SH滴加到油相。作为可选，通过调整搅拌速度制备出不同粒径的微凝胶。
作为可选方式，在上述制备方法中，巯基化透明质酸的制备方法具体为：将透明质酸粉末溶解在2-(N-吗啉)乙磺酸溶液(MES)溶液中，加入过量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，直至形成透明均匀的溶液；将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)缓慢加入混合溶液中以激活透明质酸的羧基，在冰浴条件下稳定pH使其持续反应；向反应体系中加入半胱氨酸盐酸盐反应；最后将反应溶液转移至透析袋中透析后冷冻干燥得到海绵状固体的巯基化透明质酸(HA-SH)。
本发明还公开了一种上述工程化外泌体缓释体系的应用，其特征在于，将其用于制备骨关节炎治疗药物。
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过物理作用，将软骨细胞靶向肽修饰到了外泌体表面构建了CAP-EXO。通过细胞实验及体内实验，发现CAP-EXO能较好地靶向OA软骨细胞。
(2)通过将外泌体表面巯基的暴露可以通过二硫键的形成实现其与HA-SH微凝胶的紧密结合，相比于简单将外泌体和材料共混包裹，可以实现外泌体在体内的更长效的缓释。
(3)本发明从一个较为新颖的角度入手治疗骨关节炎，并取得了较好的疗效，为骨关节炎的治疗提供了新的思路。
附图说明：
图1为靶向外泌体的合成示意图。
图2为EXO和CAP-EXO对于OA软骨细胞的结合能力对比图。
图3为反映不同外泌体在大鼠膝关节存留情况的体内成像结果，其中A为EXO和CAP-EXO在鼠关节部位的留存；B为外泌体在体内器官中的扩散；C为半定量分析。
图4为外泌体在关节部位的结合情况及其半定量分析结果。
图5为本发明所述工程化外泌体缓释体系的构建示意图。
图6为本发明所述微凝胶缓释体系中外泌体的分级释放示意图。
图7为染色的外泌体在微凝胶中的分布结果图。
图8为外泌体在材料体系中的缓释曲线对比。
图9为实施例中各组在治疗4周和8周后大鼠膝关节修复后HE染色结果对比图。各组别分别为健康关节软骨组织(NA)、未治疗的OA关节(PBS)、不含外泌体的微凝胶材料(HA)、未改造的天然外泌体(EXO)、具有软骨细胞靶向能力的外泌体(CAP-EXO)、具有体内缓释能力的天然外泌体微凝胶(EXO-HA)，以及同时具有软骨细胞靶向性和体内缓释能力的外泌体微凝胶(CAP-EXO-HA)。
图10为实施例中各组在治疗4周和8周后大鼠膝关节修复后TB染色结果对比图。各组别分别为健康关节软骨组织(NA)、未治疗的OA关节(PBS)、不含外泌体的微凝胶材料(HA)、未改造的天然外泌体(EXO)、具有软骨细胞靶向能力的外泌体(CAP-EXO)、具有体内缓释能力的天然外泌体微凝胶(EXO-HA)，以及同时具有软骨细胞靶向性和体内缓释能力的外泌体微凝胶(CAP-EXO-HA)。
图11为实施例中各组在治疗4周和8周后大鼠膝关节修复后SO/FG染色结果对比图。各组别分别为健康关节软骨组织(NA)、未治疗的OA关节(PBS)、不含外泌体的微凝胶材料(HA)、未改造的天然外泌体(EXO)、具有软骨细胞靶向能力的外泌体(CAP-EXO)、具有体内缓释能力的天然外泌体微凝胶(EXO-HA)，以及同时具有软骨细胞靶向性和体内缓释能力的外泌体微凝胶(CAP-EXO-HA)。
图12为实施例中各组在治疗4周和8周后Mankin评分结果。各组别分别为健康关节软骨组织(NA)、未治疗的OA关节(PBS)、不含外泌体的微凝胶材料(HA)、未改造的天然外泌体(EXO)、具有软骨细胞靶向能力的外泌体(CAP-EXO)、具有体内缓释能力的天然外泌体微凝胶(EXO-HA)，以及同时具有软骨细胞靶向性和体内缓释能力的外泌体微凝胶(CAP-EXO-HA)。
具体实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例1
(1)外泌体使用梯度离心法提取
将细胞(分别以脐带间充质干细胞、骨髓干细胞、胚胎干细胞为例)的上清液在4℃下300g离心10min，以去除死细胞。取上清，加入离心管，4℃下2000g离心20min，以去除死细胞及微泡。取上清，4℃下10000g离心30min，以去除细胞碎片。将上清液在4℃下100000g离心70min，弃上清液。将沉淀用PBS重悬，并在4℃下100000g离心70min。将沉淀用少量PBS重悬，经0.22μm滤网过滤，得到外泌体，存于-80℃中。
(2)靶向修饰外泌体
将胆固醇-PEG-马来酰胺溶于PBS中，将软骨细胞归巢肽CAP-SH溶于5mM的TCEP(三(2-羧乙基)膦)中，将二者以物质的量1：1的比例混合，室温下震荡10h。随后将溶液装入透析袋(Mw＝3000)在PBS中透析24h，冻干得到粉末状固体胆固醇-PEG-CAP。
将外泌体与制备好的高分子链以10：1的蛋白量比例混合后，在4摄氏度过夜，以通过物理作用实现对外泌体的表面修饰。
外泌体的膜是磷脂组成，与细胞膜相似。将软骨细胞靶向肽接到带有胆固醇的PEG上，胆固醇可以通过物理作用插入外泌体膜中，如图1所示。
(3)缓释外泌体体系的构建
1)巯基化透明质酸(HA-SH)的制备
将1mol的0.37MDa的透明质酸粉末溶解在0.1mol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液(MES)溶液中。随后，加入2mol N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，直至形成透明均匀的溶液。其次，将预先用少许去离子水溶解的5mol 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)缓慢加入混合溶液中以激活透明质酸的羧基，边加边调pH值至4.75，在冰浴条件下稳定pH使其持续反应2h。之后将预先用少量去离子水溶解的5mol CSA·HCl加入体系中反应24h，pH值控制在4.75-5.0。最后将反应溶液转移至分子量截留量为8000-14000KDa的透析袋中，先用0.1mol/L NaCl(用1M HCL调pH至3.5)透析1天，再用去离子水(pH值为3.5)透析2天。冷冻干燥得到海绵状固体的巯基化透明质酸(HA-SH)。
2)乳化法制备负载外泌体的HA-SH微凝胶
首先将外泌体用1mM的TCEP在4℃处理5h-10h或在37℃处理30min，以还原外泌体表面蛋白上的二硫键从而暴露出巯基。通过与HA-SH的巯基结合生成二硫键，实现外泌体与材料的紧密结合。将0.2mL-0.3mL司班80溶解到8mL-10mL的液态石蜡中，将0.4mL的pH＝7.4的20mg/mL的混合了外泌体悬液的HA-SH滴加到油相。通过磁力搅拌子的转速调节制备出不同粒径(40nm-100nm)的微凝胶，转速越高所得产物粒径越小。通过乳化法可以制备出直径分布在40nm左右，且大的微凝胶也在100nm以内，均可以实现注射。
如图5和图6所示，通过将外泌体表面蛋白的巯基暴露，可以构建结合在HA-SH微凝胶上的外泌体缓释体系，以提高注射后外泌体在关节部位的留存率，且体系中存在的一定未结合的外泌体也可以尽快释放，成为首先在关节软骨表面的富集的“先头兵”。
实施例2
将实施例1制备的靶向修饰的外泌体CAP-EXO及未经修饰的外泌体EXO用细胞膜绿色荧光探针(DIO)染色与人的骨关节炎软骨细胞(OA软骨细胞)共同作用6h后，弃去上清，用PBS洗涤后，通过共聚焦观察细胞上结合的外泌体，比较不同的外泌体结合OA软骨细胞能力的差异。
结果如图2所示：相比于EXO组，CAP-EXO可以在OA软骨细胞周围有更高的荧光强度。说明通过靶向修饰，在外泌体表面修饰了CAP多肽，其可以靶向软骨细胞，可以观察到修饰后的CAP-EXO可以更好的结合OA软骨细胞。
实施例3
取实施例1制备的靶向外泌体CAP-EXO和EXO分别用细胞膜深红色荧光探针(DIR)染色后注入骨关节炎大鼠的关节腔中，通过活体成像仪对注入后的4h、24h和48h的大鼠的进行拍照记录，并将24h后的大鼠进行解剖，对其各个器官的荧光强度进行了半定量分析。
结果如图3所示：CAP-EXO相比EXO更多的富集在骨关节部位，且通过解剖发现CAP-EXO在关节部位有更高的富集强度，而EXO在肾及肝的扩散程度较高。活体成像实验发现CAP-EXO相比于EXO在体内有更好的关节软骨结合能力。
实施例4
取实施例1制备的靶向外泌体CAP-EXO和EXO分别用DIO染色后注入骨关节炎小鼠的关节腔中，24小时后取关节部位，细胞核用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，用共聚焦对软骨的表面和截面进行观察，并对荧光强度进行半定量分析。
结果如图4所示：通过对截面及表面观察，CAP-EXO相比EXO更多的富集在关节的软骨部位，。说明本发明所述的微凝胶可以提高外泌体在关节部位的留存率，减少其在其他器官中的扩散。通过对小鼠关节表面及截面共聚焦观察，发现从体内关节软骨部位的截面及表面观察，CAP-EXO相比于EXO有更高的富集程度。通过对其半定量分析发现CAP-EXO在关节软骨表面的富集可以达到EXO的3倍左右。
实施例5
取实施例1制备的微凝胶，在其中负载了DiO染色的外泌体后，通过共聚焦观察了外泌体在水凝胶中的分布。
结果如图7所示：通过共聚焦观察到了绿色荧光在凝胶中分散。证明成功制备了负载外泌体的微凝胶。
实施例6
取实施例1制备的微凝胶缓释体系(HA-S-S-EXO)与直接共混的缓释体系(HA-EXO)分别置于transwell小室上室，下方孔中为PBS，在不同时间点取溶液，通过BCA试剂盒测蛋白含量制备缓释曲线。
结果如图8所示：观察曲线发现直接共混的缓释体系(HA-EXO)在3-5天就基本释放完全，而微凝胶缓释体系(HA-S-S-EXO)的缓释时间大大加长，约2周释放完全。说明体外缓释数据表明缓释体系相比于比与材料直接共混可以延长释放外泌体将近十天。
实施例7
取实施例1制备的靶向及缓释外泌体体系注射至骨关节炎大鼠关节中，2周后再次注射，在第一次注射后4周和8周收样。收获的骨关节经脱钙处理后包埋切片，并进行HE、TB和番红固绿等组织学染色以观察修复情况。
结果如图9-12所示：观察发现4周时CAP-EXO组有较好软骨基质分泌，而EXO组虽也有一定量的基质分泌，但有部分纤维化现象。说明靶向修饰后的外泌体因其更高的作用效率能更好的作用于衰老的软骨细胞，促进关节软骨的修复。而8周时CAP-EXO-HA组的软骨基质分泌最接近天然组，对骨关节炎关节软骨有较好的维持能力，说明外泌体经过微凝胶缓释负载，可以提高其在关节部位的留存率，更适合于治疗骨关节炎的较长时间。组织学评分结果也显示出各组在软骨结构、软骨细胞、基质染色情况及潮线完整性等方面与天然组的差别。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (10)
1.一种用于骨关节炎治疗的工程化外泌体靶向缓释体系，其特征在于，包括靶向修饰的外泌体和巯基化透明质酸，所述巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联形成微凝胶，所述靶向修饰的外泌体利用表面暴露的巯基与巯基化透明质酸上的巯基通过二硫键相互交联，从而固定到所述微凝胶中。
2.根据权利要求1所述的工程化外泌体靶向缓释体系，其特征在于，所述靶向修饰的外泌体包括外泌体和靶向分子，所述靶向分子包括胆固醇头部和靶向基团尾部，所述靶向分子通过胆固醇头部插入到所述外泌体的磷脂双分子层中。
3.根据权利要求2所述的工程化外泌体靶向缓释体系，其特征在于，所述靶向分子由胆固醇-PEG-马来酰胺与巯基化的软骨细胞归巢肽(CAP-SH)通过巯基-马来酰胺点击化学法合成。
4.根据权利要求1所述的工程化外泌体靶向缓释体系，其特征在于，所述外泌体为干细胞来源的外泌体，对于骨关节炎的治疗有一定的优势。
5.一种如权利要求1所述的工程化外泌体靶向缓释体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外泌体的提取；
(2)外泌体的靶向修饰；
(3)靶向修饰的外泌体与巯基化透明质酸混合交联获得载外泌体的微凝胶。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)具体为：将含胆固醇头部的靶向分子与外泌体混合后，在4摄氏度过夜，使所述靶向分子的胆固醇头部插入到所述外泌体的磷脂双分子层中，以通过物理作用实现对外泌体的表面修饰。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述靶向分子的制备方法具体为：将胆固醇-PEG-马来酰胺溶于PBS中，将软骨细胞归巢肽(CAP-SH)溶于三(2-羧乙基)膦(TCEP)中，将二者以物质的量1：1的比例混合，室温下震荡10h，随后将溶液装入透析袋在PBS中透析24h，冻干得到粉末状固体胆固醇-PEG-CAP。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体为：将靶向修饰的外泌体用三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理，以破坏外泌体上的二硫键从而暴露出巯基，然后将所得产物加入到巯基化透明质酸溶液中获得水相液体，将山梨醇酐油酸酯(span80)溶解到液态石蜡中获得油相液体，将所述水相液体滴加到所述油相液体中，搅拌10min后，滴加5％的H2O2再搅拌5min形成载外泌体的微凝胶，随后，用PBS通过离心将油相清洗干净，得到纯化的微凝胶体系。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，巯基化透明质酸的制备方法具体为：将透明质酸粉末溶解在2-(N-吗啉)乙磺酸溶液(MES)溶液中，加入过量N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，直至形成透明均匀的溶液；将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)缓慢加入混合溶液中以激活透明质酸的羧基，在冰浴条件下稳定pH使其持续反应；向反应体系中加入半胱氨酸盐酸盐反应；最后将反应溶液转移至透析袋中透析后冷冻干燥得到海绵状固体的巯基化透明质酸(HA-SH)。
10.一种如权利要求1所述的工程化外泌体缓释体系的应用，其特征在于，将其用于制备骨关节炎治疗药物。
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|---|---|
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116077426A (zh) * | 2023-04-10 | 2023-05-09 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 能够注射和缓释小分子化合物的外泌体靶向载药系统 |
| CN116271097A (zh) * | 2023-04-07 | 2023-06-23 | 四川大学 | 一种基于金属有机骨架的工程化外泌体及其制备方法和应用 |
Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014157606A1 (ja) * | 2013-03-29 | 2014-10-02 | 国立大学法人京都大学 | 架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とその製造方法 |
| CN104307049A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-28 | 四川大学华西医院 | 一种仿细胞外基质可注射的原位水凝胶及其制备方法与应用 |
| US20150232883A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-08-20 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components |
| CN104892962A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-09-09 | 四川大学 | 一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用 |
| CN108084461A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-29 | 四川大学 | 可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN109925516A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-25 | 广州医科大学附属口腔医院 | 一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法 |
| CN110755365A (zh) * | 2019-06-19 | 2020-02-07 | 江苏拓弘康恒医药有限公司 | 基于间充质干细胞外泌体的水凝胶及其喷雾剂的制备方法 |
| CN113332442A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-03 | 愈美明德(成都)生物医药科技有限公司 | 一种靶向递送分子、粒子及其制备方法、应用 |
| US20220096354A1 (en) * | 2019-03-01 | 2022-03-31 | Shanghai Cheermore Biological Technology Co., Ltd. | Preparation method and use of artificial exosome complex |
| CN114760958A (zh) * | 2019-07-26 | 2022-07-15 | 潘多姆科技私人有限公司 | 生物墨水调配物、生物打印的角膜微透镜和其应用 |
| CN114761544A (zh) * | 2019-07-26 | 2022-07-15 | 潘多姆科技私人有限公司 | 经生物工程化的调配物、其制备方法和实施方案 |
-
2022
- 2022-11-03 CN CN202211371840.XA patent/CN115737682B/zh active Active
Patent Citations (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014157606A1 (ja) * | 2013-03-29 | 2014-10-02 | 国立大学法人京都大学 | 架橋された疎水化多糖ナノゲル粒子とその製造方法 |
| US20150232883A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-08-20 | The Broad Institute Inc. | Delivery, use and therapeutic applications of the crispr-cas systems and compositions for targeting disorders and diseases using particle delivery components |
| CN104307049A (zh) * | 2014-09-29 | 2015-01-28 | 四川大学华西医院 | 一种仿细胞外基质可注射的原位水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN104892962A (zh) * | 2015-06-05 | 2015-09-09 | 四川大学 | 一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶的制备方法及其应用 |
| CN108084461A (zh) * | 2017-12-28 | 2018-05-29 | 四川大学 | 可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用 |
| CN109925516A (zh) * | 2019-02-27 | 2019-06-25 | 广州医科大学附属口腔医院 | 一种负载外泌体的复合水凝胶及其制备方法 |
| US20220096354A1 (en) * | 2019-03-01 | 2022-03-31 | Shanghai Cheermore Biological Technology Co., Ltd. | Preparation method and use of artificial exosome complex |
| CN110755365A (zh) * | 2019-06-19 | 2020-02-07 | 江苏拓弘康恒医药有限公司 | 基于间充质干细胞外泌体的水凝胶及其喷雾剂的制备方法 |
| CN114760958A (zh) * | 2019-07-26 | 2022-07-15 | 潘多姆科技私人有限公司 | 生物墨水调配物、生物打印的角膜微透镜和其应用 |
| CN114761544A (zh) * | 2019-07-26 | 2022-07-15 | 潘多姆科技私人有限公司 | 经生物工程化的调配物、其制备方法和实施方案 |
| CN113332442A (zh) * | 2021-06-10 | 2021-09-03 | 愈美明德(成都)生物医药科技有限公司 | 一种靶向递送分子、粒子及其制备方法、应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| HONGFU CAO等: "Cell-Free Osteoarthritis Treatment with Sustained-Release of Chondrocyte-Targeting Exosomes from Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells to Rejuvenate Aging Chondrocytes", ACS NANO, pages 13358 * |
| XUEHAN SANG等: "Thermosensitive Hydrogel Loaded with Primary ChondrocyteDerived Exosomes Promotes Cartilage Repair by Regulating Macrophage Polarization in Osteoarthritis", TISSUE ENG REGEN MED, pages 629 * |
| 唐川;刘俊成;周兴智;蒋革;: "蛋白多肽类药物载体应用研究进展", 沈阳药科大学学报, no. 01 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116271097A (zh) * | 2023-04-07 | 2023-06-23 | 四川大学 | 一种基于金属有机骨架的工程化外泌体及其制备方法和应用 |
| CN116271097B (zh) * | 2023-04-07 | 2024-01-26 | 四川大学 | 一种基于金属有机骨架的工程化外泌体及其制备方法和应用 |
| CN116077426A (zh) * | 2023-04-10 | 2023-05-09 | 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） | 能够注射和缓释小分子化合物的外泌体靶向载药系统 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115737682B (zh) | 2023-12-29 |
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