KR20230105384A - 줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법 - Google Patents
줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 피부 주름개선용 필러 조성물은 줄기세포를 이용한 치료의 가장 큰 문제점인 세포의 낮은 체내 생착률 및 생존율의 한계 극복뿐만 아니라, 줄기세포의 암세포화 등에 대한 부작용을 억제하면서도 뛰어난 콜라겐 생성 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 필러 조성물은 엑소좀의 서방형 방출이 가능하고, 온도에 따른 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 필러의 주사가 용이하며, 주입 부위의 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤은 탈가교화가 가능하여 환자 편의성 증대의 장점을 가진다.
Description
본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
피부는 바깥쪽의 표피와 안쪽의 진피와 피하조직의 3 층으로 구분되고, 표피와 진피 사이에 기저막이 존재하는 구조이며, 외부에서 유입되는 균의 침투를 막는 동시에 체내의 수분 유지와 체온 유지에 중요한 역할을 하는 조직이다.
진피는 그 중에서도 가장 영역이 넓은 부분으로, '세포외 기질(extracellular matrix)'이라고 불리는 거대분자의 그물 구조에 의해 채워져 있다. 이 세포외 기질은 진피 내의 섬유아세포 등에서 생성되고, 히알루론산(hyaluronic acid, HA)이나 더마탄(dermatan) 황산 등의 산성 뮤코다당이라고 불리는 다당류와, 콜라겐(collagen), 엘라스틴(elastin) 등의 섬유성 단백질로 구성되어 있다. 세포외 기질은 피부의 탄력성, 팽팽함, 촉촉함, 신진대사 등에 직접적으로 관계하고 있으며, 피부 노화의 주원인은 교원섬유(collagen, 콜라겐)와 탄력섬유(elastin, 엘라스틴) 및 점액 다당체(glycosaminoglycan and mucopolysaccharide)의 변성에 의한 피부의 탄력성 감소와 주름의 증가이다. 피부층 내에 콜라겐이 부족하면 피부층의 두께가 얇아짐으로써 탄력이 줄게 되고 주름이 발생한다. 현재, 이러한 피부 주름의 개선을 목적으로 필러(filler)에 대한 연구개발이 활발히 이루어지고 있다.
그 중에서 합성고분자로 구성된 마이크로입자 기반의 필러는 장기간 지속이 가능하고 자가면역반응을 통한 콜라겐 생성 촉진 기능을 지니고 있지만 면역반응, 홍반, 부기 등의 부작용이 있다. 또한, 잘못된 시술에 의해 부작용이 발생할 경우 임의로 분해 또는 제거가 어려우며, 주입할 때 환자에게 고통이 수반되는 한계를 가지고 있다.
최근에는 줄기세포를 이용한 항노화 치료법도 다양하게 소개되고 있지만, 이는 세포 자체의 분화조절이 어려울 뿐 아니라 타가이식의 경우 체내 면역반응에 의한 부작용이 발생할 수 있고, 생체 내 세포생존율이 매우 낮아 직접적인 임상적용에 있어 한계를 초래할 수 있다.
한편, 엑소좀은 세포막과 동일한 막 구조의 소낭체로서, 다른 세포 및 조직에 막 구성요소, 단백질, RNA 등을 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 줄기세포에서 분비되는 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하며, 줄기세포가 분비하는 다양한 성장인자와 사이토카인을 함유하고 있어, 세포의 부착, 성장, 분화 등의 거동을 조절한다고 알려져 있다. 또한 엑소좀은 분리하는 과정에서 세포 배양액 내 세포 노폐물, 항생제, 혈청 등 불순물이 제거되므로, 세포 배양액의 효과와 동등하면서 안전하게 사용 가능하다.
이에, 본 발명자들은 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하고, 이를 온도 민감성을 가진 고분자 기반의 필러에 물성의 변화 없이 첨가하여, 기존의 합성고분자 기반 필러가 나타내는 부작용을 최소화하면서도 뛰어난 주름개선 효능을 가지는 필러 조성물을 개발하고자 하였다.
본 발명자들은 종래 합성고분자 기반 필러 조성물 및 줄기세포를 이용한 항노화 치료에서 발생할 수 있는 문제점을 극복하면서도 효과가 뛰어난 주름개선용 필러 조성물을 개발하기 위해 연구한 결과, 줄기세포 유래 엑소좀을 온도 민감성 생체적합성 고분자에 첨가할 경우 엑소좀의 서방형 방출이 가능하고, 온도에 따른 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 필러의 주사가 용이하며 주입 부위의 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤은 탈가교화가 가능함을 확인하였다. 또한, 상기 줄기세포 유래 엑소좀을 함유한 온도 민감성 생체적합성 고분자는 부작용을 최소화하면서도 뛰어난 콜라겐 생성 효과를 나타내는 것을 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 친수성 고분자의 양 말단에 소수성 고분자가 각각 결합된 소수성-친수성-소수성 고분자의 형태이고, 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 단계;
(b) 친수성 고분자에 촉매를 혼합한 후, 소수성 고분자를 반응시킴으로써 소수성-친수성-소수성의 양친매성 생체적합성 고분자를 합성하는 단계; 및
(c) 상기 양친매성 생체적합성 고분자를 상기 엑소좀과 혼합하는 단계를 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법으로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤)(PCL-PEG-PCL), 폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)(PCLA-PEG-PCLA), 및 폴리(L-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-락타이드)(PLLA-PEG-PLLA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 20 ℃ 내지 30 ℃에서 액체 상태로 존재하고, 33 ℃ 내지 40 ℃에서는 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 하이드로젤 상태로 변형이 일어날 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 소수성-친수성-소수성 고분자의 분자량 비가 1 : 0.2 내지 1 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 필러 조성물은 콜라겐 생성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 필러 조성물 주입 시 엑소좀은 서방형 방출이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계에서 반응은 100 ℃ 내지 150 ℃에서 12 내지 36시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (b) 단계에서 양친매성 생체적합성 고분자는 소수성-친수성-소수성 고분자의 분자량 비가 1 : 0.2 내지 1 : 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 (c) 단계에서 양친매성 생체적합성 고분자는 20 ℃ 내지 30 ℃에서 PBS에 분산시킨 후 엑소좀과 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 필러 조성물의 피부 주름개선 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자의 피부 주름개선용 필러 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 필러 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 주름개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 피부 주름개선용 필러 조성물은 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자가 함유된 것으로서, 줄기세포를 이용한 치료의 가장 큰 문제점인 세포의 낮은 체내 생착률 및 생존율의 한계 극복뿐만 아니라, 줄기세포의 암세포화 등에 대한 부작용을 억제하면서도 뛰어난 콜라겐 생성 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 필러 조성물은 엑소좀의 서방형 방출이 가능하고, 온도에 따른 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 필러의 주사가 용이하며, 주입 부위의 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤은 탈가교화가 가능하여 환자 편의성 증대의 장점을 가진다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 콜라겐 생성 및 주름개선 작용을 간단하게 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 2a) 및 PCLA-PEG-PCLA(도 2b)의 합성 과정 및 PLLA-PEG-PLLA의 구조(도 2c)를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 3a) 및 PCLA-PEG-PCLA(도 3b)의 화학 구조 및 분광법을 통한 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 4a), PCLA-PEG-PCLA(도 4b), 및 PLLA-PEG-PLLA(도 4c)의 함량 또는 온도에 따른 졸-젤(sol-gel) 변화를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 주사기 봉입 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무 및 온도 변화에 의한 졸-젤 변화를 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 공초점 형광 현미경 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 유동학적 특성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 주입강도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 탈가교화 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에서 엑소좀의 장기 생체 분포거동을 확인한 도면이다.
도 9a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입에 의한 콜라겐 합성 효능을 조직학적 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입 후 진피층 내의 콜라겐을 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입 후 콜라겐이 분포된 진피층의 두께를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 2a 내지 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 2a) 및 PCLA-PEG-PCLA(도 2b)의 합성 과정 및 PLLA-PEG-PLLA의 구조(도 2c)를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 3a) 및 PCLA-PEG-PCLA(도 3b)의 화학 구조 및 분광법을 통한 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 4a 내지 4c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL(도 4a), PCLA-PEG-PCLA(도 4b), 및 PLLA-PEG-PLLA(도 4c)의 함량 또는 온도에 따른 졸-젤(sol-gel) 변화를 확인한 도면이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 주사기 봉입 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무 및 온도 변화에 의한 졸-젤 변화를 확인한 도면이다.
도 5c는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 공초점 형광 현미경 이미지를 나타낸 도면이다.
도 6a는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 유동학적 특성을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6b는 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 주입강도를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 함유 유무에 의한 탈가교화 효과를 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에서 엑소좀의 장기 생체 분포거동을 확인한 도면이다.
도 9a는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입에 의한 콜라겐 합성 효능을 조직학적 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9b는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입 후 진피층 내의 콜라겐을 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9c는 본 발명의 일 구현예에 따른 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입 후 콜라겐이 분포된 진피층의 두께를 정량적으로 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 실시예에서는 인간 지방 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하고(실시예 1 참조), 소수성-친수성-소수성의 온도 민감성 생체적합성 고분자를 합성한 후 엑소좀 용액과 혼합하여 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 액상을 제조하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 일 실험예에서는 PCL-PEG-PCL, PCLA-PEG-PCLA, 및 PLLA-PEG-PLLA가 37 ℃에서 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 모두 젤 상태로 변하는 것을 확인하여, 모두 온도 민감성 생체적합성 고분자로 사용할 수 있음을 알 수 있었다(실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 형태학적 분석 및 이미지 관찰 결과, 엑소좀의 함유는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 투명도 및 색 변화에 영향을 미치지 않으며, 엑소좀 함유 유무에 상관 없이 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 25 ℃에서 모두 졸(sol) 상태이고 37 ℃에서는 젤(gel) 상태로 변화했음을 확인하였다. 또한, 엑소좀은 온도 민감성 고분자 필러에 고르게 분포하는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 유동학적 특성 및 주입강도를 분석한 결과, 엑소좀 함유는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 저장탄성률, 손실탄성률, 및 주입강도에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다(실험예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 탈가교화 효과를 확인한 결과, 엑소좀 함유 유무에 상관 없이 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 젤 변화 후 PBS 첨가에 의한 탈가교화 효과를 통해 하이드로젤을 분해할 수 있음을 확인하였다(실험예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 방출거동을 확인한 결과, 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 함유된 엑소좀은 엑소좀을 단독 투여한 경우에 비해 오랫동안 피부층 내에 존재하는 것을 확인하였다(실험예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실험예에서 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입에 따른 콜라겐 합성 효과를 확인한 결과, 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 주입한 조직에서는 엑소좀 농도에 의존적으로 콜라겐 생성이 증가하고 진피층 두께가 증가한 것을 확인하였다(실험예 6 참조).
이에, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 친수성 고분자의 양 말단에 소수성 고분자가 각각 결합된 소수성-친수성-소수성 고분자의 형태이고, 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “줄기세포(stem cell)”란 여러 종류의 조직 세포로 분화할 수 있는 능력, 즉, 줄기세포성(stemness)을 가진 미분화 세포를 총칭하는 광의의 개념을 말하며, 신경, 혈액, 연골 등 생물체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 전분화능(pluripotency) 뿐만 아니라 다분화능(multipotency), 단일분화능(unipotency)을 모두 포함한다. 이러한 줄기세포는 크게 배아를 이용하여 제조할 수 있는 배아줄기세포(embryonic stem cell), 성체줄기세포(adult stem cell), 생식세포(gamete), 암 줄기세포(cancer stem cell) 등으로 나뉘며, 배아줄기세포는 수정 후 14일이 안된 상태의 구체적 장기를 형성하기 이전의 세포 덩어리 단계를 말하며, 최근에는 역분화를 통하여 정상세포로부터 배아줄기세포를 제조하기도 한다. 따라서, 신체를 이루는 모든 세포와 조직으로 분화할 수 있는 세포라면 이에 제한되지 않는다. 성체줄기세포는 제대혈, 골수, 지방, 혈액 등으로부터 추출해 낸 것으로서 뼈, 간, 혈액 등 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 원시세포를 의미한다. 생식세포란, 생식을 통해서 유전 정보를 다음 세대로 전달하는 세포로서, 인간에게는 정자와 난자가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 줄기세포는 클론을 형성하여 세포의 군집을 이루는 과정에서 자기 복제를 하여 군집 내에 새로운 하나의 줄기세포를 유지할 수 있으며, 분화를 통해 한 가지 이상의 특징적인 세포 형태를 형성할 수 있는 능력이 있는 세포이다.
본 발명에 있어서, “지방 줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)”란 골, 근육, 지방 및 제대혈 등 다양한 유래의 성체줄기세포 중에서 지방에서 추출되는 줄기세포를 말한다. 다분화능을 가진 지방줄기세포(ASC)는 지방세포, 골모세포, 연골모세포 및 근섬유모세포 등 대부분의 중간엽 세포로 분화할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 지방 줄기세포는 인간 유래 지방 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “엑소좀(exosome)”이란 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭을 말한다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 직경이 10nm 내지 500nm, 10 nm 내지 400 nm, 10 nm 내지 300 nm, 10 nm 내지 250 nm, 10 nm 내지 200 nm, 10 nm 내지 150 nm, 50 nm 내지 500 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 150 nm, 또는 80 nm 내지 130 nm일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “고분자(polymer)”란 일정 단위체 간의 반복적인 화학 결합을 통하여 만들어지는 높은 분자량의 거대분자를 의미하며, 본 발명에 있어서는 분자량이 1,000 이상인 분자를 의미할 수 있다. “생체적합성 고분자”란 투여했을 때 인체에 독성을 나타내지 않는 고분자 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 생체적합성 고분자는 양친매성일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 “양친매성”이란 친수성 및 소수성의 특성을 조합시킨 분자를 지칭한다.
본 발명에 있어서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone), PCL-PEG-PCL), 폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)(poly(ε-caprolactone-co-lactide)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone-co-lactide), PCLA-PEG-PCLA), 및 폴리(L-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-락타이드)(poly(L-lactide)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide), PLLA-PEG-PLLA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 상기 PEG는 친수성, 상기 PCL, PCLA, 또는 PLLA는 소수성일 수 있다.
본 발명에 있어서, “온도 민감성 고분자”란 외부 온도에 따라서 그 성질이 바뀌는 고분자로서 특정 온도에서 가역적인 졸-젤 상전이(sol-gel phase transition)가 일어나는 고분자를 의미한다. 본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 실온에서 액체 상태로 존재할 수 있다. 상기 실온은 예컨대 20 ℃ 내지 30 ℃, 20 ℃ 내지 28 ℃, 20 ℃ 내지 26 ℃, 20 ℃ 내지 25 ℃, 22 ℃ 내지 30 ℃, 22 ℃ 내지 28 ℃, 22 ℃ 내지 26 ℃, 22 ℃ 내지 25 ℃, 24 ℃ 내지 30 ℃, 24 ℃ 내지 28 ℃, 24 ℃ 내지 26 ℃, 24 ℃ 내지 25 ℃, 또는 25 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 실온의 범위 내에서 허용 가능한 온도의 오차 범위를 모두 포함할 수 있다. 또한, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 체온에서 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 하이드로젤 상태로 변형이 일어날 수 있다. 상기 체온은 예컨대 33 ℃ 내지 40 ℃, 33 ℃ 내지 39 ℃, 33 ℃ 내지 38 ℃, 33 ℃ 내지 37 ℃, 35 ℃ 내지 40 ℃, 35 ℃ 내지 39 ℃, 35 ℃ 내지 38 ℃, 35 ℃ 내지 37 ℃, 36 ℃ 내지 40 ℃, 36 ℃ 내지 39 ℃, 36 ℃ 내지 38 ℃, 36 ℃ 내지 37 ℃, 또는 37 ℃일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 체온의 범위 내에서 허용 가능한 온도의 오차 범위를 모두 포함할 수 있다.
이러한 온도의 변화는 친수성(PEG) 부분과 소수성(PCL, PCLA, 또는 PLLA) 부분의 물과의 상호작용의 변화를 유도해 고분자간 cross-linked 네트워크 구조적 변화를 일으키며, 결과적으로 졸-젤 상전이가 일어나게 된다. 이때, 친수성 고분자와 소수성 고분자간의 분자량이 졸-젤 상전이에 영향을 미친다.
본 발명에 있어서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 소수성-친수성-소수성 고분자의 분자량 비가 1 : 0.2 내지 1 : 1, 1 : 0.2 내지 0.9 : 1, 1 : 0.2 내지 0.85 : 1, 1 : 0.2 내지 0.7 : 1, 1 : 0.3 내지 1 : 1, 1 : 0.3 내지 0.9 : 1, 1 : 0.3 내지 0.85 : 1, 1 : 0.3 내지 0.7 : 1, 1 : 0.4 내지 1 : 1, 1 : 0.4 내지 0.9 : 1, 1 : 0.4 내지 0.85 : 1, 1 : 0.4 내지 0.7 : 1, 1 : 0.4 내지 0.6 : 1, 1 : 0.5 내지 1 : 1, 1 : 0.5 내지 0.9 : 1, 1 : 0.5 내지 0.85 : 1, 1 : 0.6 내지 1 : 1, 1 : 0.6 내지 0.9 : 1, 1 : 0.6 내지 0.85 : 1, 1 : 0.7 내지 1 : 1, 1 : 0.7 내지 0.9 : 1, 1 : 0.7 내지 0.85 : 1, 1 : 0.8 내지 1 : 1, 1 : 0.8 내지 0.9 : 1, 또는 1 : 0.8 내지 0.85 : 1일 때 고분자의 졸-젤 상전이에 바람직할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 양친매성 생체적합성 고분자는 필러 조성물의 전체 건조 중량에 대하여 10 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 27 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 12 중량% 내지 30 중량%, 12 중량% 내지 27 중량%, 12 중량% 내지 25 중량%, 15 중량% 내지 30 중량%, 15 중량% 내지 27 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 15 중량% 내지 22.5 중량%, 15 중량% 내지 20 중량%, 15 중량% 내지 17.5 중량%, 17.5 중량% 내지 25 중량%, 20 중량% 내지 25 중량%, 22.5 중량% 내지 25 중량%, 또는 25 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 피부 주름개선용 필러 조성물에 포함되는 엑소좀은, 필러 조성물의 전체 건조 중량에 대한 상기 양친매성 생체적합성 고분자 25 중량%에 대하여, 1 x 106개 내지 1 x 109개, 5 x 106개 내지 1 x 109개, 1 x 107개 내지 1 x 109개, 5 x 107개 내지 1 x 109개, 1 x 108개 내지 1 x 109개, 1 x 106개 내지 1 x 108개, 5 x 106개 내지 1 x 108개, 1 x 107개 내지 1 x 108개, 5 x 107개 내지 1 x 108개, 1 x 107개, 5 x 107개, 또는 1 x 108개가 되도록 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "피부 주름"이란, 피부가 쇠하여 생긴 잔줄을 의미하는데, 유전자에 의한 원인, 피부 진피에 존재하는 콜라겐과 엘라스틴의 감소, 외부환경 등에 의해 유발될 수 있다. 본 발명에서 "피부 주름개선"이란, 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 필러 조성물은 콜라겐 생성을 증가시킴으로써 피부 주름개선 효과를 나타낼 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 필러 조성물 주입 시 엑소좀은 서방형 방출이 가능할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, “서방형 방출”이란 엑소좀이 장기간에 걸쳐 일정하고 지속적으로 방출됨으로써 엑소좀이 일정한 농도를 유지하면서 피부층 내에 오랫동안 존재할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “필러(filler)”란 근육, 건(tendon), 섬유 조직, 지방, 혈관, 신경, 및 활막 조직(관절 주위의 조직)과 같이 신체의 다른 구조 및 기관을 연결하거나, 지지하거나, 또는 둘러싸는 조직인 연조직의 결핍 영역에 볼륨을 추가하도록 설계된 재료 또는 조성물을 광범위하게 지칭하는 것으로, 바람직하게는 피부의 주름개선을 위해 피부에 주사하거나 삽입하여 피부 속을 보충할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 포함하는 필러 조성물은 예컨대, 물 또는 식염수 용액과 혼합함으로써 더욱 가공되어 주사용 또는 국소용의 물질, 예컨대 용액, 오일, 로션, 젤, 연고, 크림, 슬러리, 밤(salve), 또는 페이스트를 형성할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 필러 조성물은 주사용일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예 또는 실험예에 따르면, 상기 주사용 필러 조성물의 제형은 액체 상태인 졸(sol) 또는 젤(gel)일 수 있다. 졸은 액체 중에서 미세한 고체 입자가 안정한 상태로 흩어져 존재하는 콜로이드 서스펜션(colloidal suspension)을 의미하며, 젤은 일반적으로 실온에서의 유동성이 액체와 고체의 유동성 사이의 상태로서, 구체적으로, 물을 흡수할 수 있는 하이드로젤일 수 있다. 예컨대, 본 발명의 필러 조성물은 온도 민감성을 가지는 양친매성 생체적합성 고분자를 포함함으로써 실온에서 액체 상태로 존재하고, 주사 시 체온에 의해 하이드로젤 상태로 변형이 이루어져, 엑소좀을 용이하게 하이드로젤 내부로 봉입할 수 있다. 또한, 본 발명의 필러 조성물의 제형이 졸 상태에서 하이드로젤 상태로 변형이 일어난 후, PBS를 첨가함으로써 상기 형성된 하이드로젤을 탈가교화(de-crosslinking)시킴으로써 졸 상태로 분해할 수 있다.
본 발명에 있어서, “탈가교화”란 가교 결합을 분해하는 것을 의미하며, “가교”란 통상적으로 수용성인 물질을 사실상 수-불용성이되 팽윤성으로 효과적으로 만드는 방법을 말한다. 이러한 방법은, 예를 들면 물리적 엉킴(entanglement), 결정질 도메인, 공유결합, 이온성 착물 및 회합, 수소결합과 같은 친수성 회합, 및 소수성 회합 또는 반데르발스력을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 주사용 필러 조성물에는 주사용 증류수, 0.9 % 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1 %, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제가 더 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 필러 조성물은 예컨대 피부의 주름살 또는 주름(예를 들어, 안면 주름 및 안면 주름살), 미간 주름, 비구순 주름, 턱 주름, 마리오네트 주름, 입 주위 주름살, 눈가 잔주름, 피부 함몰부, 흉터, 관자, 눈썹의 진피하 지지부, 광대 및 볼 지방 패드, 눈물 도랑, 코, 입술, 뺨, 입 주위 영역, 안와하 영역, 안면 비대칭, 아래턱선, 및 턱의 치료 또는 개선을 위해 투여될 수 있으며, 바늘이 있는 주사기, 피스톨(예를 들면, 유압공기식-압축 피스톨), 카테터, 국소적으로, 또는 직접 수술 이식에 의한 것을 포함하는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 임의의 수단에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 바늘은 주사기, 카테터, 및/또는 피스톨과 조립될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 필러 조성물은, 예컨대, 진피 영역(피내주사) 또는 피하 영역과 같은 피부 영역에 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 필러 조성물은 1회 또는 다회에 걸쳐 투여될 수 있고, 투여 기간 및 투여량은 일반적으로 개체 및/또는 전문의에 의해 요망되는 미용적 및/또는 임상적 효과 및 치료받는 신체 부위 또는 영역을 기초로 하여 결정될 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 필러 조성물의 피부 주름개선 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자의 피부 주름개선용 필러 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는 필러 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 피부 주름개선 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, “개체”란 피부 주름개선을 필요로 하여 본 발명의 조성물이 투여될 수 있는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 단계;
(b) 친수성 고분자에 촉매를 혼합한 후, 소수성 고분자를 반응시킴으로써 소수성-친수성-소수성의 양친매성 생체적합성 고분자를 합성하는 단계; 및
(c) 상기 양친매성 생체적합성 고분자를 상기 엑소좀과 혼합하는 단계를 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법으로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서 반응은 100 ℃ 내지 150 ℃, 100 ℃ 내지 145 ℃, 100 ℃ 내지 140 ℃, 100 ℃ 내지 135 ℃, 110 ℃ 내지 150 ℃, 110 ℃ 내지 145 ℃, 110 ℃ 내지 140 ℃, 110 ℃ 내지 135 ℃, 120 ℃ 내지 150 ℃, 120 ℃ 내지 145 ℃, 120 ℃ 내지 140 ℃, 120 ℃ 내지 135 ℃, 130 ℃ 내지 150 ℃, 130 ℃ 내지 145 ℃, 130 ℃ 내지 140 ℃, 또는 135 ℃에서 12 내지 36시간, 12 내지 30시간, 12 내지 24시간, 18 내지 36시간, 18 내지 30시간, 18 내지 24시간, 24 내지 36시간, 24 내지 30시간, 또는 24시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 양친매성 생체적합성 고분자는 20 ℃ 내지 30 ℃, 20 ℃ 내지 28 ℃, 20 ℃ 내지 26 ℃, 20 ℃ 내지 25 ℃, 22 ℃ 내지 30 ℃, 22 ℃ 내지 28 ℃, 22 ℃ 내지 26 ℃, 22 ℃ 내지 25 ℃, 25 ℃ 내지 30 ℃, 25 ℃ 내지 28 ℃, 25 ℃ 내지 26 ℃, 또는 25 ℃에서 PBS에 분산시킨 후 엑소좀과 혼합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀 추출
인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀은 인간 지방 줄기세포를 배양하는 과정에서 추출하였다.
구체적으로, 인간 지방 줄기세포를 일반 배양배지(Gibco, Cat#: 11995065)에서 배양하고 엑소좀을 추출하기 24시간 전에 무혈청, 무항생제, 무페놀레드(phenol red)인 배지(Gibco Cat#: 31053028)로 교체하여 24시간 동안 배양한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상층액은 일차적으로 2,000 x g로 4 내지 5분간 원심분리 하는 단계 및 이차적으로 10,000 x g로 4 내지 30분간 원심분리 하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거하였다. 그런 다음, 회수한 세포 배양 상층액은 일차적으로 3,000 x g로 4 ℃에서 20분간 원심분리 하는 단계 및 이차적으로 0.22 ㎛ 필터로 여과하는 단계를 거쳐 세포 잔해물 및 노폐물을 제거해주었다. 이후, 회수한 상층액을 300 kDa 필터를 이용한 접선 흐름 여과(Tangential Flow Filtration, TFF) 시스템을 이용하여 엑소좀을 분리 및 정제하였다.
실시예 2. 지방줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 제조
폴리에틸렌글리콜(Poly ethylene glycol(PEG), 분자량(MW): 1,650 g/mol) 4 g 및 Sn(Oct)2 0.04 g을 혼합한 후 110 ℃에서 2시간 동안 진공 건조시켜 수분을 제거하였다. 그런 다음, 8.97 ml의 ε-카프로락톤(ε-Caprolactone)(MW: 114.14 g/mol)을 첨가하고 질소로 채운 후 135 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 100 ml의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 반응물을 과량의 에테르/헥산(ether/hexane)(에테르:헥산=1:1(v/v))에 침전시켰다. 상기 침전물을 25 ℃ 진공오븐에서 건조하여 폴리(ε-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone), PCL-PEG-PCL)을 획득하였다.
또한, 폴리에틸렌글리콜(Poly ethylene glycol(PEG), 분자량(MW): 1,500 g/mol) 4 g 및 Sn(Oct)2 0.04 g을 혼합한 후 110 ℃에서 2시간 동안 진공 건조시켜 수분을 제거하였다. 그런 다음, ε-카프로락톤(ε-Caprolactone)(MW: 114.14 g/mol) 및 락타이드(lactide)(MW: 114.124 g/mol)를 1:2.8(v/v) 비율로 첨가하고 질소로 채운 후 135 ℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 100 ml의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 반응물을 과량의 에테르/헥산(ether/hexane)(1:1(v/v))에 침전시켰다. 상기 침전물을 25 ℃ 진공오븐에서 건조하여 폴리(ε-카프로락톤-co-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤-co-락타이드)(poly(ε-caprolactone-co-lactide)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone-co-lactide), PCLA-PEG-PCLA)을 획득하였다.
상기 제조된 PCL-PEG-PCL을 25 ℃에서 PBS(pH 7.4)에 분산시킨 후 상기 실시예 1에서 추출한 엑소좀 용액과 혼합하여 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 액상을 제조하였다.
실시예 3. 온도 민감성 생체적합성 고분자의 특성 평가
본 발명에 따른 지방 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입 용이성을 평가하기 위해, 25 ℃에서 토출하중을 평가하였으며, 졸-젤(sol-gel)전이 특성을 레오미터(rheometer)를 통해 평가하였다.
또한, 1 ml 주사기에 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤 필러 및 엑소좀 미함유 필러 각각의 하이드로젤을 넣고 주입강도를 측정하는 만능재료시험기(Universal Testing Machine)를 이용하여 주입강도를 측정하였다.
실시예 4. 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤의 제거 평가
본 발명에 따른 지방 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤에 상기 온도 민감성 생체적합성 고분자 하이드로젤과 동일한 부피의 PBS를 첨가해 형성된 젤을 탈가교화(de-crosslinking) 시킴으로써 하이드로젤 제거 효과를 평가하였다.
실시예 5. 엑소좀의 방출거동 평가
상기 실시예 2에서 제조한 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 상기 실시예 1에서 추출한 인간 지방 줄기세포 유래 Flamma Flour 675 표지 엑소좀과 섞어준 후, 상기 엑소좀의 양이 개체 1마리 당 1x108 개가 되도록 동물모델에 100 μL씩 주입하여 소동물 생체 이미징 시스템(In vivo imaging system, IVIS) 이미징 장비를 통해 시간 경과에 따라 엑소좀에 표지된 형광의 강도를 측정함으로써 필러로부터의 엑소좀 방출거동 차이를 확인하였다.
소동물 광학영상장비를 통해 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 함유된 형광 표지된 엑소좀의 생체분포거동을 실시간으로 평가하였으며, 형광 표지된 엑소좀이 피부층에 머무르는 시간을 평가하였다.
실시예 6. 동물 모델을 이용한 항노화 기능성 필러의 효능 평가
본 발명에 따른 지방 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 피부층 내 콜라겐 생성 효능을 쥐 동물모델에서 평가하였다.
구체적으로, 피내주사를 통하여 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 고분자 25 wt.% 기준 엑소좀 양이 1 x 107개, 5 x 107개, 또는 1 x 108개가 되도록 주입한 후, 4주간 하이드로젤의 형태 유지를 확인하고 희생된 동물의 피부층을 절제하여 4 % 포르말린용액에 고정 후 파라핀으로 포매를 거쳐 4 μm 두께의 조직 절편을 제작하였다. 상기 조직 절편을 Masson’s trichrome으로 염색한 후 광학 현미경으로 관찰하여 콜라겐 생성효능을 평가하였다.
[실험예]
실험예 1. 온도 민감성 생체적합성 고분자의 특성 분석
상기 실시예 2에서 제조한 온도 민감성 생체적합성 고분자 PCL-PEG-PCL 및 PCLA-PEG-PCLA를 분광법을 통해 분석하였다.
구체적으로, 500 MHz에서 작동하는 1H NMR(Varian Unity Inova 500NB)를 사용하여 PCL-PEG-PCL(도 3a) 및 PCLA-PEG-PCLA(도 3b)의 화학적 구조를 확인 하였다. 도 3a 에서 3.56 피크는 PEG를 나타내며, 1.49, 1.24 피크는 poly(caprolactone)의 methylene proton을 의미한다. 도 3b 에서 3.56, 4.06, 5.11 ppm의 피크는 각각 PEG, poly(caprolactone), poly(lactide)를 의미한다. 1H NMR 결과를 통해 온도 민감성 생체적합성 고분자가 성공적으로 합성되었음을 알 수 있었다.
또한, 합성 중에 일정한 온도 유지와 질소 퍼지를 통하여 합성에 O2, H2O 와 같은 합성 외 필요한 분자들이 관여하지 못하게 함으로써, 최적의 조건으로 합성된 온도 민감성 생체적합성 고분자의 졸-젤 변화의 물성을 평가하였다.
상기 실시예 2의 방법으로 제조한 PCL2000-PEG1650-PCL2000을 15 wt.%, 17.5 wt.%, 20 wt.%, 22.5 wt.%, 25 wt.%로 조절하여 온도 민감성 생체적합성 고분자를 제조하고 졸-젤 변화의 물성을 평가한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 37 ℃에서 모두 젤 상태로 변하는 것을 확인하였으며, 상기 실시예 2의 방법으로 제조한 PCLA2000-PEG1650-PCLA2000 및 기존 제품을 구매한 PLLA4000-PEG2000-PLLA4000를 각각 25 wt.%로 조절하여 온도 민감성 생체적합성 고분자를 제조하고 졸-젤 변화의 물성을 평가한 결과, 도 4b(PCLA2000-PEG1650-PCLA2000) 및 4c(PLLA4000-PEG2000-PLLA4000)에 나타낸 바와 같이 두 가지 고분자 모두 37 ℃에서 젤 상태로 변하는 것을 확인하였다.
실험예 2. 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 형태학적 분석 및 이미지 관찰
상기 실시예 2의 방법으로 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러 및 엑소좀을 함유하지 않는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 제조하고, 각각의 필러 용액을 주사기에 봉입한 후, 형태를 비교한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 엑소좀 함유 유무는 필러의 투명도 및 색 변화에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
또한, 온도 변화 및 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 졸-젤 변화를 평가한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 25 ℃에서는 엑소좀 함유 및 미함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 모두 졸(sol) 상태로서 기울였을 때 흐르지만, 37 ℃에서는 기울여도 흐르지 않는 것을 관찰함으로써 젤(gel) 상태로 변화했음을 확인하였다.
이에 더하여, 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 공초점 형광현미경 이미지를 관찰한 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 적색 형광(Flamma Flour 675) 표지된 엑소좀이 녹색 형광(Flamma Flour 496) 표지된 온도 민감성 고분자 필러에 고르게 분포된 것을 확인하였다.
실험예 3. 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 유동학적 특성 및 주입강도 분석
상기 실시예 2의 방법으로 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러 및 엑소좀을 함유하지 않는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 제조하고, 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 유동학적 특성을 분석하기 위해, 레오미터(Rheometer, 점도계)를 이용하여 25 ℃ 내지 50 ℃에서 저장탄성률 및 손실탄성률을 측정하였다. 그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이 엑소좀 함유는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 저장탄성률 및 손실탄성률에 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 3의 방법으로 엑소좀 함유 유무에 따른 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입강도를 분석한 결과, 도 6b에 나타낸 바와 같이 엑소좀 함유는 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 주입강도에 영향을 미치지 않는 반면, 현재 가장 많이 사용되고 있는 히알루론산 필러인 레스틸레인(restylane®) 및 고분자 기반 필러인 스컬프트라(sculptra®) 필러의 주입강도는 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 비해 각각 11.4배, 1.7배로 상당히 높은 것을 확인하였다.
실험예 4. 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 탈가교화 효과 확인
상기 실시예 4의 방법으로 온도 민감성 생체적합성 고분자 및 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자의 탈가교화(de-crosslinking) 효과를 평가하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 엑소좀 함유 및 미함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 젤 변화 후 동일한 부피의 PBS를 첨가하였을 때 두 경우 모두 졸 상태로 변화하는 것을 확인함으로써, 엑소좀 함유 유무에 상관 없이 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 PBS 첨가에 의한 탈가교화 효과를 통해 하이드로젤을 분해할 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러의 엑소좀 방출거동 확인
상기 실시예 5의 방법으로 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 함유된 엑소좀의 방출거동을 평가하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 함유된 엑소좀(TS Gel/Exo)이 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러에 함유되어 있지 않은 엑소좀(Exo)에 비해 오랫동안 피부층 내에 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 6. 마우스 모델에서 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러 주입에 따른 콜라겐 합성 효과 확인
상기 실시예 6의 방법으로 엑소좀 함유 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러 주입에 따른 콜라겐 합성 효능을 마우스 모델에서 평가하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이 샘플 주입 24주 이후, 아무것도 주입하지 않은 조직(non-treated), 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러만 주입한 조직(TS gel), 및 엑소좀만 주입한 조직(Exo)에서는 조직학적 분석에서 유의미한 콜라겐 생성 효능을 나타내지 못하였다. 또한, 현재 가장 많이 사용되고 있는 히알루론산 필러인 레스틸레인(restylane®) 및 고분자 기반 필러인 스컬프트라(sculptra®) 필러에서도 조직학적으로 유의미한 콜라겐 생성은 나타내지 못하였다. 반면, 이와는 대조적으로 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러를 주입한 조직(TS gel/Exo)에서는 엑소좀 농도에 의존적으로 우수한 콜라겐 생성 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 샘플 주입 24주 후, 진피층 내의 콜라겐을 정량적으로 분석한 결과, 도 9b에 나타낸 바와 같이 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 아무것도 주입하지 않은 경우 대비 1.49배, 엑소좀 단독 주입 대비 1.53배, restylane® 대비 1.42배, sculptra® 대비 1.63배의 콜라겐 생성 효율을 나타내는 것을 확인하였다.
이에 더하여, 샘플 주입 24주 후, 콜라겐이 분포된 진피층의 두께를 정량적으로 분석한 결과, 도 9c에 나타낸 바와 같이 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러가 주입된 진피층의 두께는 아무것도 주입하지 않은 경우 대비 2.49배, 엑소좀 단독 주입 대비 1.68배, restylane® 대비 1.48배, sculptra® 대비 1.73배 증가되는 것을 확인하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 인간 지방 줄기세포 유래 엑소좀이 함유된 온도 민감성 생체적합성 고분자 필러는 뛰어난 콜라겐 생성 효과를 나타내는 것을 확인하여 주름개선 및 항노화 효능이 있음을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예 및 실험예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (12)
- 줄기세포 유래 엑소좀 및 양친매성 생체적합성 고분자를 유효성분으로 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 친수성 고분자의 양 말단에 소수성 고분자가 각각 결합된 소수성-친수성-소수성 고분자의 형태이고, 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 폴리(ε-카프로락톤)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤)(PCL-PEG-PCL), 폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(ε-카프로락톤-코-락타이드)(PCLA-PEG-PCLA), 및 폴리(L-락타이드)-b-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-락타이드)(PLLA-PEG-PLLA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 20 ℃ 내지 30 ℃에서 액체 상태로 존재하고, 33 ℃ 내지 40 ℃에서는 졸-젤(sol-gel) 전이를 통해 하이드로젤 상태로 변형이 일어나는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 소수성-친수성-소수성 고분자의 분자량 비가 1 : 0.2 내지 1 : 1인 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 필러 조성물은 콜라겐 생성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 필러 조성물 주입 시 엑소좀은 서방형 방출이 가능한 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물.
- (a) 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 단계;
(b) 친수성 고분자에 촉매를 혼합한 후, 소수성 고분자를 반응시킴으로써 소수성-친수성-소수성의 양친매성 생체적합성 고분자를 합성하는 단계; 및
(c) 상기 양친매성 생체적합성 고분자를 상기 엑소좀과 혼합하는 단계를 포함하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법으로서,
상기 양친매성 생체적합성 고분자는 온도 민감성을 가지는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 줄기세포는 인간 지방 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 반응은 100 ℃ 내지 150 ℃에서 12 내지 36시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 양친매성 생체적합성 고분자는 소수성-친수성-소수성 고분자의 분자량 비가 1 : 0.2 내지 1 : 1인 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 (c) 단계에서 양친매성 생체적합성 고분자는 20 ℃ 내지 30 ℃에서 PBS에 분산시킨 후 엑소좀과 혼합하는 것을 특징으로 하는, 피부 주름개선용 필러 조성물의 제조 방법.
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| KR1020220000692A KR20230105384A (ko) | 2022-01-04 | 2022-01-04 | 줄기세포 유래 엑소좀 및 온도 민감성 생체적합성 고분자를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20000000414A (ko) | 1999-10-20 | 2000-01-15 | 정형동 | 음료수용 캔의 탭 이송장치 |
-
2022
- 2022-01-04 KR KR1020220000692A patent/KR20230105384A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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