CN110234314A - 在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中干燥无细胞组织提取物的方法以及包含纳米原纤纤维素和无细胞组织提取物的干燥水凝胶 - Google Patents

Abstract

本公开涉及用对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的无细胞组织提取物进行干燥的方法，该方法包括提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，提供包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物，提供聚乙二醇，提供海藻糖，将水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖混合以获得混合物，并对混合物进行冷冻干燥，以在干燥的包含纳米原纤纤维素的水凝胶中获得无细胞组织提取物。本公开涉及包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的干燥水凝胶，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物，其中，干燥水凝胶的含水量为10％(w/w)或更低。

Description

在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中干燥无细胞组织提取物的 方法以及包含纳米原纤纤维素和无细胞组织提取物的干燥水 凝胶

技术领域

本公开涉及包含纳米原纤纤维素的水凝胶，所述纳米原纤纤维素包含无细胞组织提取物，其可以在医学应用中用作医疗产品；并且涉及用于制备并干燥该含有无细胞组织提取物的水凝胶的方法。医疗用途包括将生物活性剂递送至靶组织。

背景

纳米原纤纤维素是指从纤维素原料中得到的分离的纤维素原纤或原纤束。纳米原纤纤维素是基于自然界中丰富的天然聚合物。纳米原纤纤维素具有在水中形成粘性水凝胶的能力。

纳米原纤纤维素生产技术是基于浆料纤维的水性分散体的研磨。纳米原纤纤维素在分散体中的浓度通常极低，一般约0.3-5％。在研磨或均质化过程后，得到的纳米原纤纤维素材料是稀释的粘弹性水凝胶。

由于其纳米级结构，纳米原纤纤维素具有独特的性质，其能够实现常规纤维素不能提供的功能。然而，由于相同的原因，纳米原纤纤维素也是一种有挑战性的材料。例如，纳米原纤纤维素可能难以进行脱水或处理。此外，在脱水后，通常难以使得干燥的材料再水化或再凝胶化(regel)，以获得具有与脱水或干燥前的原始纳米原纤纤维素相同性质的材料。特别具有挑战性的脱水过程是冷冻干燥。

发明内容

一个实施方式提供了对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的无细胞组织提取物进行干燥的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物，

-提供聚乙二醇，

-提供海藻糖，

-混合水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖以获得混合物，并且

-对混合物进行冷冻干燥以获得在干燥的包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的干燥的无细胞组织提取物。

一个实施方式提供用所述方法或包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的干燥的水凝胶，所述无细胞组织提取物包括生物活性物质的混合物。

一个实施方式提供包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的干燥水凝胶，所述无细胞组织提取物包括生物活性物质的混合物，其中，水凝胶的含水量为10％(w/w)或更低，例如2-10％(w/w)。

独立权利要求中揭示了主要的实施方式。各种各样的实施方式在从属权利要求中公开。除非另有说明，从属权利要求中所述的实施方式和实施例可以互相自由组合。

令人惊讶地发现当在纳米原纤纤维素水凝胶中对无细胞组织提取物进行冷冻干燥的过程中组合使用聚乙二醇和海藻糖作为冷冻保护剂，可以获得干燥的产物，所述干燥的产物能够再水化或再分散成恢复包含纳米原纤纤维素的水凝胶中组织提取物的原始性质的形式，即，干燥的产物可以进行再凝胶化。该性质包括凝胶性质和无细胞组织提取物的活性，其可以进一步从水凝胶控释。含有纳米原纤纤维素的冷冻干燥水凝胶(其含有聚乙二醇和海藻糖)再凝胶化成与冷冻干燥之前类似的均质水凝胶，同时，仅含有聚乙二醇或海藻糖中一种的类似的冷冻干燥水凝胶再凝胶化成糊状和粒状的形式。所选择的冷冻保护剂的存在不会影响生物活性剂从凝胶释放的曲线。通过对水凝胶进行干燥，医疗产品可以获得非常长的保质期。特别是，含有在潮湿条件下不稳定的活性剂(例如，对水解敏感的试剂和蛋白质)的凝胶可以成功冷冻干燥成基本不含水或实际不含水且因此具有延长的稳定性和保质期的形式。该冷冻干燥医疗产品甚至可以在室温下储存，并且可以在使用前通过添加液体(例如，水或盐水)进行再凝胶化。此外，聚乙二醇和海藻糖的组合防止纳米原纤纤维素在溶液或分散体中沉淀或沉积，该效果不能单独通过冷冻保护剂中的一种来获得。

还发现含有纳米原纤纤维素的水凝胶可以用作提供各种不同分子可控释放的材料，例如，其可以用作活性治疗剂或美容剂。纳米原纤纤维素水凝胶能够提供活性剂的延长释放，该效果可以应用于各种医疗和美容用途。在各种水凝胶浓度和各种不同大小和类型的可释放分子中获得该效果。

包含纳米原纤纤维素的水凝胶的某些有利性质包括柔性、弹性和可重塑性。由于水凝胶含有大量水，其还可以显示出良好的渗透性。例如，当水凝胶用作修复伤口的覆盖物或用于其他医学应用时，例如用于输送治疗剂或美容剂时，这些性质是有用的。

柔性是许多应用中需要的特征，例如在医学应用中。例如，包含纳米原纤纤维素水凝胶的柔性贴片和敷料可用于施用到皮肤上，例如用于覆盖伤口和其它损伤或伤害，例如灼伤。

一些实施方式的水凝胶还提供高保水能力和分子扩散速度性质，这些性能在医学应用等(如伤口愈合)中是期望的。可以制备和/或成形大的水凝胶，其可用于覆盖大面积。

本文所述的水凝胶可用于医学应用，其中，包含纳米原纤纤维素的材料与活组织接触。发现纳米原纤纤维素在例如施用到皮肤上或施用到损伤区域上时提供了不寻常的性质。如本文所述的包含纳米原纤纤维素的产品与活组织高度生物相容并且提供若干有利效果。不囿于任意具体理论的束缚，认为含有极其亲水的纳米原纤纤维素的水凝胶具有非常高的比表面积，并因此具有高保水能力，当施用于皮肤或其它组织时，在组织或伤口和包含纳米原纤纤维素的水凝胶之间形成有利的潮湿环境。纳米原纤纤维素中的大量游离羟基在纳米原纤纤维素和水分子之间形成氢键，并实现纳米原纤纤维素的高保水能力和凝胶形成。因为纳米原纤纤维素水凝胶中的大量水，认为仅水与组织接触，并且可以实现液体和/或试剂从皮肤或伤口迁移到水凝胶或从水凝胶迁移到皮肤或伤口。

当将水凝胶用于覆盖伤口或其它损伤或伤害时，例如作为这样的产品或其它产品的部分(例如，膏药、敷料，医用贴片，或膏药、贴片或敷料的部分)，提供了多种效果。产品的可用性很好，因为该产品可以容易地施用和移除而不会被损坏，例如撕裂。当用于覆盖伤口时，水凝胶保护伤口免于感染，并且保持潮湿环境以使得伤口愈合。水凝胶不会像传统材料那样以不可逆的方式附着在受损的皮肤或伤口上，所述传统材料通常很难在不损坏愈合区域的情况下被移除。产品和皮肤之间的条件有助于损伤区域的愈合。

一些实施方式的医用水凝胶在治疗损伤皮肤(其中，皮肤可能在可变深度受损或甚至可能失去皮肤)时或者在移植物(例如皮肤移植物)的治疗中是特别有利的。水凝胶可以用于覆盖损伤或移植物区域并且其用作保护层。

水凝胶还可以用于向对象(例如，患者或使用者)可控和有效地释放和递送生物活性剂，例如包含在无细胞组织提取物中的试剂，例如通过透皮途径或通过其它途径，例如直接递送或释放到受损的皮下区域。控释是指例如在一段时间内获得所需的一种或多种试剂的释放速率和/或分布，这可能受到以下因素的影响：凝胶选择，例如凝胶的百分比或凝胶的厚度，可释放剂的浓度或形式，任何助剂的存在，或对可释放剂的释放速率和/或活性有影响的其他条件，例如pH，温度等。如前所述，组织和水凝胶之间的特定条件和释放特性的组合效果提供了物质到活组织中的有效递送。纳米原纤纤维素水凝胶提供了亲水基质，其是无毒、生物相容的，并且也是生物可降解的。例如，基质可以被酶促降解。另一方面，水凝胶在生理条件下是稳定的。

例如，本文公开的无细胞组织提取物(特别是脂肪组织提取物)可以用于软组织工程改造。软组织工程改造寻求制造由例如创伤导致的软组织缺陷的替换部件，例如烧伤和疤痕，手术切除或先天性畸形。此外，美容的使用(例如，面部皱纹的填充)是重组软组织的重要应用。特别优选的治疗靶标是含脂肪的皮下软组织，也称为下皮(hypodermis)、皮下组织、下皮层(subcutis)或浅筋膜，其是脊椎动物被皮系统的最下层。当用脂肪组织提取物处理皮下组织时，提取物的生物活性物质会促进皮下软组织和皮肤的再生。

发明详述

本公开提供了含有纳米原纤纤维素的水凝胶，其也可称为纳米原纤纤维素水凝胶。水凝胶可以作为产品提供，其也可以含有其他物质或其他元素，例如增强材料、覆盖材料、活性剂、盐等。水凝胶也可以作为医用水凝胶或医疗产品提供，或称为医用水凝胶或医疗产品。

更具体地说，本申请公开了含有纳米原纤纤维素、聚乙二醇和海藻糖的水凝胶中的无细胞组织提取物，所述无细胞组织提取物包括生物活性物质的混合物。

本申请公开了一种医用水凝胶，其含有纳米原纤纤维素和无细胞组织提取物，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物。该水凝胶可以用于在具有本文所述冷冻保护剂或没有本文所述冷冻保护剂的情况下将生物活性物质给予对象，例如患者。

术语“医疗”是指产品或其中产品(即，含有实施方式的水凝胶的产品)被用于或适用于医疗目的的用途。医疗产品可以被灭菌，或者它是可灭菌的，例如通过使用温度、压力、湿度、化学物质、辐射或其组合进行灭菌。产品可以例如高压处理，或者可以使用其它利用高温的方法处理，在这种情况下，产品应当耐受超过100℃的高温，例如至少121℃或134℃的高温。在一个实例中，产品在121℃下高压灭菌15分钟。该温度处理应当优先在将任意生物活性剂添加到产品之前进行，以避免生物活性剂变性。还希望医疗产品不含热原，并且它不含有不希望的蛋白质残留物等。医疗产品优选对靶标非毒性。也可使用紫外灭菌。医疗产品也可以适用于例如美容目的。

一些实施方式的纳米原纤纤维素(NFC)水凝胶(例如，阴离子NFC水凝胶)能够以时间函数控释活性剂，特别是当温度和pH恒定时尤为如此。发现NFC水凝胶可以用特定的赋形剂冷冻干燥并仍然可以再胶凝化。实验证实，NFC水凝胶的冻干实际上对非冷冻干燥样品和冷冻干燥样品和再凝胶化样品之间的释放曲线没有影响，其是相同的。结果表明：将PEG和海藻糖一起作为冷冻保护剂的冷冻干燥方法实际上对所用NFC水凝胶(例如阴离子水凝胶)的释放能力没有影响。阴离子水凝胶对于许多应用是优选的。例如，与其它级别不同，阴离子改性的纳米原纤纤维素不容易沉淀。阴离子(aniconic)级别还特别适用于释放某些活性剂。

在该说明书中，除非另有特别说明，百分数数值是基于重量(w/w)。如果给出任何数值范围，则该范围包括给出的上限值和下限值。

一个实施方式提供了在含有纳米原纤纤维素、聚乙二醇和海藻糖的水凝胶中的可冷冻干燥的无细胞组织提取物，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物。聚乙二醇和海藻糖用作冷冻保护剂以提供协同效应，其允许纳米原纤水凝胶以这样的方式进行冷冻干燥，以获得与冷冻干燥前的水凝胶基本相同性质的冷冻干燥产品。当单独使用聚乙二醇或海藻糖时，它们均未显示出这样显著的防冻效果，可以表明其作为纳米原纤纤维素水凝胶的冷冻保护剂是有效的，或者例如防止纳米原纤纤维素沉淀。在一实例中，由水凝胶的总质量计算，可冷冻干燥的水凝胶包含0.1-2％(w/w)的聚乙二醇和0.05-1.0(w/w)的海藻糖。在一个实施方式中，无细胞组织提取物是脂肪组织提取物，例如，人脂肪组织提取物。

一个实施方式提供了对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中干燥无细胞组织提取物的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物，

-提供聚乙二醇，

-提供海藻糖，

-混合水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖以获得混合物，并且

-对混合物进行冷冻干燥以获得在干燥的包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的无细胞组织提取物。

一个实施方式提供了一种医用水凝胶，其含有纳米原纤纤维素和无细胞组织提取物，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物。一个实施方式提供了一种医用水凝胶，其含有纳米原纤纤维素和无细胞组织提取物以及另外的一种或多种治疗剂或美容剂，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物。医用水凝胶用于将物质或试剂给予对象。医用水凝胶还可以包含其它成分，例如，如本文所述的聚乙二醇和海藻糖。对象可以是患者或需要试剂的任意其它对象，例如人类或动物。

无细胞组织提取物

将组织提取物与包含纳米原纤纤维素的水凝胶合并。该组织提取物是无细胞的或者是非细胞的，这些术语可以交换使用。无细胞组织提取物包含生物物质的混合物，其意味着组织提取物包含超过一种类型的生物活性物质，其也可以称为生物活性剂。生物活性物质可以是蛋白质，激素，因子，例如生长因子、分化因子或任何其它生物活性因子，或任何其它生物活性物质或分子。生物活性物质还可以包括细胞外组分，即存在于细胞外空间的组分，例如蛋白质和非蛋白质物质，例如DNA、RNA或脂质；或细胞外原纤，例如胶原蛋白，弹性蛋白，蛋白多糖，或可含有生物活性蛋白质或核酸的胞外囊泡，例如微囊泡或其它囊泡。生物活性物质由源细胞获得，所述来源细胞可以来源于组织或细胞培养物。生物活性物质或生物活性剂或生物活性化合物是对活生物体、组织或细胞有影响的物质。无细胞组织提取物不是指单独分离的蛋白质或其它分子，而是指从源细胞一起获得的一组物质，其可以是一种类型或超过一种类型。包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物在本文中也可以称为无细胞组织提取物。

本文中所用的组织是指任意动物或植物组织。在一个实施方式中，组织是动物组织，例如，人组织。该组织可以是软组织，其包括连接、支撑或包围身体其它结构和器官的组织。在一实例中，组织不包含硬组织，例如骨骼。软组织的实例包括肌腱、韧带、筋膜、皮肤、纤维组织、脂肪组织和滑膜(其是结缔组织)以及肌肉、神经和血管(其不是结缔组织)。本文所用的组织还包括血液和其它包含细胞的流体，例如，体液和细胞培养基。

组织可以从动物或人的身体获得。无细胞组织提取物可以从小组织块或活细胞获得。在一个实施方式中，无细胞组织提取物从组织获得，例如，活细胞，即，活着的细胞(living cell)，所述组织由身体直接获得，例如，从身体获得的样品或组织分离物，即，细胞并未经过培养。小组织块是指由来源(例如，身体)获得的组织，并且其已经切成块但可能未被均质化。无细胞组织提取物是从源细胞获得的溶液，例如通过使细胞破裂并去除所有颗粒物获得的溶液，或通过在溶液中孵育活细胞而未使细胞破裂或均质化并从溶液中回收提取物而获得的溶液。溶液可以是水性溶液，例如盐水溶液、缓冲溶液或细胞培养基。当细胞未破裂或均质化时，仅提取分泌的物质和细胞外物质，从而导致提取物中更多有限量的不同物质。在一实例中，无细胞组织提取物(特别是脂肪组织提取物)通过吸脂术从身体获得。通过吸脂术获得的组织是均质型组织分离物的具体实例，其中，细胞基本不破裂或崩解，但至少部分、优选大部分细胞是活的。从去除的组织获得的细胞(例如活组织检查、吸脂术等)可以含有细胞外组分。

在一个实施方式中，无细胞组织提取物由经培养的细胞获得，例如，在条件培养基中培养的细胞。一个或多个条件培养基是已经被细胞部分使用的培养基，例如其中细胞经过数小时或数天培养的培养基。尽管一些组分耗尽，但其富含细胞衍生材料，例如少量的细胞因子、生长因子等。该细胞条件培养基将以低得多的密度支持细胞的生长，并且可以与一些新鲜培养基混合。在该情况下，无细胞组织提取物可以是条件培养基，或者它可以来自条件培养基。

通常，组织提取物可以在从细胞回收后进行过滤。这可以通过使用具有这样截止值的过滤器来进行，其能够使得具有生物活性物质的溶液通过但是防止细胞或细胞碎片通过过滤器。确保提取物中不含细胞的另一选择是对提取物进行离心并回收上清液。

源细胞可以是原核或真核细胞。例如，可以包括微生物细胞，例如细菌细胞或酵母细胞。真核细胞可以是植物细胞或动物细胞。该细胞优选是动物细胞，更优选是人细胞。细胞的实例包括：干细胞、未分化细胞、前体细胞、以及完全分化的细胞及它们的组合。真核细胞的实例包括：可移植细胞，例如，干细胞，例如，万能(omnipotent)细胞、多潜能(pluripotent)细胞、多能(multipotent)细胞、寡能(oligopotent)细胞或单能(unipotent)细胞。在人胚胎干细胞的情况下，细胞可以来自沉积的细胞系或由未受精的卵[即“孤雌生殖体(parthenote)”卵]制成，或来自孤雌生殖活化的卵，从而不会破坏人胚胎。在一些实例中，细胞包含选自下组的细胞类型：角膜细胞、角化细胞、成纤维细胞、上皮细胞及它们的组合。在一些实例中，细胞选自下组：干细胞、祖细胞、前体细胞、结缔组织细胞、上皮细胞、肌细胞、神经细胞、内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞、平滑肌细胞、基质细胞、间充质细胞、免疫系统细胞、造血细胞、树突细胞、毛囊细胞及它们的组合。

在一个实施方式中，无细胞组织提取物不是获自经培养的细胞。经培养的细胞表现出与由从身体直接得到的组织所获得的细胞不同的源细胞类型，并且其可具有不同的最终用途。

在一个实施方式中，无细胞组织提取物是脂肪组织提取物，例如，人脂肪组织提取物。含有脂肪组织提取物的产品可用于提供适用于细胞增殖和分化的微环境，因此导致形成脂肪组织而无需外源性细胞移植。最佳的微环境使得脂肪干细胞从周围组织的迁移提高，并诱导细胞分化成成熟的脂肪细胞。发育中的组织需要新血管形成以避免移植组织的坏死、疤痕形成和再吸收，并分泌多种分化因子。

一个实施方式提供了无细胞脂肪组织提取物，其优选以预定量至少包含VEGF、FGF-2和IGF-1。无细胞脂肪组织提取物可以进一步含有一种或多种其它生物活性物质或本文公开的其它物质。在一个实施方式中，提取物至少包含：每1mg总蛋白质，至少1pg的VEGF、至少70pg的FGF-2、以及至少50pg的IGF-1。在一个实施方式中，每1mg总蛋白质的VEGF含量为至少7pg。该提取物可用于软组织修复或工程改造以及组织工程改造中的血管形成诱导，例如伤口愈合、治疗烧伤和治疗缺血性病症。该用途的一个具体实例是治疗皮下软组织缺失。

一个实例是提供用于制备无细胞组织提取物(例如，无细胞脂肪组织提取物)的方法。该方法包括以下步骤：a)提供含有活细胞的非均质化组织样品，例如，脂肪组织样品，b)在溶液中将所述样品孵育预定时间，以及c)从溶液中收集或回收提取物，或者收集或回收溶液作为提取物。所述方法还可以包括先洗涤或以其它方式去除破裂或均质化的细胞，以提供仅包含活细胞或主要包含活细胞的样品。所述方法还可以包括：对提取物进行最终过滤以从提取物中去除任意剩余的细胞。另一实例提供用所述方法可获得的无细胞组织提取物，例如，无细胞脂肪组织提取物。例如，预定时间可以是5分钟至48小时，例如1–24小时，0.5–2小时，1–2小时，0.5–6小时，0.5–12小时，1–12小时，2–12小时或12–24小时，例如约1小时、约2小时、约24小时或约48小时。

脂肪组织包括各种分化状态的脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞和脂肪干细胞以及能够分化成多个细胞谱系的间充质干细胞。脂肪从头形成(即，形成新脂肪组织)是有前景的软组织工程改造方法。使用脂肪组织是基于如下研究：试图提供适用于细胞增殖和分化的微环境，由此导致形成血管和脂肪组织而无需外源性细胞移植。最佳的微环境使得脂肪干细胞从周围组织的迁移提高，并诱导内皮细胞和脂肪前体细胞分化成成熟的脂肪细胞、松散的结缔组织和肌细胞和血管细胞。发育中的组织总是需要新血管形成以避免坏死和疤痕形成，即，使得功能性成熟脂肪组织能够发育。

本文所述的无细胞脂肪组织提取物(ATE)具有诱导脂肪组织和血管在给药部位快速形成而无需给予细胞的潜力。ATE能够为脂肪从头形成和血管形成产生最佳微环境，并且因此可用于软组织修复和/或工程改造。

本文所用的术语“脂肪组织提取物”(ATE)是指由脂肪组织细胞分泌的生物活性物质、优选脂肪形成和血管形成因子，即，不同分化状态的脂肪组织、内皮细胞、成纤维细胞、周细胞以及脂肪干细胞。脂肪组织提取物与传统的条件培养基不同，例如，提取物是从小组织块或活细胞收集的。ATE的制备过程不包括细胞培养，所获得的提取物比条件培养基浓缩得多，并且孵育时间短，从几分钟到几天不等。

脂肪组织提取物可以由脂肪或由例如吸脂术或外科手术获得的脂肪组织样品制成。如需要，将组织样品切成小块，以使细胞基本保持活的。可以直接使用吸脂术材料。换言之，组织样品的处理不包括均质化。通过在培养基中、在无菌盐溶液中、在磷酸盐缓冲盐水中或其它合适的等渗水性缓冲溶液中孵育细胞来提取生物活性因子，其中在孵育期间细胞或组织块将生物活性因子释放到液相中。然后收集ATE，即，没有细胞的液相。ATE也可以在使用前进行过滤以对提取物进行灭菌并确保提取物是无细胞液体。所得到的ATE是包含蛋白质(例如，细胞因子)和其它生物活性物质的无细胞混合物。

不仅自体的、而且同种异体的脂肪组织可以用作ATE的来源，并且可以进行处理以按如上所述完成。由于提取物是无细胞的，即使在将相同提取物用于多个患者的同种异体使用中也不太可能发生免疫应答和过敏反应。这得到先前进行的动物研究的支持，其中植入大鼠的人ATE(异种移植物)不会引起任何炎症反应或其它并发症。

ATE是由脂肪组织细胞表达的脂肪形成和血管形成因子的最佳细胞因子混合物。ATE的生物活性物质可以通过本领域中已知的常规方法(例如ELISA)测量。在之前的研究中，对各种ATE中的120种细胞因子的表达进行测量。较长的孵育时间(例如24小时或更长时间)产生更多的血管形成提取物，而短的孵育时间和长的孵育时间都产生脂肪形成混合物。

ATE可以调节为包含所需或预定量的脂肪形成和血管形成因子，包括血管内皮细胞生长因子(VEGF)、基础成纤维细胞生长因子(FGF-2)和胰岛素样生长因子(IGF-1)。所需要的组合物可以取决于预期用途。根据目前的知识，VEGF和FGF-2被认为是刺激血管形成的重要因子，而FGF-2和IGF对于刺激脂肪形成很重要。因此，在一个实施方式中，ATE至少包含：每1mg总蛋白质，至少1pg的VEGF、至少70pg的FGF-2、以及至少50pg的IGF-1。该ATE特别适合用于例如在软组织修复和工程改造中刺激脂肪形成。在另一个实施方式中，ATE至少包含：每1mg总蛋白质，至少7pg的VEGF、至少70pg的FGF-2、以及至少50pg的IGF-1。该类ATE特别用于刺激血管生成，例如在诱导伤口愈合和处理缺血性病症和烧伤中用于刺激血管生成。不同调节的ATE还可以含有不同量的多种其它细胞因子，虽然其对于特定应用可能并不总是至关重要的。通常，ATE应当包含约2:1至约1:2的IGF-1和FGF-2以及约1:100至约1:10的VEGF和FGF-2。

可以通过在ATE的制备中使用不同的孵育时间和温度来调节脂肪组织提取物的含量。通常，孵育时间的范围为几分钟至几小时，例如，过夜。例如，约1小时的孵育时间通常获得1.7–2.5mg/ml的总蛋白质含量，200–1300pg/ml的IGF-1含量，200–1400pg/ml的FGF-2含量和2–25pg/ml的VEGF含量。换言之，1小时的孵育时间通常获得每1mg总蛋白质150–550pg的IGF-1含量，每1mg总蛋白质100-500pg的FGF-2含量和每1mg总蛋白质3-20pg的VEGF含量。该类型的提取物是脂肪形成和血管形成的。然而，如果在提取物中需要特别高的VEGF浓度(200–1400pg/ml，每1mg蛋白质25–500pg的VEGF)，例如，特别是在所需靶组织中诱导血管形成，孵育时间应当延长至例如约24小时。24小时的孵育时间通常获得每1mg总蛋白质60-200pg的IGF-1含量，每1mg总蛋白质130-500pg的FGF-2含量和每1mg总蛋白质25-500pg的VEGF含量。此外，各种孵育温度(通常是室温至约37℃)可以用于改变脂肪组织提取物。然而在一些实施方式中，可以使用更低的温度，例如4℃。在其它实施方式中，可以使用更高的温度，只要蛋白质不会变性即可。

更一般地，提取物中VEGF的浓度范围为1–1400pg/ml，优选10–1000pg/ml，更优选7–700pg/ml，最优选10–100pg/ml。提取物中FGF-2的浓度范围为20-1500pg/ml，优选100–1300pg/ml，更优选150–1000pg/ml，最优选200-800pg/ml。提取物中IGF-1的浓度范围为100-1500pg/ml，优选150–800pg/ml，最优选200-500pg/ml。另一方面，提取物的总蛋白质浓度范围可以是0.75–3.5mg/ml。总蛋白质浓度范围优选为1.4-2.7mg/ml，更优选1.8–2.7mg/ml，更优选2-2.7mg/ml，最优选2.1-2.5mg/ml。

提取物中生物活性物质的浓度也可以相对于提取物的总蛋白质浓度来限定。因此，含有1mg总蛋白质的提取物中VEGF的量(每1mg蛋白质的生长因子含量)范围可以为1-800pg，优选3.5-500pg，更优选7-300pg，最优选20-100pg。含有1mg总蛋白质的提取物中FGF-2的量(每1mg蛋白质的生长因子含量)范围可以为1-1200pg，优选1–600pg，更优选70-500pg，甚至更优选110–450pg，最优选250–350pg。IGF-1的量(每1mg蛋白质的生长因子含量)范围可以为50-700pg，优选100-500pg，更优选100-300pg，最优选110-230pg。

ATE还可包含天然地或加入其中以进一步调节ATE的多种其它生物活性物质或其它物质，例如脂肪形成因子和血管形成因子，例如生长因子，白介素，补体系统产品，糖皮质激素，前列腺素，脂蛋白和游离脂肪酸，以及细胞外基质组分，例如胶原蛋白I，胶原蛋白IV和胶原蛋白VI，蛋白聚糖，弹性蛋白，囊泡如含有调节蛋白、肽和/或核酸的微囊泡，以及透明质酸。此外，例如，ATE可以在使用前补充任何所需的其它药物或药剂。可以存在于ATE中的物质的实例包括：血管生成素、脂联素、TIMP-1和TIMP-2、MIF、IGFBP-6、NAP-2、瘦体素、PDGF-BB、GRO、IL-6、MCP-1、瘦体素、CCL5和VEGF。

另一方面，可以通过在使用前去除物质(如单一生长因子或细胞因子)来进一步调节ATE。例如，如果ATE用于主要诱导血管形成，例如处理缺血性病症，可以去除血管生成抑制剂(例如TIMP-1和TIMP-2)以及主要的脂肪形成因子(例如IGF-1、脂联素和/或瘦体素)。本领域容易获得去除或分离所需物质的方法，包括通过免疫吸附分离生长因子。

对ATE进行调节可以进一步包括浓缩(例如通过离心)或稀释(例如用培养基、无菌生理盐溶液或任意其它缓冲等渗溶液)以获得用于特定用途的合适ATE。

在一些实例中，如本文所述的水凝胶中包含的ATE可以用作细胞培养基或细胞培养基补充物以在体外研究脂肪形成或血管形成。ATE导致分化的脂肪细胞在细胞培养物中均匀分布，因此，提供了优异的反映人体内情况的脂肪形成的细胞模型。迄今为止，还没有适合的脂肪形成分化的细胞模型。一个实例提供了用于诱导脂肪形成的方法以及诱导血管形成的方法。所述方法包括向有此需要的患者提供本文所述水凝胶或医疗产品。

总体目标是在细胞培养中、特别是在临床应用中替代异种血清。人血清非常昂贵，因此不是最佳解决方案。在一些实例中，ATE可用作细胞培养基中的细胞培养组分或血清替代物。这不仅成本低，而且可用于产生组织工程改造的人构建体，特别是当动物衍生的组分不适合时尤为如此。

水凝胶中组织提取物(例如，脂肪组织提取物)的含量可以变化。组织提取物含量可以表示为蛋白质含量，即使组织提取物也可以含有一些非蛋白质物质。通常，水凝胶可以包含300μg/ml–1.2mg/ml、优选600μg/ml–1mg/ml、更优选800–900μg/ml的蛋白质。

当制备含有无细胞提取物的水凝胶时，主要原料包含纳米原纤纤维素，其包含直径在亚微米范围内的纤维素原纤或由直径在亚微米范围内的纤维素原纤组成。该材料即使在低浓度下也形成自组装的水凝胶网络。这些纳米原纤纤维素的凝胶本身具有高剪切稀化性和假塑性。

纳米原纤纤维素

通常由植物来源的纤维素原料制备纳米原纤纤维素。原料可以基于含纤维素的任意植物材料。原料也可以源自某些细菌发酵过程。在一个实施方式中，植物材料是木材。木材可以来自软木树如云杉、松树、冷杉、落叶松、花旗松或铁杉，或来自硬木树如桦树、白杨、杨树、桤木、桉树、橡树、山毛榉或刺槐，或者来自软木和硬木的混合物。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从木浆获得。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从硬木浆获得。在一个实例中，硬木是桦木。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素从软木浆获得。

纳米原纤纤维素优选由植物材料制备。在一个实例中，原纤是从非薄壁(non-parenchymal)植物材料获得的。在这种情况下，原纤可以从次生细胞壁获得。这种纤维素原纤的一种丰富来源是木纤维。纳米原纤纤维素是通过对来自木材的纤维状原料进行均质化制得，所述纤维原料可以是化学浆料。使纤维素纤维崩解以产生直径仅为数纳米的原纤，其直径最多为50纳米，例如，1-50μm，并且得到在水中的原纤分散体。原纤的尺寸可以减小到大部分原纤的直径仅在2-20纳米的范围内。来源于次生细胞壁的原纤基本为晶体，其结晶度至少为55％。这种原纤可以具有与源自初生细胞壁的原纤不同的性质，例如源自次生细胞壁的原纤的脱水可能更具挑战性。

如本文所用，术语“纳米原纤纤维素”是指从基于纤维素的纤维原料分离的纤维素原纤或原纤束。这些原纤具有高纵横比(长度/直径)的特征：它们的长度可超过1μm，而直径一般保持小于200nm。最小的原纤处于所谓的初级原纤的级别，直径一般为2至12nm。原纤的尺度和尺寸分布取决于精制方法和效率。纳米原纤纤维素可表征为基于纤维素的材料，其中颗粒(原纤或原纤束)的中值长度不超过50μm，例如在1至50μm的范围内，并且颗粒直径小于1μm，合适的范围是2至500nm。在天然纳米原纤纤维素的情况中，在一个实施方式中原纤的平均直径在5至100nm的范围内，例如在10至50nm的范围内。纳米原纤纤维素的特征为大比表面积和强的形成氢键的能力。在水分散体中，纳米原纤纤维素一般呈现为浅色或混浊的凝胶状材料。根据纤维原料，纳米原纤纤维素也可含有少量的其它木质组分，如半纤维素或木质素。该量取决于植物来源。纳米原纤纤维素的常用别名包括纳米原纤化纤维素(NFC)和纳米纤维素。

不同级别的纳米原纤纤维素可基于三个主要特性分类：(i)尺寸分布、长度和直径，(ii)化学组成，和(iii)流变性质。要充分描述一个级别，可以并行使用这些性质。不同级别的实例包括天然(或未改性)NFC、氧化NFC(高粘度)、氧化NFC(低粘度)、羧甲基化NFC和阳离子化NFC。在这些主要级别中，还存在亚级别，例如：极佳原纤化相比于中度原纤化、高度取代相比于低度取代、低粘度相比于高粘度，等等。原纤化技术和化学预改性对原纤尺寸分布有影响。通常，非离子级别具有更宽的原纤直径(例如10-100nm，或10-50nm)，而化学改性级别则要细很多(例如2-20nm)。改性级别的分布也更窄。某些改性(尤其是TEMPO-氧化)会产生更短的原纤。

根据原料来源不同，例如硬木(HW)和软木(SW)浆料，最终纳米原纤纤维素产品中存在不同的多糖组成。通常，从漂白的桦木浆料制备非离子级别，会产生高含量的二甲苯(25重量％)。从HW或SW浆料制备改性级别。在这些改性级别中，半纤维素与纤维素域一起被改性。最可能地，该改性是不均匀的，即，一些部分相比其它部分改性程度更高。因此，不可能进行详细的化学分析——改性产物通常是不同多糖结构的复杂混合物。

在水性环境中，纤维素纳米纤维的分散体形成粘弹性水凝胶网络。该凝胶由分散和水合的缠结原纤在相对低浓度(例如0.05至0.2％(w/w))下形成。NFC水凝胶的粘弹性可用例如动态振动流变学测量来表征。

纳米原纤纤维素水凝胶呈现出特有的流变性质。例如，纳米原纤纤维素水凝胶是剪切稀化或假塑性材料，这意味着其粘度取决于使材料变形的速度(或作用力)。当在旋转流变仪中测量粘度时，观察到以下剪切稀化特性：随着剪切速率增加而粘度降低。水凝胶显示出塑性，这意味着在材料开始容易流动之前需要一定的剪切应力(作用力)。该临界剪切应力经常被称作屈服应力。屈服应力可由用应力控制的流变仪测定的稳态流动曲线确定。当将所述粘度绘制为所施加的剪切应力的函数时，可看到在超过临界剪切应力后粘度急剧下降。零剪切粘度和屈服应力是描述材料悬浮能力的最重要流变参数。这两个参数能够非常清楚地区分不同的级别，从而能对级别进行分类。

原纤或原纤束的尺寸取决于原料和崩解方法。可采用任何合适的设备，如精制机、研磨机、分散器、均质机、磨碎机(colloider)、摩擦研磨机、销棒粉碎机(pin mill)、转子-转子解胶机、超声波破碎器、流化器(如微流化器、大流化器(macrofluidizer)或流化器型均质机)来对纤维素原料进行机械崩解。在存在足够的水以防止纤维间形成键的条件下进行崩解处理。

在一个实例中，通过使用具有至少一个转子、桨叶或类似移动机械单元的分散器进行崩解，所述分散器例如是具有至少两个转子的转子-转子解胶机(rotor-rotordispergator)。在分散器中，当桨叶以由半径(到转轴的距离)确定的圆周速度和旋转速度以相反方向旋转时，分散体中的纤维材料被转子的桨叶或拱肋从相反方向反复撞击。由于纤维材料在径向上向外转移，其撞在一个接着一个以高圆周速度从相反方向过来的桨叶(即拱肋)的宽表面上；换而言之，其受到来自相反方向的几次连续冲击。同样，在桨叶的宽表面(即拱肋)的边缘处(其边缘与下一个转子桨叶的相对边缘形成桨叶间隙)，出现剪切力，其有助于纤维的崩解并使原纤脱离。撞击频率取决于转子的旋转速度、转子的数量、各转子中桨叶的数量和分散体通过装置的流速。

在转子-转子解胶机中，纤维材料通过反向旋转的转子被引入，并且按照以下方式沿着相对于转子转轴的径向方向向外移动并籍此而同时发生原纤化：所述材料反复受到由不同的反向旋转转子引起的剪切和撞击力。转子-转子解胶机的一个实例是Atrex装置。

适于进行崩解的设备的另一实例是销棒粉碎机，例如多重外周销棒粉碎机。该设备的一个实例如US 6202946B1所述，其包括外壳，且在所述外壳内具有装配有碰撞表面的第一转子；与第一转子同心并装配有碰撞表面的第二转子，该第二转子被设置为以与第一转子相反的方向旋转；或与第一转子同心并装配有碰撞表面的定子。该设备包括位于外壳中的进料孔并向转子或转子和定子的中央开口，和外壳壁上的出料孔并向最外部转子或定子的外周开口。

在一个实施方式中，崩解通过使用均质机进行。在均质机中，纤维材料在压力的作用下均质化。纤维材料分散体均质化成纳米原纤纤维素是由分散体的强制通流引起的，这使得材料崩解为原纤。纤维材料分散体在给定的压力下通过窄通流间隙，其中，分散体线性速度的增加使分散体受到剪切力和撞击力，导致从纤维材料中移去原纤。纤维片段在原纤化步骤中崩解为原纤。

在本文中，术语"原纤化"一般指通过向颗粒作功(work)来机械崩解纤维材料，其中纤维素原纤从纤维或纤维片段中脱离。该功可基于各种作用，例如研磨、碾碎或剪切、或它们的组合，或者能够降低颗粒尺寸的其它相应的作用。精制的功所消耗的能量通常以能量/(处理的原料量)表示，单位例如是千瓦时/千克(kWh/kg)，兆瓦时/吨，或者与这些成比例的单位。表述“崩解”或“崩解处理”可与“原纤化”互换使用。

经历原纤化的纤维材料分散体是纤维材料和水的混合物，在本文中也被称为“浆料(pulp)”。纤维材料分散体一般可指整个纤维、从中分离的部分(片段)、原纤束或与水混合的原纤，并且一般地，水性纤维材料分散体是这类元素的混合物，其中组分之间的比例取决于加工程度或处理阶段，例如同一批次纤维材料在处理过程中的运行次数或“通过”次数。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是使用含有所述纳米原纤纤维素的水溶液的粘度。粘度可以是例如布氏粘度或零剪切粘度。如本文所述，比粘度区分纳米原纤纤维素与非纳米原纤纤维素。

在一个实例中，用布氏粘度计(布氏粘度)或者其它对应设备来测量纳米原纤纤维素的表观粘度。合适地使用桨式转子(vane spindle)(73号)。有几种市售的布氏粘度计可用于测量表观粘度，它们都基于相同的原理。合适地，在设备中使用RVDV弹簧(RVDVspring)(布氏RVDV-III)。用水将纳米原纤纤维素的样品稀释至0.8重量％的浓度，并混合10分钟。稀释的样品物质添加到250mL烧杯中，将温度调节至20℃±1℃，如果需要的话进行加热，并混合。使用10rpm的低转速。

在该方法中作为原料提供的纳米原纤纤维素可以通过其在水溶液中提供的粘度来表征。粘度描述了例如纳米原纤纤维素的原纤化程度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。所述纳米原纤纤维素在分散于水中时在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的的布氏粘度范围的实例包括2000–20000mPa·s、3000–20000mPa·s、10000–20000mPa·s、15000–20000mPa·s、2000–25000mPa·s、3000–25000mPa·s、10000–25000mPa·s、15000–25000mPa·s、2000–30000mPa·s、3000–30000mPa·s、10000–30000mPa·s和15000–30000mPa·s。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含未改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是未改性的纳米原纤纤维素。发现未改性的纳米原纤纤维素的排液明显比例如阴离子级别更快。未改性的纳米原纤纤维素通常具有在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的2000–10000mPa·s范围内的布氏粘度。

崩解的纤维状纤维素原料可以是改性的纤维状原料。改性的纤维状原料是指纤维受处理影响的原料，从而纤维素纳米原纤更易于从纤维上脱离。通常对液体中悬浮物(即浆料)形式存在的纤维状纤维素原料进行改性。

对纤维的改性处理可以是化学或物理性的。在化学改性中，纤维素分子的化学结构通过化学反应(纤维素的“衍生化”)改变，优选使纤维素分子的长度不受影响但将官能团添加至聚合物的β-D-吡喃葡萄糖单元。纤维素的化学改性在某一转化度发生，该转化度取决于反应物的剂量和反应条件，原则上化学改性是不完全的，以使得纤维素将作为原纤保持固体形式并不溶于水。在物理改性中，阴离子型、阳离子型或非离子型物质或其任意组合物理吸附在纤维素表面上。改性处理也可以是使用酶的。

特别地，在改性之后纤维中的纤维素可以是离子带电的，这是因为纤维素的离子电荷减弱了纤维的内部键，之后会有助于崩解至纳米原纤纤维素。可以通过纤维素的化学改性或物理改性实现离子带电。与起始原料相比，改性之后的纤维可具有较高的阴离子或阳离子电荷。最普遍使用的用于制备阴离子电荷的化学改性方法是氧化(其中羟基被氧化为醛和羧基)、磺化以及羧甲基化。进而，可以通过使得阳离子基团(例如季铵基团)连接至纤维素来进行阳离子化，从而以化学方式产生阳离子电荷。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含化学改性的纳米原纤纤维素，例如阴离子改性的纳米原纤纤维素或阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阴离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是阳离子改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是氧化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是磺化的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，阴离子改性的纳米原纤纤维素是羧甲基化的纳米原纤纤维素。化学改性的纳米原纤纤维素可以用于影响某些活性剂的释放曲线。例如，阴离子级别可以用于释放带阳离子电荷的分子以获得延长的释放速率，反之亦然。

纤维素可以被氧化。在纤维素的氧化中，纤维素的伯羟基通过杂环硝酰基化合物(例如2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基，通常称为“TEMPO”)进行催化氧化。纤维素β-D-吡喃葡萄糖单元的伯羟基基团(C6-羟基基团)被选择性地氧化为羧酸基团。还由伯羟基形成一些醛基。关于这一发现，即低氧化程度不能实现足够有效的原纤化而较高的氧化程度造成机械破坏处理之后的纤维素降解，纤维素可以氧化成一水平，该水平下在氧化的纤维素中通过电导滴定测定的羧酸含量为0.6–1.4mmol COOH/g浆料，或0.8-1.2mmol COOH/g浆料，优选为1.0-1.2mmol COOH/g浆料。当由此得到的氧化的纤维素的纤维在水中崩解时，它们提供个体化纤维素原纤的稳定透明分散体，该个体化纤维素原纤的宽度可以例如为3-5nm。当氧化的浆料作为起始培养基时，可以得到在0.8％(w/w)稠度下测得的布氏粘度至少为10000mPa·s、例如在10000–30000mPa·s范围内的纳米原纤纤维素。

在本发明中无论何时提及催化剂“TEMPO”，很明显所有涉及“TEMPO”的测量和操作都等同地或者类似地适用于TEMPO的任意衍生物或者任意能够选择性催化纤维素中C6碳的羟基基团的氧化的杂环硝酰基自由基。

在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少10000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少15000mPa·s的布氏粘度。在一个实施方式中，这些化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少18000mPa·s的布氏粘度。所用的阴离子纳米原纤纤维素的例子的布氏粘度在13000–15000mPa·s或18000–20000mPa·s范围内，或甚至最高达25000mPa·s，这取决于原纤化的程度。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。该材料在低浓度下提供高粘度，例如在0.8％(w/w)稠度和10rpm下测得的至少20000mPa·s、甚至至少25000mPa·s的布氏粘度。在一个实例中，TEMPO氧化的纳米原纤纤维素在0.8％(w/w)稠度和10rpm下测得的布氏粘度在20000–30000mPa·s的范围内，例如25000–30000mPa·s。

在一个实施方式中，纳米原纤纤维素包含未化学改性的纳米原纤纤维素。在一个实施方式中，这种未化学改性的纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测得的至少2000mPa·s，或至少3000mPa·s的布氏粘度。

纳米原纤纤维素还可以通过平均直径(或宽度)或平均直径与粘度一起来表征，所述粘度例如是布氏粘度或零剪切粘度。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为1-100nm。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为1-50nm。在一个实施方式中，所述纳米原纤纤维素的原纤数均直径范围为2-15nm，例如TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

可用多种技术(例如通过显微镜)测定原纤的直径。可通过对场致发射扫描电子显微镜(FE-SEM)、透射电子显微镜(TEM)(例如低温透射电子显微镜(cryo-TEM))或原子力显微镜(AFM)获得的图像进行图像分析来测量原纤厚度和宽度分布。通常，AFM和TEM最合适具有窄原纤直径分布的纳米原纤纤维素级别。

在一实例中，在22℃，用装配有窄间隙叶片几何结构(直径28mm，长度42mm)的应力受控的旋转流变仪(AR-G2，英国TA仪器公司(TA Instruments,UK))，在直径为30mm的圆筒形样品杯中对纳米原纤纤维素分散体的流变粘度进行测量。在将样品装载到流变仪之后，使它们静止5分钟，之后开始测量。用逐渐增加的剪切应力(其与施加的扭矩成比例)来测量稳态粘度，并测量剪切速率(其与角速度成比例)。在达到恒定剪切速率之后或者在2分钟的最大时间之后，记录某一剪切应力下的报道粘度(＝剪切应力/剪切速率)。当剪切速率超过1000s^-1时，停止测量。该方法可用于测定零剪切粘度。

在一个实例中，纳米原纤纤维素当分散在水中时提供在1000–100000Pa·s范围内、例如在5000–50000Pa·s范围内的零剪切粘度(在小剪切应力下恒定粘度的“平台”)，和在1–50Pa范围内、例如在3–15Pa范围内的屈服应力(开始剪切稀化时的剪切应力)，这些测量结果是通过旋转流变仪在稠度为0.5重量％(w/w)的条件下在水性介质中测定的。

浊度是通常为肉眼所不可见的个体颗粒(所有的悬浮或溶解固体)导致的流体的浑浊或模糊。有几种测量浊度的实用方式，最直接的是测量光穿过水样品柱时的衰减(即，强度的降低)。备选使用的杰克逊蜡烛法(单位：杰克逊浊度单位或JTU)本质上是反过来测量完全遮蔽穿过水柱所见的蜡烛火焰所需的水柱长度。

可以采用光学浊度测量仪器来定量测定浊度。存在一些市售用于定量测量浊度的浊度计。在本发明中，采用基于比浊法的方法。来自校准比浊计的浊度单位称作比浊法浊度单位(NTU)。用标准校准样品对测量设备(比浊计)进行校准和控制，之后对经稀释的NFC样品的浊度进行测量。

在一种浊度测量方法中，将纳米原纤纤维素样品在水中稀释至低于所述纳米原纤纤维素的胶凝点的浓度，测量稀释样品的浊度。测得纳米原纤纤维素样品的浊度的所述浓度为0.1％。采用具有50mL测量容器的HACH P2100浊度计(Turbidometer)来进行浊度测量。测定纳米原纤纤维素样品的干物质，将0.5g样品(以干物质计算)装载到测量容器中，其用自来水填充至500g，并通过振荡剧烈混合约30秒。立即将水性混合物分入5个测量容器中，将它们插入浊度计中。对每个容器进行3次测量。从所获得的结果计算平均值和标准偏差，最终结果单位为NTU单位。

表征纳米原纤纤维素的一种方式是既限定粘度又限定浊度。低浊度表示原纤的小尺寸，例如小直径，因为小原纤对光的散射很差。一般而言，随着原纤化程度增加，粘度增加并且同时浊度降低。然而，这发生在某个点之前。当继续进行原纤化时，原纤最终开始破裂并且不能再形成牢固的网络。因此，在此点之后，浊度和粘度都开始下降。

在一个实例中，阴离子纳米原纤纤维素的浊度低于90NTU，例如3-90NTU，如5-60NTU，例如8-40NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测量的。在一个实例中，天然纳米原纤的浊度甚至可以高于200NTU，例如10-220NTU，诸如20-200NTU，例如50–200NTU，这些数值是通过比浊法在0.1％(w/w)稠度下在水性介质中测得。为了表征纳米原纤纤维素，可以将这些范围与纳米原纤纤维素的粘度范围组合，例如纳米原纤纤维素在分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测量的至少2000mPa·s，至少3000mPa·s，至少5000mPa·s，例如至少10000mPa·s，例如至少15000mPa·s的布氏粘度。

用于制备方法的原料通常是直接由上述一些纤维原料的崩解得到的纳米原纤纤维素，它们由于崩解条件以较低浓度均匀地分布在水中。原料可以是浓度为0.2-10％的水性凝胶。

在一个实施方式中，冷冻干燥前，水凝胶中的纳米原纤纤维素的浓度范围为0.5–10％，1–10％，例如2–8％或1–7％。用于大部分应用的优选范围为3–7％，4–7％或4–8％。在测试中，选择3％和6.5％的浓度代表靠近这些范围端值的浓度。由冷冻干燥的凝胶可以在冷冻干燥后重建相同浓度的水凝胶。更特别地，干燥的凝胶可再分散于水中，并且当再分散在水中时提供的分散体浓度为例如0.1-10％(w/w)，例如0.5-2.0％(w/w)或2-8％(w/w)或3-7％(w/w)，粘度曲线等于或基本上等于其在相同的分散体浓度下具有的最初粘度曲线。

聚乙二醇

聚乙二醇(PEG)是聚醚化合物，取决于其分子量，也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。PEG的结构通常表达为H-(O-CH₂-CH₂)_n-OH。通常，聚乙二醇通过环氧乙烷的聚合来制备，并且可市售购得300g/mol至10000000g/mol宽范围分子量的聚乙二醇。聚乙二醇是水溶性的，并且其具有低毒性。

在一个实施方式中，聚乙二醇的分子量范围为100–10000kDa，例如1000–10000kDa。在一个实施方式中，聚乙二醇的分子量范围为3000-8000kDa，例如5000-7000kDa，如约6000kDa。本公开中所用的“分子量”可以是数均分子量。通常，聚合物的数均分子量可以通过如下方法测定：例如凝胶渗透色谱法，由[马克-豪威克(Mark-Houwink)方程]的粘度测定法，依数性方法，如蒸气压渗透压测定法，端基测定法或质子NMR。

海藻糖

海藻糖(也称为α,α-海藻糖；α-D-吡喃葡萄糖基-(1→1)-α-D-g吡喃葡糖苷，mycose或tremalose)是通过在两个α-葡萄糖单元之间的α,α-1,1-葡糖苷键所形成的天然α-连接的二糖。海藻糖在营养上与葡萄糖相当，因为它通过海藻糖酶迅速分解成葡萄糖。海藻糖可以以无水或二水合物的形式存在。在一个实施方式中，海藻糖是D(+)-脱水海藻糖(trehalose dehydrate)，其与纳米原纤纤维素相容。在一实例中，海藻糖是D-(+)-脱水海藻糖。它可以以固体形式提供或溶解在水性介质(例如水)中。

制备冷冻干燥产品

所述方法包括：提供成分纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖，所述纳米原纤纤维素通常为水性悬浮液或水凝胶。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是在水性悬浮液或水凝胶中的唯一纤维素材料。在一个实施方式中，纳米原纤纤维素是在水性悬浮液或水凝胶中的唯一聚合物凝胶形成材料。在一实例中，水性悬浮液或水凝胶包含一定量的其它纤维状材料(例如，非纳米原纤纤维素)，例如所述量为纤维状材料干重量的0.1-2％(w/w)。

所述方法包括：提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶。水凝胶中的纳米原纤纤维素浓度范围可以是0.1–10％(w/w)，0.5–10％(w/w)，或1–10％(w/w)，例如2–8％(w/w)。用于大部分应用的优选范围为3-6.5％(w/w)，),2.5–7％(w/w)，3–7％(w/w)，4–7％(w/w)或4–8％(w/w)。

所述方法包括：提供包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物，无细胞组织提取物的浓度可以定义为水凝胶或混合物中提取物的湿物质、水凝胶或混合物中无细胞组织提取物的干含量、或者水凝胶或混合物中干蛋白质含量，上述水凝胶或混合物优选为最终的水凝胶或含有所有成分的混合物。水凝胶或混合物中的无细胞组织提取物的干含量范围可以是0.01-20％(w/w)。由水凝胶或混合物的总质量计算的无细胞组织提取物的干含量范围可以是0.01-10％(w/w)，例如，0.05–10％(w/w)。在一个实施方式中，由水凝胶或混合物的总质量计算的水凝胶或混合物中无细胞组织提取物的干含量范围可以是0.1-5％(w/w)，例如，0.1-3％(w/w)，0.5–3.5％(w/w)或0.5–5％(w/w)。在一个实施方式中，无细胞组织提取物的干含量是指无细胞组织提取物的总干蛋白质含量。

所述方法还包括：混合水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖以获得混合物。所述成分可以以任意顺序混合以获得包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的水性混合物。在一个实施方式中，由混合物的总质量计算，混合物包含0.1-2％(w/w)的聚乙二醇和/或0.05-1.0(w/w)的海藻糖。在一个实施方式中，由混合物的总质量计算，混合物包含0.1-2％(w/w)的聚乙二醇和/或0.1-0.5(w/w)的海藻糖。在一个实施方式中，由混合物的总质量计算，混合物包含0.5-1.5％(w/w)的聚乙二醇和/或0.1-0.5(w/w)的海藻糖。在一个实施方式中，由混合物的总质量计算，混合物包含0.5-1.5％(w/w)的聚乙二醇和/或0.3-0.4(w/w)的海藻糖。该混合物是水凝胶的形式，并且其也可以称为水凝胶，更特别是包含纳米原纤纤维素和优选其它成分的水凝胶，所述其它成分为例如聚乙二醇、海藻糖和/或其它成分(例如无细胞组织提取物和如本文所述的其它可能的活性剂)。在一个实施方式中，混合物中海藻糖的存在量为5–100mmol，例如10–50mmol。混合可以使用合适的混合机或均质机进行，或者可以如在实验室规模进行的实验中所做的那样，通过连接两个含有混合物的注射器并在注射器之间重复注射混合物来混合成分，以实现混合和/或均质化。

凝胶中的干纳米原纤纤维素与冷冻保护剂(以重量计的NFC：PEG：海藻糖)的比例可以是例如约9.5:3:1至20:3:1，该范围用于实验。在一些实例中，凝胶中干纳米原纤纤维素与冷冻保护剂(NFC：PEG：海藻糖)以重量计的比例为5–40:2–6:1，9–22:2–5:1，或9.5–20:2–5:1，或9–22:2–4:1，或9.5–20:2–4:1，例如，约10:5:1，约15:5:1，约10:3:1，约15:3:1或约20:3:1。

所得混合物是可冷冻干燥的，即，冷冻干燥过程对干燥的纳米原纤凝胶的物理性质没有显著影响。混合物也可以成为可冷冻干燥的水凝胶。该物理性质的一个实例是由水凝胶释放试剂的曲线，所述试剂例如小分子或大分子，如无细胞组织提取物中的物质，或者其它治疗剂或美容剂。发现具有不同分子量的不同分子(包括相对小的有机分子以及较大的蛋白质)可以类似释放曲线从水凝胶控释。可用的分子量范围非常宽，例如在测试中，可以控释分子量在约170-70000g/mol(道尔顿)范围内的分子。然而，具有高分子量的分子比具有较低分子量的分子释放得慢。

在一个实施方式中，所述方法还包括：提供一种或多种治疗剂，并且混合治疗剂与水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖，即，将治疗剂添加到混合物。可以在添加无细胞组织提取物、聚乙二醇和/或海藻糖的同时添加一种或多种治疗剂，或者可以在此之前或之后添加治疗剂。

在一个实施方式中，所述方法还包括：提供一种或多种美容剂，并且混合美容剂与水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖，即，将美容剂添加到混合物。可以在添加聚乙二醇和/或海藻糖的同时添加一种或多种美容剂，或者可以在此之前或之后添加美容剂。还可以使用治疗剂和美容剂的组合。

在获得混合物之后进行冷冻干燥以获得干燥的含有纳米原纤纤维素的水凝胶。可以使用任意合适的冷冻干燥方法。冷冻干燥(也可称为冻干)是一种使用快速冷却以在系统内产生热力学不稳定性并导致相分离的方法。然后通过在真空下升华来去除溶剂，在其先前占据的区域中留下空隙。升华是指物质直接从固体转变为气相而不经过中间液相。升华是在其相图中低于物质三相点的温度和压力下发生的吸热相变。

在一个实施方式中，冷冻干燥包括首先将混合物的温度降至至少-30℃，例如至少-40℃，例如-30–-100℃，或降低至-40–-100℃，或者甚至降低至-200℃或更低，例如，当使用液氮时，然后施加降低的压力以从混合物中去除水。通常，混合物应当在施加降低的压力时进行冷冻。在一个实施方式中，在施加降低的压力期间和施加最低压力之后，温度升高，例如温度升高至约-20℃或甚至升至约10℃。可以在施加降低的压力之前升高温度，或者可以在施加降低的压力期间升高温度。

在一实例中，冷冻干燥通过用液氮对混合物进行冷冻来实施。例如，将含有混合物的小瓶浸入液氮中直至混合物冷冻。此后，向混合物施加降低的压力以从混合物去除水。降低的压力可以指获得水升华所需的真空。由于水的升华发生在三相点下，所需的真空压力取决于所用的温度。

如本文所用，“干燥”通常是指脱水，这些术语可互换使用，其中，从水凝胶中除去水以获得干燥或脱水的水凝胶。在一个实施方式中，继续冷冻干燥直至水凝胶具有所需的含水量或冷冻干燥持续至最小含水量，所述最小含水量优选低于20％，或更优选低于10％，或甚至低于5％，例如，含水量为1-20％、2-20％或2-10％(w/w)。在一个实施方式中，持续冷冻干燥，直至水凝胶的含水量范围为2-8％，2-6％，2-5％或1-5％(w/w)。通常，获得低于2％的含水量可能具有挑战性。在获得低含水量之后，可以在真空或保护气体中将干燥的产品打包。这将会防止干燥的水凝胶吸收环境水气，吸收环境水气可能使得含水量范围升高至例如4-8％或5-7％(w/w)。所获得的干燥的水凝胶可以通过添加水性液体(例如水)并使得干燥的产品悬浮而再凝胶化。获得再凝胶化或重新悬浮的水凝胶，其可具有与干燥前相同的浓度和水含量。该水凝胶提供了与干燥前的初始水凝胶基本相同的特性。

使用本文公开的实施方式的冷冻干燥方法获得了包含纳米原纤纤维素的干燥的最终水凝胶，更特别是冷冻干燥的水凝胶，所述纳米原纤纤维素包含无细胞组织提取物。

一个实施方式提供包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的干燥的水凝胶，所述无细胞组织提取物包含生物活性物质的混合物，其中，干燥的水凝胶的含水量为10％(w/w)或更低，或者低于10％(w/w)，例如1-20％(w/w)或2-10％(w/w)，如前文所述。

冷冻干燥的水凝胶也称为气凝胶，特别是冷冻干燥的气凝胶。根据一个定义，气凝胶是源自凝胶的多孔超轻材料，其中，凝胶的液体组分被气体替代。尽管名为气凝胶，气凝胶是坚固、刚性和干燥的材料，其物理性质不像凝胶：该名字来源于它们是由凝胶制成的。

在一个实施方式中，干燥的水凝胶中无细胞组织提取物的干含量范围为0.1–65％(w/w)，或者0.1–50％(w/w)，例如1–25％(w/w)，或1–20％(w/w)，1–10％(w/w)，1–5％(w/w)，或20–65％(w/w)，10–65％(w/w)，5–65％(w/w)，10–50％(w/w)，5–50％(w/w)，5–25％(w/w)，5–20％(w/w)，或5–15％(w/w)。这些范围还包含任意可能的治疗剂。

在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，聚乙二醇含量范围为1-20％(w/w)，并且/或者海藻糖的含量范围为0.5-10％(w/w)。在一个实施方式中，在干燥的水凝胶中，聚乙二醇含量范围为5-15％(w/w)，并且/或者海藻糖的含量范围为3-4％(w/w)。

干燥的水凝胶可以以通常适合于所需的医学目的的片材、块或其它形状或形式提供，然后可在使用前再润湿以获得适用于标靶(例如伤口)的医用凝胶。干燥的水凝胶也可以粉末或其它粉碎的形式提供。在该情况下，制备产品的方法可以包括形成粉末的步骤，例如通过对冷冻干燥的产品进行研磨或粉碎。

所获得的水凝胶在干燥之前或之后可以用于各种应用，例如本文所述的那些，如用于向对象递送物质的方法。还可以提供水凝胶作为医疗产品。

医疗产品

在水凝胶中含有组织提取物的医疗产品可用于多种应用。一个具体领域是医学应用，其中材料被施用到活组织上，例如施用到皮肤上。这些材料可用于医疗产品，如贴片，敷料，绷带和过滤器等。医疗产品也可以是治疗产品，例如含有药剂的治疗贴片或凝胶。通常，包含纳米原纤纤维素的产品的表面将在使用期间与皮肤接触。当纳米原纤纤维素表面与皮肤直接接触时，它可以提供有利的效果，例如它可以促进伤口或皮肤上其它损伤的愈合，或者它可以促进物质从医疗产品递送至皮肤。

如本文所用，术语“伤口”是指组织(例如皮肤、粘膜或皮下组织)上的任意损伤、受伤、疾病、病症等，包括开放或闭合的伤口，其中伤口的愈合是期望的并且可以用本文中所述的产品来促进。伤口可以是清洁的、污染的、感染的或定植的，其中特别是在后一些情况中，可以给予治疗剂，例如抗生素。开放伤口的例子包括擦伤、撕脱伤、切口、撕裂伤、穿刺伤和穿透伤。闭合伤口的例子包括血肿、挤压伤、缝合伤口、移植物和任何皮肤状况、皮肤病或皮肤病症。皮肤病症、皮肤病或皮肤疾病的实例包括痤疮，感染，囊泡病，唇疱疹，皮肤念珠菌病，蜂窝织炎，皮炎和湿疹，疱疹，荨麻疹，狼疮，丘疹鳞屑，风疹和红斑，牛皮癣，红斑痤疮，辐射相关病症，色素沉着，粘蛋白角化病，溃疡，萎缩，和渐进性坏死，血管炎，白癜风，疣，嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞疾病，先天性疾病，肿瘤和癌症，如黑素瘤和表皮或真皮肿瘤，或表皮和真皮的其它疾病或病症。

可以提供进一步包含治疗剂的医疗产品，其中，在纳米原纤纤维素中含有组织提取物的水凝胶还包含一种或多种治疗剂，例如，生物活性剂、活性剂、药剂或药物。术语药剂也可以与术语治疗剂互换使用。这些试剂是活性或有效的试剂，其通常以有效量存在。治疗剂可以盐、酯、酰胺、前药、偶联物、活性代谢物、异构体，片段、类似物等形式提供。该试剂可在对象中产生全身或局部作用。这样的试剂可以以预定量提供，例如，该量配置为在一定时间段期间提供期望剂量的试剂，和/或配置为对目标(例如皮肤或其它组织)提供期望的效果。治疗剂在产品中的含量范围可以例如为0.01-20％(w/w)，例如，0.05-10％(w/w)。在一个实施方式中，治疗剂在产品中的含量范围为0.1-5％(w/w)，例如，0.1-3％(w/w)，0.5–3.5％(w/w)或0.5–5％(w/w)。特别是如果包含治疗剂，则可以提供试剂的受控释放、持续释放或延长释放。在这种情况下，纳米原纤纤维素可以含有一部分水分，以使试剂能够渗透。治疗剂可以以水溶性形式，脂溶性形式或乳液形式存在，或以其它合适的形式存在。

还可以包含在本文所述医疗产品中治疗剂或生物活性剂的实例包括：蛋白质，肽，碳水化合物，脂类，核酸或其片段，优选分离的；抗生素，止痛药，例如利多卡因；阿片类药物，如芬太尼或丁丙诺啡；尼古丁；激素，如雌激素，避孕药或雄激素，如睾酮；硝酸甘油；东莨菪碱；可乐定；抗抑郁药，如司来吉兰；ADHD药物，如哌醋甲酯；维生素，如B12或氰钴维生素；5-羟色氨酸；阿尔茨海默氏症药物，如利凡斯的明；痤疮药物；抗银屑病药，糖皮质激素如氢化可的松；抗雄激素，如双氟拉洛(bifluranol)，西奥克托(cyoctol)，环丙孕酮，地马孕酮醋酸酯，氟他胺(flutimide)，尼鲁米特和奥生多龙(oxendolone)；抗雌激素，如地马孕酮醋酸酯，乙胺氧三苯醇，他莫昔芬和托瑞米芬；抗微生物剂；麻醉剂；镇痛药；抗炎化合物或试剂；抗组胺药；β-阻断剂；生长因子；免疫调节剂或用于治疗皮肤病或病症的药剂。组织提取物可以单独或与一种或多种治疗剂一起包含于例如在健康皮肤或受损皮肤上使用的医用贴片，以提供治疗剂从贴片的延长释放、持续释放或缓释，例如在数小时的时间内，所述数小时长达6、12、24或甚至48小时。

“延长释放”，也称为定时释放、持续释放或缓释，其是指药物或用药物浸渍的载体，其设计用于在延长的时期内递送一定剂量的药物。目的是将药物浓度维持在治疗窗口内最长或期望的时间。该术语通常用于口服剂型的上下文中。除了丸剂、胶囊和可注射药物载体(通常具有额外的释放功能)之外，控释药物的形式包括凝胶、植入物和装置以及透皮贴片。欧洲药典中的定义为：“延长释放剂型式是一种改良的释放剂型，其显示出活性物质的释放比通过相同途径给予的常规释放剂型的释放更慢。通过特殊配方设计和/或制造方法实现了延长释放。等效术语：缓释剂型。”

一个实施方式提供了进一步包含抗生素剂的医疗产品。这种产品特别适用于治疗伤口，其中伤口治疗特性与防止伤口中有害微生物引起的感染的抗生素特性相结合。合适的抗生素的例子特别包括局部用抗生素，如杆菌肽，红霉素，克林霉素，庆大霉素，新霉素，多粘菌素，莫匹罗星，四环素，甲氯四环素，(钠)磺胺醋酰，过氧化苯甲酰和壬二酸，以及它们的组合。也可以提供其它类型的抗生素，例如全身性抗生素，例如青霉素类，如苯氧基甲基青霉素，氟氯西林和阿莫西林；头孢菌素类，如头孢克洛和头孢羟氨；四环素类，如四环素，强力霉素和赖甲四环素；氨基糖苷类，如庆大霉素和妥布霉素；大环内酯类，如红霉素，阿奇霉素和克拉霉素；克林霉素；磺胺类和甲氧苄啶；甲硝唑和替硝唑；喹诺酮类，如环丙沙星，左氧氟沙星和诺氟沙星。

雄激素的实例包括勃地酮，氟甲睾酮，美他诺龙，美睾酮，羟甲雄二烯酮，17-甲基睾酮，17-α-甲基睾酮3-环戊基烯醇醚，诺乙雄龙，甲诺酮，氧雄龙，羟甲基睾酮，羟甲烯龙(oxymetholone)，普拉睾酮(Prasterone)，斯坦龙酮(Stanlolone)，司坦唑醇，睾酮，睾酮17-三氯乙醛半缩醛(chloral hemiacetal)，睾酮17-β-环戊丙酸酯，庚酸睾酮，烟酸睾酮，睾酮苯乙酸酯(testosterone pheynylacetate)，丙酸睾酮和硫甲睾酮。

可以包括在水凝胶中的抗生素的实例包括：氨基糖苷类(例如，妥布霉素，阿米卡星，庆大霉素，卡那霉素，奈替米星，妥布霉素，链霉素，阿奇霉素，克拉霉素，红霉素，新霉素，红霉素酯/乙基琥珀酸盐/酯，葡庚糖酸盐/乳糖酸盐/硬脂酸盐/酯(stea rate))，β-内酰胺类如青霉素(如青霉素G，青霉素V，甲氧西林，萘夫西林，苯唑西林，氯唑西林，双氯青霉素，氨苄青霉素，阿莫西林，替卡西林，羧苄青霉素，美洛西林，阿洛西林和哌拉西林)，头孢菌素(如头孢噻吩，头孢唑啉，头孢克洛，头孢孟多，头孢西丁，头孢呋辛，头孢尼西，头孢美唑，头孢替坦，头孢丙烯，氯碳头孢，头孢他美，头孢哌酮，头孢噻肟，头孢唑肟，头孢曲松，头孢他啶，头孢吡肟，头孢克肟，头孢泊肟和头孢磺啶)，氟喹诺酮类药物(如环丙沙星)，碳青霉烯类(如亚胺培南)，四环素类(如多西环素，米诺环素，四环素)，大环内酯类(如红霉素和克拉霉素)，单菌霉素(例如，氨曲南)，喹诺酮类(例如，氟罗沙星，萘啶酸，诺氟沙星，环丙沙星，氧氟沙星，依诺沙星，洛美沙星和西诺沙星)，糖肽类(例如，万古霉素，替考拉宁)，氯霉素，克林霉素，甲氧苄啶，磺胺甲恶唑，呋喃妥因，利福平和莫匹罗星，以及多粘菌素如PMB，恶唑烷酮，咪唑类(如咪康唑，酮康唑，克霉唑，益康唑，依康唑，联苯苄唑，布康唑，苯噻唑，异康唑，奥昔康唑，舍他康唑(sertaconazole)，硫康唑和噻康唑)，三唑类(例如氟康唑，伊曲康唑，艾沙康唑，雷夫康唑，泊沙康唑，伏立康唑，特康唑和阿巴康唑)，噻唑类(例如，阿巴芬净(abagungin))和烯丙胺类(例如特比萘芬，萘替芬和布替萘芬)，棘白菌素类(例如，阿尼芬净(anidulafungin)，卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin))。其它抗生素可包括水蓼二醛，苯甲酸，环吡酮，托萘酯，十一烯酸，氟胞嘧啶或5-氟胞嘧啶，灰黄霉素和卤普罗近。

也可以使用抗生素治疗痤疮，例如克林霉素，红霉素，多西环素，四环素等。还可以使用其它试剂，例如过氧化苯甲酰，水杨酸，局部用类维生素A药物，诸如维甲酸，阿达帕林或他扎罗汀，壬二酸，或雄激素阻断剂如螺内酯。例如，可以用类固醇皮质类固醇、保湿剂、卡泊三烯、煤焦油、维生素D、类维生素A、他佐罗汀、蒽林、水杨酸、甲氨蝶呤或环孢菌素治疗牛皮癣。可以用氢化可的松、鸸鹋油、杏仁油、氨、红没药醇、木瓜蛋白酶、二苯基氢化胺、金银花提取物或炉甘石之类的试剂处理昆虫叮咬或毒葛暴露(poison ivy exposure)。这些或其他处理剂中的一些也可以被归类为美容剂。

可包括在水凝胶中的抗微生物剂的实例包括银颗粒，特别是银纳米颗粒，释放银离子的试剂或化合物，葡萄糖酸氯己定和聚六亚甲基双胍。

可包括在水凝胶中的麻醉剂的实例包括普鲁卡因、苯佐卡因、氯普鲁卡因、可卡因、环甲基卡因、二甲卡因、匹派鲁卡因(piperocaine)、丙氧卡因、普鲁卡因、奴佛卡因、丙美卡因、丁卡因、利多卡因、阿替卡因、布比卡因、地布卡因(cinchocaine)、依替卡因、左布比卡因、甲哌卡因、丙胺卡因、罗哌卡因和曲美卡因。在一些实施方式中，麻醉剂是利多卡因和丙胺卡因的组合。

可包括在水凝胶中的镇痛药的实例包括阿片类药物及其类似物。示例性的阿片类药物包括吗啡、可待因、羟考酮、氢可酮、二氢吗啡、哌替啶、丁丙诺啡、曲马多、芬太尼和文拉法辛。

可以包括在水凝胶中的抗炎化合物的实例包括氢化可的松、可的松、地塞米松、氟轻松、曲安奈德、甲羟孕酮、泼尼松龙、氟氢缩松(flurandrenolide)、泼尼松、氯氟舒松(halcinonide)、甲基强的松龙、泼尼松、哈西奈德(halcinonide)、氟氢可的松、皮质酮、对氟米松(paramethasone)、倍他米松、布洛芬(ibuprophen)、萘普生、非诺洛芬、芬布芬、氟比洛芬、吲哚洛芬、酮洛芬、舒洛芬、吲哚美辛、吡罗昔康、乙酰水杨酸、水杨酸、二氟尼柳、水杨酸甲酯、保泰松、舒林酸、甲芬那酸、甲氯芬那酸钠和托美汀。

可包括在水凝胶中的抗组胺药的实例包括苯海拉明、茶苯海明、奋乃静、曲普利啶、吡拉明、氯环嗪、异丙嗪、卡比沙明(carbinoxamine)、曲吡那敏(tripelennamine)、溴苯那敏、羟嗪、赛克利嗪(cyclizine)、敏克静(meclizine)、氯丙那林、特非那定和氯苯那敏。

可包括在水凝胶中的生长因子的实例包括血管内皮生长因子("VEGF")，神经生长因子，例如NGF-β，血小板衍生生长因子(PDGF)，成纤维细胞生长因子，包括例如，aFGF和bFGF，表皮生长因子(EGF)，角化细胞生长因子，肿瘤坏死因子，转化生长因子(TGF)，包括但不限于TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1，TGF-β2，TGF-β3，TGF-β4或TGF-β5，胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)，des(-1-3)-IGF-I(脑IGF-1)，神经营养素-3(NT-3)和脑源性神经营养因子(BDNF)。

可包括在水凝胶中的免疫调节剂的实例包括环孢菌素A、脒腙、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环磷酰胺和他克莫司。

一个实施方式提供包含文中所述的水凝胶的医疗产品，例如敷料、贴剂或滤料。

本文所述的冷冻干燥的水凝胶可以作为植入物提供，或作为任何其它合适的医疗装置提供，例如递送装置，其构造成被引入或植入对象的身体，例如患者或有此需要的任意其它对象。包含冷冻干燥的医用水凝胶的植入物可以被引入组织、体腔或其它位置内以使水凝胶暴露于体液或其它水性环境。植入物的表面积范围为10–1000mm²，例如300–600mm²。植入物可以具有合适的尺寸和形状，例如，圆柱形形状。在一个实例中，圆柱形植入物的长度范围为5-60mm，并且直径范围为1.5-5mm。植入物可以在植入前进行再水化或润湿，或者其可以设置成在植入后在体内水化。

一个实施方式提供了用于治疗和/或覆盖皮肤伤口或其他损伤的水凝胶，其含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。一个实施方式提供了这样的水凝胶，其用作敷料或贴剂，或用于敷料或贴剂中，用于治疗和/或覆盖皮肤伤口或其他损伤。

一个实施方式提供了用于治疗和/或覆盖皮下软组织损伤(例如，由伤口、其它损伤或手术导致的皮下软组织损伤)的水凝胶，其含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。

一个实施方式提供了用于治疗和/或覆盖被移植物(例如皮肤移植物)覆盖的皮肤伤口的水凝胶，所述水凝胶含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。一个实施方式提供了水凝胶，其用作敷料或贴剂，或用于敷料或贴剂中，用于治疗和/或覆盖被移植物(例如皮肤移植物)覆盖的皮肤伤口，所述水凝胶含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。

一个实施方式提供了水凝胶，用于给予另外的治疗剂、更具体地是一种或多种治疗剂的用途，所述水凝胶含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。在一个实例中，水凝胶可以原样提供，或者例如以贴剂的形式提供。在一个实例中，水凝胶可以以可注射的形式提供。一种或多种治疗剂可以被包含(例如浸渍)在本文所述的水凝胶中，并且对患者的给予可以是经皮、透皮或皮下的。

一个实施方式提供包含所述水凝胶的美容产品，例如敷料、面膜或贴剂，所述水凝胶含有无细胞组织提取物、特别是脂肪组织提取物。这种产品也可以称为美容产品。产品可以以各种形状提供，例如可以将面膜设计成适合脸部，例如眼睛下方或下巴、鼻子或额头上。一个实施方式提供了水凝胶用作美容产品的用途。该产品可用于将一种或多种美容剂释放给使用者，例如释放给使用者的皮肤。这种美容产品可以包含一种或多种美容剂。美容剂可以包含(例如浸渍)在产品中，美容剂将从该产品被释放或递送。美容剂在产品中的含量可以例如在0.01–20％(w/w)的范围内，例如0.05–10％(w/w)。在一个实施方式中，美容剂在产品中的含量在0.1-5％(w/w)的范围内，例如0.1–3％(w/w)，或0.5–5％(w/w)。美容剂可以与上面对治疗剂所述类似地存在或提供在产品中，反之亦可。美容用途可以类似于本文所述的医疗用途，特别是给予治疗剂。美容剂也可用于美容治疗皮肤疾病或病症，例如本文提及的那些。这样的美容产品可用于例如治疗丘疹，痤疮皮肤，褐斑，皱纹，油性皮肤，干性皮肤，老化皮肤，蛛网状血管，日晒后红斑，黑眼圈等。美容贴片的例子包括皮肤清洁剂，如毛孔清洁剂，黑头去除剂，拉伸条，短期贴片状面膜，短期治疗贴剂和隔夜治疗贴剂。

美容剂的例子包括维生素及其前体的形式，如维生素A；例如类维生素A，如视黄醛(视网膜的)，视黄酸，棕榈酸视黄酯和视黄酸视黄酯，抗坏血酸，α-羟基酸如乙醇酸和乳酸；乙二醇；生物技术产品；角质层分离剂；氨基酸；抗菌剂；保湿剂；颜料；抗氧化剂；植物提取物；清洁剂或卸妆剂；抗蜂窝脂剂，如咖啡因，肉碱，银杏和七叶树；调理剂；芳香剂如香薰剂和香水；湿润剂如尿素，透明质酸，乳酸和甘油；润肤剂如羊毛脂，甘油三酯和脂肪酸酯；FR清除剂，单线氧清除剂，超氧化物清除剂或过氧化氢清除剂，诸如抗坏血酸(维生素C)，谷胱甘肽，生育酚(维生素E)，类胡萝卜素，辅酶Q10，胆红素，硫辛酸，尿酸，酶模拟剂，艾地苯醌，多酚，硒，自旋捕捉剂如苯基丁基硝酮(PBN)，蛋白质甲硫氨酸基团，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，硒过氧化物酶，血红素加氧酶等或它们的组合。美容剂可以以水溶性形式，脂溶性形式或乳液形式存在，或以其他合适的形式存在。

如本文所述的医用或美容水凝胶可以掺入或包装在施用装置中，所述施用装置为例如注射器，涂药器、泵或管，其含有所需量的水凝胶，例如尺寸为0.5ml至200ml或甚至更大的注射器。该装置可包括接口件(mouthpiece)或喷嘴，用于提供所需厚度和宽度及几何形状的恒定水凝胶流。在一个实例中，水凝胶是具有一定浓度和粘度使得能够例如通过针或通过注射器接口件或喷嘴进行注射的可注射形式。冷冻干燥的水凝胶可以提供包装在密封包装中的形式提供，例如，包装在真空包装或含有保护性气体的包装中。水凝胶、尤其是冷冻干燥形式的水凝胶可以是植入物形式的，其可以是例如医用胶囊等。水凝胶可以是在润湿后可施加到伤口或其它靶标的片材等。这些“即用型”装置可以包装，灭菌和储存，并在需要时使用。这些施用装置可以包含在即用型试剂盒中。冷冻干燥的水凝胶或含有其的产品(如含有治疗剂的产品)中的含水量范围为2–10％(w/w)，例如2–8％(w/w)，1–5％(w/w)，2–5％(w/w)或5–7％(w/w)。在一个实例中，例如，包装中提供有包含预定量的液体的单独容器，所述液体为例如水、盐水溶液、缓冲溶液或类似水性液体，所述预定量设置成使凝胶再水化成所需的含水量，如本文所述。可以例如在注射器或类似的施用器中提供液体，或者包装可以包含用于液体的单独隔室，其可以连接到包含干燥水凝胶的另一隔室，例如通过按压包装并破坏密封或类似地使液体与干燥凝胶相互接触。

一个实施方式提供了用于美容处理皮肤的方法，所述方法包括将本文所述的医疗产品或美容产品施用到皮肤上。

一个实施方式提供了包装在独立包装中的本文所述的医疗产品或美容产品。单独的包装可以作为一系列包装提供。通常这样的包装产品以灭菌形式提供。

一个实施方式提供了包含本文所述的医疗产品或美容产品(例如包装产品)的试剂盒，其中试剂盒可以包含一个或多个包装产品。试剂盒还可以包含其它材料或设备，例如，用于在使用前对产品进行预处理的容器，所述容器含有水或其它水性液体如盐水溶液等，例如，预定量的水或其它水性溶液，以获得具有所需含水量的再凝胶化产品。

一个实例提供了用于将物质递送或给予对象的方法，该方法包括提供如实施方式中所述的含有无细胞组织提取物和任选地一种或多种物质(例如治疗或美容物质或试剂)的医用水凝胶，并且将水凝胶施用到对象的皮肤上。对象可以是患者或需要该物质的任何其他对象，例如人或动物。通过将水凝胶施用到皮肤上，物质将经皮递送，优选通过控制和/或延长释放速率进行递送。

一个实例提供了用于将物质递送至对象的方法，该方法包括提供如实施方式中所述的含有无细胞组织提取物和任选地一种或多种物质(例如治疗或美容物质或试剂)的医用水凝胶，并将水凝胶注射至对象。注射、或更确切地说给予途径可以是皮下或肌肉内。

一个实例提供了用于治疗皮肤伤口或其他损伤或伤害的方法，所述方法包括将本文所述的医疗产品施用到伤口、损伤或伤害上。一个具体实例提供了用于治疗覆盖有移植物如皮肤移植物(例如网状移植物或全厚移植物)的皮肤伤口的方法，所述方法包括将本文所述的医疗产品施用于移植物上。

移植是指将组织从身体的一个部位移动到另一个部位或从另一个人身上移动的手术过程，而不需要自带血液供应。相反，移植物放置后会产生新的血液供应。自体移植物和同系移植物通常不被认为是外来的，因此不会引起排斥反应。同种异体移植物和异种移植物被受体认为是外来物并被排斥。

皮肤移植通常用于治疗由于伤口、烧伤、感染或手术导致的皮肤损失。在皮肤受损的情况下，它会被移除，并且新的皮肤会被移植到其位置。皮肤移植可以减少所需的治疗和住院过程，并且还可以改善功能和外观。有两种类型的皮肤移植物：中厚(split-thickness)皮肤移植物(表皮+部分真皮)和全厚皮肤移植物(表皮+整个真皮厚度)。

网状移植物是已经开孔以允许排液和扩张的全厚或部分厚皮片。网状移植物可用于身体上的许多位置，因为它们可以顺应不平坦的表面。它们可以被放置在过度运动的位置，因为它们可以被缝合到下面的伤口床上。此外，它们的开孔为可能积聚在移植物下方的流体提供了出口，这有助于降低张力和感染风险并改善移植物的血管化。

在将医疗产品施用到皮肤上之前，可以对产品进行预处理，即湿润或润湿，一般用水溶液进行。湿润或润湿可以例如通过使用水或常规生理盐水溶液来进行，所述常规生理盐水溶液通常是0.90％w/w NaCl溶液，其渗透压为约308mOsm/l。也可以使用其他类型的水性溶液，例如具有不同浓度的盐水溶液。湿润或润湿材料增强了与皮肤的接触以及材料片的可塑性。

实施例

选择聚乙二醇和海藻糖作为冷冻保护剂，因为特别是在再分散阶段检测到协同效应。制备仅含聚乙二醇、仅含海藻糖、以及含有聚乙二醇和海藻糖作为冷冻保护剂的NFC水凝胶并进行冷冻干燥。以类似的方式将水加入所有样品中，但仅含有聚乙二醇和海藻糖的水凝胶再凝胶化成适当的凝胶形式，即，再凝胶化成与冷冻干燥前相似的形式。这可以通过目视检查立即检测到。没有检测到水凝胶的沉淀。仅含有聚乙二醇或仅含有海藻糖的水凝胶样品没有再凝胶化成均匀的凝胶形式，结果是糊状和粒状的，这不适合用于进一步研究。此外，当将样品置于玻璃瓶中过夜时，水凝胶沉淀并且在不含冷冻保护剂或仅含聚乙二醇或仅含海藻糖的瓶子中分离出清楚可见的水相，但并未在含有聚乙二醇和海藻糖的瓶子中分离出清楚可见的水相。

在测试中发现并显示出TEMPO氧化的NFC水凝胶可以成功地进行冷冻干燥并再分散成水凝胶形式。与不含冷冻保护剂PEG6000和海藻糖的制剂不同，所使用的冷冻保护剂PEG6000和海藻糖一起显著改进了冷冻干燥后再水化和再分散的NFC水凝胶的储存和损耗模量。在再水化时，具有赋形剂的冷冻干燥的NFC水凝胶的粘度也得以保留。

如本文所述，将脂肪组织提取物与约3.2％和6％(w/w)纳米原纤纤维素凝胶混合并进行冷冻干燥。获得可再分散的干燥产物，其显示出初始脂肪组织提取物中存在的生物活性。

这些发现表明冷冻保护剂有助于在冷冻干燥过程中保持NFC纤维的结构。因此，NFC气凝胶的产生并未显著改变流变性质。此外，在冷冻干燥之前和之后，生物活性化合物的生物活性物质释放曲线相似。这是组织提取物制剂非常期望的特征，因为对于水解敏感的组织提取物，气凝胶的干燥状态可以增加产品的保质期。气凝胶可以很容易地再水化并在需要时给予。

Claims (19)

1.一种对在包含纳米原纤纤维素的水凝胶中的无细胞组织提取物进行干燥的方法，所述方法包括：

-提供包含纳米原纤纤维素的水凝胶，

-提供包含生物活性物质混合物的无细胞组织提取物，

-提供聚乙二醇，

-提供海藻糖，

-混合水凝胶、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖以获得混合物，并且

-对混合物进行冷冻干燥以获得在包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶中的干燥的无细胞组织提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述无细胞组织提取物获自从身体直接获得的组织。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述无细胞组织提取物获自培养的细胞，例如获自条件培养基。

4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述无细胞组织提取物是脂肪组织提取物，例如人脂肪组织提取物，所述脂肪组织提取物优选至少包含VEGF、FGF-2和IGF-1。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，以混合物的总质量计算，所述混合物中无细胞组织提取物的干含量范围是0.01-10％(w/w)，例如，0.1-5％(w/w)。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，以混合物的总质量计算，所述混合物包含0.1-2％(w/w)的聚乙二醇和/或0.05-1.0(w/w)的海藻糖。

7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米原纤纤维素当分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测量的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s，例如至少10000mPa·s，例如2000–20000mPa·s的布氏粘度。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，冷冻干燥前，所述水凝胶中的纳米原纤纤维素的浓度范围为0.5–10％，例如2-8％，如3–7％。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述纳米原纤纤维素选自阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素和未改性的纳米原纤纤维素，以及TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述冷冻干燥持续进行直至干燥的水凝胶的含水量为10％或更低，例如2–10％(w/w)，如2–5％(w/w)。

11.一种包含纳米原纤纤维素、无细胞组织提取物、聚乙二醇和海藻糖的干燥的水凝胶，所述无细胞组织提取物包括生物活性物质的混合物，其中，干燥的水凝胶的含水量为10％(w/w)或更低，例如2-10％(w/w)，如2–8％(w/w)。

12.如权利要求11所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述干燥的水凝胶中无细胞组织提取物的干含量范围是0.1-65％(w/w)，例如，0.1-50％(w/w)，例如1–25％(w/w)。

13.如权利要求11或12所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，在干燥的水凝胶中，聚乙二醇含量范围为1-20％(w/w)，和/或海藻糖的含量范围为0.5-10％(w/w)。

14.如权利要求11-13中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述无细胞组织提取物获自从身体直接获得的组织。

15.如权利要求11-13中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述无细胞组织提取物获自培养的细胞，例如获自条件培养基。

16.如权利要求11-15中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述无细胞组织提取物是脂肪组织提取物，例如人脂肪组织提取物，所述脂肪组织提取物优选至少包含VEGF、FGF-2和IGF-1。

17.如权利要求11-16中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述纳米原纤纤维素当分散于水中时提供在0.8％(w/w)的稠度和10rpm下测量的至少2000mPa·s，例如至少3000mPa·s，例如至少10000mPa·s，例如2000–20000mPa·s的布氏粘度。

18.如权利要求11-17中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，其中，所述纳米原纤纤维素选自阴离子改性的纳米原纤纤维素，阳离子改性的纳米原纤纤维素和未改性的纳米原纤纤维素，以及TEMPO氧化的纳米原纤纤维素。

19.如权利要求11-18中任一项所述的包含纳米原纤纤维素的干燥的水凝胶，所述干燥的水凝胶使用如权利要求1-10中任一项所述的方法获得。