CN102399808B - 一种可生物降解的非病毒基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体,可作为非病毒阳离子型生物活性试剂载体,其以伯胺或仲胺化合物和含还原敏感性二硫键的二丙烯酸酯类化合物为单体,通过Michael加成反应聚合而成。通过静电力作用,该聚(β-氨基酯)类聚合物载体可与核酸等生物活性试剂形成纳米级大小的复合物,并可将生物活性试剂送至体外或体内的特定细胞内。本发明的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体具有聚合物反应条件温和、材料廉价易得、合成和后处理方法简单、回收率高、复合物制备方法简单、携带核酸的转染效率高、生物毒性低等特点,其结构式如下。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体及其制备方法和应用,具体地说,涉及一类可将核酸输送至体外和体内各种细胞中,并表达基因编码产物或沉默靶基因表达的输送载体及其制备方法和应用。本发明也提供了一种可生物降解的且具有生物相容性的核酸的输送载体,并提供了该载体与核酸组成的复合物及其输送方法。
背景技术
基因治疗是通过合适的载体将目的基因运送到特定的组织细胞内并使其在细胞内长期稳定表达治疗蛋白或取代、修复有缺陷的基因,进而达到治疗疾病的目的,其已经成为一种研究基因功能和调控,建立各种疾病模型,以及开发针对不同获得性和遗传性疾病的治疗方法的重要工具。裸核酸分子通过静脉注射进入血液循环后,会由于血清中核酶的作用迅速降解。而且,由于其分子量大、带有负电荷,难以有效被细胞摄取。因此,基因治疗的主要挑战就是开发合适的载体和输送方法以保护核酸不被降解并输送至靶细胞内。
病毒载体已被广泛作为核酸载体而应用,但是病毒载体同时也带来毒性、免疫原性、插入突变、包装容量有限和难以大规模生产等问题,促使人们开始关注具有安全性高、免疫原性低、可携带大容量外源基因和具有大规模生产潜力等优点的人工合成非病毒载体。目前非病毒载体主要包括阳离子脂质体、聚合物、树状大分子和多肽等。阳离子脂质体稳定性较差,在有血清存在的条件下转染效率很低。阳离子聚合物能够通过正负电荷相互作用与核酸分子结合,并将其压缩成为纳米级大小的颗粒,同时由于阳离子聚合物中和了核酸分子的负电荷以及具有“质子海绵”效应,即为核酸分子被细胞所摄取和从内涵体中逃逸提供了条件。目前,新型阳离子聚合物基因输送系统已成为基因非病毒载体选择开发的主要方向,如聚左旋赖氨酸、聚乙烯亚胺(PEI)、聚酰胺-胺树状高分子等。但PEI等阳离子聚合物也存在严重问题,如不能在体内被降解,对细胞产生较大毒性而导致其体内应用受到限制,以及对核酸压缩过于紧密,不能及时释放核酸使其从内涵体逃逸进入细胞质,造成了转染效率低的结果。
为了克服这一障碍,许多研究人员将细胞内可降解的化学键引入聚合物中,这种降解包括单纯的水解,在内涵体低pH条件下水解,酶催化降解等。
发明内容
由于在细胞内的环境中存在浓度较高的谷胱甘肽和硫氧蛋白还原酶,二硫键能够迅速断裂,因此可以考虑将这一性质用于生物可降解的阳离子聚合物非病毒基因载体的选择中。
基于上述原理,本发明首次选择并制备出含有生物可还原性二硫键的阳离子聚合物非病毒基因载体,在生理条件下,该聚合物载体可以与生物活性试剂例如核酸分子在静电力作用下形成纳米级大小的复合物,易于被细胞摄取。在细胞内的还原性环境下,聚合物中的二硫键能够迅速断裂,导致聚合物降解成无毒的小分子,核酸等生物活性试剂分子及时从复合物中被释放到细胞质中,发挥作用,达到更好的转染或RNA干扰效果。
本发明的目的是提供一种可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体及其制备方法和应用。
本发明可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体主链含有还原敏感性的二硫键;所述的聚合物分子量是300-100000Da,其结构式如下:
式中:n为重复单元的个数,与聚合物分子量有关;
R1为-烷基-O-烷基-或者-烷基-(NH-烷基)m-;m为1~8的整数;
R、R2和R3各自独立地表示氢原子、烷基、烷基氧基取代的烷基、羟基烷基氧基取代的烷基、氨基取代的烷基、烷基氨基取代的烷基或者羟基取代的烷基。
上文所述的烷基是指具有1~8个碳原子的直链或支链烷基。例如:甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、正己基、正庚基、正辛基等。
优选地,上式中:
R1为-烷基-O-烷基-或者-烷基-(NH-烷基)m-;m为1~4的整数;
R2和R3各自独立地表示氢原子、烷基、氨基取代的烷基、烷基氨基取代的烷基或者羟基取代的烷基;
R表示烷基、氨基取代的烷基、烷基氨基取代的烷基或者羟基取代的烷基;
所述的烷基是指具有1~5个碳原子的直链或支链烷基。
更优选地,所述的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体具体为:
所述的可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体,可由伯胺或仲胺化合物与二丙烯酸酯类化合物聚合而成。
上述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体的制备方法的步骤如下:
步骤1:先通过丙烯酰氯与双(2-羟乙基)-二硫的取代反应合成二丙烯酸酯类化合物,
步骤2:再通过该二丙烯酸酯类化合物与伯胺或仲胺化合物通过Michael加成反应聚合,得到可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体,
其中,R、R1、R2和R3的定义同上;n为重复单元的个数;
所述聚合物分子量为300-100000Da。
上述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体可在体外和体内用作核酸的输送载体,所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。
本发明所述的可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体,可以将核酸分子输送至体外和体内各种细胞中。由于该聚合物的主链含有二硫键,在细胞内含有较高浓度的还原剂谷胱甘肽和含有硫氧蛋白还原酶的条件下,二硫键会发生断裂,从而导致聚合物的降解,从而及时将生物活性试剂释放到细胞质中。
本发明还提供了一种含有核酸和上述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体的复合物。
上述复合物的体外细胞毒性为,IC50值为1×10-3-1×103mg/mL。
该复合物的制备方法具体为:将一定质量的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸分别溶于纯水或缓冲液中,分别配制成N/P比为0.001-1000的溶液,边涡旋化边将核酸的溶液加入到所述聚合物的溶液中,或将所述聚合物的溶液加入到核酸的溶液中,所得混合溶液涡旋化20-30秒,室温下放置一段时间(例如20-200分钟)至复合物形成。
本发明还提供了将核酸输送至体外和体内靶细胞中的方法,其中使用上述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体作为核酸的输送载体。
该方法进一步包括使上述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物被体外或体内的靶细胞所摄取的以下步骤:
体外:将细胞培养在特定的培养基中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长,取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化后,按每孔3×104-2×105个细胞接种于24孔板,每孔含培养基0.5mL,放在培养箱内培养至细胞贴壁;按一定的N/P比制备聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物,将其分散在20-50μL纯水或缓冲液中;将所得到的复合物溶液用450-480μL培养基稀释,混合均匀;将24孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到一个孔内;至少设3种N/P比,每种N/P比设3-6个平行孔,37℃下孵育12-72小时。
体内:按一定的N/P比制备聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物,分散在50-200μL缓冲液中;通过静脉注射、腹腔注射或皮下注射的方法,将上述复合物溶液导入动物体内,并使其自行到达靶组织,被靶细胞摄取。
附图说明
图1表示实施例七中测得的聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-二乙烯三胺](PAD)的1H-NMR图谱。
图2表示实施例八中测得的PAD的重均分子量(Mw)和分散度(Mw/Mn)。
图3表示实施例九中测定的PAD在含有还原剂DTT(0.0025mM)(A)和不含DTT(B)的PBS(0.8%NaCl,3.23%Na2HPO4·12H2O,0.45%NaH2PO4·2H2O)中的降解情况。
图4(A)表示实施例十中制得的包含PAD的复合物的琼脂糖凝胶电泳示意图。
图4(B)表示实施例十中制得的包含PAD的复合物的平均粒径和表面zeta电位。
图5表示实施例十一中测定的PAD与25kDa分枝PEI(PEI 25kDa)对MCF-7细胞的毒性对比。
图6(A)和图6(B)是实施例十二中考察的PAD(A)和25kDa分枝PEI(B)分别与编码绿荧光蛋白(EGFP)的pDNA组成的复合物、对MCF-7细胞转染24小时后的荧光照片。
图7(A)(a)-(c)和图7(B)表示实施例十三中考察的PAD(图7(A)(b)中)和25kDa分枝PEI(图7(A)(c)中)分别与表达GFP-shRNA的pDNA(以下简称GFP-shRNA)组成的复合物在HEK 293-GFP细胞中的RNA干扰效率对比。图7(A)(a)-(c)是干扰48小时后的荧光照片,其中图7(A)(a)为空白对照。图7(B)表示用流式细胞仪分析的GFP表达被沉默的百分率(PEINs表示25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物)。
图8表示实施例十四中测定的不同转染试剂在最佳转染条件下进行转染后HEK 293-GFP细胞存活百分率对比柱状图(PEINs表示25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物)。
图9(A)(a)-(c)表示实施例十五中考察的给荷U-87MG-GFP瘤的BALB/c裸鼠静脉注射不同转染试剂48小时后、肿瘤部位的RNA干扰效果。图9(A)(a)-(c)是肿瘤切片荧光照片。其中图9(A)(a):生理盐水组;图9(A)(b):PAD/GFP-shRNA复合物组;图9(A)(c):PEI 25kDa/GFP-shRNA复合物组。图9(B)表示用流式细胞仪分析的GFP表达被沉默的百分率(PADNs表示PAD/GFP-shRNA复合物,PEINs表示25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物)。
具体实施方式
现在对本发明进行一般性的示范性描述,结合下面的实施例可以更容易地理解本发明,这些实施方式和实施例只是用来理解本发明的特定方面和实施方案,而不是对本发明的实质和范围进行任何意义地限定,本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物来限定。
对本发明可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物进行结构确证。具体方法为:称取5-20mg的聚合物,用400-600μL重水溶解,用400MHz的1H-NMR进行图谱解析鉴定。
测定本发明可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物的分子量。具体方法为:以分子量4400-401000Da的葡聚糖作为标准品,0.03-0.1%的叠氮化钠水溶液作为流动相,通过凝胶渗透色谱和示差折光检测器测定。
测定本发明可生物降解的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体在体外模拟的生理条件下、在有或无还原剂存在的情况下的聚合物降解的速率。具体方法为:将一定质量的聚合物非病毒基因载体溶于PBS中,加入或不加一定质量的还原剂,在37℃下孵育一段时间,采用凝胶渗透色谱方法测定其分子量,考察孵育时间和分子量的关系。
测定本发明聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体的体外细胞毒性。具体方法为:细胞培养在特定的培养基中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长;取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后,按每孔3×103-2×104个细胞接种于96孔板,每孔含培养基0.2mL,放在培养箱内培养至细胞贴壁;将不同质量的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体溶于培养基中,配制浓度为1×10-3-104mg/mL的溶液各0.2mL;将96孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有聚合物的培养基分别加入一个孔内,至少设8种浓度,每种浓度设3-6个平行孔;37℃下孵育24小时,除去培养基,每孔加入含同样浓度MTT的培养基0.2mL(MTT浓度为0.2-1mg/mL),37℃下孵育4小时。小心吸去孔内培养基,每孔加入0.2mL二甲亚砜,37℃下摇床振摇5-10分钟(50-100rpm),通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值。
利用凝胶电泳阻滞试验,证实上述本发明复合物的形成,并测定该复合物的光散射粒径和表面zeta电位。
测定本发明聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物的体外细胞毒性。具体方法为:细胞培养在特定的培养基中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后,按每孔3×103-2×104个细胞接种于96孔板,每孔含培养基0.2mL,放在培养箱内培养至细胞贴壁;按一定的N/P比制备聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物,分散在5-15μL纯水或缓冲液中;将所得到的复合物溶液用185-195μL培养基稀释,混合均匀。将96孔板内原有的培养基吸走;将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入一个孔内,至少设8种N/P比,每种N/P比设3-6个平行孔。37℃下孵育24小时,除去培养基,每孔加入含同样浓度MTT的培养基0.2mL(MTT浓度为0.2-1mg/mL),37℃下孵育4小时;小心吸去孔内培养基,每孔加入0.2mL二甲亚砜,37℃下摇床振摇5-10分钟(50-100rpm),通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值。
测定本发明聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物的体外细胞转染效率或基因沉默效率。具体方法为:细胞培养在特定的培养基中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后,按每孔3×104-2×105个细胞接种于24孔板,每孔含培养基0.5mL,放在培养箱内培养至细胞贴壁;按一定的N/P比制备聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物,分散在10-50μL纯水或缓冲液中;将所得到的复合物溶液用450-490μL培养基稀释,混合均匀。将24孔板内原有的培养基吸走;将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入一个孔内,至少设3种N/P比,每种N/P比设3-6个平行孔。37℃下孵育12-48小时,分析转染效率或基因沉默效率。
测定本发明聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物的体内转染效率或基因沉默效率。具体方法为:按一定的N/P比制备聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸的复合物,分散在50-300μL PBS缓冲液中。将实验动物分为若干组,每组3-8只,按照每公斤实验动物0.1-1mgGFP-shRNA的剂量,尾静脉注射0.05-0.3mL上述复合物溶液或生理盐水。给药后12-48小时处死动物,分析体内转染效率或基因沉默效率。
实施例一聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-N,N-二甲基乙二胺](PAA)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.25g N,N-二甲基乙二胺溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入N,N-二甲基乙二胺溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例二聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-(5-氨基戊醇)](PAAP)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.29g 5-氨基戊醇溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入5-氨基戊醇溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例三聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-2,2’-氧双(乙胺)](PAOE)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.30g 2,2’-氧双(乙胺)溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入2,2’-氧双(乙胺)溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例四聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-二乙烯三胺](PAD)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.29g二乙烯三胺溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入二乙烯三胺溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例五聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-三乙烯四胺](PAT)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.42g三乙烯四胺溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入三乙烯四胺溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例六聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-四乙烯五胺](PAP)非病毒基因载体的合成
1)双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯的合成
称取5.00g双(2-羟乙基)-二硫和9.84g三乙胺,溶于150mL无水四氢呋喃中。在冰浴条件下,边搅拌边缓缓滴入17.60g丙烯酰氯,速度为每1-2秒一滴。当全部丙烯酰氯滴加完毕后停止冰浴,使反应温度慢慢恢复至室温,继续搅拌12小时。反应结束后旋转蒸发除去溶剂,将残渣溶于100mL二氯甲烷中,分别用饱和碳酸钠溶液、去离子水和饱和氯化钠溶液洗三遍。所得溶液用无水硫酸钠干燥,常压过滤,收集滤液,旋转蒸发除去溶剂,常温下真空干燥12小时。
2)聚合反应
称取0.54g四乙烯五胺溶于3mL无水二氯甲烷中,再称取0.5g双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶于2mL无水二氯甲烷中,边搅拌边将双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯溶液滴入四乙烯五胺溶液中。滴加完毕后用氮气将反应烧瓶内气体置换三次,保持氮气通入,45℃下避光搅拌5天。反应结束后将溶剂蒸干,残渣用冷的正己烷洗两遍,干燥后用足量去离子水溶解,用去离子水透析3天。将透析纯化后的产物真空干燥,与-20℃下保存。聚合物结构式为:
实施例七PAD的结构确证
将8mg PAD溶于500μL重水中,通过NMR色谱仪,在400MHz测定其1H-NMR图谱,并进行解析。结果如图1所示,1H-NMR图谱解析结果与其结构相符。
实施例八PAD的分子量测定
将分子量4400-401000Da的葡聚糖溶于0.05%的叠氮化钠水溶液,配制成1mg/mL的溶液,作为标准品,以0.05%的叠氮化钠水溶液为流动相,在凝胶渗透色谱仪上通过示差折光检测器建立标准曲线。将PAD溶于0.05%的叠氮化钠水溶液,配制成5mg/mL的溶液,以0.05%的叠氮化钠水溶液为流动相,在凝胶渗透色谱仪上通过示差折光检测器测定分子量。结果如图2所示。
实施例九PAD的体外降解试验
将实施例四中制备的PAD溶于PBS(0.8%NaCl,3.23%Na2HPO4·12H2O,0.45%NaH2PO4·2H2O)中,配制成5mg/mL的溶液,在37℃下孵育,每隔24小时取出150μL,采用凝胶渗透色谱方法测定分子量,并根据所测分子量与孵育时间作图。
按照上述方法配制5mg/mL的PAD的PBS溶液,加入DTT使其终浓度为0.0025mM,在37℃下孵育,每隔5分钟取出150μL,以0.05%的叠氮化钠水溶液为流动相,在凝胶渗透色谱仪上通过示差折光检测器测定分子量,并根据所测分子量与孵育时间作图。结果如图3所示,表明该类聚合物在正常生理条件下相对稳定,当有还原剂存在时则迅速降解。
实施例十制备和表征由PAD与pEGFP组成的复合物
1)制备复合物
配制编码绿荧光蛋白的质粒DNA(pEGFP)的水溶液30μL,浓度为0.2mg/mL,按一定的N/P比将实施例四中所合成的可生物降解的PAD溶于120μL纯水中,将所配的PAD溶液与pEGFP溶液混合,室温下涡旋化30秒后,室温下放置1小时。
2)凝胶电泳阻滞试验
按照步骤1)制备复合物溶液。取一系列PAD与pEGFP的N/P比(5,10,20,25,30,40,50)的复合物溶液各10μL,分别与2μL DNA载样缓冲液混合,加入到1%琼脂糖(含0.5μg/mL溴乙锭)凝胶中,以TAE为缓冲液,电压5V/cm进行电泳试验。结果如图4(A)所示,表明所合成的聚合物PAD有结合DNA的能力,其中第1道:裸pDNA;第2-8道:聚合物与DNA的N/P比为5(第2道),10(第3道),20(第4道),25(第5道),30(第6道),40(第7道),50(第8道)。
3)复合物的粒径和表面电位测定
按照步骤1)制备复合物溶液。在Nicomp 380/ZLS zeta电位/粒径测定仪上,在25℃下测定表面电位和利用光散射法测定平均粒径。结果如图4(B)所示,表明所制备的聚合物粒径均在100-150nm之间,表面zeta电位均在+10mV以上。
图4(A)和4(B)实质上是对聚(β-氨基酯)类聚合物、聚[双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯-β-二乙烯三胺]/pDNA复合物的表征。
实施例十一PAD对MCF-7细胞的体外毒性试验
1)细胞培养
将MCF-7细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100U/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素)中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化后,按每孔1×104个细胞接种于96孔板,每孔含培养基0.2mL,放在培养箱内培养12小时。
2)细胞毒性试验
将不同质量的实施例四中制备的PAD和25kDa分枝PEI溶于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,配制一定浓度的溶液各0.2mL。将96孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有聚合物的培养基分别加入一个孔内。共设0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01mg/mL八种浓度,每个浓度设3个平行孔。37℃下孵育24小时,除去培养基,每孔加入含0.5mg/mLMTT的培养基0.2mL,37℃下孵育4小时。小心吸去孔内培养基,每孔加入0.2mL二甲亚砜,37℃下摇床振摇10分钟(90rpm),通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值。结果如图5所示,表明所述PAD对MCF-7细胞的体外毒性明显低于25kDa分枝PEI。
实施例十二PAD/pEGFP复合物的体外MCF-7细胞转染试验
1)细胞培养
将MCF-7细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100U/mL氨苄青霉素和100μg/mL链霉素)中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化后,按每孔1×105个细胞接种于24孔板,每孔含培养基0.5mL,放在培养箱内培养12小时。
2)细胞转染
配制0.2mg/mL的pEGFP水溶液12.5μL,按一定的N/P比将实施例四中制备的PAD溶于7.5μL纯水中,将所配制的PAD溶液与pEGFP溶液混合,室温下涡旋化30秒后,室温下放置1小时,将所得到的复合物溶液用480μL含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释,混合均匀。按同样方法制备含有25kDa分枝PEI/pEGFP复合物(N/P比为5)的培养基0.5mL。将24孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到一个孔内。每种N/P比设三个平行孔。37℃下孵育24小时,在荧光显微镜下观察并拍照,结果如图6(A)和图6(B)所示,表明所述合成的聚(β-氨基酯)类聚合物PAD对MCF-7细胞有较高的转染效率,与25kDa分枝PEI相当。
实施例十三PAD/GFP-shRNA复合物体外RNA干扰试验
1)细胞培养
将HEK 293-GFP细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100U/mL氨苄青霉素,100μg/mL链霉素和50μg/mL G418)(完全DMEM培养基)中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶的消化液消化后,按每孔1×105个细胞接种于24孔板,每孔含培养基0.5mL,放在培养箱内培养12小时。
2)RNA干扰实验
配制0.2mg/mL的GFP-shRNA水溶液12.5μL,按一定的N/P比将实施例四中制备的PAD溶于7.5μL纯水中,将所配制的PAD溶液与GFP-shRNA溶液混合,室温下涡旋化30秒后,室温下放置1小时。将所得到的复合物溶液用480μL完全DMEM培养基稀释,混合均匀。按同样方法制备含有25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物(N/P比为5)的培养基0.5mL。将24孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到一个孔内。每种N/P比设三个平行孔。37℃下孵育24小时,在荧光显微镜下观察并拍照。照片如图7(A)(a)-(c)所示。图7(A)(a)-(c)表示实施例四中制得的聚(β-氨基酯)类聚合物PAD(图7(A)(b)中)和25kDa分枝PEI(图7(A)(c)中)分别与表达GFP-shRNA的pDNA(以下简称GFP-shRNA)组成的复合物在HEK293-GFP细胞中的RNA干扰效率对比。图7(A)(a)-(c)是干扰48小时后的荧光照片,其中图7(A)(a)为空白对照。结果表明:PAD/GFP-shRNA复合物在HEK 293-GFP细胞中有较高的RNA干扰效率,且干扰效率大于25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物。
3)用流式细胞仪分析GFP表达沉默率
用胰蛋白酶将24孔板内细胞消化,并用DMEM培养基重悬细胞,2000×g离心5分钟,吸去上清,用PBS(0.8%NaCl,3.23%Na2HPO4·12H2O,0.45%NaH2PO4·2H2O)重悬沉淀的细胞。再次2000×g离心5分钟,吸去上清,用PBS重悬细胞,利用流式细胞仪分析所得细胞悬液,测定GFP的荧光强度,并与未加PAD/GFP-shRNA复合物培养的细胞比较,计算GFP表达沉默率。图7(B)表示用流式细胞仪分析的GFP表达被沉默的百分率。结果如图7(B)所示,表明PAD对HEK 293-GFP细胞有较高的RNA干扰效率,且高于25kDa分枝PEI。
实施例十四PAD/GFP-shRNA复合物和25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物体外HEK 293-GFP细胞毒性对比
1)细胞培养
HEK 293-GFP细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基(含100U/mL氨苄青霉素,100μg/mL链霉素和50μg/mL G418)(完全DMEM培养基)中,放置在37℃,5%CO2的培养箱中生长。取处于对数生长期的细胞,用含0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶消化液消化后,按每孔1×104个细胞接种于96孔板,每孔含培养基0.2mL,放在培养箱内培养12小时。
2)细胞毒性试验
配制0.2mg/mL的GFP-shRNA水溶液5μL,按一定的N/P比将实施例四中制备的PAD溶于3μL纯水中,将所配制的PAD溶液与GFP-shRNA溶液混合,室温下涡旋化30秒后,室温下放置1小时。将所得到的复合物溶液用192μL完全DMEM培养基稀释,混合均匀。按同样方法制备含有25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物(N/P比为5)的培养基0.2mL。将96孔板内原有的培养基吸走,将按上述方法配制的含有上述复合物的培养基加入到一个孔内。每种N/P比设三个平行孔。37℃下孵育24小时,除去培养基,每孔加入含0.5mg/mL MTT的培养基0.2mL,37℃下孵育4小时,小心吸去孔内培养基,每孔加入0.2mL二甲亚砜,37℃下摇床振摇10分钟(90rpm),通过酶标仪测定各孔在570nm的光吸收值。图8表示不同转染试剂在最佳转染条件下进行转染后HEK 293-GFP细胞存活百分率对比柱状图。结果如图8所示,表明所聚(β-氨基酯)类聚合物/核酸复合物PAD/GFP-shRNA复合物对HEK293-GFP细胞的体外毒性明显低于25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物。
实施例十五PAD/GFP-shRNA复合物体内RNA干扰试验
1)肿瘤接种
取对数生长期的U-87MG-GFP细胞5×106个,在无菌条件下接种于BALB/C雄性裸鼠右肩部皮下,接种细胞悬液体积为0.2mL。当肿瘤体积长至150-200mm3时可进行动物实验。
2)体内RNA干扰实验
配制0.2mg/mL的GFP-shRNA水溶液,按一定的N/P比将实施例四中制备的PAD溶于PBS(0.8%NaCl,3.23%Na2HPO4·12H2O,0.45%NaH2PO4·2H2O)中,将所配的PAD溶液与GFP-shRNA溶液混合,室温下涡旋化30秒后,室温下放置1小时。按同样方法制备25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物(N/P比为5)。将荷瘤鼠分为三组,每组六只,按照每公斤裸鼠0.2mg GFP-shRNA的剂量,尾静脉注射0.2mL按上述方法配制的复合物溶液或生理盐水。给药后48小时断颈处死裸鼠,皮下剥离肿瘤组织,OTC包埋后冷冻切片,在荧光显微镜下观察肿瘤切片标本并拍照。照片如图9(A)(a)-(c)所示。图9(A)(a)-(c)表示给荷U-87MG-GFP瘤的BALB/c裸鼠静脉注射不同转染试剂48小时后、肿瘤部位的RNA干扰效果。图9(A)(a)-(c)是肿瘤切片荧光照片。其中图9(A)(a):生理盐水组;图9(A)(b):PAD/GFP-shRNA复合物组;图9(A)(c):25kDa分枝PEI//GFP-shRNA复合物组。结果表明:PAD/GFP-shRNA复合物在荷U-87MG-GFP瘤的BALB/c裸鼠体内注射后,能够有效干扰肿瘤部位的GFP表达,且干扰效率高于25kDa分枝PEI/GFP-shRNA复合物。
3)用流式细胞仪分析瘤内GFP表达沉默率
将肿瘤组织剪碎,在PBS中匀浆,所得混悬液过尼龙膜,滤液2000×g离心5分钟,弃去上清,用0.5mL PBS重悬沉淀,再次2000×g离心5分钟,用0.5mLPBS重悬沉淀,利用流式细胞仪分析所得细胞悬液,测定GFP的荧光强度,并与注射生理盐水组的肿瘤细胞悬液比较,计算GFP表达沉默率。图9(B)表示用流式细胞仪分析的GFP表达被沉默的百分率。结果如图9(B)所示,表明聚(β-氨基酯)类聚合物PAD对荷U-87MG-GFP肿瘤的裸鼠有较高的瘤内RNA干扰效率,并且高于25kDa分枝PEI。
尽管已经对本发明的具体实施方式进行了描述,但对本领域普通技术人员来说,显然在不脱离由如下权利要求所限定的本发明实质和范围的情况下,可对本发明进行各种变通和改进。
Claims (8)
2.一种如权利要求1所述的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体的制备方法,其特征在于:由二乙烯三胺与双(2-羟乙基)-二硫-二丙烯酸酯聚合而成。
4.如权利要求1所述的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体在制备核酸输送载体中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途,其中,所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。
6.一种复合物,其含有权利要求1所述的聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸。
7.根据权利要求6所述的复合物,其中,所述的核酸包括DNA、RNA、寡聚核苷酸和/或修饰的核酸。
8.一种如权利要求6或7所述的复合物的制备方法:其特征在于制备步骤如下:将所述聚(β-氨基酯)类聚合物非病毒基因载体和核酸分别溶于纯水或缓冲液中,配制成N/P比为5、10、20、30、40、50的溶液,边涡旋化边将核酸的溶液加入到所述聚合物的溶液中,或将所述聚合物的溶液加入到核酸的溶液中,所得混合溶液涡旋化20-30秒,室温下放置20-200分钟至所述复合物形成。
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