CN111939266B - 一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用,该桦木酸前药胶束中桦木酸骨架的载药量高,由于桦木酸骨架体积较大,且疏水性很强,设计将其骨架本身作为胶束的疏水端,省略了设计聚合物片段中具有疏水端,这样做不仅进一步提高了桦木酸骨架的载药量,还减少了辅料的使用,进一步提高载药体系(胶束)的安全性;对肿瘤细胞组织的靶向性强;在体液环境中循环时间长,即避免了体内清除速度快,延长了实际药效作用时间;用作抗肿瘤药剂可以与光热疗法协同作用杀灭肿瘤细胞;该桦木酸前药胶束的制备方法简单,确保了该桦木酸前药胶束的制备和实施可行性,为桦木酸在抗肿瘤疾病治疗领域奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,具体涉及一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用。
背景技术
桦木酸(英文名称:Betulinic acid,简称BA)也称为白桦脂酸,是一种来源于白桦树、酸枣仁、迷迭香、夏枯草等植物的羽扇豆烷型五环三萜类化合物,其结构通式参见式1。桦木酸的羟基衍生物桦木醇在白桦树皮中的含量最高,可达10%~35%,可用于大量制备桦木酸。桦木酸为白色结晶,熔点为295~298℃,分子式为C30H48O3,分子结构中有A、B、C、D、E共5个环,含有3位羟基和28位羧基两个主要的官能团,脂溶性高,故不溶于水,微溶于甲醇、乙醇、丙酮,易溶于氯仿、四氢呋喃、吡啶等有机溶剂。
桦木酸具有多种药理活性,尤其以抗肿瘤作用最为显著。研究表明,桦木酸及其衍生物对肺癌、结肠癌、神经细胞瘤、卵巢癌、白血病等多种癌症都有明显抑制效果。
为了增强桦木酸的抗肿瘤活性,同时改善药代动力学性质。科学家们对其进行了大量的结构改造,主要集中在三个位点:A环,C-3羟基和C-28羧基(如式2所示)。C-3位修饰的BA衍生物对人体有较好的抗肿瘤作用并表现出良好的药代动力学特性。C-3羟基可以氧化成酮,并进一步衍生为含氮类似物(胺、肟或氨基甲酸酯):C-3羟基氧化成酮后细胞毒活性增加但选择性降低;C-3羟基衍生成胺或肟降低了活性和选择性;而C-3羟基糖基化衍生物则显示出8-12倍的肿瘤细胞选择性;C-3羟基与邻苯二甲酸酯化后对某些细胞的活性略有增强;C-3羟基与N-羧酸-咪唑成酯后细胞毒性显著增强。C-2位修饰的BA,如引入丁腈、羟基或杂环基团,导致细胞毒性增加;C-2位引入羟基,同时将C-3羟基氧化成酮显著提高活性;在C-2位和C-3位引入吲哚环后的BA衍生物具有较好的活性。C-28的羰基是维持药效的必要基团,为了达到更好的修饰效果,通常修饰羧基的时候也伴随着其他位点的修饰。C-28引入氨基酸侧链后具有黑素瘤特异性细胞毒性并提高了水溶性。然而,C-28羧基的糖苷化并没有提高活性。此外,在C-28位引入氨基酸聚合物可以增强水溶性和细胞毒性。
虽然桦木酸具有广泛的抗癌活性,但仍存在一些明显的缺陷,比如:水溶性差、全身清除快、非选择性细胞毒性、体外活性不强,这些缺陷极大地限制了BA在抗肿瘤领域的治疗效果。
发明内容
本发明的目的在于,克服现有技术中存在的缺陷,提供一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束、制备方法和应用,该桦木酸前药胶束中桦木酸骨架的载药量高,由于桦木酸骨架体积较大,且疏水性很强,设计将其骨架本身作为胶束的疏水端,省略了设计聚合物片段中具有疏水端,这样做不仅进一步提高了桦木酸骨架的载药量,还减少了辅料的使用,进一步提高载药体系(胶束)的安全性;对肿瘤细胞组织的靶向性强;在体液环境中循环时间长,即避免了体内清除速度快,延长了实际药效作用时间;用作抗肿瘤药剂可以与光热疗法协同作用杀灭肿瘤细胞;该桦木酸前药胶束的制备方法简单,确保了该桦木酸前药胶束的制备和实施可行性,为桦木酸在抗肿瘤疾病治疗领域奠定了基础。
为实现上述目的,本发明的技术方案是设计一种具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,所述胶束由聚合物1(mPEG-SS-BA Ploymers)和聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers)自组装而成,聚合物1的结构通式参见式3、聚合物2的结构通式参见式4:
优选的技术方案是,所述聚合物1中聚乙二醇基团的分子量为2000~10000;所述聚合物2中聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic)为F68、F108或F127中的一种。
一种上述具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束的制备方法,包括如下步骤:
步骤一:制备聚合物1(mPEG-SS-BA Ploymers),反应流程参见式5:
H1:将溴乙酸和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)搅拌溶于溶剂中,于氮气氛围下冷却至0℃,向反应液中滴加一定量的缩合剂,滴加完毕,室温搅拌6h;将N-Boc-胱氨和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)继续加入上述反应液中,室温搅拌至反应完全,过滤,滤液依次经浓缩、柱层析、旋蒸、干燥,得白色固体化合物Link SS;
H2:将步骤H1制备的化合物Link SS和桦木酸搅拌溶于溶剂中,加入一定量的碳酸钾,搅拌溶解,于氮气氛围下升温至50℃,搅拌3h至反应完全,过滤,滤液依次经浓缩、柱层析、旋蒸浓缩,得无色油状化合物BA-SS;
H3:将步骤H2制备的化合物BA-SS溶于溶剂中,于氮气氛围下冷却至0~5℃,搅拌滴加一定量的氯化氢有机相溶液,室温搅拌1h至反应完全,得反应产物混合液;将反应产物混合液蒸发浓缩去除氯化氢,得浓缩液;向浓缩液中加入一定量的二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)和甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS),于25℃条件下搅拌反应48h至反应完全;将反应产物混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析24h,将所得液体冻干,得白色固体聚合物1(mPEG-SS-BA Ploymers);
步骤二:制备聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers),反应流程参见式6:
R1:将化合物Cypate-I和3-溴丙酸搅拌溶于溶剂中,加入一定量的碘化钾,搅拌溶解,于氮气氛围下升温至110℃,搅拌16h至反应完全;冷却至室温,加入甲基叔丁基醚(MTBE),析出固体,过滤,并用甲基叔丁基醚(MTBE)洗涤滤饼,真空干燥,得棕色固体化合物Cypate-II;
R2:将化合物Cypate-III和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)搅拌溶于溶剂中,冷却至0~5℃,滴加乙酰氯有机相溶液,滴加完毕,升至室温搅拌0.5h至反应完全;向反应产物混合液中加入一定量的去离子水萃取,有机相依次经干燥、浓缩,得油状化合物Cypate-IV;
R3:将步骤R1制备的化合物Cypate-II和醋酸钠搅拌分散于溶剂中,于氮气氛围下升温至50℃,加入步骤R2制备的化合物Cypate-IV有机相溶液,升温至回流,保温反应16h至反应完全;将反应产物混合液依次经浓缩、干燥、洗涤和重结晶,得墨绿色固体化合物Cypate;
R4:将步骤R3制备的化合物Cypate搅拌溶于溶剂中,加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic)并搅拌均匀,于氮气氛围下,室温避光反应48h;将反应产物混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析24h,将所得液体冻干,得聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers);
步骤三:制备具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,将步骤一制备的聚合物1(mPEG-SS-BA Ploymers)和步骤二制备的聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers)按照质量投料比1:1溶于二甲基亚砜(DMSO)中,并于超声条件下缓慢滴入一定量的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜(DMSO),并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束成品。
优选的技术方案有,所述步骤H1和H2中,所用的溶剂均为四氢呋喃(THF),所述步骤H1中的缩合剂为二环己基碳二亚胺(DCC);
所述步骤H3中,所用的溶剂为1,4-二氧六环;
所述步骤R1中,所用的溶剂为邻二氯苯;
所述步骤R2中,所用的溶剂为二氯甲烷;
所述步骤R3中,所用的溶剂为甲醇;
所述步骤R4中,所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。
进一步优选的技术方案还有,所述的步骤H1中,摩尔投料比为溴乙酸:N-羟基丁二酰亚胺:缩合剂:N-Boc-胱氨:N,N-二异丙基乙胺=1:1.1:1.1:1:1;
所述步骤H2中,摩尔投料比为Link SS:桦木酸:碳酸钾=1:1:1.1;
所述步骤H3中,摩尔投料比为化合物BA-SS:甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG-NHS)=5:1;
所述步骤R1中,摩尔投料比为Cypate-I:3-溴丙酸:碘化钾=1:2:2;
所述步骤R2中,摩尔投料比为Cypate-III:N,N-二异丙基乙胺(DIPEA):乙酰氯=1:2:1.1;
所述步骤R3中,摩尔投料比为化合物Cypate-II:化合物Cypate-IV=2:1;
所述步骤R4中,摩尔投料比为化合物Cypate:N,N-二异丙基乙胺(DIPEA):N-羟基丁二酰亚胺(NHS):聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic)=1:1.1:1.1:0.2。
一种上述具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束的应用,所述的桦木酸前药胶束用作抗肿瘤靶向药。
优选的技术方案有,所述桦木酸前药胶束以适于注射或输注的调配物存在。
一种上述具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束与光热疗法的组合,用于治疗肿瘤疾病。
本发明的优点和有益效果在于:
1、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,聚合物1(mPEG-SS-BAPloymers)中桦木酸骨架与聚合物片段(聚乙二醇基团)之间以化学键相连,与传统的物理包埋法相比,桦木酸骨架的载药量提高,由于桦木酸骨架体积较大,且疏水性很强,设计将其骨架本身作为胶束的疏水端,省略了设计聚合物片段中具有疏水端,这样做不仅进一步提高了桦木酸骨架的载药量,还减少了辅料的使用,进一步提高载药体系(胶束)的安全性;
2、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,在桦木酸骨架和聚合物片段(聚乙二醇基团)之间引入二硫键,由于二硫键可以被谷胱甘肽(GSH)还原,细胞外液中GSH的浓度仅为2-10μM,而细胞内液的GSH浓度为1-10mM,此外肿瘤细胞内的GSH浓度比正常组织细胞内液高约3-4倍,使得胶束中的二硫键可在体循环液体环境中保持稳定,同时在肿瘤细胞内高浓度GSH下迅速裂解以加速药物分子(桦木酸分子)的释放,再结合肿瘤组织的高通透性和滞留效应,被动靶向到肿瘤细胞,极大增加了药物分子(桦木酸分子)在肿瘤组织中的蓄积,从而实现靶向抗肿瘤;
3、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,桦木酸骨架与聚合物片段(聚乙二醇基团)的连接臂以酯键连接,确保前药(桦木酸)在酸性溶酶体中可以降解为原药;聚乙二醇基团醇化后的桦木酸,不仅溶解度显著增加,还能避免巨噬细胞吞噬,在体液环境中循环时间长,即避免了体内清除速度快,延长了实际药效作用时间;
4、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,聚合物1(mPEG-SS-BAPloymers)具有还原性、聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers)由光热剂Cypate与Pluronic共聚物通过共价键结合而具有NIR(近红外光谱)响应性光热性质,因而聚合物1(mPEG-SS-BA Ploymers)和聚合物2(Pluronic-Cypate Ploymers)组装而成的桦木酸前药胶束具有还原与NIR双重响应性,其中聚合物1和聚合物2中的疏水端作为胶束的内核、聚合物1和聚合物2中的亲水链作为外壳,使该胶束水溶性好,不仅能确保该胶束中顺利到达肿瘤靶标,还能改善胶束的物理性质,获得更适宜的粒径大小和更低的临界胶束浓度;当双重响应型前药胶束给药后,对肿瘤组织进行局部NIR激光照射,利用Cypate基团的光热效应可以使肿瘤组织的温度升高,不仅可以直接杀灭肿瘤细胞,还可以加速装载的聚合物1在细胞质中释放桦木酸原药分子的速度,从而产生光热增强的热化疗协同作用;
5、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束可以用作抗肿瘤靶向药,靶向性更精准,还可以与光热疗法组合用于抗肿瘤疾病的治疗;
6、本发明具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束的制备方法简单,确保了该桦木酸前药胶束的制备和实施可行性,为桦木酸在抗肿瘤疾病治疗领域奠定了基础。
附图说明
图1是化合物Link SS的核磁氢谱图;
图2是化合物Link SS的质谱图;
图3是化合物BA-SS的核磁氢谱图;
图4是化合物BA-SS的质谱图;
图5是实施1中聚合物1(mPEG2K-SS-BA Ploymers)的核磁氢谱图;
图6是实施1中聚合物1(mPEG2K-SS-BA Ploymers)的核磁碳谱图;
图7是化合物Cypate的核磁氢谱图;
图8是实施例8中4T1细胞抑制率统计图,其中图8的(a)为化疗组试验数据图谱,图8的(b)为光热治疗组试验数据图谱;
图9是实施例9中实验组和对照组BALB/c小鼠肿瘤局部温度变化图谱;
图10是实施例9中体内药效学试验的肿瘤抑制率图谱;
图11是实施例9中实验小鼠治疗后收集切除的肿瘤照片;
图12是实施例9中实验小鼠治疗过程中肿瘤组织的体积变化曲线图;
图13是实施例9中实验小鼠治疗过程中体重的变化曲线图;
图14是实施例9中实验小鼠组织器官的H&E染色图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
制备聚合物1(mPEG2K-SS-BA Ploymers),反应流程参见上述式5:
H1:合成化合物Link SS,将溴乙酸(2.00g,14.39mmol)溶于10mL四氢呋喃(THF)中,加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.84g,15.83mmol),搅拌溶清后氮气保护,降温至0℃;称取二环己基碳二亚胺(DCC)(3.07g,15.83mmol)溶于10mL THF中,滴加到上述反应液中,控制滴加速度,保证温度不超过5℃,滴毕,室温搅拌6h;向反应液中加入N-Boc-胱氨(3.63g,14.39mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(1.85g,14.39mmol),室温搅拌过夜,TLC监测原料完全转化(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=3:1),将反应液过滤,少量THF漂洗滤饼,浓缩滤液,柱层析(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=4:1),得类白色固体化合物Link SS(3.89g,10.46mmol),收率:72.7%,化合物Link SS的核磁氢谱参见图1、质谱图参见图2,核磁氢谱数据为:1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.18(s,1H),4.97(s,1H),3.90(s,2H),3.63(q,J=6.1Hz,2H),3.46(q,J=5.9Hz,2H),2.86(t,J=5.9Hz,2H),2.80(t,J=6.7Hz,2H),1.45(s,9H);质谱数据为:C11H21BrN2O3S2,m/z:395.1for[M+Na]+;
H2:合成化合物BA-SS,将Link SS(1.00g,2.69mmol)溶解于10mL THF中,再加入桦木酸(1.23g,2.69mmol),搅拌溶清,一次性加入碳酸钾(0.41g,2.96mmol),氮气保护,升温至50℃反应3h,TLC监测原料完全转化(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=2:1),过滤,浓缩滤液,柱层析(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=3:1),得无色油状化合物BA-SS(1.64g,2.19mmol),收率:81.5%,化合物BA-SS的核磁氢谱参见图3、质谱图参见图4,核磁氢谱数据为:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.10(s,1H),6.97(s,1H),4.68(s,1H),4.56(s,1H),4.44(s,2H),4.26(s,1H),3.18(s,2H),2.92(d,J=47.0Hz,2H),2.79–2.72(m,3H),2.23–2.15(m,2H),1.98–1.93(m,1H),1.86–1.69(m,2H),1.66–0.89(m,40H),0.85(d,J=15.3Hz,7H),0.76(d,J=4.6Hz,3H),0.65(s,4H);质谱数据为:C41H68N2O6S2,m/z:771.6for[M+Na]+;
H3:合成聚合物1(mPEG2K-SS-BA Ploymers),将无色油状化合物BA-SS(1.60g,2.14mmol)溶于8mL 1,4-二氧六环中,氮气保护,降温至0-5℃,搅拌下滴加8mL 4M盐酸-1,4-二氧六环溶液,滴毕,室温搅拌1h,TLC检测原料完全转化;旋干溶液,加入适量甲苯带干盐酸,向浓缩物中加入16mL二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.56g,4.28mmol)和分子量为2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS)(0.91g,0.43mmol),搅拌溶清,25℃反应48h;待反应结束后,用截留分子量为1000Da的透析袋在去离子水中透析24h。将所得液体冻干,得白色固体聚合物1(mPEG2K-SS-BA Ploymers)(1.11g),聚合物1mPEG2K-SS-BA Ploymers)的核磁氢谱参见图5、核磁碳谱参见图6,核磁氢谱数据为:1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.11(t,J=5.5Hz,1H),7.86(t,J=5.7Hz,0H),4.68(s,1H),4.56(s,1H),4.49–4.40(m,2H),4.26(s,1H),3.88(s,1H),3.24(s,3H),3.01–2.84(m,3H),2.80(dt,J=19.1,6.9Hz,3H),2.19(dd,J=23.1,10.4Hz,2H),1.96(dd,J=12.0,8.2Hz,1H),1.86–1.77(m,1H),1.68–0.90(m,29H),0.90–0.72(m,12H),0.67–0.60(m,4H);
核磁碳谱数据为:13C NMR(151MHz,DMSO)δ174.99,169.86,167.35,150.62,110.14,77.24,71.76,70.38,70.26,70.06,62.14,58.52,56.26,55.38,50.41,49.22,46.95,42.45,40.72,38.96,38.74,38.45,37.87,37.49,37.17,36.67,34.33,31.79,30.37,29.56,28.55,27.62,25.52,20.89,19.38,18.42,16.38,16.25,16.10,14.82。
实施例2
制备聚合物1(mPEG5K-SS-BAPloymers),操作方法与实施例1相同,区别在于:步骤H3中,使用分子量为5000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG5K-NHS)替代2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS),得白色固体聚合物1(mPEG5K-SS-BA Ploymers)(2.24g)。
实施例3
制备聚合物1(mPEG10K-SS-BAPloymers),操作方法与实施例1相同,区别在于:步骤H3中,使用分子量为10000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG10K-NHS)替代分子量为2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS),得白色固体聚合物1(mPEG10K-SS-BAPloymers)(1.24g)。
实施例4
制备聚合物2(Pluronic F68-Cypate Ploymers),反应流程参见上述式6:
R1:合成化合物Cypate-II,将Cypate-I(4.06g,20mmol)和3-溴丙酸(6.12g,40mmol)溶于30mL邻二氯苯中,加入碘化钾(6.64g,40mmol),氮气保护,升温至110℃,保温反应16h,TLC检测原料完全转化,冷却至室温,加入20mL甲基叔丁基醚(MTBE),析出固体,过滤,滤饼以MTBE洗涤数次,真空干燥,得棕色固体化合物Cypate-II 7.6g,收率92.5%;
R2:合成化合物Cypate-IV,将Cypate-III(2.85g,10mmol)和DIPEA(2.71g,21mmol)置于反应瓶中,25mL加入二氯甲烷搅拌溶清,冷却至0~5℃;滴加5mL乙酰氯(0.86g,11mmol)的二氯甲烷溶液,滴毕,升至室温搅拌0.5h,TLC检测原料完全转化;向反应瓶中加水(15mL)萃取,有机层用无水硫酸钠干燥,浓缩得到油状物Cypate-IV 2.84g,收率95.9%;
R3:合成化合物Cypate,将Cypate-II(1.05g,5mmol)和醋酸钠(0.82g,10mmol)分散于甲醇(20mL)中,氮气保护,升温至50℃,加入Cypate-IV(2.05g,5mmol)的甲醇(10mL)溶液,升温至回流,保温反应16h;将反应液浓缩至干,固体依次用乙酸乙酯(20mL)、5%盐酸水溶液(20mL)、乙酸乙酯(20mL)洗涤,再用10mL体积比乙腈/水=3:7的溶剂重结晶,得墨绿色固体Cypate 1.9g,收率60.6%,化合物Cypate的核磁氢谱参见图7,核磁氢谱数据为:1HNMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.21(d,J=8.4Hz,2H),8.02(t,J=8.6Hz,4H),7.93(t,J=12.6Hz,2H),7.70(d,J=8.7Hz,2H),7.62(t,J=7.5Hz,2H),7.47(t,J=7.4Hz,2H),6.63–6.31(m,4H),4.40(s,4H),2.64(t,J=6.8Hz,4H),1.86(s,12H);
R4:合成聚合物2(Pluronic F68-Cypate),将Cypate((0.56g,0.90mmol))溶解于20mL DMF中,加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺(EDCI)(0.19g,1.00mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(0.12g,1.00mmol)和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F68)(1.55g,0.18mmol),氮气保护,室温下避光反应48h;待反应结束后,用截留分子量为1000Da的透析袋在去离子水中透析24h,将所得液体冻干,得聚合物2(Pluronic F68-Cypate)(1.65g)。
实施例5
制备聚合物2(Pluronic F108-Cypate Ploymers),操作方法与实施例4相同,区别在于:步骤R4中,使用聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F108)(2.69g,0.18mmol)替代聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F68),得聚合物2(Pluronic F108-Cypate)(2.88g)。
实施例6
制备聚合物2(Pluronic F127-Cypate Ploymers),操作方法与实施例4相同,区别在于:步骤R4中,使用聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F127)(2.18g,0.18mmol)替代聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(Pluronic F68),得聚合物2(Pluronic F127-Cypate)(2.30g)。
实施例7
制备聚合物1、聚合物2和具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate):
将实施例1中制备的聚合物1(mPEG2K-SS-BAPloymers,10mg)和实施例4中制备的聚合物2(Pluronic F68-Cypate Ploymers,10mg)溶于500μL二甲基亚砜(DMSO)中,并于超声条件下缓慢滴入1.70mL的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜(DMSO),并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)溶液成品;
将实施例1中制备的聚合物1(mPEG2K-SS-BAPloymers,10mg)溶于300μL二甲基亚砜(DMSO)中,并于超声条件下缓慢滴入1.70mL的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜(DMSO),并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得聚合物1(mPEG2K-SS-BA)前药胶束溶液成品;
将实施例4中制备的聚合物2(Pluronic F68-Cypate Ploymers,10mg)溶于300μL二甲基亚砜(DMSO)中,并于超声条件下缓慢滴入1.70mL的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜(DMSO),并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得聚合物2(Pluronic F68-Cypate)前药胶束溶液成品。
对比例1
制备聚合物1”(mPEG2K-CC-BA Ploymers),反应流程参见式7:
H1:合成化合物Link CC,将溴乙酸(2.00g,14.39mmol)溶于10mL四氢呋喃(THF)中,加入N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(1.84g,15.83mmol),搅拌溶清后氮气保护,降温至0℃;称取二环己基碳二亚胺(DCC)(3.07g,15.83mmol)溶于10mL THF中,滴加到上述反应液中,控制滴加速度,保证温度不超过5℃,滴毕,室温搅拌6h;向反应液中加入N-Boc-1,6-己二胺(3.11g,14.39mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(1.85g,14.39mmol),室温搅拌过夜,TLC监测原料完全转化(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=3:1),将反应液过滤,少量THF漂洗滤饼,浓缩滤液,柱层析(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=4:1),得类白色固体化合物Link CC(3.68g,10.97mmol),收率:76.2%;
H2:合成化合物BA-CC,将Link CC(0.90g,2.69mmol)溶解于10mL THF中,再加入桦木酸(1.23g,2.69mmol),搅拌溶清,一次性加入碳酸钾(0.41g,2.96mmol),氮气保护,升温至50℃反应3h,TLC监测原料完全转化(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=2:1),过滤,浓缩滤液,柱层析(展开剂,正己烷:乙酸乙酯=3:1),得无色油状化合物BA-CC(1.61g,2.26mmol),收率:84%;
H3:合成聚合物1”(mPEG-CC-BA Ploymers),将无色油状化合物BA-CC(1.52g,2.14mmol)溶于8mL 1,4-二氧六环中,氮气保护,降温至0-5℃,搅拌下滴加8mL4M盐酸-1,4-二氧六环溶液,滴毕,室温搅拌1h,TLC检测原料完全转化;旋干溶液,加入适量甲苯带干盐酸,向浓缩物中加入16mL二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)(0.56g,4.28mmol)和分子量为2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS)(0.91g,0.43mmol),搅拌溶清,25℃反应48h;待反应结束后,用截留分子量为1000Da的透析袋在去离子水中透析24h。将所得液体冻干,得白色固体聚合物1”(mPEG2K-CC-BA Ploymers)(1.01g)。
对比例2
制备聚合物1”(mPEG5K-CC-BA Ploymers),操作方法与对比例1相同,区别在于:步骤H3中,使用分子量为5000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG5K-NHS)(2.25g,0.43mmol)替代分子量为2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS),得白色固体聚合物1”(mPEG5K-CC-BA Ploymers)(2.19g)。
对比例3
制备聚合物1”(mPEG10K-CC-BA Ploymers),操作方法与对比例1相同,区别在于:步骤H3中,使用分子量为10000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG10K-NHS)(1.20g,0.11mmol)替代分子量为2000的甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(mPEG2K-NHS),得白色固体聚合物1”(mPEG10K-CC-BA Ploymers)(1.22g)。
对比例4
制备非还原响应型桦木酸前药胶束(mPEG2K-CC-BA@F68-Cypate):
将对比例1中制备的聚合物1”(mPEG2K-CC-BA Ploymers,10mg)和实施例4中制备的聚合物2(Pluronic F68-Cypate Ploymers,10mg)溶于500μL二甲基亚砜(DMSO)中,并于超声条件下缓慢滴入1.70mL的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜(DMSO),并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得非还原响应型桦木酸前药胶束(mPEG2K-CC-BA@F68-Cypate)溶液成品。
实施例8细胞毒性实验
用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮杂溴化物)试验来评估4T1细胞的细胞毒性,具体操作如下:
对于化疗组,将4T1细胞以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中,同时在96孔板最外层的36个孔中加入100μL的无菌PBS,置于37℃培养箱中培养24h;待细胞贴壁后,更换培养基为新鲜无FBS培养基,分别加入不同浓度的游离桦木酸(BA)、实施例7中制备的聚合物2(Pluronic F68-Cypate)胶束溶液、聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束溶液和桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)溶液,将其置于培养箱中孵育;
对于光热治疗组,与上述化疗组的区别在于:在预定的培养时间后吸弃掉悬浮液,并用无菌PBS洗涤样品板的每个孔,随后,在每个孔内加入新鲜适量的培养基,用808nm激光器以2W/cm2的NIR照射细胞悬浮液5min,随后将4T1细胞进一步培养,使其总孵育时间与化疗组相同;
对于所有试验组,细胞培养48h之后,倒掉孔板中的培养基,并在每个相对应的孔中加入50μL配制好的2mg/mL的MTT无菌溶液,在培养箱中继续培养4h,取出后倒掉培养基;在每个孔中加入150μL DMSO,使甲臜晶体完全溶解,在37℃下振荡15min;最后在570nm处测定每个孔的吸光度A值,并根据以下公式(1)计算出各细胞的生长抑制率:
研究通过计算联合指数(CI)来评价联合化疗和光热疗法的治疗效果,联合指数(CI)的计算公式(2)如下:
CI=[IC50(联合化疗)/IC50(化疗)]+[IC50(联合光热疗法)/IC50(光热疗法)] 公式(2)
其中,CI<1表示协同作用,CI>1表示拮抗作用,CI=1表示累加作用。
如图8所示,研究通过MTT法来评价不同载药体系对4T1细胞的细胞毒性,以评价热疗和化疗的协同治疗效果:对于化疗组,参见图8的(a),Pluronic F68-Cypate胶束孵育的4T1细胞在测试浓度范围内显示出很高的细胞存活力(>85%),初步证明Pluronic F68-Cypate胶束具有良好的生物相容性;相比之下,对于光热治疗组,参见图8的(b),在NIR照射下Pluronic F68-Cypate胶束在14.96μg/mL的Cypate浓度下表现出明显的细胞毒性,细胞活力降低至约38%;对于游离BA化疗组,发现明显的浓度依赖性细胞抑制效率,当BA的浓度高达25μg/mL时,细胞存活率接近32%。
此外,研究计算了不同给药制剂组的IC50值(参见表1):
表1游离桦木酸(BA)、聚合物2(Pluronic F68-Cypate)胶束溶液、聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束和桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)分别孵育4T1细胞48h的IC50值
注释:IC50值基于桦木酸分子的浓度。
实验结果证明:与游离BA组相比,BA+NIR照射在相应的BA浓度下具有相似的细胞活力,并且游离BA(10.23μg/mL)和BA+NIR照射组(10.56μg/mL)的IC50值几乎相同,即NIR激光照射对细胞活力没有明显的抑制作用;对于无NIR照射的聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束组,与游离BA组相比,显示出较低的细胞存活力,这归因于BA在mPEG2K-SS-BA胶束中的溶解度增加,以及细胞对BA的摄取提高;同样,在NIR照射下,聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束的IC50与未进行近红外照射的聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束相似;
桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)未照射组与聚合物1(mPEG2K-SS-BA)胶束组相比,观察到相似的细胞存活力;令人鼓舞的是,与化疗组(未进行NIR照射的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate))和光热治疗组(聚合物2(Pluronic F68-Cypate)胶束+NIR)相比,在NIR激光照射下桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)孵育的4T1细胞表现出当BA浓度为25μg/mL时,抑制效果高达86.4%;另外,研究通过计算联合指数(CI)来说明化疗和光热治疗法的协同作用(CI<1表示协同作用,CI=1表示累加作用,而CI>1表示拮抗作用),即在NIR照射下桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)的CI值是0.635,表明化疗和光热治疗法具有一定的协同作用,这主要是由于,在NIR光照射下,桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)孵育的4T1细胞的温度提高,产生有毒的热量一方面能够破坏细胞,另一方面能加速药物BA分子的释放,及增加肿瘤细胞对BA分子的敏感性,从而引起更大的细胞毒性。
实施例9药效学实验
动物肿瘤模型的建立:取状态良好的4T1细胞制成1×107个细胞/mL的肿瘤细胞悬液,取数十只6~8周龄体重在18~20g的BALB/c雌鼠,分别于右侧后背部皮下注射肿瘤细胞混悬液100μL,观察小鼠臀后肿瘤的生长变化情况,待肿瘤体积长至大约100mm3,分组进行后续试验。
体内热化疗联合的药效学试验:待Balb/c荷瘤小鼠的肿瘤体积达到100mm3后,选择肿瘤生长状况良好,且出血坏死的荷瘤小鼠,随机分为6组,每组5只,实验分组分别包括:PBS组、游离桦木酸BA组、桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)(制剂化疗组)、桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)+NIR组(联合治疗组)、聚合物2(Pluronic F68-Cypate)前药胶束+NIR组(单纯光热疗组)、桦木酸前药胶束(mPEG2K-CC-BA@F68-Cypate)+NIR组(非还原敏感组),并经尾静脉分别给对应组的荷瘤小鼠注射给药,注射给药等量转换为BA分子的剂量为5mg/kg。对于NIR组,在第1、3和5天注射6h后,以1.0W/cm2的NIR激光照射局部肿瘤组织5min。之后实验小鼠正常饲养,每隔一天监测小鼠的体重,并用数显游标卡尺测量肿瘤的长轴直径(L)和短轴直径(S),观测记录肿瘤生长情况,肿瘤体积V的计算公式(3)为:
V=L×S2/2 公式(3)
当小鼠带瘤生长至15天,脱颈处死全部试验小鼠,并剥离肿瘤组织,用生理盐水简单清洗表面血液,用滤纸将水分吸干,称量各试验组肿瘤的质量,按照如下公式(4)计算肿瘤抑制率(Tumor Inhibiting Rate,TIR):
其中,Ws为生理盐水组肿瘤组织的平均质量,Wt为其他试验组肿瘤组织的平均质量。
桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)体内升温效果评价:将6只荷瘤的BALB/c小鼠,随机分为2个试验组,分别给予生理盐水、桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)溶液,经小鼠尾静脉注射给药6h后(给药剂量相当于BA的量为:5mg/kg)。
研究采用红外热成像仪同步记录了在NIR激光照射过程中,BALB/c小鼠肿瘤局部的温度变化情况,结果参见图9,用808nm的NIR激光以1W/cm2的功率密度照射两组BALB/c小鼠的肿瘤部位3min,对于生理盐水组的BALB/c小鼠在近红外光照射下,肿瘤局部温度由30.4℃升高至为38.7℃;对于桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)+NIR组,当桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)在肿瘤组织中聚集后,由于桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)中接枝的Cypate光热染料具有近红外光热转化的升温特性,在相同功率的NIR激光照射下,小鼠肿瘤的局部温度由31.1℃升高至51.2℃,远远超过了肿瘤组织可耐受热疗的温度(约42℃),从而对肿瘤组织产生热损伤和消融,实现肿瘤的光热治疗。
桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)的体内药效学试验:
4T1乳腺癌细胞为鼠源癌细胞,在Balb/c雌性小鼠皮下可顺利成瘤。由于桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)在NIR照射下具有良好的体外协同抗肿瘤作用,因此研究进一步使用4T1荷瘤小鼠来评价前药胶束的体内联合抗肿瘤效果。
治疗15天后,记录肿瘤体积并计算肿瘤抑制率,结果如图10所示:生理盐水组(Saline)较其他试验组显示出更快的肿瘤生长速度:对于游离BA组,观察到中等抑制率(34.6±15.3)%:单纯光热治疗组(聚合物2(Pluronic F68-Cypate)前药胶束+NIR)也显示出明显的肿瘤抑制率(50.3±8.8)%。
未经NIR照射的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)表现出更明显的抑瘤率(60.7±2.2)%,这是由于循环时间增加和对纳米颗粒的溶解度提高;令人兴奋的是,对于联合治疗组,采用NIR照射的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)+NIR显示出比其他试验组明显更高的抑制率,其抑制率为(92.0±5.7)%,显示较好的热疗和化疗的联合治疗效果;相比之下,在NIR照射下非还原响应型桦木酸前药胶束(mPEG2K-CC-BA@F68-Cypate)+NIR组与还原敏感的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)+NIR相比,对肿瘤的抑制率较低为71.6%,这是因为在NIR照射下,非还原响应型桦木酸前药胶束(mPEG2K-CC-BA@F68-Cypate)中桦木酸分子BA的释放量相对较低,不能很好的实现热化疗的治疗效果。
4T1荷瘤小鼠在经历了15天治疗后的各组实体肿瘤照片如图11所示,肿瘤体积-时间曲线如图12所示,实验结果进一步证明桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)+NIR的光热化疗协同作用对肿瘤的抑制较任何单一疗法(化疗或光热疗法)更有效;研究记录了治疗过程中4T1荷瘤小鼠的体重变化情况如图13所示,游离BA组试验小鼠给药后体重略微下降,表明游离BA具有一定的生物毒性,而其他各试验组在治疗过程中未观察到体重异常现象,说明胶束载体具有一定的安全性,即纳米胶束载体未引起毒性或副作用。基于这些结果,表明桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)对荷瘤小鼠没有明显的毒性,从而为纳米载体的出色安全性提供了证据。因此,本发明方法制备的桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)为联合疗法带来了广阔的前景。
组织病理学试验:将上述试验中剖离的荷瘤小鼠的主要脏器以及肿瘤组织进行组织学观察,来验证各试验组治疗方案对小鼠的潜在毒性,具体操作为:将上述体内药效试验中取出的各试验组小鼠的主要器官包括心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织,浸泡于4%多聚甲醛溶液中进行固定,经过石蜡切片处理,H&E染色后,用显微镜下直接观察各组织器官的病理学变化情况,结果参见图14,结果表明:试验组小鼠的主要器官中均未观察到明显的病理学改变,因此可以推测桦木酸前药胶束(mPEG2K-SS-BA@F68-Cypate)具有良好的相容性和安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (3)
2.一种如权利要求1所述的具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,其特征在于,所述桦木酸前药胶束用于治疗肿瘤疾病时与光热疗法一起组合使用。
3.一种如权利要求1或2所述的具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
步骤一:制备聚合物1:mPEG-SS-BA Ploymers,反应流程参见式5:
H1:将溴乙酸和N-羟基丁二酰亚胺搅拌溶于溶剂中,于氮气氛围下冷却至0℃,向反应液中滴加一定量的缩合剂,滴加完毕,室温搅拌6h;将N-Boc-胱氨和N,N-二异丙基乙胺继续加入上述反应液中,室温搅拌至反应完全,过滤,滤液依次经浓缩、柱层析、旋蒸、干燥,得白色固体化合物Link SS;
H2:将步骤H1制备的化合物Link SS和桦木酸搅拌溶于溶剂中,加入一定量的碳酸钾,搅拌溶解,于氮气氛围下升温至50℃,搅拌3h至反应完全,过滤,滤液依次经浓缩、柱层析、旋蒸浓缩,得无色油状化合物BA-SS;
H3:将步骤H2制备的化合物BA-SS溶于溶剂中,于氮气氛围下冷却至0~5℃,搅拌滴加一定量的氯化氢有机相溶液,室温搅拌1h至反应完全,得反应产物混合液;将反应产物混合液蒸发浓缩去除氯化氢,得浓缩液;向浓缩液中加入一定量的N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二异丙基乙胺和甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯:mPEG-NHS,于25℃条件下搅拌反应48h至反应完全;将反应产物混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析24h,将所得液体冻干,得白色固体聚合物1:mPEG-SS-BA Ploymers;
步骤二:制备聚合物2:Pluronic-Cypate Ploymers,反应流程参见式6:
R1:将化合物Cypate-I和3-溴丙酸搅拌溶于溶剂中,于氮气氛围下升温至110℃,搅拌16h至反应完全;冷却至室温,加入甲基叔丁基醚,析出固体,过滤,并用甲基叔丁基醚洗涤滤饼,真空干燥,得棕色固体化合物Cypate-II;
R2:将化合物Cypate-III和N,N-二异丙基乙胺搅拌溶于溶剂中,冷却至0~5℃,滴加乙酰氯有机相溶液,滴加完毕,升至室温搅拌0.5h至反应完全;向反应产物混合液中加入一定量的去离子水萃取,有机相依次经干燥、浓缩,得油状化合物Cypate-IV;
R3:将步骤R1制备的化合物Cypate-II和醋酸钠搅拌分散于溶剂中,于氮气氛围下升温至50℃,加入步骤R2制备的化合物Cypate-IV有机相溶液,升温至回流,保温反应16h至反应完全;将反应产物混合液依次经浓缩、干燥、洗涤和重结晶,得墨绿色固体化合物Cypate;
R4:将步骤R3制备的化合物Cypate搅拌溶于溶剂中,加入1-乙基-3(3-二甲基丙胺)碳二亚胺、N-羟基丁二酰亚胺和聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物:Pluronic并搅拌均匀,于氮气氛围下,室温避光反应48h;将反应产物混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析24h,将所得液体冻干,得聚合物2:Pluronic-Cypate Ploymers;
步骤三:制备具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束,将步骤一制备的聚合物1:mPEG-SS-BA Ploymers和步骤二制备的聚合物2:Pluronic-Cypate Ploymers:按照质量投料比1:1溶于二甲基亚砜中,并于超声条件下缓慢滴入一定量的去离子水中,制备成胶束混合液,将胶束混合液置于截留分子量为1000Da的透析袋,并于去离子水中透析4h换水一次,总共透析12h;去除二甲基亚砜,并使用超滤管浓缩胶束混合液至一定浓度,得具有还原、近红外光双重响应的桦木酸前药胶束成品;
所述步骤H1和H2中,所用的溶剂均为四氢呋喃,所述步骤H1中的缩合剂为二环己基碳二亚胺;
所述步骤H3中,所用的溶剂为1,4-二氧六环;
所述步骤R1中,所用的溶剂为邻二氯苯;
所述步骤R2中,所用的溶剂为二氯甲烷;
所述步骤R3中,所用的溶剂为甲醇,所述化合物Cypate-IV有机相溶液为Cypate-IV乙腈溶液;
所述步骤R4中,所用的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺;
所述的步骤H1中,摩尔投料比为溴乙酸:N-羟基丁二酰亚胺:缩合剂:N-Boc-胱氨:N,N-二异丙基乙胺=1:1.1:1.1:1:1;
所述步骤H2中,摩尔投料比为Link SS:桦木酸:碳酸钾=1:1:1.1;
所述步骤H3中,摩尔投料比为化合物BA-SS:甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯=5:1;
所述步骤R1中,摩尔投料比为Cypate-I:3-溴丙酸:碘化钾=1:2:2;
所述步骤R2中,摩尔投料比为Cypate-III:N,N-二异丙基乙胺:乙酰氯=1:2:1.1;
所述步骤R3中,摩尔投料比为化合物Cypate-II:化合物Cypate-IV=2:1;
所述步骤R4中,摩尔投料比为化合物Cypate:N,N-二异丙基乙胺:N-羟基丁二酰亚胺:聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物=1:1.1:1.1:0.2。
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