CN112718029B - 提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法及微流控材料 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法及微流控材料，涉及医用材料技术领域。提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法包括：在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷芯片，且对聚二甲基硅氧烷芯片做导电化处理得到导电的PDMS微芯片；采用静电纺丝方式将电纺纤维沉积到导电的PDMS微芯片表面得到电纺纤维改性微芯片；通过引入二硫键的方式将一种或多种抗体修饰到电纺纤维改性微芯片表面。用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料包括聚二甲基硅氧烷微支柱阵列，在微支柱阵列上沉积有电纺纤维，抗体通过二硫键修饰在电纺纤维表面，能够对CTCs更精确的捕获，且还能够将CTCs完整地释放出来。

Description

提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法及微流控材料
技术领域
本发明涉及医用材料技术领域，且特别涉及提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法及微流控材料。
背景技术
在肿瘤转移中，从肿瘤原发处脱落进入血液循环的各类肿瘤细胞，即循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)，是被广泛地认为与肿瘤转移密切相关的。CTCs的检测属于微创检测，只需人体少量血液即可，对人体损伤小。目前，已在包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌以及胰腺癌等癌症患者血液中发现了相应的CTCs，而在健康人体血液中则没有发现。随着研究的深入，癌症患者体内的CTCs个数已经被认为是判断癌症是否发生转移、评定癌症发展进程的重要指标。因此，CTCs的精准高效检测，对深入理解癌症转移机制，以及对癌症筛查、预后、转移和复发的监测等，都具有十分重要的价值。
要实现CTCs的精准高效检测，必须得首先实现对血液中CTCs精准有效的捕获。然而，在血液中CTCs的数量极其稀少，血液成分复杂干扰大；并且CTCs本身存在异质性，同一患者体内的同一类CTCs可能存在不同的表型。这就使得对CTCs的精准有效捕获难以实现。针对这些问题，研究者们主要是根据CTCs区别于血液中其他血细胞等成分的理化特性，而发展出相应的捕获技术。主要包括：(1)根据CTCs生物化学特性，即CTCs细胞膜表面的特异性标记物，而利用相关的亲和分子开发的亲和力型CTCs捕获技术。由于CTCs细胞多属于上皮类型的细胞，现在报道较多的就是根据上皮类CTCs细胞膜表面的“上皮细胞粘附分子”，而选用与之相对应的抗体来对捕获材料进行修饰。已见报道的其他CTCs表面标记物还包括：N-钙粘蛋白(N-cadherin)，丝束蛋白3(plastin 3,PLS3)，人表皮生长因子受体2(humanepidermal growth factor receptor 2，HER2)，叶酸受体等。(2)根据CTCs生物物理特性，即密度较大，易团聚成簇，尺寸较大，变形能力较差等，而开发出的非亲和力型CTCs捕获技术。这类捕获技术，无需用CTCs相关的亲和分子来标记用于捕获的材料，理论上对多种表型的CTCs都能实现捕获，具有一定的潜在应用价值。
总体而言，两种捕获方式均能在一定程度上实现对某些CTCs的有效捕获，但也存在很多不足，还达不到精准捕获CTCs的要求。为此，各国研究人员利用了各种技术手段，来克服这些不足，提高捕获技术的精准度。其中微流控技术的引入，则是最具代表性的一种提高CTCs捕获精准度的手段。微流控技术通过构建各类微流通道系统来实现对微流体的各种复杂控制，在CTCs的检测中，具备很多优点，如所需血液样本体积小、高通量输出、分离处理时间短、便于进行单细胞分析、可以集成后续的CTCs分析系统等。
微流控技术中，由微支柱阵列构成的微芯片能起到改变流体状态的作用，因为流体的流动状态可以根据其雷诺数来反映，而在微流控的通道中由于其特征长度非常小，雷诺数非常小，流体呈层流流动，但是微柱的存在，流体与微柱的碰撞产生了垂直于通道方向的流速，引起了流体的紊乱，在整个三维空间上与微柱的碰撞几率增大，而且这其中，确定性侧向位移(DLD)芯片更是近年比较受关注的分选细胞的方法，DLD芯片主要是根据细胞尺寸设计合适大小的微支柱阵列，当细胞或其他物质流经阵列时，会与微支柱发生碰撞，尺寸大于分选临介半径的物质会朝一侧聚集，而尺寸小于分选临介半径的则不会发生侧移。这种确定性侧向位移技术也能有效实现对肿瘤细胞的捕获，但容易出现假阳性结果，还需进一步改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，旨在将纤维状纳米结构引入微流控通道表面，增加细胞与微流控通道的接触面积，且在纤维表面引入一种或多种亲和分子，提高对CTCs捕获的精准度，并能够将CTCs完整的释放出来。
本发明的另一目的在于提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，其能够对CTCs更精确的捕获，且还能够将CTCs完整地释放出来。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出了一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，包括如下步骤：
S1:在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷芯片，且对聚二甲基硅氧烷芯片进行导电化处理得到导电的PDMS微芯片；其中，在微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径为30-50μm，高度为30-100μm，直径与高度的比值为1～0.5，处在同一横排微柱间隙为30-160μm，相邻两排微柱间距离为30～160μm，相邻两排微柱偏离位错距离为2.8～80μm；
S2:以导电的PDMS微芯片为接收板，采用静电纺丝方式将电纺纤维沉积到导电的PDMS微芯片表面得到电纺纤维改性微芯片，电纺纤维直径为0.15～4μm；静电纺丝过程中所用的纺丝溶液是将高分子聚合物溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺形成的混合溶剂中；其中，二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为2.5:1-3.5:1，高分子聚合物在纺丝溶液中的质量分数为10-30％；且该静电纺丝电压为10-22KV，推速为0.2-2mL/h，推收距离为12-22cm。
S3:通过引入二硫键的方式将一种或多种抗体修饰到电纺纤维改性微芯片表面。
本发明还提出一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，微流控材料应用上述提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法制备而得。
本发明实施例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法的有益效果是：其通过在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷芯片，一般情况微柱的排列可设计成平行的阵列或平行交错排列，通过有限元动态模拟软件分析，在较大尺寸下的平行交错排列能产生更多的不均匀速度场分布，对微柱间的流体产生更多的分流，表明细小颗粒可以在更多的地方与微柱表面接触；特别地，当这些微支柱阵列按一定方式排列时，其能满足确定性侧向位移的条件，即可利用微流控通道使血液中尺寸较大的CTCs流经通道时能与微支柱发生碰撞而发生侧向位移，CTCs与尺寸较小的其他血液成分发生分离；在微支柱表面通过先引入电纺纤维，再通过二硫键引入用于捕获CTCs的特异性抗体，进一步提升CTCs捕获的精准度，且二硫键在还原剂存在的情况下可以在温和的条件下断裂，将CTCs完整的释放出来用于后续的研究。
本发明还提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，其通过聚二甲基硅氧烷微支柱阵列形成微流控通道，便于捕获CTCs；还通过引入抗体进一步增加了对CTCs捕获的精准度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是可提高循环肿瘤细胞捕获精准度的电纺纤维增强微流控芯片的制备流程图；
图2是电纺纤维增强的微流控芯片的微观结构光镜图；
图3是电纺纤维经多巴胺溶液改性处理后的扫描电镜图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料进行具体说明。
本发明实施例提供的一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其包括如下步骤：
S1、聚二甲基硅氧烷芯片的制备
请结合图1，在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片，且在聚二甲基硅氧烷芯片中掺杂导电材料得到导电的PDMS微芯片。利用PDMS形成的微阵列结构形成微流控芯片，对循环肿瘤细胞CTCs进行捕获，导电材料的加入使材料可以通过静电纺丝的方式沉积电纺纤维。
需要说明的是，常规参数条件下，微柱间的尺寸较大，主要是通过微柱对流体的阻碍使其向侧向产生分流，并在微柱的表面产生不均匀的速度场分布，使得其中的颗粒在微柱表面的三维空间内有更多的运动轨迹和与微柱有更多的碰撞，特别地，当微支柱条件满足Dc＝1.4·(G–d)·(ΔG/G)0.48公式时，其中ΔG为相邻两行微柱的位错偏移距离，G为每行内相邻两微柱圆心之间的水平距离，d为微柱直径，Dc为微流控对颗粒的临界分选尺寸，PDMS微芯片是利用微流控通道使血液中尺寸较大的CTCs流经通道时能与微支柱发生碰撞而发生侧向位移，CTCs与尺寸较小的其他血液成分发生分离。
具体地，导电的PDMS微芯片的制备过程包括：将硅片模板进行硅烷化处理后，将硅片模板放入容器中，向容器中倒入PDMS预聚物和交联剂形成的混合物，控制PDMS厚度为3.5-4.5mm，然后将容器放入干燥器中固化交联，最后将已固化的PDMS微阵列芯片从硅片上剥离并进行切割处理，最后对所用的PDMS微芯片进行喷金或喷铂处理。
进一步地，硅片模板是设计并定制相应的负性微图案硅模板，为市购材料。将硅片模板进行硅烷化处理是在硅基底上滴3-4滴六甲基二硅胺烷，待挥发完，再次滴入，重复2-3次。
进一步地，PDMS预聚物和交联剂的质量比为8-12:1，如9:1、10:1、11:1等。控制PDMS厚度是为了控制最终形成微支柱的尺寸，固化成型后经过剥离和切割控制微支柱的尺寸。一般而言，在微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径为30-50μm，高度为30-100μm，直径与高度的比值为1～0.5，处在同一横排微柱间隙为30-160μm，相邻两排微柱间距离为30～160μm，相邻两排微柱偏离位错距离为2.8～80μm。此种尺寸的微支柱阵列结构更有利于提高对CTCs捕获的精确度。可以用场发射扫描电镜对PDMS微阵列进行形貌表征，根据结果进行制备工艺优化。
具体地，交联剂可以为正硅酸乙酯、苯基三甲氧基硅烷和辛基三甲氧基硅烷等交联剂中的任意一种。
S2、电纺纤维沉积至PDMS芯片表面
以导电的PDMS微芯片为接收板，采用静电纺丝方式将电纺纤维沉积到导电的PDMS微芯片表面得到电纺纤维改性微芯片，电纺纤维直径为0.15～4μm。利用导电的PDMS微芯片的导电性可以采用静电纺丝的方式加载电纺纤维，以便于后续的多巴胺的沉积。
具体地，静电纺丝过程中所用的纺丝溶液是将高分子聚合物溶于二氯甲烷和甲基甲酰胺形成的混合溶剂中。可以采用单轴静电纺丝技术制备电纺纤维，为进一步提高对CTCs捕获的精确度打下基础。
更优选地，高分子聚合物选自聚苯乙烯、聚己内酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇-聚丙交酯共聚物、聚偏氟乙烯、聚乙二醇-聚己内酯共聚物和聚氨酯中的任意一种或多种。以上几种高分子聚合物均为市购原料，适合于作为静电纺丝的纤维基材。
进一步地，静电纺丝过程中所用的纺丝溶液是将高分子聚合物溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺形成的混合溶剂中；其中，二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为2.5:1-3.5:1，所述高分子聚合物在所述纺丝溶液中的质量分数为10-30％；且该静电纺丝电压为10-22KV，推速为0.2-2mL/h，推收距离为12-22cm。在静电纺丝过程中的参数操控对于制备得到的电纺纤维尺寸有显著影响，发明人发现纤维直径要根据芯片中相邻微支柱的间距大小来选择，才能有效地贴附到基底表面达到后续引入抗体的目的。具体而言，当间距为160～100μm时，适宜的纤维直径为小于3μm；当间距为100～60μm时，适宜的纤维直径为小于1μm；当小于60μm的间距时，适宜的纤维直径为小于0.4μm。而静电纺丝过程中的操作电压、高分子聚合物在纺丝溶液中的浓度、推速等参数对纤维直径影响显著，高分子聚合物浓度过高、操作电压过低均不利于制备得到符合工艺要求的纤维。
S3、利用二硫键引入多种CTCs相关抗体
通过引入二硫键的方式将一种或多种抗体修饰到电纺纤维改性微芯片表面。采用引入二硫键的方式一方面能够更方便地引入抗体进行CTCs捕获，更为重要的是可以通过加入生物相容性良好的还原剂，在温和条件下实现基底表面二硫键的快速断裂，将CTCs完整地释放出来用于后续的研究。
具体地，将抗体修饰至电纺纤维改性微芯片表面的过程包括：将电纺纤维改性微芯片的表面进行聚多巴胺改性，再将材料浸泡在单端生物素修饰的胱胺溶液中，然后再将材料浸泡在链霉亲和素溶液中得到链霉亲和素修饰的基底材料；将生物素修饰的抗体溶液和链霉亲和素修饰的基底材料混合。
优选地，生物素修饰的抗体溶液中包括两种或两种以上的抗体种类，引入多种抗体后，当CTCs与微支柱碰撞时，纤维状的电纺结构能增加CTCs与微流控通道的接触面积，从而增加与纤维表面抗体的特异性结合几率，提高捕获精准度，且仿细胞外基质结构的电纺纤维将有助于保持CTCs的完整性和活力。
具体地，链霉亲和素修饰的基底材料的制备过程包括：将电纺纤维改性微芯片表面进行预处理(可选两种方式：第一种为进行等离子体处理0.5-2min(如1分钟)修饰上羟基；第二种为浸泡在异丙醇中0.5-2小时(如1小时)，再用去离子水浸泡至少3次，每次浸泡0.5-2小时(如1小时)，再在多巴胺溶液中浸泡1-5h，经过清洗干燥后再将材料浸泡在单端生物素修饰的胱胺溶液中，再次经过清洗干燥后将材料在8-15μg/mL的链霉亲和素溶液中浸泡0.5-2h得到链霉亲和素修饰的基底材料。
优选地，多巴胺溶液的浓度为1-3mg/mL，多巴胺溶液的溶剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值为8.5，且多巴胺溶液温度为18～50℃。将电纺纤维改性微芯片在多巴胺溶液中浸泡后，可以使多巴胺在材料表面沉积聚合，然后利用单端生物素修饰的胱胺与聚多巴胺发生迈克尔加成反应引入生物素修饰的胱胺，再利用链霉亲和素与生物素的作用引入链霉亲和素，以便后续利用链霉亲和素和生物素的结合引入生物素修饰的抗体。
具体地，生物素修饰的抗体溶液中的抗体选自抗上皮粘附分子、抗丝束蛋白3、叶酸小分子、RGD靶向多肽和适配子中的任意一种或多种。以上几种抗体可以根据需要选择一种或多种引入，生物素修饰的抗体如生物素化的抗上皮粘附分子(biotinylated anti-EpCAM)、生物素化的抗丝束蛋白3(biotinylated anti-PLS3)等，为市购原料。
具体地，单端生物素修饰的胱胺溶液的制备过程包括：将胱胺和生物素溶于有机溶剂，在催化剂存在的条件下反应20-30h。优选地，胱胺和生物素的质量比为2.5-3.5:1，催化剂包括1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，且生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.5-2:1.5-2。单端生物素修饰的胱胺溶液的制备是现有过程，主要是为了利用生物素和链霉亲和素的作用引入链霉亲和素。
优选地，将生物素修饰的抗体溶液和链霉亲和素修饰的基底材料混合反应后，在反应后的体系中加入过量的甲氧基聚乙二醇胺。甲氧基聚乙二醇胺的加入可以有效屏蔽掉基底上多余的聚多巴胺官能团。
本发明实施例还提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，包括聚二甲基硅氧烷微支柱阵列，在聚二甲基硅氧烷微支柱阵列上沉积有电纺纤维，一种或多种抗体通过二硫键修饰在电纺纤维表面。利用微支柱阵列形成的微流控通道和多种抗体的结合实现对CTCs的精准捕获，利用二硫键的断裂可以很方便地将CTCs完整地释放，具有广阔的市场利用价值。
其中，在微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径为30-50μm，高度为30-100μm，直径与高度的比值为1～0.5，处在同一横排微柱间隙为30-160μm，相邻两排微柱间距离为30～160μm，相邻两排微柱偏离位错距离为2.8～80μm。优选地，微流控材料应用上述提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法制备而得。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其包括以下步骤：
(1)取干净硅片模板，氮气吹干净，置于底部平整的培养皿中，然后进行硅烷化处理(在硅基底上滴3滴六甲基二硅胺烷，待挥发完，再次滴入，重复3次)。接着，按10:1的质量比称取一定量PDMS预聚物和正硅酸乙酯，混合约2分钟后，倒入放置有硅模板的培养皿中，控制PDMS厚度为3.5mm左右。将装有PDMS和硅模板的培养皿放置于真空干燥箱中，抽真空2分钟，除去气泡，然后在室温下静置15分钟，再转移到80℃的恒温干燥箱中约60分钟，进行固化交联。将已固化的PDMS微阵列芯片从硅片上剥离，然后精确切割出需要的部分，以使微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径约为50μm，高度约为100μm，微柱间隙约为160μm，相邻排微柱偏离的距离为80μm，呈平行交错排列。最后对所用的PDMS微芯片进行喷金处理。
(2)将导电的PDMS微芯片用作接收板，通过单轴静电纺丝技术，将电纺纤维沉积到PDMS微支柱阵列表面。纺丝溶液配制：将聚苯乙烯溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合溶液中(二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为2.5:1)，配制成质量分数为25％的聚合物溶液，利用单轴静电纺丝的方式，调节合适的电压15KV、推速0.5mL/h、接收距离15cm。电纺纤维修饰后的微芯片微观结构如图2所示。
(3)将制备好的电纺纤维覆盖的微芯片，浸泡2mg/mL的多巴胺溶液(多巴胺溶液的溶剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.5))中，浸泡约3小时，溶液温度保持为50℃，使得多巴胺在纤维膜上均匀地沉积聚合。然后，用蒸馏水对纤维膜进行反复清洗，再真空干燥。聚多巴胺改性后的电纺纤维微观结果如图3所示。接下来，将聚多巴胺修饰的纤维膜浸没到所制备好的单端生物素修饰的胱胺溶液中，通过迈克尔加成反应将生物素修饰的胱胺接枝到沉积有聚多巴胺的纤维/微图案表面，清洗后，再浸泡到含有8μg/mL链霉亲和素的溶液中约0.5小时。将生物素修饰的两种抗体分子(biotinylated anti-EpCAM和biotinylatedanti-PLS3)按摩尔比为1:2加入到链霉亲和素修饰的基底上，通过抗体上修饰的生物素与链霉亲和素结合，即制备得两种抗体修饰的电纺纤维增强的基底。然后再加入过量的甲氧基聚乙二醇胺溶液，通过迈克尔加成反应，室温下反应24小时，将mPEG-NH2结合到聚多巴胺涂层表面，屏蔽掉基底上多余的聚多巴胺官能团。完成后，进行封片。
其中，单端生物素修饰的胱胺溶液的制备过程：将胱胺和生物素(质量比2.5:1)溶于二甲亚砜溶剂中，加入催化剂碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应20h。其中，催化剂生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.5:1.5。用薄层色谱法对产物“单端生物素修饰的胱胺”检测生物素是否反应完全，待反应完成后，用100目硅胶进行硅胶色谱柱分离纯化。
实施例2
本实施例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其包括以下步骤：
(1)取干净硅片模板，氮气吹干净，置于底部平整的培养皿中，然后进行硅烷化处理(在硅基底上滴4滴六甲基二硅胺烷，待挥发完，再次滴入，重复2次)。接着，按8:1的质量比称取一定量PDMS预聚物和苯基三甲氧基硅烷，混合约2分钟后，倒入放置有硅模板的培养皿中，控制PDMS厚度为4.5mm左右。将装有PDMS和硅模板的培养皿放置于真空干燥箱中，抽真空2分钟，除去气泡，然后在室温下静置20分钟，再转移到80℃的恒温干燥箱中约60分钟，进行固化交联。将已固化的PDMS微阵列芯片从硅片上剥离，然后精确切割出需要的部分，以使微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径约为50μm，高度约为100μm，微柱间隙约为100μm，相邻排微柱偏离的距离为40μm，呈平行交错排列最后对所用的PDMS微芯片进行喷铂处理。
(2)将导电的PDMS微芯片用作接收板，通过单轴静电纺丝技术，将电纺纤维沉积到PDMS微支柱阵列表面。纺丝溶液配制：将聚己内酯溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合溶液中(二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为3.5:1)，配制成质量分数为20％的聚合物溶液，利用单轴静电纺丝的方式，调节合适的电压22KV、推速2mL/h、接收距离22cm。
(3)将制备好的电纺纤维覆盖的微芯片，浸泡到1mg/mL的多巴胺溶液(多巴胺溶液的溶剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.5))中，浸泡约6小时，溶液温度保持为37℃，使得多巴胺在纤维膜上均匀地沉积聚合。然后，用蒸馏水对纤维膜进行反复清洗，再真空干燥。接下来，将聚多巴胺修饰的纤维膜浸没到所制备好的单端生物素修饰的胱胺溶液中，通过迈克尔加成反应将生物素修饰的胱胺接枝到沉积有聚多巴胺的纤维/微图案表面，清洗后，再浸泡到含有15μg/mL链霉亲和素的溶液中约2小时。将生物素修饰的两种抗体分子(biotinylated anti-EpCAM和biotinylated anti-PLS3)按摩尔比为1:1加入到链霉亲和素修饰的基底上，通过抗体上修饰的生物素与链霉亲和素结合，即制备得两种抗体修饰的电纺纤维增强的基底。然后再加入过量的甲氧基聚乙二醇胺溶液，通过迈克尔加成反应，室温下反应24小时，将mPEG-NH2结合到聚多巴胺涂层表面，屏蔽掉基底上多余的聚多巴胺官能团。完成后，进行封片。
其中，单端生物素修饰的胱胺溶液的制备过程：将胱胺和生物素(质量比3.5:1)溶于二甲亚砜溶剂中，加入催化剂碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应30h。其中，催化剂生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:2:2。用薄层色谱法对产物“单端生物素修饰的胱胺”检测生物素是否反应完全，待反应完成后，用100目硅胶进行硅胶色谱柱分离纯化。
实施例3
本实施例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其包括以下步骤：
(1)取干净硅片模板，氮气吹干净，置于底部平整的培养皿中，然后进行硅烷化处理(在硅基底上滴4滴六甲基二硅胺烷，待挥发完，再次滴入，重复2次)。接着，按10:1的质量比称取一定量PDMS预聚物和辛基三甲氧基硅烷，混合约2分钟后，倒入放置有硅模板的培养皿中，控制PDMS厚度为4mm左右。将装有PDMS和硅模板的培养皿放置于真空干燥箱中，抽真空2分钟，除去气泡，然后在室温下静置20分钟，再转移到80℃的恒温干燥箱中约60分钟，进行固化交联。将已固化的PDMS微阵列芯片从硅片上剥离，然后精确切割出需要的部分，以使微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径约为50μm，高度约为80μm，微柱间隙约为50μm，相邻排微柱偏离的距离为4μm，最后对所用的PDMS微芯片进行喷金处理。
(2)将导电的PDMS微芯片用作接收板，通过单轴静电纺丝技术，将电纺纤维沉积到PDMS微支柱阵列表面。纺丝溶液配制：将聚苯乙烯溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺混合溶液中(二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为3:1)，配制成质量分数为15％的聚合物溶液，利用单轴静电纺丝的方式，调节合适的电压18KV、推速1mL/h、接收距离18cm。
(3)将制备好的电纺纤维修饰的微芯片，浸泡到0.5mg/mL的多巴胺溶液(多巴胺溶液的溶剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH＝8.5))中，浸泡约5小时，溶液温度保持为20℃，使得多巴胺在纤维膜上均匀地沉积聚合。然后，用蒸馏水对纤维膜进行反复清洗，再真空干燥。接下来，将聚多巴胺修饰的纤维膜浸没到所制备好的单端生物素修饰的胱胺溶液中，通过迈克尔加成反应将生物素修饰的胱胺接枝到沉积有聚多巴胺的纤维/微图案表面，清洗后，再浸泡到含有10μg/mL链霉亲和素的溶液中约1小时。将生物素修饰的两种抗体分子(biotinylated anti-EpCAM和biotinylated anti-PLS3)按摩尔比为2:1加入到链霉亲和素修饰的基底上，通过抗体上修饰的生物素与链霉亲和素结合，即制备得两种抗体修饰的电纺纤维增强的基底。然后再加入过量的甲氧基聚乙二醇胺溶液，通过迈克尔加成反应，室温下反应24小时，将mPEG-NH2结合到聚多巴胺涂层表面，屏蔽掉基底上多余的聚多巴胺官能团。完成后，进行封片。
其中，单端生物素修饰的胱胺溶液的制备过程：将胱胺和生物素(质量比3:1)溶于二甲亚砜溶剂中，加入催化剂碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，常温下反应24h。其中，催化剂生物素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.8:1.8。用薄层色谱法对产物“单端生物素修饰的胱胺”检测生物素是否反应完全，待反应完成后，用150目硅胶进行硅胶色谱柱分离纯化。
对比例1
本对比例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：纺丝溶液中聚合物质量分数为30％。在该浓度下，所纺出的纤维直径在3μm以上，不能很好的贴附到微支柱阵列上。
对比例2
本对比例提供一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其具体步骤与实施例3大致相同，不同之处在于：静电纺丝过程中的操作电压为5KV。电压过低导致所纺出的纤维直径在1μm以上，不能很好的贴附到微支柱阵列上。
对比例3
本对比例提供一种循环肿瘤细胞捕获方法，其微流控通道使CTCs发生确定性侧向位移进行捕获，微流控材料的制备过程与实施例3中步骤(1)相同。再进一步按实施例3中步骤(3)进行抗体修饰。
综上所述，本发明提供的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其通过在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷芯片，利用微流控通道使血液中尺寸较大的CTCs流经通道时能与微支柱发生碰撞而发生侧向位移，CTCs与尺寸较小的其他血液成分发生分离；在微支柱表面通过先引入电纺纤维，再通过二硫键引入用于捕获CTCs的特异性抗体，进一步提升CTCs捕获的精准度，且二硫键在还原剂存在的情况下可以在温和的条件下断裂，将CTCs完整的释放出来用于后续的研究。
本发明提供的一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，其通过聚二甲基硅氧烷微支柱阵列形成微流控通道，便于捕获CTCs；还通过引入抗体进一步增加了对CTCs捕获的精准度。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (9)

1.一种提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1:在硅片模板上制作微支柱阵列结构的聚二甲基硅氧烷芯片，且对所述聚二甲基硅氧烷芯片进行导电化处理得到导电的PDMS微芯片；其中，在所述微支柱阵列结构中，圆柱形微柱的直径为30-50μm，高度为30-100μm，直径与高度的比值为1～0.5，处在同一横排微柱间隙为30-160μm，相邻两排微柱间距离为30～160μm，相邻两排微柱偏离位错距离为2.8～80μm；
S2:以所述导电的PDMS微芯片为接收板，采用静电纺丝方式将电纺纤维沉积到所述导电的PDMS微芯片表面得到电纺纤维改性微芯片，电纺纤维直径为0.15～4μm；所述静电纺丝过程中所用的纺丝溶液是将高分子聚合物溶于二氯甲烷和二甲基甲酰胺形成的混合溶剂中；其中，二氯甲烷和二甲基甲酰胺的体积比为2.5:1-3.5:1，所述高分子聚合物在所述纺丝溶液中的质量分数为10-20％；且静电纺丝电压为10-22KV，推速为0.2-2mL/h，推收距离为12-22cm；
S3:通过引入二硫键的方式将一种或多种抗体修饰到所述电纺纤维改性微芯片表面；
将抗体修饰至所述电纺纤维改性微芯片表面的过程包括：将所述电纺纤维改性微芯片的表面进行预处理再进行聚多巴胺改性，再将材料浸泡在单端生物素修饰的胱胺溶液中，然后再将材料浸泡在链霉亲和素溶液中得到链霉亲和素修饰的基底材料；将生物素修饰的抗体溶液和所述链霉亲和素修饰的基底材料混合。
2.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述预处理是进行等离子处理0.5-2min并进行羟基的修饰；
或，所述预处理是在异丙醇中浸泡0.5-2h，再用水浸泡至少3次，每次浸泡0.5-2h。
3.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，将所述生物素修饰的抗体溶液和所述链霉亲和素修饰的基底材料混合反应后，在反应后的体系中加入过量的甲氧基聚乙二醇胺。
4.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述链霉亲和素修饰的基底材料的制备过程包括：
将所述电纺纤维改性微芯片在多巴胺溶液中浸泡1-5h，经过清洗干燥后再将材料浸泡在所述单端生物素修饰的胱胺溶液中，再次经过清洗干燥后将材料在8-15μg/mL的链霉亲和素溶液中浸泡0.5-2h得到所述链霉亲和素修饰的基底材料。
5.根据权利要求4所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述多巴胺溶液的浓度为1-3mg/mL，所述多巴胺溶液的溶剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液pH值为8.5，且多巴胺溶液温度为18～50℃。
6.根据权利要求5所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述生物素修饰的抗体溶液中的抗体选自抗上皮粘附分子、抗丝束蛋白3、叶酸小分子、RGD靶向多肽和适配子中的任意一种或多种。
7.根据权利要求4所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述单端生物素修饰的胱胺溶液的制备过程包括：将胱胺和生物素溶于有机溶剂，在催化剂存在的条件下反应20-30h。
8.根据权利要求1所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法，其特征在于，所述导电的PDMS微芯片的制备过程包括：将硅片模板进行硅烷化处理后，将硅片模板放入容器中，向容器中倒入PDMS预聚物和交联剂形成的混合物，控制PDMS厚度为3.5-4.5mm，然后将容器放入干燥器中固化交联，接着将已固化的PDMS微阵列芯片从硅片上剥离并进行切割处理，最后对所用的PDMS微芯片进行喷金或喷铂处理。
9.一种用于捕获循环肿瘤细胞的微流控材料，其特征在于，所述微流控材料应用权利要求1-8中任一项所述的提高循环肿瘤细胞捕获精准度的方法制备而得。
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